KR101809829B1 - Probe nanoparticles for fluorescence imaging through semi-interpenetrating network formation in the core of micelle - Google Patents
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Abstract
본 발명은 sIPN 구조가 코어에 형성된 형광 이미징용 표지나노입자에 관한 것으로, 본 발명에 따른 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조가 코어에 형성된 형광 이미징용 표지나노입자는 다양한 소수성 유기형광염료를 적용가능하고, 다수의 화학 기능기를 표면에 정밀히 도입할 수 있으며, 미셀 코어에 sIPN 구조가 형성됨에 따라서 미셀의 안정성이 현저히 향상되는 효과가 있으며, 생체이미징시에 종래 염료에 비해 체내 순환시간이 향상되고, BBB(blood brain barrier)를 통과할 수 있어 뇌 진단에도 사용될 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a labeled nanoparticle for fluorescent imaging in which a sIPN structure is formed on a core, and a fluorescent nanoparticle for fluorescent imaging in which a sIPN (Semi-Interpenetrating Network) structure according to the present invention is formed on a core can be applied to various hydrophobic organic fluorescent dyes And it is possible to precisely introduce a large number of chemical functional groups onto the surface thereof, and the stability of the micelles is remarkably improved by forming the sIPN structure in the micellar core, and the circulation time in the body is improved as compared with the conventional dyes in the living body imaging, It can pass through BBB (blood brain barrier) and can be used for brain diagnosis.
Description
본 발명은 sIPN 구조가 코어에 형성된 미셀에 형광염료를 담지한 표지나노입자의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing labeled nanoparticles in which a fluorescent dye is supported on a micelle in which a sIPN structure is formed on a core.
대부분의 유기형광염료들은 열악한 수성 용해성을 가지고 있고, 이는 임상시험 등을 성공적으로 통과하기 위한 새로운 유기형광염료가 해결해야 할 필수불가결한 물성이다. 환자 혹은 생물시료에 대한 형광염료의 사용성을 향상시키기 위하여 유기합성 방법의 기능기 도입 외에도 수용성을 확보하기 위한 여러가지 시도들이 소수성 유기형광염료들을 용해시키는 데에 있어서 사용되어 왔다. 그러한 시도들 중의 몇 가지 방법은 밀링(milling), 사이클로덱스트린과의 복합체형성(complexation), 염의 형성, 및 계면활성제 또는 고분자소재 미셀들(polymeric micelles)을 사용하는 분산(dispersion) 등이다. 이러한 방법들은 각각 장점 및 단점들을 가지고 있으며, 따라서 유기형광염료를 수용성 환경에서 사용하기 위한 향상된 접근 방법들이 매우 요구되고 있는 실정이다.Most organic fluorescent dyes have poor aqueous solubility, which is an indispensable property that new organic fluorescent dyes to successfully pass clinical trials, etc., must solve. In addition to introducing functional groups of organic synthesis methods to improve the usability of fluorescent dyes to patients or biological samples, various attempts to ensure water solubility have been used to dissolve hydrophobic organic fluorescent dyes. Some of such attempts include milling, complexation with cyclodextrin, salt formation, and dispersion using surfactants or polymeric micelles. These methods each have advantages and disadvantages and therefore, there is a great need for improved approaches for using organic fluorescent dyes in an aqueous environment.
고분자소재 미셀들은 양친매성(amphiphilic) 블록 또는 그래프트 공중합체들(copolymers)이 자기조립(self-assembly)하여 형성한다. 고분자 미셀들은 콜로이드성 약물 전달 시스템에 이용되어 주목받아 왔다. 이러한 콜로이드 시스템에서, 공중합체의 소수성 블록은 소수성 카고 분자(hydrophobic cargo molecules) 담지를 위한 "마이크로 혹은 나노 컨테이너(micro-/ nanocontainer)"를 형성하는 중심부(core)를 형성한다. 상기 미셀들의 친수성 부분은 외부의 수성 환경과 중심부 사이의 계면(interface)을 안정화시키는 바깥 껍질(outer shell)을 형성한다. 계면활성제 기반 미셀 시스템들과 비교할 때에, 고분자 기반 미셀들은 낮은 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC) 및 감소된 독성(reduced toxicity)과 같은 장점들을 가진다. 이러한 장점들에도 불구하고, 현재까지 미셀 시스템은 생분해성, 생체적합성 (biocompatibility), 캡슐화 효율 (encapsulation efficiency), 안정성, 그 제형들의 임상적 부작용, 및 알려진 미셀적 제형의 제조와 관련한 어려움 및 비용으로 인하여 다소 제한적으로 약물전달 등에 응용되어 왔다. 따라서, 고분자소재 미셀 약물전달 시스템의 장점을 포함하는 동시에 향상된 생체적합성을 가지고 또한 제조가 보다 용이하고 비용이 덜 드는 새로운 미셀 시스템 개발이 절실하다.The polymeric micelles are formed by self-assembly of amphiphilic blocks or graft copolymers. Polymeric micelles have been used for colloidal drug delivery systems. In such a colloidal system, the hydrophobic block of the copolymer forms a core that forms a "micro- or nanocontainer" for supporting hydrophobic cargo molecules. The hydrophilic portion of the micelles forms an outer shell that stabilizes the interface between the external aqueous environment and the center. Compared to surfactant-based micelle systems, polymer-based micelles have advantages such as low critical micelle concentration (CMC) and reduced toxicity. Despite these advantages, up to now, the micelle system has been shown to be biodegradable, biocompatibility, encapsulation efficiency, stability, clinical side effects of the formulations, and difficulties and costs associated with the manufacture of known micelle formulations Have been applied to drug delivery to a limited extent. Therefore, it is urgent to develop a new micellar system that has advantages of polymeric micellar drug delivery system, at the same time has improved biocompatibility, and is easier to manufacture and less costly.
이에, 본 발명자들은 생체적합성이 확보된 고분자 미셀의 중심부에 소수성 유기형광염료 및 가교제를 함유하도록 다양한 방법으로 용액을 제조한 후에, UV 조사 및 온도 상승을 통해 미셀 중심부를 반상호침투 구조화 (semi-interpenetrating network, sIPN)하여 얻은 나노입자가 다양한 소수성 유기형광염료를 중심부에 담지 가능하고, 미셀 중심부에 sIPN 구조가 형성됨에 따라서 나노구조의 안정성이 현저히 향상되는 효과가 있으며, 세포 및 생체이미징이 다양한 파장에서 가능하고, 특히 체내 순환시간이 향상되며, BBB(blood brain barrier)를 통과할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Thus, the present inventors have found that, after preparing a solution by various methods so as to contain a hydrophobic organic fluorescent dye and a crosslinking agent in the center of a polymer micelle having secured biocompatibility, the center of the micelle is semi- interpenetrating network, sIPN) can carry various hydrophobic organic fluorescent dyes at the center, and the sIPN structure is formed at the center of the micelle, the stability of the nanostructure is remarkably improved. In addition, And it is confirmed that the circulation time can be improved and the blood brain barrier can be passed through the BBB. Thus, the present invention has been completed.
본 발명의 목적은 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조가 중심부에 형성된 형광 이미징용 표지나노입자를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a labeled nanoparticle for fluorescence imaging in which a sIPN (Semi-Interpenetrating Network) structure is formed at the center.
본 발명의 다른 목적은 상기 형광 이미징용 표지나노입자의 제조방법 1-5를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method 1-5 for producing the labeled nanoparticles for fluorescence imaging.
상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,
본 발명은 미셀을 형성하는 양친매성 트리블록공중합체;The present invention relates to amphiphilic triblock copolymers which form micelles;
미셀 코어에 봉입되는 유기형광염료; 및An organic fluorescent dye encapsulated in a micelle core; And
미셀 코어에 봉입되어 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 가교제;A cross-linking agent which is enclosed in the micelle core to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure;
를 포함하는 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조가 코어에 형성된 형광 이미징용 표지나노입자를 제공한다.A semi-interpenetrating network (sIPN) structure comprising a core is provided on the core.
여기서, 상기 양친매성 트리블록공중합체는 PEO-block-PPO-block-PEO 구조인 것을 사용할 수 있다. 이때, 상기 양친매성 트리블록공중합체의 양말단은 하이드록시기로 구성되어 있고, 이를 다양한 작용기로 개질하여 사용할 수 있다. 또한, 양말단이 개질되지 않은 양친매성 트리블록공중합체 및 1종 이상의 양말단이 개질된 양친매성 트리블록공중합체를 사용 목적에 적합한 혼합비율로 사용할 수 있다.Here, the amphiphilic triblock copolymer may be a PEO-block-PPO-block-PEO structure. At this time, both ends of the amphiphilic triblock copolymer are composed of a hydroxyl group and can be modified by various functional groups. In addition, an amphiphilic triblock copolymer in which both ends are not modified and an amphipathic triblock copolymer in which one or more ends are modified may be used in a mixing ratio suitable for the purpose of use.
또한, 본 발명은 양친매성 트리블록공중합체를 정제수에 용해하여 중합체 용액을 준비하는 단계(단계 1);The present invention also relates to a process for preparing a polymer solution by dissolving an amphiphilic triblock copolymer in purified water (step 1);
유기형광염료를 유기 용매에 용해하여 염료 용액을 준비하는 단계(단계 2);Preparing a dye solution by dissolving the organic fluorescent dye in an organic solvent (step 2);
가교제를 유기용매에 용해하여 가교제 용액을 준비한 다음, 여기에 상기 단계 2에서 준비한 염료 용액을 첨가하고, 유기용매를 증발시켜 바이알 밑바닥에 가교제-염료 필름을 형성하는 단계(단계 3);Dissolving the cross-linking agent in an organic solvent to prepare a cross-linking agent solution, adding the dye solution prepared in
상기 단계 3의 바이알에 상기 단계 1에서 준비한 중합체 용액을 첨가하여 미셀 용액을 준비하는 단계(단계 4);Preparing a micellar solution by adding the polymer solution prepared in
가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계(단계 5); 및(Step 5) heating to 50-70 占 폚 above the critical micelle temperature of the amphiphilic triblock copolymer for internalization of the micelle core of the crosslinker; And
UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계(단계 6);(Step 6) of cross-linking the cross-linking agent encapsulated in the micelles by irradiating UV to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure;
를 포함하는 형광 이미징용 표지나노입자의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing labeled nanoparticles for fluorescence imaging.
나아가, 본 발명은 유기형광염료를 유기용매에 용해하고, 용매를 모두 증발시킨 바이알 A를 준비하는 단계(단계 1);Furthermore, the present invention relates to a method for preparing a vial A comprising the steps of: (1) preparing an vial A by dissolving an organic fluorescent dye in an organic solvent and evaporating all of the solvent;
가교제를 유기용매에 용해하고, 용매를 모두 증발시킨 바이알 B를 준비하는 단계(단계 2);Dissolving the cross-linking agent in an organic solvent, and preparing vial B in which all of the solvent is evaporated (Step 2);
양친매성 트리블록공중합체를 정제수에 용해하여 중합체 용액을 준비하는 단계(단계 3);Preparing a polymer solution by dissolving the amphiphilic triblock copolymer in purified water (step 3);
상기 단계 3에서 준비한 중합체 용액을 단계 1의 바이알 A에 붓고 혼합하는 단계(단계 4);Pouring the polymer solution prepared in
상기 단계 4에서 준비한 용액을 단계 2에서 준비한 바이알 B에 붓는 단계(단계 5);Pouring the solution prepared in the
가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계(단계 6); 및Heating (step 6) to 50-70 DEG C above the critical micelle temperature of the amphiphilic triblock copolymer for internalization of the micelle core of the crosslinker; And
UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계(단계 7);Crosslinking the cross-linking agent encapsulated in the micelles by irradiation with UV to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure (Step 7);
를 포함하는 형광 이미징용 표지나노입자의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing labeled nanoparticles for fluorescence imaging.
또한, 본 발명은 양친매성 트리블록공중합체를 유기용매에 용해하고, 여기에 유기형광염료를 혼합한 다음 유기용매를 증발시켜, 중합체-염료 필름을 밑바닥에 형성시킨 바이알 A를 준비하는 단계(단계 1);The present invention also relates to a method for producing a polymer-dye film, comprising the steps of: dissolving an amphiphilic triblock copolymer in an organic solvent, mixing an organic fluorescent dye thereto, and then evaporating the organic solvent to prepare a vial A having a polymer- One);
상기 단계 1의 바이알 A에 정제수를 붓고, 초음파 처리하고 교반한 다음, 실린지 필터로 여과하는 단계(단계 2);Pouring purified water into the vial A of the
가교제를 유기용매에 용해시킨 다음, 유기용매를 증발시켜 가교제 필름을 밑바닥에 형성시킨 바이알 B를 준비하는 단계(단계 3);Dissolving the crosslinking agent in an organic solvent, and then evaporating the organic solvent to prepare a vial B having a crosslinker film formed on the bottom thereof (Step 3);
단계 2에서 준비한 용액을 단계 3의 바이알 B에 붓고 교반하는 단계(단계 4);Pouring the solution prepared in
가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계(단계 5); 및(Step 5) heating to 50-70 占 폚 above the critical micelle temperature of the amphiphilic triblock copolymer for internalization of the micelle core of the crosslinker; And
UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계(단계 6);(Step 6) of cross-linking the cross-linking agent encapsulated in the micelles by irradiating UV to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure;
를 포함하는 형광 이미징용 표지나노입자의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing labeled nanoparticles for fluorescence imaging.
나아가, 본 발명은 양친매성 트리블록공중합체를 유기용매에 용해하고, 여기에 유기형광염료를 함께 혼합한 용액 A를 준비하는 단계(단계 1);Furthermore, the present invention provides a method of preparing a solution A, which comprises dissolving an amphipathic triblock copolymer in an organic solvent and mixing together an organic fluorescent dye (Step 1);
상기 단계 1의 용액 A에서 유기용매와 정제수가 투석 멤브레인을 통해 빠져나오고 들어가는 평형과정을 통해 양친매성 트리블록공중합체 중심에 유기형광염료가 내재된 수용액 B 를 준비하는 단계(단계 2);Preparing an aqueous solution B containing an organic fluorescent dye at the center of the amphiphilic triblock copolymer through an equilibrium process in which the organic solvent and the purified water are passed through the dialysis membrane in the solution A of the step 1 (step 2);
가교제를 유기용매에 용해시킨 다음, 유기용매를 증발시켜 가교제 필름을 밑바닥에 형성시킨 바이알 B를 준비하는 단계(단계 3);Dissolving the crosslinking agent in an organic solvent, and then evaporating the organic solvent to prepare a vial B having a crosslinker film formed on the bottom thereof (Step 3);
단계 2에서 준비한 수용액 B를 단계 3의 바이알 B에 붓고 교반하는 단계(단계 4);Pouring the aqueous solution B prepared in
가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계(단계 5); 및(Step 5) heating to 50-70 占 폚 above the critical micelle temperature of the amphiphilic triblock copolymer for internalization of the micelle core of the crosslinker; And
UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계(단계 6);(Step 6) of cross-linking the cross-linking agent encapsulated in the micelles by irradiating UV to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure;
를 포함하는 형광 이미징용 표지 나노입자의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing labeled nanoparticles for fluorescence imaging.
마지막으로, 본 발명은 양친매성 트리블록공중합체와 유기형광염료를 고체상태에서 용융하여 혼합한 다음 밑바닥에 형성시킨 바이알 A를 준비하는 단계(단계 1);Finally, the present invention relates to a process for preparing a vial A (step 1) comprising melting an amphipathic triblock copolymer and an organic fluorescent dye in a solid state and mixing and then forming a bottomed vial A;
상기 단계 1의 바이알 A에 가교제를 혼합하여 바이알 B를 준비하는 단계(단계 2);Preparing a vial B by mixing a cross-linking agent in the vial A of the step 1 (step 2);
상기 단계 2의 바이알 B에 정제수를 붓고, 초음파 처리하고 교반한 다음, 실린지 필터로 여과하는 단계(단계 3);Pouring purified water into vial B of
가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계(단계 4); 및Heating (step 4) to 50-70 DEG C above the critical micelle temperature of the amphiphilic triblock copolymer for internalization of the micelle core of the cross-linking agent; And
UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계(단계 5);Crosslinking the cross-linking agent encapsulated in the micelle to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure by irradiating UV light (step 5);
를 포함하는 형광 이미징용 표지 나노입자의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing labeled nanoparticles for fluorescence imaging.
본 발명에 따른 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조가 코어에 형성된 형광 이미징용 표지나노입자는 다양한 소수성 유기형광염료를 적용가능하고, 다수의 화학 기능기를 표면에 정밀히 도입할 수 있으며, 미셀 코어에 sIPN 구조가 형성됨에 따라서 미셀의 안정성이 현저히 향상되는 효과가 있으며, 생체이미징시에 종래 염료에 비해 체내 순환시간이 향상되고, BBB(blood brain barrier)를 통과할 수 있어 뇌 진단에도 사용될 수 있는 효과가 있다.The labeling nanoparticles for fluorescent imaging in which a sIPN (Semi-Interpenetrating Network) structure according to the present invention is formed on a core can be applied to various hydrophobic organic fluorescent dyes, can precisely introduce a large number of chemical functional groups onto the surface, As the structure is formed, the stability of micelles is remarkably improved. In the living body imaging, the circulation time is improved in comparison with the conventional dyes, the blood brain barrier can be passed through the BBB, have.
도 1은 제법 1의 개략도이다.
도 2는 제법 2의 개략도이다.
도 3은 제법 3의 개략도이다.
도 4a - 도 4c는 실시예 1-12에서 사용한 유기형광염료의 화학구조식이다.
도 5는 임계미셀온도(CMT) 테스트 이후에 실시예 1 및 비교예 1의 흡광(a) 및 형광(b) 스펙트라이다.
도 6은 가교제(PETA) 함량에 따른 파이렌의 흡광값을 나타낸 그래프이다.
도 7은 UV 조사 시간에 따른 흡광 세기를 측정한 그래프이다.
도 8은 반응 온도에 따른 흡광(a) 및 형광(b) 스펙트라이다.
도 9는 상온 및 CMT 이하의 온도에서 측정한 파이렌 함량의 영향으로서 파이렌 흡광 커브를 나타낸다.
도 10은 파이렌 함량에 따른 형광 스펙트라이다.
도 11은 5 mL 바이알에서 0.5, 1, 2 및 3 mL 미셀 용액에 따른 흡광 및 형광을 측정한 스펙트라이다.
도 12는 20 mL 바이알에서 15, 10 및 5 mL 미셀 용액에 따른 흡광 및 형광을 측정한 스펙트라이다.
도 13은 실시예 1에서 제조한 F127-py-PETA sIPN 미셀을 PCR 테스트 후에 흡광을 측정한 스펙트라이다.
도 14는 염기성 환경에서 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 미셀의 흡광 스펙트라이다.
도 15는 실시예 1 및 비교예 1의 흡광(Abs) 및 형광(Flu) 스펙트라이다.
도 16은 실시예 8(KIM B)에서 제조한 미셀을 처리한 TC1(폐암 세포)의 공초점 현미경 이미지이다(a-e는 control, 폴리머 농도 0.001%, 0.0005%, 0.0002%, 0.0001%의 미셀이고, f-g는 0.0002% 및 0.0001% 폴리머 농도의 미셀을 처리한 TC1 폐암 세포의 100배 확대 이미지이다).
도 17은 실시예 12(프탈로시아닌) 및 대조군으로서 ICG를 마우스에 투입한 in vivo 및 ex vivo 형광 이미지이다(도 17a: 실시예 12 (50㎍) in vivo, 도 17b: ICG (100㎍) in vivo, 도 17c: ICG (100㎍) ex vivo, 도 17d: 실시예 12 (50㎍) ex vivo).
도 18은 실시예 1-12에서 사용한 유기형광염료의 흡광 스펙트라이다.
도 19는 실시예 1-12에서 사용한 유기형광염료의 발광 스펙트라이다.
도 20은 실시예 1-12에서 제조한 미셀 용액을 촬영한 사진이다.
도 21은 실시예 1에서 제조한 F127-py-PETA sIPN의 DLS 및 TEM 측정 결과이다.
도 22는 F127 및 F127-PO(OH)2 혼합 개체비율(0-100%)을 달리하여 제조한 형광이미징용 표지나노입자 샘플의 전기영동 사진이다(사진에서 '0%'는 F127-PO(OH)2 100%이다).1 is a schematic view of
2 is a schematic view of
3 is a schematic view of
4A to 4C are chemical structural formulas of the organic fluorescent dyes used in Examples 1-12.
Figure 5 is the absorbance (a) and fluorescence (b) spectra of Example 1 and Comparative Example 1 after a critical micelle temperature (CMT) test.
6 is a graph showing the absorption of pyrene according to the content of crosslinking agent (PETA).
FIG. 7 is a graph showing the measurement of the intensity of light according to the UV irradiation time.
Fig. 8 shows the absorption (a) and fluorescence (b) spectra according to the reaction temperature.
Figure 9 shows the pyrene absorption curve as an effect of the pylene content measured at ambient temperature and below CMT.
10 is a fluorescence spectra according to the content of pyrene.
FIG. 11 is a spectra measuring absorbance and fluorescence according to 0.5, 1, 2 and 3 mL micellar solutions in 5 mL vials.
FIG. 12 is a spectra showing the absorption and fluorescence of 15, 10 and 5 mL micellar solutions in 20 mL vials.
FIG. 13 is a spectra obtained by measuring the absorption of F127-py-PETA sIPN micelle prepared in Example 1 after a PCR test.
14 is an absorption spectrum of the micelle prepared in Example 1 and Comparative Example 1 in a basic environment.
Fig. 15 shows the Abs and Flu spectra of Example 1 and Comparative Example 1. Fig.
16 is a confocal microscopic image of TC1 (lung cancer cells) treated with micelles prepared in Example 8 (KIM B) (ae is control, polymer concentration is 0.001%, 0.0005%, 0.0002%, 0.0001% fg is a 100-fold magnification image of TC1 lung cancer cells treated with 0.0002% and 0.0001% polymer micelles).
Figure 17 is an in vivo and ex vivo fluorescence image of Example 12 (phthalocyanine) and ICG as a control group (Figure 17a: Example 12 (50g) in vivo, Figure 17b: ICG (100g) in vivo , Fig. 17c: ICG (100 g) ex vivo, Fig. 17d: Example 12 (50 g) ex vivo).
18 is an absorption spectrum of the organic fluorescent dye used in Examples 1-12.
19 is a light emission spectrum of the organic fluorescent dye used in Example 1-12.
20 is a photograph of the micellar solution prepared in Example 1-12.
21 shows the DLS and TEM measurement results of the F127-py-PETA sIPN prepared in Example 1. Fig.
FIG. 22 is an electrophoresis image of a labeled nanoparticle sample for fluorescent imaging prepared with different F127 and F127-PO (OH) 2 mixture ratio (0-100%) ('0%' represents F127-PO OH) < / RTI > 2 100%).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 미셀을 형성하는 양친매성 트리블록공중합체;The present invention relates to amphiphilic triblock copolymers which form micelles;
미셀 코어에 봉입되는 유기형광염료; 및An organic fluorescent dye encapsulated in a micelle core; And
미셀 코어에 봉입되어 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 가교제;A cross-linking agent which is enclosed in the micelle core to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure;
를 포함하는 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조가 코어에 형성된 형광 이미징용 표지나노입자를 제공한다.A semi-interpenetrating network (sIPN) structure comprising a core is provided on the core.
여기서, 상기 양친매성 트리블록공중합체는 PEO-block-PPO-block-PEO 구조인 것을 사용할 수 있다. 이때, 상기 양친매성 트리블록공중합체의 양말단은 하이드록시기로 구성되어 있고, 이를 하기의 다양한 작용기 등으로 개질하여 사용할 수 있다. Here, the amphiphilic triblock copolymer may be a PEO-block-PPO-block-PEO structure. At this time, both ends of the amphiphilic triblock copolymer are composed of a hydroxy group, which can be modified by various functional groups described below.
-SH, -SO3H, 
또한, 양말단이 개질되지 않은 양친매성 트리블록공중합체 및 1종 이상의 양말단이 개질된 양친매성 트리블록공중합체를 사용 목적에 적합한 혼합 개체비율(0-100:100-0)로 사용할 수 있다. 여기서, 상기 '1종 이상의 양말단이 개질된 양친매성 트리블록공중합체'는 양말단이 개질된 양친매성 트리블록공중합체를 여러 종류 혼합하여 사용할 수 있음을 의미한다.In addition, an amphiphilic triblock copolymer not modified at both ends and at least one amphiphilic triblock copolymer modified at both ends can be used as the mixing ratio (0-100: 100-0) suitable for the purpose of use . Herein, the term 'amphiphilic triblock copolymer having at least one end-modified end' means that various kinds of amphipathic triblock copolymers modified at both ends can be used.
본 발명에 따른 형광이미징용 표지나노입자는 원하는 표면 작용기를 원하는 비율로 개질이 용이하므로, 다양한 생물학적 적용 가능성을 확보할 수 있다. 구체적으로, 생물학적 적용의 예로는 passive/active 세포섭취, 조직섭취, 암세포 표적화 등에 응용할 수 있고, 생결합에 적용의 예로는 항체결합, 단백질 표지, 핵산 표지 등에 응용할 수 있으며, 나노과학적 적용의 예로는 분자이미징시 마커로 활용(예를 들어, avidin-biotin 상호작용), 금나노입자 등과 결합 형성에 적용할 수 있다.The labeled nanoparticles for fluorescence imaging according to the present invention can be easily modified at desired ratios of desired surface functional groups, thus ensuring various biological applicability. Specifically, examples of biological applications include passive / active cell uptake, tissue ingestion, targeting of cancer cells, and the like. Examples of application to biological binding include antibody binding, protein labeling, and nucleic acid labeling. Examples of nanoscale applications include It can be used as a marker in molecular imaging (for example, avidin-biotin interaction), for binding with gold nanoparticles and the like.
본 발명에 따른 형광 이미징용 표지나노입자에 있어서, 상기 양친매성 트리블록공중합체는 PEO-block-PPO-block-PEO 구조의 양친매성 트리블록공중합체를 사용할 수 있다. 본 발명에서는 양친매성 트리블록공중합체의 일례로 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)을 사용하였다. 플루로닉은 PEO-block-PPO-block-PEO 구조의 양친매성 트리블록공중합체로서, 분자량과 PEO/PPO 조성에 따라 다양한 모델이 판매되고 있으며, 본 발명에서는 하기 풀루로닉 모델명의 양친매성 트리블록공중합체를 모두 사용할 수 있다:In the labeled nanoparticles for fluorescence imaging according to the present invention, the amphiphilic triblock copolymer may be an amphiphilic triblock copolymer having a PEO-block-PPO-block-PEO structure. In the present invention, Pluronic F127 (EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) was used as an example of the amphiphilic triblock copolymer. Pluronic is an amphiphilic triblock copolymer of PEO-block-PPO-block-PEO structure. Various models are sold according to molecular weight and PEO / PPO composition. In the present invention, amphipathic tree Block copolymers can all be used:
P85, P84, P123, P104, P103, N3, L92, L81, L64, L62, L61, L43, L35, L31, L121, L101, L10, FT L61, F88, F87, F77, F68, F38, F127, F108, 31R, 25R, 17R, 10R 등.F85, F127, F108, F108, F107, F108, F88, F87, F77, F108, F108, F107, F108, P85, P84, P123, P104, P103, N3, L92, L81, L64, L62, L61, L43, L35, L31, , 31R, 25R, 17R, 10R, and the like.
또한, Lutrol, Poloxamer, Epan 등의 다른 시판 고분자도 상술한 플루로닉 계열의 양친매성 트리블록공중합체와 유사한 구조이므로, 이들 역시 사용할 수 있다.Other commercially available polymers such as Lutrol, Poloxamer, and Epan are also similar in structure to the above-described pluronic amphipathic triblock copolymers, and these can also be used.
본 발명에 따른 형광 이미징용 표지나노입자에 있어서, 상기 유기형광염료는 300-900 nm의 자외선-가시광선-적외선 파장 영역에서 광자를 흡수 후 여기되어 다시 발광하는 유기물질이다. 즉, 파이렌, Lumogen® F violet 570, 3-티오펜헥실, Lumogen® F yellow 083, 2,3-디메틸-5,8-디-티오펜-2-일퀴옥살린 (KIM A), Lumogen® F orange 240, 나프토티아디아졸, 4,7-디-티오펜-2-일벤조[1,2,5]티아디아졸 (KIM B), Lumogen® red 350, Se-벤조티아디아졸, Nile red, 프탈로시아닌 등을 사용할 수 있고, 이에 제한하지 않는다. 상기 유기형광염료의 화학구조식을 도 4a - 도 4c에 나타내었다.In the labeled nanoparticles for fluorescence imaging according to the present invention, the organic fluorescent dye is an organic material which absorbs photons in the ultraviolet-visible-infrared wavelength region of 300-900 nm, excites them, and emits light again. Lumogen ® F violet 570, 3-thiophene hexyl, Lumogen ® F yellow 083, 2,3-dimethyl-5,8-di-thiophene-2-yloquinoxaline (KIM A), Lumogen ® F orange 240, naphthothiadiazole, 4,7-di-thiophen-2-yl benzo [1,2,5] thiadiazole (KIM B), Lumogen ® red 350, Seibenzothiadiazole, Nile red, phthalocyanine, and the like can be used, but the present invention is not limited thereto. The chemical structure of the organic fluorescent dye is shown in Figs. 4A to 4C.
즉, 유기용매에 용해 가능한 폴리아로마틱 하이드로카본, 티오펜 유도체, 나프탈렌이미드 유도체, 페릴렌 및 터릴렌이미드 유도체, 나프토티아디아졸 유도체, 벤조티아디아졸, 옥사존 유도체, 프탈로시아닌 유도체 등을 형광염료로서 사용할 수 있다.That is, it is possible to use a polyaromatic hydrocarbon, a thiophene derivative, a naphthaleneimide derivative, a perylene and teryleneimide derivative, a naphthothiadiazole derivative, a benzothiadiazole, an oxazone derivative, a phthalocyanine derivative, It can be used as a dye.
본 발명에 따른 형광 이미징용 표지나노입자에 있어서, 상기 가교제는 다수의 아크릴, 메타크릴레이트, 비닐 작용기에 자외선, 열, 광개시제의 사용을 통하여 라디칼을 생성함으로서 최종적으로 망상구조 형성이 가능한 시약을 사용할 수 있다. 구체적으로, PET4A (Pentaerythritol tetraacrylate), PET3A (Pentaerythritol triacrylate) 등을 사용할 수 있고, 본 발명에서는 일례로 PET4A를 사용하였다.In the labeled nanoparticles for fluorescent imaging according to the present invention, the crosslinking agent generates radicals through the use of ultraviolet rays, heat, and a photoinitiator to a large number of acrylic, methacrylate, and vinyl functionalities, thereby finally using a reagent capable of forming a reticular structure . Specifically, PET4A (Pentaerythritol tetraacrylate), PET3A (Pentaerythritol triacrylate) or the like can be used, and PET4A is used as an example in the present invention.
여기서, 자외선을 통하여 가교할 경우 UV 조사시간은 4-8분일 수 있고, 광개시제를 추가로 포함할 경우에는 UV 조사 시간을 6분 이하로 할 수 있다.Here, the UV irradiation time may be 4-8 minutes when crosslinking through ultraviolet rays, and the UV irradiation time may be less than 6 minutes when a photoinitiator is further included.
본 발명에 따른 형광 이미징용 표지나노입자는, 세포 주입을 고려하여 3-100 nm, 바람직하게는 3-50 nm, 더욱 바람직하게는 3-20 nm인 것이 바람직하다. 만약, 100 nm를 초과할 경우 세포사멸 등의 결과를 가져올 수 있다.The labeled nanoparticles for fluorescence imaging according to the present invention are preferably 3-100 nm, preferably 3-50 nm, more preferably 3-20 nm in consideration of cell injection. If it exceeds 100 nm, cell death may result.
본 발명에 따른 형광 이미징용 표지나노입자는 생체 이미징, 세포 이미징, 단분자 이미징 등에 사용할 수 있다.The labeled nanoparticles for fluorescent imaging according to the present invention can be used for biomedical imaging, cell imaging, monomolecular imaging, and the like.
상기 생체이미징은 본 발명에 따른 표지나노입자를 생체에 주입하여 타겟으로 하는 장기(organ)를 관찰할 수 있다. 이때 표지나노입자는 타겟으로 하는 장기에 따라서 그 구성을 최적화할 수 있다.In the biomedical imaging, the target nanoparticle according to the present invention can be injected into a living body to observe a target organ. At this time, the labeled nanoparticles can be optimally configured according to the target organs.
상기 세포 이미징은 암세포, 정상세포 또는 줄기세포에 적용할 수 있다. 암세포의 예로는 A549, Hela, MDA-MB-436, AGS, RKO, SK-MEL-2, SK-MEL-28, SNU8, PC9, HepG2, MDA-MB-231, TC1, HT-29, SH-SY5Y (neuroblastoma), LN-229 (glioblastoma), K563, HL-60 (Leukemia), primary cells: B16(melanoma), THP-1(leukemia), BMDC (bone marrow-derived cells) 등에 사용할 수 있다. 정상세포의 예로는 BEAS-2B, HEK293T 등에 사용할 수 있다. 줄기세포의 예로는 mESC 등에 사용할 수 있다.The cell imaging can be applied to cancer cells, normal cells or stem cells. Examples of cancer cells include A549, Hela, MDA-MB-436, AGS, RKO, SK-MEL-2, SK-MEL-28, SNU8, PC9, HepG2, MDA- And may be used for, for example, SY5Y (neuroblastoma), LN-229 (glioblastoma), K563, HL-60 (leukemia), primary cells B16 (melanoma), THP-1 (leukemia) and BMDC (bone marrow- Examples of normal cells include BEAS-2B, HEK293T, and the like. Examples of stem cells can be used for mESC and the like.
제조방법 1
본 발명은 하기 단계를 포함하는 형광 이미징용 표지나노입자의 제조방법 1을 제공한다. 제조방법 1에 대한 개략도를 도 1에 나타내었다.The present invention provides a
양친매성 트리블록공중합체를 정제수에 용해하여 중합체 용액을 준비하는 단계(단계 1);Preparing a polymer solution by dissolving the amphiphilic triblock copolymer in purified water (step 1);
유기형광염료를 유기 용매에 용해하여 염료 용액을 준비하는 단계(단계 2);Preparing a dye solution by dissolving the organic fluorescent dye in an organic solvent (step 2);
가교제를 유기용매에 용해하여 가교제 용액을 준비한 다음, 여기에 상기 단계 2에서 준비한 염료 용액을 첨가하고, 유기용매를 증발시켜 바이알 밑바닥에 가교제-염료 필름을 형성하는 단계(단계 3);Dissolving the cross-linking agent in an organic solvent to prepare a cross-linking agent solution, adding the dye solution prepared in
상기 단계 3의 바이알에 상기 단계 1에서 준비한 중합체 용액을 첨가하여 미셀 용액을 준비하는 단계(단계 4);Preparing a micellar solution by adding the polymer solution prepared in
가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계(단계 5); 및(Step 5) heating to 50-70 占 폚 above the critical micelle temperature of the amphiphilic triblock copolymer for internalization of the micelle core of the crosslinker; And
UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계(단계 6).UV is irradiated to cross-link the cross-linking agent encapsulated in the micelle to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure (step 6).
본 발명에 따른 제조방법 1에 있어서, 상기 단계 1은 양친매성 트리블록공중합체를 정제수에 용해하여 중합체 용액을 준비하는 단계이다. 상기 양친매성 트리블록공중합체의 예는 상술한 바와 같다.In the
본 발명에 따른 제조방법 1에 있어서, 상기 단계 2는 유기형광염료를 유기 용매에 용해하여 염료 용액을 준비하는 단계이다. 여기서, 상기 유기형광염료의 예는 상술한 바와 같고, 바람직하게는 파이렌, Lumogen F violet 570, 2,3-디메틸-5,8-디-티오펜-2-일퀴옥살린 (KIM A), 4,7-디-티오펜-2-일벤조[1,2,5]티아디아졸 (KIM B), 또는 Nile red를 사용할 수 있다. 상기 유기용매로는 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로카본, 헥산, 톨루엔, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 테트라하이드로퓨란 등을 사용할 수 있다.In the
상기 유기형광염료의 함량은 양친매성 트리블록공중합체 100 중량부 대비 0.12 중량부 이하, 바람직하게는 0.08-0.12 중량부로 사용할 수 있다. 만약, 0.12 중량부 초과할 경우 가교제 함유량이 적어져 안정성이 저하되거나 형광염료가 응집(aggregation)되어 광학적 성질이 저하되는 문제가 있을 수 있다.The content of the organic fluorescent dye may be 0.12 parts by weight or less, preferably 0.08-0.12 parts by weight, based on 100 parts by weight of the amphiphilic triblock copolymer. If the amount is more than 0.12 parts by weight, the content of the crosslinking agent may be decreased to lower the stability, or the fluorescent dye may be aggregated to deteriorate the optical properties.
본 발명에 따른 제조방법 1에 있어서, 상기 단계 3은 가교제를 유기용매에 용해하여 가교제 용액을 준비한 다음, 여기에 상기 단계 2에서 준비한 염료 용액을 첨가하고, 유기용매를 증발시켜 20 ml 바이알 밑바닥에 가교제-염료 필름을 형성하는 단계이다. 여기서, 가교제의 예는 상술한 바와 같고, 유기용매로는 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로카본, 헥산, 톨루엔, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 테트라하이드로퓨란 등을 사용할 수 있다. 상기 가교제의 함량은 트리블록공중합체 100 중량부 대비 2.3-3.0 중량부 사용하는 것이 바람직하다. 만약, 2.3 중량부 미만일 경우 미셀의 안정성이 유지되지 못하는 문제가 있을 수 있고, 3.0 중량부 초과할 경우 미셀 코어가 오그라지는 현상으로 인해 염료의 로딩 함량이 감소하는 문제가 있을 수 있다. In the
본 발명에 따른 제조방법 1에 있어서, 상기 단계 4는 상기 단계 3의 20 ml 바이알에 상기 단계 1에서 준비한 중합체 용액을 첨가하여 미셀 용액을 준비하는 단계이다. 여기서, 단계 4에서 준비한 UV 조사하기 전의 미셀 용액의 함량은 8-12 mL가 바람직하다. 만약, 8 mL 미만일 경우 임계미셀온도 이하에서 미셀의 안정성이 저하되는 문제가 있을 수 있고, 12 mL 초과할 경우 로딩이 원활하지 않은 문제가 있을 수 있다. 보다 적은 양의 제조에는 4 ml 바이알을 이용하여 1-2 ml 용액을 제조하며, 보다 많은 양의 제조에는 250 ml 이상의 초자를 이용하여 약 40-50% 의 용액 부피를 제조할 수 있다.In the
본 발명에 따른 제조방법 1에 있어서, 상기 단계 5는 가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도(Critical Micelle Temperature, CMT) 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계이다. 여기서, UV 조사 전에 단계 4에서 준비한 미셀 용액의 온도가 50℃ 미만일 경우 가교제의 라디칼 중합이 효과적으로 일어나지 못하는 문제가 있을 수 있고, 70℃ 초과할 경우 용액 내의 미셀들이 높은 온도에 의해 안정하지 않은 문제가 있을 수 있다.In the
본 발명에 따른 제조방법 1에 있어서, 상기 단계 6은 UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계이다. 여기서, UV 조사는 1-3 W/cm2 세기로 4-8분, 바람직하게는 5-7분, 특히 바람직하게는 6분 동안 조사할 수 있다. 만약, UV 조사 시간이 4분 미만일 경우 미셀 코어에 sIPN 구조 형성이 완전하지 않아 미셀의 안정성이 저하되는 문제가 있을 수 있고, 8분 초과일 경우 유기형광염료의 광퇴색이 발생하는 문제가 있을 수 있다. UV 조사 4분 미만의 제조법이 필요한 특수한 경우에는 광개시제 (벤조페논 등)를 사용하여 단축할 수 있다.In the
제조방법 2
본 발명은 하기 단계를 포함하는 형광 이미징용 표지나노입자의 제조방법 2를 제공한다. 제조방법 2에 대한 개략도를 도 2에 나타내었다.The present invention provides a
유기형광염료를 유기용매에 용해하고, 용매를 모두 증발시킨 바이알 A를 준비하는 단계(단계 1);Preparing a vial A by dissolving the organic fluorescent dye in an organic solvent and evaporating all of the solvent (Step 1);
가교제를 유기용매에 용해하고, 용매를 모두 증발시킨 바이알 B를 준비하는 단계(단계 2);Dissolving the cross-linking agent in an organic solvent, and preparing vial B in which all of the solvent is evaporated (Step 2);
양친매성 트리블록공중합체를 정제수에 용해하여 중합체 용액을 준비하는 단계(단계 3);Preparing a polymer solution by dissolving the amphiphilic triblock copolymer in purified water (step 3);
상기 단계 3에서 준비한 중합체 용액을 단계 1의 바이알 A에 붓고 혼합하는 단계(단계 4);Pouring the polymer solution prepared in
상기 단계 4에서 준비한 용액을 단계 2에서 준비한 바이알 B에 붓는 단계(단계 5);Pouring the solution prepared in the
가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계(단계 6); 및Heating (step 6) to 50-70 DEG C above the critical micelle temperature of the amphiphilic triblock copolymer for internalization of the micelle core of the crosslinker; And
UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계(단계 7).UV is irradiated to cross-link the cross-linking agent encapsulated in the micelle to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure (Step 7).
본 발명에 따른 제조방법 2에 있어서, 상기 단계 1은 유기형광염료를 유기용매에 용해하고, 용매를 모두 증발시킨 바이알 A를 준비하는 단계이다. 여기서, 상기 유기형광염료의 예는 상술한 바와 같고, 바람직하게는 상기 유기형광염료는 3-티오펜헥실, Lumogen F yellow 083, Lumogen F orange 240, 나프토티아디아졸, Lumogen red 350, 또는 Se-벤조티아디아졸을 사용할 수 있다. 상기 유기용매로는 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로카본, 헥산, 톨루엔, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 테트라하이드로퓨란 등을 사용할 수 있다.In the
상기 유기형광염료의 함량은 양친매성 트리블록공중합체 100 중량부 대비 0.12 중량부 이하, 바람직하게는 0.08-0.12 중량부로 사용할 수 있다. 만약, 0.12 중량부 초과할 경우 가교제 함유량이 적어져 안정성이 저하되거나 형광염료가 응집(aggregation) 되어 광학적 성질이 저하되는 문제가 있을 수 있다.The content of the organic fluorescent dye may be 0.12 parts by weight or less, preferably 0.08-0.12 parts by weight, based on 100 parts by weight of the amphiphilic triblock copolymer. If the amount is more than 0.12 parts by weight, the content of the crosslinking agent may be decreased to lower the stability, or the fluorescent dye may be aggregated to deteriorate the optical properties.
본 발명에 따른 제조방법 2에 있어서, 상기 단계 2는 가교제를 유기용매에 용해하고, 용매를 모두 증발시킨 바이알 B를 준비하는 단계이다. 여기서, 가교제의 예는 상술한 바와 같고, 유기용매로는 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로카본, 헥산, 톨루엔, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 테트라하이드로퓨란 등을 사용할 수 있다. 상기 가교제의 함량은 양친매성 트리블록공중합체 100 중량부 대비 2.3-3.0 중량부 사용하는 것이 바람직하다. 만약, 2.3 중량부 미만일 경우 미셀의 안정성이 유지되지 못하는 문제가 있을 수 있고, 3.0 중량부 초과할 경우 미셀 코어가 오그라지는 현상으로 인해 염료의 로딩 함량이 감소하는 문제가 있을 수 있다. In the
본 발명에 따른 제조방법 2에 있어서, 상기 단계 3은 양친매성 트리블록공중합체를 정제수에 용해하여 중합체 용액을 준비하는 단계이다. 상기 양친매성 트리블록공중합체의 예는 상술한 바와 같다. In the
본 발명에 따른 제조방법 2에 있어서, 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 준비한 중합체 용액을 단계 1의 바이알 A에 붓고 혼합하는 단계이다.In the
본 발명에 따른 제조방법 2에 있어서, 상기 단계 5는 상기 단계 4에서 준비한 용액을 단계 2에서 준비한 바이알 B에 붓는 단계이다. 여기서, 단계 5에서 준비한 UV 조사하기 전의 미셀 용액의 함량은 8-12 mL가 바람직하다. 만약, 8 mL 미만일 경우 임계미셀온도 이하에서 미셀의 안정성이 저하되는 문제가 있을 수 있고, 12 mL 초과할 경우 로딩이 원활하지 않은 문제가 있을 수 있다. 보다 적은 양의 제조에는 4 ml 바이알을 이용하여 1-2 ml 용액을 제조하며, 보다 많은 양의 제조에는 250 ml 이상의 초자를 이용하여 약 40-50% 의 용액 부피를 제조할 수 있다.In the
본 발명에 따른 제조방법 2에 있어서, 상기 단계 6은 제조방법 1의 단계 5와 동일하고, 상기 단계 7은 제조방법 1의 단계 6과 동일하다.In
제조방법 3
본 발명은 하기 단계를 포함하는 형광 이미징용 표지나노입자의 제조방법 3을 제공한다. 제조방법 3에 대한 개략도를 도 3에 나타내었다.The present invention provides a
양친매성 트리블록공중합체를 유기용매에 용해하고, 여기에 유기형광염료를 혼합한 다음 유기용매를 증발시켜, 중합체-염료 필름을 밑바닥에 형성시킨 바이알 A를 준비하는 단계(단계 1);Preparing a vial A in which an amphiphilic triblock copolymer is dissolved in an organic solvent, an organic fluorescent dye is mixed with the organic fluorescent dye, and the organic solvent is then evaporated to form a polymer-dye film on the bottom (Step 1);
상기 단계 1의 바이알 A에 정제수를 붓고, 초음파 처리하고 교반한 다음, 실린지 필터로 여과하는 단계(단계 2);Pouring purified water into the vial A of the
가교제를 유기용매에 용해시킨 다음, 유기용매를 증발시켜 가교제 필름을 밑바닥에 형성시킨 바이알 B를 준비하는 단계(단계 3);Dissolving the crosslinking agent in an organic solvent, and then evaporating the organic solvent to prepare a vial B having a crosslinker film formed on the bottom thereof (Step 3);
단계 2에서 준비한 용액을 단계 3의 바이알 B에 붓고 교반하는 단계(단계 4);Pouring the solution prepared in
가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계(단계 5); 및(Step 5) heating to 50-70 占 폚 above the critical micelle temperature of the amphiphilic triblock copolymer for internalization of the micelle core of the crosslinker; And
UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계(단계 6).UV is irradiated to cross-link the cross-linking agent encapsulated in the micelle to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure (step 6).
본 발명에 따른 제조방법 3에 있어서, 상기 단계 1은 양친매성 트리블록공중합체를 유기용매에 용해하고, 여기에 유기형광염료를 혼합한 다음 유기용매를 증발시켜, 중합체-염료 필름을 밑바닥에 형성시킨 바이알 A를 준비하는 단계이다. 상기 양친매성 트리블록공중합체의 예는 상술한 바와 같다. 상기 유기형광염료의 예는 상술한 바와 같고, 바람직하게는 프탈로시아닌을 사용할 수 있다. 상기 유기용매로는 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로카본, 헥산, 톨루엔, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 테트라하이드로퓨란 등을 사용할 수 있다.In the
상기 유기형광염료의 함량은 양친매성 트리블록공중합체 100 중량부 대비 0.12 중량부 이하, 바람직하게는 0.08-0.12 중량부로 사용할 수 있다. 만약, 0.12 중량부 초과할 경우 가교제 함유량이 적어져 안정성이 저하되거나 형광염료가 응집(aggregation) 되어 광학적 성질이 저하되는 문제가 있을 수 있다.The content of the organic fluorescent dye may be 0.12 parts by weight or less, preferably 0.08-0.12 parts by weight, based on 100 parts by weight of the amphiphilic triblock copolymer. If the amount is more than 0.12 parts by weight, the content of the crosslinking agent may be decreased to lower the stability, or the fluorescent dye may be aggregated to deteriorate the optical properties.
본 발명에 따른 제조방법 3에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1의 바이알 A에 정제수를 붓고, 초음파 처리하고 교반한 다음, 실린지 필터로 여과하는 단계이다. 여기서 상기 실린지 필터는 0.2-0.5㎛를 사용할 수 있다.In the
본 발명에 따른 제조방법 3에 있어서, 상기 단계 3은 가교제를 유기용매에 용해시킨 다음, 유기용매를 증발시켜 가교제 필름을 밑바닥에 형성시킨 바이알 B를 준비하는 단계이다. 여기서, 가교제의 예는 상술한 바와 같고, 유기용매로는 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로카본, 헥산, 톨루엔, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 테트라하이드로퓨란 등을 사용할 수 있다. 상기 가교제의 함량은 양친매성 트리블록공중합체 100 중량부 대비 2.3-3.0 중량부 사용하는 것이 바람직하다. 만약, 2.3 중량부 미만일 경우 미셀의 안정성이 유지되지 못하는 문제가 있을 수 있고, 3.0 중량부 초과할 경우 미셀 코어가 오그라지는 현상으로 인해 염료의 로딩 함량이 감소하는 문제가 있을 수 있다.In the
본 발명에 따른 제조방법 3에 있어서, 상기 단계 4는 단계 2에서 준비한 용액을 단계 3의 바이알 B에 붓고 교반하는 단계이다. In the
본 발명에 따른 제조방법 3에 있어서, 상기 단계 5는 제조방법 1의 단계 5와 동일하고, 상기 단계 6은 제조방법 1의 단계 6과 동일하다.In
본 발명에 따른 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조가 코어에 형성된 형광 이미징용 표지나노입자는 다양한 소수성 유기형광염료를 적용가능하고, 미셀 코어에 sIPN 구조가 형성됨에 따라서 미셀의 안정성이 현저히 향상되는 효과가 있으며, 생체이미징시에 종래 염료에 비해 체내 순환시간이 향상되고, BBB(blood brain barrier)를 통과할 수 있어 뇌 진단에도 사용될 수 있는 효과가 있다.The labeled nanoparticles for fluorescence imaging in which the sIPN (Semi-Interpenetrating Network) structure according to the present invention is formed on the core can be applied to various hydrophobic organic fluorescent dyes, and the stability of the micelles can be remarkably improved as the sIPN structure is formed in the micelle cores And has an effect of improving the circulation time in the body as compared with the conventional dyes in the case of biological imaging, passing through the blood brain barrier (BBB), and being used for brain diagnosis.
제조방법 4
본 발명은 하기 단계를 포함하는 형광 이미징용 표지나노입자의 제조방법 4를 제공한다.The present invention provides a
양친매성 트리블록공중합체를 유기용매에 용해하고, 여기에 유기형광염료를 함께 혼합한 용액 A를 준비하는 단계(단계 1);Preparing a solution A in which an amphiphilic triblock copolymer is dissolved in an organic solvent and an organic fluorescent dye is mixed therewith (step 1);
상기 단계 1의 용액 A에서 유기용매와 정제수가 투석 멤브레인을 통해 빠져나오고 들어가는 평형과정을 통해 양친매성 트리블록공중합체 중심에 유기형광염료가 내재된 수용액 B 를 준비하는 단계(단계 2);Preparing an aqueous solution B containing an organic fluorescent dye at the center of the amphiphilic triblock copolymer through an equilibrium process in which the organic solvent and the purified water are passed through the dialysis membrane in the solution A of the step 1 (step 2);
가교제를 유기용매에 용해시킨 다음, 유기용매를 증발시켜 가교제 필름을 밑바닥에 형성시킨 바이알 B를 준비하는 단계(단계 3);Dissolving the crosslinking agent in an organic solvent, and then evaporating the organic solvent to prepare a vial B having a crosslinker film formed on the bottom thereof (Step 3);
단계 2에서 준비한 수용액 B를 단계 3의 바이알 B에 붓고 교반하는 단계(단계 4);Pouring the aqueous solution B prepared in
가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계(단계 5); 및(Step 5) heating to 50-70 占 폚 above the critical micelle temperature of the amphiphilic triblock copolymer for internalization of the micelle core of the crosslinker; And
UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계(단계 6).UV is irradiated to cross-link the cross-linking agent encapsulated in the micelle to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure (step 6).
본 발명에 따른 제조방법 4에 있어서, 상기 단계 1은 양친매성 트리블록공중합체를 유기용매에 용해하고, 여기에 유기형광염료를 함께 혼합한 용액 A를 준비하는 단계이다. 상기 양친매성 트리블록공중합체의 예는 상술한 바와 같다. 상기 유기형광염료의 예는 상술한 바와 같고, 바람직하게는 프탈로시아닌을 사용할 수 있다. 상기 유기용매로는 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로카본, 헥산, 톨루엔, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 테트라하이드로퓨란 등을 사용할 수 있다.In
상기 유기형광염료의 함량은 양친매성 트리블록공중합체 100 중량부 대비 0.12 중량부 이하, 바람직하게는 0.08-0.12 중량부로 사용할 수 있다. 만약, 0.12 중량부 초과할 경우 가교제 함유량이 적어져 안정성이 저하되거나 형광염료가 응집(aggregation) 되어 광학적 성질이 저하되는 문제가 있을 수 있다.The content of the organic fluorescent dye may be 0.12 parts by weight or less, preferably 0.08-0.12 parts by weight, based on 100 parts by weight of the amphiphilic triblock copolymer. If the amount is more than 0.12 parts by weight, the content of the crosslinking agent may be decreased to lower the stability, or the fluorescent dye may be aggregated to deteriorate the optical properties.
본 발명에 따른 제조방법 4에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1의 용액 A에서 유기용매와 정제수가 투석 멤브레인을 통해 빠져나오고 들어가는 평형과정을 통해 양친매성 트리블록공중합체 중심에 유기형광염료가 내재된 수용액 B 를 준비하는 단계이다. 구체적으로, 단계 1의 용액 A를 투석 멤브레인이 구비된 용기의 한쪽에 붓고, 투석 멤브레인의 반대쪽에 정제수를 부어, 용액 A의 유기용매와 정제수가 서로 평형과정이 일어나도록 유도하여 수용액 B를 준비할 수 있다.In the
본 발명에 따른 제조방법 4에 있어서, 상기 단계 3은 가교제를 유기용매에 용해시킨 다음, 유기용매를 증발시켜 가교제 필름을 밑바닥에 형성시킨 바이알 B를 준비하는 단계이다. 여기서, 가교제의 예는 상술한 바와 같고, 유기용매로는 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로카본, 헥산, 톨루엔, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 테트라하이드로퓨란 등을 사용할 수 있다. 상기 가교제의 함량은 양친매성 트리블록공중합체 100 중량부 대비 2.3-3.0 중량부 사용하는 것이 바람직하다. 만약, 2.3 중량부 미만일 경우 미셀의 안정성이 유지되지 못하는 문제가 있을 수 있고, 3.0 중량부 초과할 경우 미셀 코어가 오그라지는 현상으로 인해 염료의 로딩 함량이 감소하는 문제가 있을 수 있다.In the
본 발명에 따른 제조방법 4에 있어서, 상기 단계 4는 단계 2에서 준비한 수용액 B를 단계 3의 바이알 B에 붓고 교반하는 단계이다.In the
본 발명에 따른 제조방법 4에 있어서, 상기 단계 5는 제조방법 1의 단계 5와 동일하고, 상기 단계 6은 제조방법 1의 단계 6과 동일하다.In
제조방법 5
본 발명은 하기 단계를 포함하는 형광 이미징용 표지나노입자의 제조방법 5를 제공한다.The present invention provides a
양친매성 트리블록공중합체와 유기형광염료를 고체상태에서 용융하여 혼합한 다음 밑바닥에 형성시킨 바이알 A를 준비하는 단계(단계 1);Preparing a vial A formed at the bottom by melting the amphiphilic triblock copolymer and the organic fluorescent dye in a solid state and mixing them (Step 1);
상기 단계 1의 바이알 A에 가교제를 혼합하여 바이알 B를 준비하는 단계(단계 2);Preparing a vial B by mixing a cross-linking agent in the vial A of the step 1 (step 2);
상기 단계 2의 바이알 B에 정제수를 붓고, 초음파 처리하고 교반한 다음, 실린지 필터로 여과하는 단계(단계 3);Pouring purified water into vial B of
가교제의 미셀 코어 내재화(internalization)를 위해 양친매성 트리블록공중합체의 임계미셀온도 보다 높은 50-70℃로 가열하는 단계(단계 4); 및Heating (step 4) to 50-70 DEG C above the critical micelle temperature of the amphiphilic triblock copolymer for internalization of the micelle core of the cross-linking agent; And
UV를 조사하여 미셀 내부에 봉입된 가교제를 가교하여 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 단계(단계 5).UV is irradiated to cross-link the cross-linking agent encapsulated in the micelle to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure (Step 5).
본 발명에 따른 제조방법 5에 있어서, 상기 단계 1은 양친매성 트리블록공중합체와 유기형광염료를 고체상태에서 용융하여 혼합한 다음 밑바닥에 형성시킨 바이알 A를 준비하는 단계이다. 상기 양친매성 트리블록공중합체의 예는 상술한 바와 같다. 상기 유기형광염료의 예는 상술한 바와 같고, 바람직하게는 프탈로시아닌을 사용할 수 있다.In the
상기 유기형광염료의 함량은 양친매성 트리블록공중합체 100 중량부 대비 0.12 중량부 이하, 바람직하게는 0.08-0.12 중량부로 사용할 수 있다. 만약, 0.12 중량부 초과할 경우 가교제 함유량이 적어져 안정성이 저하되거나 형광염료가 응집(aggregation) 되어 광학적 성질이 저하되는 문제가 있을 수 있다.The content of the organic fluorescent dye may be 0.12 parts by weight or less, preferably 0.08-0.12 parts by weight, based on 100 parts by weight of the amphiphilic triblock copolymer. If the amount is more than 0.12 parts by weight, the content of the crosslinking agent may be decreased to lower the stability, or the fluorescent dye may be aggregated to deteriorate the optical properties.
본 발명에 따른 제조방법 5에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1의 바이알 A에 가교제를 혼합하여 바이알 B를 준비하는 단계이다. 여기서, 가교제의 예는 상술한 바와 같다. 상기 가교제의 함량은 양친매성 트리블록공중합체 100 중량부 대비 2.3-3.0 중량부 사용하는 것이 바람직하다. 만약, 2.3 중량부 미만일 경우 미셀의 안정성이 유지되지 못하는 문제가 있을 수 있고, 3.0 중량부 초과할 경우 미셀 코어가 오그라지는 현상으로 인해 염료의 로딩 함량이 감소하는 문제가 있을 수 있다.In the
본 발명에 따른 제조방법 5에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2의 바이알 B에 정제수를 붓고, 초음파 처리하고 교반한 다음, 실린지 필터로 여과하는 단계이다. 여기서 상기 실린지 필터는 0.2-0.5㎛를 사용할 수 있다.In the
본 발명에 따른 제조방법 5에 있어서, 상기 단계 4는 제조방법 1의 단계 5와 동일하고, 상기 단계 5는 제조방법 1의 단계 6과 동일하다.In
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
<< 제조예Manufacturing example 1> 'F127' 1> 'F127' 양말단Sock end 하이드록시기의Hydroxy-group 아민Amine 개질 (F127-NH Modification (F127-NH2 22 ))
참조문헌(Chem . Commun . 2010, 46 (27), 4935-4937)에 공지되어 있는 하기 방법을 이용하여, 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)의 양말단 하이드록시기를 아민기로 개질하였다.The terminal hydroxyl group of Pluronic F127 (EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) was reacted with a hydroxyl group of the formula (I) using the following method known from the reference ( Chem . Commun . 2010 , 46 (27) , 4935-4937) Amine groups.
<< 제조예Manufacturing example 2> 'F127' 2> 'F127' 양말단Sock end 하이드록시기의Hydroxy-group 카르복실산Carboxylic acid 개질 (F127- Modification (F127- COOHCOOH ))
참조문헌(J Nanomedic Nanotechnol, 2011 2 (114) 2157-7439)에 공지되어 있는 하기 방법을 이용하여, 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)의 양말단 하이드록시기를 카르복실산기로 개질하였다.Reference literature ( J Nanomedic Both end hydroxyl groups of Pluronic F127 (EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) were modified to carboxylic acid groups using the following method, known in the art, Nanotechnol , 2011 2 (114) 2157-7439.
<< 제조예Manufacturing example 3> 'F127' 3> 'F127' 양말단Sock end 하이드록시기의Hydroxy-group 포스페이트Phosphate 개질 (F127-PO(OH) The modification (F127-PO (OH) 22 ))
참조문헌(Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2014 58 (2), 966 -977)에 공지되어 있는 하기 방법을 이용하여, 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)의 양말단 하이드록시기를 포스페이트기로 개질하였다.(EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) using the following method, known in the art ( Antimicrobial Agents and Chemotherapy , 2014 58 (2), 966-977) Phosphate group.
<< 제조예Manufacturing example 4> 'F127' 4> 'F127' 양말단Sock end 하이드록시기의Hydroxy-group 트리메틸암모늄Trimethylammonium 개질 (F127-N(CH Modification (F127-N (CH 33 )) 33 Br)Br)
참조문헌(Bioorg . Med . Chem . Lett ., 2003, 13 (7), 1381-1384)에 공지되어 있는 하기 방법을 이용하여, 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)의 양말단 하이드록시기를 트리메틸암모늄기로 개질하였다.(EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600), using the following method known in the literature ( Bioorg . Med . Chem . Lett . , 2003 , 13 (7), 1381-1384) Both ends hydroxy groups were modified with trimethylammonium groups.
<< 제조예Manufacturing example 5> 'F127' 5> 'F127' 양말단Sock end 하이드록시기의Hydroxy-group NHSNHS 에스테르 개질 (F127- Ester modification (F127- NHSNHS ester) ester)
참조문헌(RSC Adv ., 2014 20 (4), 10076-10089)에 공지되어 있는 하기 방법을 이용하여, 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)의 양말단 하이드록시기를 NHS 에스테르기로 개질하였다. NHS 에스테르는 1차 아민을 가진 말레이미드(maleimide)로 변환할 수 있다.The end-capped hydroxy group of Pluronic F127 (EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) was reacted with NHS (MW = 12600) using the following method, known in the reference ( RSC Adv . , 2014 20 (4) , 10076-10089) Ester group. NHS esters can be converted to maleimides with primary amines.
<< 제조예Manufacturing example 6> 'F127' 6> 'F127' 양말단Sock end 하이드록시기의Hydroxy-group 엽산 개질 (F127-엽산) Folic acid modification (F127-folic acid)
참조문헌(Biomaterials, 2009, 30 (28), 5114-5124)에 공지되어 있는 하기 방법을 이용하여, 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)의 양말단 하이드록시기를 엽산으로 개질하였다.The end-stage hydroxyl groups of Pluronic F127 (EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) were converted into folic acid using the following method known from the reference ( Biomaterials , 2009 , 30 (28) , 5114-5124) Lt; / RTI >
<< 제조예Manufacturing example 7> 'F127' 7> 'F127' 양말단Sock end 하이드록시기의Hydroxy-group 바이오틴Biotin 개질 (F127- Modification (F127- 바이오틴Biotin ))
참조문헌(Journal of AppliedPolymer Science, 2010, 115 (3), 1573-1580)에 공지되어 있는 하기 방법을 이용하여, 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)의 양말단 하이드록시기를 바이오틴으로 개질하였다.References ( Journal of Applied Polymer Science , 2010 , 115 (3) , (EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) was modified with biotin using both methods described below.
<< 제조예Manufacturing example 8> 'F127' 8> 'F127' 양말단Sock end 하이드록시기의Hydroxy-group 리포산 개질 (F127-리포산) Lipoic acid modification (F127-Lipoic acid)
참조문헌(Journal of AppliedPolymer Science, 2010, 115 (3), 1573-1580)에 공지되어 있는 하기 방법을 이용하여, 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)의 양말단 하이드록시기를 리포산으로 개질하였다.References ( Journal of Applied Polymer Science , 2010 , 115 (3) , (EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) was modified to a lipoic acid using both methods described below.
<< 제조예Manufacturing example 9> 'F127' 9> 'F127' 양말단Sock end 하이드록시기의Hydroxy-group 티올Thiol 개질 (F127- Modification (F127- SHSH ))
참조문헌(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 1381-1384)에 공지되어 있는 하기 방법을 이용하여, 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)의 양말단 하이드록시기를 티올로 개질하였다.(EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) using the following method, which is known from the reference ( Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 1381-1384) Thiol.
<< 제조예Manufacturing example 10> 'F127' 10> 'F127' 양말단Sock end 하이드록시기의Hydroxy-group 설폰산Sulfonic acid 개질 (F127- Modification (F127- SOSO 33 HH ))
참조문헌(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 1381-1384)에 공지되어 있는 하기 방법을 이용하여, 플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600)의 양말단 하이드록시기를 설폰산으로 개질하였다.(EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) using the following method, which is known from the reference ( Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 1381-1384) Sulfonic acid.
<< 실시예Example 1> 1> 파이렌Pyrene 함유한 'F127- The 'F127- pypy -- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
단계 1-4: 'F127-Step 1-4: 'F127- pypy -- PETAPETA ( ( 미셀Micelle ) 용액'의 준비) Solution '
플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600) 5 g을 팔콘튜브에 담고 정제수 45 g을 첨가하여 'F127 용액'을 준비하였다. 상기 F127 용액을 완전한 용해를 위해 냉장고에 하룻밤 동안 두었다.5 g of pluronic F127 (EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) was placed in a falcon tube and 45 g of purified water was added to prepare a 'F127 solution'. The F127 solution was left in the refrigerator overnight for complete dissolution.
미셀 내부 소수성 환경에 존재하는 것을 추적하기 위한 형광 프로브로서 파이렌(Pyrene)을 사용하였다. 파이렌 10 mg을 아세톤 5 mL에 용해하여 '파이렌 용액' (2 mg/mL)을 깨끗한 바이알에 준비하였다.Pyrene was used as a fluorescent probe to track what is present in the micelle internal hydrophobic environment. 10 mg of pyrene was dissolved in 5 mL of acetone and a pyrene solution (2 mg / mL) was prepared in a clean vial.
PETA (Pentaerythritol tetraacrylate) 1 g을 아세톤에 용해하여, 총용량이 10 mL가 되도록 'PETA 용액' (100 mg/mL)을 준비하였다.A PETA solution (100 mg / mL) was prepared by dissolving 1 g of PETA (Pentaerythritol tetraacrylate) in acetone to a total volume of 10 mL.
상기 PETA 용액 0.25 mL를 깨끗한 바이알에 담겨 있는 상기 파이렌 용액 0.5 mL에 부은 다음, 상온(25℃)에서 하룻밤 동안 용매를 증발시켜, 바이알의 밑바닥에 'PETA-파이렌 필름'을 형성시켰다.0.25 mL of the PETA solution was poured into 0.5 mL of the pyrene solution in a clean vial, and then the solvent was evaporated overnight at room temperature (25 캜) to form a PETA-pyrene film at the bottom of the vial.
상기 PETA-파이렌 필름이 밑바닥에 형성된 바이알에 상기 F127 용액 10 mL를 첨가하고, 상온에서 하룻밤 동안 쉐이커(200rpm)로 혼합하여, 'F127-py-PETA 용액'을 준비하였다. 상기 'F127-py-PETA 용액'은 플루로닉 F127 1 g(10% w/w, volume 10 mL), 파이렌 1 mg 및 PETA 25 mg으로 구성된다.10 mL of the F127 solution was added to the bottom of the PETA-pyrene film, and the solution was mixed with a shaker (200 rpm) at room temperature overnight to prepare a 'F127-py-PETA solution'. The 'F127-py-PETA solution' consists of 1 g of pluronic F127 (10% w / w,
단계 5-6: UV 조사를 통한 Step 5-6: UV irradiation PETAPETA 가교로 'F127- The bridge 'F127- pypy -- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
플루로닉 F127에 의해 형성된 미셀 코어에 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하기 위하여 UV 조사를 실시하였다. 여기서, UV 조사기는 "Lumen Dynamic (OmniCure series 2000, filter 320-500 nm)" 장치를 이용하였고, 조작 조건은 1.5 W/cm2 세기로 6분 동안 조사하였다. 여기서, UV 조사 전에 상기에서 준비한 'F127-py-PETA 용액'에 아르곤 가스를 주입하였다.UV irradiation was performed to form a semi-interpenetrating network (sIPN) structure on the micelle core formed by Pluronic F127. Here, the UV irradiator was a "Lumen Dynamic (OmniCure series 2000, filter 320-500 nm)" apparatus, and the operating conditions were irradiated for 6 minutes at 1.5 W / cm 2 intensity. Here, argon gas was injected into the 'F127-py-PETA solution' prepared before UV irradiation.
PETA (Pentaerythritol tetraacrylate)의 미셀 코어 내재화(internalization)를 향상하기 위해, UV 조사 전에 'F127-py-PETA 용액'의 온도를 CMT(Critical Micelle Temperature) (50℃) 보다 높도록 10분간 올렸다.Prior to UV irradiation, the temperature of 'F127-py-PETA solution' was elevated to above the critical micelle temperature (CMC) (50 ° C) for 10 minutes in order to improve the internalization of the micelle core of PETA (Pentaerythritol tetraacrylate).
최종생성물을 0.2㎛ 실린지 필터(Ministart® Sartorius Stedium)로 여과하여 'F127-py-PETA sIPN 미셀'을 제조하였고, 이를 깨끗한 바이알에 보관하였다.The final product was filtered with a 0.2 μm syringe filter (Ministart ® Sartorius Stedium) to prepare 'F127-py-PETA sIPN micelle', which was stored in a clean vial.
본 실시예 1에 대한 제법 1의 개략도를 도 1에 나타내었다.Fig. 1 shows a schematic view of
<< 실시예Example 2> 2> LumogenLumogen ®® F violet 570을 함유한 'F127-violet- F violet 570 " F127-violet- PETAPETA sIPNsIPN 미beauty 셀'의 제조Manufacture of cell '
실시예 1의 단계 1에서 형광 염료로 파이렌 대신 Lumogen® F violet 570을 사용한 것과, 형광 염료를 용해하는 용매로 아세톤 대신 클로로포름을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 'F127-violet-PETA sIPN 미셀'을 제조하였다.The procedure of Example 1 was repeated except that Lumogen ® F violet 570 was used instead of pyrene as a fluorescent dye in
<< 실시예Example 3> 3- 3> 3- 티오펜헥실을Thiophene hexyl 함유한 'F127- The 'F127- ThioThio -- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
단계 1-5: 'F127-Step 1-5: 'F127- ThioThio -- PETAPETA 용액'의 준비 Preparation of solution
3-티오펜헥실 1 mg을 클로로포름에 용해하여 20 mL 용량의 '바이알 A'에 두고 용매를 상온에서 모두 증발시켰다. 1 mg of 3-thiophenehexyl was dissolved in chloroform and placed in a vial A of 20 mL, and the solvent was evaporated at room temperature.
또 다른 20 mL 용량의 '바이알 B'에 PETA (Pentaerythritol tetraacrylate) 25 mg을 아세톤에 용해한 다음 용매를 상온에서 모두 증발시켰다.25 mL of PETA (Pentaerythritol tetraacrylate) was dissolved in another 20 mL volume of 'Vial B' in acetone, and the solvent was evaporated at room temperature.
플루로닉 F127 (EO98PO67EO98, MW=12600) 5 g을 팔콘튜브에 담고 정제수 45 g을 첨가하여 'F127 용액'을 준비하고, 이를 상기 바이알 A에 첨가하고 30℃에서 5분간 초음파 처리하여 혼합하고, 용해를 위해 40℃에서 15분간 열을 가하고 쉐이커로 하룻밤 동안 교반하였다.5 g of Pluronic F127 (EO 98 PO 67 EO 98 , MW = 12600) was added to a falcon tube and 45 g of purified water was added thereto to prepare an 'F127 solution.' This was added to the vial A and ultrasonicated Treated, mixed, heated at 40 占 폚 for dissolving for 15 minutes, and stirred with a shaker overnight.
다음으로, 바이알 A의 F127-염료 혼합용액을 상기 바이알 B에 붓고, 쉐이커(200 rpm)로 하룻밤 동안 교반하였다. Next, the F127-dye mixed solution of vial A was poured into the vial B and stirred with a shaker (200 rpm) overnight.
단계 6-7: UV 조사를 통한 Step 6-7: UV irradiation PETAPETA 가교로 'F127- The bridge 'F127- ThioThio -- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
UV 조사 단계는 실시예 1의 단계 2와 동일하게 실시하여, 'F127-Thio-PETA sIPN 미셀'을 제조하였고, 이를 깨끗한 바이알에 보관하였다.The UV irradiation step was carried out in the same manner as in
본 실시예 3에 대한 제법 2의 개략도를 도 2에 나타내었다.Fig. 2 shows a schematic view of
<< 실시예Example 4> 4> LumogenLumogen ®® F yellow 083을 함유한 'F127-yellow- F yellow 083 'F127-yellow- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
실시예 3의 단계 1에서 형광 염료로 파이렌 대신 3-티오펜헥실을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 'F127-yellow-PETA sIPN 미셀'을 제조하였다.F127-yellow-PETA sIPN micelles were prepared in the same manner as in Example 3 except that 3-thiophenehexyl was used instead of pyrene as a fluorescent dye in
<< 실시예Example 5> KIM A를 함유한 'F127-KIM A- 5 > > F127-KIM A- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
실시예 1의 단계 1에서 형광 염료로 파이렌 대신 KIM A (2,3-Dimethyl-5,8-di-thiophen-2-ylquioxaline)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 'F127-KIM A-PETA sIPN 미셀'을 제조하였다.The procedure of Example 1 was repeated except that KIM A (2,3-Dimethyl-5,8-di-thiophen-2-ylquioxaline) was used instead of pyrene as the fluorescent dye in
<< 실시예Example 6> 6> LumogenLumogen ®® F orange 240을 함유한 'F127-orange- F orange-containing " F127-orange- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
실시예 3의 단계 1에서 형광 염료로 파이렌 대신 Lumogen® F orange 240을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 'F127-orange-PETA sIPN 미셀'을 제조하였다.F127-orange-PETA sIPN micelles were prepared in the same manner as in Example 3, except that Lumogen ® F orange 240 was used instead of pyrene as a fluorescent dye in
<< 실시예Example 7> 7> 나프토티아디아졸을Naphthothiadiazole 함유한 'F127-Nap- ≪ RTI ID = 0.0 > F127-Nap- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
실시예 3의 단계 1에서 형광 염료로 파이렌 대신 나프토티아디아졸을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 'F127-Nap-PETA sIPN 미셀'을 제조하였다.'F127-Nap-PETA sIPN micelle' was prepared in the same manner as in Example 3, except that naphthothiadiazole was used instead of pyrene as a fluorescent dye in
<< 실시예Example 8> KIM B를 함유한 'F127-KIM B- 8 > KIM B-containing F127-KIM B- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
실시예 1의 단계 1에서 형광 염료로 파이렌 대신 KIM B (4,7-Di-thiophen-2-ylbenzo[1,2,5]thiadiazole)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 'F127-KIM B-PETA sIPN 미셀'을 제조하였다.The procedure of Example 1 was repeated except that KIM B (4,7-Di-thiophen-2-ylbenzo [1,2,5] thiadiazole) was used instead of pyrene as a fluorescent dye in
<< 실시예Example 9> 9> LumogenLumogen ®® red 350을 함유한 'F127-red- The 'F127-red- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
실시예 3의 단계 1에서 형광 염료로 파이렌 대신 Lumogen® red 350을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 'F127-red-PETA sIPN 미셀'을 제조하였다.'F127-red-PETA sIPN micelle' was prepared in the same manner as in Example 3, except that Lumogen ® red 350 was used instead of pyrene as a fluorescent dye in
<< 실시예Example 10> Se- 10> Se- 벤조티아디아졸을Benzothiadiazole 함유한 'F127-Se- ≪ RTI ID = 0.0 > F127-Se- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
실시예 3의 단계 1에서 형광 염료로 파이렌 대신 Se-벤조티아디아졸을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 'F127-Se-PETA sIPN 미셀'을 제조하였다.'F127-Se-PETA sIPN micelle' was prepared in the same manner as in Example 3, except that Se-benzothiadiazole was used instead of pyrene as a fluorescent dye in
<< 실시예Example 11> Nile red를 함유한 'F127-Nile- 11> Nile red containing 'F127-Nile- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
실시예 1의 단계 1에서 형광 염료로 파이렌 대신 Nile red를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 'F127-Nile-PETA sIPN 미셀'을 제조하였다.'F127-Nile-PETA sIPN micelle' was prepared in the same manner as in Example 1 except that Nile red was used instead of pyrene as a fluorescent dye in
<< 실시예Example 12> 12> 프탈로시아닌을Phthalocyanine 함유한 'F127- The 'F127- PcPc -- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
단계 1-4: 'F127-Step 1-4: 'F127- PcPc -- PETAPETA 용액'의 준비 Preparation of solution
20 mL 용량의 '바이알 A'에 풀루로닉 F127 500 mg이 클로로포름에 용해된 용액을 붓고, 클로로포름에 용해된 프탈로시아닌(Pc) 2.5 mg을 첨가하였다. 상기 혼합용액에서 클로로포름을 회전농축기(PC 3001 Vario Pro Vacuu brand)로 증발시켜 바이알의 밑바닥에 'F127-Pc 필름'을 형성시켰다. A solution of 500 mg of PULURRONIC F127 dissolved in chloroform was added to 20 mL of 'Vial A', and 2.5 mg of phthalocyanine (Pc) dissolved in chloroform was added. The chloroform was evaporated from the mixed solution with a rotary condenser (PC 3001 Vario Pro Vacuu brand) to form an 'F127-Pc film' on the bottom of the vial.
다음으로, 상기 바이알 A에 정제수 10 mL를 붓고 30℃에서 1분간 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 샘플을 하룻밤 동안 교반한(200rpm) 다음, 0.2㎛ 실린지 필터(Ministart® Sartorius Stedium)로 여과하였다.Next, 10 mL of purified water was poured into the vial A and ultrasonicated at 30 ° C for 1 minute. Of stirring the samples sonicated overnight (200rpm) followed by filtration, 0.2㎛ syringe filter (Sartorius ® Ministart Stedium).
또 다른 바이알 B에 PETA (Pentaerythritol tetraacrylate) 25 mg을 아세톤에 용해시킨 다음 아세톤을 상온에서 증발시켜 PETA 필름을 형성시켰다.In another vial B, 25 mg of PETA (Pentaerythritol tetraacrylate) was dissolved in acetone and acetone was evaporated at room temperature to form a PETA film.
상기 바이알 A에서 준비된 용액을 바이알 B에 혼합하고 상온에서 하룻밤 동안 교반하여(200 rpm), 'F127-Pc-PETA 용액'을 준비하였다.The solution prepared in the vial A was mixed with the vial B and stirred at room temperature overnight (200 rpm) to prepare a 'F127-Pc-PETA solution'.
단계 5-6: UV 조사를 통한 Step 5-6: UV irradiation PETAPETA 가교로 'F127- The bridge 'F127- PcPc -- PETAPETA sIPNsIPN 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
UV 조사 단계는 실시예 1의 단계 2와 동일하게 실시하여, 'F127-Pc-PETA sIPN 미셀'을 제조하였고, 이를 깨끗한 바이알에 보관하였다.The UV irradiation step was carried out in the same manner as in
본 실시예 12에 대한 제법 3의 개략도를 도 3에 나타내었다.Fig. 3 shows a schematic view of
하기 표에 실시예 1-12에서 사용한 형광 염료와 형광 염료 용해에 사용한 용매 및 여기 파장(λex)을 정리하여 기입하였고, 도 4a - 도 4c에 형광 염료의 화학구조식을 나타내었다.The fluorescent dyes used in Examples 1-12 and the solvent and excitation wavelength (λ ex ) used for dissolving the fluorescent dye were listed in the following table, and the chemical structures of the fluorescent dyes are shown in FIGS. 4A to 4C.
<< 비교예Comparative Example 1> 'F127- 1 > 'F127- pypy 미셀Micelle '의 제조'Manufacturing
실시예 1에서 PETA (Pentaerythritol tetraacrylate)를 첨가하지 않고, UV 조사를 하지 않은 것을 제외하고는 동일하게 실시하여, 'F127-py 미셀'을 제조하였다.'F127-py micelle' was prepared in the same manner as in Example 1, except that PETA (Pentaerythritol tetraacrylate) was not added and UV irradiation was not performed.
<< 실험예Experimental Example 1> 임계 1> Critical 미셀Micelle 온도(critical micelle temperature, The critical micelle temperature, CMTCMT ) 테스트) Test
CMT(critical micelle temperature) 평가를 위해 샘플(sIPN and micelle)을 CMT 보다 낮은 온도에서 하룻밤 동안 배양한 다음, 4℃에서 10분간 14000rpm으로 원심분리하였다. 샘플의 원심분리 후 상청액(supernatant)을 깨끗한 튜브로 옮기고, 이를 CMT 평가에 이용하였다.Samples (sIPN and micelle) were incubated overnight at a lower temperature than CMT for critical micelle temperature (CMT) evaluation and then centrifuged at 14000 rpm for 10 min at 4 ° C. After centrifugation of the sample, the supernatant was transferred to a clean tube and used for CMT evaluation.
구체적으로, 실시예 1에서 제조한 'F127-py-PETA sIPN 미셀'을 CMT 이하의 온도에서 안정성 테스트를 하였다. 주어진 농도(10%)에서, 플루로닉 F127의 CMT는 17℃이다. 실시예 1 및 비교예 1에서 파이렌의 흡광 및 형광 세기는 도 5에 나타내었고, 관련 데이터를 하기 표 2에 나타내었다.Specifically, 'F127-py-PETA sIPN micelle' prepared in Example 1 was subjected to stability test at a temperature lower than CMT. At a given concentration (10%), the CMT of Pluronic F127 is 17 [deg.] C. The absorption and fluorescence intensities of pyrene in Example 1 and Comparative Example 1 are shown in Fig. 5, and related data are shown in Table 2 below.
도 5는 CMT 테스트 이후에 실시예 1 및 비교예 1의 흡광(a) 및 형광(b) 스펙트라이다.FIG. 5 shows the spectra (a) and (b) of fluorescence of Example 1 and Comparative Example 1 after the CMT test.
(4℃/ 25℃)Intensity ratio
(4 ° C / 25 ° C)
상기 표 2에 나타난 바와 같이, CMT 테스트 이후 실시예 1에서 파이렌의 높은 흡광 세기가 나타나는 한편, 비교예 1에서는 형광 세기 감소가 나타났다. 상기에서 얻은 결과는, CMT 온도 이하에서 실시예 1은 미셀 구조가 해리되지 않고 유지할 수 있음을 나타낸다. As shown in Table 2 above, the high absorbance intensity of pyrene was shown in Example 1 after the CMT test, while the fluorescence intensity was decreased in Comparative Example 1. The results obtained above show that in Example 1 below the CMT temperature, the micelle structure can be maintained without dissociation.
<< 실험예Experimental Example 2> 2> sIPNsIPN 형성 최적 조건 탐색 Exploring forming conditions
PETAPETA ( ( PentaerythritolPentaerythritol tetraacrylate테트라acrylate ) ) 가교제Cross-linking agent 함량: content:
sIPN 형성을 위한 PETA 최적 함량을 알아보기 위하여, 플루로닉 F127 함량 1g(10% w/w, volume 10 mL) 대비 PETA 함량을 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 5, 7.5, 10, 20, 30, 40 중량부로 준비한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하여 'F127-py-PETA sIPN 미셀'을 준비하였다. PETA의 효과는 CMT 이하의 온도에서 파이렌 흡광 변화를 모니터링하여 평가하였다.To determine the optimal amount of PETA for sIPN formation, the PETA content was compared with that of Pluronic F127 (1 g, 10% w / w,
sIPN 형성에 PETA 함량의 효과는 도 6 및 하기 표 3에 나타내었다.The effect of PETA content on sIPN formation is shown in Figure 6 and Table 3 below.
도 6은 PETA 함량에 따른 파이렌의 흡광값을 나타낸 그래프이다.6 is a graph showing the absorption of pyrene according to PETA content.
(플루로닉 F127 100 중량부 대비 중량부)PETA
(Parts by weight relative to 100 parts by weight of pluronic F127)
(4℃/25℃)Intensity ratio
(4 ° C / 25 ° C)
미셀 코어에서 PETA의 중합도는 PETA 함량에 큰 영향을 받는다. PETA의 높은 함량은 강한 나노-네트워크를 형성할 수 있지만, 미셀 코어가 오그라지는 현상으로 인해 형광 염료의 로딩 용량은 감소한다.The degree of polymerization of PETA in the micelle core is strongly influenced by the PETA content. The high content of PETA can form a strong nano-network, but the loading capacity of the fluorescent dye is reduced due to the phenomenon that the micelle core shrinks.
상기 표 3에 나타난 바와 같이, sIPN 형성을 위한 PETA의 최적 함량은 2.5 중량부인 것으로 나타났다. PETA 함량 2.5 미만에서, CMT 테스트 후에 시료의 흡광 및 형광 세기의 확연한 감소가 나타나 불안정한 나노입자 형성이 관찰되었다. 반면에 PETA 함량이 2.5 중량부 초과할 경우에는 흡광 세기가 역시 감소되었는데, 이는 코어의 오그라짐 현상에 따른 것이다. As shown in Table 3, the optimum amount of PETA for sIPN formation was 2.5 parts by weight. At a PETA content of less than 2.5, unstable nanoparticle formation was observed after a CMT test with a marked reduction in the absorbance and fluorescence intensity of the sample. On the other hand, when the content of PETA exceeds 2.5 parts by weight, the light intensity is also decreased, which is due to the shrinkage of the core.
UV 조사 시간:UV irradiation time:
sIPN 형성을 위한 UV 조사 최적 시간을 알아보기 위하여, UV 조사 시간을 0, 3, 6, 9, 12, 15, 30, 45, 60 분 동안 조사한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하여 'F127-py-PETA sIPN 미셀'을 준비하였다.In order to examine the optimum time of UV irradiation for sIPN formation, the same procedure as in Example 1 was carried out except that the UV irradiation time was irradiated for 0, 3, 6, 9, 12, 15, 30, 'F127-py-PETA sIPN micelle' was prepared.
코어 내부 가교에 UV 조사 시간의 영향은 도 7 및 표 4에 나타내었다. 구체적으로 실시예 1에서 UV 조사 시간을 달리한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 시료들을 제조한 다음 흡광 세기를 측정하여 평가하였다.The effects of UV irradiation time on core internal crosslinking are shown in FIG. 7 and Table 4. Specifically, samples were prepared in the same manner as in Example 1, except that the UV irradiation time was different, and the intensity of the light was measured and evaluated.
도 7은 UV 조사 시간에 따른 흡광 세기를 측정한 그래프이다.FIG. 7 is a graph showing the measurement of the intensity of light according to the UV irradiation time.
(min)UV irradiation time
(min)
(4℃/25℃)Intensity ratio
(4 ° C / 25 ° C)
미셀 코어 내부에서 강한 sIPN 형성은 UV 조사에 의한 PETA 중합에 기인한다. 그러나, 과도한 UV 조사 시간은 광퇴색(photobleaching)을 야기하기 때문에, 유기 분자에 해로울 수 있다. 그러므로, 미셀의 우수한 안정성 및 광학 특성을 얻기 위해서는, 최적의 UV 조사 시간이 필요하다. Strong sIPN formation in the micelle core is due to the polymerization of PETA by UV irradiation. However, excessive UV exposure times can cause harmful organic molecules, since they cause photobleaching. Therefore, in order to obtain excellent stability and optical characteristics of micelles, an optimal UV irradiation time is required.
상기 표 4에 나타난 바와 같이, UV 조사 시간은 6분이면 안정한 미셀을 형성하는데 충분하다. UV 조사 시간 6분 미만일 경우, CMT 테스트 후에 파이렌의 낮은 흡광 세기가 나타나 sIPN 형성이 완전하지 않은 것을 알 수 있다. 한편, UV 조사 시간이 6분 초과일 경우, 흡광은 역시 감소하는 것으로 나타나, 파이렌의 광퇴색이 관찰되었다.As shown in Table 4, the UV irradiation time is sufficient to form stable micelles at 6 minutes. When the UV irradiation time is less than 6 minutes, the low absorption intensity of pyrene appears after the CMT test, indicating that sIPN formation is not complete. On the other hand, when the UV irradiation time was longer than 6 minutes, the light absorption also decreased, and light discoloration of pyrene was observed.
UV 조사시의 반응온도: Reaction temperature at UV irradiation:
sIPN 형성을 위한 UV 조사시의 최적 온도를 알아보기 위하여, UV 조사시의 온도를 25, 35, 50℃로 설정한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하여 'F127-py-PETA sIPN 미셀'을 준비하였다. sIPN 형성에 있어서 반응 온도의 영향을 UV 흡광값 측정을 통해 평가하였고, 이를 하기 도 8 및 표 5에 나타내었다.In order to investigate the optimum temperature for UV irradiation for sIPN formation, the same procedure as in Example 1 was carried out except that the temperature at the time of UV irradiation was set at 25, 35, and 50 ° C to obtain 'F127-py-PETA sIPN Michel 'was prepared. The influence of the reaction temperature on the formation of sIPN was evaluated by measuring the UV absorbance value, which is shown in Fig. 8 and Table 5 below.
도 8은 반응 온도에 따른 흡광(a) 및 형광(b) 스펙트라이다.Fig. 8 shows the absorption (a) and fluorescence (b) spectra according to the reaction temperature.
(℃)Reaction temperature
(° C)
(4℃/25℃)Intensity ratio
(4 ° C / 25 ° C)
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 반응 온도가 50 ℃일 때, 미셀 코어에서 sIPN이 형성되었다. 반응 온도 50 ℃ 초과에서 UV 조사할 경우 더욱 가교되는 경향이 있는데, 이는 이 온도에서 국부 결정 용융이 가교 영역에서 비정질상을 이끌기 때문이다. 나아가, 상승한 온도에서, PETA는 미셀의 코어로 더 쉽게 내재화될 수 있다. As shown in Table 5, sIPN was formed at the micelle core when the reaction temperature was 50 ° C. When irradiated at a reaction temperature of more than 50 DEG C, it tends to be more crosslinked because the local crystal melt at this temperature leads to an amorphous phase in the cross-linking region. Further, at elevated temperatures, PETA can be more easily internalized into the core of the micelles.
형광 Neon 프로브Probe 함량: content:
sIPN 형성을 위한 형광 프로브 최적 함량을 알아보기 위하여, 파이렌 함량을 0.25, 0.5, 0.75, 1 mg으로 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하여 'F127-py-PETA sIPN 미셀'을 준비하였다.F127-py-PETA sIPN micelles were prepared in the same manner as in Example 1 except that the content of pyrene was added in an amount of 0.25, 0.5, 0.75, and 1 mg in order to examine the optimum content of fluorescent probes for sIPN formation. Were prepared.
도 9는 상온 및 CMT 이하의 온도에서 측정한 파이렌 함량의 영향으로서 파이렌 흡광 커브를 나타낸다. 상세한 흡광 및 세기 비율을 하기 표 6에 나타내었다.Figure 9 shows the pyrene absorption curve as an effect of the pylene content measured at ambient temperature and below CMT. The detailed absorbance and intensity ratios are shown in Table 6 below.
(mg)Pyrene content
(mg)
(4℃/25℃)Intensity ratio
(4 ° C / 25 ° C)
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 파이렌 함량은 미셀 안정성에 확연한 영향을 나타내지는 않았다. As shown in Table 6 above, the pylene content did not show a significant influence on the micelle stability.
추가로, 파이렌 함량의 효과로서 파이렌 여기 2합체의 형성 역시 조사하였다. 파이렌 여기 2합체가 존재하지 않는 파이렌 함량을 조사하였고, 이를 도 10에 나타내었다.In addition, the formation of pyrene exciplex as an effect of pyrene content was also investigated. The content of pyrene in the absence of pyrene excimer bonds was investigated and is shown in FIG.
도 10은 파이렌 함량에 따른 형광 스펙트라이다.10 is a fluorescence spectra according to the content of pyrene.
도 10에 나타난 바와 같이, 파이렌 여기 2합체는 파이렌 1 mg 포함 샘플에서만 관찰되었고, 나머지 샘플에서는 관찰되지 않았다(130.64 A.U.). sIPN 형성을 위한 최적의 파이렌 함량은 미셀의 안정성 및 로딩 함량을 고려하여 파이렌 1 mg 포함 샘플이었다. As shown in Fig. 10, the pyrene exciplex was observed only in the sample containing 1 mg of pyrene and not in the remaining samples (130.64 A.U.). The optimum pylene content for sIPN formation was a sample containing 1 mg of pyrene in consideration of the stability of the micelle and the loading amount.
'F127-'F127- pypy -- PETAPETA ( ( 미셀Micelle ) 용액') Solution < 의 용량: Capacity of:
sIPN 형성을 위한 미셀 용액의 최적 용량을 알아보기 위하여, 실시예 1의 단계 1-4에서 준비한 'F127-py-PETA (미셀) 용액'의 용량이 0.5, 1, 2, 3, 5, 10, 15 mL가 되도록 준비한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하여 'F127-py-PETA sIPN 미셀'을 준비하였다. 본 실험에서 역시 플루로닉 F127 1 g, 파이렌 1 mg 및 PETA 25 mg으로 구성되고, 미셀 용액의 함량을 변화하면 실험하였다.To determine the optimum capacity of the micellar solution for sIPN formation, the capacity of the 'F127-py-PETA (micelle) solution' prepared in steps 1-4 of Example 1 was 0.5, 1, 2, 3, F127-py-PETA sIPN micelle 'was prepared in the same manner as in Example 1, In this experiment, 1 g of pluronic F127, 1 mg of pyrene and 25 mg of PETA were also tested by varying the content of micelle solution.
구체적으로, 20 mL 및 5 mL 용량의 바이알을 사용하였다. 20 mL 바이알에서는 15, 10 및 5 mL 미셀 용액 함량을 평가하였고, 5 mL 바이알에서는 0.5, 1, 2 및 3 mL 미셀 용액 함량을 평가하였다. 모든 시료에서 PETA: py: F127의 비율은 0.025:0.001:1이었다. 본 실험의 결과는 도 11-12 및 표 7에 나타내었다.Specifically, 20 mL and 5 mL vials were used. The 15, 10 and 5 mL micellar solution contents were evaluated in 20 mL vials, and the 0.5, 1, 2 and 3 mL micellar solution contents in 5 mL vials were evaluated. The ratio of PETA: py: F127 in all samples was 0.025: 0.001: 1. The results of this experiment are shown in Figs. 11-12 and Table 7.
도 11은 5 mL 바이알에서 0.5, 1, 2 및 3 mL 미셀 용액에 따른 흡광 및 형광을 측정한 스펙트라이다.FIG. 11 is a spectra measuring absorbance and fluorescence according to 0.5, 1, 2 and 3 mL micellar solutions in 5 mL vials.
도 12는 20 mL 바이알에서 15, 10 및 5 mL 미셀 용액에 따른 흡광 및 형광을 측정한 스펙트라이다.FIG. 12 is a spectra showing the absorption and fluorescence of 15, 10 and 5 mL micellar solutions in 20 mL vials.
(mL)Micelle solution content
(mL)
(4℃/25℃)Intensity ratio
(4 ° C / 25 ° C)
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 미셀 용액 10 mL 샘플에서 최적의 나노-네트워크를 형성함을 알 수 있었다. 미셀 용액 5 mL 샘플의 경우 상온에서는 흡광 세기가 10 mL 샘플에 비해 약 2배로 나타나지만, CMT 이하의 온도(4℃)에서는 흡광 세기가 급격히 줄어드는 것으로 나타났다. 미셀 코어 내부의 고농도 파이렌이 PETA에 의해 가리워질 수 있다. 또한, 5 mL 바이알 샘플 실험결과는 작은 용매(정제수) 함량에서 sIPN 형성이 가능함을 알 수 있었다.As shown in Table 7, it was found that the optimal nano-network was formed in the 10 mL sample of the micelle solution. In the case of 5 mL of micellar solution, the absorbance intensity was about twice that of the 10 mL sample at room temperature, but the absorption intensity decreased sharply at a temperature lower than CMT (4 ° C.). The high concentration pylene inside the micelle core can be covered by PETA. In addition, the results of the 5 mL vial sample test show that sIPN formation is possible in a small amount of solvent (purified water).
<< 실험예Experimental Example 3> 3> sIPNsIPN 미셀의Micelle 안정성 평가 Stability evaluation
PCRPCR test: test:
급격한 온도변화에 대한 'F127-py-PETA sIPN 미셀'의 내구성을 테스트하기 위하여, 30회의 열처리 및 냉처리를 실시하였다. PCR 샘플을 3분간 원심분리한 후, 상온에서 분광 측정하였다. PCR 테스트는 펠티어 기반의 열순환기(Peltier-based thermal cycler, 제조사: Ssufine, 모델명: fine cycler C100)를 이용하여 측정하였다.In order to test the durability of 'F127-py-PETA sIPN micelle' against abrupt temperature change, 30 heat treatment and cold treatment were performed. The PCR sample was centrifuged for 3 minutes and then spectroscopically measured at room temperature. PCR tests were performed using a Peltier-based thermal cycler (manufacturer: Ssufine, model: fine cycler C100).
약물전달체로서 실시예 1에서 제조한 'F127-py-PETA sIPN 미셀'은 DNA와 함께 기능화되는 것을 고려하여야 한다. 안정한 'F127-py-PETA sIPN 미셀'과 DNA의 사용을 위해서는, PCR 처리후 안정성이 요구된다. 실시예 1에서 제조한 'F127-py-PETA sIPN 미셀'의 PCR 결과를 도 13에 나타내었고, 관련 흡광 결과를 표 8에 나타내었다.The 'F127-py-PETA sIPN micelle' prepared in Example 1 as a drug delivery vehicle should be considered to be functionalized with DNA. Stable 'F127-py-PETA sIPN micelles' and DNA require stability after PCR treatment. The PCR result of the 'F127-py-PETA sIPN micelle' prepared in Example 1 is shown in FIG. 13, and the results of the relevant absorption are shown in Table 8.
도 13은 실시예 1에서 제조한 F127-py-PETA sIPN 미셀을 PCR 테스트 후에 흡광을 측정한 스펙트라이다.FIG. 13 is a spectra obtained by measuring the absorption of F127-py-PETA sIPN micelle prepared in Example 1 after a PCR test.
(ref/25℃)ratio
(ref / 25 DEG C)
PCR 테스트 후, 실시예 1 및 비교예 1 모두 흡광의 감소를 나타내었다. PCR 테스트 후, 실시예 1 및 비교예 1의 안정성 값은 각각 70.3% 및 69.9%로 나타나, PCR 처리에도 함께 사용할 수 있음을 알 수 있었다.After the PCR test, both Example 1 and Comparative Example 1 showed a decrease in light absorption. After the PCR test, the stability values of Example 1 and Comparative Example 1 were 70.3% and 69.9%, respectively, indicating that they can be used in PCR treatment.
NaOHNaOH test: test:
실시예 1에서 제조한 'F127-py-PETA sIPN 미셀'과 비교예 1에서 제조한 ''F127-py 미셀' 0.7 mL 각각을 에펜도르프 튜브(Axygen® scientific)에서 NaOH (0.5 M, 0.7 mL)와 혼합하였다. 상기 혼합물을 상온에서 1시간 동안 평형화하고(equilibrated), UV/Vis 및 형광 측정으로 NaOH 첨가에 의한 효과를 측정하였고, 그 결과를 도 14 및 표 9에 나타내었다.Example 1 'F127-py-PETA sIPN micelles' as in Comparative Example 1 NaOH to prepare a '' F127-py micelles, 0.7 mL each in eppendorf tubes (Axygen ® scientific) in (0.5 M, 0.7 mL) prepared in ≪ / RTI > The mixture was equilibrated at room temperature for 1 hour and the effect of addition of NaOH was determined by UV / Vis and fluorescence measurements. The results are shown in FIG. 14 and Table 9.
도 14는 염기성 환경에서 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 미셀의 흡광 스펙트라이다.14 is an absorption spectrum of the micelle prepared in Example 1 and Comparative Example 1 in a basic environment.
(NaOH r.t./ref)Intensity ratio
(NaOH rt / ref)
도 14 및 표 9에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 경우 NaOH를 혼합한 이후에도 sIPN 나노입자는 안정하였을 뿐만 아니라, CMT 테스트 후에도 안정함을 알 수 있었다. 비교예 1의 안정성은 NaOH 배양 후에 실시예 1에 비해 낮았다.As shown in FIG. 14 and Table 9, it was found that the sIPN nanoparticles were stable not only after the mixing of NaOH but also after the CMT test. The stability of Comparative Example 1 was lower than that of Example 1 after NaOH incubation.
<< 실험예Experimental Example 4> UV/ 4> UV / VisVis 및 형광 분광을 통한 형광 And fluorescence through fluorescence spectroscopy 프로브Probe 로딩 용량 및 안정성 평가 Loading capacity and stability evaluation
실시예 1에서 제조한 'F127-py-PETA sIPN 미셀'의 로딩 용량 및 안정성을 파이렌 흡광 및 형광 스펙트라 변화를 측정하여 평가하였다. 흡광 스펙트라는 Shimadzu UV-2600 UV-Vis 분광기를 이용하였다(300-400 nm 파장대 측정). 상기 형광 스펙트라는 JASCO FP-6300 분광기를 이용하였다(여기 파장 336 nm). 발광(emission) 스펙트라는 360-520 nm 영역을 기록하였다. 상기 흡광 및 형광 측정은 상온에서 실시하였다.The loading capacity and stability of 'F127-py-PETA sIPN micelle' prepared in Example 1 were evaluated by measuring pyrene absorption and fluorescence spectral change. The absorption spectrum was measured using a Shimadzu UV-2600 UV-Vis spectrometer (300-400 nm wavelength band). The fluorescence spectrum was measured using a JASCO FP-6300 spectrometer (excitation wavelength: 336 nm). The emission spectra recorded in the 360-520 nm region. The absorption and fluorescence measurements were carried out at room temperature.
구체적으로, 실시예 1에서 제조한 'F127-py-PETA sIPN 미셀'의 흡광(300-400 nm) 및 발광(360-520 nm) 스펙트라를 측정하였다. 파이렌의 흡광 스펙트라는 308, 321 및 336 nm에서 3개의 피크를 나타내었다. Specifically, the absorption (300-400 nm) and the emission (360-520 nm) spectra of the 'F127-py-PETA sIPN micelle' prepared in Example 1 were measured. The absorption spectra of pyrene showed three peaks at 308, 321 and 336 nm.
도 15는 실시예 1 및 비교예 1의 흡광(Abs) 및 형광(Flu) 스펙트라이다.Fig. 15 shows the Abs and Flu spectra of Example 1 and Comparative Example 1. Fig.
도 15에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 비해 비교예 1의 파이렌의 흡광이 조금 더 높게 나타났다. 미셀 코어의 가교 형성에 따라서 파이렌의 로딩 용량은 감소하였다. 파이렌 모노머에 대한 360-420 nm 영역에서 발광 피크를 기록하였고, 430-520 nm 영역에서, 473 nm에서 맥시멈 피크와 함께 광범위 구조-적은 밴드(broad structure-less band)관찰되었고, 파이렌의 여기 2합체(excimer) 형광을 나타낸다. 동일한 파이렌 농도에서, 실시예 1에 비하여 비교예 1에서 더 높은 파이렌의 여기 2합체 발광이 발견되었다. 미셀 코어 내부의 나노-네트워크 형성은 2개의 파이렌 분자 사이에서 π-π 적층 상호작용의 가능성을 감소시켰다. 파이렌의 형광 세기(모노머 피크)는 관찰된 것보다 높아야 하지만, 파이렌 분자는 여기 2합체로 전환시켰다. 여기 2합체 밴드의 세기가 감소하는 동안 모너머 밴드의 세기는 감소하였다. 형광 밝기 및 양자효율 등 광학특성의 조절을 위하여 위와 같이 유기형광염료의 로딩 양과 제법을 최적화할 필요가 있다.As shown in FIG. 15, the absorption of pyrene of Comparative Example 1 was slightly higher than that of Example 1. The loading capacity of pyrene decreased with crosslinking of the micelle core. Emission peaks were recorded in the 360-420 nm region for the pyrene monomer and in the 430-520 nm region broad structure-less band was observed along with the maxima peak at 473 nm, 2 < / RTI > excimer fluorescence. At the same pyrene concentration, a higher pyrene excited bidentate luminescence was found in Comparative Example 1 as compared to Example 1. Nano-network formation inside the micelle cores reduced the possibility of pi-pi lamination interaction between two pyrene molecules. The fluorescence intensity of the pyrene (monomer peak) should be higher than that observed, but the pyrene molecules converted to the excited bimolecular. The strength of the monomer band was reduced while the intensity of the excitation bands decreased. It is necessary to optimize the loading amount and the preparation method of the organic fluorescent dye as described above in order to control optical characteristics such as fluorescence brightness and quantum efficiency.
<< 실험예Experimental Example 5> 형광 양자수율(Φ 5> Fluorescence quantum yield (Φ ff ) 값 측정) Measure the value
형광 양자 수율값(Φf)은 형광단(fluorophore)의 내재적 성질이고, 신규 형광 프로브의 광학적 성질 규명을 위해 중요하다. 형광 양자 수율값은 하기 수학식 1로 표현되고, 이 결과를 하기 표 12에 나타내었다. 형광 양자 수율값은 분자가 형광(fluoresce) 또는 인광(phosphoresce)을 낼 가능성을 평가하는데 이용된다. 높은 형광을 내는 분자의 경우, 형광 양자 수율값은 1에 가깝고, 반대는 0에 가깝다.The fluorescence quantum yield value (phi f ) is an intrinsic property of a fluorophore and is important for the optical characterization of a novel fluorescent probe. The fluorescence quantum yield value is expressed by the following equation (1), and the results are shown in Table 12 below. Fluorescent quantum yield values are used to assess the likelihood that a molecule will fluoresce (fluoresce) or phosphoresce. For molecules with high fluorescence, the fluorescence quantum yield value is close to 1, and the opposite is close to zero.
구체적으로, 형광 양자수율(Φf) 값은 Hamamatsu Photonics K.K으로부터 적분구(integrating sphere) 셋업 C9920-02를 이용하였다. 실시예 1-12에서 제조한 모든 샘플들은 모두 다른 여기 파장에서 여기되었다. 용매(아세톤 또는 클로로포름) 3.5 mL에 형광 프로브 저장 용액(1 mg/mL) 10-50 ㎕를 첨가하여, 유기 용매에서 형광 프로브의 순 양자수율을 측정하였다. 형광 양자수율(fluorescence quantum yield, FQY) 값 측정을 위한 실시예 1-12의 샘플 농도는 원래 폴리머 농도 (10% w/w)를 2번 희석하였다. 실시예 1(파이렌) 및 실시예 5(KIM A)를 제외한 모든 샘플들은 동일한 희석 인자로 희석하였고, 실시예 1 및 실시예 5는 각각 13번 및 4번 희석하였다. 형광 양자수율(Φf) 값은 PLQ 소프트웨어로부터 직접 얻었다. 흡광 스펙트라는 Shimadzu UV-2600 UV-Vis 분광기를 이용하였고, 흡광 스펙트라는 300-750 nm 영역을 기록하였다. 형광 스펙트라는 JASCO FP-6300 분광기를 이용하였다.Specifically, the fluorescence quantum yield (Φ f ) values were obtained from Hamamatsu Photonics KK using an integrating sphere setup C9920-02. All the samples prepared in Examples 1-12 were excited at different excitation wavelengths. To 3.5 mL of the solvent (acetone or chloroform) was added 10-50 μl of fluorescent probe storage solution (1 mg / mL), and the net quantum yield of the fluorescent probe was measured in the organic solvent. The sample concentrations of Examples 1-12 for measuring fluorescence quantum yield (FQY) values were originally diluted 2 times the polymer concentration (10% w / w). All samples except Example 1 (pyrene) and Example 5 (KIM A) were diluted to the same dilution factor, and Example 1 and Example 5 were diluted 13 and 4, respectively. Fluorescence quantum yield (Φ f ) values were obtained directly from the PLQ software. The absorbance spectra were measured using a Shimadzu UV-2600 UV-Vis spectrometer and the absorbance spectra recorded in the region of 300-750 nm. Fluorescence spectra were measured using a JASCO FP-6300 spectrometer.
상기 수학식 1에서,In the above equation (1)
'Nem(λex)'는 방출된 포톤의 수이고,'N em (λ ex )' is the number of emitted photons,
'Nabs(λex)'는 흡수된 포톤의 수이다.'N abs (λ ex )' is the number of absorbed photons.
(Φf)Fluorescence quantum yield value of fluorescent probe in organic solvent
(? F )
(Φf)The fluorescence quantum yield value in the micelles prepared in the examples
(? F )
상기 표 10에 나타난 바와 같이, 실시예 1-12에서 제조한 미셀에 포함된 유기형광염료들의 형광을 막지 않음을 알 수 있다. KIM A 및 KIM B는 신규로 합성한 염료이고, 이들은 높은 양자 수율값 때문에 전자 장치에서 형광 염료로서 응용될 수 있다. 파이렌의 경우, 고농도의 파이렌에서 높은 π-π 적층 상호작용은 파이렌 포함 미셀에서 희석이 필요하다. 미셀에 포함된 프탈로시아닌의 낮은 형광 양자 수율 값은 고분자 체인 내부에서 프탈로시아닌의 응집에 의해 야기되는 형광 꺼짐 현상으로서 설명된다.As shown in Table 10, it can be seen that the fluorescence of the organic fluorescent dyes contained in the micelles prepared in Example 1-12 is not blocked. KIM A and KIM B are newly synthesized dyes, which can be applied as fluorescent dyes in electronic devices due to their high quantum yield values. In the case of pyrene, high π-π stacking interactions at high concentrations of pyrene require dilution in micelle containing pyrene. The low fluorescence quantum yield value of the phthalocyanine contained in the micelle is explained as a fluorescence off phenomenon caused by phthalocyanine aggregation inside the polymer chain.
<< 실험예Experimental Example 6> 세포 흡수 실험 6> Cell Absorption Experiment
세포내 흡수 실험을 위해, TC1 세포(3 x 105 cells/cm2)를 6-웰플레이트에 씨딩하고, 12시간 후에 실시예 8(KIM B)에서 제조한 'F127-KIM B-PETA sIPN 미셀'을 세포에 첨가하였다. 세포 흡수 실험을 위한 폴리머 미셀의 몰랄 농도는 0.01, 0.002 및 0.005%(w/w)이었다. 샘플들은 공초점현미경(Zeiss, LSM 7100)으로 관찰하기 전에 12시간 배양하였고, 관찰 결과를 도 16에 나타내었다.For the intracellular absorption experiment, TC1 cells (3 x 10 5 cells / cm 2 ) were seeded in a 6-well plate, and after 12 hours, 'F127-KIM B-PETA sIPN micelle prepared in Example 8 (KIM B) Was added to the cells. The molar concentrations of polymer micelles for the cell uptake experiments were 0.01, 0.002 and 0.005% (w / w). Samples were incubated for 12 hours before observation with a confocal microscope (Zeiss, LSM 7100) and the results are shown in FIG.
도 16은 실시예 8(KIM B)에서 제조한 미셀을 처리한 TC1(폐암 세포)의 공초점 현미경 이미지이다(a-e는 control, 폴리머 농도 0.001%, 0.0005%, 0.0002%, 0.0001%의 미셀이고, f-g는 0.0002% 및 0.0001% 폴리머 농도의 미셀을 처리한 TC1 폐암 세포의 100배 확대 이미지이다).16 is a confocal microscopic image of TC1 (lung cancer cells) treated with micelles prepared in Example 8 (KIM B) (ae is control, polymer concentration is 0.001%, 0.0005%, 0.0002%, 0.0001% fg is a 100-fold magnification image of TC1 lung cancer cells treated with 0.0002% and 0.0001% polymer micelles).
도 16에 나타난 바와 같이, 초록 형광은 세포 내에서 KIM B에 의한 것이다. 모든 농도에서 초록 형광이 관찰되었다. TC1 세포에서 관찰된 초록 형광은 실시예 8에서 제조한 미셀이 식균작용의 객실(endocytic compartment)에서 축적되는 것을 나타낸다. 여기서, 유기형광염료로서 KIM B를 세포 흡수 실험에서 선택한 것은 586 nm에서 여기 장파장 및 600 nm 주변의 강한 발광을 나타내기 때문이다.As shown in Fig. 16, the green fluorescence is due to KIM B in the cells. Green fluorescence was observed at all concentrations. The green fluorescence observed in TC1 cells indicates that the micelles prepared in Example 8 are accumulated in the endocytic compartment. Here, the selection of KIM B as an organic fluorescent dye in the cell uptake experiment is due to the strong long-wavelength excitation at 586 nm and strong luminescence around 600 nm.
<< 실험예Experimental Example 7> 동물 7> Animals 이미징Imaging 평가 evaluation
실시예 12(프탈로시아닌)에서 제조한 미셀의 생체 적합성을 알아보기 위하여, 마우스의 in vivo 및 ex vivo 형광 이미지를 관찰하였다.Example 12 In order to examine the biocompatibility of micelles prepared in (phthalocyanine), in vivo and ex vivo fluorescence images of mice were observed.
구체적으로, 수컷 무흉선증 누드 마우스 (BALB/c nu/nu) orientbio로부터 구입하였고, 무병(pathogen-free) 환경에서 사육하였다. 실험 처리를 위해서, 7주간 사육한 BALB/c 누드 마우스를 실험에 사용하였다. 마우스는 1.5% 이소풀루란 흡입으로 마취시켰고, 정맥에 ICG(IndoCyanine Green) (0.5 mg/kg), 프탈로시아닌(0.25 mg/kg) 또는 프탈로시아닌(0.5 mg/kg)를 주사하였다. in vivo 형광 이미지는 Xenogen IVIS spectrum (Perkin Elmer)를 이용하여 시간별로 측정하였다.Specifically, male athymic nude mice (BALB / c nu / nu) were purchased from orientbio and raised in a pathogen-free environment. For experimental treatment, BALB / c nude mice raised for 7 weeks were used in the experiment. Mice were anesthetized with 1.5% isoflurane inhalation and intravenously injected with ICG (IndoCyanine Green) (0.5 mg / kg), phthalocyanine (0.25 mg / kg) or phthalocyanine (0.5 mg / kg). In vivo fluorescence images were measured over time using the Xenogen IVIS spectrum (Perkin Elmer).
도 17은 실시예 12(프탈로시아닌) 및 대조군으로서 ICG를 마우스에 투입한 in vivo 및 ex vivo 형광 이미지이다(도 17a: 실시예 12 (50㎍) in vivo, 도 17b: ICG (100㎍) in vivo, 도 17c: ICG (100㎍) ex vivo, 도 17d: 실시예 12 (50㎍) ex vivo).Figure 17 is an in vivo and ex vivo fluorescence image of Example 12 (phthalocyanine) and ICG as a control group (Figure 17a: Example 12 (50g) in vivo, Figure 17b: ICG (100g) in vivo , Fig. 17c: ICG (100 g) ex vivo, Fig. 17d: Example 12 (50 g) ex vivo).
도 17a-d에 나타난 바와 같이, 실시예 12(프탈로시아닌)에서 제조한 미셀을 주입한 마우스에서 형광 시그널이 관찰되었다. 주입 후에 인큐베이션 시간이 길어질수록, 형광 시그널은 더욱 강하게 나타났다. 동물 이미징에서 이미징 프로브로서 실시예 12에서 제조한 미셀의 가능성은 시중에서 판매되고 있는 이미징 프로브인 ICG(IndoCyanine Green)와 비교하였다. 주입 후 1시간 인큐베이션 때에는, 실시예 12에서 제조한 미셀은 ICG에 비해 더 느리게 분포하였지만, 1시간 이후에는 실시예 12에서 제조한 미셀을 주입한 모든 마우스에서 강한 형광이 명확하게 나타났다. 나아가, 실시예 12에서 제조한 미셀을 주입한 마우스의 경우 주입 후 48시간 경과시에도 여전히 강한 시그널이 나타났지만, ICG를 주입한 마우스에서는 형광 시그널이 나타나지 않았다. 이는 실시예 12에서 제조한 미셀이 ICG에 비해 혈액 내에서 더 긴 순환시간을 갖는 것을 의미한다. 본 실험에서 다른 흥미있는 발견은 실시예 12에서 제조한 미셀을 주입한 마우스의 경우 뇌 영역에서 강한 형광이 나타나, BBB(blood brain barrier)를 통과할 수 있음을 보여준다는 점이다. As shown in Figs. 17A-D, a fluorescence signal was observed in a mouse injected with micelles prepared in Example 12 (phthalocyanine). The longer the incubation time after injection, the stronger the fluorescence signal. The possibility of micelles prepared in Example 12 as an imaging probe in animal imaging was compared with ICG (IndoCyanine Green), a commercially available imaging probe. The micelles prepared in Example 12 were distributed more slowly than those in ICG at the time of incubation for 1 hour after the injection, but after 1 hour, strong fluorescence clearly appeared in all the mice injected with the micelles prepared in Example 12. Furthermore, in the case of the mouse injected with micelles prepared in Example 12, a strong signal still appeared at 48 hours after the injection, but the fluorescence signal was not observed in the mouse injected with ICG. This means that the micelles prepared in Example 12 have a longer circulation time in blood than ICG. Another interesting finding in this experiment is that mice injected with micelles prepared in Example 12 show strong fluorescence in the brain region and can pass through the blood brain barrier (BBB).
또한, ex vivo 이미징에서 생리적 환경하에 실시예 12에서 제조한 미셀의 안정성을 보여준다. 이러한 결과는 실시예 12에서 제조한 미셀이 혈액 흐름에서 안정함을 나타낸다. 이러한 결과는 in vivo 및 ex vivo 연구를 위한 이미징 프로브로서 실시예 12에서 제조한 미셀이 응용가능함을 나타낸다.It also shows the stability of the micelles prepared in Example 12 under physiological conditions in ex vivo imaging. These results indicate that the micelles prepared in Example 12 are stable in the blood flow. These results indicate that the micelles prepared in Example 12 are applicable as imaging probes for in vivo and ex vivo studies.
<< 실험예Experimental Example 8> 8> 실시예Example 1-12에서 제조한 1-12 미셀에Michelle 포함되는 유기형광염료의 광학 특성 Optical properties of organic fluorescent dyes included
본 실험에서는 UV/Vis 파장 영역에서 흡광 및 발광 스펙트라를 갖는 실시예 1-12에서 제조한 미셀을 사용하였다. 실시예 1(파이렌) 및 실시예 11(Nile red)에서 사용한 염료는 시중에서 구입가능하고, 나머지 실시예 2-10 및 실시예 12에서 사용한 염료는 새로이 합성하여 사용하였다.In this experiment, the micelles prepared in Example 1-12 having absorbance and emission spectra in the UV / Vis wavelength region were used. The dyes used in Example 1 (pyrene) and Example 11 (Nile red) were commercially available, and the remaining dyes used in Examples 2-10 and 12 were newly synthesized and used.
화학구조에 기반하여, 본 실험에서는 2개의 그룹으로 형광 프로브를 분류하여 실험하였다. 첫 번째 그룹은 평면 구조 및 높은 공액(conjugated) 탄소계를 갖는 형광 프로브로서, 파이렌, lumogen violet, lumogen yellow, lumogen orange, lumogen red, nile red 및 프탈로시아닌(Pc)이다. 두 번째 그룹은 티오펜 그룹 및 다른 무거운 원자(예를 들어, 셀레늄, 브롬 및 황)를 갖는 형광 프로브로서, 3-티오펜헥실, KIM A, KIM B Se-벤조티아디아졸, 나프토티아디아졸이다.Based on the chemical structure, the fluorescence probes were classified into two groups and tested in this experiment. The first group is a fluorescent probe with a planar structure and a highly conjugated carbon system, pyrene, lumogen violet, lumogen yellow, lumogen orange, lumogen red, nile red and phthalocyanine (Pc). The second group is a fluorescent probe with a thiophene group and other heavy atoms (e. G., Selenium, bromine and sulfur) such as 3-thiophenehexyl, KIM A, KIM B Se-benzothiadiazole, naphthothiadiazole .
실시예 1-12에서 제조한 미셀에 로딩된 유기형광염료의 광학 특성은 도 18-19에 나타내었고, 표 11-12에 이들의 흡광 및 형광 데이터를 나타내었다.The optical characteristics of the micelle-loaded organic fluorescent dyes prepared in Examples 1-12 are shown in Figs. 18-19, and the absorption and fluorescence data thereof are shown in Table 11-12.
도 18은 실시예 1-12에서 사용한 유기형광염료의 흡광 스펙트라이다.18 is an absorption spectrum of the organic fluorescent dye used in Examples 1-12.
도 19는 실시예 1-12에서 사용한 유기형광염료의 발광 스펙트라이다.19 is a light emission spectrum of the organic fluorescent dye used in Example 1-12.
평면 구조(파이렌, 프탈로시아닌 및 루모겐 염료들)를 갖는 형광 프로브들이 대부분 높은 흡광 및 발광 세기를 나타냈다. 첫 번째 그룹의 형광 프로브에서 높은 공액 π 전자가 UV 및 가시광 영역에서 우수한 광학 특성을 갖기 때문에 주요한 원인일 수 있다. 평면성 분자들은 이셀 코어에 형광 프로브가 쉽게 포함되도록 기여할 수 있다. 상기 표 11의 흡광 세기에 기반하여, 유기형광염료들은 높은 세기부터 낮은 세기 순으로 다음과 같이 나열할 수 있다: 파이렌, 3-티오펜헥실, 프탈로시아닌(Pc), Nile red, KIM B, lumogen red, lumogen orange, KIM A, lumogen violet, Se-벤조티아디아졸, 나프토티아디아졸 및 lumogen yellow.Fluorescent probes with planar structures (pyrene, phthalocyanine and lumogen dyes) showed high absorption and emission intensity. High conjugated pi electrons in the first group of fluorescent probes can be a major cause because they have excellent optical properties in the UV and visible regions. Planar molecules can contribute to the inclusion of fluorescent probes in the eclipse core. Based on the absorbance intensities in Table 11 above, the organic fluorescent dyes can be listed in order of high intensity to low intensity as follows: Pyrene, 3-thiophenehexyl, phthalocyanine (Pc), Nile red, KIM B, lumogen red, lumogen orange, KIMA, lumogen violet, Se-benzothiadiazole, naphthothiadiazole and lumogen yellow.
실시예 1-12에서 제조한 미셀의 유기 형광 프로브의 형광 스펙트라는 UV/Vis 영역(373-734 nm) 영역에 놓여 있다. 이러한 사실은 실시예 1-12에서 사용한 유기형광염료 이외의 다양한 염료 역시 광학 특성에 영향을 받지 않고 사용할 수 있음을 의미한다. 형광 세기에 기반한 형광 프로브는 높은 세기로부터 낮은 세기 순으로 다음과 같이 나열할 수 있다: 파이렌, 프탈로시아닌(Pc), Nile red, KIM B, 나프토티아디아졸, lumogen F violet, lumogen F orange, lumogen yellow, 3-티오펜헥실, lumogen red, KIM A 및 Se-벤조티아디아졸. UV 광원(365 nm) 하에서, 실시예 1-12에서 제조한 미셀은 다양한 색상을 나타내고, 이를 도 20에 나타내었다.The fluorescence spectra of the micellar organic fluorescent probes prepared in Examples 1-12 are in the UV / Vis region (373-734 nm). This fact means that various dyes other than the organic fluorescent dyes used in Examples 1-12 can also be used without being affected by optical characteristics. Fluorescent probes based on fluorescence intensity can be listed in order of intensity from low to high: pyrene, phthalocyanine (Pc), Nile red, KIM B, naphthothiadiazole, lumogen F violet, lumogen F orange, lumogen yellow, 3-thiophenehexyl, lumogen red, KIM A and Se-benzothiadiazole. Under the UV light source (365 nm), the micelles prepared in Examples 1-12 exhibited various colors, which are shown in Fig.
<< 실험예Experimental Example 9> 9> 양말단이Horseshoe 개질된Reformed 양친매성Amphipathic 트리블록공중합체의Triblock copolymer 비율에 따른 형광 이미징용 표지나노입자의 전기영동 평가 Electrophoretic evaluation of labeled nanoparticles for fluorescence imaging by ratio
양친매성 트리블록공중합체로 'F127-PO(OH)2(제조예 3)' 및 'F127'의 혼합 개체비율(0-100%)을 달리한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 제조한 샘플을 전기영동으로 평가하였고, 그 결과를 도 22에 나타내었다.Except that the mixing ratio (0-100%) of 'F127-PO (OH) 2 (Preparation Example 3)' and 'F127' as the amphiphilic triblock copolymer was changed as in Example 1 The prepared samples were evaluated by electrophoresis, and the results are shown in Fig.
도 22는 F127 및 F127-PO(OH)2 혼합 개체비율(0-100%)을 달리하여 제조한 형광이미징용 표지나노입자 샘플의 전기영동 사진이다(사진에서 '0%'는 F127-PO(OH)2 100%이다).FIG. 22 is an electrophoresis image of a labeled nanoparticle sample for fluorescent imaging prepared with different F127 and F127-PO (OH) 2 mixture ratio (0-100%) ('0%' represents F127-PO OH) < / RTI > 2 100%).
도 22에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 형광이미징용 표지나노입자는 원하는 표면 작용기를 원하는 비율로 개질이 용이하므로, 다양한 생물학적 적용 가능성을 확보할 수 있다. 구체적으로, 생물학적 적용의 예로는 passive/active 세포섭취, 조직섭취, 암세포 표적화 등에 응용할 수 있고, 생결합에 적용의 예로는 항체결합, 단백질 표지, 핵산 표지 등에 응용할 수 있으며, 나노과학적 적용의 예로는 분자이미징시 마커로 활용(예를 들어, avidin-biotin 상호작용), 금나노입자 등과 결합 형성에 적용할 수 있다.As shown in FIG. 22, the labeled nanoparticles for fluorescent imaging according to the present invention can easily modify the desired surface functional groups at a desired rate, thus ensuring various biological applicability. Specifically, examples of biological applications include passive / active cell uptake, tissue ingestion, targeting of cancer cells, and the like. Examples of application to biological binding include antibody binding, protein labeling, and nucleic acid labeling. Examples of nanoscale applications include It can be used as a marker in molecular imaging (for example, avidin-biotin interaction), for binding with gold nanoparticles and the like.
Claims (25)
파이렌, Lumogen F violet 570, 3-티오펜헥실, Lumogen F yellow 083, 2,3-디메틸-5,8-디-티오펜-2-일퀴옥살린 (KIM A), Lumogen F orange 240, 나프토티아디아졸, 4,7-디-티오펜-2-일벤조[1,2,5]티아디아졸 (KIM B), Lumogen red 350, Se-벤조티아디아졸, Nile red 및 프탈로시아닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 미셀 코어에 봉입되는 유기형광염료; 및
PET4A (Pentaerythritol tetraacrylate) 및 PET3A (Pentaerythritol triacrylate)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 미셀 코어에 봉입되어 sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조를 형성하는 가교제;를 포함하고,
sIPN(Semi-Interpenetrating Network) 구조가 코어에 형성된 것을 특징으로 하는 표지나노입자를 함유하는 뇌(brain) 이미징용 조성물.
Amphiphilic triblock copolymers forming one kind of pluronic micelles selected from the group consisting of F88, F87, F77, F68, F38 and F127;
Pyrene, Lumogen F violet 570, 3-thiophenehexyl, Lumogen F yellow 083, 2,3-dimethyl-5,8-di-thiophen-2-yloquinoxaline (KIM A), Lumogen F orange 240, A group consisting of tautiadizole, 4,7-di-thiophen-2-yl benzo [1,2,5] thiadiazole (KIM B), Lumogen red 350, Se-benzothiadiazole, Nile red and phthalocyanine An organic fluorescent dye encapsulated in one kind of micelle core selected from the group consisting of: And
And a cross-linking agent which is encapsulated in one kind of micelle core selected from the group consisting of PET4A (Pentaerythritol tetraacrylate) and PET3A (Pentaerythritol triacrylate) to form a semi- interpenetrating network (sIPN) structure,
wherein a semi-interpenetrating network (sIPN) structure is formed on the core.
상기 양친매성 트리블록공중합체는 PEO(polyethyleneoxide)-block-PPO(polypropyleneoxide)-block-PEO(polyethyleneoxide) 구조인 것을 특징으로 하는 뇌 이미징용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the amphiphilic triblock copolymer has a structure of PEO (polyethyleneoxide) -block-PPO (polypropyleneoxide) -block-PEO (polyethyleneoxide).
상기 양친매성 트리블록공중합체의 양말단 하이드록시기는 -SH, -SO3H,
3. The method of claim 2,
Both ends of the amphiphilic triblock copolymer hydroxy groups -SH, -SO 3 H,
상기 양말단이 개질되지 않은 양친매성 트리블록공중합체 및 1종 이상의 양말단이 개질된 양친매성 트리블록공중합체의 혼합 개체비율은 0-100:100-0인 것을 특징으로 하는 뇌 이미징용 조성물.
The method of claim 3,
Wherein the mixing ratio of the amphiphilic triblock copolymer not modified at both ends to amphiphilic triblock copolymer at least one modified at both ends is 0-100: 100-0.
상기 표지나노입자의 크기는 3-20 nm인 것을 특징으로 하는 뇌 이미징용 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the size of the labeled nanoparticles is 3-20 nm.
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