KR101807871B1 - Analysis method using high sensitivity in vitro diagnostic kit using the europium particles with a fluorescent dye - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 유로퓸 입자와 형광 염료를 이용한 고감도 체외 진단 키트를 이용한 정량 분석 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항체에 결합된 유로퓸 입자와 형광 염료에서 방출되는 2개의 광신호가 합쳐진 신호를 하나의 리더기에서 수신하기 때문에 정확한 정량 분석과, 저농도의 시료에서도 높은 형광 시그널을 얻을 수 있는 유로퓸 입자와 형광 염료를 이용한 고감도 체외 진단 키트를 이용한 정량 분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a quantitative analysis method using a high-sensitivity in vitro diagnostic kit using europium particles and a fluorescent dye, and more particularly, to a method of quantitatively analyzing europium particles bound to an antibody and two optical signals emitted from a fluorescent dye, The present invention relates to an accurate quantitative analysis and a quantitative analysis method using a highly sensitive in vitro diagnostic kit using europium particles and a fluorescent dye capable of obtaining a high fluorescence signal even in a low concentration sample.
최근, 바이러스나 세균 등의 병원체 감염의 유무, 임신의 유무, 암 마커의 유무, 식품 중의 특정 원재료나 잔류 농약 등의 유해 물질의 유무 등의 여러가지 검사를 단시간에 행하는 간이 검사 시약이나 진단약, 진단 키트가 개발되고 있다. 이들은 각각의 검사 대상 물질과, 검사 대상 물질에 특이적으로 반응하는 물질에 의한 특이적 반응이 이용된다. 특히, 항원과 항체에 의한 항원 항체 반응을 이용하는 면역학적 측정법은, 면역크로마트 측정법, 비탁 면역 측정법, 효소 면역 측정법, 화학 발광 측정법, 방사 면역 측정법, 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 측정법 등, 많은 측정법이 개발되고 있다. 그리고 이들 측정법은 병원, 진료소 등에서의 병 등의 검사나,In recent years, there have been a variety of simple tests, such as the presence or absence of pathogenic infections such as viruses and bacteria, the presence or absence of pregnancy, the presence of cancer markers, the presence of harmful substances such as specific raw materials in food or residual pesticides, A kit is being developed. These use a specific reaction with each substance to be tested and a substance that specifically reacts with the substance to be tested. In particular, many immunoassay methods using an antigen-antibody reaction by an antigen and an antibody have been developed, including immunochromatography, tachykinin immunoassay, enzyme immunoassay, chemiluminescence assay, radioimmunoassay, and measurement using surface plasmon resonance . These methods can be used for examinations of illnesses in hospitals and clinics,
식품 회사 등에서의 음식물 검사 등에 이용되고 있다. 그 중에서도 면역크로마트 측정법은, 특별한 설비, 기기, 지식을 필요로 하지 않고 조작도 간편하며 저렴하고, 신속한 진단이 가능하다는 특징으로부터 매우 많은 검사가 실시되고 있다. 최근에는 임신 검사약이나 HIV 검사약 등은 일반 약국에서 시판되어 일반 소비자도 측정할 수 있게 되고, 나아가서는 검사 대상 물질의 유무를 검사하는 정성 검사뿐만 아니라 양을 측정하는 정량 검사 등도 할 수 있다.Food inspections at food companies, etc. Among them, the immunochromatometric method is very much inspected because it does not require special facilities, equipment and knowledge, is simple in operation, is inexpensive, and enables rapid diagnosis. In recent years, pregnancy test drugs and HIV test drugs are available in general pharmacies and can be measured by general consumers. In addition, quantitative tests such as qualitative tests for the presence or absence of test substances can be performed.
면역크로마트 측정법의 측정 원리로는, 플로우 스루형이나 래터럴 플로우형이라고 불리는 방법이 있다. 검체 중의 검사 대상 물질로는 여러 가지 물질을 검출할 수 있지만, 전형적인 예로는 샌드위치법에 의해 항원을 검출하는 측정이 있으며, 이하와 같은 조작이 순차 실행된다.As a measurement principle of the immunochromatometric method, there is a method called a flow-through type or a lateral flow type. As a substance to be inspected in a specimen, various substances can be detected, but a typical example is a measurement for detecting an antigen by a sandwich method, and the following operations are sequentially performed.
먼저, 검사 대상 물질인 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 니트로셀룰로오스막 등의 크로마토그래프 매체의 소정의 부위에 고정화하여, 크로마토그래프 매체의 임의의 위치에 테스트 라인이라고 불리는 반응 부위를 형성한다.First, an antibody that specifically binds to an antigen, which is a substance to be tested, is immobilized on a predetermined site of a chromatographic medium such as a nitrocellulose membrane, and a reaction site called a test line is formed at an arbitrary position on the chromatographic medium.
다음으로, 효소, 발색 입자, 형광 발색 입자, 자성 입자 등의 표지 물질에, 검사 대상 물질과 특이적으로 결합하는 항체를 담지시킨 검출 시약을 조제하고, 컨쥬게이트 패드 등에 검출 시약을 도포 건조하여, 검출 시약 함유부를 형성시키고, 상기 크로마토그래프 매체와 조합하여 면역크로마트 진단 키트를 형성한다.Next, a detection reagent having an antibody that specifically binds to the substance to be tested is supported on a labeling substance such as an enzyme, coloring particles, fluorescent particles, or magnetic particles, and a detection reagent is applied to a conjugate pad and dried, A detection reagent containing portion is formed, and an immunochromatographic diagnostic kit is formed in combination with the chromatographic medium.
그 다음으로, 항원을 포함하는 검체 자체, 또는 그것을 임의의 액체로 희석한 용액을 상기 면역크로마트 진단 키트의 소정의 위치에, 예컨대, 샘플 패드에 적하하여, 항원과 검출 시약을 크로마토그래프 매체 상에 전개시킨다.Next, the sample containing the antigen itself, or a solution thereof diluted with any liquid, is dropped onto a predetermined position of the immunochromatographic diagnostic kit, for example, a sample pad, and the antigen and the detection reagent are immobilized on a chromatographic medium Respectively.
이들 조작에 의해, 반응 부위에 있어서 크로마토그래프 매체 상에 고정화된 항체에, 항원을 통해 표지 물질이 포착되고, 표지 물질의 신호를 검출함으로써 면역크로마트 진단 키트에 의한 진단을 행한다. 일반적인 진단은 항원의 유무만을 검사하는 정성 진단이지만, 최근에는 그 신호의 강도를 육안 혹은 기계로 검출함으로써 정량 진단을 행할 수도 있다.By these operations, the labeling substance is captured by the antigen on the antibody immobilized on the chromatographic medium in the reaction site, and the signal of the labeling substance is detected, thereby performing diagnosis by the immunochromatographic diagnostic kit. The general diagnosis is qualitative diagnosis that tests only for the presence or absence of an antigen, but in recent years, quantitative diagnosis can be performed by detecting the intensity of the signal by visual or mechanical observation.
형광 물질의 신호를 측정하는 광학적 방법에 의하여 정량 분석을 구현할 수 있으며, 그 방법으로는 크게 나노 입자 표지법과 fluorescent dye 표지법 2가지가 있었으나, 기존에는 2가지 표지법 중 어느 하나만을 사용하기 때문에 발광의 감도를 높이는 데 한계가 있었다.Quantitative analysis can be realized by an optical method for measuring the signal of a fluorescent material. There are two methods of the quantitative analysis, namely, nanoparticle labeling and fluorescent dye labeling. However, since only one of two labeling methods is used, There was a limit to heightening.
따라서, 많은 질병 중 예를 들어, 갑상선 관련 질병의 경우, 세계적으로 2억명이 넘는 것으로 추정되는데, 저농도에서도 정확하고 신속하게 TSH(갑상선 자극 호르몬)를 조기 진단할 수 있는 진단 키트의 개발이 역할이 중요해 질 것이다.Therefore, it is estimated that more than 200 million cases of thyroid-related diseases among many diseases, for example, the development of diagnostic kits that can accurately and rapidly detect TSH (thyroid stimulating hormone) at low concentration It will be important.
본 발명은 종래 기술에 따른 문제를 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 본 발명의 주된 목적은, 항체에 결합된 유로퓸 입자와 형광 염료에서 방출되는 2개의 광신호가 합쳐진 신호를 하나의 리더기에서 수신하기 때문에 정확한 정량 분석과, 저농도의 시료에서도 높은 형광 시그널을 얻을 수 있는 고감도 체외 진단 키트 및 이를 이용한 정량 분석 방법을 제공하는 것이다.The main object of the present invention is to solve the problem according to the prior art, and it is a main object of the present invention to provide a method and apparatus for detecting europium particles bound to an antibody and a fluorescent dye, Analysis kit and a high-sensitivity in vitro diagnostic kit capable of obtaining a high fluorescence signal even in a low-concentration sample, and a quantitative analysis method using the same.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.The problems to be solved by the present invention are not limited to those mentioned above, and other solutions not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트를 이용한 정량 분석 방법은 고감도 체외 진단 키트를 사용하여 표적물질을 정량 분석하는 방법에 관한 것으로서,
타겟 물질을 포함하는 시료를 샘플 패드에 공급하는 단계와; 상기 시료가 컨쥬게이션 패드로 이동하여 상기 타겟 물질과 결합한 제1항체를 상기 제3항체에서 포획하는 단계와; 제1파장을 가지는 제1광원을 유로퓸(Europium) 입자에 조사하고, 상기 제1파장과 다른 제2파장을 가지는 제2광원을 상기 형광 염료에 조사하여 상기 유로퓸에서 방출하는 제1광신호와 상기 형광 염료에서 방출하는 제2광신호를 하나의 포토다이오드(photo diode)에서 동시에 수신하여 신호 유무 및 세기를 확인하는 단계;를 포함하되,
상기 고감도 체외 진단 키트는,
지지체와, 지지체 상에 고정되는 스트립을 포함하며,
상기 스트립은, 상기 지지체의 상부에 적층되며 nitro cellulose membrane으로 이루어지는 다공성 막과, 상기 다공성 막의 일단에 배치되는 컨쥬게이션 패드(conjugation pad)와, 상기 컨쥬게이션 패드의 일단에 마련되는 샘플 패드(sample pad)를 포함하고, 상기 컨쥬게이션 패드에는 타겟 물질과 결합 가능한 제1항체와, 상기 제1항체에 결합되는 유로퓸(Europium) 입자 및 형광 염료를 포함하며,
상기 다공성 막에는 테스트 라인(test line) 및 컨트롤 라인(control line)이 배치되고, 상기 테스트 라인에는 상기 타겟 물질과 결합한 제1항체와 결합하는 제3항체가 형성되며, 상기 컨트롤 라인에는 컨쥬게이션 패드(conjugation pad)에 존재하는 제2항체와 특이적으로 결합하는 제4항체를 포함하고,
형광 염료의 표면에는 실리카 층이 형성되고, 상기 실리카 층에는 -COOH 기가 형성되며,
상기 제1항체에 유로퓸(Europium) 입자 및 형광 염료를 결합하는 과정은 형광 염료-NHS ester와 제1항체를 접합하는 제1과정과, 상기 제1과정에서 형광 염료와 결합시킨 제1항체를 유로퓸 입자에 접합하는 제2과정으로 이루어지고,
상기 제1과정은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)과, 중탄산 나트륨 완충액(Sodium bicarbonate buffer)으로 조정된 제1항체를 넣고 교반하여 제1항체를 용해시킨 제1용액과, DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 DMF(dimethylformamide)에 녹인 게 형광 염료-NHS(N-Hydroxysuccinimide) ester를 첨가하고 암실에서 교반한 제2용액과, 상기 제1용액에 제2용액을 첨가하여 교반시킨 제3용액을 각각 마련한 다음, 상기 제3용액을 컬럼에 떨어뜨리고 상기 컬럼에서 형광 염료로 표지된 제1항체만을 분리한 항체 용액을 마련하여 이루어지고,
상기 제2과정은 표면에 실리카 층이 형성된 형광 염료를 NHS(N-Hydroxysuccinimide)를 함유하는 접합 완충액(conjugation buffer)에 녹인 다음 EDC(1-ethyl-3 3-dimethylaminopropyl carbodiimide)를 첨가하고 교반하면서 반응을 진행시켜 유로퓸 용액(Europium solution)을 마련한 다음, 상기 유로퓸 용액(Europium solution)과 항체 용액을 혼합하여 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 한다.As a means for achieving the object of the present invention, a quantitative analysis method using a high-sensitivity in vitro diagnostic kit according to the present invention is a method for quantitatively analyzing a target substance using a high-sensitivity in vitro diagnostic kit,
Supplying a sample containing a target material to a sample pad; Capturing the first antibody bound to the target substance in the third antibody by moving the sample to a conjugation pad; A first light source having a first wavelength is irradiated to europium particles and a second light source having a second wavelength different from the first wavelength is irradiated to the fluorescent dye, And simultaneously receiving a second optical signal emitted from the fluorescent dye by a photodiode to confirm the presence or absence of the signal and the strength of the second optical signal,
The high-sensitivity in vitro diagnostic kit comprises:
A support, and a strip secured on the support,
The strip includes a porous membrane formed of a nitrocellulose membrane, a conjugation pad disposed at one end of the porous membrane, and a sample pad provided at one end of the conjugation pad. Wherein the conjugation pad comprises a first antibody capable of binding with a target substance, Europium particles and a fluorescent dye bonded to the first antibody,
A test line and a control line are disposed on the porous membrane and a third antibody is formed on the test line to bind to the first antibody bound to the target material, and a fourth antibody that specifically binds to a second antibody present on a conjugation pad,
A silica layer is formed on the surface of the fluorescent dye, a -COOH group is formed on the silica layer,
The process for binding Europium particles and a fluorescent dye to the first antibody comprises a first step of binding a fluorescent dye -NHS ester to a first antibody, a first step of binding the first antibody bound to the fluorescent dye in the first step to europium And a second step of bonding to the particles,
In the first step, a first solution prepared by dissolving a first antibody dissolved in PBS (Phosphate-Buffered Saline) and a sodium bicarbonate buffer is added to the first solution, and the first solution is diluted with DMSO (dimethyl sulfoxide) or DMF (N-Hydroxysuccinimide) ester dissolved in dimethylformamide and stirred in a dark room, and a third solution in which the second solution is added to the first solution and stirred, A third solution is dropped onto a column, and an antibody solution obtained by separating only the first antibody labeled with a fluorescent dye in the column is provided,
The second step is to dissolve a fluorescent dye having a silica layer on its surface in a conjugation buffer containing NHS (N-Hydroxysuccinimide), add EDC (1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide) To prepare an europium solution, and then the europium solution and the antibody solution are mixed and reacted.
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상술한 바와 같은 본 발명에 따른 유로퓸 입자와 형광 염료를 이용한 고감도 체외 진단 키트 및 이를 이용한 정량 분석 방법 의하면, 항체에 결합된 유로퓸 입자와 형광 염료에서 방출되는 2개의 광신호가 합쳐진 신호를 하나의 리더기에서 수신하기 때문에 정확한 정량 분석과, 저농도의 시료에서도 높은 형광 시그널을 얻을 수 있는 유로퓸 입자와 형광 염료를 이용한 고감도 체외 진단 키트 및 이를 이용한 정량 분석 방법에 관한 것이다.According to the high-sensitivity in vitro diagnostic kit using the europium particles and the fluorescent dye according to the present invention and the quantitative analysis method using the europium particles and the fluorescent dye according to the present invention, the signal combining the europium particles bound to the antibody and the two optical signals emitted from the fluorescent dye is read out from one reader The present invention relates to a highly sensitive in vitro diagnostic kit using europium particles and a fluorescent dye capable of obtaining an accurate quantitative analysis and a high fluorescence signal even in a low concentration sample, and a quantitative analysis method using the same.
본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.The effects of the present invention are not limited to those mentioned above, and other solutions not mentioned may be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
도 1a은 본 발명에 따른 유로퓸 입자와 형광 염료를 이용한 고감도 체외 진단 키트의 구조를 도시하는 단면도이고, 도 1b는 본 발명의 테스트 라인에서 항체-항원-항체 결합체를 리더기로 분석하는 것을 모식적으로 나타낸 단면도이다.
도 2a는 본 발명의 형광 염료와 제1항체가 결합하는 모습을 도시하는 모식도이고, 도 2b는 본 발명의 유로퓸과 EDC/NHS와 반응하는 모습을 도시하는 모식도이며, 도 2c는 본 발명의 도 2a 및 도 2b의 생성물이 반응하는 모습을 도시하는 모식도이다.
도 3은 도 1b에 따라 2개의 laser diode를 사용해 레이저를 쏘아 하나의 photo diodefh 형광도를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 각 결합하는 물질에 따라 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.FIG. 1A is a cross-sectional view showing the structure of a highly sensitive in vitro diagnostic kit using europium particles and a fluorescent dye according to the present invention. FIG. 1B schematically shows analysis of an antibody-antigen-antibody complex in a test line of the present invention by a reader Fig.
FIG. 2A is a schematic diagram showing a state in which the fluorescent dye of the present invention and the first antibody are bound to each other, FIG. 2B is a schematic diagram showing a state in which europium is reacted with EDC / NHS according to the present invention, 2a and Fig. 2b. Fig.
FIG. 3 is a graph showing a result of confirming one photo diode fluorescence intensity by using a laser diode with two laser diodes according to FIG. 1b. FIG.
Fig. 4 shows the result of observation with a fluorescence microscope according to each binding substance.
본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 판례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.In the following description of the present invention, a detailed description of known functions and configurations incorporated herein will be omitted when it may make the subject matter of the present invention rather unclear. In addition, the terms described below are defined in consideration of the functions of the present invention, and these may vary depending on the intention of the user, the operator, or the precedent. Therefore, the definition should be based on the contents throughout this specification.
본 발명은 기존의 나노 입자(nano paticle)만을 사용하거나, 또는 형광 염료(fluorescent paticle)만을 사용하는 것과 달리, 본 발명에서는 제1항체에 나노 입자와 형광 염료를 동시에 결합함으로써, 고감도의 검출 신호를 얻을 수 있는 것을 특징으로 한다.Unlike conventional nanoparticles or fluorescent particles alone, the present invention simultaneously binds nanoparticles and fluorescent dyes to the first antibody, thereby providing a highly sensitive detection signal .
도 1a은 본 발명에 따른 유로퓸 입자와 형광 염료를 이용한 고감도 체외 진단 키트의 구조를 도시하는 단면도이고, 도 1b는 본 발명의 테스트 라인에서 항체-항원-항체 결합체를 리더기로 분석하는 것을 모식적으로 나타낸 단면도이다.FIG. 1A is a cross-sectional view showing the structure of a highly sensitive in vitro diagnostic kit using europium particles and a fluorescent dye according to the present invention. FIG. 1B schematically shows analysis of an antibody-antigen-antibody complex in a test line of the present invention by a reader Fig.
도 1a를 참조하면, 본 발명에 따른 유로퓸 입자와 형광 염료를 이용한 고감도 체외 진단 키트(100)는 측방 유도형(LFA,Lateral flow array) 형태의 스트립(110)을 포함하는 것으로서, 크게 지지체(101)와, 지지체(101) 상에 고정되는 스트립(strip)(110)을 포함하여 이루어진다.1A, the high-sensitivity in vitro
상기 스트립(110)은 상기 지지체(101)의 상부에 적층된 다공성 막(111)과, 상기 다공성 막(membrance)(111)의 일단에 배치되는 컨쥬게이션 패드(conjugation pad)(120)와, 상기 컨쥬게이션 패드(120)의 일단에 마련되는 샘플 패드(sample pad)(130)와, 상기 다공성 막(111)의 타단에 배치되는 흡수 패드(absobtion pad)(140)를 포함한다.The strip 110 includes a
상기 다공성 막(111)은 상기 지지체(101) 상에 고정되며, 모세관 현상에 의해 시료를 이동할 수 있도록 해주는 것으로서, 니트로 셀룰로오스(nitro cellulose)로 이루어지는 것을 예시할 수 있다.The
도 1b를 참조하면, 상기 컨쥬게이션 패드(120)에는 유로퓸(Europium) 입자(122) 및 형광 염료(123)가 결합된 제1항체(121)가 형성되는데, 시료가 상기 샘플 패드(130)를 지나 제1항체(121)와 제2항체(125)가 존재하는 컨쥬게이션 패드(120)로 이동하면 시료에 포함된 타겟 물질(예를 들어, 항원)과, 제1항체(121)가 항원-항체 결합을 하여 상기 타겟 물질은 라벨링된다.Referring to FIG. 1B, the
상기 다공성 막(111)에는 상호 이격하여 배치되는 테스트 라인(test line)(113) 및 컨트롤 라인(control line)(117)이 형성된다.A
상기 테스트 라인(113)에는 상기 타겟 물질과 결합한 제1항체(121)와 결합하는 제3항체(115)가 형성된다.A
상기 컨트롤 라인(117)에는 컨쥬게이션 패드(conjugation pad)에 존재하는 제2항체(125)와 특이적으로 결합하는 제4항체(119)가 형성된다.The
상기 흡수 패드(absobtion pad)(140)는 상기 샘플 패드(130), 컨쥬게이션 패드(120) 및 테스트 라인(113)과 컨트롤 라인(117)을 거쳐 이동한 시료를 흡수하고, 모세관 현상을 통해 시료가 이동할 수 있는 동력을 제공하는 역할을 수행한다.The
이하에서는, 제1항체에 유로퓸(Europium) 입자 및 형광 염료를 결합하는 과정을 설명한다.Hereinafter, the process of binding Europium particles and fluorescent dyes to the first antibody will be described.
도 2a는 본 발명의 형광 염료와 제1항체가 결합하는 모습을 도시하는 모식도이고, 도 2b는 본 발명의 유로퓸과 EDC/NHS와 반응하는 모습을 도시하는 모식도이며, 도 2c는 본 발명의 도 2a 및 도 2b의 생성물이 반응하는 모습을 도시하는 모식도이다.FIG. 2A is a schematic diagram showing a state in which the fluorescent dye of the present invention and the first antibody are bound to each other, FIG. 2B is a schematic diagram showing a state in which europium is reacted with EDC / NHS according to the present invention, 2a and Fig. 2b. Fig.
먼저, 도 2a를 참조하면, 표면에 NHS ester가 결합된 형광 염료(Dye)에 제1항체를 반응시키면 안정한 아마이드 결합을 한 라벨링된 제1항체를 얻을 수 있다.First, referring to FIG. 2A, a first antibody labeled with a stable amide bond can be obtained by reacting a first antibody with a fluorescent dye (Dye) having an NHS ester bonded to its surface.
다음으로, 도 2b를 참조하면, 실리카 층이 형성되고 표면에 -COOH를 갖는 유로퓸(Eu)에 EDC/NHS를 반응시키면 아민 반응성 유로퓸(amine reactive product)을 얻을 수 있다.Next, referring to FIG. 2B, an amine reactive product can be obtained by reacting EDC / NHS with europium (Eu) having a silica layer and -COOH on its surface.
그 다음으로, 도 2c를 참조하면, 유로퓸과 표지된 제1항체를 반응시키면, 제1항체를 중심으로 양쪽에 유로퓸과 형광 염료가 결합된 구조의 제1항체를 얻게 된다.Next, referring to FIG. 2C, when europium and the labeled first antibody are reacted, a first antibody having a structure in which europium and a fluorescent dye are bonded to both sides of the first antibody is obtained.
보다 구체적으로, 본 발명의 제1항체에 유로퓸(Europium) 입자 및 형광 염료를 결합하는 과정은 크게 형광 염료-NHS ester와 제1항체를 Conjugation하는 제1과정과, 상기 제1과정에서 형광 염료와 결합시킨 제1항체를 유로퓸 입자에 conjugation하는 제2과정으로 이루어질 수 있다.More specifically, the process of binding Europium particles and a fluorescent dye to the first antibody of the present invention comprises a first step of conjugating the fluorescent dye -NHS ester with the first antibody, a first step of conjugating the fluorescent dye -NHS ester with the first antibody, And a second step of conjugating the bound first antibody to europium particles.
상기 제1과정은 2.5ml vial에 1 × PBS(Phosphate-Buffered Saline), 1M Sodium bicarbonate buffer(pH 8.31) 제1항체를 넣고 30분 내지 1시간 동안 교반하여 제1항체를 용해시킨 제1용액(solution)을 마련한다.In the first step, a first antibody (1 × PBS (Phosphate-Buffered Saline) and 1 M sodium bicarbonate buffer (pH 8.31) was added to a 2.5 ml vial and stirred for 30 minutes to 1 hour to obtain a first solution solution.
그리고 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 DMF(dimethylformamide)에 녹인 fluorescent dye-NHS(N-Hydroxysuccinimide) ester를 첨가하고, 암실에서 1시간 정도 교반하여 제2용액을 마련한다.Then, a fluorescent dye-NHS (N-Hydroxysuccinimide) ester dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) is added and stirred for about 1 hour in a dark room to prepare a second solution.
제1용액에 제2용액을 첨가해주고, 약 1시간 정도 교반시킨 제3용액을 마련한다. 상기 제3용액을 미리 준비한 G-25로 컬럼에 떨어뜨리고, 상기 컬럼에서 형광 염료로 표지된 제1항체만을 분리한 항체 용액을 마련한다.The second solution is added to the first solution, and the third solution is stirred for about one hour. The third solution is dropped onto a column with G-25 prepared in advance, and an antibody solution obtained by separating only the first antibody labeled with a fluorescent dye is prepared in the column.
상기 항체 용액을 UV-visible spectromiter로 측정해 제1항체의 purify와 항체/dye간의 결합 ratio를 계산한 다음, 냉장 및 암실에서 보관한다.The antibody solution is measured with a UV-visible spectrometer to calculate the binding ratio between the purify of the first antibody and the antibody / dye, and then stored in the refrigerator and the dark room.
상기 제2과정은 먼저 EDC(1-ethyl-3 3-dimethylaminopropyl carbodiimide)를 room temperature에 두어 equilibrate시킨다.The second step is to equilibrate EDC (1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide) at room temperature.
Europium@carboxylate_modified microspheres를 NHS를 함유하는 conjugation buffer에 녹인 다음 상기 EDC를 첨가하고, 약 2시간 정도 room temperature에서 교반하면서 반응을 진행시켜 유로퓸 용액(Europium solution)을 마련한다.Europium @ carboxylate_modified microspheres are dissolved in a conjugation buffer containing NHS, EDC is added, and the reaction is carried out at room temperature for about 2 hours to prepare an europium solution.
상기 유로퓸 용액(Europium solution)과 항체 용액을 혼합하여 반응시키면 제1항체에 유로퓸(Europium) 입자 및 형광 염료가 결합된 최종 생성물을 얻을 수 있다. 상기 최종 생성물은 컨쥬게이션 패드에 적층된다.When the europium solution and the antibody solution are mixed and reacted, an end product in which europium particles and a fluorescent dye are bound to the first antibody can be obtained. The final product is laminated to a conjugation pad.
상기 최종 생성물 보관 시에는 냉장(단기간 보관) 또는 냉동(장기간 보관)으로 보관한다. When storing the final product, it is stored in a refrigerator (short-term storage) or freezing (long-term storage).
이하에서는 본 발명의 진단 키트를 사용하여 표적물질을 정량 분석하는 방법을 살펴보도록 한다.Hereinafter, a method for quantitatively analyzing a target substance using the diagnostic kit of the present invention will be described.
본 발명의 진단 키트를 사용하여 표적물질을 정량 분석하는 방법은 도 1b를 다시 참조하면, 타겟 물질을 포함하는 시료를 샘플 패드(130)에 공급하는 단계와, 상기 시료가 제1항체와 제2항체가 존재하는 컨쥬게이션 패드(120)로 이동하여 상기 타겟 물질과 결합한 제1항체(121)를 상기 제3항체(115)에서 포획하는 단계와, 제1파장을 가지는 제1광원(201)을 유로퓸(Europium) 입자에 조사하고, 상기 제1파장과 다른 제2파장을 가지는 제2광원(202)을 상기 형광 염료에 조사하여 상기 유로퓸에서 방출하는 제1광신호와 상기 형광 염료에서 방출하는 제2광신호를 하나의 포토다이오드(photo diode)에서 동시에 수신하여 신호 유무 및 세기를 확인하는 단계로 이루어질 수 있다.Referring to FIG. 1B again, a method of quantitatively analyzing a target substance using the diagnostic kit of the present invention includes the steps of supplying a sample containing a target material to a
여기서, 제1광원(201) 및 제2광원(202)은 레이저를 이용하는 것을 예시할 수 있으며, 상기 제1, 2광신호는 형광신호인 것을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Here, the first
도 3은 도 1b에 따라 2개의 laser diode를 사용해 레이저를 쏘아 하나의 photo diodefh 형광도를 확인한 결과를 나타내는 그래프로서, 도 1b와 도 3을 함께 참조하면, 본 발명은 상기 유로퓸(Europium) 입자 및 형광 염료에서 흡수하는 제1, 2광원의 파장은 서로 다르지만, 유로퓸(Europium) 입자 및 형광 염료에서 방출하는 제1광신호와 제2광신호의 파장은 비슷한 것을 이용한 것으로서, 하나의 포토다이오드(photo diode) 내지 리더기에서는 비슷한 대역의 제1, 2광신호를 동시에 수신하기 때문에 고감도 검출 성능을 발휘할 수 있고, 저농도의 시료에서도 정확한 정량 분석이 가능하며, 질병을 보다 정밀하고 신속하게 진단할 수 있는 장점이 있다. 즉, 제1, 2광신호가 도 3에 도시된 바와 같이 한 파장에서 합쳐져 형광신호를 형성하기 때문에 고감도 신호를 얻을 수 있다.FIG. 3 is a graph showing a result of confirming one photo diode fluorescence intensity by using a laser diode with two laser diodes according to FIG. 1B. Referring to FIGS. 1B and 3, Although the wavelengths of the first and second light sources absorbed by the fluorescent dye are different from each other, the wavelengths of the first and second optical signals emitted from the Europium particles and the fluorescent dye are similar to each other, and one photodiode (photo diodes) and readers simultaneously receive the first and second optical signals of the same band. Therefore, it is possible to exhibit high sensitivity detection performance, enable precise quantitative analysis even in a low concentration sample, and can diagnose the disease more precisely and quickly . That is, since the first and second optical signals are combined at one wavelength as shown in FIG. 3 to form a fluorescence signal, a high-sensitivity signal can be obtained.
그리고 본 발명을 통해 진단 가능한 질병은 TSH(갑상선 자극 호르몬)과 관련질병인 것을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The diseases which can be diagnosed by the present invention are exemplified by TSH (thyroid stimulating hormone) -related diseases, but the present invention is not limited thereto.
이하에서는 본 발명에서 결합되는 물질에 따른 형광도 비교분석을 위한 진단키트 분석 실험예를 제공한다.Hereinafter, examples of assay kits for comparative analysis of fluorescence according to the substance to be bound in the present invention are provided.
[[ 실험예Experimental Example ]]
(1) 실험 방법(1) Experimental method
DISPENSER SYSTEM(ZETA corporation, 한국)을 사용한 스트립에 대한 라인 분주에 대한 방법 및 키트 분석방법을 제공한다.Provides method and kit analysis method for line dispensing for strip using DISPENSER SYSTEM (ZETA corporation, Korea).
여기서, 라인분주는 DISPENSER SYSTEM(ZETA corporation, 한국) 장비를 이용하여 1.0uL/cm의 분주량, 60mm/sec의 속도로 진단키트의 test, control line에 해당하는 NC membrane에 capture antibody를 붙인다.Here, line dispensation is carried out using a DISPENSER SYSTEM (ZETA corporation, Korea), a test kit of the diagnostic kit at a rate of 1.0 uL / cm 2 at a rate of 60 mm / sec, and a capture antibody to the NC membrane corresponding to the control line.
항체 Rat Ig G(Jackson Immuno research, 미국)를 1xPBS에 1mg/ml의 농도로 녹인 후, DISPENSER SYSTEM(ZETA corporation, 한국)을 사용하여 항체의 분주를 시작한다. 분주가 완료되면 컷팅을 하고, 조립하여 키트를 만든다. 만들어진 Buffer를 sample pad에 로딩하여 분석을 실시한다. Antibody Rat Ig G (Jackson Immuno research, USA) is dissolved in 1xPBS at a concentration of 1 mg / ml and the dispensation of the antibody is started using a DISPENSER SYSTEM (ZETA corporation, Korea). When dispensing is complete, cut and assemble to make the kit. Perform the analysis by loading the prepared buffer onto the sample pad.
(2) Base Buffer의 제조(2) Preparation of Base Buffer
1xPBS, 0.5% Tween 20, 1% BSA, 0.1% Sodium azide를 비커에 넣고 다 녹을 때까지 교반한다.Add 1xPBS, 0.5% Tween 20, 1% BSA, 0.1% Sodium azide into a beaker and stir until all is dissolved.
(3)Conjugation pad의 조성(3) Composition of Conjugation pad
염료 및 유로퓸 입자로 표지 된 anti Rat Ig G(Jackson Immuno research, 미국)가 농도 0.1ug/ml로 존재한다.Dye and europium particles labeled anti Rat Ig G (Jackson Immuno research, USA) are present at a concentration of 0.1 ug / ml.
(4) Strip의 제조(4) Manufacture of Strips
sample pad는 grade 319, conjugation pads는 grade 8964, NC membrane은 Nu-10u을사용 하며, Absorption pad로는 grade 222을 사용하여 strip을 제조하였다.The sample pad was grade 319, the conjugation pads were grade 8964, the NC membrane was Nu-10u, and the absorption pad was grade 222.
그리고 도 4를 참조하면, 위 실험예((a)Eu-단백질-형광물질)과 함께, (b) 형광물질-단백질, (c) Eu-단백질 및 (d) 단백질(표지되지 않은 대조군)에 대하여 레이저를 조사하였을 때 방출되는 광신호를 형광 현미경으로 촬영한 결과, 본 발명의 실험예인 (a)Eu-단백질-형광물질가, 나머지 (b) 형광물질-단백질, (c) Eu-단백질 및 (d) 단백질(표지되지 않은 대조군)에 비해 광신호 세기 내지 밝기가 현저히 강하다는 것을 확인할 수 있었다.(B) fluorescence-protein, (c) Eu-protein and (d) protein (unlabeled control) together with the above experiment ((a) Eu-protein-fluorescent substance) (B) fluorescence-protein, (c) Eu-protein, and (c) Eu-protein-fluorescent substance, which are experimental examples of the present invention, were obtained by photographing a light signal emitted when a laser was irradiated with a fluorescence microscope. d) It was confirmed that the optical signal intensity or brightness was remarkably stronger than that of the protein (unlabelled control group).
이상에서 설명된 본 발명은 예시적인 것에 불과하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, is intended to cover various modifications and equivalent arrangements included within the spirit and scope of the invention. Therefore, it is to be understood that the present invention is not limited to the above-described embodiments. Accordingly, the true scope of the present invention should be determined by the technical idea of the appended claims. It is also to be understood that the invention includes all modifications, equivalents, and alternatives falling within the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.
100 : 체외 진단 키트 101 : 지지체
110 : 스트립 111 : 다공성 막
113 : 테스트 라인 115 : 제3항체
117 : 컨트롤 라인 119 : 제4항체
120 : 컨쥬게이션 패드 121 : 제1항체
122 : 유로퓸 입자 123 : 형광 염료
125 : 제2항체 130 : 샘플 패드
140 : 흡수 패드 201 : 제1광원
202 : 제2광원 203 : 포토다이오드100: In Vitro Diagnostic Kit 101: Support
110: Strip 111: Porous membrane
113: Test line 115: Third antibody
117: control line 119: fourth antibody
120: conjugation pad 121: first antibody
122: Europium particle 123: Fluorescent dye
125: Second antibody 130: Sample pad
140: absorption pad 201: first light source
202: second light source 203: photodiode
Claims (6)
타겟 물질을 포함하는 시료를 샘플 패드에 공급하는 단계와; 상기 시료가 컨쥬게이션 패드로 이동하여 상기 타겟 물질과 결합한 제1항체를 상기 제3항체에서 포획하는 단계와; 제1파장을 가지는 제1광원을 유로퓸(Europium) 입자에 조사하고, 상기 제1파장과 다른 제2파장을 가지는 제2광원을 상기 형광 염료에 조사하여 상기 유로퓸에서 방출하는 제1광신호와 상기 형광 염료에서 방출하는 제2광신호를 하나의 포토다이오드(photo diode)에서 동시에 수신하여 신호 유무 및 세기를 확인하는 단계;를 포함하되,
상기 고감도 체외 진단 키트는,
지지체와, 지지체 상에 고정되는 스트립을 포함하며,
상기 스트립은, 상기 지지체의 상부에 적층되며 nitro cellulose membrane으로 이루어지는 다공성 막과, 상기 다공성 막의 일단에 배치되는 컨쥬게이션 패드(conjugation pad)와, 상기 컨쥬게이션 패드의 일단에 마련되는 샘플 패드(sample pad)를 포함하고, 상기 컨쥬게이션 패드에는 타겟 물질과 결합 가능한 제1항체와, 상기 제1항체에 결합되는 유로퓸(Europium) 입자 및 형광 염료를 포함하며,
상기 다공성 막에는 테스트 라인(test line) 및 컨트롤 라인(control line)이 배치되고, 상기 테스트 라인에는 상기 타겟 물질과 결합한 제1항체와 결합하는 제3항체가 형성되며, 상기 컨트롤 라인에는 컨쥬게이션 패드(conjugation pad)에 존재하는 제2항체와 특이적으로 결합하는 제4항체를 포함하고,
형광 염료의 표면에는 실리카 층이 형성되고, 상기 실리카 층에는 -COOH 기가 형성되며,
상기 제1항체에 유로퓸(Europium) 입자 및 형광 염료를 결합하는 과정은 형광 염료-NHS ester와 제1항체를 접합하는 제1과정과, 상기 제1과정에서 형광 염료와 결합시킨 제1항체를 유로퓸 입자에 접합하는 제2과정으로 이루어지고,
상기 제1과정은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)과, 중탄산 나트륨 완충액(Sodium bicarbonate buffer)으로 조정된 제1항체를 넣고 교반하여 제1항체를 용해시킨 제1용액과, DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 DMF(dimethylformamide)에 녹인 게 형광 염료-NHS(N-Hydroxysuccinimide) ester를 첨가하고 암실에서 교반한 제2용액과, 상기 제1용액에 제2용액을 첨가하여 교반시킨 제3용액을 각각 마련한 다음, 상기 제3용액을 컬럼에 떨어뜨리고 상기 컬럼에서 형광 염료로 표지된 제1항체만을 분리한 항체 용액을 마련하여 이루어지고,
상기 제2과정은 표면에 실리카 층이 형성된 형광 염료를 NHS(N-Hydroxysuccinimide)를 함유하는 접합 완충액(conjugation buffer)에 녹인 다음 EDC(1-ethyl-3 3-dimethylaminopropyl carbodiimide)를 첨가하고 교반하면서 반응을 진행시켜 유로퓸 용액(Europium solution)을 마련한 다음, 상기 유로퓸 용액(Europium solution)과 항체 용액을 혼합하여 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 고감도 체외 진단 키트를 이용한 정량 분석 방법.
A method for quantitatively analyzing a target substance using a high-sensitivity in vitro diagnostic kit,
Supplying a sample containing a target material to a sample pad; Capturing the first antibody bound to the target substance in the third antibody by moving the sample to a conjugation pad; A first light source having a first wavelength is irradiated to europium particles and a second light source having a second wavelength different from the first wavelength is irradiated to the fluorescent dye, And simultaneously receiving a second optical signal emitted from the fluorescent dye by a photodiode to confirm the presence or absence of the signal and the strength of the second optical signal,
The high-sensitivity in vitro diagnostic kit comprises:
A support, and a strip secured on the support,
The strip includes a porous membrane formed of a nitrocellulose membrane, a conjugation pad disposed at one end of the porous membrane, and a sample pad provided at one end of the conjugation pad. Wherein the conjugation pad comprises a first antibody capable of binding with a target substance, Europium particles and a fluorescent dye bonded to the first antibody,
A test line and a control line are disposed on the porous membrane and a third antibody is formed on the test line to bind to the first antibody bound to the target material, and a fourth antibody that specifically binds to a second antibody present on a conjugation pad,
A silica layer is formed on the surface of the fluorescent dye, a -COOH group is formed on the silica layer,
The process for binding Europium particles and a fluorescent dye to the first antibody comprises a first step of binding a fluorescent dye -NHS ester to a first antibody, a first step of binding the first antibody bound to the fluorescent dye in the first step to europium And a second step of bonding to the particles,
In the first step, a first solution prepared by dissolving a first antibody dissolved in PBS (Phosphate-Buffered Saline) and a sodium bicarbonate buffer is added to the first solution, and the first solution is diluted with DMSO (dimethyl sulfoxide) or DMF (N-Hydroxysuccinimide) ester dissolved in dimethylformamide and stirred in a dark room, and a third solution in which the second solution is added to the first solution and stirred, A third solution is dropped onto a column, and an antibody solution obtained by separating only the first antibody labeled with a fluorescent dye in the column is provided,
The second step is to dissolve a fluorescent dye having a silica layer on its surface in a conjugation buffer containing NHS (N-Hydroxysuccinimide), add EDC (1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide) Wherein the europium solution is prepared by preparing an europium solution, and then the europium solution and the antibody solution are mixed and reacted. The method for quantitative analysis using the high-sensitivity in vitro diagnostic kit.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| GRNT | Written decision to grant |