KR101793172B1 - Metallic nano particles having core-shell structure with surface of modified nucleic acid and method for manufacturing thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 항암제, 핵산 약물 전달하는데 유용한 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자 구조체로서, 구체적으로 금속 나노 입자에 L-DNA, 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA, 및 2’-할로-RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 변형 핵산(modified nucleic acid)을 표면 처리하여 얻은 신규한 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자 및 이의 제조방법이다.The present invention relates to a metal nanoparticle structure having a core-shell structure useful for delivering an anticancer agent and a nucleic acid drug. More specifically, the present invention relates to a metal nanoparticle structure comprising L-DNA, 2 '- (C 1 -C 6 alkoxy) -RNA, and a method for producing the same. The present invention also relates to a method for producing the metal nanoparticles of the core-shell structure, which is obtained by surface-treating at least one modified nucleic acid selected from the group consisting of RNA and RNA.
구형 핵산(Spherical Nucleic Acids, SNAs)은 금속 나노 입자 코어 표면에 올리고뉴클레오타이드이 결합한 코어-쉘 나노 구조체(도 1의 (A) 참조)로서, 포유동물 세포 속으로 내재화(internalization)되는 것으로 알려져 있다(도 1의 (B) 참조). 이러한 구형 핵산은 항암제, 핵산 약물 등을 전달하는데 유용한 전달체로 활용될 수 있다.Spherical Nucleic Acids (SNAs) are known to internalize into mammalian cells as core-shell nanostructures (see Figure 1 (A)) in which oligonucleotides are attached to the surface of metal nanoparticle cores 1 (B)). Such a spherical nucleic acid can be used as a carrier for transferring anticancer drugs, nucleic acid drugs and the like.
나노 메디신 시장(nano medicine market)은 2013 ~ 2019년 사이 연간 12.3%로 신장해 2019년에는 1776억 달러 규모에 이를 것으로 예측되는 큰 시장(Transparency Market Research)이며, SNAs를 제품화하여 활동하는 회사 (AuraSense, 2011년 Millipore에 합병)가 존재한다.The nano medicine market is a Transparency Market Research that will grow to 12.3% annually between 2013 and 2019 and reach $ 177.6 billion by 2019. It is a company that manufactures SNAs (AuraSense , Merger to Millipore in 2011).
이러한 SNAs, 즉 올리고뉴클레오타이드로 코팅된 나노 입자는 바이오 활성 분자의 세포내 운반을 위한 나노 운반체로 분류되어 왔다. 비록 최외각층에서 강한 음전하는 음의 세포막에 밀어내는 상호작용을 한다고 가정되지만, 많은 연구에서는 SNAs가 다양한 유형으로 세포 속으로 들어갈 수 있다고 증명하고 있다. 이러한 유용한 SNAs의 세포 내부로의 흡수(cellular uptake) 특징은 암치료, 진단법, 유전자 조절을 위한 약물 전달체로서 많이 응용되어 왔다.These SNAs, that is, nanoparticles coated with oligonucleotides, have been classified as nano-carriers for intracellular delivery of bioactive molecules. Although strong negative charges in the outermost layer are supposed to interact with the negative membrane, many studies have shown that SNAs can enter cells in a variety of ways. The cellular uptake characteristic of these useful SNAs has been widely applied as a drug delivery system for cancer therapy, diagnosis and gene regulation.
그러나 이전 연구들은 SNAs의 세포 흡수 효율이 올리고뉴클레오타이드의 로딩 수, 올리고뉴클레오타이드 가닥의 서열, 금 나노 입자의 지름에 의해 영향을 받을 수 있음을 제안하고 있을 뿐이며, 흡수 효율의 조절할 수 있는 다른 여러 인자들에 대해서는 여전히 밝혀지지 않은 상태이다.Previous studies, however, have only suggested that the cell uptake efficiency of SNAs may be influenced by the loading number of oligonucleotides, the sequence of oligonucleotide strands, and the diameter of gold nanoparticles, and many other factors Is still unknown.
최근에 자가 조립 DNA 나노 구조체(self-assembled DNA nanostructures)의 세포 흡수 효율은 나노 구조를 구성하는 DNA 가닥의 슈가 백본(sugar backbone)의 변화가 세포 내로의 흡수 효율에 영향을 미칠 수 있음을 관찰한 바가 있다.Recently, it has been observed that the cell uptake efficiency of self-assembled DNA nanostructures can be affected by changes in the sugar backbone of DNA strands constituting the nanostructure, There is a bar.
이러한 사실을 바탕으로, 본 발명의 발명자들은 SNAs의 올리고뉴클레오타이드의 슈가 백본(sugar backbone)의 다양성이 세포 내부로의 흡수(cellular uptake)에 미치는 영향을 밝혀내고자 하였다.Based on this fact, the inventors of the present invention sought to investigate the effect of the sugar backbone diversity of oligonucleotides of SNAs on cellular uptake.
이에 본 발명자들은 DNA, L-DNA, RNA, 2’-메톡시-RNA (2’-OMe-RNA), and 2’-플루오르-RNA (2’-F-RNA)의 5 가지의 슈가 백본(sugar backbone)을 갖는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드를 금(Au) 나노 입자 표면에 코팅한 코어-쉘 구조의 SNAs를 준비한 후, 이를 엔도사이토시스 과정(endocytosis mechanisms), 흡수 동력학(uptake kinetics), 세포 내 위치(subcellular localization)에 대해 연구함으로써, 올리고뉴클레오타이드의 슈가 백본에 따른 SNAs의 세포 흡수 효율을 분석하였다.Thus, the inventors of the present invention found that five sugar backbones of DNA, L-DNA, RNA, 2'-OMe-RNA, and 2'-F- SNAs having a core-shell structure in which single-stranded oligonucleotides having a sugar backbone are coated on the surface of gold (Au) nanoparticles are prepared and then subjected to endocytosis mechanisms, uptake kinetics, By studying location (subcellular localization), the cell uptake efficiency of SNAs according to the sugar backbone of oligonucleotide was analyzed.
이에 본 발명은 변형 핵산을 표피로 갖는 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자를 제공하는데 있다. Accordingly, the present invention provides a core-shell structure metal nanoparticle having a modified nucleic acid as a skin.
또한 본 발명은 상기 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자의 제조방법을 제공하는데 있다.The present invention also provides a method for producing metal nanoparticles of the core-shell structure.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명에서는 금속 나노 입자 코어 층, 및 상기 코어 층 표면에 L-DNA, 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA, 및 2’-할로-RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단일 가닥의 변형 핵산(modified nucleic acid)이 포함되어 있는 쉘 층을 포함하는 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자를 제공한다.In order to solve the above-described problems, the present invention provides a metal nanoparticle core layer and a method of fabricating the same, which comprises the steps of: forming a metal nanoparticle core layer and a group consisting of L-DNA, 2 '- (C 1 -C 6 alkoxy) And a shell layer containing at least one single-stranded nucleic acid modified nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs.
또한 (a) 금(Au) 화합물과 시트레이트염(citrate)을 반응시켜 금 나노 입자 코어를 제조하는 단계, 및 (b) 상기 금 나노 입자 코어 표면에 L-DNA, 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA, 및 2’-할로-RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단일 가닥의 변형 핵산(modified nucleic acid)을 처리하여 쉘 층을 형성하는 단계를 포함하는 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자의 제조방법을 제공한다.(A) reacting a gold compound with citrate to produce a gold nanoparticle core; and (b) contacting the surface of the gold nanoparticle core with L-DNA, 2 '- (C 1 - C- 6 alkoxy) -RNA, and 2'-halo-RNA to form a shell layer. The core-shell structure of the metal- A method for producing nanoparticles is provided.
본 발명에 따른 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자는 세포 독성이 없으면서도 세포 내 흡수 효율이 매우 우수하여, 다양한 나노 메디신(nano medicine) 및 약물 전달 기술에 널리 활용될 수 있다. The metal-nanoparticles of the core-shell structure according to the present invention are excellent in the intracellular absorption efficiency without cytotoxicity, and can be widely applied to various nano medicine and drug delivery technologies.
도 1의 (A)는 본 발명에 따른 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자(SNAs)를 나타낸 것이고, (B)는 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자(SNAs)의 세포 흡수 과정인 엔도사이토시스 메커니즘(endocytosis mechanisms)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2의 (A)는 금 나노 입자(GNPs)에 올리고뉴클레오타이드가 접합한 것을 나타낸 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자(SNAs)의 모식도이며, (B)는 금 나노 입자(GNPs)에 올리고뉴클레오타이드의 접합 전(검은색 피크)과 접합 후(컬러 피크)의 입자 크기를 나타낸 것이고, (C)는 SNAs의 투과전자현미경(TEM) 이미지이다.
도 3의 (A)는 Cy3로 표지화된 SNAs를 처리한 HeLa 세포의 형광 현미경(Fluorescence microscopy) 측정 결과이고, (B)는 유세포분석기(Flow cytometer)를 이용하여 Cy3로 표지화된 SNAs로 처리한 HeLa 세포의 시간 경과에 따른 세포 흡수를 분석한 것이고(왼쪽, n=3), 처리 후에 2시간 시점에서 Cy3로 표지화된 SNAs의 흡수 효율을 나타낸 유세포분석 히스토그램(오른쪽)이며, (C) SNAs의 시간 의존적인 세포 흡수 효율(n=4)을 나타낸 유도결합플라즈마-질량분석기(ICP-MS)의 분석 결과이다.
도 4는 HeLa 세포에 대한 SNAs의 세포 독성 분석 결과(Cytotoxicity assay)이다(n=3).
도 5는 세포 표면(A) 및 세포 내 분포(B)에 존재하는 SNAs의 TEM 이미지(빨간 화살표)이다.
도 6의 (A) 및 (B)은 에너지 제거 조건 또는 다양한 엔도사이토시스 저해제 조건에서 SNAs의 세포 내 흡수 효율을 ICP-MS을 이용하여 측정한 결과이며, (C)는 SNAs의 세포 흡수 과정에 이용되는 엔도사이토시스 메커니즘(endocytosis mechanisms)을 나타낸 것이다. 1 (A) shows metal nanoparticles (SNAs) of a core-shell structure according to the present invention, and (B) shows endocytosis mechanism of cell uptake process of metal nanoparticles (SNAs) (endocytosis mechanisms).
2 (A) is a schematic diagram of metal-nanoparticles (SNAs) having a core-shell structure in which oligonucleotides are bonded to gold nanoparticles (GNPs) (Black peak) and after bonding (color peak), and (C) is a transmission electron microscope (TEM) image of SNAs.
FIG. 3 (A) is a fluorescence microscopic measurement result of HeLa cells treated with Cy3-labeled SNAs, and FIG. 3 (B) shows the results of HeLa treated with SNAs labeled with Cy3 using a flow cytometer (Left, n = 3) analysis of cell uptake over time (left), histogram of flow cytometry analysis (right) showing the absorption efficiency of Cy3-labeled SNAs at 2 hours after treatment, (C) time of SNAs (ICP-MS), which showed a dependent cell-sorption efficiency (n = 4).
4 is a cytotoxicity assay (n = 3) of SNAs against HeLa cells.
Figure 5 is a TEM image (red arrow) of SNAs present in cell surface (A) and intracellular distribution (B).
6 (A) and (B) show the results of measurement of intracellular absorption efficiency of SNAs using ICP-MS under energy removal conditions or various endocytosis inhibitor conditions, and (C) Lt; RTI ID = 0.0 > endocytosis < / RTI > mechanisms.
본 발명은 금속 나노 입자 코어 층, 및 상기 코어 층 표면에 L-DNA, 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA, 및 2’-할로-RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단일 가닥의 변형 핵산(modified nucleic acid)이 포함되어 있는 쉘 층을 포함하는 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자에 관한 것이다. 도 1의 (A)는 금 나노 입자(GNPs)에 올리고뉴클레오타이드가 접합(conjugation)한 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자의 모식도이다.The present invention relates to a metal nanoparticle core layer, and a method for producing a metal nanoparticle core layer, comprising the steps of: forming a metal nanoparticle core layer on a surface of the core layer and one or more single strands selected from the group consisting of L-DNA, 2 '- (C 1 -C 6 alkoxy) And a shell layer containing a modified nucleic acid of the core-shell structure. 1 (A) is a schematic view of a metal-nanoparticle of a core-shell structure in which oligonucleotides are conjugated to gold nanoparticles (GNPs).
본 발명에서의 금속 나노 입자는 평균 입경이 3 ~ 100nm인 금(Au) 나노 입자를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 3 ~ 60nm 이며, 더욱 바람직하게는 5 ~ 30nm이다.The metal nanoparticles used in the present invention may be gold (Au) nanoparticles having an average particle size of 3 to 100 nm, preferably 3 to 60 nm, and more preferably 5 to 30 nm.
또한 본 발명에서의 변형 핵산(modified nucleic acid)은 L-DNA, 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA, 및 2’-할로-RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단일 가닥(single strand)으로서, 바람직하게는 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA는 2’-메톡시-RNA(2’-OMe-RNA)이며, 2’-할로-RNA는 2'-플루오르-RNA(2’-F-RNA)이다. 더욱 바람직하게는 2'-플루오르-RNA(2’-F-RNA)이다.Also, the modified nucleic acid in the present invention may be a nucleic acid having at least one single strand selected from the group consisting of L-DNA, 2 '- (C 1 -C 6 alkoxy) -RNA, and 2'- strand), preferably 2'- (C 1 -C 6 alkoxy) -RNA is 2'-methoxy-RNA (2'-OMe-RNA) and 2'- RNA (2'-F-RNA). More preferably 2'-fluoro-RNA (2'-F-RNA).
본 발명의 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자(SNAs)는 10 ~ 10,000개의 변형 핵산이 코어의 표면에 접합된 코어-쉘 구조의 금속 나노 구조체로서, 이는 세포 능력에 영향을 미치지 않으면서도(세포 독성 없음), 세포 내로의 흡수 효율이 우수하다. 바람직하게는 100 ~ 5,000개의 변형 핵산이 접합된다.The metal nanoparticles (SNAs) of the core-shell structure of the present invention are core-shell structure metal nanostructures with 10 to 10,000 modified nucleic acids conjugated to the surface of the core, ), And the absorption efficiency into cells is excellent. Preferably 100 to 5,000 modified nucleic acids are conjugated.
다음으로, 본 발명은 (a) 금(Au) 화합물과 시트레이트염(citrate)을 반응시켜 금 나노 입자 코어를 제조하는 단계, 및 (b) 상기 금 나노 입자 코어 표면에 L-DNA, 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA, 및 2’-할로-RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단일 가닥의 변형 핵산(modified nucleic acid)을 처리하여 쉘 층을 형성하는 단계를 포함하는 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자의 제조방법을 제공한다. Next, the present invention provides a method for preparing a gold nanoparticle core, comprising the steps of: (a) reacting a gold compound with citrate to prepare a gold nanoparticle core; and (b) - (C 1 -C 6 alkoxy) -RNA, and 2'-halo-RNA, to form a shell layer, wherein the shell layer is formed by treating a modified nucleic acid of at least one single strand selected from the group consisting of - shell structure of metal nanoparticles.
전술한 바와 같이, 상기 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA는 2’-메톡시-RNA(2’-OMe-RNA)이, 2’-할로-RNA는 2'-플루오르-RNA(2’-F-RNA)을 사용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 2'-플루오르-RNA(2’-F-RNA)이다.As described above, the 2'- (C 1 -C 6 alkoxy) -RNA is a 2'-methoxy-RNA (2'-OMe-RNA), the 2'-halo-RNA is a 2'- (2'-F-RNA) is preferably used. More preferably 2'-fluoro-RNA (2'-F-RNA).
아울러, 상기 금속 나노 입자(GNPs)는 평균 입경이 3 ~ 100nm인 금(Au) 나노 입자를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 3 ~ 60nm 이며, 더욱 바람직하게는 5 ~ 30nm이다.In addition, the metal nanoparticles (GNPs) may use gold (Au) nanoparticles having an average particle size of 3 to 100 nm, preferably 3 to 60 nm, more preferably 5 to 30 nm.
이때 상기 (a) 단계는 금(Au) 화합물과 시트레이트염(citrate)을 70 ~ 100℃ 온도로 가열 반응시켜 금 나노 입자를 제조하는 것이 바람직하며, 상기 (b) 단계는 금 나노 입자 코어와 변형 핵산을 14 ~ 18시간 동안 배양(incubation)시켜 쉘 층을 형성하는 것이 바람직하다.In the step (a), gold nanoparticles may be prepared by reacting gold (Au) compound with citrate at a temperature of 70 to 100 ° C to form gold nanoparticles. In the step (b) It is preferred that the modified nucleic acid is incubated for 14-18 hours to form a shell layer.
아울러, 본 발명에 따른 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자(SNAs)는 약물전달체로서 제공될 수 있다. 구체적으로, 상기 L-DNA은 대음세포작용, 클라트린을 매개로 하는 엔도사이토시스, 카베올래를 매개로 하는 엔도사이토시스, 또는 스캐빈저 수용체를 매개로 하는 엔도사이토시스의 경로를 통해 전달되는 약물전달체이다. 아울러, 상기 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA는 클라트린을 매개로 하는 엔도사이토시스, 카베올래를 매개로 하는 엔도사이토시스, 또는 스캐빈저 수용체를 매개로 하는 엔도사이토시스의 경로를 통해 전달되는 약물전달체이다. 상기 2’-할로-RNA는 스캐빈저 수용체를 매개로 하는 엔도사이토시스의 경로를 통해 전달되는 약물전달체이다.In addition, the metal nanoparticles (SNAs) of the core-shell structure according to the present invention can be provided as a drug delivery vehicle. Specifically, the L-DNA is transferred through the pathway of endocytic processes mediated by articular cell action, clathrin-mediated endocytosis, caveolae-mediated endocytosis, or scavenger receptor mediated endocytosis It is a drug delivery system. In addition, the 2 '-( C 1 -C 6 alkoxy) -RNA may be used as an endocytosis mediated by clathrin-mediated endocytosis, caveolae mediated endocytosis, or scavenger receptor mediated endocytosis Pathway < / RTI > The 2'-halo-RNA is a drug delivery vehicle that is delivered through the pathway of endocytosis through the scavenger receptor.
따라서, 본 발명에 따른 변형 핵산을 표피로 갖는 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자는 세포에 미치는 독성이 없으면서도 세포 내 흡수 효율이 매우 우수하여, 다양한 나노 메디신(nano medicine) 및 약물 전달 기술에 활용될 수 있다. Therefore, the core-shell structure metal nanoparticles having the modified nucleic acid according to the present invention as the epidermis have excellent cell-absorptive efficiency without toxicity to the cells, and can be utilized for various nano medicine and drug delivery technologies .
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 하나, 하기한 실시예는 본 발명을 예증하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것은 아님을 이해하여만 할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, it should be understood that the following examples are intended to illustrate the present invention and not to limit the present invention.
실시예Example 1: One: 올리고뉴클레오타이드로By oligonucleotide 기능화된 GNPs( Functional GNPs ( SNAsSNAs ) 제조) Produce
1-1. GNPs 합성(GNPs synthesis)1-1. GNPs synthesis (GNPs synthesis)
시트레이트(Citrate)로 안정화된 GNPs는 종래에 알려진 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 간략하게, HAuCl4 용액(1mM, 100 mL)을 95℃까지 데우고, 소듐 시트레이트(33.8mM, 10mL)를 매우 빠르게 용액에 첨가하였다. 용액의 색깔이 오렌지-엘로우에서 검은색으로 변화하고 나면, 전형적으로 극성 광학 특성을 갖는 GNPs는 5 분 안에 빨간색으로 된다. 용액은 추가적으로 95℃ 온도에서 10분 동안 유지하고, 그 후 천천히 4℃로 낮춰 냉각시켜 금속 나노 입자(GNPs)를 준비하였다. Citrate-stabilized GNPs can be synthesized using methods known in the art. Briefly, HAuCl 4 The solution (1 mM, 100 mL) was warmed to 95 ° C and sodium citrate (33.8 mM, 10 mL) was added to the solution very quickly. Once the color of the solution changes from orange-yellow to black, GNPs with polarity optics typically become red in 5 minutes. The solution was further held at 95 DEG C for 10 minutes and then slowly cooled to 4 DEG C to prepare metal nanoparticles (GNPs).
1-2. 1-2. 올리고뉴클레오타이드Oligonucleotide 합성(synthesis) 및 정제(purification) Synthesis and purification.
올리고뉴클레오타이드 합성을 위해 포스포라미디트(phosphoramidites)를 사용하고, 고체상의 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 표준 프로토콜에 따라 MerMade4 DNA 합성기(BioAutomation, USA)을 이용하여 합성하였다. DNA, RNA, 3’-티올-개질된 포스포라미디트, 조절 공극 유리(CPG)는 글렌 연구소(USA, Glen Research)에서 구입하였다. 2’-OMe-RNA, 2’-F-RNA, and L-DNA 포스포라미디트는 켐진(USA, ChemGenes)에서 구입하였고, 다른 화학 시약은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. 올리고뉴클레오타이드의 정제는 semi-preparative DNAPac PA-100 음이온 교환 컬럼이 장착된 Agilent 1200 series HPLC를 이용하여 수행하였다.Phosphoramidites were used for oligonucleotide synthesis and synthesized using MerMade4 DNA synthesizer (BioAutomation, USA) according to standard protocols for the synthesis of oligonucleotides on solid phase. DNA, RNA, 3'-thiol-modified phosphoramidite, and controlled void glass (CPG) were purchased from Glen Research, USA. 2'-OMe-RNA, 2'-F-RNA, and L-DNA phosphoramidite were purchased from ChemGenes and other chemical reagents were purchased from Sigma-Aldrich. Purification of oligonucleotides was performed using an Agilent 1200 series HPLC equipped with a semi-preparative DNAPac PA-100 anion exchange column.
1-3. 1-3. 올리고뉴클레오타이드로By oligonucleotide 기능화된 GNPs 제조(GNPs functionalization with oligonucleotides) Functionalization with oligonucleotides (GNPs)
3’탄소 티올레이트 올리고뉴클레오타이드(3’-thiolated oligonucleotides)는 트리(2-카복실에틸)포스핀(TCEP)(100 equiv.)과 함께 반응시켰다. 그리고 3,000 MWCO(Merck Millipore, Germany)의 Amicon ultra centrifugal filter unit를 이용하여 3번 탈염하였다. GNPs는 10 mM 인산염 용액(sodium phosphate buffer)(pH 7.4)에서 올리고뉴클레오타이드(300 equiv.)와 함께 배양(incubation) 하였다. 배양 용액의 이온 강도(ionic strength)는 5M 염화나타륨액을 최종 염의 농도가 0.5M에 도달할 때까지 시간당 0.1M 첨가함으로써 상승적으로 증가시켰다. 추가적으로 16시간 동안 배양한 후, 기능화된 GNPs는 원심분리(15분 동안 15,000g)하고, 상층액은 제거하였다. 입자는 다시 증류수로 섞어(resuspend) 주었다. 이러한 원심분리를 기초로 한 워싱 단계는 3번 반복하여 수행하여 얻었다(도 1의 (A) 참조).The 3'-thiolated oligonucleotides were reacted with tri (2-carboxylethyl) phosphine (TCEP) (100 equiv.). And desalted 3 times using a 3,000 MWCO (Merck Millipore, Germany) Amicon ultra centrifugal filter unit. GNPs were incubated with oligonucleotides (300 equiv.) In 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4). The ionic strength of the culture solution was increased synergistically by the addition of 5M sodium chloride solution at 0.1M per hour until the final salt concentration reached 0.5M. After an additional 16 hours of incubation, the functionalized GNPs were centrifuged (15,000 g for 15 minutes) and the supernatant removed. The particles were again resuspended in distilled water. The washing step based on such centrifugal separation was obtained by repeating the washing three times (see Fig. 1 (A)).
실시예Example 2: 2: 동적광산란법Dynamic light scattering method (Dynamic Light scattering layer)(Dynamic Light scattering layer)
상기 실시예에서 준비한 GNPs와 5 종류의 SNAs의 입자 크기와 표면 전하(surface charge)를 Zetasizer Nano ZS(Malvern, UK)로 측정하였다(도 2의 (B) 참조). The particle size and surface charge of the GNPs and the five kinds of SNAs prepared in the above examples were measured with a Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK) (see FIG. 2 (B)).
도 2의 (B)의 결과를 통해, 금 나노 입자 크기는 4 ~ 5nm 증가하였고, 이들의 표면 전하는 -13 mV에서 표면 변형(surface modification) 후에 -27 mV로 더욱 음전하를 띄었음을 알 수 있었다.2 (B), the gold nanoparticles increased in size by 4 to 5 nm, and their surface charge was negative at -27 mV after surface modification at -13 mV .
실시예Example 3: 3: SNAs의Of SNAs 투과 전자 현미경 분석(Transmission electron microscopic analysis, Transmission electron microscopic analysis (Transmission electron microscopy, TEMTEM ))
나노 입자의 TEM의 밝은 영역의 이미지(bright-field images)는 200kV에서 TecnaiF20-cryo(FEI)를 사용하여 측정하였다. GNPs 표면의 핵산의 안정적인 기능화를 확인하기 위해, 에너지분산형 분광분석법(EDS)의 성분 맵핑(elemental mapping)과 스펙트럼 분석(spectrum analysis)은 4개의 실리콘 표류 검출기(SDDs)가 있는 super-X EDS system가 구비된 Talos TEM(FEI; Talos F200X)을 사용하여 수행하였다. TEM의 X-ray 방출 스펙트럼은 1keV에서 6 keV 조건에서 스크리닝 하였다. 금(Au, M 방출선의 2.120 KeV)과 인(P, Kα 방출선의 2.013 KeV)의 X-ray 에너지 포인트(energy points)는 이미지 픽셀(pixel)에 존재하는 각각의 대응되는 요소가 존재하는지 여부를 가시화하여 판단하였다(도 2의 (C) 참조).Bright-field images of the TEM of the nanoparticles were measured using TecnaiF20-cryo (FEI) at 200 kV. Elemental mapping and spectrum analysis of energy dispersive spectroscopy (EDS) were performed using a super-X EDS system with four silicon drift detectors (SDDs) to confirm the stable functionalization of the GNPs surface nucleic acid Using a Talos TEM (FEI; Talos F200X) equipped with a stirrer. The X-ray emission spectrum of TEM was screened at 1 keV and 6 keV. X-ray energy points of gold (2.120 KeV of Au, M emission line) and phosphorus (2.013 KeV of P, K emission line) indicate whether each corresponding element present in the image pixel exists (See Fig. 2 (C)).
도 2의 (C)를 살펴보면, 금(Au) 맵핑(mapping)은 전자를 전달하지 않는 GNPs에서 나타내는 HAADF 이미지와 잘 일치하는 결과를 나타낸다. 아울러, SNAs의 인(P)의 지문점(Elemental fingerprints)은 GNPs의 황 주변부안에 금의 신호와 잘 오버랩되었고, 이는 GNPs 표면에 올리고뉴클레오타이드가 성공적으로 고정되었음을 의미한다.Referring to FIG. 2 (C), gold (Au) mapping shows a good agreement with the HAADF image represented by GNPs that do not carry electrons. In addition, the elemental fingerprints of phosphorus in the SNAs were well overlapped with the gold signal in the sulfur perimeter of GNPs, indicating that oligonucleotides were successfully immobilized on the surface of GNPs.
실시예Example 4: GNP 하나 당 4: per GNP 결합(Conjugation)되는Conjugated 올리고뉴클레오타이드Oligonucleotide 가닥 수의 정량적 확인 Quantitative determination of the number of strands
실시예 1의 SNAs는 1,4-dithiothreitol(DTT) solution(1M)의 동등한 용적량(volumetric amount)으로 처리하였다. 16시간 동안 배양한 후(1시간 당 15,000g), 상층액에 SYBR Gold nucleic acid staining dye(ThermoFisher Scientific, USA)를 혼합하였다. 그리고 혼합물의 형광분광기를 통해 형광 강도(fluorescence intensity)를 측정하였다. 그 결과, 실시예 1의 5 종류의 SNAs는 약 130개 정도의 올리고뉴클레오타이드가 GNP의 표면에 접합됨을 알 수 있었다(표 1 참조). 이를 통해, 결합 효율은 올리고뉴클레오타이드의 백본 타입에 의해 크게 차이나지 않음을 알 수 있었다.The SNAs of Example 1 were treated with an equivalent volumetric amount of 1,4-dithiothreitol (DTT) solution (1M). After incubation for 16 hours (15,000 g per hour), SYBR Gold nucleic acid staining dye (ThermoFisher Scientific, USA) was added to the supernatant. And the fluorescence intensity was measured through a fluorescence spectrometer of the mixture. As a result, it was found that about 130 oligonucleotides were bonded to the surface of GNP in the five kinds of SNAs of Example 1 (see Table 1). As a result, it was found that the binding efficiency was not significantly different by the backbone type of the oligonucleotide.
실시예Example 5: 5: SNAs의Of SNAs 세포 흡수(Cellular uptake of Cellular uptake of SNAsSNAs ))
이론적으로, 세포독성평가(cytotoxicity assay), 형광 현미경 기술(fluorescence microscopy), 유세포분석법(flow cytometry), TEM 분석, 및 유도결합플라즈마 질량분석기(ICP-MS) 분석을 위한 SNAs 세포 흡수 실험은 동일한 절차를 기초로 한다.Theoretically, SNAs cell uptake experiments for cytotoxicity assay, fluorescence microscopy, flow cytometry, TEM analysis, and ICP-MS analysis were performed using the same procedure .
구체적으로, HeLa 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 10% 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 DMEM에서 배양하였다. SNAs의 세포 흡수 실험을 위해, HeLa 세포는 미리 배양 접시에 접종하고 세포가 80% confluence까지 될 때까지 배양하였다. 다음으로, 배양된 세포를 DPBS로 씻어내고, 이를 무혈청 DMEM 배지에서 배양하였다. 2시간 또는 6시간 동안 배양한 후, 세포를 힘차게 DPBS로 5번 씻어내고, 추가적인 분석을 수행하였다. SNAs 세포 흡수를 확인하기 위한 실험 조건은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다. 본 발명에서는 흡수 메커니즘을 조사하기 위해, 세포 내 흡수 실험을 진행하기 30분 전에 엔도사이토시스 저해제를 전처리 함으로써, 세포는 각각의 억제 조건에서 미리 배양되었다.Specifically, HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin at 37 ° C and 5% CO 2 . For the cell uptake experiments of SNAs, HeLa cells were inoculated in culture dishes and cultured until the cells reached 80% confluence. Next, the cultured cells were washed with DPBS and cultured in serum-free DMEM medium. After incubation for 2 or 6 hours, cells were washed vigorously 5 times with DPBS and additional analysis was performed. Experimental conditions for confirming SNAs cell uptake are shown in Table 2 below. In the present invention, to investigate the absorption mechanism, cells were pre-cultured at each inhibition condition by pretreatment of the
실시예Example 6: 6: SNAs의Of SNAs 세포 흡수의 형광 분석(Fluorescence-based analysis) Fluorescence-based analysis of cell uptake
SNAs의 HeLa 세포 흡수 특성을 분석하기 위해, 형광 현미경(fluorescence microscopy)을 이용하고, Cy3로 표지된 SNAs(Cy3-labeled SNAs)을 사용하였다. SNA 세포 흡수 이전에, Hoechst 33342에 의해 SNAs가 염색되는 것을 방지하기 위해, HeLa 세포를 Hoechst 33342 nuclei staining dye로 염색하였다. 세포 흡수 이후에, 세포를 상온에서 30분 동안 4% 포름알데히드 용액에서 고정하였다. 이미지는 CCD camera(Nikon, Japan)가 창작된 Eclipse Ti-S 형광 현미경으로 측정하였으며, Image J software로 분석하였다. Cy3로 표지된 SNAs로 처리된 세포는 또한 Guava easyCyte Flow Cytometer(Merck Millipore, UK)로 측정되었다. 얻은 데이터는 FlowJo software로 분석하였다.To analyze the HeLa cell uptake characteristics of SNAs, fluorescence microscopy and Cy3-labeled SNAs (Cy3-labeled SNAs) were used. Prior to SNA cell uptake, HeLa cells were stained with Hoechst 33342 nuclei staining dye to prevent SNAs from staining by Hoechst 33342. After cell uptake, the cells were fixed in 4% formaldehyde solution for 30 minutes at room temperature. Images were analyzed using an Eclipse Ti-S fluorescence microscope (CCD camera, Nikon, Japan) and analyzed with Image J software. Cells treated with Cy3-labeled SNAs were also measured with a Guava easyCyte Flow Cytometer (Merck Millipore, UK). The obtained data was analyzed with FlowJo software.
그 결과인 도 3의 (A)를 살펴보면, SNAL -DNA와 SNA2'OMe -RNA의 세포내 운반은 SNADNA와 유사한 반면, SNA2 '-F-RNA와 SNARNA는 SNADNA의 흡수와 비교하여 향상되었음을 알 수 있다.3 (A), the intracellular transport of SNA L- DNA and SNA 2'OMe- RNA On the other hand similar to the SNA DNA, SNA 2 '-F- RNA and RNA SNA may be seen that the improvement in comparison with the absorption of SNA DNA.
또한, 도 3의 (B)는 유세포 분석법에 의해 Cy3로 표지화된 SNAs로 처리한 HeLa 세포의 시간에 따른 세포 내 흡수 효율 분석(왼쪽), 및 처리 후 2시간 시점에서 Cy3로 표지화된 SNAs의 세포 내로의 흡수 효율을 나타내는 히스토그램(오른쪽)을 나타낸 것으로, 시간이 경과함에 따라서 SNAs의 세포로의 내재화도 증가함을 알 수 있다. 또한, SNA2 '-F-RNA는 다른 어떤 SNAs 보다 훨씬 더 빠른 흡수 동력학(uptake kinetics)을 나타냄을 알 수 있었다.FIG. 3 (B) is a graph showing the results of analysis of the intracellular absorption efficiency (left) of HeLa cells treated with SNAs labeled with Cy3 by flow cytometry over time and the cell numbers of SNAs labeled with Cy3 at 2 hours after treatment (Right side) showing the absorption efficiency into SNAs, indicating that the internalization of SNAs into cells increases with time. In addition, SNA 2 '-F-RNA could see a much more rapid absorption kinetics (uptake kinetics) than any other represents the SNAs.
한편, SNARNA는 2시간 까지 비슷한 흡수율을 나타내었다. SNADNA, SNAL -DNA, 및 SNA2 ‘- OMe -RNA는 형광 현미경 이미지(microscopic images)와 유사한 경향성의 흡수 동력학을 나타내었다.On the other hand, SNA RNA was detected up to 2 hours Similar absorption rates were obtained. SNA DNA, SNA L -DNA, and SNA 2 '- OMe -RNA showed the absorption kinetics of the trend is similar to the fluorescence microscope image (microscopic images).
또한, 도 3의 (B)를 살펴보면, 6시간 동안의 세포 내 흡수가 축적됨에 따라, SNARNA, SNA2 ’F-RNA의 경우, SNADNA 대비 각각 80% 또는 165%씩 SNAs의 내재화(internalization)가 증가되었다. 비록 2'-OMe-RNA는 2' 탄소가 변형된 핵산(2’-modified backbone-based nucleic acid)라 할지라도, SNA2 '- OMe -RNA는 SNADNA의 세포 흡수 효율과 비교하여 다소 낮았다. 또한 SNAL -DNA는 SNADNA와 비슷한 세포 흡수를 나타내었다.Further, Fig. Referring to (B) of 3, as the absorption cells for 6 hours to accumulate, SNA RNA, for SNA 2 'F-RNA, SNA DNA compared to each 80% or internalization of by 165% SNAs (internalization ) Was increased. Although 2'-OMe-RNA is 2 'carbon is also referred to, although a modified nucleic acid (2'-modified backbone-based nucleic acid), SNA 2' - OMe -RNA is the SNA DNA Compared with the cell uptake efficiency. SNA L- DNA also showed similar cell uptake as SNA DNA .
실시예Example 7: 7: 유도결합플라즈마Inductively coupled plasma 질량분석기(Induced coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS) Induced coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS)
형광 표지를 기본으로 하는 유세포분석과 함께, GNPs에 기초가 되는 정량적인 흡수 데이터를 얻기 위해, 유도결합플라즈마 질량분석기(ICP-MS)를 이용하여 세포 내 금(Au) 함량을 측정하였다.The intracellular gold (Au) content was measured using an inductively coupled plasma mass spectrometer (ICP-MS) to obtain quantitative absorption data based on GNPs, along with flow cytometry based on fluorescent labels.
구체적으로, 모든 유리 기구는 염산과 질산을 3:1의 분자 비율로 혼합한 산 혼합액인 왕수(aqua regia)로 세척하고, 증류수로 3번에 걸쳐 씻었다. 세포 흡수 실험 후에, 각 샘플의 세포 수를 세포 수 검사 장치인 혈구계산판(hemocytometer)을 통해 측정하였다. 0.1 mL 미만인 샘플은 0.5mL의 왕수로 상온에서 6시간 동안 소화되었고, 다음으로 증류수를 사용하여 10mL까지 볼륨-업(volume-up)하였다. 소화된 금(Au)의 양은 Varian 820-MS mass spectrometer로 측정하고, 하나의 HeLa 세포에 내재화(internalization)된 평균 GNP 수(number)를 계산하였다(도 3의 (C) 참조).Specifically, all glassware was washed with aqua regia, an acid mixture mixed with hydrochloric acid and nitric acid at a molecular ratio of 3: 1, and washed three times with distilled water. After the cell uptake experiment, the number of cells in each sample was measured using a hemocytometer, a cell counting device. Samples less than 0.1 mL were digested in 0.5 mL of water for 6 hours at room temperature and then volume-up to 10 mL using distilled water. The amount of digested gold (Au) was measured with a Varian 820-MS mass spectrometer and the average number of GNPs internalized in one HeLa cell was calculated (see FIG. 3C).
도 3의 (C)를 살펴보면, 6시간에서 가장 높은 흡수율을 나타내는 것은 SNA2 '-F- RNA이고 가장 낮은 흡수율을 나타내는 것은 SNA2 '- OMe -RNA 임을 알 수 있다. 모든 SNAs는 6시간에서 내재화된 나노 입자의 양이 2시간에서의 내재화된 나노입자의 양 보다 높았다. 이러한 결과는 상기 유세포분석 결과와 일치한다. Referring to FIG. 3 (C), the highest absorption rate at 6 hours is SNA 2 '-F- RNA and the lowest absorption rate SNA 2 '- OMe- RNA . In all SNAs, the amount of internalized nanoparticles at 6 hours was higher than the amount of internalized nanoparticles at 2 hours. These results are consistent with the flow cytometry results.
그러나 SNAL -DNA의 흡수는 SNADNA보다 다소 낮았으며, 이는 SNADNA에서 비슷한 흡수 효율을 나타낸 형광 데이터의 결과와는 서로 다른 결과이다.However, the absorption of SNA L - DNA was somewhat lower than that of SNA DNA , which is different from the result of fluorescence data showing similar absorption efficiencies in SNA DNA .
아울러, 슈가 백본(sugar backbone) 유형에 따른 흡수 순서와 효율의 다양성은 유세포분석기를 통해 측정한 결과로 비교하여 보았을 때, SNA2 ‘-F-RNA(222.1%) > SNARNA(147.6%) > SNADNA(100%) > SNAL -DNA(60.33%) > SNA2 ’- OMe -RNA(41.3%)의 순서로 나타낼 수 있다. 이때 SNA2 ‘-F-RNA이 가장 흡수 효율이 우수함을 알 수 있다.In addition, SNA 2 '-F-RNA (222.1%), SNA RNA (147.6%) and SNA 2 ' -F- RNA (147.6%) were different according to the sugar backbone type, SNA DNA (100%)> SNA L -DNA (60.33%)> SNA 2 '- it can be represented by the sequence of OMe -RNA (41.3%). At this time, SNA 2 '-F-RNA shows the best absorption efficiency.
그리고, 2시간 또는 6시간 동안 SNAs의 처리는 세포 생존능력(cell viability)에 영향을 미치지 않았다(도 4 참조).And, treatment of SNAs for 2 or 6 hours did not affect cell viability (see FIG. 4).
실시예Example 8: 8: 내재화된 SNAs의 TEMTEM of internalized SNAs 분석( analysis( TEMTEM analysis of internalized analysis of internalized SNAsSNAs ))
SNAs의 세포내 위치(subcellular localization)를 확인하기 위해, TEM을 이용하여 SNAs의 세포내 분산(distributions)을 조사하였다. TEM 분석을 위해, 5종류의 SNAs 시료는 다음의 규정된 절차에 의해 고정(fixation), 탈수(dehydration), 수지 침투(resin-infiltration) 단계를 거쳤다. 모든 절차는 달리 언급한 것이 없으면 4℃에서 수행하였다. 이하 구체적으로 설명한다.To confirm the subcellular localization of SNAs, intracellular distributions of SNAs were examined using TEM. For the TEM analysis, five SNAs samples were subjected to fixation, dehydration, and resin-infiltration steps by the following defined procedures. All procedures were performed at 4 ° C unless otherwise noted. This will be described in detail below.
첫번째, SNA를 처리한 HeLa 세포의 기본 고정(primary fixation)은 Karnovsky’s fixative solution(pH 7.4의 0.1 M 카코딜레이트염 용액에 2.5% 글루타르알데히드 및 4% 파라포름알데하이드 용액 포함)을 이용하여 2시간 동안 수행하였다. 0.05M 카코딜레이트염 용액으로 3번 워싱(washing)한 이후, 후 고정(post fixation)은 2% 오스미움 테트로사이드 용액과 0.1M 카코딜레이트염 용액을 이용하여 2시간 동안 수행하였고, 다음으로 증류수로 워싱(washing) 하였다. 다음으로, 시료를 6시간 동안 0.5% 우라닐 아세테이트 용액(uranyl acetate solution)에 담갔다. 탈수(dehydration)는 각각 30%, 50%, 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올에서 10시간 동안 노출하였다. 수지 침투(resin-infiltration)는 시료를 프로필렌 옥사이드 용액(propylene oxide solution) 및 스퍼스 레진(Spurr’s resin)에서 2시간 동안 배양하였고, 상온에서 16시간 동안 100% 스퍼스 레진에서 내장시켰다. 그런 다음, 배양 온도를 수지의 폴리머화를 위해 70℃ 온도로 조절하였다. 고체화된 합성수지 침투 시료는 초박절편(ultrathin sections) 준비를 위해 EM UC7 ultramicrotome (Leica, Germany)를 수행하였으며, 이는 80kV에서 작동한 JEM1010 TEM (JEOL, Japan)에 의해 분석되었다(도 5 참조).First, the primary fixation of SNA-treated HeLa cells was carried out for 2 hours using Karnovsky's fixative solution (containing 2.5% glutaraldehyde and 4% paraformaldehyde solution in 0.1 M chondroitate solution at pH 7.4) Respectively. After washing 3 times with 0.05 M chocodilate solution, post fixation was performed for 2 hours using 2% osmium tetroxide solution and 0.1 M chocodylate salt solution, followed by distilled water . ≪ / RTI > Next, the sample was immersed in a 0.5% uranyl acetate solution for 6 hours. Dehydration was exposed for 10 hours at 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 100% ethanol, respectively. Resin-infiltration samples were incubated in propylene oxide solution and Spurr's resin for 2 hours and embedded in 100% sprue resin at room temperature for 16 hours. The incubation temperature was then adjusted to a temperature of 70 DEG C for polymerisation of the resin. The solidified synthetic resin infiltration samples were run on an EM UC7 ultramicrotome (Leica, Germany) for the preparation of ultrathin sections, which was analyzed by JEM1010 TEM (JEOL, Japan) operating at 80 kV (see FIG.
도 5의 (A)를 살펴보면, 2시간 동안 SNAs를 처리한 HeLa 세포는 GNPs가 세포 내로 이입되었음을 분명하게 관찰할 수 있었으나, 반면에 세포 표면에서는 GNPs가 발견되지 않았음을 확인할 수 있었다.5 (A), HeLa cells treated with SNAs for 2 hours were able to clearly observe that GNPs were transferred into cells, whereas GNPs were not found on cell surfaces.
도 5의 (B)를 살펴보면, 몇몇 GNPs가 엔도솜(endosomes) 및/또는 리소좀(endosomes)에서 발견되었지만, 대부분의 나노 입자는 소낭(vesicles) 안에 남아 있었다. 특히 SNAL -DNA는 소낭 안에서 응집된 클러스트(cluster)로 발견된 다른 4 종류의 SNAs 와는 대조적으로, 주로 소낭 안에 분산적인 단일 나노 입자로 존재함을 알 수 있었다(빨간색 화살표 확인). SNAL -DNA 클러스터(cluster)는 오직 둘 또는 셋의 나노입자, 시료에서 감지된 입자 전체 수의 3% 이상이 되지 않게 구성되어 있다. 이는 자연적인 카이럴 성을 갖는 핵산들로 구성된 SNAs와 다른 방식으로 SNAL -DNA가 세포와 상호작용을 하기 때문이다.Referring to Figure 5 (B), while some GNPs were found in endosomes and / or lysosomes, most of the nanoparticles remained in vesicles. In particular, it was found that SNA L- DNA exists as a dispersed single nanoparticle mainly in the follicle as opposed to the other four SNAs found as agglutinated clusters in the follicle (see red arrow). The SNA L- DNA cluster is composed of only two or three nanoparticles, not more than 3% of the total number of particles detected in the sample. This is because SNA L- DNA interacts with cells differently from SNAs composed of nucleic acids with natural chiralities.
실시예Example 9: 9: SNAs의Of SNAs 흡수 및 약물 전달 과정( Absorption and drug delivery processes 엔도사이토시스Endocytosis 메커니즘) mechanism)
실시예 7과 동일한 방법으로 ICP-MS을 이용하여 SNAs의 세포 내로의 흡수 과정을 확인하였다. 이는 약물 전달 과정이기도 하다. 다만, SNAs의 세포 내 흡수 과정을 밝히기 위해, 엔도사이토시스 메커니즘에 영향을 미치는 저해제를 사용하였다.The process of absorption of SNAs into cells was confirmed by ICP-MS in the same manner as in Example 7. [ This is also a drug delivery process. However, in order to elucidate the intracellular uptake process of SNAs, an inhibitor that affects the endocytosis mechanism was used.
도 6의 (A) 및 (B)를 살펴보면, 4℃, 또는 소듐 아자이드와 2-디옥시글루코오스(DOG), ATP 제거제(ATP-depleting agents) 존재 하에서 SNAs의 세포 흡수가 수행될 때, 모든 SNAs의 세포내 운반은 그렇지 않은 세포(100%)와 대비하여 매우 급격하게 줄었음을 알 수 있다. 이러한 결과는 모든 SNAs가 에너지 의존적 ATP 소비 엔도사이토시스 메커니즘을 통해 세포로 내재화(internalization)됨을 알 수 있다.6 (A) and 6 (B), when cell uptake of SNAs is performed at 4 ° C or in the presence of sodium azide and 2-deoxyglucose (DOG), ATP-depleting agents, The intracellular transport of SNAs was dramatically reduced as compared to the untreated cells (100%). These results show that all SNAs are internalized into cells via the energy-dependent ATP-consuming endocytosis mechanism.
아울러, 스캐빈저 수용체를 매개로 하는 엔도사이토시스(scavenger receptor-mediated endocytosis)의 저해제로 알려져 있는 폴리이노신산(Poly I)를 처리한 경우, 실질적으로 모든 SNAs의 흡수 효율(50% 보다 낮음)을 감소시켰다. 이는 모든 SNAs의 세포내 운반은 스캐빈저 수용체를 매개로 하는 엔도사이토시스(scavenger receptor-mediated endocytosis)에 의존함을 의미한다.In addition, when treated with polyinosinic acid (Poly I), known as an inhibitor of scavenger receptor-mediated endocytosis mediated by scavenger receptors, the absorption efficiency (<50%) of virtually all SNAs Respectively. This implies that intracellular delivery of all SNAs depends on scavenger receptor-mediated endocytosis.
다음으로, 대음세포작용(macropinocytosis) 저해제인 에틸 이소프로필 아밀로라이드(EIPA)를 처리한 경우, SNAL -DNA의 흡수를 다소 감소시킨 반면에, 다른 SNAs의 내재화는 현저하게 저해하지 않았다. SNAL -DNA는 클라트린을 매개로 하는 엔도사이토시스(clathrin-mediated endocytosis)의 저해제인 chlorpromazine (CPZ)에 의해 미비한 정도의 세포 흡수를 나타내었다.Next, treatment with ethyl isopropyl amiloride (EIPA), a macropinocytosis inhibitor, somewhat reduced the absorption of SNA L- DNA , but did not significantly inhibit the internalization of other SNAs. SNA L- DNA showed insufficient cellular uptake by chlorpromazine (CPZ), an inhibitor of clathrin-mediated endocytosis mediated by clathrin.
그러나, SNADNA를 내재화하는 매개체로 알려진 카베올래를 매개로 하는 엔도사이토시스(caveolae-mediated endocytosis)의 저해제인 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD)를 사용한 경우, SNADNA와 SNA2 ’- OMe -RNA의 흡수 수준은 SNAL -DNA 만큼 감소하였다. 아울러, SNARNA와 SNA2 ’-F-DNA는 MβCD에 현저하게 영향을 받지 않았다.However, in the case of using the endocytosis of methyl -β- cyclodextrin (MβCD) inhibitors (caveolae-mediated endocytosis) to the carbenium Trying known as mediators, which internalize the SNA DNA-mediated, DNA and SNA SNA 2 '- OMe - The level of absorption of RNA SNA L- DNA . In addition, RNA and SNA SNA 2 '-F-DNA did not significantly affect the MβCD.
이러한 결과를 바탕으로, SNAs의 세포내 흡수 과정을 정리하면 도 5의 (C)에 나타낸 바와 같다. 모든 SNAs의 세포내 흡수 과정은 스캐빈저 수용체를 매개로 하는 엔도사이토시스(scavenger receptor-mediated endocytosis)가 주요 경로가 된다. 아울러, SNADNA와 SNA2 ’- OMe -RNA는 카베올래를 매개로 하는 엔도사이토시스(caveolae-mediated endocytosis)에 의해 운반되며, SNAL -DNA는 모든 메커니즘을 활용하여 세포에 내재화됨을 알 수 있었다(도 5의 (C) 참조). 결국 모든 SNAs는 스캐빈저 수용체를 매개로 하는 엔도사이토시스(scavenger receptor-mediated endocytosis)에 의해 세포 내로 흡수되더라도, 슈가 백본(sugar backbone)의 차이로 세포 흡수율 차이와 흡수 메커니즘이 다양해짐을 알 수 있었다.Based on these results, the intracellular uptake process of SNAs is summarized in FIG. 5 (C). The intracellular uptake of all SNAs is the main pathway for scavenger receptor-mediated endocytosis. In addition, DNA and SNA SNA 2 '- OMe -RNA is carried by endocytosis (caveolae-mediated endocytosis) to the carbenium Trying as a medium, SNA L -DNA has been found that by utilizing all of the mechanisms for cell internalization (See Fig. 5 (C)). In conclusion, although all of the SNAs were absorbed into the cells by scavenger receptor-mediated endocytosis, differences in sugar uptake and different absorption mechanisms were observed due to differences in sugar backbone .
본 발명에서는 다양한 슈가 백본(sugar backbone)으로 개조된 올리고뉴클레오타이드를 접합한 SNAs가 슈가 백본에 따라 세포 흡수 효율에 차이가 남을 확인하였고 이들의 흡수 경로를 밝힌 것으로, 이러한 본 발명에 따른 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자는 세포 독성이 없으면서도 세포 내 흡수 효율이 매우 우수하여, 다양한 나노 메디신(nano medicine) 및 약물 전달 기술에 널리 응용되고 활용될 수 있다. In the present invention, SNAs conjugated with oligonucleotides modified with various sugar backbones have different absorption efficiencies depending on the sugar backbone, and their absorption pathways are revealed. The core-shell structure The metal nanoparticles of the present invention can be widely applied and utilized in various nano medicine and drug delivery technologies because of its excellent intracellular absorption efficiency without cytotoxicity.
Claims (14)
금속 나노 입자 코어 층; 및
상기 코어 층 표면에 L-DNA, 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA, 및 2’-할로-RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단일 가닥의 변형 핵산(modified nucleic acid)이 포함되어 있는 쉘 층;을 포함하며,
상기 L-DNA은 대음세포작용, 클라트린을 매개로 하는 엔도사이토시스, 카베올래를 매개로 하는 엔도사이토시스, 또는 스캐빈저 수용체를 매개로 하는 엔도사이토시스의 경로를 통해 전달되며,
상기 2'-(C1-C6 알콕시)-RNA는 클라트린을 매개로 하는 엔도사이토시스, 카베올래를 매개로 하는 엔도사이토시스, 또는 스캐빈저 수용체를 매개로 하는 엔도사이토시스의 경로를 통해 전달되고,
상기 2'-할로-RNA는 스캐빈저 수용체를 매개로 하는 엔도사이토시스의 경로를 통해 전달되는, 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자인 약물전달체.
In a drug delivery system which is a metal nanoparticle of a core-shell structure,
Metal nanoparticle core layer; And
The surface of the core layer contains at least one single strand of modified nucleic acid selected from the group consisting of L-DNA, 2 '- (C 1 -C 6 alkoxy) -RNA, and 2'-halo-RNA A shell layer on the substrate,
The L-DNA is transmitted through the pathway of endocytosis mediated by articular cell action, clathrin-mediated endocytosis, caveolae-mediated endocytosis, or scavenger receptors,
The 2 '-( C 1 -C 6 alkoxy) -RNA can be used to express the pathway of endocytosis mediated by clathrin, endocytosis mediated by Caveolae, or scavenger receptors Lt; / RTI >
Wherein said 2'-halo-RNA is a core-shell structure metal nanoparticle delivered via a pathway of endocytosis mediated by a scavenger receptor.
The drug delivery system according to claim 1, wherein the 2'-halo-RNA is a metal nanoparticle having a core-shell structure of 2'-fluoro-RNA.
The drug carrier according to claim 1, wherein the metal nanoparticles are metal nanoparticles having a core-shell structure with an average particle diameter of 3 to 100 nm.
The method of claim 1, wherein the metal-nanoparticles of the core- Wherein the metal nanoparticle is a core-shell structure in which 10 to 10,000 modified nucleic acids are bound to a core skin.
(a) 금속 화합물과 시트레이트염(citrate)을 반응시켜 금속 나노 입자 코어를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 금속 나노 입자 코어 표면에 L-DNA, 2’-(C1-C6 알콕시)-RNA, 및 2’-할로-RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단일 가닥의 변형 핵산(modified nucleic acid)을 처리하여 쉘 층을 형성하는 단계;
를 포함하는 코어-쉘 구조의 금속 나노 입자인 약물전달체의 제조방법.
A method for manufacturing a drug delivery vehicle, which is a metal nanoparticle according to any one of claims 1 to 4,
(a) preparing a metal nanoparticle core by reacting a metal compound with a citrate salt; And
(b) one or more single-stranded modified nucleic acids selected from the group consisting of L-DNA, 2 '- (C 1 -C 6 alkoxy) -RNA, and 2'-halo-RNA on the surface of the metal nanoparticle core nucleic acid to form a shell layer;
Wherein the metal nanoparticles have a core-shell structure.
The method according to claim 5, wherein the 2'-halo-RNA is 2'-fluoro-RNA.
6. The method of claim 5, wherein the metal nanoparticles have an average particle diameter of 3 to 100 nm.
6. The method of claim 5, wherein the metal-nanoparticles of the core- Wherein 10 to 10,000 modified nucleic acids are bound to the core epidermis.
The method of claim 5, wherein the metal is gold (Au), and the step (a) is a heating reaction at a temperature of 70 to 100 ° C to produce gold nanoparticles.
6. The method of claim 5, wherein the step (b) comprises incubating for 14-18 hours to form a shell layer.
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| WO2009104937A2 (en) | 2008-02-22 | 2009-08-27 | 이화여자대학교 산학협력단 | Optical gene code identification system using nanohybrid technology |
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