KR101793722B1 - 성상세포의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 높은 순도와 동일한 형질의 성상세포를 지속적으로 생산할 수 있도록 줄기세포로부터 신경전구세포를 형성한 다음, 상기 신경전구세포를 2단계에 걸쳐 성상세포로 분화시키는 단계를 포함하는 성상세포의 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 성상세포에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 성상세포의 생산방법을 이용하면, 높은 순도로 성상세포를 생산할 수 있고, 동일한 형질의 성상세포를 보다 빠르게 생산할 수 있을 뿐만 아니라 신경전구세포를 사용하여 필요할 때에 신속하게 성상세포를 분화시킬 수 있으므로, 성상세포의 이식이 필요한 질환이 발병된 환자의 효과적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

성상세포의 생산방법{Process for preparing astrocyte}
본 발명은 성상세포의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 높은 순도와 동일한 형질의 성상세포를 지속적으로 생산할 수 있도록 줄기세포로부터 신경전구세포를 형성한 다음, 상기 신경전구세포를 2단계에 걸쳐 성상세포로 분화시키는 단계를 포함하는 성상세포의 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 성상세포에 관한 것이다.
포유동물은 신경세포가 손상되면 더 이상 재생되지 않으며, 신경세포가 손상되면 뇌졸중, 파킨슨병 또는 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)이 발생할 수 있기 때문에 신경세포 사멸에 따른 질환을 치료할 수 있는 치료법 개발은 오랫동안 전 세계적으로 활발히 연구되고 있지만, 아직까지 좋은 치료법이 개발되지 못하고 있는 상태이다.
최근에는, 다양한 세포로 분화될 수 있는 만능세포인 줄기세포(stem cells)를 신경세포로 분화시켜 손상된 신경세포를 치료하는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 줄기세포는 다양한 세포로 분화될 수 있기 때문에, 조직손상을 유발하는 질환을 치료하는 근본적인 방법이 될 수 있으나, 줄기세포를 수득하기가 용이하지 않고, 줄기세포를 목적하는 세포로 분화시키기가 용이하지 않으며, 줄기세포 자체가 환자의 면역체계에 의해 거부되지 않아야 한다는 문제점으로 인하여, 아직까지는 보편적으로 사용되지 못하고 있다. 그러나, 신경세포의 손상이 수반되는 뇌신경계 질환의 경우에는, 다른 어느 질병보다 줄기세포를 이용한 치료에 가장 합당한 대상이라 여겨지는데, 이는 뇌신경계 조직이 다른 조직과는 달리 면역거부반응이 거의 없어, 외부로부터 세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있기 때문이다.
이에, 뇌졸중, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 탈수초질환(demyelinating disease) 및 척추손상(spinal cord injury) 등의 질환 치료에 줄기세포를 적용하는 방법을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 국제특허공개 WO 2005/003320호에는 줄기세포에 염기성 섬유아세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자 8과 SHH(Sonic Hedgehog) 및 뇌-유래 신경영양 인자를 순차적으로 가하여 배양하고, 마지막으로 신경교 성상세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제495532호에는 중간엽 줄기세포를 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor)와 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 신경세포로 분화 및 증식시키는 방법이 개시되어 있다.
한편, 신경세포의 일종인 성상세포(astrocyte)는 성상교세포라고도 하는데, 신경계에 가장 많은 수를 차지하는 세포로서 뉴런이 분비하는 신경전달물질을 적절하게 제거하거나 뇌 내의 이온 농도를 조절하면서 뉴런 활성을 보조하는 역할을 수행한다고 알려져 있다. 최근에는, 뉴런의 시냅스 형성, 시냅스 숫자 조절, 시냅스 가소성 등에 일정한 역할을 수행하고, 퇴행성 신경계 질환의 발병에도 일정한 역할을 수행하며, 신경줄기세포가 신경으로 분화할 때에도 일정한 역할을 수행함이 규명됨에 따라, 성상세포를 분화시켜서, 퇴행성 신경계 질환에 치료 또는 개선에 사용할 수 있는지에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
지금까지 보고된 바에 의하면, 신경줄기세포에서 성상전구세포를 거쳐 성상세포를 분화시키는 방법(한국특허공개 제2014-0071512호), B27, bFGF 및 heparin을 포함한 DMEM/F-12배지를 사용하여 성상세포를 분화시키는 방법(미국특허등록 제6,897,061호) 등이 알려져 있다. 그러나, 상기 기존의 방법에 의해 분화된 성상세포에는 순수한 성상세포 이외에도 다른 세포들이 함께 포함되어 있어, 성상세포의 분화효율 및 순도가 낮은 수준이라는 문제점이 있으며, 아직까지는 이러한 문제점을 해결되지 않고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 줄기세포를 분화시켜서 순도가 높은 성상세포를 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 줄기세포를 직접적으로 성상세포로 분화시키기 보다는 줄기세포로부터 신경전구세포를 형성한 다음, 상기 신경전구세포를 2단계에 걸쳐 분화시킬 경우, 성상세포를 높은 순도로 생산할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 줄기세포로부터 성상세포를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 성상세포를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 줄기세포를 분화시켜서 순도가 높은 성상세포를 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 신경전구세포를 경유하는 방법에 주목하게 되었다. 상기 신경전구세포는 다른 신경세포와는 달리 동결보존이 가능할 뿐만 아니라 분화된 세포의 순도를 조절하기 어려운 줄기세포와는 달리, 높은 순도의 성상세포로 분화시키는 것이 가능함을 확인하였다. 이같은 방법을 사용하여 성상세포를 생산하면, 줄기세포로부터 성상세포를 분화시키는 종래의 방법과는 달리, 신경전구세포로부터 성상세포를 분화시킬 수 있으므로, 성상세포를 보다 신속하게 수득할 수 있다는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 상기 신경전구세포를 곧바로 성상세포로 분화시키지 않고, 2단계에 걸쳐 분화시키면, 상기 신경전구세포로부터 분화된 성상세포 외의 다른 분화부산물 세포의 비율이 급격하게 감소하므로, 종래의 방법에 비하여 성상세포로 분화되는 효율이 증가하는 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였는데, 이러한 효과는 공지된 방법을 사용하는 종래기술에서는 전혀 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 확인되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 줄기세포로부터 신경전구세포를 형성한 다음, 상기 신경전구세포를 성상세포로 분화시키는 단계를 포함하는 성상세포의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "줄기세포(stem cell)"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multpotent stem cells)로 분류할 수 있고, 줄기세포의 유래조직에 따라 중간엽 줄기세포, 배아줄기세포 및 역분화줄기세포로 분류할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 본 발명에서 제공하는 성상세포로 분화될 수 있는 줄기세포로 해석될 수 있는데, 상기 줄기세포는 배아유사세포 덩어리, 로제트(Rosette), 신경구세포 및 신경전구세포를 거쳐 성상세포로 분화될 수 있다. 따라서, 본 발명에서는, 상기 성상세포로 분화가능하다면 중간엽 줄기세포, 배아줄기세포, 역분화줄기세포 등의 모든 종류의 줄기세포를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 배아줄기세포, 역분화 줄기세포 또는 골수, 지방조직, 치아, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 태아로부터 유래한 중간엽 줄기세포가 될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 성상세포를 생산하기 위한 줄기세포로서 배아줄기세포를 이용하였는데, 상기 배아줄기세포를 배아 섬유아세포와 공배양하면서, 줄기세포의 분화억제 및 증식을 유도하는 염기성 섬유아세포성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)를 가하여 배양한 것을 사용하였다.
본 발명의 용어 "배아유사세포 덩어리(embryoid body)"는, 배상체라고도 하며, 세포분열 초기에 줄기세포들이 공모양으로 뭉쳐 형성된 세포덩어리를 의미한다. 상기 배아유사세포 덩어리는 통상적인 배아줄기세포와 유사한 수준의 전분화능을 나타내어, 골세포, 근육세포, 신경세포, 상피세포, 섬유세포 등의 다양한 생체조직으로 분화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배아유사세포 덩어리는 줄기세포를 신경전구세포로 분화시키기 위한 중간매개체로서 사용될 수 있으며, 이는 줄기세포를 다양한 성분(예를 들어, 혈청, NEAA, 항생제, LDN193189, SB431542 등)이 포함된 통상적인 줄기세포 배양용 배지(예를 들어, DMEM/F12 배지, KO-DMEM/F12 배지 등)에서 배양함으로써 형성될 수 있다. 상기 줄기세포로부터 배아유사세포 덩어리를 형성하기 위하여 배양하는 시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 2 내지 10일이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 3 내지 7일이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 4일이 될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 배아줄기세포를 4일 동안 배양하여 배아유사세포 덩어리를 수득하였다.
본 발명의 용어 "신경전구세포(neural progenitor cell)"란, "뉴런전구세포(neuron precursor cell)"라고도 하는데, 넓은 범위에서는 신경세포로 분화할 수 있거나 또는 분화과정중에 존재하는 모든 세포를 의미한다. 상기 신경전구세포는 신경줄기세포 또는 그외의 다른 줄기세포가 분열되어 신경아세포(neuroblast)를 형성하고, 상기 형성된 신경아세포는 신경관 또는 신경세포가 형성될 부위로 이동한 다음, 이동한 부위에서 축삭과 수상돌기를 형성하도록 형태적 및 기능적으로 분화되어, 최종적으로 신경세포를 형성하는데, 상기 줄기세포로부터 분화가 완료되기 직전까지의 모든 세포가 넓은 범위의 신경전구세포에 해당하며, 보다 좁은 범위로는 분열이 종료된 신경아세포가 신경전구세포에 해당한다고 볼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신경전구세포는 분열이 종료된 신경아세포에 해당한다고 해석될 수 있는데, 실험실적 조건(in vitro)에서 배아유사세포 덩어리로부터 상기 신경전구세포를 수득하기 위하여는, 로제트 배지(N2, B27, bFGF 등을 포함하는 통상적인 줄기세포 배양용 배지)에 상기 배아유사세포 덩어리를 접종하고 배양하여 로제트(Rosette)를 수득한 다음, 상기 로제트를 회수하고 이를 동일한 배지에서 배양하여 신경구세포(neurosphere)를 수득하였으며, 상기 신경구세포를 신경전구세포 배양용 배지(예를 들어, 혈청(예를 들어, FBS 등)이 포함된 세포배양용 배지 등)에 접종하여 배양함으로써, 신경전구세포를 수득할 수 있다.
이때, 상기 배아유사세포 덩어리부터 로제트를 형성하기 위하여 배양하는 시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 4 내지 10일이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 5 내지 8일이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 7일이 될 수 있다.
또한, 상기 로제트로부터 신경구세포를 형성하기 위하여 배양하는 시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 2 내지 5일이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 3 내지 4일이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 3일이 될 수 있다.
끝으로, 상기 신경구세포로부터 신경전구세포를 형성하기 위하여 배양하는 시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 5일이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 2 내지 3일이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 2일이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "로제트(Rosette)"란, 배아유사세포 덩어리를 신경세포분화유도 성분을 포함하는 신경분화유도 배지에서 배양하여 생성되는 세포집합체를 의미하는데, 대체로 꽃모양의 형태로 세포가 결합된 형태를 나타낸다. 상기 로제트는 줄기세포에서 신경세포로 분화되는데 필요한 유전자가 발현되어 형태적인 변화가 함께 수반되는 중간단계의 세포라도 이해될 수 있는데, 상기 로제트로부터 보다 효과적으로 신경구세포를 형성하기 위하여는, 이들 로제트의 집적이 필요하므로, 상기 로제트의 형성이 확인되면, 로제트를 수집하여 높은 밀도를 갖도록 배양용기에 접종하고, 이를 배양하는 방법을 사용함이 바람직하다.
본 발명의 용어 "성상세포"란, 성상교세포라고도 하는데, 신경계에 가장 많은 수를 차지하는 세포로서 뉴런이 분비하는 신경전달물질을 적절하게 제거하거나 뇌 내의 이온 농도를 조절하면서 뉴런 활성을 보조하는 역할을 수행한다고 알려져 있다. 최근에는, 뉴런의 시냅스 형성, 시냅스 숫자 조절, 시냅스 가소성 등에 일정한 역할을 수행하고, 퇴행성 신경계 질환의 발병에도 일정한 역할을 수행하며, 신경줄기세포가 신경으로 분화할 때에도 일정한 역할을 수행함이 규명됨에 따라, 성상세포를 분화시켜서, 퇴행성 신경계 질환에 치료 또는 개선에 사용할 수 있는지에 대한 연구가 활발히 진행되고 있을 뿐만 아니라, 면역기능을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 특히, 병원균이 생체에 감염되고, 이를 뇌에서 인식하면, 다양한 사이토카인의 분비량을 증가시키는데, 이러한 사이토카인은 성상세포를 활성화시켜서, 상기 성상세포가 대식세포의 기능을 수행하게 함으로써, 결과적으로는 면역기능을 향상시키게 된다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 성상세포는 신경전구세포를 1차 성상세포 분화배지(NEAA, 헤파린 및 EGF가 포함된 로제트 배지)에 접종하고 1차 배양한 다음, 2차 성상세포 분화배지(CNTF, Activin A, Heregulin 1β, IGF1 analog 및 bFGF을 포함하는 StemPro hESC SFM 배지)를 사용한 2차 배양을 수행하여 생산할 수 있다. 상기 1차 배양에 소요되는 시간은 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 2 내지 10일, 보다 바람직하게는 4 내지 7일, 가장 바람직하게는 5일이 될 수 있고; 2차 배양에 소요되는 시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 15 내지 30일, 보다 바람직하게는 20 내지 25일, 가장 바람직하게는 23일이 될 수 있다.
따라서, 신경전구세포를 1차 성상세포 분화배지에 접종하고 배양하기 시작한 시점을 기준으로 바람직하게는 17 내지 40일, 보다 바람직하게는 24 내지 32일, 가장 바람직하게는 28일이 경과된 후에, 상기 성상세포를 생산할 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면, 높은 순도의 성상세포를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 동결보존가능한 신경전구세포를 이용하여 동일한 형질의 성상세포를 지속적으로 생산할 수 있으며, 신경전구세포로부터 성상세포를 분화생산하는 과정만을 반복수행함으로써 성상세포를 생산하는데 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다는 장점이 있다. 본 발명에서 생산하는 성상세포를 면역기능이 저하된 환자 또는 퇴행성 신경계 질환이 발병된 환자에게 이식하여 상기 질환을 치료 또는 개선시킬 경우에는, 환자의 생체내 조건에 부합되는 종류의 성상세포를 사용하여야 하는데, 이때 환자의 증세에 따라 상기 성상세포를 일정 주기로 지속적으로 이식하는 과정이 요구될 수 있다. 이 경우, 최초 사용된 성상세포와 이후에 사용된 성상세포가 서로 다른 형질을 나타낼 경우에는, 상기 질환의 치료성공율이 급격히 저하될 수 있다는 문제점이 있으므로, 동일한 형질의 성상세포를 사용하여야만 하는데, 최초 사용된 성상세포를 치료가 끝날때까지 유지시키는 것은 실질적으로 불가능한 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에서 제공하는 방법을 사용하면 성상세포로 분화될 수 있는 전구세포를 보존하고 이를 사용하여 동일한 형질의 성상세포를 환자의 치료가 완료될 때까지 지속적으로 생산하여 공급할 수 있으므로, 상기 질환의 치료성공율을 현저히 향상시킬 수 있다.
아울러, 동결보존가능한 신경전구세포로부터 성상세포를 분화생산하는 과정만을 반복수행함으로써, 줄기세포로부터 성상세포를 생산하는 종래기술에 비하여, 성상세포를 생산하는데 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에서 제공하는 성상세포의 생산방법의 구체적인 예로서, 본 발명은 (a) 줄기세포를 배양하여 배아유사세포 덩어리(embryoid body)를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 배아유사세포 덩어리를 배양하여 신경구세포(neurosphere)를 수득하는 단계; (c) 상기 수득한 신경구세포를 배양하여 신경전구세포를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 수득한 신경전구세포를 성상세포 분화용 배지에서 2단계로 배양하여 성상세포를 생성시키는 단계를 포함하는, 성상세포의 생산방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, (a) 단계의 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 배아줄기세포 또는 역분화줄기세포가 될 수 있고; (a) 단계의 줄기세포는 혈청, NEAA, 항생제, LDN193189, SB431542 등을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 2 내지 10일 동안 배양하여 배아유사세포 덩어리를 형성할 수 있으며; (b) 단계에서, 배아유사세포 덩어리를 로제트 배지(N2, B27, bFGF 등을 포함하는 통상적인 줄기세포 배양용 배지)에서 4 내지 10일 동안 배양하여 로제트(Rosette)를 수득하고, 상기 수득한 로제트를 동일한 배지에서 2 내지 5일 동안 배양하여 신경구세포를 수득할 수 있으며; (c) 단계에서, 신경구세포를 신경전구세포 배양용 배지(예를 들어, 혈청(예를 들어, FBS 등)이 포함된 세포배양용 배지 등)에서 1 내지 5일 동안 배양하여, 신경전구세포를 수득할 수 있고, 상기 신경전구세포는 동결보존이 가능하여, 동일한 형질의 성상세포를 반복재현하는데 사용될 수 있으며; (d) 단계에서, 신경전구세포를 1차 성상세포 분화배지(NEAA, 헤파린 및 EGF가 포함된 로제트 배지)에서 2 내지 10일 동안 배양한 다음, 2차 성상세포 분화배지(CNTF, Activin A, Heregulin 1β, IGF1 analog 및 bFGF을 포함하는 StemPro hESC SFM 배지)에서 15 내지 30일 동안 배양하여, 성상세포를 생산할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 배아줄기세포를 배양하여 배아유사세포 덩어리를 수득하였으며, 상기 수득한 배아유사세포 덩어리를 배양하여 로제트를 형성하고, 상기 형성된 로제트를 회수한 다음, 다시 배양하여 신경구세포를 수득하였다. 상기 수득한 신경구세포를 2종의 성상세포 분화용 배지에서 순차적으로 배양하여 성상세포를 생산하였다.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상술한 성상세포의 생산방법으로 제조된 성상세포를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 성상세포는 종래의 방법으로 생산된 성상세포에 비하여, 성상세포를 제외한 다른 세포의 함량이 현저한 수준으로 낮아. 성상세포의 순도가 현저하게 증가된 것이므로, 성상세포의 이식이 필요한 질환이 유발된 환자의 치료효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 제공하는 성상세포의 생산방법을 이용하면, 높은 순도로 성상세포를 생산할 수 있고, 동일한 형질의 성상세포를 보다 빠르게 생산할 수 있을 뿐만 아니라 신경전구세포를 사용하여 필요할 때에 신속하게 성상세포를 분화시킬 수 있으므로, 성상세포의 이식이 필요한 질환이 발병된 환자의 효과적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 성상세포를 생산하는 과정에서 생성된 배아유사세포 덩어리(A), 로제트(B), 신경구세포(C), 신경전구세포(D), 중간단계 세포(E) 및 성상세포(F)의 형상을 나타내는 현미경 사진이다.
도 2는 신경전구세포를 1차 및 2차 성상세포 분화배지에서 28일 동안 배양하는 과정에서 5, 10, 14, 17, 21 및 28일이 경과된 시점의 배양세포를 대상으로 신경세포 마커(MAP2) 및 성상세포 마커(GFAP)를 이용한 면역형광염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 신경전구세포로부터 분화생산된 성상세포의 비율을 유세포 분석을 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 신경전구세포로부터 분화생산된 유효세포의 약 93%가 성상세포임을 확인하였다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 성상세포의 생산
실시예 1-1: 인간 배아 줄기세포( hES )의 배양
배아줄기세포의 분화를 억제한 상태로 증식시킬 수 있는 20ng/㎖의 염기성 섬유아세포성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 20% KnockOut™ Serum Replacement, NEAA 및 β-머캅토에탄올이 포함된 DMEM/F12 배지에서, 인간 배아 줄기 세포주(H9)를, γ선 조사를 통해 생육이 정지된 쥐 배아 섬유아세포(mouse MEF)와 공배양하고, 매일 배지를 교체하면서 6일 간격으로 계대배양하였다.
실시예 1-2: 배아유사세포 덩어리( embryoid body )의 수득
상기 실시예 1-1에서 배양된 인간 배아 줄기세포를 약 250㎛2의 크기로 절단하고, 20% KnockOut™ Serum Replacement, 100nM LDN193189 및 10μM SB431542가 포함된 DMEM/F12배지에 접종하고, 매일 배지를 교체하면서 4일 동안 배양하여 배아유사세포 덩어리를 수득하였다.
실시예 1-3: 신경구세포(neurosphere)의 수득
마트리젤(Matrigel™)이 코팅된(50㎕/㎠; BD) 배양용기에서, 상기 실시예 1-2에서 수득한 배아유사세포 덩어리를 로제트 배지(100X N2, 50X B27 및 20ng/㎖ bFGF를 포함하는 DMEM/F12 배지)에 접종하고, 2일 간격으로 배지를 교체하면서 7일 동안 배양하여, 불꽃모양으로 형성된 로제트(rosette)를 회수하고, 상기 회수된 로제트를 동일한 배지에 접종하고 3일 동안 부유배양시켜서 신경구세포를 수득하였다.
실시예 1-4: 신경전구세포( Neural progenitor cell , NPC ) 의 수득
상기 실시예 1-3에서 수득한 신경구세포에 Accutage™(Inactive cell technologies)를 처리하여 단일세포를 수득하고, 수득한 단일세포를 마트리젤(Matrigel™)이 코팅된(50㎕/㎠; BD) 배양용기에서, StemCell™ Neural Progenitor 배지(StemCellTechnologies)에 접종하고 2일 동안 배양하여 신경전구세포를 수득하였다.
실시예 1-5: 성상세포의 생산
상기 실시예 1-4에서 수득한 신경전구세포를 1차 성상세포 분화배지(100X NEAA, 5㎍/㎖ Heparin 및 20ng/㎖ EGF를 포함하는 로제트 배지)와 함께 마트리젤(Matrigel™)이 코팅된(50㎕/㎠; BD) 배양용기에 접종하고 2일마다 배지를 교체하면서 5일 동안 배양하여 신경전구세포와 성상세포의 중간단계 세포를 수득하고, 상기 수득한 중간단계 세포를 2차 성상세포 분화배지(10ng/㎖ CNTF, 10ng/㎖ Activin A, 10ng/㎖ Heregulin 1β, 200ng/㎖ IGF1 analog 및 8ng/㎖ bFGF를 포함하는 StemPro hESC SFM 배지)에 접종하고, 2일마다 배지를 교체하면서 23일 동안 배양하여 성상세포를 생산하였다(도 1).
도 1은 성상세포를 생산하는 과정에서 생성된 배아유사세포 덩어리(A), 로제트(B), 신경구세포(C), 신경전구세포(D), 중간단계 세포(E) 및 성상세포(F)의 형상을 나타내는 현미경 사진이다.
실시예 2: 성상세포의 분화효율 검증
실시예 2-1: 성상세포 분화시간의 경과에 따른 성상세포 생성율 비교
상기 실시예 1-5에 있어서, 신경전구세포를 1차 및 2차 성상세포 분화배지에서 28일 동안 배양하는 과정에서 5, 10, 14, 17, 21 및 28일이 경과된 시점의 배양세포를 분취하고, 상기 분취된 각 세포를 대상으로 신경세포 마커(MAP2) 및 성상세포 마커(GFAP)를 이용한 면역형광염색을 수행하여, 분화시간의 경과에 따른 신경세포와 성상세포의 생성율을 비교하였다(도 2).
도 2는 신경전구세포를 1차 및 2차 성상세포 분화배지에서 28일 동안 배양하는 과정에서 5, 10, 14, 17, 21 및 28일이 경과된 시점의 배양세포를 대상으로 신경세포 마커(MAP2) 및 성상세포 마커(GFAP, S100β 및 CD44)를 이용한 면역형광염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서 보듯이, 5일이 경과된 시점에서는 신경세포 마커가 관찰되고, 10일이 경과된 시점에서는 신경세포 마커가 대부분을 차지하였으나, 14일이 경과된 시점부터 성상세포 마커가 관찰되고, 시간이 경과함에 따라 성상세포 마커의 비율이 증가하는 반면 신경세포 마커의 비율이 감소하였으며, 28일이 경과된 시점에서는 성상세포 마커만이 관찰되었고, 신경세포 마커는 관찰되지 않음을 확인하였다. 도 2에서 보듯이, 신경전구세포로부터 성상세포를 생산하는데 총 28일이 소요되었으며, 이는 종래의 방법보다도 성상세포 생산에 소요되는 시간을 단축시킨 것임을 알 수 있었다. 즉, 신경전구세포로부터 성상세포를 분화시키는 종래의 방법(Stem Cells 2013;31:941-952)에 의하면, 피브로넥틴이 코팅된 배양용기에서 신경전구세포를 성상세포 분화배지(10ng/㎖ Activin A, 10ng/㎖ Heregulin 1β 및 200ng/㎖ IGF1 analog를 포함한 StemPro hESC SFM 배지)에 접종하고 35일 이상의 기간동안 배양할 경우에 성상세포를 생산할 수 있다고 알려져 있으므로, 본 발명의 방법을 이용하면 약 7일간의 배양시간을 단축시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 유세포 분석
상기 실시예 1-5에서 28일 동안 배양된 성상세포를 대상으로, 성상세포 마커의 하나인 CD44에 대한 항체를 이용한 면역형광염색을 수행하고, 상기 염색된 세포를 사용한 유세포 분석(FITC)을 수행하여 CD44로 염색된 성상세포의 비율을 측정하였다(도 3).
도 3은 신경전구세포로부터 분화생산된 성상세포의 비율을 유세포 분석을 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 신경전구세포로부터 분화생산된 유효세포의 약 93%가 성상세포임을 확인하였다.
지금까지 보고된 바에 의하면, 줄기세포를 24 내지 25주동안 배양한 후 90% 이상의 GFAP가 발현됨이 알려져 있고(Nature Protocol, 2011;6(11):1710-1717), 줄기세포를 35 내지 42일 동안 배양한 후에 사용된 줄기세포의 최고 80%를 성상세포로 분화시킬 수 있다고 알려져 있다(Stem Cells, 2013;31:941-952).
이러한 종래기술에 비하면, 본 발명의 성상세포분화방법은 성상세포를 분화시키는데 소요되는 시간이 종래의 기술보다도 현저하게 단축될 뿐만 아니라 사용된 줄기세포 대비 분화된 성상세포의 비율이 현저하게 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 성상세포의 생산방법을 이용하면, 성상세포를 신속하고, 높은 효율로 줄기세포로부터 분화생산할 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 삭제
  2. (a) 줄기세포를 배양하여 배아유사세포 덩어리(embryoid body)를 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득한 배아유사세포 덩어리를 N2, B27 및 염기성 섬유모세포생장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)를 포함하는 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modied Eagle's medium; DMEM)인 로제트 배지에서 부착배양하여 로제트(Rosette)를 수득하는 단계;
    (c) 상기 수득한 로제트를 상기 로제트 배지에서 부유배양하여 신경구세포(neurosphere)를 수득하는 단계;
    (d) 상기 수득한 신경구세포를 배양하여 신경전구세포를 수득하는 단계;
    (e) 상기 수득한 신경전구세포를 비필수 아미노산(Nonessential amino acid; NEAA), 헤파린 및 표피성장인자(Epithelial growth factor; EGF)를 포함하는 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modied Eagle's medium; DMEM)인 1차 성상세포 분화배지에서 1차 배양하는 단계; 및
    (f) 상기 1차 배양된 세포를 모양체 신경영양인자(Ciliary neurotrophic factor; CNTF), 액티빈 A(Activin A), 헤레귤린 1β (Heregulin 1β), 인슐린유사생장인자 1 유사체 (Insulin-like growth factor 1 analog; IGF1 analog) 및 염기성 섬유모세포생장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)를 포함하는 StemPro hESC SFM (StemPro human embryonic stem cell serum-free medium) 배지인 2차 성상세포 분화배지에서 배양하여 성상세포를 생산하는 단계를 포함하는,
    성상세포의 생산방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 줄기세포는 배아줄기세포 또는 역분화줄기세포인 것인 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제2항에 있어서,
    상기 로제트 배지는 N2, B27 및 염기성 섬유모세포생장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)를 포함하는 둘베코수정이글배지/F12 (Dulbecco's modied Eagle's medium/F12; DMEM/F12) 또는 넉아웃 둘베코수정이글배지/F12 (knockout Dulbecco's modified Eagle's medium/F12; KO-DMEM/F12)인 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제2항에 있어서,
    상기 (e) 단계에서 1차 배양기간은 2 내지 10일인 것인 방법.
  10. 삭제
  11. 제2항에 있어서,
    상기 (f) 단계에서 2차 배양기간은 15 내지 30일인 것인 방법.
  12. 제2항에 있어서,
    상기 성상세포의 생산방법은 (a') 배아줄기세포를 2 내지 10일 동안 배양하여 배아유사세포 덩어리(embryoid body)를 수득하는 단계; (b') 상기 수득한 배아유사세포 덩어리를 N2, B27 및 염기성 섬유모세포생장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)를 포함하는 둘베코수정이글배지/F12 (Dulbecco's modied Eagle's medium/F12; DMEM/F12) 또는 넉아웃 둘베코수정이글배지/F12 (knockout Dulbecco's modified Eagle's medium/F12; KO-DMEM/F12)인 로제트 배지에서 4 내지 10일 동안 부착배양하여 로제트(Rosette)를 수득하는 단계; (c') 상기 수득한 로제트를 상기 로제트 배지에서 2 내지 5일 동안 부유배양하여 신경구세포(neurosphere)를 수득하는 단계; (d') 상기 수득한 신경구세포를 1 내지 5일 동안 배양하여 신경전구세포를 수득하는 단계; (e') 상기 수득한 신경전구세포를 비필수 아미노산(Nonessential amino acid; NEAA), 헤파린 및 표피성장인자(Epithelial growth factor; EGF)를 포함하는 로제트 배지인 1차 성상세포 분화배지에서 2 내지 10일 동안 1차 배양하는 단계; (f') 상기 1차 배양된 세포를 모양체 신경영양인자(Ciliary neurotrophic factor; CNTF), 액티빈 A(Activin A), 헤레귤린 1β (Heregulin 1β), 인슐린유사생장인자 1 유사체 (Insulin-like growth factor 1 analog; IGF1 analog) 및 염기성 섬유모세포생장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)를 포함하는 StemPro hESC SFM (StemPro human embryonic stem cell serum-free medium) 배지인 2차 성상세포 분화배지에서 15 내지 30일 동안 배양하여 성상세포를 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 수행되는 것인 방법.
  13. 삭제
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