KR101791296B1 - 알츠하이머병 관련 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 카세트, 벡터, 및 이를 이용하여 형질전환된 세포주 - Google Patents
알츠하이머병 관련 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 카세트, 벡터, 및 이를 이용하여 형질전환된 세포주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알츠하이머병과 관련된 유전자를 포함하는 발현 카세트, 벡터 및 이를 이용하여 형질전환된 세포주에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명의 발현 카세트는 알츠하이머병과 관련된 APP(아밀로이드 전구 단백질), Tau(타우 단백질) 및 PS1(프리세닐린 1:Preseniline -1) 돌연변이 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 이들 유전자를 포함한다. 또한 본 발명은 상기 유전자들을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 이용하여 형질전환된 세포주에 관한 것이며, 나아가 상기 벡터 또는 세포주를 이용하여 형질전환된 동물 모델에 관한 것이다.
Description
본 발명은 알츠하이머병과 관련된 유전자를 포함하는 발현 카세트, 벡터 및 이를 이용하여 형질전환된 세포주에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명의 발현 카세트는 알츠하이머병과 관련된 APP(아밀로이드 전구 단백질), Tau(타우 단백질) 및 PS1(프리세닐린 1:Preseniline-1) 돌연변이 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 이들 유전자를 포함한다. 또한 본 발명은 상기 유전자들을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 이용하여 형질전환된 세포주에 관한 것이며, 나아가 상기 벡터 또는 세포주를 이용하여 형질전환된 동물 모델에 관한 것이다.
알츠하이머병은 퇴행성 뇌질환 중 하나로서 신경세포의 점진적인 퇴화로 인해 인지능력 상실을 가져오는 치매 중 60%를 차지한다. 알츠하이머는 원인에 따라서 유전적 요인에 의해 나타나는 가족성 알츠하이머병과 정확한 원인은 알 수 없으나 많은 수의 환자에게서 발병하는 산발성 알츠하이머병으로 나뉜다. 현미경으로 알츠하이머병으로 사망한 환자의 뇌 조직을 검사하였을 때, 특징적인 병변으로 신경반 (neuritic plaque) (또는 노인반) 과 신경원섬유 다발(neurofibrillary tangles)등이 관찰되고, 육안 관찰 시에는 신경세포 소실로 인하여 전반적 뇌 위축 소견이 보이다.
이 중 신경반은 세포외부에 단백질과 죽은 세포 등이 축적되어 형성되는 것으로서 주 구성성분은 42개 혹은 43개의 아미노산으로 이루어진 β-아밀로이드(Aβ)라는 펩티드이며, 신경원섬유 다발은 세포 내에서 세포골격(cytoskeleton)이 과다하게 인산화된 Tau 단백질을 중심으로 비정상적으로 뭉쳐져 실뭉치처럼 보이는 것을 말한다.
알츠하이머병의 대표적인 원인유전자로 알려진 APP, Tau 및 PS1이 알츠하이머병을 일으키는 병인기전인 이러한 β-아밀로이드의 과발현과 Tau 단백질의 응집에 기여 한다는 것이 알려져 있다.
β-아밀로이드는 아밀로이드 전구단백질(amyloid precursor protein; APP)로부터 프로테올리시스(proteolysis) 과정을 통해 만들어진다. 전구단백질인 APP는 하나의 트랜스맴브레인 도메인(transmembrane domain)을 가지고 있는 단백질로 교번 스플리싱(alternative splicing)에 의해 몇 가지 이소타입으로 발현되며 세포 내에서 두 가지 대사경로를 거치는 것으로 알려져 있다. 한가지는 α-시크리테아제와 γ-시크리테아제에 의해 p3와 sAPPα가 생성되는 경로이며 다른 한가지는 β-시크리테아제와 γ-시크리테아제에 의해 β-아밀로이드와 APPβ가 생성되는 경로이다. 가족성 알츠하이머병 환자들에서 이 APP 단백질에 돌연변이가 발견된다. 지금까지 발견된 돌연변이는 APP670/671(Swedish), APP672(Flemish), APP716(Florida), APP717 (London) 등이 있으며 이들 돌연변이에서 β-아밀로이드의 형성이 증가하는 것이 밝혀져 있다.
가족성 알츠하이머병을 유발하는 돌연변이를 나타내는 또 다른 한가지의 유전자는 프리세닐린 1(PS1)이다. PS1은 8개의 트랜스맴브레인 도메인을 가진 단백질로서 발생 과정에서 중요한 역할을 하며 γ- 시크리테아제 자체 또는 복합체의 일원으로 작용하는 것으로 알려져 있다. PS1은 단백질 전체에 걸쳐 가족성 알츠하이머병을 유발하는 돌연변이들이 45가지 이상이 보고되어 있으며 이들 돌연변이들 역시 β-아밀로이드의 형성량을 증가시키는 것으로 밝혀져 있다.
생성된 β-아밀로이드에 의한 알츠하이머병의 발병은 Tau 단백질의 과인산화에 의한 신경세포손상의 과정을 동반하며, 이러한 Tau 단백질의 과인산화에는 몇 가지 인산화효소가 작용하는 것으로 알려져 있다. Tau의 과인산화와 더불어 Tau의 tangle 형성 또한 신경세포를 손상시키는 역할을 하며, 다발 (tangle)이 잘 형성되는 Tau의 돌연변이가 발견되었다.
인간 뇌세포의 노화 외에도, β-아밀로이드의 축적과 응집, Tau 단백질의 tangle 형성기전을 밝히는 것이 알츠하이머병의 치료방법에 있어서 중요한 역할을 할 것으로 예상되므로, 이를 연구하기 위하여 APP 유전자 돌연변이, PS1 유전자 돌연변이, 및 Tau 유전자 돌연변이가 동시에 발현하는 세포주 또는 동물 모델을 수립할 필요성이 요구된다.
여러 연구에서 알츠하이머병의 병인기전의 연구를 위해서 형질전환 마우스를 수립하기 위한 시도가 있었다. 이러한 시도의 주 목표가 된 형질전환 유전자는 가족성 알츠하이머병에서 원인 유전자로 밝혀진 APP, PS1, Tau 및 ApoE4 같은 유전자들이다. 현재 연구에 주로 사용되고 있는 형질전환 마우스는 APP 또는 PS1 유전자 돌연변이를 이용하여 뇌 속에 β-아밀로이드의 농도를 올려서 신경반이 형성되게 하는 모델이다. 하지만 β-아밀로이드만으로는 알츠하이머병의 병인기전을 정확히 알기 어렵기 때문에 최근에는 Tau의 돌연변이 유전자를 동시에 넣는 시도들이 이뤄지고 있다. 이는 형질전환 마우스의 뇌 속에 β-아밀로이드 및 Tau를 동시에 발현시켜 인간의 알츠하이머병에 보다 더 근접한 모델을 만들기 위한 것이다.
또한 APP 및 PS1 이 동시에 돌연변이 형태로 존재하면 β-아밀로이드를 보다 이른 시기에 만들어 낼 수 있다. 1세대 형질전환 마우스인 TG2576는 생후 12개월 이상 사육을 해야 뇌 속에 β-아밀로이드의 축적 현상이 시작되는데 반하여, 5XFAD 또는 APP/PS1 마우스의 경우에는 6개월 이내에 β-아밀로이드 축적이 시작된다. 1996년 Duff 그룹에서 APP 및 PS1의 단일 형질전환 마우스를 교배시켜서 얻은 이중 형질전환 마우스의 개발에 성공한 이후 현재까지 여러 연구에서 이 형질전환 마우스가 사용되고 있다. 실제로 이중 형질전환 마우스의 경우 두 가지 유전자의 상승 효과(Synergistic Effect)로 인해 반점 형성기간이 3개월에서 9개월 사이로 앞당겨짐을 관찰할 수 있다. 하지만, 이들 마우스는 대부분이 APP 및 PS1 각각의 형질전환 마우스를 교배하여 얻어진 것이기 때문에 각 유전자의 발현은 각각의 프로모터로부터 독립적으로 조절되며, 사용된 프로모터들은 신경세포에만 특이적으로 발현되는 것이 아닌 경우가 많아 알츠하이머병의 병인 기전 연구에 어려움이 있다. 또한 설치류인 마우스의 경우에는 대사작용이 인간과 많이 달라서 알츠하이머병 약물 개발 시 그 유효성 평가에 많은 차이를 보이기도 한다.
이러한 문제점을 개선하기 위해서는 하나의 염색체 상에 알츠하이머병 돌연변이 유전자들이 존재하여 다음세대로 완전 연관되어 유전될 수 있어야 하며, 비설치류 중에서 형질전환이 자유롭고 인간과 매우 가까운 동물을 이용할 필요성이 요구된다.
본 발명의 목적은, 알츠하이머병과 관련된 APP(아밀로이드 전구 단백질), Tau(타우 단백질) 및 PS1(프리세닐린 1:Presenilin -1) 돌연변이 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 이들 유전자를 포함하는 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 세포주 및 형질전환된 동물 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트는 a) 아밀로이드 전구단백질(APP)을 암호화하는 APP 돌연변이 유전자, b) 타우 단백질(Tau)을 암호화하는 타우 돌연변이 유전자, c) 프리세닐린 1(PS1)을 암호화하는 PS1 돌연변이 유전자 및 d) 상기 세 돌연변이 유전자를 한번에 조절할 수 있는 신경세포 특이적 프로모터를 포함한다.
상기 프로모터는 인간 PDGF-β 융합 프로모터일 수 있으며, 또는 서열번호 2의 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트는 CMV 인핸서를 더 포함할 수 있다.
상기 CMV 인핸서는 서열번호 3의 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 APP 돌연변이 유전자는 595번 아미노산, 596번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있으며, 또는 서열번호 4의 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 타우 돌연변이 유전자는, 243번 아미노산이 돌연변이된 것일 수 있으며, 또는 서열번호 5의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트
상기 PS1 돌연변이 유전자는, 146번 아미노산, 286번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있으며, 또는 서열번호 6의 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 APP 돌연변이 유전자, 상기 타우 돌연변이 유전자 및 상기 PS1 돌연변이 유전자 각각의 사이에 2A 서열을 더 포함할 수 있다.
상기 2A 서열은, 서열번호 8의 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트를 포함한다.
상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 9의 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 세포주는 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 것이다.
본 발명의 인간을 제외한 동물은 상기 재조합 발현 벡터 또는 상기 형질전환된 세포주를 이용하여 형질전환된 것이다.
상기 인간을 제외한 동물은 포유류일 수 있다.
상기 동물은 돼지일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터 제조방법은, 제한효소부위를 포함하고 프로모터 및 유전자 클러스터가 제거된 제1 벡터를 구축하는 단계; 제2 벡터 내에 프로모터, APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자를 각각 삽입하여 재조합 제2 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 제2 벡터 상의 APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자 각각에 돌연변이를 유도하는 단계; 및 상기 제1 벡터 내에 상기 재조합 제2 벡터를 삽입하는 단계:를 포함한다.
본 발명은, 하나의 유전자 운반벡터에 하나의 프로모터를 사용하여 세 가지 알츠하이머병 관련 유전자 APP, PS-1 및 타우 (Tau)가 동시에 조절 및 발현될 수 있도록 하는 유전자 발현 카세트, 발현 벡터, 형질전환된 세포주, 및 형질전환된 동물모델을 제공하며, 이는 세 가지 알츠하이머병 관련 유전자들 사이의 병인 기전을 밝히는 연구에 이용될 수 있다. 또한 이렇게 생산된 세포주 또는 동물모델은 발병 시간이 기존의 동물모델의 발병 시간보다 짧으므로 알츠하이머병 관련 약물 개발에 보다 효율적으로 이용될 수 있다.
도 1a는, 본래의 pTet CKOS 레트로바이러스 벡터의 모식도이다.
도 1b는, 구조 변형된 pTet 벡터의 모식도이다.
도 2는, hPDGFb 프로모터, hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자를 포함하는 psCMV 벡터의 구조 모식도이다.
도 3a는, CMV 인핸서 및 hPDGF-β 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 일차원적 구조 모식도이다.
도 3b는, CMV 인핸서 및 hPDGF-β 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 고리형 구조 모식도이다.
도 4는, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터를 HEK-293 세포에 일시발현 (transient expression)시킨 후에 웨스턴 블롯 (Western blot) 으로 단백질을 확인한 사진이다.
도 5는, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 인테그레이션 (integration) 확인에 사용된 프라이머들이다.
도 6은, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터를 이용한 돼지 세포주 16개를 확인한 사진이다.
도 7은, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터로 만든 돼지 세포주를 분석한 사진이다.
도 1b는, 구조 변형된 pTet 벡터의 모식도이다.
도 2는, hPDGFb 프로모터, hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자를 포함하는 psCMV 벡터의 구조 모식도이다.
도 3a는, CMV 인핸서 및 hPDGF-β 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 일차원적 구조 모식도이다.
도 3b는, CMV 인핸서 및 hPDGF-β 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 고리형 구조 모식도이다.
도 4는, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터를 HEK-293 세포에 일시발현 (transient expression)시킨 후에 웨스턴 블롯 (Western blot) 으로 단백질을 확인한 사진이다.
도 5는, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 인테그레이션 (integration) 확인에 사용된 프라이머들이다.
도 6은, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터를 이용한 돼지 세포주 16개를 확인한 사진이다.
도 7은, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터로 만든 돼지 세포주를 분석한 사진이다.
이하, 실시예들을 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.
본 발명은, a) 아밀로이드 전구단백질(APP)을 암호화하는 APP 돌연변이 유전자, b) 타우(Tau)단백질을 암호화하는 타우 돌연변이 유전자, c) 프리세닐린 1(PS1)을 암호화하는 PS1 돌연변이 유전자 및 d) 상기 세 돌연변이 유전자를 한번에 조절할 수 있는 신경세포 특이적 프로모터를 포함하는, 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트를 제공한다.
상기 프로모터는 신경세포에서 유전자가 특이적으로 발현될 수 있게 하는 프로모터이면 그 종류를 구별하지 않고 사용 가능하다. 본 발명의 일실시예로서, 상기 프로모터는 인간 PDGF-β 융합 프로모터 (hPDGF promoter : Platelet Drived Growth Factor promoter)일 수 있으며, 이는 돼지의 뇌세포에서 외래유전자가 발현될 수 있게 하는 프로모터로 알려져있다.
상기 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트는, 유전자의 발현을 보다 향상시키기 위하여 인핸서를 더 포함할 수 있으며, 본 발명의 일실시예로서 CMV (Cytomegalo virus) 인핸서를 포함할 수 있다.
상기 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트는, 상기 APP 돌연변이 유전자, 타우 (Tau) 돌연변이 유전자 및 PS1 돌연변이 유전자 각각의 사이에 2A 서열을 더 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 APP 돌연변이 유전자와 상기 타우 돌연변이 유전자 사이에 2A 서열을 더 포함하고, 상기 타우 돌연변이 유전자와 상기 PS1 돌연변이 유전자 사이에 2A 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 2A 유전자서열은 18 내지 22개 아미노산을 코딩하고 있으며 그 중에서 말단에 위치하는 4개의 아미노산 Asparagine (N), Proline (P), Glycine (G), Proline (P)은 종간에 중요하게 보존되어 있는 아미노산이다. 상기 서열은 펩티드로 합성될 때, 자기-분열 (self-cleavage)이 일어나는 경향을 보인다. 이러한 성질로 인하여 리보좀(Ribosome)이 단백질 전사를 진행할 때 2A 서열 말단에 위치한 N, P, G를 암호화한 유전자 코드 (genetic code)에 도달하면, NPG를 차례로 인지하여 펩티드 결합을 만들고 다음 아미노산인 proline 암호화 코드에 Proline 이 결합된 prolyl-tRNA을 가져오는 대신에 방출 요소 (releasing factor: RF) 인자를 가져온다. RF 인자가 결합하고 난 다음에는 앞에서 이미 형성된 펩티드는 더 이상 펩티드 결합을 이어가지 못하고 리보좀에서 방출된다. 그리고 2A 서열 이후에 암호화된 코드는 정상적으로 작동하여 다음 단백질 전사를 진행하게 된다. 결론적으로 2A 서열을 삽입함으로써 하나의 프로모터를 이용하여 여러 유전자를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 유전자 카세트는 이러한 2A 서열을 세 유전자들 사이 각각에 삽입함으로써, 상기 유전자들을 동시에 발현할 수 있다.
상기 APP 돌연변이 유전자는, 595번 아미노산, 596번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있으며, 상기 타우 돌연변이 유전자는, 243번 아미노산이 돌연변이된 것일 수 있다. 또한, 상기 PS1 돌연변이 유전자는, 146번 아미노산, 286번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있다. 이러한 돌연변이된 아미노산의 일실시예로서, 상기 APP 돌연변이 유전자는 APP695의 595번 아미노산 Lys 이 Asn 으로 돌연변이 되고, 596번 아미노산 Met 이 Lys 으로 돌연변이 되어있는 유전자일 수 있으며, 상기 타우 돌연변이 유전자는 243번 아미노산 Phe 이 Lys 으로 돌연변이 되어있는 유전자일 수 있다. 또한 상기 PS1 돌연변이 유전자는 146번 아미노산 Met 에서 Leu 으로 돌연변이 되고, 286번 아미노산 Pro 이 Leu 으로 돌연변이된 유전자일 수 있다.
본 발명의 일실시예로, 상기 APP 돌연변이 유전자는 서열번호 4의 서열을 가질 수 있으며, 상기 타우 돌연변이 유전자는 서열번호 5의 서열을 가질 수 있으며, 또한 상기 PS1 돌연변이 유전자는 서열번호 6의 서열을 가질 수 있다.
본 발명은, 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 일실시예로 사용할 수 있는 발현 벡터는, 신경세포에 특이적으로 상기 알츠하이머 관련 단백질을 효율적으로 발현을 유도 하고자 할 때 이용 될 수 있는 것이면 종류에 제한 없이 사용가능하나, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명은, 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 세포주를 제공하며, 또한 상기 세포주를 이용하여 형질전환된 인간을 제외한 동물을 제공한다.
상기 세포주는 포유류에서 비롯된 것이면 인간을 제외하고 제한 없이 사용가능하다. 하지만 기존에 주로 사용되는 마우스의 경우, 대사가 매우 빠르며 일생의 변화가 인간과 매우 다르기 때문에 정확한 질병모델로 사용하기에 어려운 점이 있어왔다. 따라서 인간의 몸집과 유사한 크기를 갖고 있으며 대사 측면에서 유사한 형태를 가지는 동물이 바람직하며, 그 중에서도 돼지가 가장 바람직하다. 본 발명에 의하여 생산되는 알츠하이머병의 돌연변이 유전자로 형질전환된 돼지를 이용할 경우, 알츠하이머 관련 세 가지 유전자를 동시에 생성하게 함으로써 세 가지 유전자의 작용을 동시에 연구할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 신경세포에서 특이적으로 발현하게 함으로써 알츠하이머병에서 문제가 되는 신경계에서의 변화만을 중점적으로 연구할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1 : 새로운 레트로바이러스 벡터의 제조
레트로바이러스의 벡터인 pTet-CKOS 를 이용하여 이 벡터에 존재하는 TRE 미니멀 CMV 프로모터와 CKOS 유전자 클러스터를 제거하였다. 유전자 클로닝에 유리하도록 BglII, SwaI, PacI, NotI 그리고 XhoI 등의 제한효소부위를 갖도록 벡터를 수정하였다.
도 1a는, 본래의 pTet CKOS 레트로 바이러스 벡터의 모식도이다.
도 1b는, 구조 변형된 pTet 벡터의 모식도이다.
본래의 pTet-CKOS 벡터 총 길이 13,320bp 중에서 TRE 미니멀 프로모터 (TRE minimal promoter)와 CKOS 부분 (5,568bp)를 제거하고, 이곳에 76bp 멀티플 클로닝 사이트 (multiple cloning site)를 삽입하였다 (도 1a 에서 도 1b로). 구조 변형된 pTet 벡터의 염기서열의 일실시예는 첨부된 서열목록 1을 참고할 수 있다.
실시예 2 : CMV 인핸서, hPDGF 프로모터, 알츠하이머병 유전자 도입
인간 PDGF 프로모터, CMV 인핸서, 및 알츠하이머병의 원인이 되는 β-아밀로이드의 전구단백질(APP) 유전자(NM_201414.2), 프리세닐린(PS-1) 유전자(NM_000021.3), 타우(Tau) 유전자(NM_016834.4) 등을 벡터에 삽입하기 위하여 제한효소 사이트가 포함된 프라이머를 제작하여 사용하였다.
표적 | 프라이머 이름 | 서열 (5' -> 3') | 크기 |
pTet-enz. insert | pTet-Enz-insert-F | AGATCTATTTAAATACCGGT | 67bp |
pTet-Enz-insert-R | CTCGAGGCGGCCGCCCTGCA | ||
hPDGFb promoter | BamH1-Swa1-PDGFb-F | GGATCCATTTAAATGCTGGGACTACAGGAGCTTG | 1530bp |
PDGFb-Cla1-R | ATCGATGTGCGCGCAAAGTATCTCTA | ||
hAPPswcDNA |
Cla1-hAPPsw-F | ATCGATATGCTGCCCGGTTTGGCACT | 2106bp |
hAPPsw-Pac1-Sph1-R | GGCATGCTTAATTAAGTTCTGCATCTGCTCAAAGA | ||
hTaucDNA |
Bgl2-hTau-F | AGATCTATGGCTGAGCCCCGCCAGGA | 1161bp |
hTau-EcoR1-R | GAATTCCAAACCCTGCTTGGCCAGGG | ||
2A peptide | EcoR1-2A-F | GAATTCGGAAGCGGAGCTACTAACTT | 78bp |
2A-Xho1-R | CTCGAGAGGTCCAGGGTTCTCCTCCA | ||
hPS1 cDNA |
Xho1-hPS1-F | CTCGAGATGACAGAGTTACCTGCACC | 1424bp |
hPS1-Xba1-R | TCTAGACCTGCAGGCTAGATATAAAATTGATGGA | ||
CMV nhancer |
CMVE-F | ATTTAAATGCGTTACATAACTTACGG | 321bp |
CMVE-R | ATTTAAATCATGGTAATAGCGATGAC |
상기 표 1은 사용된 프라이머들을 나타낸 것이다.
알츠하이머병 관련 유전자들이 뇌신경세포에서 특이적으로 과발현하도록 CMV 인핸서와 PDGF 프로모터를 hybrid 형태로 만들어서 프로모터로 사용하였다. 최종 벡터인 레트로바이러스 벡터를 만들기 전에 각각의 돌연변이 유전자, CMV 인핸서 및 PDGF 프로모터를 psCMV 벡터에 삽입하였다. psCMV 에 유전자를 삽입하기 위해 각각 PCR 을 이용하여 증폭하였으며, 백터 내 도입된 제한효소 사이트를 이용하여 클로닝하였다.
도 2는, 본 발명의 일실시예로 제조된, hPDGFb 프로모터, hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자를 포함하는 psCMV 벡터의 구조 모식도이다.
실시예 3 : 알츠하이머병 유전자의 돌연변이 도입
psCMV 벡터에 삽입한 후에 알츠하이머병 돌연변이 유전자의 아미노산 변이를 유도하기 위하여 위치선택적 돌연변이 키트 (site-directed mutagenesis kit: Stratagene)를 이용하였다.
표적 | 프라이머 이름 | 서열 (5' -> 3') |
hAPPSw Mutagenesis-1 | hAPPsw-M1(KM/NL)-F | GAGATCTCTGAAGTGAATCTGGATGCAGAATTCCGA |
hAPPsw-M1(KM/NL)-R | TCGGAATTCTGCATCCAGATTCACTTCAGAGATCTC | |
hAPPSw Mutagenesis-2 | hAPPsw-M2(IV/VI)-F | GTCATAGCGACAGTGGTCATCATCACCTTGGTGATG |
hAPPsw-M2(IV/VI)-R | CATCACCAAGGTGATGATGACCACTGTCGCTATGAC | |
hTau Mutagenesis | hTau-M(P/L)-F | AATATCAAACACGTCCTGGGAGGCGGCAGTGTGC |
hTau-M(P/L)-R | CACACTGCCGCCTCCCAGGACGTGTTTGATATT | |
hPS1 Mutagenesis-1 | hPS1-M1(M/V)-F | AGTGTCATTGTTGTCCTGACTATCCTCCTGGTG |
hPS1-M1(M/V)-R | CACCAGGAGGATAGTCAGGACAACAATGACACT | |
hPS1 Mutagenesis-2 | hPS1-M2(L/V)-F | TGAAACGCTTTTTCCAGCTGTCATTTACTCCTCAACA |
hPS1-M2(L/V)-R | TGTTGAGGAGTAAATGACAGCTGGAAAAAGCGTTTCA |
APP 의 경우에는 뇌신경세포에 발현되는 APP695 타입의 유전자를 이용하였으며 유전자의 알츠하이머병의 가족적 변이 (familial mutation)가 발견된 595번 및 596번 두 군데 이중 돌연변이를 도입하였다. 이들 돌연변이는 β-아밀로이드 42 형태를 더 많이 만들어 내는 것으로 알려져 있다. 상기 아미노산 변이는 각각 K595N, N596M 으로 명명하였다. 프리세닐린 역시 두 개의 아미노산 돌연변이가 도입되었다. 146번과 286번 아미노산의 돌연변이가 도입되었으며, 각각 M146L, P286L 로 명명되었다. Tau의 경우에는 243번 아미노산 한 개만 변이되었으며 P243L 로 명명되었다.
세 개의 돌연변이 유전자는 하나의 mRNA 로 전사가 된 후에, 각각 단백질로 번역이 될 때 독립적인 펩티드로 분리되도록 하기 위해서 2A서열로 서로 연결되도록 하였다(도 2).
실시예 4 : pTet 레트로바이러스 멀티-시스트로닉 벡터의 완성
PDGF 프로모터와 세 개의 돌연변이 유전자가 일렬로(tandem) 연결된 psCMV 벡터를 제조한 후에, 실시예 1에서 제조한 레트로바이러스 벡터로 SwaI, PAcI 및 NotI 제한효소를 이용하여 옮겨 최종 재조합 발현벡터를 완성하였다. 완성된 재조합 발현벡터는 염기서열 결정을 통해 전체 14,618bp 의 DNA 서열을 확인하였다.
도 3은, CMV 인핸서 및 hPDGF-β 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 일차원적 구조 (도 3a) 및 이의 고리형 구조 (도 3b) 이다. 본 발명의 재조합된 최종 벡터의 일실시예로, pTet-CMVE-hPDGFb-APPsw-2A-Tau-2A-PS1 의 염기서열은 첨부된 서열목록 9을 참고할 수 있다.
실시예 5 : 최종 재조합 발현벡터의 발현 확인
최종 재조합 발현벡터를 DNA 프레퍼레이션 (DNA preparation)하여 리포펙타민(Lipofectamine: Invitrogen) 방법을 이용하여 HT22 세포에 트렌스펙션 (transfection)하여 18시간 뒤에 세포 내에 세 개의 유전자가 동시에 발현하는지 확인하였다.
세 가지 유전자의 발현은 각각에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯(Western blot) 방법으로 확인하였다. APP 발현은 22C11 항체와 6E10 항체를 이용하였으며, Tau 는 Tau5 항체를 이용하였고 PS1 은 PS1 특이적 항체를 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.
도 4는, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터를 HEK-293 세포에 일시발현 (transient expression)시킨 후에 웨스턴 블롯으로 단백질을 확인한 사진이다. 도 4에서 각각의 밴드가 뚜렷이 나타난 것으로 미루어보아, 재조합 발현벡터에서 2A 시스템이 제대로 작동하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6 : 알츠하이머병 돌연변이 유전자가 도입된 돼지 세포주 개발
최종 재조합 발현벡터를 DNA 프레퍼레이션하고 전기천공법 (electroporation)으로 돼지 귀세포에 트랜스펙션하여 히그로마이신 (hygromycin)으로 세포주를 선별하였다. 전기천공법은 총 11가지 조건에서 실시하였다.
|
3275 세트 파라미터 | ||||||||||
천공 펄스 (Poring Pulse: PP) | 트랜스퍼 펄스 (Transfer Pulse: TP) | ||||||||||
V |
시간 | 간격 | 횟수 |
붕괴율 (Decay rate) |
V |
시간 | 간격 | 횟수 |
붕괴율 (Decay rate) |
극성 (Polarity) |
|
(ms) | (ms) | (%) | (ms) | (ms) | (%) | ||||||
1 | 대조군 (전기천공 하지 않은 DNA와 세포를 갖는) | ||||||||||
2 | 125 | 2.5 | 50 | 2 | 10 | 20 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
3 | 125 | 5 | 50 | 2 | 10 | 20 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
4 | 150 | 5 | 50 | 2 | 10 | 20 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
5 | 175 | 5 | 50 | 2 | 10 | 20 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
6 | 200 | 5 | 50 | 2 | 10 | 20 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
7 | 225 | 5 | 50 | 2 | 10 | 20 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
8 | 275 | 0.5 | 50 | 2 | 10 | 20 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
9 | 275 | 1 | 50 | 2 | 10 | 20 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
10 | 275 | 1.5 | 50 | 2 | 10 | 20 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
11 | 275 | 2 | 50 | 2 | 10 | 20 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
상기 표는 실시된 전기천공법의 조건을 나타낸 것이다.
유전자 도입 및 발현 효율이 가장 높은 #5조건 (175 V, 5 ms)을 이용하여 히그로마이신 (300 ug/mL)을 5일간 지속적으로 처리하여 세포주 선별을 실시하였다. 선별된 세포주에서 세 가지 돌연변이 유전자가 염색체에 도입되었는지 PCR로 확인하였다.
도 5는, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 인테그레이션 (integration) 확인을 위해 PCR에서 사용된 프라이머들이다.
도 6은, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터를 이용한 돼지 세포주 16개를 확인한 사진이다.
총 16개의 콜로니로부터 각각의 세포주를 획득하였으며 프로모터 부분부터 각각의 돌연변이 유전자, 그리고 poly(A)에 이르기까지 모든 유전자 부위가 염색체에 인테그레이션 되어 있는 것을 도 6의 사진을 통하여 확인하였다.
실시예 7 : 알츠하이머병 돌연변이 유전자가 도입된 돼지 세포주 분석
실시예 6에서 얻어진 알츠하이머병 돌연변이 유전자 도입된 세포주를 계대배양하여 세포수를 늘리고 분리하여 스톡을 만들었다. 생산된 세포주는 단백질 추출을 하여 알츠하이머병 유전자 세 가지가 모두 발현하는지를 확인하였다.
실시예 5에서 사용한 것과 동일한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 발현을 확인하였다.
도 7은, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터로 만든 돼지 세포주를 분석한 사진이다.
단백질의 발현양에서 각각 차이는 있으나 세포주에서 세 가지 단백질 모두를 발현하는 것을 도 7에서 확인할 수 있었다.
실시예 8 : 핵치환 또는 DNA 주입에 의한 알츠하이머질환 모델 돼지의 생산
알츠하이머질환 모델 돼지 생산을 위한 형질전환 수정란 생산은 핵치환 방법과 DNA 주입으로 실시하였다. 핵치환 방법에 의한 형질전환 수정란 생산을 위해 먼저 체외 성숙된 돼지 난자의 탈핵을 실시하고 알츠하이머병 유전자가 도입된 형질전환 세포를 바로 주입하여 0.3M mannitol (Sigma) 용액내에서 LF201 Electro Cell Fusion Generator (NEPA GENE, Shioyaki, Japan) 을 사용하여 세포 융합을 실시하였으며 (120 volt에서 1pulse 60㎲) 30분 후에 세포융합여부를 관찰한 다음 7.5 mg/ml cytochalasin B (sigma) 가 첨가된 PZM-5 배양액에 5시간 처리하였다.
DNA 주입에 의한 형질전환 수정란 생산방법은 체외 성숙된 돼지난자에 신선한 돼지 정자로 체외수정을 5시간 동안 실시하고 (난자 1개당 5,000 마리의 정자농도), 수정 후 18시간째에 15,000rpm 내지 18,000rpm에서 10분 정도 원심분리를 하여 지방구가 한쪽으로 모이게 한 뒤 미세조작기로 고정한 후, eppendorf femtojet을 사용하여 돼지 수정란의 전핵 (pronuclei)에 2 ng/ul 농도의 형질전환 DNA를 주입하여 생산하였다.
생산된 형질전환 수정란 (핵치환법 또는 DNA 주입법) 은 알츠하이머질환 모델 돼지를 생산하기 위해 대리모에 이식을 실시하게 되는데 보통 대리모 한 마리당 대략 150 내지 200여개의 난자를 이식하였다. 이때의 수란돈의 상태는 보통 배란 전 상태의 돼지를 사용하여 이식을 하고 이식 후 100일을 전후하여 1차 초음파 검사를 수행하였다. 2차 초음파 검사는 150일 정도에 관찰을 하고 대략 180일경에 분만을 유도하여 알츠하이머질환 모델 돼지를 생산하였다.
<110> Cheju National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Expression cassette and vector with genes related Alzheimer's
disease and transgenic cell line made from it
<130> APC-2014-0154
<160> 9
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 7785
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified Tet vector Sequence
<400> 1
tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60
ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120
tgaataccaa acaggatatc tgtggtaagc ggttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 180
gatgagacag ctgagtgatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 240
ctcggggcca agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagtgaa 300
tcatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtacc ttatttgaac 360
taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc cgctctccga gctcaataaa 420
agagcccaca acccctcact cggcgcgcca gtcttccgat agactgcgtc gcccgggtac 480
ccgtattccc aataaagcct cttgctgttt gcatccgaat cgtggtctcg ctgttccttg 540
ggagggtctc ctctgagtga ttgactaccc acgacggggg tctttcattt gggggctcgt 600
ccgggatttg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg taagctggcc 660
agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg tttgatgtta tgcgcctgcg 720
tctgtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa ctgacgagtt 780
ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc gtttttgtgg 840
cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg tggttctggt 900
aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt cggtttggaa 960
ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagcg ctgcagcatc gttctgtgtt gtctctgtct 1020
gactgtgttt ctgtatttgt ctgaaaatta gggccagact gttaccactc ccttaagttt 1080
gaccttaggt cactggaaag atgtcgagcg gatcgctcac aaccagtcgg tagatgtcaa 1140
gaagagacgt tgggttacct tctgctctgc agaatggcca acctttaacg tcggatggcc 1200
gcgagacggc acctttaacc gagacctcat cacccaggtt aagatcaagg tcttttcacc 1260
tggcccgcat ggacacccag accaggtccc ctacatcgtg acctgggaag ccttggcttt 1320
tgacccccct ccctgggtca agccctttgt acaccctaag cctccgcctc ctcttcctcc 1380
atccgccccg tctctccccc ttgaacctcc tcgttcgacc ccgcctcgat cctcccttta 1440
tccagccctc actccttctc taggcgccgg aattccgatc tgatagcttg ccacaacccg 1500
taccaaagat ggatagatcc ggaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc 1560
tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc 1620
gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg 1680
atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc 1740
cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg 1800
cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg 1860
tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc 1920
cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg 1980
ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg 2040
cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg 2100
tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca 2160
ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct 2220
ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg 2280
agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct 2340
atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg 2400
caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg 2460
ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca 2520
ctcgtccgag ggcaaaggaa tagagtagat gccgaccgaa caagagctga tttcgagaac 2580
gcctcagcca gcaactcgcg cgagcctagc aaggcaaatg cgagagaacg gccttacgct 2640
tggtggcaca gttctcgtcc acagttcgct aagctcgctc ggctgggtcg cgggagggcc 2700
ggtcgcagtg attcaggccc ttctggattg tgttggtccc cagggcacga ttgtcatgcc 2760
cacgcactcg ggtgatctga ctgatcccgc agattggaga tcgccgcccg tgcctgccga 2820
ttgggtgcag atctatttaa ataccggtac gcgtatgcat ttaattaagt ttaaacatgc 2880
atcctgcagg gcggccgcct cgagagatcc cctcaggata tagtagtttc gcttttgcat 2940
agggaggggg aaatgtagtc ttatgcaata ctcttgtagt cttgcaacat ggtaacgatg 3000
agttagcaac atgccttaca aggagagaaa aagcaccgtg catgccgatt ggtggaagta 3060
aggtggtacg atcgtgcctt attaggaagg caacagacgg gtctgacatg gattggacga 3120
accactgaat tccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacagcaaac 3180
gccatttgac cattcaccac attggtgtgc acctccaagc ttgttaattc accatgtcta 3240
gactggacaa gagcaaagtc ataaacggcg ctctggaatt actcaatgga gtcggtatcg 3300
aaggcctgac gacaaggaaa ctcgctcaaa agctgggagt tgagcagcct accctgtact 3360
ggcacgtgaa gaacaagcgg gccctgctcg atgccctgcc aatcgagatg ctggacaggc 3420
atcataccca cttctgcccc ctggaaggcg agtcatggca agactttctg cggaacaacg 3480
ccaagtcatt ccgctgtgct ctcctctcac atcgcgacgg ggctaaagtg catctcggca 3540
cccgcccaac agagaaacag tacgaaaccc tggaaaatca gctcgcgttc ctgtgtcagc 3600
aaggcttctc cctggagaac gcactgtacg ctctgtccgc cgtgggccac tttacactgg 3660
gctgcgtatt ggaggaacag gagcatcaag tagcaaaaga ggaaagagag acacctacca 3720
ccgattctat gcccccactt ctgagacaag caattgagct gttcgaccgg cagggagccg 3780
aacctgcctt ccttttcggc ctggaactaa tcatatgtgg cctggagaaa cagctaaagt 3840
gcgaaagcgg cgggccggcc gacgcccttg acgattttga cttagacatg ctcccagccg 3900
atgcccttga cgactttgac cttgatatgc tgcctgctga cgctcttgac gattttgacc 3960
ttgacatgct ccccgggtaa ctaagtaagg atcaacatcg aattcgattt ctgttcctgt 4020
taatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 4080
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 4140
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 4200
gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 4260
tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 4320
tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 4380
gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaagctg acgtcctttc catggctgct 4440
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 4500
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 4560
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ctgtttcgcc 4620
tcgggctcaa tcactagtga attcgataaa ataaaagatt ttatttagtc tccagaaaaa 4680
ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 4740
caaggcatgg aaaaatacat aactgagaat agagaagttc agatcaaggt caggaacaga 4800
tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc 4860
agggccaaga acagatggaa cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag 4920
ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtcca gccctcagca 4980
gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat gaccctgtgc 5040
cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgctccccg 5100
agctcaataa aagagcccac aacccctcac tcggggcgcc agtcctccga ttgactgagt 5160
cgcccgggta cccgtgtatc caataaaccc tcttgcagtt gcatccgact tgtggtctcg 5220
ctgttccttg ggagggtctc ctctgagtga ttgactaccc gtcagcgggg gtctttcatt 5280
tgggggctcg tccgggatcg ggagacccct gcccagggac caccgaccca ccaccgggag 5340
gtaagctggc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 5400
cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 5460
cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 5520
cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 5580
atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 5640
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 5700
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 5760
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 5820
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 5880
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 5940
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 6000
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 6060
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 6120
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 6180
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 6240
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 6300
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 6360
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 6420
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 6480
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 6540
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 6600
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 6660
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 6720
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 6780
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 6840
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tgcaggcatc 6900
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 6960
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 7020
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 7080
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 7140
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat 7200
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 7260
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 7320
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 7380
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 7440
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 7500
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 7560
ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 7620
acgaggccct ttcgtcttca agaattcata ccagatcacc gaaaactgtc ctccaaatgt 7680
gtccccctca cactcccaaa ttcgcgggct tctgcctctt agaccactct accctattcc 7740
ccacactcac cggagccaaa gccgcggccc ttccgtttct ttgct 7785
<210> 2
<211> 1510
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human PDGF promoter sequence
<400> 2
gctgggacta caggagcttg ttaccacacc cagctccagt ttataaattc atctccagtt 60
tataaaggag gaaaccgagg tactgagagg ttaaaaaacc ttcctgcaga cacttgtcca 120
gcaagtggcc actccaggat ttggaccaag gtgatgtgtc ttcaggctgt gtctctgcca 180
ctgtgccacg ctgctgggtg gtaggcagca gtgggtgggt gcctgcagtg gtctgtaaag 240
accacctgag atgtccttcc tcctctgttc caccctgtcc aggtccaaga agacagtcta 300
tgaagagaga gcaggtgtga ctctctcagt gtgctcctct gtgagaagca ggctgacatc 360
ccaaagggaa gggcggataa cagagacagt gcaagcggag gagatgaggg tgcctcaaag 420
ccgggaggct gggtgatgca ggagcctgcg tgtcccgagg ggggtgctgg gcccagtgtg 480
agtacgtgtg actgtgactg agacagtgtg actgctgaag gcagggacac agcagctccc 540
tgactggggg cagaaggcgt taactgtgtg aaggctggtt gtgggtgggt gggctctggg 600
cctcgaaccc gggggctgag ggagatagta aacagcaggg tgactgacgg gaagatcatg 660
ttggtagccc tgcgaagatg ctgcagggct gtgggggttt gtgtgacttt gcagttcaac 720
aaattcaaat tcagccaacg ctggcagggc ctgttgtgcc aggcaaccag ctaggaggag 780
gagactcgga cccagcttgc agctgaaggg cgctggctgc cgggttctgt gggttcacct 840
tgcggtgtct tcccttgcta acactgagtc cttacaatag ccccatctcc aggttgaggc 900
tagatggagg ggacagaggg aagtgacttg cccaaggtga cccaagctcc cgagtgccag 960
ggcaggatct gaattcaggc tctcagactg cagagcctga gtccctccct gccatgcctg 1020
tgccagggtg gaaatgtctg gtcctggagg ggagcgtgga ctcctggcct tggctctgga 1080
gacatccccc tagaccacgt gggctcctaa cctgtccatg gtcactgtgc tgaggggcgg 1140
gacggtgggt cacccctagt tcttttttcc ccagggccag attcatggac tgaagggttg 1200
ctcggctctc agagaccccc taagcgcccc gccctggccc caagccctcc cccagctccc 1260
gcgtcccccc cctcctggcg ctgactccgg gccagaagag gaaaggctgt ctccacccac 1320
ctctcgcact ctcccttctc ctttataaag gccggaacag ctgaaagggt ggcaacttct 1380
cctcctgcag ccgggagcgg cctgcctgcc tccctgcgca cccgcagcct cccccgctgc 1440
ctccctaggg ctcccctccg gccgccagcg cccatttttc attccctaga tagagatact 1500
ttgcgcgcac 1510
<210> 3
<211> 305
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV enhancer
<400> 3
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 60
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 120
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 180
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 240
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 300
ccatg 305
<210> 4
<211> 2085
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human APPsw sequence
<400> 4
atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gctggaggta 60
cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga ttgccatgtt ctgtggcaga 120
ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt cagatccatc agggaccaaa 180
acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc aagaagtcta ccctgaactg 240
cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca tccagaactg gtgcaagcgg 300
ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc cctaccgctg cttagttggt 360
gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca aattcttaca ccaggagagg 420
atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg ccaaagagac atgcagtgag 480
aagagtacca acttgcatga ctacggcatg ttgctgccct gcggaattga caagttccga 540
ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg acaatgtgga ttctgctgat 600
gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag acacagacta tgcagatggg 660
agtgaagaca aagtagtaga agtagcagag gaggaagaag tggctgaggt ggaagaagaa 720
gaagccgatg atgacgagga cgatgaggat ggtgatgagg tagaggaaga ggctgaggaa 780
ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca ccaccaccac caccaccaca 840
gagtctgtgg aagaggtggt tcgagttcct acaacagcag ccagtacccc tgatgccgtt 900
gacaagtatc tcgagacacc tggggatgag aatgaacatg cccatttcca gaaagccaaa 960
gagaggcttg aggccaagca ccgagagaga atgtcccagg tcatgagaga atgggaagag 1020
gcagaacgtc aagcaaagaa cttgcctaaa gctgataaga aggcagttat ccagcatttc 1080
caggagaaag tggaatcttt ggaacaggaa gcagccaacg agagacagca gctggtggag 1140
acacacatgg ccagagtgga agccatgctc aatgaccgcc gccgcctggc cctggagaac 1200
tacatcaccg ctctgcaggc tgttcctcct cggcctcgtc acgtgttcaa tatgctaaag 1260
aagtatgtcc gcgcagaaca gaaggacaga cagcacaccc taaagcattt cgagcatgtg 1320
cgcatggtgg atcccaagaa agccgctcag atccggtccc aggttatgac acacctccgt 1380
gtgatttatg agcgcatgaa tcagtctctc tccctgctct acaacgtgcc tgcagtggcc 1440
gaggagattc aggatgaagt tgatgagctg cttcagaaag agcaaaacta ttcagatgac 1500
gtcttggcca acatgattag tgaaccaagg atcagttacg gaaacgatgc tctcatgcca 1560
tctttgaccg aaacgaaaac caccgtggag ctccttcccg tgaatggaga gttcagcctg 1620
gacgatctcc agccgtggca ttcttttggg gctgactctg tgccagccaa cacagaaaac 1680
gaagttgagc ctgttgatgc ccgccctgct gccgaccgag gactgaccac tcgaccaggt 1740
tctgggttga caaatatcaa gacggaggag atctctgaag tgaatctgga tgcagaattc 1800
cgacatgact caggatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg 1860
ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg 1920
gtcatcatca ccttggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggtgtg 1980
gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaatct gcagcagaac 2040
ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaac 2085
<210> 5
<211> 1149
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human Tau sequence
<400> 5
atggctgagc cccgccagga gttcgaagtg atggaagatc acgctgggac gtacgggttg 60
ggggacagga aagatcaggg gggctacacc atgcaccaag accaagaggg tgacacggac 120
gctggcctga aagctgaaga agcaggcatt ggagacaccc ccagcctgga agacgaagct 180
gctggtcacg tgacccaagc tcgcatggtc agtaaaagca aagacgggac tggaagcgat 240
gacaaaaaag ccaagggggc tgatggtaaa acgaagatcg ccacaccgcg gggagcagcc 300
cctccaggcc agaagggcca ggccaacgcc accaggattc cagcaaaaac cccgcccgct 360
ccaaagacac cacccagctc tggtgaacct ccaaaatcag gggatcgcag cggctacagc 420
agccccggct ccccaggcac tcccggcagc cgctcccgca ccccgtccct tccaacccca 480
cccacccggg agcccaagaa ggtggcagtg gtccgtactc cacccaagtc gccgtcttcc 540
gccaagagcc gcctgcagac agcccccgtg cccatgccag acctgaagaa tgtcaagtcc 600
aagatcggct ccactgagaa cctgaagcac cagccgggag gcgggaaggt gcagataatt 660
aataagaagc tggatcttag caacgtccag tccaagtgtg gctcaaagga taatatcaaa 720
cacgtcctgg gaggcggcag tgtgcaaata gtctacaaac cagttgacct gagcaaggtg 780
acctccaagt gtggctcatt aggcaacatc catcataaac caggaggtgg ccaggtggaa 840
gtaaaatctg agaagcttga cttcaaggac agagtccagt cgaagattgg gtccctggac 900
aatatcaccc acgtccctgg cggaggaaat aaaaagattg aaacccacaa gctgaccttc 960
cgcgagaacg ccaaagccaa gacagaccac ggggcggaga tcgtgtacaa gtcgccagtg 1020
gtgtctgggg acacgtctcc acggcatctc agcaatgtct cctccaccgg cagcatcgac 1080
atggtagact cgccccagct cgccacgcta gctgacgagg tgtctgcctc cctggccaag 1140
cagggtttg 1149
<210> 6
<211> 1404
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human PS1 sequence
<400> 6
atgacagagt tacctgcacc gttgtcctac ttccagaatg cacagatgtc tgaggacaac 60
cacctgagca atactgtacg tagccagaat gacaatagag aacggcagga gcacaacgac 120
agacggagcc ttggccaccc tgagccatta tctaatggac gaccccaggg taactcccgg 180
caggtggtgg agcaagatga ggaagaagat gaggagctga cattgaaata tggcgccaag 240
catgtgatca tgctctttgt ccctgtgact ctctgcatgg tggtggtcgt ggctaccatt 300
aagtcagtca gcttttatac ccggaaggat gggcagctaa tctatacccc attcacagaa 360
gataccgaga ctgtgggcca gagagccctg cactcaattc tgaatgctgc catcatgatc 420
agtgtcattg ttgtcctgac tatcctcctg gtggttctgt ataaatacag gtgctataag 480
gtcatccatg cctggcttat tatatcatct ctattgttgc tgttcttttt ttcattcatt 540
tacttggggg aagtgtttaa aacctataac gttgctgtgg actacattac tgttgcactc 600
ctgatctgga attttggtgt ggtgggaatg atttccattc actggaaagg tccacttcga 660
ctccagcagg catatctcat tatgattagt gccctcatgg ccctggtgtt tatcaagtac 720
ctccctgaat ggactgcgtg gctcatcttg gctgtgattt cagtatatga tttagtggct 780
gttttgtgtc cgaaaggtcc acttcgtatg ctggttgaaa cagctcagga gagaaatgaa 840
acgctttttc cagctgtcat ttactcctca acaatggtgt ggttggtgaa tatggcagaa 900
ggagacccgg aagctcaaag gagagtatcc aaaaattcca agtataatgc agaaagcaca 960
gaaagggagt cacaagacac tgttgcagag aatgatgatg gcgggttcag tgaggaatgg 1020
gaagcccaga gggacagtca tctagggcct catcgctcta cacctgagtc acgagctgct 1080
gtccaggaac tttccagcag tatcctcgct ggtgaagacc cagaggaaag gggagtaaaa 1140
cttggattgg gagatttcat tttctacagt gttctggttg gtaaagcctc agcaacagcc 1200
agtggagact ggaacacaac catagcctgt ttcgtagcca tattaattgg tttgtgcctt 1260
acattattac tccttgccat tttcaagaaa gcattgccag ctcttccaat ctccatcacc 1320
tttgggcttg ttttctactt tgccacagat tatcttgtac agccttttat ggaccaatta 1380
gcattccatc aattttatat ctag 1404
<210> 7
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 poly A sequence
<400> 7
agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt 60
tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt 120
aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt 180
taattc 186
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2A sequence
<400> 8
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 9
<211> 14618
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> final construct pTet-CMVE-hPDGFb-APPsw-2A-Tau-2A-PS1
<400> 9
tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60
ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120
tgaataccaa acaggatatc tgtggtaagc ggttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 180
gatgagacag ctgagtgatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 240
ctcggggcca agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagtgaa 300
tcatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtacc ttatttgaac 360
taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc cgctctccga gctcaataaa 420
agagcccaca acccctcact cggcgcgcca gtcttccgat agactgcgtc gcccgggtac 480
ccgtattccc aataaagcct cttgctgttt gcatccgaat cgtggtctcg ctgttccttg 540
ggagggtctc ctctgagtga ttgactaccc acgacggggg tctttcattt gggggctcgt 600
ccgggatttg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg taagctggcc 660
agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg tttgatgtta tgcgcctgcg 720
tctgtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa ctgacgagtt 780
ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc gtttttgtgg 840
cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg tggttctggt 900
aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt cggtttggaa 960
ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagcg ctgcagcatc gttctgtgtt gtctctgtct 1020
gactgtgttt ctgtatttgt ctgaaaatta gggccagact gttaccactc ccttaagttt 1080
gaccttaggt cactggaaag atgtcgagcg gatcgctcac aaccagtcgg tagatgtcaa 1140
gaagagacgt tgggttacct tctgctctgc agaatggcca acctttaacg tcggatggcc 1200
gcgagacggc acctttaacc gagacctcat cacccaggtt aagatcaagg tcttttcacc 1260
tggcccgcat ggacacccag accaggtccc ctacatcgtg acctgggaag ccttggcttt 1320
tgacccccct ccctgggtca agccctttgt acaccctaag cctccgcctc ctcttcctcc 1380
atccgccccg tctctccccc ttgaacctcc tcgttcgacc ccgcctcgat cctcccttta 1440
tccagccctc actccttctc taggcgccgg aattccgatc tgatagcttg ccacaacccg 1500
taccaaagat ggatagatcc ggaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc 1560
tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc 1620
gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg 1680
atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc 1740
cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg 1800
cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg 1860
tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc 1920
cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg 1980
ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg 2040
cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg 2100
tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca 2160
ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct 2220
ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg 2280
agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct 2340
atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg 2400
caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg 2460
ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca 2520
ctcgtccgag ggcaaaggaa tagagtagat gccgaccgaa caagagctga tttcgagaac 2580
gcctcagcca gcaactcgcg cgagcctagc aaggcaaatg cgagagaacg gccttacgct 2640
tggtggcaca gttctcgtcc acagttcgct aagctcgctc ggctgggtcg cgggagggcc 2700
ggtcgcagtg attcaggccc ttctggattg tgttggtccc cagggcacga ttgtcatgcc 2760
cacgcactcg ggtgatctga ctgatcccgc agattggaga tcgccgcccg tgcctgccga 2820
ttgggtgcag atctatttaa atgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 2880
ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 2940
atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 3000
gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 3060
cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 3120
tacgtattag tcatcgctat taccatgatt taaatgctgg gactacagga gcttgttacc 3180
acacccagct ccagtttata aattcatctc cagtttataa aggaggaaac cgaggtactg 3240
agaggttaaa aaaccttcct gcagacactt gtccagcaag tggccactcc aggatttgga 3300
ccaaggtgat gtgtcttcag gctgtgtctc tgccactgtg ccacgctgct gggtggtagg 3360
cagcagtggg tgggtgcctg cagtggtctg taaagaccac ctgagatgtc cttcctcctc 3420
tgttccaccc tgtccaggtc caagaagaca gtctatgaag agagagcagg tgtgactctc 3480
tcagtgtgct cctctgtgag aagcaggctg acatcccaaa gggaagggcg gataacagag 3540
acagtgcaag cggaggagat gagggtgcct caaagccggg aggctgggtg atgcaggagc 3600
ctgcgtgtcc cgaggggggt gctgggccca gtgtgagtac gtgtgactgt gactgagaca 3660
gtgtgactgc tgaaggcagg gacacagcag ctccctgact gggggcagaa ggcgttaact 3720
gtgtgaaggc tggttgtggg tgggtgggct ctgggcctcg aacccggggg ctgagggaga 3780
tagtaaacag cagggtgact gacgggaaga tcatgttggt agccctgcga agatgctgca 3840
gggctgtggg ggtttgtgtg actttgcagt tcaacaaatt caaattcagc caacgctggc 3900
agggcctgtt gtgccaggca accagctagg aggaggagac tcggacccag cttgcagctg 3960
aagggcgctg gctgccgggt tctgtgggtt caccttgcgg tgtcttccct tgctaacact 4020
gagtccttac aatagcccca tctccaggtt gaggctagat ggaggggaca gagggaagtg 4080
acttgcccaa ggtgacccaa gctcccgagt gccagggcag gatctgaatt caggctctca 4140
gactgcagag cctgagtccc tccctgccat gcctgtgcca gggtggaaat gtctggtcct 4200
ggaggggagc gtggactcct ggccttggct ctggagacat ccccctagac cacgtgggct 4260
cctaacctgt ccatggtcac tgtgctgagg ggcgggacgg tgggtcaccc ctagttcttt 4320
tttccccagg gccagattca tggactgaag ggttgctcgg ctctcagaga ccccctaagc 4380
gccccgccct ggccccaagc cctcccccag ctcccgcgtc ccccccctcc tggcgctgac 4440
tccgggccag aagaggaaag gctgtctcca cccacctctc gcactctccc ttctccttta 4500
taaaggccgg aacagctgaa agggtggcaa cttctcctcc tgcagccggg agcggcctgc 4560
ctgcctccct gcgcacccgc agcctccccc gctgcctccc tagggctccc ctccggccgc 4620
cagcgcccat ttttcattcc ctagatagag atactttgcg cgcacatcga tatgctgccc 4680
ggtttggcac tgctcctgct ggccgcctgg acggctcggg cgctggaggt acccactgat 4740
ggtaatgctg gcctgctggc tgaaccccag attgccatgt tctgtggcag actgaacatg 4800
cacatgaatg tccagaatgg gaagtgggat tcagatccat cagggaccaa aacctgcatt 4860
gataccaagg aaggcatcct gcagtattgc caagaagtct accctgaact gcagatcacc 4920
aatgtggtag aagccaacca accagtgacc atccagaact ggtgcaagcg gggccgcaag 4980
cagtgcaaga cccatcccca ctttgtgatt ccctaccgct gcttagttgg tgagtttgta 5040
agtgatgccc ttctcgttcc tgacaagtgc aaattcttac accaggagag gatggatgtt 5100
tgcgaaactc atcttcactg gcacaccgtc gccaaagaga catgcagtga gaagagtacc 5160
aacttgcatg actacggcat gttgctgccc tgcggaattg acaagttccg aggggtagag 5220
tttgtgtgtt gcccactggc tgaagaaagt gacaatgtgg attctgctga tgcggaggag 5280
gatgactcgg atgtctggtg gggcggagca gacacagact atgcagatgg gagtgaagac 5340
aaagtagtag aagtagcaga ggaggaagaa gtggctgagg tggaagaaga agaagccgat 5400
gatgacgagg acgatgagga tggtgatgag gtagaggaag aggctgagga accctacgaa 5460
gaagccacag agagaaccac cagcattgcc accaccacca ccaccaccac agagtctgtg 5520
gaagaggtgg ttcgagttcc tacaacagca gccagtaccc ctgatgccgt tgacaagtat 5580
ctcgagacac ctggggatga gaatgaacat gcccatttcc agaaagccaa agagaggctt 5640
gaggccaagc accgagagag aatgtcccag gtcatgagag aatgggaaga ggcagaacgt 5700
caagcaaaga acttgcctaa agctgataag aaggcagtta tccagcattt ccaggagaaa 5760
gtggaatctt tggaacagga agcagccaac gagagacagc agctggtgga gacacacatg 5820
gccagagtgg aagccatgct caatgaccgc cgccgcctgg ccctggagaa ctacatcacc 5880
gctctgcagg ctgttcctcc tcggcctcgt cacgtgttca atatgctaaa gaagtatgtc 5940
cgcgcagaac agaaggacag acagcacacc ctaaagcatt tcgagcatgt gcgcatggtg 6000
gatcccaaga aagccgctca gatccggtcc caggttatga cacacctccg tgtgatttat 6060
gagcgcatga atcagtctct ctccctgctc tacaacgtgc ctgcagtggc cgaggagatt 6120
caggatgaag ttgatgagct gcttcagaaa gagcaaaact attcagatga cgtcttggcc 6180
aacatgatta gtgaaccaag gatcagttac ggaaacgatg ctctcatgcc atctttgacc 6240
gaaacgaaaa ccaccgtgga gctccttccc gtgaatggag agttcagcct ggacgatctc 6300
cagccgtggc attcttttgg ggctgactct gtgccagcca acacagaaaa cgaagttgag 6360
cctgttgatg cccgccctgc tgccgaccga ggactgacca ctcgaccagg ttctgggttg 6420
acaaatatca agacggagga gatctctgaa gtgaatctgg atgcagaatt ccgacatgac 6480
tcaggatatg aagttcatca tcaaaaattg gtgttctttg cagaagatgt gggttcaaac 6540
aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tagcgacagt ggtcatcatc 6600
accttggtga tgctgaagaa gaaacagtac acatccattc atcatggtgt ggtggaggtt 6660
gacgccgctg tcaccccaga ggagcgccac ctgtccaatc tgcagcagaa cggctacgaa 6720
aatccaacct acaagttctt tgagcagatg cagaacttaa ttaaggcatg cggaagcgga 6780
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctaga 6840
tctatggctg agccccgcca ggagttcgaa gtgatggaag atcacgctgg gacgtacggg 6900
ttgggggaca ggaaagatca ggggggctac accatgcacc aagaccaaga gggtgacacg 6960
gacgctggcc tgaaagctga agaagcaggc attggagaca cccccagcct ggaagacgaa 7020
gctgctggtc acgtgaccca agctcgcatg gtcagtaaaa gcaaagacgg gactggaagc 7080
gatgacaaaa aagccaaggg ggctgatggt aaaacgaaga tcgccacacc gcggggagca 7140
gcccctccag gccagaaggg ccaggccaac gccaccagga ttccagcaaa aaccccgccc 7200
gctccaaaga caccacccag ctctggtgaa cctccaaaat caggggatcg cagcggctac 7260
agcagccccg gctccccagg cactcccggc agccgctccc gcaccccgtc ccttccaacc 7320
ccacccaccc gggagcccaa gaaggtggca gtggtccgta ctccacccaa gtcgccgtct 7380
tccgccaaga gccgcctgca gacagccccc gtgcccatgc cagacctgaa gaatgtcaag 7440
tccaagatcg gctccactga gaacctgaag caccagccgg gaggcgggaa ggtgcagata 7500
attaataaga agctggatct tagcaacgtc cagtccaagt gtggctcaaa ggataatatc 7560
aaacacgtcc tgggaggcgg cagtgtgcaa atagtctaca aaccagttga cctgagcaag 7620
gtgacctcca agtgtggctc attaggcaac atccatcata aaccaggagg tggccaggtg 7680
gaagtaaaat ctgagaagct tgacttcaag gacagagtcc agtcgaagat tgggtccctg 7740
gacaatatca cccacgtccc tggcggagga aataaaaaga ttgaaaccca caagctgacc 7800
ttccgcgaga acgccaaagc caagacagac cacggggcgg agatcgtgta caagtcgcca 7860
gtggtgtctg gggacacgtc tccacggcat ctcagcaatg tctcctccac cggcagcatc 7920
gacatggtag actcgcccca gctcgccacg ctagctgacg aggtgtctgc ctccctggcc 7980
aagcagggtt tggaattcgg aagcggagct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga 8040
gacgtggagg agaaccctgg acctctcgag atgacagagt tacctgcacc gttgtcctac 8100
ttccagaatg cacagatgtc tgaggacaac cacctgagca atactgtacg tagccagaat 8160
gacaatagag aacggcagga gcacaacgac agacggagcc ttggccaccc tgagccatta 8220
tctaatggac gaccccaggg taactcccgg caggtggtgg agcaagatga ggaagaagat 8280
gaggagctga cattgaaata tggcgccaag catgtgatca tgctctttgt ccctgtgact 8340
ctctgcatgg tggtggtcgt ggctaccatt aagtcagtca gcttttatac ccggaaggat 8400
gggcagctaa tctatacccc attcacagaa gataccgaga ctgtgggcca gagagccctg 8460
cactcaattc tgaatgctgc catcatgatc agtgtcattg ttgtcctgac tatcctcctg 8520
gtggttctgt ataaatacag gtgctataag gtcatccatg cctggcttat tatatcatct 8580
ctattgttgc tgttcttttt ttcattcatt tacttggggg aagtgtttaa aacctataac 8640
gttgctgtgg actacattac tgttgcactc ctgatctgga attttggtgt ggtgggaatg 8700
atttccattc actggaaagg tccacttcga ctccagcagg catatctcat tatgattagt 8760
gccctcatgg ccctggtgtt tatcaagtac ctccctgaat ggactgcgtg gctcatcttg 8820
gctgtgattt cagtatatga tttagtggct gttttgtgtc cgaaaggtcc acttcgtatg 8880
ctggttgaaa cagctcagga gagaaatgaa acgctttttc cagctgtcat ttactcctca 8940
acaatggtgt ggttggtgaa tatggcagaa ggagacccgg aagctcaaag gagagtatcc 9000
aaaaattcca agtataatgc agaaagcaca gaaagggagt cacaagacac tgttgcagag 9060
aatgatgatg gcgggttcag tgaggaatgg gaagcccaga gggacagtca tctagggcct 9120
catcgctcta cacctgagtc acgagctgct gtccaggaac tttccagcag tatcctcgct 9180
ggtgaagacc cagaggaaag gggagtaaaa cttggattgg gagatttcat tttctacagt 9240
gttctggttg gtaaagcctc agcaacagcc agtggagact ggaacacaac catagcctgt 9300
ttcgtagcca tattaattgg tttgtgcctt acattattac tccttgccat tttcaagaaa 9360
gcattgccag ctcttccaat ctccatcacc tttgggcttg ttttctactt tgccacagat 9420
tatcttgtac agccttttat ggaccaatta gcattccatc aattttatat ctagcctgca 9480
ggtctagata gctagcctcc ctatagtgag tcgtattacg tagatccaga catgataaga 9540
tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt 9600
gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac 9660
aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa 9720
ttcgcggccg cctcgagaga tcccctcagg atatagtagt ttcgcttttg catagggagg 9780
gggaaatgta gtcttatgca atactcttgt agtcttgcaa catggtaacg atgagttagc 9840
aacatgcctt acaaggagag aaaaagcacc gtgcatgccg attggtggaa gtaaggtggt 9900
acgatcgtgc cttattagga aggcaacaga cgggtctgac atggattgga cgaaccactg 9960
aattccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacagca aacgccattt 10020
gaccattcac cacattggtg tgcacctcca agcttgttaa ttcaccatgt ctagactgga 10080
caagagcaaa gtcataaacg gcgctctgga attactcaat ggagtcggta tcgaaggcct 10140
gacgacaagg aaactcgctc aaaagctggg agttgagcag cctaccctgt actggcacgt 10200
gaagaacaag cgggccctgc tcgatgccct gccaatcgag atgctggaca ggcatcatac 10260
ccacttctgc cccctggaag gcgagtcatg gcaagacttt ctgcggaaca acgccaagtc 10320
attccgctgt gctctcctct cacatcgcga cggggctaaa gtgcatctcg gcacccgccc 10380
aacagagaaa cagtacgaaa ccctggaaaa tcagctcgcg ttcctgtgtc agcaaggctt 10440
ctccctggag aacgcactgt acgctctgtc cgccgtgggc cactttacac tgggctgcgt 10500
attggaggaa caggagcatc aagtagcaaa agaggaaaga gagacaccta ccaccgattc 10560
tatgccccca cttctgagac aagcaattga gctgttcgac cggcagggag ccgaacctgc 10620
cttccttttc ggcctggaac taatcatatg tggcctggag aaacagctaa agtgcgaaag 10680
cggcgggccg gccgacgccc ttgacgattt tgacttagac atgctcccag ccgatgccct 10740
tgacgacttt gaccttgata tgctgcctgc tgacgctctt gacgattttg accttgacat 10800
gctccccggg taactaagta aggatcaaca tcgaattcga tttctgttcc tgttaatcaa 10860
cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt 10920
acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct 10980
ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc 11040
gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg 11100
ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc 11160
acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 11220
actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccatggct gctcgcctgt 11280
gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca 11340
gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt 11400
cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcctgtttc gcctcgggct 11460
caatcactag tgaattcgat aaaataaaag attttattta gtctccagaa aaagggggga 11520
atgaaagacc ccacctgtag gtttggcaag ctagcttaag taacgccatt ttgcaaggca 11580
tggaaaaata cataactgag aatagagaag ttcagatcaa ggtcaggaac agatggaaca 11640
gctgaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca 11700
agaacagatg gaacagctga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc 11760
cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt ccagccctca gcagtttcta 11820
gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt 11880
gaactaacca atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa 11940
taaaagagcc cacaacccct cactcggggc gccagtcctc cgattgactg agtcgcccgg 12000
gtacccgtgt atccaataaa ccctcttgca gttgcatccg acttgtggtc tcgctgttcc 12060
ttgggagggt ctcctctgag tgattgacta cccgtcagcg ggggtctttc atttgggggc 12120
tcgtccggga tcgggagacc cctgcccagg gaccaccgac ccaccaccgg gaggtaagct 12180
ggctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 12240
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 12300
gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 12360
tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 12420
gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 12480
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 12540
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 12600
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 12660
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 12720
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 12780
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 12840
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 12900
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 12960
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 13020
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 13080
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 13140
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 13200
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 13260
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 13320
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 13380
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 13440
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 13500
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 13560
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 13620
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 13680
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt 13740
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 13800
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 13860
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 13920
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 13980
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg 14040
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 14100
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 14160
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 14220
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 14280
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 14340
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 14400
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 14460
cctttcgtct tcaagaattc ataccagatc accgaaaact gtcctccaaa tgtgtccccc 14520
tcacactccc aaattcgcgg gcttctgcct cttagaccac tctaccctat tccccacact 14580
caccggagcc aaagccgcgg cccttccgtt tctttgct 14618
Claims (20)
- a) 아밀로이드 전구단백질(APP)을 암호화하는 APP 돌연변이 유전자, b) 타우단백질(Tau)을 암호화하는 타우 돌연변이 유전자, c) 프리세닐린 1(PS1)을 암호화하는 PS1 돌연변이 유전자 및
d) 상기 세 돌연변이 유전자를 한번에 조절할 수 있는 신경세포 특이적 프로모터를 포함하도록 제작되고,
상기 세 돌연변이 유전자는 일렬(tandem)로 연결되는, 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트.
- 제1항에 있어서,
상기 프로모터는, 인간 PDGF-β 융합 프로모터인 것인, 발현 카세트.
- 제1항에 있어서,
상기 프로모터는, 서열번호 2의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
CMV 인핸서를 더 포함하는, 발현 카세트.
- 제4항에 있어서,
상기 CMV 인핸서는, 서열번호 3의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트.
- 제1항에 있어서,
상기 APP 돌연변이 유전자는, 595번 아미노산, 596번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것인, 발현 카세트.
- 제1항에 있어서,
상기 APP 돌연변이 유전자는, 서열번호 4의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트.
- 제1항에 있어서,
상기 타우 돌연변이 유전자는, 243번 아미노산이 돌연변이된 것인, 발현 카세트.
- 제1항에 있어서,
상기 타우 돌연변이 유전자는, 서열번호 5의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트
- 제1항에 있어서,
상기 PS1 돌연변이 유전자는, 146번 아미노산, 286번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것인, 발현 카세트.
- 제1항에 있어서,
상기 PS1 돌연변이 유전자는, 서열번호 6의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트.
- 제1항에 있어서,
상기 APP 돌연변이 유전자, 상기 타우 돌연변이 유전자 및 상기 PS1 돌연변이 유전자 각각의 사이에 2A 서열을 더 포함하는 것인, 발현 카세트.
- 제12항에 있어서,
상기 2A 서열은, 서열번호 8의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트.
- 제1항의 발현 카세트를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
- 제14항에 있어서,
상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 9의 서열을 갖는 것인, 재조합 발현 벡터.
- 제14항의 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 세포주.
- 제14항의 재조합 발현 벡터 또는 제16항의 형질전환된 세포주를 이용하여, 형질전환된, 인간을 제외한 동물.
- 제17항에 있어서,
상기 동물은, 포유류인 것인, 형질전환된, 인간을 제외한 동물.
- 제17항에 있어서,
상기 동물은, 돼지인 것인, 형질전환된, 인간을 제외한 동물.
- 제한효소부위를 포함하고 프로모터 및 유전자 클러스터가 제거된 제1 벡터를 구축하는 단계;
제2 벡터 내에 프로모터, APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자를 각각 삽입하여 재조합 제2 벡터를 제조하는 단계;
상기 재조합 제2 벡터 상의 APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자 각각에 돌연변이를 유도하는 단계; 및
상기 제1 벡터 내에 상기 재조합 제2 벡터를 삽입하는 단계:를 포함하는, 재조합 발현 벡터 제조방법.
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