KR101795262B1 - Simple Sequence Repeat DNA primer for discrimination of Angelica gigas, Angelica acutiloba and Angelica sinesis - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 당귀 판별을 위한 SSR 마커에 대한 프라이머 세트 및 이를 이용한 당귀의 판별방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for SSR markers for the identification of Angelica gigas, and a method for identifying Angelica gigas using the primer set.
당귀는 decursin, decursinol angelate, nodakenin, β-sitoster, polyacetylene계, Phthalide계, cumarin계, Adenosine, ligustilide, butylphthalide 등의 성분을 갖고 있으며, 자궁기능조절, 면역기능 활성화, 항염, 진통, 항균, 혈액순환개선, 항산화, 면역조정, 항종양 및 조혈 작용 증진, 생리불순, 무월경 등 여성혈관계 질환에 효능이 뛰어나며 대장의 건강에도 효능이 있다. 한약재로서 사용되는 당귀는 한국에서는 참당귀 ‘Angelica gigas’를 기원으로 하며 일본에서는 일당귀 ‘Angelica acutiloba’, 중국에서는 중국당귀 ‘Angelica sinesis’가 기원식물로 같은 용도의 한약재로 사용되어 지며 유사한 효능을 나타낸다. 국내에서 한약재로 사용되어 지는 당귀는 “대한민국약전”에 등재된 참당귀 ‘Angelica gigas’를 기원으로 한다. 국내에서 재배되고 있는 당귀로는 참당귀와 일당귀가 가장 많이 재배되고 있다. 국내 한약재 시장에 유통되어지는 당귀의 문제점으로는 일당귀, 중국당귀 및 참당귀의 원료혼용이 문제점으로 야기되어지고 있다. Angelica has components such as decursin, decursinol angelate, nodakenin, β-sitoster, polyacetylene, phthalide, cumarin, adenosine, ligustilide and butylphthalide and has functions such as regulation of uterine function, activation of immune function, anti-inflammation, analgesia, It is effective for female vascular diseases such as improvement, antioxidation, immune regulation, promotion of antitumor and hematopoiesis, physiological impurity, amenorrhea, and is effective for the health of the colon. Angelica ginseng is used as a medicinal herb in Korea. Angelica gigas originated in Korea, Angelica acutiloba in Japan and Angelica sinesis in China are used as originals and have similar efficacy. . Angelica gigas is the origin of Angelica gigas, which is listed in the "Korean Pharmacopoeia". In Korea, cultivated Angelica angustifolia is the most cultivated. As a problem of Angelica gigas, which is distributed in Korean herbal medicine market, there is a problem in mixing raw materials of Angelica gigas, Angelica gigas and Angelica gigas.
최근 들어 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종내 품종간 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있다. 이를 위하여 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(genetic diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되고 있다. 분자생물학 수준에서의 DNA 분석에 의한 변종의 감별은 그 변종의 양적수준과 더불어 다수의 특성을 파악하여 알 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 그 중에서 RFLP(제한효소 단편 장다형, Restriction Fragment Length Polymorphism)는 일련의 DNA 사슬을 제한효소로 처리했을 때 생기는 DNA 단편들이 개체간의 유전적 조성의 차이 즉, 염기 서열상의 차이에 따라서 그 수나 길이가 서로 다르게 나타난다는 사실에 기초한 것으로써 다양하게 이용되고 있다. 하지만, RFLP는 순도가 높은 DNA가 다량으로 필요하며 시간과 노력과 비용이 많이 소요될 뿐 아니라 시험과정이 복잡하고 방사성 동위원소를 이용해야 하는 단점이 있다.In recent years, along with the radical development of molecular biology, molecular biology methods have been widely used to classify plants as genus, species or species. To this end, nucleic acid fingerprint analysis methods and various DNA markers have been developed that enable genetic diversity studies at the DNA level. The discrimination of strains by DNA analysis at the level of molecular biology has the advantage of being able to grasp many characteristics along with the quantitative level of the strains and to exclude the influence of the environment. Among them, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) is a technique in which DNA fragments generated when a series of DNA chains are treated with a restriction enzyme have a number or length depending on the difference in genetic composition between individuals, that is, It is based on the fact that it appears differently and is being used variously. However, RFLP requires a large amount of high purity DNA, is time-consuming, laborious and costly, has a complicated test procedure, and has a disadvantage of using radioactive isotopes.
이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로 간단하고 신속한 결과를 얻을 수 있는 SSR 마커를 이용한 PCR 기술을 이용할 수 있다. SSR는 짧은 염기서열의 반복 8-12 뉴클레오티드)으로 만들어져 있어, PCR 반응에서 식물 유전체에 결합하여 DNA를 증폭시킨다. 그 결과 식물의 종, 또는 속에 따라 다양한 크기의 DNA 조각을 만들어 증폭시킨다. 이것은 전기영동 방법을 사용하여 그 패턴을 판독함으로서 고유한 프로필을 SSR 반응에서 수집할 수 있다. To overcome these problems, PCR technology using SSR markers can be used to obtain simple and rapid results. SSR is made up of repeating 8-12 nucleotides of short base sequence), which binds to the plant genome in the PCR reaction and amplifies the DNA. As a result, DNA fragments of various sizes are made and amplified according to the plant species or genus. This allows the unique profile to be collected in the SSR reaction by reading the pattern using an electrophoretic method.
이에 본 발명자들은 분자생물학적인 접근 중 SSR 마커의 증폭을 이용하여,“대한민국약전”에 등록되어진 당귀의 기원식물인 참당귀를 정확히 판별하고 국내 한약재 시장에서 유통되는 당귀의 원료의 혼용을 방지하고 국내에서 생산되는 참당귀의 품질관리법으로 사용하고자, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 차이를 비교 분석하기 위한 총 4개의 SSR 프라이머 세트를 제작하였고, 특이적인 밴드가 형성되는 것을 통해, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors used the amplification of the SSR marker during the molecular biological approach to accurately determine the genus Angelica gigas, the origin of Angelica gigas, which is registered in the "Korean Pharmacopoeia", and to prevent the mixture of raw materials of Angelica gigas A total of 4 SSR primer sets were prepared for comparative analysis of the differences between Chrysanthemum japonica, Chrysanthemum morifolium and Chrysanthemum japonica for use as a quality control method of Chrysanthemum morifolium. The present inventors completed the present invention by confirming that it is possible to discriminate Chinese angelica.
따라서 본 발명의 목적은 국내에서 유통되는 당귀의 기원을 효과적으로 판별할 수 있는 SSR 프라이머를 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an SSR primer capable of effectively discriminating the origins of Angelica gigas Nakai distributed in Korea.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 다른 목적은 상기 SSR 프라이머를 포함하는 당귀 판별용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for the determination of Angelicae gigantis comprising the SSR primer.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 당귀 판별용 키트를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a kit for the identification of Angelicae ginseng comprising the above composition.
본 발명의 또 다른 목적은 당귀 DNA를 본 발명의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 참당귀, 일당귀 또는 중국당귀를 구별하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for distinguishing true Angelica gigas, Angelica gigas, or Chinese Angelica gigas, comprising the step of performing PCR using Angelica gigas DNA using the primer of the present invention.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, In order to achieve the above-mentioned object of the present invention,
본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; The present invention relates to a primer set of SEQ ID NOS: 1 and 2;
서열번호 3 및 4의 프라이머 세트;A primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4;
서열번호 5 및 6의 프라이머 세트;및A primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6;
서열번호 7 및 8 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 당귀 판별용 SSR(Simple Sequence Repeat) 프라이머 세트를 제공한다.SEQ ID NOS: 7 and 8 primer set; and SSR (Simple Sequence Repeat) primer set for discriminating at least one kind of Angelica gigantorum.
또한, 본 발명은 상기 프라이머를 포함하는 당귀 판별용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for identifying Angelica gigantum comprising the primer.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 당귀 판별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for the identification of Angelica gigantum comprising the above composition.
또한, 본 발명은 당귀 DNA를 본 발명의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 참당귀 또는 일당귀를 구별하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for distinguishing true angelica or monkeyia, comprising the step of performing PCR using the primer of the present invention.
본 발명의 일실시예에서, 상기 구별은 PCR을 통해 수득한 PCR 산물의 전기영동 패턴을 분석하는 것으로 수행하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the distinction may be performed by analyzing an electrophoresis pattern of the PCR product obtained through PCR.
본 발명의 프라이머 세트 및 이를 이용한 당귀의 구별방법은 당귀의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 이를 통해 당귀의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입 시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 당귀의 품종을 판별할 수 있는 효과가 있다. 또한, 국내에 산재해 있는 토종 품종(계통)의 구분을 명확히 할 수 있을 뿐만 아니라 이름 없는 품종들의 신품종 등록이 가능하여 우리의 소중한 유전자원을 보호할 수 있으며, 국내산과 수입산의 식별이 가능해져 국내 당귀 시장의 유통질서를 확립하는데 기여할 수 있다.The primer set of the present invention and the method for distinguishing angelica gigas using the same can be very useful for preparing the DNA profile of Angelica gigas, and by efficiently evaluating the genetic resources of Angelica gigas, Analysis and novelty can be effectively performed, and it is possible to discriminate the varieties of Angelica gigas. In addition, it is possible to clearly distinguish native varieties (strains) scattered in Korea, and to register new varieties of unnamed varieties, thereby protecting our valuable genetic resources and enabling identification of domestic and imported varieties. It can contribute to establishment of the order of distribution of the market of Angelica gigas.
도 1은 ag ssr 2-2 프라이머 세트(서열번호 1 및 2)를 이용하여 당귀를 구별한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 ag ssr 2-4 프라이머 세트(서열번호 3 및 4)를 이용하여 당귀를 구별한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 ag ssr 5-2 프라이머 세트(서열번호 5 및 6)을 이용하여 당귀를 구별한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 ag ssr 5-5 프라이머 세트(서열번호 7 및 8)을 이용하여 당귀를 구별한 결과를 나타낸 도이다. Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a diagram showing the results of discriminating Angelica gigas using the ag ssr 2-2 primer set (SEQ ID NOS: 1 and 2).
Fig. 2 is a diagram showing the results of discriminating Angelicae gigatsu using ag ssr 2-4 primer sets (SEQ ID NOS: 3 and 4).
Fig. 3 is a diagram showing the results of distinguishing angelica gigas using the ag ssr 5-2 primer set (SEQ ID NOS: 5 and 6).
4 is a diagram showing the results of distinguishing angelica guinea using ag ssr 5-5 primer sets (SEQ ID NOS: 7 and 8).
본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; The present invention relates to a primer set of SEQ ID NOS: 1 and 2;
서열번호 3 및 4의 프라이머 세트;A primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4;
서열번호 5 및 6의 프라이머 세트;및A primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6;
서열번호 7 및 8 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 당귀 판별용 SSR(Simple Sequence Repeat) 프라이머 세트를 제공한다.SEQ ID NOS: 7 and 8 primer set; and SSR (Simple Sequence Repeat) primer set for discriminating at least one kind of Angelica gigantorum.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 참당귀, 일당귀 및 중국당귀에서 참당귀를 판별하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.In the present invention, the primer set of SEQ ID NOS: 1 and 2 or the primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4 may be characterized by distinguishing True Angelica from Angelicae gigantis, Angelicae gigantis, and Chinese Angelica gigas.
본 발명에서 있어서, 상기 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트 또는 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트는 참당귀, 일당귀 및 중국당귀에서 중국당귀를 판별하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.In the present invention, the primer set of SEQ ID NOs: 5 and 6 or the primer set of SEQ ID NOs: 7 and 8 can be characterized by distinguishing Chinese Angelicae from Angelicae gigantis, Angelica gigas and Chinese Angelica gigas.
본 발명에서 상기 ‘당귀’는 어린순을 나물로 식용하고 뿌리를 당귀라고 하며 약제로 사용한다. 당귀는 중국산을 중국당귀(안젤리카 시넨시스, A. sinensis), 일본산을 왜당귀 또는 일당귀(안젤리카 아큐틸로바, A. acutiloba), 한국산을 참당귀(안젤리카 기가스, A. gigas)라고 한다. 한국·중국·일본 등지에 분포한다.In the present invention, the 'Angelica koreana' is used as a herb, and its roots are called angri, and is used as a medicine. Angelica sinensis is the Chinese origin, Angelica gigas is A. gigas, and Angelica gigas is the Korean mountain. It is distributed in Korea, China, and Japan.
본 발명에서 사용되는 SSR(Simple Sequence Repeat)은 미세부수체(Microsatellites) 또는 Short Tandem Repeats (STRs)라고도 불리는 DNA 다형성의 일종이다. SSR은 일반적으로 중립이고 공우성(co-dominant)이며, 혈통이나 군집에서 표현형과 유전형을 매개할 수 있는 유전학적인 마커로 사용되는 유전체 내의 1-6개의 반복되는 염기서열을 의미한다. The SSR (Simple Sequence Repeat) used in the present invention is a kind of DNA polymorphism called Microsatellites or Short Tandem Repeats (STRs). SSRs are usually neutral and co-dominant, meaning 1-6 repeated nucleotide sequences in the genome used as genetic markers that can mediate phenotypes and genotypes in lineage or population.
본 발명에서 용어, ‘프라이머'란 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시에서는, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 프라이머를 사용하였다. In the present invention, the term 'primer' refers to a short nucleic acid sequence capable of forming a base pair with a complementary template and functioning as a starting point for template strand copying. In a specific embodiment of the invention, SEQ ID NOS: 1 and 2; SEQ ID NOS: 3 and 4; SEQ ID NOS: 5 and 6; One primer selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 7 and 8 was used.
또 다른 양태로서, 상기 프라이머 세트를 포함하는 당귀 판별용 조성물을 제공한다.In another embodiment, there is provided a composition for determining the genitalia of Angelica gigas comprising the primer set.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 당귀 판별용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for the identification of Angelicae kaleiensis comprising the above composition.
본 발명에 따른 당귀 판별용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 시료 내에서 당귀 판별을 위하여 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.In addition to the primer set, the kit for the identification of angelica ginseng according to the present invention may further include a reaction buffer solution, a polymerase, a dNTP, a stabilizer, and all biological or chemical reagents and instructions for identification of Angelica gigas in a sample. Other configurations of such kits may be suitably selected by those skilled in the art.
또 다른 양태로서, 본 발명은 당귀 DNA를 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;를 포함하는, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for distinguishing between Angelicae gigantis, Angelica gigas, and Chinese Angelica gigas, comprising performing a PCR using the primer set of claim 1.
상기 구별은 PCR을 통해 수득한 PCR 산물의 전기영동 패턴을 분석하는 것으로 수행하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The discrimination may be performed by analyzing the electrophoresis pattern of the PCR product obtained through PCR.
본 발명의 상기 개체는 판별하고자 하는 대상 당귀이다.The subject of the present invention is a target Angelicae to be discriminated.
본 발명의 PCR 수행은, 개체로부터 얻어진 핵산 시료를 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머 세트를 갖는 당귀 판별용 SSR 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. The PCR of the present invention can amplify the target sequence by amplifying the nucleic acid sample obtained from the individual using the SSR primer for the geneticin determination with the primer set selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 8.
본 발명의 일실시예에 있어서, PCR 수행은 90 내지 100℃에서 1분 내지 5분간 preheating을 거친 후, 90 내지 100℃에서 1분 내지 5분(denaturation), 45 내지 60℃에서 10초 내지 50초(annealing), 72℃에서 30초 내지 2분(extension)간의 반응을 30 내지 40회 실시하고, 최종 extension 과정으로 72℃에서 1 내지 10분간하는 과정을 30 내지 40 cycle 반복하여 반응시키는 과정을 통해 이루어질 수 있다.In one embodiment of the present invention, PCR is performed by preheating at 90 to 100 ° C for 1 to 5 minutes, followed by denaturation at 90 to 100 ° C for 1 minute to 5 minutes, at 45 to 60 ° C for 10 seconds to 50 Annealing at 72 ° C for 30 seconds to 2 minutes and 30-40 cycles at 72 ° C for 1 to 10 minutes in a final extension step is repeated for 30 to 40 cycles, Lt; / RTI >
상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCT 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다. The target sequence amplified by the PCR may be labeled with a detectable labeling substance. In one specific example, the labeling material can be, but is not limited to, a material that emits fluorescence, phosphorescence, or radiation. Preferably, the labeling substance is Ethidium Bromide (EtBr), Cy-5 or Cy-3. When the target sequence is amplified, PCR is carried out by labeling the 5'-end of the primer with Cy-5 or Cy-3, and the target sequence may be labeled with a detectable fluorescent labeling substance. In addition, if the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCT reaction solution during the PCR, the amplification product may be synthesized and the radiation may be incorporated into the amplification product and the amplification product may be labeled with the radiation.
상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.Detection of the amplified product can be performed through DNA chip, gel electrophoresis, radiation measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As one method of detecting the amplification product, gel electrophoresis can be performed. Gel electrophoresis can be performed using agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. Also, in the fluorescence measurement method, Cy-5 or Cy-3 is labeled at the 5'-end of the primer. When PCR is carried out, the target is labeled with a fluorescent label capable of detecting the target sequence. The labeled fluorescence is measured using a fluorescence meter can do. In addition, in the case of performing the PCR, the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution to mark the amplification product, and then the radioactivity is measured by a radiation measuring device such as a Geiger counter or liquid scintillation counter The radiation can be measured using a liquid scintillation counter.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
[[ 실시예Example 1] SSR 1] SSR 마커를Marker 이용한 참당귀, However, 일당귀Unreasonable 및 중국당귀 감별 And Chinese Angelicae
1. 참당귀, 1. True Angelica, 일당귀Unreasonable 및 중국당귀로부터 DNA 추출 And DNA Extraction from Chinese Angelica
참당귀 5개체, 일당귀 5개체 및 중국당귀 5개체를 준비하였다. 일당귀 5개체 및 중국당귀 5개체의 경우, 국내 온라인 쇼핑몰(다농, 아람씨앗, 성우종묘, 아시아종묘, 민속씨앗, 세계종묘에서 구매하여 유식물을 키워 무작위로 5개체를 선택하여 DNA를 추출하여 실험에 사용하였음)에 거래되는 종묘회사의 종자를 구입하여 파종 후 유식물을 사용하였으며, 참당귀 5개체는 충북대학교 약초실습 포장의 5개체에서 잎을 채취하여 발명의 시료(재료)로 이용하였다. 5 ginseng, 5 ginseng and 5 ginseng were prepared. 5 individuals and 5 individuals in China were purchased from domestic online shopping malls (Danong, Aram Seed, Sungwoo Jongmyo, Asian Seedling, Folk Seed and World Seed), and 5 selected individuals were randomly selected for DNA extraction And 5 seedlings of Chrysanthemum japonica were collected from 5 individuals of Chungbuk National University Herbal Practice Package and used as a sample (material) of the invention.
상기 준비된 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 샘플을 액체질소를 이용하여 얼린 뒤 막자사발로 분쇄하여 1g을 준비한 후 CTAB 방법을 이용하여 추출하였고, TE 버퍼에 용출시켜 각각의 DNA를 5ng으로 정량하였다. 보다 구체적으로, CTAB과정으로는 마이크로 튜브에 분쇄하여 준비한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 각각의 파우더 샘플 1g과 0.2% 2-머캅토에탄올(Mercaptoethanol)이 첨가된 CTAB 용액 700㎕를 넣고 혼합한 뒤 항온수조 65℃에서 30분간 배양하였다. 배양 후 클로로폼(chloroform)과 이소-아밀알콜(iso-amylalchol)을 24:1 비율로 700㎕를 첨가하여 10분간 12000rpm으로 16℃에서 원심분리하고 상등액을 수득하였다. 수득한 상등액은 이소프로파놀(isopropanol)을 1:1 비율로 동일하게 첨가한 후 inverting하여 DNA 확인 후 5분간 12000rpm으로 4℃에서 원심분리하여 생성된 펠렛에 70% 에탄올 200㎕를 넣어준 뒤, 12000rpm, 4℃, 5분의 조건으로 원심분리하고 상온에서 10분 방치하여 에탄올을 휘발시킨 후 1X TE buffer 200㎕ 첨가하여 녹인 후 RNase(10mg/ml)를 1㎕, 37℃, 30분 처리하여 DNA 농도를 확인하였다.The prepared Angelica gigas Nakai, Angelica gigas and Chinese Angelicae samples were frozen in liquid nitrogen and ground into a mortar and 1 g was prepared. The mixture was extracted with CTAB method and eluted into TE buffer to quantify 5 ng of each DNA. More specifically, as the CTAB process, 1 g of each of the powder samples of Chrysanthemum japonica, Chrysanthemum morifolium and Chrysanthemum morifolium prepared by pulverizing into microtube and 700 μl of CTAB solution containing 0.2% 2-mercaptoethanol were added and mixed, And cultured in a water bath at 65 DEG C for 30 minutes. After culturing, chloroform and iso-amylalchol were added in a ratio of 24: 1 at a ratio of 700: 1, centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 16 ° C, and a supernatant was obtained. The resulting supernatant was added with isopropanol in a ratio of 1: 1, inverted and DNA was identified, centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C, and 200 μl of 70% ethanol was added to the resulting pellet. The mixture was centrifuged at 12,000 rpm at 4 ° C for 5 minutes and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Ethanol was volatilized and then 200 μl of 1 × TE buffer was added to dissolve. 1 μl of RNase (10 mg / ml) DNA concentration was confirmed.
2. 2. PCR을PCR 이용한 DNA 증폭 및 당귀 감별. DNA amplification and differential discrimination.
상기 실시예 1.1에서 CTAB 방법을 이용하여 추출한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 DNA를 5 pmol로 희석하여 DNA 10ng, 하기 표 1에 정리된 서열번호 1 내지 8의 SSR 프라이머 세트를 10ng을 넣어 20㎕의 PCR 반응 혼합물을 만든다. PCR 과정은 preheating 95℃ 180초, denaturation 95℃ 60초, annealing 52℃ 30초, extension 72℃ 60초, post extension 72℃ 300초, 35 cycle을 반복하여 PCR을 수행하였다.10 ng of DNA and 10 ng of the SSR primer set of SEQ ID NOs: 1 to 8 set forth in Table 1 below were diluted by DNA of Chrysanthemum rhodesporatum, Angelica gigas and Angelica gigas L. extracted using CTAB method in Example 1.1, To make a PCR reaction mixture. PCR was performed by repeating preheating at 95 ° C for 180 seconds, denaturation at 95 ° C for 60 seconds, annealing at 52 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 60 seconds, post extension at 72 ° C for 300 seconds, and 35 cycles.
증폭된 DNA 단편을 확인하기 위해 4.0% 아가로스젤에 10㎕씩 로딩하여 전기영동을 실시하고, Molecular imagerⓡ Gel DocTM XR+ imaging system (Bio-Rad, USA)을 이용하여 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 특이 밴드를 확인하였다. 이의 결과를 도 1 내지 4에 나타내었다.To confirm the amplified DNA fragment, 10 μl of the DNA was loaded on 4.0% agarose gel, and electrophoresis was performed. Using a Molecular Imager ⓡ Gel Doc ™ XR + imaging system (Bio-Rad, USA) Specific bands of Angelica gigas were identified. The results are shown in Figs.
Sequence (5’-3’)Nucleotide
Sequence (5'-3 ')
Sequence (5’-3’)Nucleotide
Sequence (5'-3 ')
도 1 내지 4에 나타난 바와 같이, ag ssr 2-2(서열번호 1 및 2) 프라이머 세트 및 2-4의 프라이머 세트(서열번호 3 및 4)를 사용하여 참당귀, 일본당귀 및 중국당귀 중에서 참당귀를 구분할 수 있음을 확인하였고, ag ssr 5-2(서열번호 5 및 6) 및 5-5(서열번호 7 및 8) 프라이머 세트를 이용하여 참당귀, 일본당귀 및 중국당귀 중에서 중국당귀를 구분할 수 있음을 확인하였다.As shown in Figs. 1 to 4, using the ag ssr 2-2 (SEQ ID NOs: 1 and 2) primer sets and 2-4 primer sets (SEQ ID NOs: 3 and 4) And it was confirmed that the genus Angelicae was distinguishable from the genus Angelicae, Angelica gigantosa, and Chinese Angelica gigas using ag ssr 5-2 (SEQ ID NOS: 5 and 6) and 5-5 (SEQ ID NOS: 7 and 8) Respectively.
따라서, 상기 두 종류의 프라이머 세트를 이용하면 참당귀, 일본당귀, 중국당귀를 모두 구분할 수 있음을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that when using the above two types of primer sets, it is possible to distinguish all of the genus Chrysanthemum, Angelica gigas, and Angelica gigas.
<110> Chungbuk universty industry cooperation <120> Simple Sequence Repeat DNA primer for discrimination of Angelica gigas, Angelica acutiloba and Angelica sinesis <130> P-2 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ssr 2-2 <400> 1 gccttccaag ctaacgat 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ssr 2-2 <400> 2 acctctgtcc tatccatt 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ssr 2-4 <400> 3 gacgtcgact ataaccccta 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ssr 2-4 <400> 4 acctctgtcc tatccatt 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ssr 5-2 <400> 5 gattctttat cctgttcgtc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ssr 5-2 <400> 6 gacgtcgact ataaccccta 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ssr 5-5 <400> 7 acatctcttt cttgtgtcg 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ssr 5-5 <400> 8 cctcgctctc ttttgttt 18 <110> Chungbuk universty industry cooperation <120> Simple Sequence Repeat DNA primer for discrimination of Angelica gigas, Angelica acutiloba and Angelica sinesis <130> P-2 <160> 8 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ssr 2-2 <400> 1 gccttccaag ctaacgat 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ssr 2-2 <400> 2 acctctgtcc tatccatt 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ssr 2-4 <400> 3 gacgtcgact ataaccccta 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ssr 2-4 <400> 4 acctctgtcc tatccatt 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ssr 5-2 <400> 5 gattctttat cctgttcgtc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ssr 5-2 <400> 6 gacgtcgact ataaccccta 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ssr 5-5 <400> 7 acatctcttt cttgtgtcg 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ssr 5-5 <400> 8 cctcgctctc ttttgttt 18
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| KR20200050756A (en) * | 2018-11-02 | 2020-05-12 | 대한민국(산림청 국립산림과학원장) | SSR molecular markers for discriminating of Angelica gigas Nakai and uses thereof |
-
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Youyuan Lu et al., Biochemical Systematics and Ecology, 61, pp.488-492, 2015. |
| 박상익 등, Korean J. Medical Crop Sci., 24(4), p317-322, 2016 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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