KR101784331B1 - 6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene for increasing the expression of Aquaporin-3 and uses thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물 및 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 화합물은 아쿠아포린-3(AQP3) 및 CLOCK의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시킴으로써 피부 보습에 효과적이고, 아토피 피부염의 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a cosmetic composition for skin moisturizing comprising a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis, wherein the compound is aquaporin- (AQP3) and CLOCK mRNA or protein, thereby being effective for moisturizing the skin and useful for the treatment or improvement of atopic dermatitis.

Description

아쿠아포린-3의 발현을 증가시키는 6,7-디메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘 및 이의 용도{6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene for increasing the expression of Aquaporin-3 and uses thereof}6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene and its use {6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H- chromene for increasing expression of aquaporin- Aquaporin-3 and uses thereof}

본 발명은 아쿠아포린-3의 발현을 증가시키는 6,7-디메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘 및 이의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to 6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl- 2H -chromenes and their use for increasing the expression of aquaporin-3.

사람의 피부는 표피층(epidermis)과 진피층(dermis) 및 피하지방 조직의 3개 층으로 크게 구분되며, 유해미생물, 물리적 손상, 자외선 등과 같은 외부환경에 의한 물리적 자극 또는 화학적 자극으로부터 인체를 보호하는 일차적인 보호장벽의 역할을 수행한다. 또한, 피부는 인체에 필요한 각종 생리 활성 물질을 운반하는 역할을 할 뿐만 아니라, 인체의 약 65% 내지 70%에 해당하는 수분이 체외로 증발되는 것을 조절한다.Human skin is largely divided into three layers: epidermis, dermis and subcutaneous fat tissue. It is a primary skin that protects the body from physical stimulation or chemical stimulation by external environment such as harmful microorganisms, physical damage, It acts as a protective barrier. In addition, the skin not only serves to transport various physiologically active substances required for the human body but also controls the evaporation of moisture, which corresponds to about 65% to 70% of the human body, to the outside of the body.

표피층은 외부로부터 각질층(stratum corneum), 과립층, 유극층 및 기저층의 순서로 구분된다. 피부각질층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고, 각질세포 사이의 세포간 지질들은 세라마이드, 콜레스테롤 또는 지방산 등과 같은 지질혼합체로 세포 간 박판(Intercellular lamellae) 구조를 이루어 피부 장벽을 구성한다. 표피층을 구성하는 세포로는 각질형성세포(keratinocyte), 랑겔한스 세포, 머켈 세포 등의 다양한 세포들이 있으며, 이 중에서 대부분을 차지하는 세포가 각질형성세포(keratinocyte)이다. 각질형성세포는 기저층에서 세포 증식활동을 하고 과립층을 지나면서 케라틴을 비롯한 세포 구성성분들을 합성을 하게 되며 최종적으로 피부 각질층에 도달한다. 각질층에 도착한 세포들은 각질(keratin)이 되어 납작하게 죽은 세포들로서 하루에 수백만 개의 죽은 각질세포가 피부에서 떨어져 나가고 새 각질 세포로 교체된다. 상기 납작하게 된 각질 세포는 마치 벽돌을 쌓아 놓은 듯 층층이 단단하게 연결되어 있어 각질층을 강하게 만드는 동시에, 자유로운 움직임으로 설명되는 유연성을 획득하고 방어벽으로서 기능을 나타내는 것이다. 각질층은 약 10% 내지 20%의 수분을 함유하고 인체의 가장 바깥에 존재함으로써, 체외로의 수분 증발을 억제하여 피부 내 수분량을 적절하게 유지시키는 한편, 외부로부터의 물질의 과잉 침투를 차단하여 피부의 방어기능을 수행한다. The epidermal layer is divided into stratum corneum, granular layer, polar layer and base layer in order from the outside. Cells in the stratum corneum act like bricks, and the intercellular lipids between keratinocytes are lipid mixtures such as ceramides, cholesterol, or fatty acids, forming an intercellular lamellae structure to form a skin barrier. Cells constituting the epidermal layer include various cells such as keratinocyte, Rangelchs cell, and Merkel cell, and keratinocyte is the majority of the cells. The keratinocytes undergo cell proliferation in the basal layer and pass through the granules to synthesize keratin and other cellular constituents, ultimately reaching the horny layer of the skin. Cells that arrive at the stratum corneum are keratinized, flat-dead cells, where millions of dead keratinocytes are removed from the skin and replaced with new keratinocytes. The flattened keratinocytes are firmly connected to each other as if the bricks are piled up, so as to strengthen the stratum corneum, to acquire flexibility explained by free movement, and to function as a barrier. The stratum corneum contains moisture of about 10% to 20% and is located at the outermost part of the human body, thereby suppressing moisture evaporation to the outside of the body, appropriately maintaining the moisture content in the skin, And performs the defensive function of FIG.

상기 피부장벽 기능을 좌우하는 각질층의 방어기능을 약화시키는 요인은 내적 요인과 외적인 요인으로 구분될 수 있다. 내적 요인으로는 질병, 유전적인 결함 또는 노화 등이 있으며, 외적 요인으로는 비누나 세제의 잦은 사용, 자외선, 악조건의 온습도 환경에서의 장기 노출 또는 좋지 않은 식습관 등이 있다. 그러나, 피부가 건조해지면 피부 장벽 구조가 손상되면서 각질층의 수분함유 능력이 감소하게 된다. 이때 피부 장벽 기능을 정상적으로 유지하려는 항상성반응이 연쇄적으로 일어나서 표피 세포들의 증식과 각질층이 증가되어 피부 표면이 거칠어지고 각질이 많이 생기게 된다. 따라서, 피부 건강을 유지하기 위해서는 피부 건조함을 방지하는 것이 중요하고, 이를 위해서는 적절한 피부 보습제를 사용하는 것이 필요하다.Factors that weaken the protective function of the stratum corneum that dominate the skin barrier function can be classified into internal factors and external factors. Internal factors include illness, genetic defects or aging. Exogenous factors include frequent use of soap and detergents, long-term exposure to ultraviolet light, bad weather conditions, or poor eating habits. However, when the skin becomes dry, the skin barrier structure is damaged and the ability of the stratum corneum to contain moisture decreases. At this time, the homeostatic reaction that normally maintains the skin barrier function is consecutively generated, and the proliferation of the epidermal cells and the stratum corneum are increased, so that the surface of the skin becomes rough and many dead skin cells are formed. Therefore, in order to maintain skin health, it is important to prevent skin dryness, and it is necessary to use an appropriate skin moisturizing agent.

현재 화장품 류에서 가장 널리 사용되는 보습제(moisturizer)는 피부에 수분을 공급하고 증발을 막아주거나 공기 중의 수분을 피부로 끌어당겨주는 역할을 한다. 화장품에서 많이 사용하는 보습제로는 글리세린(glycerin/글리세롤(glycerol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 디프로필렌글리콜(dipropylene glycol), 1,3-부틸렌글리콜(1,3-butylene glycol), 솔비톨(sorbitol), 젖산나트륨(sodium lactate), 2-피톨리돈-5-카르본산나트륨(sodium 2-pyrrolidone-5-carboxylate), 히아루론산나트륨(Sodium hyaluronate: N-아세트글루코사민과 글루크론산이 서로 결합한 산성 뮤코다당의 일종) 등이 있으며, 표피층 하부의 결합조직 내에서 수분을 유지시켜주며, 조직내에 젤상의 메트릭스를 형성하여 피부의 윤활성과 유연성을 갖게 하고, 외부의 압력 및 세균감염을 방지하는 기능을 한다.Currently, the most widely used moisturizers in cosmetics are to supply moisture to the skin, prevent evaporation, and attract moisture from the air into the skin. The most commonly used moisturizers in cosmetics are glycerin, glycerol, propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, sorbitol sorbitol, sodium lactate, sodium 2-pyrrolidone-5-carboxylate, sodium hyaluronate (acid hyaluronate: an acidic mucoadhesive of N-acetylglucosamine and glucuronic acid) Etc.), and it maintains moisture in the connective tissue of the lower part of the epidermal layer, and forms a gel-like matrix within the tissue to have skin lubrication and flexibility, and to prevent external pressure and bacterial infection.

아쿠아포린(Aquaporin)은 세포막에서 물 분자를 능동적으로 세포내로 이동시키는 수송단백질(transporter)로서 세포막에 존재한다(J Biol Chem 1999;274:21631-21636, Curr. Opin. Struct. Biol. 2005;15:176-183). 아쿠아포린 단백질은 포유류에서 현재까지 13종류가 알려져 있으며, 이중에서 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질은 물 분자와 글리세롤(glycerol)을 선택적으로 통과시키는 아쿠아글리세로포린(aquaglyceroporin) 단백질 일종으로서, 피부의 보습(hydration)과 상처 치료에 중요하게 작용한다고 알려져 있다(J Invest Dermatol 2002;118:678-685, J. Mol. Med. 2008;96:523-529). Aquaporin is present in the cell membrane as a transporter that actively transports water molecules in the cell membrane into cells (J Biol Chem 1999; 274: 21631-21636, Curr. Opin. Struct. Biol. 2005; 15 : 176-183). AQP3 protein is a kind of aquaglyceroporin protein which selectively passes water molecule and glycerol. It is a kind of aquaprylin protein which is a kind of aquaglyceroporin protein. (J Invest Dermatol 2002; 118: 678-685, J. Mol. Med. 2008; 96: 523-529).

체내에 존재하는 글리세롤은 지방족 3가 알코올 일종으로서 지방산과 결합하여 중성 지방산(fatty acid)을 만드는 분자이다. 글리세롤에는 하이드록시기(-OH)가 3개 존재하여 (분자식: C₃H₅(OH)₃; CH₂OH-CHOH-CH₂OH) 물과 친한 성질을 가지고 있어 흡습성이 강하며 생체에서 천연 보습제 효과를 나타낸다 (J. Biol. Chem. 2002;277:46616-46621). 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자가 결핍되어 있는 생쥐의 각질층(stratum corneum)과 표피층(epidermis)에서 수분과 피부 탄력성이 현저히 부족하였다 (J. Biol. Chem. 2002;277; 17147-17153). 또한, 아쿠아포린-3 결핍 생쥐에 글리세롤을 도포하여 주면 피부 보습과 탄력도가 회복되었다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002;100:7360-7365). 이러한 연구 결과를 통해, 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질이 피부 각질층으로의 수분 유입과 표피층의 글리세롤 농도를 유지시켜주어 피부 보습을 유지하는데 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.Glycerol in the body is an aliphatic trivalent alcohol, a molecule that binds to fatty acids and produces fatty acids. There are three hydroxyl groups (-OH) in glycerol (molecular formula: C ₃ H ₅ (OH) ₃ ; CH ₂ OH-CHOH-CH ₂ OH) (J. Biol. Chem. 2002; 277: 46616-46621). (J. Biol. Chem. 2002; 277: 17147-17153) in the stratum corneum and epidermis of mice deficient in the aquaporin-3 (AQP3) gene. In addition, when glycerol was applied to aquaporin-3 deficient mice, skin moisturization and elasticity were restored (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 100: 7360-7365). These results indicate that the aquaporin-3 (AQP3) protein plays an important role in maintaining moisture retention by maintaining the glycerol concentration in the epidermal layer and the influx of water into the stratum corneum of the skin.

1. 한국공개특허 제10-2014-0070192호1. Korean Patent Publication No. 10-2014-0070192

1. J Biol Chem 1999;274:21631-21636, 1. J Biol Chem 1999; 274: 21631-21636, 2. Curr. Opin. Struct. Biol. 2005;15:176-1832. Curr. Opin. Struct. Biol. 2005; 15: 176-183 3. J Invest Dermatol 2002;118:678-685,3. J Invest Dermatol 2002; 118: 678-685, 4. J. Mol. Med. 2008;96:523-5294. J. Mol. Med. 2008; 96: 523-529 5. J. Biol. Chem. 2002;277:46616-466215. J. Biol. Chem. 2002; 277: 46616-46621 6. J. Biol. Chem. 2002;277; 17147-171536. J. Biol. Chem. 2002; 277; 17147-17153 7. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002;100:7360-73657. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 100: 7360-7365 8. J. Cell. Physiol. 2008;215: 506-5168. J. Cell. Physiol. 2008; 215: 506-516 9. Journal of Investigative Dermatology 2014;134: 1636-16449. Journal of Investigative Dermatology 2014; 134: 1636-1644

본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a cosmetic composition for skin moisturizing comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising the compound represented by the formula (1) as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 개선 또는 치료용 피부 외용제를 제공한다. Another object of the present invention is to provide an external preparation for skin for improving or treating atopic dermatitis comprising the compound represented by the formula (1) as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 개선용 화장료 조성물을 제공한다. Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for improving atopic dermatitis comprising the compound represented by the formula (1) as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 불로화의 알코올 추출물로부터 물, 헥산 및 클로로포름으로 순차적으로 분획되어 얻어지는 분획물을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다. Yet another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for moisturizing the skin, which comprises a fraction obtained by sequentially fractionating the alcohol extract of maltose with water, hexane and chloroform.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a cosmetic composition for skin moisturizing comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

본 발명의 일실시예 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 6,7-디메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘인 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the compound represented by Formula 1 may be 6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl- 2H -chromene.

본 발명의 일실시예 있어서, 상기 화합물은 아쿠아포린-3(AQP3)의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 것일 수 있다 .In one embodiment of the present invention, the compound may be one that increases the expression level of mRNA or protein of aquaporin-3 (AQP3).

본 발명의 일실시예 있어서, 상기 화합물은 CLOCK의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the compound may increase the expression level of mRNA or protein of CLOCK.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 개선 또는 치료용 피부 외용제를 제공한다. The present invention also provides an external preparation for skin for improving or treating atopic dermatitis comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 개선용 화장료 조성물을 제공한다. The present invention also provides a cosmetic composition for improving atopic dermatitis, which comprises a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

또한, 본 발명은 불로화의 알코올 추출물로부터 물, 헥산 및 클로로포름으로 순차적으로 분획되어 얻어지는 분획물을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다. The present invention also provides a cosmetic composition for skin moisturizing comprising a fraction obtained by sequentially fractionating an alcoholic extract of malic acid with water, hexane and chloroform.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 알코올은 에탄올인 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the alcohol may be ethanol.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 헥산 분획물인 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the fraction may be a hexane fraction.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 아쿠아포린-3(AQP3)의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the fraction may be one that increases the expression level of mRNA or protein of aquaporin-3 (AQP3).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 CLOCK의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the fraction may increase the expression level of mRNA or protein of CLOCK.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물인 아제라린(Agerarin)은 아쿠아포린-3(AQP3) 및 CLOCK의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시킴으로써 피부 보습에 효과적이고, 아토피 피부염의 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다. Agerarin, a compound represented by formula (I) according to the present invention, is effective for moisturizing skin by increasing the expression level of aquaporin-3 (AQP3) and CLOCK mRNA or protein, and is useful for the treatment or improvement of atopic dermatitis Lt; / RTI >

도 1은 불로화-에탄올추출물(AHE)을 처리한 후 아쿠아포린-3(AQP3) 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. (A) 및 (B)는 RT-PCR에 의하여 AQP3 mRNA의 발현량을 측정한 것이고, (C)는 면역블롯법에 의하여 AQP3 단백질의 발현량을 측정한 것이다.
도 2는 불로화-에탄올추출물(AHE)을 처리한 후 자외선 조사를 하고 아쿠아포린-3(AQP3) 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 RT-PCR에 의하여 AQP3 mRNA의 발현량을 측정한 것이고, (B)는 QRT-PCR에 의하여 mRNA의 발현량을 정량한 것이며, (C)는 면역블롯법에 의하여 AQP3 단백질의 발현량을 측정한 것이고, (D) 면역형광법에 의하여 세포에서 AQP3 단백질의 발현 여부를 측정한 것이다.
도 3은 불로화-에탄올추출물(AHE)에서 헥산 및 클로로포름으로 분획되는 과정 및 상기 분획물에 대한 아쿠아포린-3(AQP3) 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 불로화의 에탄올 추출물에서 헥산 및 클로로포름으로 분획되는 과정을 나타낸 것이고, (B)는 불로화-에탄올추출물(AHE)에서 분리한 헥산, 클로로포름 및 물 분획물을 처리한 후 자외선 조사를 하고 아쿠아포린-3(AQP3) 발현량을 QRT-PCR로 측정한 결과를 나타낸 것이며, (C)는 불로화-에탄올추출물(AHE) 및 헥산 분획물의 아쿠아포린-3(AQP3) 발현량을 RT-PCR로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 불로화 헥산 분획물을 크로마토그램으로 분석한 결과로서, (A) 불로화 헥산 분획물의 크로마토그램을 나타낸 것이고, (B)는 8.6분 첨두 물질을 photodiode array detector로 찍은 3차원 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 5는 불로화-헥산 분획물(AHE-Hx)에서 분리한 화합물인 아제라린(Agerarin)의 아쿠아포린-3(AQP3) 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. (A) 및 (C)는 RT-PCR에 의한 결과이고, (B) 및 (D)는 QRT-PCR에 의한 결과이다.
도 6은 불로화-헥산 분획물(AHE-Hx)에서 분리한 화합물인 아제라린(Agerarin)에 대한 1차 핵자기공명분광 스펙트럼을 나타낸 것으로서, (A)는 탄소-핵자기공명분광 스펙트럼, (B)는 수소-핵자기공명분광 스펙트럼, (C)는 DEPT(Distortionless enhancement by polarization transfer) 스펙트럼, (D)는 HMQC(Heteronuclear multiple quantum coherence) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 불로화-헥산 분획물(AHE-Hx)에서 분리한 화합물인 아제라린(Agerarin)에 대한 2차 핵자기공명분광 스펙트럼을 나타낸 것으로서, (A)는 TOCSY(Total correlated spectroscopy) 스펙트럼, (B)는 COSY(Correlated spectroscopy) 스펙트럼, (C)는 HMBC(Heteronuclear multiple bonded connectivities) 스펙트럼, (D)는 COSY와 HMBC 실험 결과로부터 탄소 및 수소의 연결된 관계 (점선: COSY 결과, 실선: HMBC 결과)를 나타낸 것이고, (E) 고분해능질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7e는 아제라린(Agerarin)의 구조를 재확인하기 위하여 Waters ACQUITY UPLC system (Waters, Milford, MA)이 장착된 UPLC-TOFMS(ultra-performance liquid chromatography-hybrid quadrupole-time-of-flight mass spectrometry)를 사용하여 고분해능질량분석 실험을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 불로화-헥산 분획물(AHE-Hx)에서 분리한 화합물인 아제라린(Agerarin)에 의한 CLOCK의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 CLOCK 유전자에 대한 shRNA(small hairpin RNA)를 주입(shCLOCK)한 후, CLOCK mRNA와 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA의 발현량을 RT-PCR에 의하여 측정한 것이고, (B)는 시간에 따른 CLOCK mRNA 발현량을 RT-PCR에 의하여 측정한 것이며, (C)는 시간에 따른 CLOCK mRNA 발현량을 QRT-PCR에 의하여 정량한 것이며, (D)는 시간에 따른 CLOCK 단백질의 발현량을 면역블롯법에 의하여 측정한 것이다.
도 9는 CLOCK 유전자 발현을 억제한 후, 아제라린(Agerarin)에 의한 CLOCK 및 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. (A) 및 (C)는 RT-PCR에 의하여 각각 CLOCK mRNA와 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA의 발현량을 측정한 것이고, (B) 및 (D)는 QRT-PCR에 의하여 각각 CLOCK mRNA와 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA의 발현량을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 10은 아제라린(Agerarin)이 피부 보습에 효과가 있다는 내용을 도식화한 것으로서, 아제라린(Agerarin)은 CLOCK 발현을 증가시키고 CLOCK은 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현을 촉진시킬 수 있다는 내용을 요약한 것이다. FIG. 1 shows the results of measurement of the amount of aquaporin-3 (AQP3) expression after treatment with a fluoro-ethanol extract (AHE). (A) and (B) show the expression levels of AQP3 mRNA by RT-PCR, and (C) the expression levels of AQP3 protein by immunoblotting.
FIG. 2 shows the results of measurement of the amount of aquaporin-3 (AQP3) expressed after irradiation with ultraviolet light after treatment with fluoro-ethanol extract (AHE). (A) expresses the expression level of AQP3 mRNA by RT-PCR, (B) quantifies the expression level of mRNA by QRT-PCR, and (C) expresses the expression of AQP3 protein by immunoblotting , And (D) the expression of AQP3 protein in cells by immunofluorescence.
FIG. 3 shows the results of measuring the amount of aquaporin-3 (AQP3) expressed in the fraction obtained by fractionation with hexane and chloroform in the volatile-ethanol extract (AHE). (A) shows the process of fractionation with ethanol and hexane and chloroform, and (B) the treatment with hexane, chloroform and water fractions separated from ethanol-ethanol extract (AHE) (AQP3) expression level of aquaporin-3 (AQP3) was measured by QRT-PCR, and (C) the expression level of aquaporin-3 (AQP3) As shown in FIG.
FIG. 4 shows chromatograms of the fractions of fluorohexane, (A) chromatogram of fractions of fluorohexane, and (B) shows three-dimensional chromatograms of 8.6-minute peak materials taken with a photodiode array detector will be.
FIG. 5 shows the results of measurement of the amount of aquaporin-3 (AQP3) expressed in the agararin compound isolated from the fluoride-hexane fraction (AHE-Hx). (A) and (C) are the results of RT-PCR, and (B) and (D) are the results of QRT-PCR.
FIG. 6 shows a first nuclear magnetic resonance spectroscopy spectrum of Agerarin, a compound isolated from the fluoride-hexane fraction (AHE-Hx), wherein (A) is a carbon-nuclear magnetic resonance spectroscopy spectrum, ) Shows a hydrogen-nuclear magnetic resonance spectroscopy spectrum, (C) shows a DEPT (Distortionless enhancement by polarization transfer) spectrum, and (D) shows a Heteronuclear multiple quantum coherence (HMQC) spectrum.
FIG. 7 shows a second nuclear magnetic resonance spectroscopy spectrum of Agerarin, a compound isolated from the fluoride-hexane fraction (AHE-Hx), wherein (A) shows a TOCSY (total correlated spectroscopy) spectrum, (COSY) and HMBC (HMBC) spectra, (C) HMBC (Heteronuclear multiple bonded connectivities) spectrum, (D) And (E) high resolution mass spectrometry spectrum.
FIG. 7E shows an UPLC-TOFMS (ultra-performance liquid chromatography-hybrid quadrupole-time-of-flight mass spectrometry) equipped with a Waters ACQUITY UPLC system (Waters, Milford, Mass.) To reconfirm the structure of the Agerarin The results of high resolution mass spectrometry are shown in Fig.
FIG. 8 shows the results of measurement of CLOCK expression by agararin, a compound isolated from the fluoride-hexane fraction (AHE-Hx). (A) shows the expression level of CLOCK mRNA and aquaporin-3 (AQP3) mRNA by RT-PCR after shCLOCK shRNA (small hairpin RNA) for CLOCK gene and (B) (CLOCK mRNA expression level by time was measured by RT-PCR. (C) was the amount of CLOCK mRNA expression by time determined by QRT-PCR, and (D) Were measured by the immunoblotting method.
FIG. 9 shows the results of measurement of expression of CLOCK and aquaporin-3 (AQP3) mRNA by agararin after inhibiting CLOCK gene expression. (A) and (C) show the expression levels of CLOCK mRNA and aquaporin-3 (AQP3) mRNA by RT-PCR, respectively. (B) and (D) (AQP3) mRNA expression level of the aquaporin-3.
Figure 10 is a graphical representation of the effect of Agerarin on skin moisturization. Agerarin increases CLOCK expression and CLOCK promotes aquaporin-3 (AQP3) gene expression. It is summarized.

본 발명의 용어, "아제라린(Agerarin)"은 6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene(6,7-디메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘)이라는 화학명을 가지고 있고, 구조는 하기 화학식 1로 표기할 수 있다. Terms of the present invention, "azelaic Lin (Agerarin)" is 6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl- 2 H -chromene - of (6,7-Dimethoxy-2,2-dimethyl -2 H-chromen) And the structure thereof can be represented by the following formula (1).

[화학식 1][Chemical Formula 1]

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 보습용 화장료 조성물은 상기 화학식 1의 화합물을 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~30 중량%의 양으로 포함할 수 있으나, 바람직한 피부 보습 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.In the cosmetic composition according to the present invention, the skin moisturizing cosmetic composition may contain the compound of Formula 1 in an amount of 0.0001 to 30% by weight based on the total weight of the composition, But is not limited to, including an effective amount.

본 발명에 따른 피부 보습용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.The cosmetic composition for moisturizing the skin according to the present invention can be used as an external skin ointment, cream, softening longevity, nutritional lotion, pack, essence, hair tonic, shampoo, rinse, hair conditioner, hair treatment, gel, skin lotion, Lotion, milk lotion, moisturizing lotion, nutrition lotion, massage cream, nutritional cream, moisturizing cream, hand cream, foundation, nutrition essence, sunscreen, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion and body cleanser , ≪ / RTI > and the like. The composition of each of these formulations may contain various kinds of bases and additives necessary for formulation of the formulation, and the kinds and amounts of these ingredients can be easily selected by those skilled in the art.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal fiber, plant fiber, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier component .

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component. In the case of a spray, in particular, / Propane or dimethyl ether.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.In the case of the solution or emulsion of the present invention, a solvent, a solvent or an emulsifier is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, , 3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid esters.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is an interfacial active agent-containing cleansing, the carrier component is selected from aliphatic alcohol sulfates, aliphatic alcohol ether sulfates, sulfosuccinic acid monoesters, isethionates, imidazolinium derivatives, methyltaurate, sarcosinates, fatty acid amides Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, linolenic derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters.

본 발명의 제형은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.The formulation of the present invention may further contain an excipient including a fluorescent substance, a fungicide, a hygroscopic substance, a humidifier, a fragrance, a fragrance carrier, a protein, a solubilizing agent, a sugar derivative, a sunscreen, a vitamin, .

상기와 같이 피부 보습용 화장료 조성물을 의약품 또는 화장품으로 제형화할 경우, 활성 성분에 대한 담체로 작용하는 피부에 적용가능한 공지의 부형제를 포함할 수 있다. 의약품으로의 제형화시에는 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있으며, 화장품으로 제형화시에는 [International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있을 것이다. 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.As described above, when formulating the cosmetic composition for skin moisturization into medicines or cosmetics, it may contain known excipients applicable to the skin acting as a carrier for the active ingredient. When formulating into pharmaceuticals, reference is made to the disclosure of [Remington ' s Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA], and in formulation into cosmetics, International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995). Which are incorporated herein by reference.

본 발명에 의한 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 유효성분인 상기 화학식 1의 화합물을 그대로 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다. 산 부가염 이외에도, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민, 3차-부틸아민과 같은 염기 부가염도 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis according to the present invention can be used as it is or in the form of a pharmaceutically acceptable salt. The salt is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable so long as it is pharmaceutically acceptable and includes, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrobromic acid, formic acid acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, , Benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, and naphthalenesulfonic acid. In addition to acid addition salts, additional base salts such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethylamine, tertiary-butylamine may also be used.

본 발명에 의한 약학 조성물의 제형에 있어서, 유효성분의 함유량은 제형에 따라 광범위하게 변할 수 있으며, 통상적인 방법에 따른다.In the formulation of the pharmaceutical composition according to the present invention, the content of the active ingredient may vary widely depending on the formulations, and is generally according to a conventional method.

본 발명에 의한 약학 조성물은, 유효성분에 악영향을 미치지 않는 한, 필요에 따라 의약에 사용되는 각종 보조제, 예컨대 담체나 기타 첨가제, 예컨대 안정제, 완화제, 유화제 등을 첨가하여 제제화될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated by adding various adjuvants such as carriers and other additives such as stabilizers, emollients, emulsifiers and the like, which are used in medicines, if necessary, so long as they do not adversely affect the active ingredients.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 또는 경구 등으로 투여할 수 있다. 비경구 투여 루트로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 국소도포가 가장 바람직하다. 예를 들어, 반창고 형태로 제조하여 붙일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제형으로는, 연고, 크림, 주사제, 산제, 과립제, 정제 등을 비롯하여 약학적 제제에 적합한 어떠한 제형으로도 할 수 있다.In addition, the composition according to the present invention can be administered parenterally or orally. As the route of parenteral administration, transdermal administration is preferable, and local application is most preferable. For example, it may be manufactured in the form of a bandage, but is not limited thereto. The formulations may be any formulations suitable for pharmaceutical preparations including ointments, creams, injections, powders, granules, tablets, and the like.

본 발명에 의한 약학 조성물의 바람직한 투여량은 0.001 내지 1000 ㎎/kg·day일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에 의한 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 약제와 동등하게 또는 다른 약제를 보조하기 위해 함께 투여될 수 있다. 또한, 각 제형의 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분인 조성물 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 통상의 기술자가 선정할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.The preferred dose of the pharmaceutical composition according to the present invention may be 0.001 to 1000 mg / kg · day, but is not limited thereto. In addition, the composition according to the present invention may be administered alone, or may be administered together with other medicines in order to aid in the same or another medicament. In addition, in the composition of each formulation, components other than the above-mentioned essential component, other than the composition, can be selected by a typical technician according to the formulation or purpose of use of the other external preparation. In this case, Can happen.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1. 실험방법 1. Experimental Method

1.1. 1.1. 불로화Blowing 추출물 및  The extract and 분획물의Fraction 제조 Produce

불로화(Ageratum houstonianum) 식물은 음건하여 건중량 1,248 g을 얻었고, 에탄올을 동량 첨가하여 3일간 침지시켰다. 이후, 여과한 후 감압증류기로 용매를 증류시켜 에탄올 추출물(AHE; Ageratum houstonianum Ethanol Extract) 150.9 g을 얻었다. 수율은 12.09%였다. Ageratum houstonianum plants were shredded and weighed 1,248 g, and the same amount of ethanol was added for 3 days. After filtration, the solvent was distilled off with a vacuum distiller to obtain an ethanol extract (AHE; Ageratum houstonianum Ethanol Extract). The yield was 12.09%.

불로화-에탄올 추출물(AHE) 120g은 극성에 따라서 액체-액체 분리를 수행하였다. 헥산과 물을 동량으로 넣고 층 분리를 하여 헥산층(17.63g, 14.69%)과 클로로포름층(6.7g, 5.58%) 을 확보하였다. 극성에 따른 불로화 추출물의 분리는 도 3A과 같이 수행하였다. 120 g of fluoro-ethanol extract (AHE) was subjected to liquid-liquid separation according to the polarity. Hexane and water were added in the same volume and the layers were separated to obtain hexane layer (17.63 g, 14.69%) and chloroform layer (6.7 g, 5.58%). The separation of the non-fluoridated extract according to the polarity was carried out as shown in FIG. 3A.

1.2. 1.2. 액체크로마토그라피를Liquid chromatography 이용한 성분 분리 및 핵자기공명분광기를 이용한 분자 구조 분석 Separation of components and molecular structure analysis using nuclear magnetic resonance spectroscopy

헥산층의 활성 물질을 분리하기 위하여 prep-HPLC, Agilent 1100 Series와 Luna C18 column (10 X 250mm, 5μm)을 사용하여 분취 액체크로마토그라피를 수행하였다. 이동상은 30℃에서 acetonitrile/methanol/Water (v/v 30:50:20)를 이용하였고, 이동속도는 3.0 mL/min이었다. 컬럼 주입 시료양은 50μL였으며, potodiode array detector를 이용하여 230nm에서 검출하였다. 분취 액체크로마토그라피에 사용한 시료들은 모두 이소프로판올에 녹였다.Preparative liquid chromatography was performed using prep-HPLC, Agilent 1100 Series and Luna C18 column (10 X 250 mm, 5 μm) to separate the hexane layer active material. The mobile phase was acetonitrile / methanol / water (v / v 30:50:20) at 30 ℃ and the migration rate was 3.0 mL / min. The column was filled with 50 μL of the sample and detected at 230 nm using a potodiode array detector. All of the samples used for preparative liquid chromatography were dissolved in isopropanol.

유효 활성 물질인 아제라린(Agerarin)의 구조를 동정하기 위하여 시료를 CDCl₃에 녹여서 2.5-mm 핵자기공명분광 튜브에 넣고 핵자기공명분광 실험을 수행하였다. 사용한 기기는 Bruker AVANCE 400 spectrometer system (9.4　T; Bruker, Karlsruhe, Germany)으로 실온에서 실험을 수행하였다. 자세한 실험 방법은 논문 (Magn Reson Chem 51:364) 에 발표된 방법을 따라서 수행하였다.In order to identify the structure of the active agent, Agerarin, a sample was dissolved in CDCl ₃ , put into a 2.5-mm nuclear magnetic resonance spectroscopy tube, and subjected to nuclear magnetic resonance spectroscopy. The instrument was run at room temperature with a Bruker AVANCE 400 spectrometer system (9.4T; Bruker, Karlsruhe, Germany). Detailed experiments were performed according to the method described in the article (Magn Reson Chem 51: 364).

1.3.1.3. 피부 각질형성세포(Skin keratinocyte ( keratinocyteskeratinocytes ) 배양) Culture

인간 각질형성 세포(HaCaT)는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였고, 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies), Antibiotic-Antimycotic solution (Invitrogen Life Technologies)이 포함된 DMEM(Invitrogen Life Technologies) 배양액을 사용하여 2일에 한 번씩 100-mm 세포배양접시에 1 x 10⁶의 접종 밀도(seed density)로 계대 하면서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.Human keratinocytes (HaCaT) were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) and were cultured in DMEM (Invitrogen Life Technologies) containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies), Antibiotic-Antimycotic solution (Invitrogen Life Technologies) The cells were cultured in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C in a 100-mm cell culture dish at a seeding density of 1 × 10 ⁶ every 2 days.

1.4.1.4. 역전사Reverse transcription 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)  Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

총 RNA는 TRIzol RNA Isolation Reagents(QIAGEN)를 이용하여 추출하였다. 총 RNA 0.5 μg을 iScript cDNA synthesis kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 제조회사의 권장하는 방법에 의하여 역전사반응을 이용한 이중나선 cDNA를 합성하였다. 이중나선 cDNA 0.0125μg 으로 PCR을 수행하였다. 유전자 증폭을 위한 프라이머 염기 서열은 하기 표 1과 같다. 대조군으로는 항존유전자(housekeeping gene)인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였다. PCR은 95℃, 5분에서 DNA를 변성시킨 후, 94℃, 1분; 65℃, 2분; 및 70℃, 1분간 반응시키는 사이클을 30회 반복하였다. PCR 최종 산물은 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하였고, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다.Total RNA was extracted using TRIzol RNA Isolation Reagents (QIAGEN). Double-stranded cDNA was synthesized by reverse transcription using 0.5 μg of total RNA using the iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) according to the manufacturer's recommended method. PCR was performed with 0.0125 [mu] g of double helix cDNA. Primer base sequences for gene amplification are shown in Table 1 below. GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), a housekeeping gene, was used as a control. After denaturation of the DNA at 95 ° C for 5 minutes, PCR was carried out at 94 ° C for 1 minute; 65 DEG C, 2 min; And a reaction at 70 占 폚 for 1 minute were repeated 30 times. The PCR products were electrophoresed on 1% agarose gel and stained with EtBr (ethidium bromide).

유전자gene 서열order AQP3AQP3 forwardforward 5'-CCTTTGGCTTTGCTGTCACTCT-3’(서열번호 1)5'-CCTTTGGCTTTGCTGTCACTCT-3 '(SEQ ID NO: 1) reversereverse 5'-CGGGGTTGTTGTAGGGGTCA-3' (서열번호 2)5'-CGGGGTTGTTGTAGGGGTCA-3 '(SEQ ID NO: 2) CLOCKCLOCK forwardforward 5'-TAGGGTATTTGCCATTTGA-3 (서열번호 3)5'-TAGGGTATTTGCCATTTGA-3 (SEQ ID NO: 3) reversereverse 5'-GCCAAGTTCTCGTCGTC-3' (서열번호 4)5'-GCCAAGTTCTCGTCGTC-3 '(SEQ ID NO: 4) GAPDHGAPDH forwardforward 5'-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3' (서열번호 5)5'-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3 '(SEQ ID NO: 5) reversereverse 5'-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3' (서열번호 6)5'-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3 '(SEQ ID NO: 6)

1.5.1.5. 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(Quantitative Real-time polymerase chain reaction; QRT-PCR) Quantitative real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR)

정량적 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative Real-time polymerase chain reaction; QRT-PCR) 은 중합효소 연쇄 반응을 기반으로 한 정량적 실험방법이다. 즉, 타겟 유전자의 증폭 정도와 발현양을 동시에 측정함으로써 정확한 mRNA 양을 측정할 수 있는 방법이다. 상기 실시예 1.4와 같은 방법으로 cDNA를 합성한 후, TaqMan-iQ supermix kit (Bio-Rad)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 측정을 위한 TaqMan probe 염기서열은 5'-6-FAM-CCCTTCACGATCCACCCTTTCA-BHQ-1-3'(서열번호 7)이었으며, 대조군인 GAPDH mRNA 측정을 위해 사용한 TaqMan probe 염기서열은 5'-Yakima YellowTM-CGTCGCCAGCCGAGCCACATCGC-BHQ-1-3'(서열번호 8)으로 하여 실험을 수행하였다. Quantitative real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR) is a quantitative method based on polymerase chain reaction. That is, it can measure the amount of mRNA accurately by simultaneously measuring the amplification degree and the expression amount of the target gene. CDNA was synthesized in the same manner as in Example 1.4, and PCR was performed using a TaqMan-iQ supermix kit (Bio-Rad). The TaqMan probe sequence for measuring aquaporin-3 (AQP3) mRNA was 5'-6-FAM-CCCTTCACGATCCACCCTTTCA-BHQ-1-3 '(SEQ ID NO: 7) and the TaqMan probe sequence used for the control GAPDH mRNA Was performed with 5'-Yakima YellowTM-CGTCGCCAGCCGAGCCACATCGC-BHQ-1-3 '(SEQ ID NO: 8).

1.6.1.6. 면역블롯법Immunoblot method

GAPDH(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) 및 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질에 대한 항체(antibody)는 BOSTER (Pleasanton, CA) 회사에서 구입하였다. 배양된 HaCaT 세포는 수확하여 20mM HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 150mM NaCl, 10㎍/㎕ Leupeptin, 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 함유하는 완충용액으로 세포를 용해시킨 후, 고속원심분리하여 세포 용해액만을 획득하였다. 세포 용해액의 단백질의 양은 Pierce BCA Protein Assay Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 분석하였다. 동량의 단백질(10~20 μg)이 포함되도록 제조된 시료를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel) 전기영동을 실시하여 세포에 존재하는 단백질들을 분리하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 폴리스틸렌 막(polystyrene membrane)으로 옮긴 후 아쿠아포린-3(AQP3)과 GAPDH를 인지하는 일차항체)를 각각 5시간 반응시킨 후, 일차항체를 인지하는 이차항체(Cell Signaling Technology)를 1시간 동안 반응시켰다. 화학형광감지 시스템(Enhanced Chemiluminescence System; Amersham Pharmacia Biotechnology)을 이용하여 단백질 변화량을 분석하였다.Antibodies to GAPDH (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) and aquaporin-3 (AQP3) proteins were purchased from BOSTER (Pleasanton, CA). The cultured HaCaT cells were harvested and harvested and resuspended in 20 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 1% Triton X-100, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 10 μg / l Leupeptin, 1 mM PMSF ), Followed by high-speed centrifugation to obtain only the cell lysate. The amount of protein in the cell lysate was analyzed using Pierce BCA Protein Assay Reagent (Thermo Scientific, Rockford, Ill., USA). Samples prepared to contain the same amount of protein (10-20 μg) were subjected to SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel) electrophoresis to separate the proteins present in the cells. After separation of the proteins separated by electrophoresis, the cells were transferred to a polystyrene membrane, followed by reaction with aquaporin-3 (AQP3) and GAPDH-recognizing primary antibodies for 5 hours. Cell signaling technology ) Was reacted for 1 hour. The amount of protein change was analyzed using an Enhanced Chemiluminescence System (Amersham Pharmacia Biotechnology).

1.7.1.7. 면역형광Immunofluorescence 현미경(Immunofluorescence microscopy)법 Immunofluorescence microscopy

HaCaT 세포는 커버 글라스(cover glasss)에서 배양하고, 불로화추출물를 24시간 동안 처리한 후 4% 포름알데하이드(formaldehyde)를 첨가하여 세포를 고정시켰다. 2% 우혈청알부민(bovine serum albumin)이 포함된 0.1% Triton X-100 용액을 첨가하여 세포막으로 항체가 통과할 수 있도록 하였다. 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질과 결합하는 일차 항체를 90분 동안 반응하고 적색 형광체 Alexa-Fluor 555 가 결합된 2차 항체 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 30분 동안 반응시켰다. 커버글라스를 PBS 완충 용액으로 10분간 세척하고 청색형광으로 DNA를 선택적으로 염색하는 시약 Hoechst 33258 (Invitrogen)을 첨가한 후 EVOS FL 형광 현미경(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 관찰하였다.HaCaT cells were cultured in cover glasses, treated with the extract for 24 hours, and fixed with 4% formaldehyde. A 0.1% Triton X-100 solution containing 2% bovine serum albumin was added to allow the antibody to pass through the cell membrane. The primary antibody bound to the aquaporin-3 (AQP3) protein was reacted for 90 minutes and reacted with the secondary antibody conjugated with the red phosphor Alexa-Fluor 555 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for 30 minutes. The coverslips were washed with PBS buffer for 10 minutes and incubated with EVCH FL fluorescence microscope (Life Technologies, Carlsbad, Calif., USA) after the addition of the reagent Hoechst 33258 (Invitrogen) to selectively stain the DNA with blue fluorescence.

1.8. 1.8. shRNA(small hairpin RNA)를shRNA (small hairpin RNA) 이용한 CLOCK 유전자 발현 억제 Inhibition of CLOCK gene expression

HaCaT 세포는 60-mm 세포배양접시에 배양하였고, 50-80% 접종 밀도(seed density)가 되었을 때 CLOCK 유전자에 대한 shRNA가 발현하는 lentiviral particle (Sigma)을 접종하였다. 24시간 후에 2 μg/ml 농도의 puromycin이 포함된 배양액에서 10-14일 동안 배양한 후에 CLOCK 유전자 발현이 억제된 콜로니를 선택적으로 배양하여 실험에 사용하였다.HaCaT cells were cultured in 60-mm cell culture dishes and lentiviral particles (Sigma) expressing shRNA against the CLOCK gene were inoculated at 50-80% seed density. After 24 hours, cultures were incubated in culture medium containing 2 μg / ml of puromycin for 10-14 days. Then, colonies with suppressed CLOCK gene expression were selectively cultured and used in the experiments.

실시예Example 2.  2. 불로화Blowing -에탄올추출물(- ethanol extract ( AHEAHE )의 )of 아쿠아포린Aquaporin -3(-3 ( AQP3AQP3 ) 발현 증가 효과) Increased expression effect

본 발명자들의 선행 특허에서는 불로화-메탄올 추출물에 의하여 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(한국공개특허 제10-2014-0070192호). 본 발명에서는 불로화-에탄올 추출물(AHE)에 의한 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자의 발현량이 증가함을 확인하였다. In our prior patents, aquaporin-3 (AQP3) It was confirmed that the expression level of the gene was increased (Korean Patent Publication No. 10-2014-0070192). In the present invention, it was confirmed that the expression level of aquaporin-3 (AQP3) gene was increased by AHE.

구체적으로, HaCaT 세포에 0, 5, 10, 20 μg/ml 농도의 불로화-에탄올추출물(AHE)을 24 시간 처리한 후, 총 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 불로화-에탄올추출물(AHE)은 농도-의존적으로 아쿠아포린-3(AQP3)의 mRNA 양을 증가시켰음을 확인하였다(도 1A). Specifically, HaCaT cells were treated with 0, 5, 10, and 20 μg / ml of fluoro-ethanol extract (AHE) for 24 hours, and total RNA was isolated and RT-PCR was performed. As a result, it was confirmed that the fluorogenic-ethanol extract (AHE) increased the amount of aquaporin-3 (AQP3) mRNA in a concentration-dependent manner (FIG. 1A).

또한, 시간-의존적 반응성을 분석하기 위하여, 20 μg/ml 농도의 불로화-에탄올추출물(AHE)을 6, 12, 24 시간 처리한 후 아무 처리도 하지 않은 그룹(0 h)과 함께 세포를 수확한 후, 총 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 불로화-에탄올추출물(AHE)을 처리하면 처리 후 6시간 이내에 아쿠아포린-3(AQP3)의 mRNA 양이 증가하기 시작하여 처리 24 시간 후까지 지속적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 1B). In order to analyze the time-dependent reactivity, the cells were harvested with a 20 μg / ml ethanol-ethanol extract (AHE) for 6, 12 and 24 hours and then treated with no treatment (0 h) After that, total RNA was isolated and RT-PCR was performed. As a result, it was confirmed that the amount of mRNA of aquaporin-3 (AQP3) started to increase within 6 hours after treatment with AHE and continuously increased until 24 hours after treatment (Fig. 1B) .

또한, 본 발명자들은 불로화-에탄올추출물(AHE)에 의한 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질의 발현량에도 변화를 주는지를 확인하기 위한 면역블럿 실험을 수행하였다. 그 결과, HaCaT 세포에 20 μg/ml 농도의 불로화-에탄올추출물(AHE)을 12, 24 시간 처리하는 경우 아무 처리도 하지 않은 그룹(0 h)에서 보다 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(도 1C).In addition, the present inventors carried out an immunoblot experiment to confirm whether the expression level of aquaporin-3 (AQP3) protein by AHE was changed. As a result, the expression of aquaporin-3 (AQP3) protein was significantly higher in HaCaT cells treated with 20 μg / ml of fluoro-ethanol extract (AHE) for 12 hours and 24 hours than in no- (Fig. 1C).

따라서, 불로화-에탄올추출물(AHE)은 인간 각질형성세포에서 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 및 단백질의 발현량을 증가시킴을 확인하였다. Therefore, it has been confirmed that the AHE-induced increase in the expression level of aquaporin-3 (AQP3) gene and protein in human keratinocytes.

실시예Example 3.  3. 불로화Blowing -에탄올추출물(- ethanol extract ( AHEAHE )의 자외선 조사에 의해 ) By ultraviolet irradiation 감소된Reduced 아쿠아포Aquapo 린-3(AQP3) 발현 회복 효과Recovery effect of lean-3 (AQP3) expression

자외선-B (UVB)가 피부에 노출되면 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현이 감소되어 피부 보습이 감소되고 피부 노화가 촉진된다 (J. Cell. Physiol. 2008;215: 506-516). 본 발명자들은 불로화-에탄올추출물(AHE)이 UVB 조사에 의해 감소되는 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는지 조사하였다. HaCaT 세포에 UVB(30J/m²)를 단독 조사(irradiation), 또는 불로화-에탄올추출물(AHE)을 다양한 농도(5, 10, 20 μg/ml)로 30분 동안 전처리(pre-treatment)하였고, UVB를 조사한 후, 24 시간 후에 세포를 수확하였다. 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA의 발현량은 RT-PCR 및 QRT-PCR를 통해 분석되었다. 그 결과, 불로화-에탄올추출물(AHE)은 UVB에 의해 감소된 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 발현량을 농도 의존적으로 회복시켰다(도 2A 및 2B). 특히, 10 μg/ml 농도 이상의 에탄올추출물(AHE)을 처리하는 경우에는 UVB를 처리하지 않은 대조군에 비해 더 많은 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA를 발현시키는 효과가 있음을 확인하였다.Exposure to ultraviolet-B (UVB) to the skin reduces the expression of aquaporin-3 (AQP3) gene, thereby reducing skin moisturization and promoting skin aging (J. Cell. Physiol. 2008; 215: 506-516). The present inventors have investigated whether fluoro-ethanol extract (AHE) can affect the expression of aquaporin-3 (AQP3) gene, which is reduced by UVB irradiation. HaCaT cells were pre-treated with UVB (30 J / m ² ) alone or irradiated with ethanol-ethanol extract (AHE) at various concentrations (5, 10, 20 μg / ml) for 30 min , UVB was irradiated, and cells were harvested after 24 hours. The expression level of aquaporin-3 (AQP3) mRNA was analyzed by RT-PCR and QRT-PCR. As a result, the fluorogenic-ethanol extract (AHE) restored the amount of aquaporin-3 (AQP3) mRNA expression reduced by UVB in a concentration-dependent manner (FIGS. 2A and 2B). In particular, it was confirmed that the ethanol extract (AHE) at a concentration of 10 μg / ml or more was more effective in expressing aquaporin-3 (AQP3) mRNA than the control without UVB treatment.

또한, 본 발명자들은 불로화-에탄올추출물(AHE)을 20 μg/ml 농도로 30분 동안 전처리(pre-treatment)한 후 UVB를 조사하고, 24 시간 후에 세포를 수확하여 면역블롯법에 의해 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질의 발현량을 확인하였다. 그 결과, UVB에 의해 감소된 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질은 UVB를 처리하지 않은 대조군과 유사한 단백질 발현량을 나타냄을 확인하였다(도 3C). In addition, the inventors of the present invention conducted preliminary treatment of AHE at a concentration of 20 μg / ml for 30 minutes, followed by irradiation with UVB, harvesting the cells after 24 hours, -3 (AQP3) protein. As a result, it was confirmed that the aquaporin-3 (AQP3) protein reduced by UVB showed a protein expression amount similar to that of the control without UVB treatment (Fig. 3C).

본 발명자들은 불로화-에탄올추출물(AHE)에 의한 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질 생성 효과를 세포 수준에서 좀 더 알아보기 위하여, 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. HaCaT 세포를 커버 글라스 (cover glasss)에서 배양한 후 30 J/m² 의 UVB를 단독 조사하거나, UVB 조사 30분 전에 20 μg/ml 농도의 불로화-에탄올추출물(AHE)을 전처리(pre-treatment)한 후 UVB를 조사하고, 24 시간 후에 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질 분포를 형광현미경으로 분석하였다. 그 결과, UVB를 세포에 조사하면 적색 형광을 보이는 세포가 감소하였고, 불로화-에탄올추출물(AHE)을 처리한 세포에서 적색 형광이 다시 나타남을 확인하였다. 이로써, 불로화-에탄올추출물(AHE)은 UVB에 의해 감소되는 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질 발현량을 다시 회복시켰음을 확인하였다. The present inventors analyzed the effect of the AHP-induced AQP3 protein on the cell level using a fluorescence microscope. HaCaT cells were cultured in cover glasses and irradiated with UVB at a dose of 30 J / m ² alone or pre-treated with 20 μg / ml of 20 μg / ml of UVB-ethanol extract (AHE) ), UVB was irradiated, and the distribution of aquaporin-3 (AQP3) protein was analyzed by fluorescence microscope after 24 hours. As a result, when UVB cells were irradiated to the cells, red fluorescence was decreased, and red fluorescence was observed again in the cells treated with AHE. Thus, it was confirmed that the fluorescence-ethanol extract (AHE) restored the expression amount of aquaporin-3 (AQP3) protein reduced by UVB.

실시예Example 4.  4. 불로화Blowing -에탄올추출물(- ethanol extract ( AHEAHE )에서 분리한 ) 헥산과Hexane and 클로로포름  chloroform 분획물의Fraction 아쿠아포린Aquaporin -3(-3 ( AQP3AQP3 ) 발현 효과 분석) Expression effect analysis

불로화-에탄올추출물(AHE)에서 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현을 촉진시키는 유효성분을 동정하기 위하여 상기 실시예 1.1.에서와 같이 불로화-에탄올추출물(AHE)에서 헥산과 클로로포름 분획층을 분리하였다 (도 3A). 본 발명자들은 상기 분획물에 의하여 UVB에 의해 감소된 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 발현량에 변화를 주는지를 RT-PCR를 통해 확인하였다. 그 결과, 클로로포름 분획물에서는 대조군에 비해 어떠한 차이가 없었으나, 불로화-에탄올추출물(AHE) 및 헥산 분획물에서는 UVB에 의해 감소된 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 발현량이 현저하게 증가하였음을 확인하였다(도 3B). In order to identify the active ingredient promoting the expression of aquaporin-3 (AQP3) gene in the fluorogenic-ethanol extract (AHE), hexane and chloroform fraction layers were separated from the fluorinated-ethanol extract (AHE) (Fig. 3A). The present inventors confirmed by RT-PCR whether this fraction changed the amount of UVA-induced aquaporin-3 (AQP3) mRNA expression by the fraction. As a result, it was confirmed that the amount of aquaporin-3 (AQP3) mRNA expression reduced by UVB was remarkably increased in the chloroform-ethanol extract (AHE) and the hexane fraction, although there was no difference in the chloroform fraction compared with the control group 3B).

또한, 본 발명자들은 불로화-헥산 분획물(AHE-Hx)이 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현을 촉진시키는지 알아보기 위한 실험을 수행하였다. HaCaT 세포에 20 μg/ml 농도의 불로화-헥산분획물(AHE-Hx)을 24 시간 동안 처리한 후 RT-PCR를 통해 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA의 발현량을 분석하였다. 그 결과, 불로화-헥산분획물(AHE-Hx)은 불로화-에탄올추출물(AHE)을 처리한 경우와 유사하게 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA의 발현량을 증가시킴을 확인하였다(도 3C). In addition, the present inventors conducted an experiment to determine whether the fluoro-hexane fraction (AHE-Hx) promotes the expression of the aquaporin-3 (AQP3) gene. The expression level of aquaporin-3 (AQP3) mRNA was analyzed by RT-PCR after treating the HaCaT cells with 20 μg / ml of fluorohexane fraction (AHE-Hx) for 24 hours. As a result, it was confirmed that the fluoro-hexane fraction (AHE-Hx) increased the expression level of aquaporin-3 (AQP3) mRNA similarly to the case of treatment with the inflammation-ethanol extract (AHE) .

실시예Example 5.  5. 불로화Blowing -- 헥산Hexane 분획물(AHE-Hx)에서The fraction (AHE-Hx) 분리된  Isolated 활성물질에 대한 분석 결과Analysis results for active substances

헥산 분획물에서의 활성물질의 분리는 상기 실시예 1.2.에서와 같이 분취 액체크로마토그라피 실험을 통해 수행되었다. 그 결과, retention time이 8.6분에서 나온 첨두가 양적으로 가장 많이 존재하여 상기 물질을 분리하였다 (도 4A). 상기 분리한 물질이 단일물질인지를 확인하기 위하여 photodiode array detector로 3차원 크로마토그램을 수행한 결과, 단일물질임을 확인하였다(도 4B). 본 발명자들은 상기 분리된 단일물질을 '아제라린(Agerarin)'으로 명명하였다.Separation of the active material in the hexane fraction was carried out through an aliquot liquid chromatographic experiment as in Example 1.2. Above. As a result, the peak was found at a peak of retention time of 8.6 minutes, and the material was isolated (FIG. 4A). In order to confirm whether the separated material is a single substance, a three-dimensional chromatogram was performed using a photodiode array detector, and it was confirmed that the substance was a single substance (FIG. 4B). The present inventors named the separated single substance as 'Agerarin'.

실시예Example 6.  6. 아제라린(Agerarin)의Agerarin's 아쿠아포린Aquaporin -3(-3 ( AQP3AQP3 ) 발현 증가 효과) Increased expression effect

본 발명자들은 상기 실시예 5의 아제라린(Agerarin)에 대한 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현 변화를 분석하였다. HaCaT 세포에 20 μg/ml 농도의 불로화-에탄올추출물(AHE) 또는 20 μg/ml 아제라린(Agerarin)을 24시간 처리한 후, 세포를 수확하여 총 RNA를 분리하고 RT-PCR을 통해 아쿠아포린-3(AQP3)의 mRNA 발현량을 측정하였다. 그 결과, 불로화-에탄올추출물(AHE) 및 아제라린(Agerarin)을 처리한 경우 대조군에 비해 아쿠아포린-3(AQP3)의 mRNA 발현량이 증가됨을 확인하였다(도 5A). The present inventors analyzed the expression of aquaporin-3 (AQP3) gene in Agerarin of Example 5 above. HaCaT cells were treated with 20 μg / ml of fluoro-ethanol extract (AHE) or 20 μg / ml of agararin for 24 hours. Cells were harvested and total RNA was isolated and analyzed by RT-PCR using aquaporin -3 (AQP3). ≪ / RTI > As a result, it was confirmed that the amount of aquaporin-3 (AQP3) mRNA expression was increased in the case of treatment with fluoro-ethanol extract (AHE) and agararin (FIG. 5A).

또한, QRT-PCR을 통해 아제라린(Agerarin)에 의한 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 발현량을 정량적으로 분석하기 위하여, HaCaT 세포에 20 μg/ml 농도의 불로화-에탄올추출물(AHE) 또는 아제라린(Agerarin)을 24 시간 처리한 경우 아쿠아포린-3(AQP3)의 mRNA 발현량은 비교하였다. 그 결과, 불로화-에탄올추출물(AHE)을 처리한 경우에는 아쿠아포린-3(AQP3)의 mRNA 발현량이 대조군에 비해 약 3.2 배 증가하였고, 아제라린(Agerarin)를 처리한 경우에는 대조군에 비해 약 7.2 배 증가하였음을 확인하였다(도 5B). In order to quantitatively analyze the amount of aquaporin-3 (AQP3) mRNA expression by agararin through QRT-PCR, HaCaT cells were treated with 20 μg / ml of fluoro-ethanol extract (AHE) The amount of mRNA expression of aquaporin-3 (AQP3) was compared when agararin was treated for 24 hours. As a result, the amount of mRNA expression of aquaporin-3 (AQP3) was increased about 3.2 times as compared with that of the control group when treated with the fluoro-ethanol extract (AHE) and compared with that of the control group when treated with agararin 7.2 fold (Fig. 5B).

또한, 본 발명자들은 아제라린(Agerarin)이 UVB 조사에 의해 감소되는 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 발현을 회복시키는지 분석하였다. HaCaT 세포에 UVB(30J/m²)를 단독 조사, 또는 20 μg/ml 농도의 불로화-에탄올추출물(AHE)과 아제라린(Agerarin)을 30분 동안 전처리(pre-treatment)한 후 UVB를 조사한 후, 24 시간 후에 세포를 수확하여 RT-PCR(도 5C) 및 QRT-PCR(도 5D)을 수행하였다. 그 결과, 아제라린(Agerarin)은 불로화-에탄올추출물(AHE)을 처리한 경우보다 더 현저하게 UVB에 의해 감소된 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA의 발현량을 회복시켰음을 확인하였다(도 5C 및 5D). In addition, the present inventors analyzed whether Agerarin restores the expression of aquaporin-3 (AQP3) mRNA reduced by UVB irradiation. HaCaT cells were irradiated with UVB (30 J / m ² ) alone or pre-treated with 20 μg / ml of fluoro-ethanol extract (AHE) and azerarin for 30 min, After 24 hours, the cells were harvested and RT-PCR (Fig. 5C) and QRT-PCR (Fig. 5D) were performed. As a result, it was confirmed that Agerarin restored the expression amount of aquaporin-3 (AQP3) mRNA reduced by UVB more markedly than in the case of treatment with fluoro-ethanol extract (AHE) (Fig. 5C And 5D).

실시예Example 7.  7. 아제라린(Agerarin)의Agerarin's 구조 규명 Structure identification

본 발명자들은 아제라린(Agerarin)의 구조를 규명하기 위하여 상기 실시예 1.2.에서와 같이 핵자기공명분광기를 이용하여 분자 구조를 분석하였다. 탄소-핵자기공명분광 실험 스펙트럼에서 총 12개의 첨두가 관찰되었고(도 6A), 수소-핵자기공명분광 실험 스펙트럼에서는 7개의 첨두가 관찰되었다(도 6B). 아제라린(Agerarin)은 DEPT(distortionless enhancement by polarization transfer) 실험으로부터 quartet 탄소 3개, doublet 탄소 4개, singlet 탄소 5개로 구성된 것으로 확인되었다(도 6C). 56.1와 56.7ppm에서 관찰된 두 개의 탄소 첨두는 HMQC(heteronuclear multiple quantum coherence) 실험에서 3.80와 3.78ppm의 수소에 각각 결합된 것이 드러났기 때문에 이들은 methoxy기로 결정되었다(도 6D). 또한, 1.38 ppm에서의 수소 첨두는 27.8 ppm의 탄소 첨두에 직접 결합되어 있기 때문에 이는 methyl기로 결정되었는데 수소 첨두의 면적이 두 개의 methyl기가 있는 것으로 판단되어 아제라린(Agerarin)은 두개의 methyl기를 가지고 있는 것으로 결정되었다. 나머지 7개의 탄소 첨두들과 4개의 수소 첨두들은 chromene 골격의 핵자기공명분광실험 결과들과 유사하기 때문에 아제라린(Agerarin)은 chromene 골격을 가지고 있는 것으로 판단하고 논문 (Magn Reson Chem 50:759)의 자료와 비교하여 아제라린(Agerarin)의 구조를 확정하였다. The present inventors analyzed the molecular structure using nuclear magnetic resonance spectroscopy as described in Example 1.2 to identify the structure of Agerarin. A total of 12 peaks were observed in the carbon-nuclear magnetic resonance spectroscopy (Fig. 6A) and seven peaks were observed in the hydrogen-nuclear magnetic resonance spectroscopy (Fig. 6B). Agerarin was confirmed to be composed of three quartet carbons, four doublet carbons, and five singlet carbons from DEPT (Fig. 6C). The two carbon peaks observed at 56.1 and 56.7 ppm were found to bind to 3.80 and 3.78 ppm hydrogen in the HMQC (heteronuclear multiple quantum coherence) experiments, respectively, so they were determined as methoxy groups (Fig. 6D). In addition, since the peak of hydrogen at 1.38 ppm is directly bound to the peak of carbon at 27.8 ppm, it is determined as a methyl group. As the peak area of hydrogen is considered to have two methyl groups, Agerarin has two methyl groups . The remaining seven carbon peaks and four hydrogen peaks are similar to the results of the nuclear magnetic resonance spectroscopy of the chromene skeleton, so that Agerarin is believed to have a chromene skeleton, and the article (Magn Reson Chem 50: 759) The structure of Agerarin was confirmed by comparison with the data.

아제라린(Agerarin)은 2차 핵자기공명실험들인 TOCSY(total correlated spectroscopy, 도 7A), COSY(correlated spectroscopy, 도 7B) 및 HMBC(heteronuclear multiple bonded connectivities, 도 7C)의 해석으로부터 2H-chromenone을 포함하는 것으로 결정되었다. COSY와 HMBC 실험 결과로부터 탄소 및 수소의 연결된 관계를 결정한 결과는 도 7D와 같이 나타내었다. 이상의 핵자기공명분광 실험 결과로 얻은 탄소, 수소 첨두들은 표 2에서와 같이 요약하였다.Agerarin obtained 2 H -chromenone from the analysis of secondary nuclear magnetic resonance experiments TOCSY (total correlated spectroscopy, Fig. 7A), COZY (correlated spectroscopy, Fig. 7B) and HMBC (heteronuclear multiple bonded connectivities . From the results of COZY and HMBC experiment, the relationship between carbon and hydrogen was determined as shown in FIG. 7D. The carbon and hydrogen peaks obtained from the nuclear magnetic resonance spectroscopy were summarized as shown in Table 2.

No.No. δ of ¹³Cδ of ¹³ C DEPTDEPT δ of 1H? of 1H TOCSYTOCSY COSYCOZY HMBCHMBC 77 149.9149.9 ss -- -- -- C7-H5/H8/H7-OMeC7-H5 / H8 / H7-OMe 99 147.4147.4 ss -- -- -- C9-H5/H8C9-H5 / H8 66 143.3143.3 ss -- -- -- C6-H8/H6-OMeC6-H8 / H6-OMe 33 128.4128.4 dd 5.44(d, 9.7)5.44 (d, 9.7) H3-H8H3-H8 H3-H4H3-H4 C3-H2-CH₃ C3-H2-CH ₃ 44 122.1122.1 dd 6.20(d, 9.7)6.20 (d, 9.7) H4-H5/H8H4-H5 / H8 H4-H3H4-H3 C4-H5C4-H5 1010 113.2113.2 ss -- -- -- C10-H3/H8C10-H3 / H8 55 110.0110.0 dd 6.50(s)6.50 (s) H5-H4/H8/H6-OMeH5-H4 / H8 / H6-OMe -- -- 88 101.2101.2 dd 6.38(s)6.38 (s) H8-H3/H4/H5/H7-OMeH8-H3 / H4 / H5 / H7-OMe -- -- 22 76.276.2 ss -- -- -- C2-H3/H4/H2-CH₃ C2-H3 / H4 / H2- CH 3 6-OMe6-OMe 56.756.7 qq 3.78(s)3.78 (s) H6-OMe-H5H6-OMe-H5 -- -- 7-OMe7-OMe 56.156.1 qq 3.80(s)3.80 (s) H7-OMe-H8H7-OMe-H8 -- -- 2-CH₃ 2-CH ₃ 27.827.8 qq 1.38(s)1.38 (s) -- -- --

상기 결과로부터, 아제라린(Agerarin)은 6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene(6,7-디메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘)으로 확인되었고, 구조는 하기 화학식 1과 같다. From the above results, azelaic Lin (Agerarin) is 6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl- 2 H -chromene - have been identified as (6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl -2 H-chromen), The structure is shown in the following formula (1).

[화학식 1][Chemical Formula 1]

아제라린(Agerarin)의 분자식은 C₁₃H₁₆O₃, 분자량은 220.1099로 최종 결정되었다. 구조를 재확인하기 위하여 Waters ACQUITY UPLC system (Waters, Milford, MA)이 장착된 UPLC-TOFMS(ultra-performance liquid chromatography-hybrid quadrupole-time-of-flight mass spectrometry)를 사용하여 고분해능질량분석 실험을 수행하였다. 그 결과, [M+H] 첨두가 221.5345에서 관찰되었고, 이론값은 221.1178이었기 때문에 AG-H-1의 구조가 맞는 것으로 확인하였다(도 7e). The molecular formula of azelaic Lin (Agerarin) is C ₁₃ H ₁₆ O _3, molecular weight was determined to be the final 220.1099. High resolution mass spectrometry experiments were performed using UPLC-TOFMS (Waters, Milford, MA) equipped with a Waters ACQUITY UPLC system (Waters, Milford, MA) . As a result, the peak of [M + H] was observed at 221.5345 and the theoretical value was 221.1178, confirming that the structure of AG-H-1 is correct (FIG.

실시예Example 8.  8. 아제라린(Agerarin)에To Agerarin 의한 CLOCK 유전자 발현 증가 효과 Of CLOCK gene expression

아쿠아포린-3(AQP3)은 생체시계(circadian clock) 조절 유전자인 CLOCK(Circadian Locomotor Output Cycles Kaput) 유전자에 의해 24시간 주기로 발현된다고 알려져 있다 (Journal of Investigative Dermatology 2014;134: 1636-1644). 실제로, 상기 실시예 1.8. 에서와 같이 CLOCK 유전자에 대한 shRNA(small hairpin RNA)를 주입(shCLOCK)하여 CLOCK 유전자 발현을 억제시키면, 대조 shRNA(shCont)를 발현시킨 세포에 비해 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA의 발현량이 현저하게 억제됨을 확인하였다(도 8A). It is known that aquaporin-3 (AQP3) is expressed in a 24-hour cycle by the circadian locomotor output cycle caput (CLOCK) gene, which is a circadian clock regulation gene (Journal of Investigative Dermatology 2014; 134: 1636-1644). Actually, in Example 1.8. (ShCLOCK) to the CLOCK gene (shCLOCK) to inhibit the expression of the CLOCK gene, the expression level of aquaporin-3 (AQP3) mRNA was remarkably higher than that of the cells expressing the control shRNA (Fig. 8A).

상기의 결과로부터 CLOCK 유전자가 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현에 중요하게 작용하는데, 본 발명에서는 아제라린(Agerarin)이 CLOCK 유전자의 발현에 변화를 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. HaCaT 세포에 20 μg/ml 농도의 아제라린(Agerarin)을 6, 12, 24 시간 처리한 후 아무 처리도 하지 않은 그룹(0 h)과 함께 세포를 수확한 후, 총 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 아제라린(Agerarin)을 처리하면 처리 후 6시간 이내에 CLOCK의 mRNA 발현량이 증가하기 시작하여 처리 24 시간 후에는 점차 감소하는 것을 확인하였다(도 8B). From the above results, the CLOCK gene plays an important role in the expression of the aquaporin-3 (AQP3) gene. In the present invention, an experiment was conducted to confirm whether agerarin changes the expression of the CLOCK gene. HaCaT cells were treated with agararin at a concentration of 20 μg / ml for 6, 12, and 24 hours, harvested with no-treatment groups (0 h) Respectively. As a result, the amount of CLOCK mRNA expression started to increase within 6 hours after treatment with Agerarin, and gradually decreased after 24 hours of treatment (Fig. 8B).

또한, 아제라린(Agerarin)에 의해 증가되는 CLOCK mRNA 양을 정량적으로 측정하기 위하여 QRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 20 μg/ml 농도의 아제라린(Agerarin)을 HaCaT 세포에 처리하면 CLOCK mRNA 양은 아무 처리도 하지 않은 그룹(0 h)과 비교하여 6 시간과 12 시간 후에는 각각 2.5배와 3.8배 현저하게 증가하였고, 24시간 후에는 약간 감소하여 대조군에 비해 1.8배 증가한 것으로 나타났다(도 8C).In addition, QRT-PCR was performed to quantitatively measure the amount of CLOCK mRNA increased by agararin. As a result, when HaCaT cells were treated with 20 μg / ml of agararin, the amount of CLOCK mRNA was 2.5 times and 3.8 times greater after 6 hours and 12 hours than in the group without any treatment (0 h) , And slightly decreased after 24 hours and increased 1.8-fold compared with the control (Fig. 8C).

아제라린(Agerarin)에 의한 CLOCK 단백질의 발현량에도 변화를 주는지 확인하기 위하여 면역블롯을 수행하였다. 그 결과, HaCaT 세포에 20 μg/ml 농도의 아제라린(Agerarin)을 6, 12, 24 시간 처리하는 경우 상기 mRNA 발현량의 변화에서와 마찬가지로 6 시간 및 12시간 후에는 대조군에 비해 현저하게 증가하였고, 24시간 후에는 대조군에 비해 증가하였으나 12시간에 비해 약간 감소된 발현량을 보였다(도 8D). Immunoblotting was performed to determine whether the expression level of CLOCK protein by Agerarin was also changed. As a result, when HaCaT cells were treated with Agerarin at a concentration of 20 μg / ml for 6, 12, and 24 hours, the amount of mRNA expression was significantly increased after 6 and 12 hours compared to the control group , And increased after 24 hours compared to the control group, but slightly decreased compared to 12 hours (FIG. 8D).

따라서, 아제라린(Agerarin)은 인간 각질형성세포에서 생체시계 조절 유전자인 CLOCK 유전자 및 단백질의 발현량을 증가시켰음을 확인하였다. Therefore, Agerarin increased the expression level of CLOCK gene and protein in human keratinocytes.

실시예Example 9.  9. 아제라린(Agerarin)의Agerarin's CLOCK 유전자를 통한  Through the CLOCK gene 아쿠아포린Aquaporin -3(-3 ( AQP3AQP3 ) 유전자 발현 효과) Gene expression effect

아제라린(Agerarin)에 의한 CLOCK 유전자 발현이 직접적으로 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현과 관련되어 있는지를 알아보기 위하여 shRNA를 이용하여 CLOCK 유전자가 적게 발현되는 세포에서 아제라린(Agerarin)에 의한 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현 효과를 분석하였다.In order to investigate whether CLOCK gene expression by Agerarin is directly related to the expression of aquaporin-3 (AQP3) gene, the expression of CLOCK gene by Agerarin in a cell with low expression of CLOCK gene using shRNA 3 (AQP3) gene expression was analyzed.

CLOCK 유전자의 shRNA(shCLOCK)와 대조 shRNA(shCont)를 발현시킨 HaCaT 세포에 20 μg/ml 농도의 아제라린(Agerarin)을 6시간 처리한 후 아무 처리도 하지 않은 세포와 함께 수확한 후, 총 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 대조 shRNA(shCont)가 발현되는 세포에서는 아제라린(Agerarin)에 의해 CLOCK의 mRNA 발현량이 증가하였지만, CLOCK 유전자의 shRNA(shCLOCK)가 발현되는 세포에서는 아제라린(Agerarin)을 처리하여도 CLOCK의 mRNA 발현량이 증가되지 않았다(도 9A). 또한, QRT-PCR에서도 유사한 결과가 확인되었다(도 9B). HaCaT cells expressing CLOCK gene shRNA (shCLOCK) and control shRNA (shCont) were treated with agararin at a concentration of 20 μg / ml for 6 hours and then harvested with untreated cells. Total RNA And RT-PCR was performed. As a result, in the cells expressing the control shRNA (shCont), the amount of CLOCK mRNA expression was increased by agararin, but in the cells expressing the CLOCK gene shRNA (shCLOCK), the expression of CLOCK (Fig. 9A). Similar results were also confirmed in QRT-PCR (Fig. 9B).

아제라린(Agerarin)에 의한 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현 증가가 CLOCK 유전자에 의존하는지를 알아보기 위하여 대조 shRNA(shCont)와 CLOCK 유전자의 shRNA(shCLOCK)가 발현되는 세포에 20 μg/ml 농도의 아제라린(Agerarin)을 24시간 처리한 후 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 양을 분석하였다. To determine whether the increased expression of aquaporin-3 (AQP3) gene by Agerarin is dependent on the CLOCK gene, cells expressing shRNA (shCLOCK) with the control shRNA (shCont) and CLOCK gene were transfected with 20 μg / ml Agararin was treated for 24 hours and the amount of aquaporin-3 (AQP3) mRNA was analyzed.

RT-PCR 방법을 수행하였을 때, 대조 shRNA(shCont)가 발현되는 세포에서는 아제라린(Agerarin)에 의해 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 양이 증가하였지만, CLOCK 유전자의 shRNA(shCLOCK)가 발현되는 세포에서는 아제라린(Agerarin)을 처리하여도 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 양이 증가되지 않았다(도 9C). 또한, 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA의 발현량을 정량적으로 측정하기 위하여 QRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 대조 shRNA(shCont)가 발현되는 HaCaT 세포에서 아제라린(Agerarin)을 처리하면 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 양은 3.0배 증가하는 반면, CLOCK 유전자에 대한 shRNA(shCLOCK)가 발현되는 세포에서는 아무 처리도 하지 않은 상황에서도 아쿠아포린-3(AQP3) mRNA 양이 대조세포에 비해 40% 감소되었으며(0.6배), 아제라린(Agerarin)을 처리하여도 대조세포에 비해 1.2배 정도만 증가하였다.When the RT-PCR method was performed, the amount of aquaporin-3 (AQP3) mRNA was increased by agararin in the cells expressing the control shRNA (shCont), but the cells expressing shRNA (shCLOCK) Did not increase the amount of aquaporin-3 (AQP3) mRNA after treatment with agararin (Fig. 9C). In addition, QRT-PCR was performed to quantitatively measure the expression level of aquaporin-3 (AQP3) mRNA. As a result, treatment of agararin in HaCaT cells expressing control shRNA (shCont) increased the amount of aquaporin-3 (AQP3) mRNA 3.0-fold, whereas in cells expressing shRNA (shCLOCK) The amount of aquaporin - 3 (AQP3) mRNA was decreased by 40% (0.6 times) compared with that of control cells even when no treatment was performed, and increased by about 1.2 times compared to control cells even when treated with agararin.

따라서, 아제라린(Agerarin)은 CLOCK 유전자에 의해 아쿠아포린-3(AQP3) 유전자 발현을 증가시킨다는 사실을 확인할 수 있었다(도 10).Thus, it was confirmed that Agerarin increases the expression of aquaporin-3 (AQP3) gene by the CLOCK gene (Fig. 10).

<110> Agera BioTech <120> A novel compound for increasing the expression of Aquaporin-3 and uses thereof <130> PN1702-093 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP3 forward <400> 1 cctttggctt tgctgtcact ct 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP3 reverse <400> 2 cggggttgtt gtaggggtca 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLOCK forward <400> 3 tagggtattt gccatttga 19 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLOCK reverse <400> 4 gccaagttct cgtcgtc 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward <400> 5 acccactcct ccacctttg 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse <400> 6 ctcttgtgct cttgctggg 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP3 probe <400> 7 cccttcacga tccacccttt ca 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH probe <400> 8 cgtcgccagc cgagccacat cgc 23 <110> Agera BioTech <120> A novel compound for increasing expression of Aquaporin-3 and          uses thereof <130> PN1702-093 <160> 8 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP3 forward <400> 1 cctttggctt tgctgtcact ct 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP3 reverse <400> 2 cggggttgtt gtaggggtca 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLOCK forward <400> 3 tagggtattt gccatttga 19 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLOCK reverse <400> 4 gccaagttct cgtcgtc 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward <400> 5 acccactcct ccacctttg 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse <400> 6 ctcttgtgct cttgctggg 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP3 probe <400> 7 cccttcacga tccacccttt ca 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH probe <400> 8 cgtcgccagc cgagccacat cgc 23

Claims (12)

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물:
[화학식 1]

.A cosmetic composition for skin moisturizing comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
[Chemical Formula 1]

. 제 1 항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 6,7-디메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘인 것을 특징으로 하는 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the compound represented by Formula 1 is 6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl- 2H -chromene. 제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 아쿠아포린-3(AQP3)의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물. The method according to claim 1,
Wherein said compound increases the expression level of mucin or protein of aquaporin-3 (AQP3). 제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 CLOCK의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물. The method according to claim 1,
Wherein said compound increases the expression level of mRNA or protein of CLOCK. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]

.A pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
[Chemical Formula 1]

. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 개선 또는 치료용 피부 외용제:
[화학식 1]

.An external skin preparation for improving or treating atopic dermatitis comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
[Chemical Formula 1]

. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 개선용 화장료 조성물:
[화학식 1]

.A cosmetic composition for improving atopic dermatitis comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
[Chemical Formula 1]

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