KR101779616B1 - 키나아제의 세포-침투성 펩티드-기초된 저해물질 - Google Patents

키나아제의 세포-침투성 펩티드-기초된 저해물질 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 최소한 하나의 키나아제 효소를 저해하는 치료적 저해물질 펩티드의 치료 효과량을 포함하는 키나아제 저해 조성물, 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환을 치료하는 방법, 그리고 이들 키나아제 저해 조성물을 이용하여 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제시한다.

Description

키나아제의 세포-침투성 펩티드-기초된 저해물질{CELL-PERMEANT PEPTIDE-BASED INHIBITOR OF KINASES}
교차 참조
본 출원은 2008년 12월 10일 제출된 U.S. 가출원 61/121,396에 우선권을 주장하고, 이의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
정부 지원에 관한 진술
본 발명은 National Institutes of Health에 의해 부여된 보조금 K25HL074968 하에 정부 지원을 받아 만들어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 세포 생물학, 세포-침투성 펩티드, 세포-침투성 펩티드 조성물, 그리고 이들의 이용 방법, 그리고 단백질 조작의 방법에 관계한다.
배경기술
단백질 분자의 3-차원 형태는 이의 아미노산 서열에 의해 결정되고, 그리고 단백질의 형태의 상세는 이의 화학적 성질을 결정한다.
단백질은 일반적으로, 측쇄가 부착된 폴리펩티드 골격으로 구성된다. 아미노산의 화학적으로 상이한 측쇄의 서열은 각 단백질을 독특하게 만든다. 단백질의 접힘된 구조는 폴리펩티드 사슬의 상이한 부분, 상기 사슬의 한쪽 부분과 다른 부분 사이에 형성되는 비공유 상호작용 (가령, 수소 결합, 이온 결합, 그리고 판 데르 발스 인력)에 의해 안정화된다. 각 접힘된 형상의 안정성은 다수의 이런 비공유 결합의 통합된 힘에 의해 결정된다.
각 단백질은 4가지 수준의 구조 조직을 보유한다. 아미노산 서열은 단백질의 일차 구조이다. 이차 구조는 측쇄-주쇄와 측쇄-측쇄 수소 결합 (가령, α 나선, β-시트)의 고려 없이 골격 아미드와 카르복실 기 사이에 수소 결합의 패턴에 의해 정의된다. 폴리펩티드 사슬의 완전한 3-차원 조직인 삼차 구조는 단백질의 이차 구조의 시트와 나선이 자체적으로 접혀 3-차원 구조를 정의하는 방식이다. 사차 구조는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬의 복합체로서 형성된 단백질 분자의 완전한 구조를 지칭한다.
단백질 도메인은 서로 다소간 독립적으로 접혀 구형 밀집 구조를 형성하는 구조 단위이다. 도메인은 일반적으로, 대략 40개 내지 대략 350개 아미노산을 포함하고, 그리고 다수의 더욱 큰 단백질이 작제되는 기준 단위 (modular unit)이다. 단백질의 상이한 도메인은 종종, 상이한 기능과 연관된다. 임의의 폴리펩티드 사슬에 의해 채택되는 최종 접힘된 구조, 또는 형태는 일반적으로, 자유 에너지 (free energy)가 최소화되는 구조이다.
1. 키나아제
키나아제는 포스페이트 공여자 (일반적으로, 아데노신-5' -트리포스페이트 (ATP))로부터 수용체 기질로 포스포릴 전이 반응을 촉진하는 효소의 편재성 기이다. 비록 모든 키나아제가 본질적으로 동일한 포스포릴 전이 반응을 촉진하지만, 이들은 그들의 기질 특이성, 구조, 그리고 그들이 참여하는 경로에서 현저한 다양성을 나타낸다. 모든 가용한 키나아제 서열 (대략 60,000개 서열)의 최근 분류는 키나아제가 상동성 단백질의 25가지 집단으로 분류될 수 있음을 지시한다. 이들 키나아제 집단은 구조적 접힘 (structural fold)의 유사성에 기초하여 12가지 접힘 군으로 더욱 집합된다. 게다가, 25가지 집단 중에서 22가지(모든 서열 중에서 대략 98.8%)는 구조적 접힘이 알려져 있는 10가지 접힘 군에 속한다. 다른 3가지 집단 중에서, 폴리포스페이트 키나아제는 상이한 접힘 군을 형성하고, 그리고 나머지 2가지 집단은 둘 모두, 막관통 키나아제이고 최종 접힘 군을 포함한다. 이들 접힘 군은 가장 광범위하게 퍼져있는 단백질 접힘 중에서 일부, 예를 들면, Rossmann-유사 접힘 (위상 순서 베타-알파-베타-알파-베타로 2개의 알파 나선에 의해 연결된 3개 또는 그 이상의 평행 베타 가닥), 페러독신-유사 접힘 (골격을 따라서 기호 βαββαβ 이차 구조를 보유하는 공통의 α+β 단백질 접힘), TIM-배럴 접힘 (펩티드 골격을 따라서 교대하는 8개의 α-나선 및 8개의 평행 β-가닥으로 구성되는 보존된 단백질 접힘을 의미함), 그리고 역평행 β-배럴 접힘 (베타 배럴은 첫 번째 가닥이 마지막 가닥에 수소 결합되는 닫힌 구조가 형성되도록 뒤틀리고 감겨지는 큰 베타-시트이다) 뿐만 아니라 단백질 구조의 모든 주요 부류 (모든 α, 모든 β, α+β, α/β)를 포함한다. 접힘 군 내에서, 각 집단의 뉴클레오티드-결합 도메인의 코어는 동일한 체계 (architecture)를 갖고, 그리고 단백질 코어의 위상은 동일하거나, 또는 원순열 (circular permutation)에 의해 관련된다. 접힘 군 내에 집단 간에 상동성은 암시되지 않는다.
그룹 I (23,124개 서열) 키나아제는 단백질 S/T-Y 키나아제, 비정형 단백질 키나아제, 지질 키나아제, 그리고 ATP grasp 효소를 통합하고, 그리고 단백질 S/T-Y 키나아제, 그리고 비정형 단백질 키나아제 집단 (22,074개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 키나아제에는 콜린 키나아제 (EC 2,7.1.32); 단백질 키나아제 (EC 2.7.137); 포스포릴라아제 키나아제 (EC 2.7.1.38); 호모세린 키나아제 (EC 2,7.1.39); I-포스파티딜이노시톨 4-키나아제 (EC 2.7.1.67); 스트렙토마이신 6-키나아제 (EC 2.7.1.72); 에탄올아민 키나아제 (EC 2.7.1.82); 스트렙토마이신 3'-키나아제 (EC 2.7.1.87); 카나마이신 키나아제 (EC 2.7.1.95); 5-메틸티오리보오스 키나아제 (EC 2.7.1.100); 비오마이신 키나아제 (EC 2.7.1.103); [히드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소 (NADPH2)] 키나아제 (EC 2.7.1.109); 단백질-티로신 키나아제 (EC 2.7.1.112); [이소시트레이트 탈수소효소 (NADP+)] 키나아제 (EC 2.7.1.116); [미오신 경쇄] 키나아제 (EC 2.7.1.117); 히그로마이신-B 키나아제 (EC 2.7.1.119); 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 (EC 2.7.1.123); 로돕신 키나아제 (EC 2.7.1.125); [베타-아드레날린성-수용체] 키나아제 (EC 2.7.1.126); [미오신 중쇄] 키나아제 (EC 2.7.1.129); [Tau 단백질] 키나아제 (EC 2.7.1.135); 마크롤리드 2'-키나아제 (EC 2.7.1.136); I-포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (EC 2.7.1.137); [RNA-중합효소]-아단위 키나아제 (EC 2.7.1.141); 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나아제 (EC 2.7.1.153); 그리고 포스파티딜이노시톨-4-포스페이트 3-키나아제 (EC 2.7.1.154)가 포함된다. 그룹 I는 지질 키나아제 집단 (321개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 키나아제에는 I-포스파티딜이노시톨-4-포스페이트 5-키나아제 (EC 2.7.1.68); I D-미오-이노시톨-트리포스페이트 3-키나아제 (EC 2.7.1.127); 이노시톨-테트라키스포스페이트 5-키나아제 (EC 2.7.1.140); I-포스파티딜이노시톨-5-포스페이트 4-키나아제 (EC 2.7.1.149); I-포스파티딜이노시톨-3-포스페이트 5-키나아제 (EC 2.7.1.150); 이노시톨-폴리포스페이트 멀티키나아제 (EC 2.7.1.151); 그리고 이노시톨-헥사키포스페이트 키나아제 (EC 2.7.4.21)가 포함된다. 그룹 I는 이노시톨-테트라키스포스페이트 I-키나아제 (EC 2.7.1.134); 피루베이트, 포스페이트 디키나아제 (EC 2.7.9.1); 그리고 피루베이트, 물 디키나아제 (EC 2.7.9.2)를 비롯한 ATP-grasp 키나아제 (729개 서열)를 더욱 포함한다.
그룹 II (17,071개 서열) 키나아제는 Rossman-유사 키나아제를 포함한다. 그룹 II는 P-루프 키나아제 집단 (7,732개 서열)을 포함한다. 이들에는 글루코노키나아제 (EC 2.7.1.12); 포스포리불로키나아제 (EC 2.7.1.19); 티미딘 키나아제 (EC 2.7.1.21); 리보실니코틴아미드 키나아제 (EC 2.7.1.22); 디포스포-CoA 키나아제 (EC 2.7.1.24); 아데닐릴설페이트 키나아제 (EC 2.7.1.25); 판토테네이트 키나아제 (EC 2.7.1.33); 단백질 키나아제 (세균) (EC 2.7.1.37); 우리딘 키나아제 (EC 2.7.1.48); 시키메이트 키나아제 (EC 2.7.1.71); 디옥시시티딘 키나아제 (EC 2.7.1.74); 디옥시아데노신 키나아제 (EC 2.7.1.76); 폴리뉴클레오티드 5'-히드록실-키나아제 (EC 2.7.1.78); 6-포스포프럭토-2-키나아제 (EC 2.7.1.105); 디옥시구아노신 키나아제 (EC 2.7.1.113); 테트라아실디사카라이드 4'-키나아제 (EC 2.7.1.130); 디옥시뉴클레오시드 키나아제 (EC 2.7.1.145); 아데노실코빈아미드 키나아제 (EC 2.7.1.156); 폴리포스페이트 키나아제 (EC 2.7.4.1); 포스포메발로네이트 키나아제 (EC 2.7.4.2); 아데닐레이트 키나아제 (EC 2.7.4.3); 뉴클레오시드-포스페이트 키나아제 (EC 2.7.4.4); 구아닐레이트 키나아제 (EC 2.7.4.8); 티미딜레이트 키나아제 (EC 2.7.4.9); 뉴클레오시드-트리포스페이트-아데닐레이트 키나아제 (EC 2.7.4.10); (디옥시)뉴클레오시드-포스페이트 키나아제 (EC 2.7.4.13); 시티딜레이트 키나아제 (EC 2.7.4.14); 그리고 우리딜레이트 키나아제 (EC 2.7.4.-)가 포함된다. 그룹 II는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 집단 (815개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 효소에는 단백질 키나아제 (HPr 키나아제/포스파타아제) (EC 2.7.1.37); 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 (GTP) (EC 4.1.1.32); 그리고 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 (ATP) (EC 4.1.1.49)가 포함된다. 그룹 II는 포스포글리세르산 키나아제 집단 (1,351개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 효소에는 포스포글리세르산 키나아제 (EC 2.7.2.3)와 포스포글리세르산 키나아제 (GTP) (EC 2.7.2.10)가 포함된다. 그룹 II는 아스파르토키나아제 집단 (2,171개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 효소에는 카바메이트 키나아제 (EC 2.7.2.2); 아스파르테이트 키나아제 (EC 2.7.2.4); 아세틸글루타메이트 키나아제 (EC 2.7.2.81); 글루타메이트 5-키나아제 (EC 2.7.2.1)와 우리딜레이트 키나아제 (EC 2.7.4.-)가 포함된다. 그룹 II는 포스포프럭토키나아제-유사 키나아제 집단 (1,998개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 효소에는 6-포스포프럭토키나아제 (EC 2.7.1.11); NAD(+) 키나아제 (EC 2.7.1.23); I-포스포프럭토키나아제 (EC 2.7.1.56); 디포스페이트-프럭토오스-6-포스페이트 I-포스포트랜스퍼라아제 (EC 2.7.1.90); 스핀가닌 키나아제 (EC 2.7.1.91); 디아실글리세롤 키나아제 (EC 2.7.1.107); 그리고 세라미드 키나아제 (EC 2.7,1.138)가 포함된다. 그룹 II는 리보키나아제-유사 집단 (2,722개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 효소에는 글루코키나아제 (EC 2.7.1,2); 케토헥소키나아제 (EC 2.7.1.3); 프럭토키나아제 (EC 2.7.1.4); 6-포스포프럭토키나아제 (EC 2.7.1. 11); 리보키나아제 (EC 2.7.1.15); 아데노신 키나아제 (EC 2.7.1.20); 피리독살 키나아제 (EC 2.7.1.35); 2-디히드로-3-디옥시글루코노키나아제 (EC 2.7.1.45); 히드록시메틸피리미딘 키나아제 (EC 2.7.1.49); 히드록시에틸티아졸 키나아제 (EC 2.7.1.50); I-포스포프럭토키나아제 (EC 2.7.1.56); 이노신 키나아제 (EC 2.7.1.73); 5-디히드로-2-디옥시글루코노키나아제 (EC 2.7.1.92); 타가토오스-6-포스페이트 키나아제 (EC 2.7.1.144); ADP-의존성 포스포프럭토키나아제 (EC 2.7.1.146); ADP-의존성 글루코키나아제 (EC 2.7.1.147); 그리고 포스포메틸피리미딘 키나아제 (EC 2.7.4.7)가 포함된다. 그룹 II는 티아민 피로포스포키나아제 (EC 2.7.6.2)를 비롯한 티아민 피로포스포키나아제 집단 (175개 서열)을 더욱 포함한다. 그룹 II는 글리세르산 키나아제 (EC 2.7.1.31)를 비롯한 글리세르산 키나아제 집단 (107개 서열)을 더욱 포함한다.
그룹 III 키나아제 (10,973개 서열)는 페러독신-유사 접힘 키나아제를 포함한다. 그룹 III은 뉴클레오시드-디포스페이트 키나아제 집단 (923개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 효소에는 뉴클레오시드-디포스페이트 키나아제 (EC 2.7.4.6)가 포함된다. 그룹 III은 HPPK 키나아제 집단 (609개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 효소에는 2-아미노-4-히드록시-6-히드록시메틸디히드로프테리딘 피로포스포키나아제 (EC 2.7.6.3)가 포함된다. 그룹 III은 구아니도 키나아제 집단 (324개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 효소에는 구아니도아세테이트 키나아제 (EC 2.7.3.1); 크레아틴 키나아제 (EC 2.7.3.2); 아르기닌 키나아제 (EC 2.7.3.3); 그리고 롬브리신 키나아제 (EC 2.7.3.5)가 포함된다. 그룹 III은 히스티딘 키나아제 집단 (9,117개 서열)을 더욱 포함한다. 이들 효소에는 단백질 키나아제 (히스티딘 키나아제) (EC 2.7.1.37); [피루베이트 탈수소효소 (리포아미드)] 키나아제 (EC 2.7.1.99); 그리고 [3-메틸-2-옥시부타노에이트 탈수소효소(리포아미드)] 키나아제 (EC 2.7.1.115)가 포함된다.
그룹 IV 키나아제 (2,768개 서열)는 리보뉴클레아제 H-유사 키나아제를 통합한다. 이들 효소에는 헥소키나아제 (EC 2.7.1.1); 글루코키나아제 (EC 2.7.1.2); 프럭토키나아제 (EC 2.7.1.4); 람눌로키나아제 (EC 2.7.1.5); 만노키나아제 (EC 2.7.1.7); 글루코노키나아제 (EC 2.7.1.12); L-리불로키나아제 (EC 2.7.1.16); 자이룰로키나아제 (EC 2.7.1.17); 에리트리톨 키나아제 (EC 2.7.1.27); 글리세롤 키나아제 (EC 2.7.1.30); 판토테네이트 키나아제 (EC 2.7.1.33); D-리불로키나아제 (EC 2.7.1.47); L-푸콜로키나아제 (EC 2.7.1.51); L-자이룰로키나아제 (EC 2.7.1.53); 알로오스 키나아제 (EC 2.7.1.55); 2-디히드로-3-디옥시갈락토노키나아제 (EC 2.7.1.58); N-아세틸글루코사민 키나아제 (EC 2.7.1.59); N-아실만노사민 키나아제 (EC 2.7.1.60); 폴리포스페이트-글루코오스 포스포트랜스퍼라아제 (EC 2.7.1.63); 베타-글루코시드 키나아제 (EC 2.7.1.85); 아세테이트 키나아제 (EC 2.7.2.1); 부티레이트 키나아제 (EC 2.7.2.7); 가지형-사슬-지방산 키나아제 (EC 2.7.2.14); 그리고 프로피오네이트 키나아제 (EC 2.7.2.-)가 포함된다.
그룹 V 키나아제 (1,119개 서열)는 TIM β/α-배럴 키나아제를 통합한다. 이들 효소에는 피루베이트 키나아제 (EC 2,7.1.40)가 포함된다.
그룹 VI 키나아제 (885개 서열)는 GHMP 키나아제를 통합한다. 이들 효소에는 갈락토키나아제 (EC 2.7.1.6); 메발로네이트 키나아제 (EC 2.7.1.36); 호모세린 키나아제 (EC 2.7.1.39); L-아라비노키나아제 (EC 2.7.1.46); 푸코키나아제 (EC 2.7.1.52); 시키메이트 키나아제 (EC 2.7.1.71); 4-(시티딘 5'-디포스포)-2-C-메틸-D-에리트리올 키나아제 (EC 2.7.1.148); 그리고 포스포메발로네이트 키나아제 (EC 2.7.4.2)가 포함된다.
그룹 VII 키나아제 (1,843개 서열)는 AIR 합성효소-유사 키나아제를 통합한다. 이들 효소에는 티아민-포스페이트 키나아제 (EC 2.7.4.16)와 셀레니드, 물 디키나아제 (EC 2.7.9.3)가 포함된다.
그룹 VIII 키나아제 (565개 서열)는 리보플라빈 키나아제 (565개 서열)를 통합한다. 이들 효소에는 리보플라빈 키나아제 (EC 2.7.1.26)가 포함된다.
그룹 IX 키나아제 (197개 서열)는 디히드록시아세톤 키나아제를 통합한다. 이들 효소에는 글리세론 키나아제 (EC 2.7.1.29)가 포함된다.
그룹 X 키나아제 (148개 서열)는 추정 글리세르산 키나아제를 통합한다. 이들 효소에는 글리세르산 키나아제 (EC 2.7.1.31)가 포함된다.
그룹 XI 키나아제 (446개 서열)는 폴리포스페이트 키나아제를 통합한다. 이들 효소에는 폴리포스페이트 키나아제 (EC 2.7.4.1)가 포함된다.
그룹 XII 키나아제 (263개 서열)는 막관통 키나아제를 통합한다. 그룹 XII는 돌리콜 키나아제 집단을 포함한다. 이들 효소에는 돌리콜 키나아제 (EC 2.7.1.108)이 포함된다. 그룹 XII는 언데카프레놀 키나아제 집단을 더욱 포함한다. 이들 효소에는 언데카프레놀 키나아제 (EC 2.7.1.66)가 포함된다.
키나아제는 다수의 세포 물질대사와 신호전달 경로에서 필수적인 역할을 수행하고, 그리고 이들은 구조적 수준, 생화학적 수준, 그리고 세포 수준에서 가장 많이 연구된 효소들이다. 모든 키나아제가 동일한 포스페이트 공여자 (대부분의 경우에, ATP)를 이용하고 겉보기에 동일한 포스포릴 전이 반응을 촉진한다는 사실에도 불구하고, 이들은 그들의 구조적 접힘과 기질 인식 기전에서 현저한 다양성을 나타낸다. 이는 아마도, 그들의 기질의 구조와 특성의 극히 다양한 성질에 상당 부분 기인한다.
2. 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제 (MK2와 MK3)
MAPK-활성화된 단백질 키나아제 (MAP-KAPK)의 상이한 기는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제 (MAPK)의 하류로 정의되었다. 이들 효소는 MAPK의 직접적인 기질이 아닌 표적 단백질에 신호를 전달하고, 따라서 MAPK 캐스케이드에 따른 인산화-의존성 신호전달을 다양한 세포 기능에 중계하는 역할을 한다. 이들 기 중에서 하나는 3가지 MAPKAPK: MK2, MK3 (일명, 3pK), 그리고 MK5 (일명, PRAK)에 의해 형성된다. 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제 2 (일명, "MAPKAPK2", "MAPKAP-K2", "MK2")는 세린/트레오닌 (Ser/Thr) 단백질 키나아제 집단의 키나아제이다. MK2는 MK3에 고도로 상동성이다 (대략 75% 아미노산 동일성). MK2와 MK3의 키나아제 도메인은 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 (CaMK), 포스포릴라아제 b 키나아제, 그리고 리보솜 S6 키나아제 (RSK) 동종형의 C-말단 키나아제 도메인 (CTKD)에 가장 유사하였다 (대략 35% 내지 40% 동일성). mk2 유전자는 370개 아미노산 (MK2A)과 400개 아미노산 (MK2B)의 2개의 선택적으로 절단접합된 전사체를 인코딩한다. mk3 유전자는 382개 아미노산의 1개 전사체를 인코딩한다. MK2-와 MK3 단백질은 고도로 상동성이지만, MK2A가 더욱 짧은 C-말단 영역을 보유한다. MK2B의 C-말단은 더욱 짧은 MK2A 동종형 내에 존재하지 않는 기능적 2부(部) 핵 국지화 서열 (NLS) (Lys-Lys-Xaa10-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys) (SEQ ID NO: 45)을 포함하는데, 이는 선택적 절단접합 (alternative splicing)이 MK2 동종형의 세포 국지화를 결정한다는 것을 지시한다. MK3은 유사한 핵 국지화 서열을 보유한다. MK2B와 MK3 둘 모두에서 관찰되는 핵 국지화 서열은 여러 연구에서 MK2B와 MK3의 p38α와 p38β와의 특정한 상호작용을 매개하는 것으로 밝혀진 D 도메인 (Leu-Leu-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys) (SEQ ID NO: 46)을 포함한다. MK2B와 MK3은 또한, NLS와 D 도메인의 N-말단에 위치하는 기능적 핵 이출 신호 (NES)를 보유한다. MK2B 내에서 NES는 자극 이후에 핵 이출 (nuclear export)을 유인할 만큼 충분하고, 이러한 과정은 렙토마이신 B에 의해 저해될 수 있다. MK2와 MK3 내에서 촉매성 도메인의 N-말단에서 서열은 프롤린이 풍부하고 1개 (MK3) 또는 2개 (MK2) 추정 Src 상동성 3 (SH3) 도메인-결합 부위를 포함하며, 이들 연구는 MK2가 시험관내에서 c-Ab1의 SH3 도메인에 결합을 매개한다는 것을 증명하였다. 최근의 연구 결과는 이러한 도메인이 MK2-매개된 세포 이동에 관여하다는 것을 암시한다.
MK2B와 MK3은 주로, 무활동 세포의 핵 내에 위치하는 반면, MK2A는 세포질 내에 존재한다. 양쪽 MK2B와 MK3은 스트레스 자극 시에 염색체 영역 유지 단백질 (CRM1)-의존성 기전을 통해 세포질로 빠르게 이출된다. MK2B의 핵 이출은 키나아제 활성화에 의해 매개되는 것으로 생각되는데, 그 이유는 키나아제의 활성화 루프 내에서 Thr334의 인산화모방성 돌연변이가 MK2B의 세포질 국지화를 강화시키기 때문이다. 이론에 한정됨 없이, MK2B와 MK3은 구조적으로 활성 NLS와 인산화-조절된 NES를 포함하는 것으로 생각된다.
MK2와 MK3은 편재성으로 발현되는 것으로 보이는데, 이러한 발현은 심장, 골격근, 그리고 신장 조직에서 우세하다.
2.1. 활성화
p38α와 p38β의 다양한 활성인자는 MK2와 MK3 활성을 강하게 자극한다. p38은 4개의 프롤린-지향된 부위: Thr25, Thr222, Ser272, 그리고 Thr334에서 MK2의 시험관내와 생체내 인산화를 매개한다. 이들 부위 중에서, Thr25만 MK3에서 보존되지 않는다. 이론에 한정됨 없이, 인산화된 Thr25의 기능이 알려져 있진 않지만, 2개의 SH3 도메인-결합 부위 사이에 이의 위치는 인산화된 Thr25가 단백질-단백질 상호작용을 조절할 수 있다는 것을 암시한다. MK2 내에서 Thr222 (MK3 내에서 Thr201)는 키나아제 도메인의 활성화 루프 내에 위치하고, 그리고 MK2와 MK3 키나아제 활성에 필수적인 것으로 밝혀졌다. MK2 내에서 Thr334 (MK3 내에서 Thr313)는 촉매성 도메인의 C-말단에 위치하고 키나아제 활성에 필수적이다. MK2의 결정 구조는 분석되었고, 그리고 이론에 한정됨 없이, Thr334 인산화가 MK2 핵 이입과 이출을 위한 스위치로서 기능한다는 것을 암시한다. Thr334의 인산화는 또한, 촉매성 도메인에 MK2의 C 말단의 결합을 약화시키거나 차단하여, NES을 노출시키고 핵 이출을 증진할 수 있다.
p38이 핵 내에서 MK2와 MK3을 활성화시킬 수 있긴 하지만, 실험 증거가 MK2와 MK3의 활성화와 핵 이출이 p38 안정화와 국지화를 유발하는 인산화-의존성 형태 스위치에 의해 결합되고, 그리고 p38 자체의 세포 위치가 MK2와 아마도, MK3에 의해 조절된다는 것을 암시하는 것으로 여러 연구에서 밝혀졌다. 다른 연구에서 핵 p38이 MK2의 인산화와 활성화 이후에 MK2와의 복합체로 세포질 내로 이출되는 것으로 밝혀졌다. p38과 MK2 사이에 이러한 상호작용은 p38 안정화에 중요할 수 있는데, 그 이유는 여러 연구 결과에서 p38 수준이 MK2-결함성 세포에서 낮고 촉매적으로 비활성 MK2 단백질의 발현이 p38 수준을 복원하는 것으로 지시되기 때문이다.
2.2. 기질과 기능
MK2는 MK3과 많은 기질을 공유한다. 양쪽 효소는 비교되는 기질 선호를 갖고, 그리고 유사한 동역학적 상수 (kinetic constant)로 펩티드 기질을 인산화시킨다. MK2에 의한 효율적인 인산화에 요구되는 최소 서열은 Hyd-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-pSer/Thr인 것으로 밝혀졌고, 여기서 Hyd는 부피가 큰 소수성 잔기이다.
실험 증거는 사이토킨 생합성과 세포 이동의 조절에서 p38에 대한 역할을 뒷받침한다. 생쥐에서 mk2 유전자의 표적화된 결실은 비록 p38이 많은 유사한 키나아제의 활성화를 매개하긴 하지만, MK2가 이들 p38-의존성 생물학적 과정을 주도하는 핵심적인 키나아제인 것으로 보인다는 것을 암시하였다. MK2의 상실은 (i) 사이토킨, 예를 들면, 종양 괴사 인자 알파 (TNFα), 인터류킨-6 (IL-6), 그리고 감마 인터페론 (IFN-γ)의 리포폴리사카라이드 (LPS)-유도된 합성에서 결함, 그리고 (ii) 생쥐 배아 섬유아세포, 평활근 세포, 그리고 호중구의 이동에서 변화를 유발하였다. 염증성 반응에서 MK2에 대한 역할과의 모순 없이, MK2-결함성 생쥐는 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 감염에 대한 증가된 감수성, 그리고 국소 허혈 이후에 감소된 염증-매개된 뉴런 사멸을 보였다. p38 단백질의 수준 역시 MK2-결함성 세포에서 현저하게 감소되기 때문에, 이들 표현형이 MK2의 상실에만 기인하는 지를 식별하는 것이 필요하였다. 이를 달성하기 위하여, MK2 돌연변이체가 MK2-결함성 세포에서 발현되고, 그리고 이의 결과는 MK2의 촉매성 활성이 p38 수준을 복원하는데 필수적이진 않지만 사이토킨 생합성을 조절하기 위하여 요구된다는 것을 지시하였다.
2.3. mRNA 번역의 조절
여러 연구에서 MK2는 이의 mRNA의 번역 속도를 증가시킴으로써 TNFα 생산을 증가시키는 것으로 밝혀졌다; TNFα의 전사, 가공, 그리고 흘림 (shedding)에서 유의미한 감소는 MK2-결함성 생쥐에서 검출되지 않았다. p38 경로는 mRNA 안정성의 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 그리고 MK2는 p38이 이러한 기능을 매개하게 되는 가능 표적을 대표한다. MK2-결함성 생쥐를 이용한 연구는 MK2의 촉매성 활성이 사이토킨 생산과 이동에 대한 이의 효과에 필요하다는 것을 지시하였고, 이는 이론에 한정됨 없이, MK2가 mRNA 안정성에 관여하는 표적을 인산화시킨다는 것을 암시한다. 이와 일관되게, MK2는 이질성 핵 리보뉴클레오단백질 (hnRNP) AO, 트리스테트라프롤린, 폴리(A)-결합 단백질 PABP1, 그리고 HuR (RNA-결합 단백질의 elav (노랑초파리 (Drosophila melanogaster) 내에서 embryonic-lethal abnormal visual) 집단의 편재성으로 발현된 구성원)에 결합하고 및/또는 이들을 인산화시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 기질은 3' 비번역 영역 내에 AU-풍부한 성분을 포함하는 mRNA에 결합하거나, 또는 이러한 mRNA와 동시정화되는 것으로 알려져 있고, 이는 MK2가 AU-풍부한 mRNA, 예를 들면, TNFα의 안정성을 조절할 수 있다는 것을 암시한다. MK3이 유사한 기능을 수행하는 지는 현재 알려져 있지 않지만, MK2-결함성 섬유아세포의 LPS 처리는 hnRNP AO 인산화를 완전하게 소멸시키고, 이는 MK3이 MK2의 상실을 보충할 수 없다는 것을 암시한다.
MK3은 MK2와 함께, 진핵생물 신장 인자 (eukaryotic elongation factor 2, eEF2) 키나아제의 인산화에 참여한다. eEF2 키나아제는 eEF2를 인산화시키고 비활성화시킨다. eEF2 활성은 번역 동안 mRNA의 신장에 결정적이고, 그리고 Thr56 상에서 eEF2의 인산화는 mRNA 번역의 종결을 유발한다. Ser377 상에서 eEF2 키나아제의 MK2와 MK3 인산화는 이들 효소가 eEF2 키나아제 활성을 조정하고, 따라서 mRNA 번역 신장을 조절할 수 있다는 것을 암시한다.
2.4. MK2와 MK3에 의한 전사 조절.
많은 MK와 유사하게 핵 MK2는 cAMP 반응 요소 결합 (CREB), 혈청 반응 인자 (SRF), 그리고 전사 인자 ER81의 인산화에 기여한다. 야생형과 MK2-결함성 세포의 비교는 MK2가 스트레스에 의해 유도된 주요 SRF 키나아제임을 확인시키고, 스트레스-매개된 극초기 반응에서 MK2에 대한 일정한 역할을 암시한다. MK2와 MK3 둘 모두 생체내에서 염기성 나선-루프-나선 전사 인자 E47과 상호작용하고 시험관내에서 E47을 인산화시킨다. E47의 MK2-매개된 인산화는 E47의 전사 활성을 억제하고, 따라서 E47-의존성 유전자 발현을 저해하는 것으로 밝혀졌고, 이는 MK2와 MK3이 조직-특이적인 유전자 발현과 세포 분화를 조절한다는 것을 암시하였다.
2.5. MK2와 MK3의 다른 표적.
여러 생물학적 과정에서 MK2와 MK3의 다양한 기능을 반영하듯, 여러 다른 MK2와 MK3 기질 역시 확인되었다. 스캐폴딩 (scaffolding) 단백질 14-3-3ζ는 생리학적 MK2 기질이다. 여러 연구에서 14-3-3ζ는 단백질 키나아제, 포스파타아제, 그리고 전사 인자를 비롯한 세포 신호전달 경로의 다수의 성분과 상호작용하는 것으로 지시된다. 추가의 연구에서 Ser58 상에서 14-3-3ζ의 MK2-매개된 인산화는 이의 결합 활성을 약화시키는 것으로 증명되고, 이는 MK2가 통상적으로 14-3-3ζ에 의해 조절되는 여러 신호전달 분자의 조절에 영향을 줄 수 있다는 것을 암시한다.
추가 연구에서 MK2는 또한, Ser77 상에서 7개-구성원 Arp2와 Arp3 복합체 (p16-Arc)의 p16 아단위와 상호작용하고 이를 인산화시키는 것으로 밝혀졌다. p166-Arc는 액틴 세포골격 (actin cytoskeleton)의 조절에서 일정한 역할을 하고, 이는 MK2가 이러한 과정에 관여할 수 있다는 것을 암시한다. 진전된 연구에서 소형 열 충격 단백질 HSP27, 림프구-특이적 단백질 LSP-1, 그리고 비멘틴은 MK2에 의해 인산화되는 것으로 밝혀졌다. HSP27은 특히 주목되는데, 그 이유는 HSP27이 분자 샤프롱 (molecular chaperone)으로서 기능하고 열 충격과 산화 스트레스로부터 세포를 보호하는 큰 올리고머를 형성하기 때문이다. 인산화 이후, HSP27은 큰 올리고머를 형성하는 능력을 상실하고 액틴 중합화를 차단할 수 없는데, 이는 HSP27의 MK2-매개된 인산화가 그렇지 않으면, 스트레스 동안 불안정화되는 액틴 동역학을 조절하는 것을 목적으로 하는 항상성 기능을 수행한다는 것을 암시한다. MK3은 또한, 시험관내와 생체내에서 HSP27을 인산화시키는 것으로 밝혀지긴 했지만 스트레스 조건 동안 이의 역할은 아직 밝혀지지 않았다.
MK2와 MK3은 또한, 5-리폭시게나아제를 인산화시킬 수 있다. 5-리폭시게나아제는 염증성 매개인자 류코트리엔의 형성에서 최초 단계를 촉진한다. 티로신 히드록실라아제, 글리코겐 신타아제, 그리고 Akt 역시 MK2에 의해 인산화되는 것으로 밝혀졌다. 최종적으로, MK2는 Serl210 상에서 종양 억제자 단백질 투베린을 인산화시켜 14-3-3에 대한 도킹 부위를 발생시킨다. 투베린과 하마르틴은 통상적으로, mTOR-의존성 신호전달을 중화시킴으로써 세포 성장을 음성적으로 조절하는 기능적 복합체를 형성하고, 이는 MK2의 p38-매개된 활성화가 투베린에 14-3-3 결합을 증가시킴으로써 세포 성장을 조절할 수 있다는 것을 암시한다.
3. 키나아제 저해
진핵생물 단백질 키나아제는 그들의 촉매성 도메인에 의하여 관련되는 상동성 단백질의 최대 집단 중에서 하나를 구성한다. 가장 관련된 단백질 키나아제는 세린/트레오닌 또는 티로신 인산화에 특이적이다. 단백질 키나아제는 세포외 자극에 대한 세포 반응에서 필수적인 역할을 수행한다. 따라서 단백질 키나아제의 자극은 신호 전달 시스템에서 가장 공통의 활성화 기전 중의 하나인 것으로 간주된다. 많은 기질은 복합 단백질 키나아제에 의한 인산화를 겪는 것으로 알려져 있다. 다양한 단백질 키나아제의 촉매성 도메인의 일차 서열에 관한 상당한 양의 정보가 공개되었다. 이들 서열은 ATP 결합, 촉매, 그리고 구조 일체성 (structural integrity)의 유지에 관여하는 다수의 잔기를 공유한다. 대부분의 단백질 키나아제는 충분히 보존된 30-32 kDa 촉매성 도메인을 보유한다.
여러 연구에서 단백질 키나아제의 조절 요소를 확인하고 이용하려는 시도가 있었다. 이들 조절 요소에는 저해물질, 항체, 그리고 차단 펩티드가 포함된다.
3.1. 저해물질
효소 저해물질은 효소에 결합하여 효소 활성을 감소시키는 분자이다. 저해물질의 결합은 기질이 효소의 활성 부위로 들어가는 것을 중단시키고 및/또는 효소가 반응을 촉진하는 것을 방해할 수 있다. 저해물질 결합은 가역적 또는 비가역적이다. 비가역적 저해물질은 통상적으로, 효소와 반응하고 이를 화학적으로 변화시켜 (가령, 효소 활성에 요구되는 핵심 아미노산 잔기를 변형함으로써), 효소가 반응을 더 이상 촉진할 수 없도록 한다. 대조적으로, 가역적 저해물질은 비-공유적으로 결합하고, 그리고 이들 저해물질이 효소, 효소-기질 복합체, 또는 둘 모두에 결합하는 지에 따라 상이한 유형의 저해가 발생된다.
효소 저해물질은 종종, 그들의 특이성과 효능에 의해 평가된다. 본 명세서에서, 용어 "특이성"은 저해물질의 선별적 부착 또는 다른 단백질에 결합의 부재를 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 "효능"은 저해물질의 해리 상수 (dissociation constant)를 지칭하고, 이는 효소를 저해하는데 필요한 저해물질의 농도를 지시한다.
단백질 키나아제의 저해물질은 단백질 키나아제 활성 조절에서 도구로서 이용이 조사되었다. 저해물질은 예로써, 사이클린-의존성 (Cdk) 키나아제, MAP 키나아제, 세린/트레오닌 키나아제, Src 집단 단백질 티로신 키나아제, 티로신 키나아제, 칼모듈린 (CaM) 키나아제, 카세인 키나아제, 체크포인트 키나아제 (CHK1), 글리코겐 신타아제 키나아제 3 (GSK-3), c-Jun N-말단 키나아제 (JNK), 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제 1 (MEK), 미오신 경쇄 키나아제 (MLCK), 단백질 키나아제 A, Akt (단백질 키나아제 B), 단백질 키나아제 C, 단백질 키나아제 G, 단백질 티로신 키나아제, Raf 키나아제, 그리고 Rho 키나아제와 함께 이용이 조사되었다.
3.2. 항체
항체는 혈청 단백질이고, 이들의 분자는 그들의 표적 상에 작은 화학적 기들에 상보적인 그들의 표면 상에 작은 부위를 보유한다. 이들 상보적인 영역 (항체 결합 부위 또는 항원 결합 부위로 지칭됨)은 항원 (항원성 결정인자 또는 에피토프) 상에서 그들의 상응하는 상보적인 영역과 반응하여 다가 항원의 여러 분자를 서로 연결하고 격자를 형성하고, 이들 상보적인 영역 중에서 항체 분자당 최소한 2개, 그리고 일부 유형의 항체 분자에서 10개, 8개, 또는 일부 종에서 많게는 12개가 존재한다.
완전 항체 분자의 기본 구조 단위는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 2개의 동일한 경쇄 (L) (각각은 대략 220개 아미노산을 포함) 및 2개의 동일한 중쇄 (H) (각각은 통상적으로, 대략 440개 아미노산을 포함)로 구성된다. 이들 2개의 중쇄와 2개의 경쇄는 비공유와 공유 (이황화) 결합의 조합에 의해 서로 묶여진다. 상기 분자는 2개의 동일한 절반으로 구성되고, 각각은 경쇄의 N-말단 영역 및 중쇄의 N-말단 영역으로 구성되는 동일한 항원-결합 부위를 보유한다. 경쇄와 중쇄 둘 모두 통상적으로, 협력하여 항원 결합 표면을 형성한다.
인간 항체는 2가지 종류의 경쇄, κ와 λ를 보인다; 면역글로불린의 개별 분자는 일반적으로, 단지 한쪽 또는 다른 쪽이다. 정상적인 혈청에서, 이들 분자 중에서 60%는 κ 결정인자를 갖고 30%는 λ 결정인자를 갖는 것으로 밝혀졌다. 많은 다른 종은 2가지 종류의 경쇄를 보이는 것으로 밝혀지긴 했지만 그들의 비율이 변한다. 가령, 생쥐와 쥐에서, λ 사슬은 전체 중에서 단지 %만을 구성한다; 개와 고양이에서, κ 사슬은 매우 적다; 말은 κ 사슬을 갖는 것으로 보이지 않는다; 토끼는 종족 및 b-좌위 알로타입 (allotype)에 따라서, 5 내지 40% λ를 보유할 수 있다; 그리고 닭 경쇄는 κ보다 λ에 더욱 상동성이다.
포유동물에서, 5가지 부류의 항체, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 그리고 IgM이 존재하고, 각각은 자체 부류의 중쇄 - α (IgA의 경우), δ (IgD의 경우), ε (IgE의 경우), γ (IgG의 경우), 그리고 μ (IgM의 경우)를 보유한다. 이에 더하여, 각각 γ1, γ2, γ3, 그리고 γ4 중쇄를 보유하는 IgG 면역글로불린 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 4가지 하위부류가 존재한다. 분비된 형태에서, IgM은 5개의 4개-사슬 단위로 구성되는 펜타머이고, 여기에서 총 10개의 항원 결합 부위가 제공된다. 각 펜타머는 J 사슬의 1개 사본을 포함하고, 이는 2개의 인접하는 꼬리 영역 사이에 공유 삽입된다.
5가지 면역글로불린 부류 모두 그들이 넓은 범위의 전기영동 이동도 (electrophoretic mobility)를 보이고 상동성이 아니라는 점에서, 다른 혈청 단백질과 상이하다. 이러한 이질성 - 개별 IgG 분자들이 예로써, 순 전하 (net charge)에서 서로 상이하다 -은 이들 면역글로불린의 본질적인 특성이다.
단일클론 항체 (mAb)는 면역화된 공여자로부터 생쥐 비장 세포를 생쥐 골수종 세포주와 융합하여 선별적 배지에서 성장하는 확립된 생쥐 하이브리도마 클론을 산출함으로써 생산될 수 있다. 하이브리도마 세포는 항체-분비 B 세포의 골수종 세포와의 시험관내 융합으로부터 발생하는 영속화된 하이브리드 세포이다. 배양 중인 항원-특이적 B 세포의 일차 활성화를 지칭하는 시험관내 면역화는 생쥐 단일클론 항체를 생산하는 다른 널리-확립된 수단이다.
말초혈 림프구로부터 면역글로불린 중쇄 (VH)와 경쇄 (Vκ와 Vλ) 가변 유전자의 상이한 라이브러리는 또한, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 증폭될 수 있다. 중쇄와 경쇄 가변 도메인이 폴리펩티드 스페이서 (단일 사슬 Fv 또는 scFv)에 의해 연결되는 단일 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 유전자는 PCR을 이용하여 중쇄와 경쇄 V-유전자를 무작위로 결합시킴으로써 만들어질 수 있다. 이후, 조합 라이브러리 (combinatorial library)가 파지 (phage)의 끝에서 소량 외피 단백질에 융합에 의해 섬유상 박테리오파지의 표면 상에 전시를 위하여 클로닝될 수 있다.
인도된 선택의 기술은 설치류 면역글로불린 V 유전자와 뒤섞이는 인간 면역글로불린 V 유전자에 기초된다. 상기 방법은 (i) 인간 λ 경쇄의 레퍼토리를 목적되는 항원과 반응성인 생쥐 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역 (VH) 도메인과 뒤섞는 단계; (ii) 상기 항원 상에서 절반-인간 Fab를 선택하는 단계; (iii) 선택된 λ 경쇄 유전자를 이차 뒤섞기에서 인간 중쇄의 라이브러리에 대한 "도킹 도메인"으로서 이용하여 인간 경쇄 유전자를 보유하는 클론 Fab 단편을 분리하는 단계; (v) 전기천공에 의해, 상기 유전자를 내포하는 포유동물 세포 발현 벡터로 생쥐 골수종 세포를 형질감염시키는 단계; 그리고 (vi) 상기 항원과 반응성인 Fab의 V 유전자를 생쥐 골수종 내에서 완전 IgG1, λ 항체 분자로서 발현하는 단계를 수반한다.
본 명세서에서, 용어 "항체"는 예로써, 자연 발생과 비-자연 발생 항체 둘 모두를 포함한다. 구체적으로, 용어 "항체"는 다중클론 항체와 단일클론 항체, 그리고 이들의 단편을 포함한다. 게다가, 용어 "항체"는 키메라 항체와 완전 합성 항체, 그리고 이들의 단편을 포함한다.
항원성 결정인자 또는 에피토프는 분자 상에서 항원성 부위이다. 순차적 항원성 결정인자/에피토프는 본질적으로, 선형 사슬이다. 정연한 구조, 예를 들면, 나선 중합체 또는 단백질에서, 항원성 결정인자/에피토프는 본질적으로, 서로 가까워질 수 있는, 분자의 상이한 부분으로부터 아미노산 측쇄를 포함하는 구조의 표면 내에 또는 표면 상에 한정된 영역 또는 조각 (patch)일 것이다. 이들은 형태 결정인자이다. 본 명세서에서, 에피토프는 키나아제 저해 펩티드 상에 항원성 결정인자/항원 결합 부위일 수 있다. 에피토프는 일차, 이차, 또는 상관된 삼차-서열일 수 있다.
자물쇠에 열쇠의 맞춤과 종종 비교되는 상보성 (complementarity)의 원리는 2개의 반응 분자가 서로에 매우 가깝게, 그리고 한쪽 분자의 돌출 구성 원자 또는 원자 군이 다른 분자에서 상보적인 함몰 또는 오목 내로 맞춤될 수 있을 만큼 실제로 가깝게 접근할 수 있을 때에만 효과적으로 작용할 수 있는 상대적으로 약한 결합력 (소수성과 수소 결합, 판 데르 발스 힘, 그리고 이온 상호작용)을 필요로 한다. 항원-항체 상호작용은 높은 정도의 특이성을 보이는데, 이는 많은 수준에서 명백하다. 분자 수준에서, 특이성은 항원에 항체의 결합 부위가 관계없는 항원의 항원성 결정인자와 전혀 유사하지 않은 상보성을 갖는다는 것을 의미한다. 2가지 상이한 항원의 항원성 결정인자가 상당한 구조적 유사성을 갖는 경우에, 다른 결정인자에 대한 일부 항체의 결합 부위 내로 한쪽 결정인자의 상당한 정도의 맞춤이 발생하고, 그리고 이러한 현상은 교차-반응을 발생시킨다. 교차 반응은 항원-항체 반응의 상보성 또는 특이성을 이해하는데 매우 중요하다. 면역학적 특이성 또는 상보성은 항원 사이에 소량의 불순물/오염의 검출을 가능하게 만든다.
일정한 항체와 단백질 키나아제 사이에 상호작용의 특이성은 단백질 키나아제 활성 조절에서 이용이 조사되었다. 항체는 예로써, MAP 키나아제 경로, 단백질 키나아제 A, 단백질 키나아제 B, 단백질 키나아제 G, 세린/트레오닌 키나아제, 글리코겐-신타아제 키나아제-3 (GSK-3), 스트레스-활성화된 단백질 (SAP) 키나아제 경로, 그리고 티로신 키나아제와 함께 이용을 위하여 분리되었다. 부가적으로, 항체는 단백질 키나아제 저해물질 및 단백질 키나아제 기질과 함께 이용을 위하여 분리되었다.
3.3. 차단 펩티드
펩티드는 2개 또는 그 이상의 아미노산의 사슬로 구성되는 화학적 화합물이고, 여기서 사슬 내에서 한쪽 아미노산의 카르복실 기가 펩티드 결합을 통해 다른 아미노산의 아미노 기에 연결된다. 펩티드는 특히, 단백질 구조와 기능의 연구에 이용된다. 합성 펩티드는 특히, 단백질-펩티드 상호작용이 발생하는 지를 살펴보기 위한 프로브로서 이용될 수 있다. 저해 펩티드는 특히, 단백질 키나아제, 암 단백질 및 기타 질환의 저해에 대한 펩티드의 효과를 조사하기 위한 임상 연구에 이용될 수 있다.
여러 차단 펩티드의 이용이 조사되었다. 가령, MAPK 단백질 키나아제인 세포외 신호-조절된 키나아제 (ERK)는 세포 증식과 분화에 필수적이다. MAPK의 활성화는 캐스케이드 기전을 필요로 하고, 여기서 MAPK는 상류 MAPKK (MEK)에 의해 인산화되고, 이는 이후 차례로, 세 번째 키나아제 MAPKKK (MEKK)에 의해 인산화된다. ERK 저해 펩티드는 ERK에 결합에 의해 MEK 미끼로서 기능한다. 이는 MEK1의 아미노-말단 13개 아미노산 (GMPKKKPTPIQLN) [SEQ ID NO: 1]을 포함하고 ERK에 결합한다. 이는 MEK에 의한 ERK 활성화를 차단하는데, 그 이유는 ERK가 MEK와 상호작용할 수 없기 때문이다. ERK 저해 펩티드는 또한, 상기 펩티드를 세포 침투성으로 만드는, 안테나피디어 (Antennapedia)로부터 유래된 단백질 형질도입 (PTD) 서열 (DRQIKIWFQNRRMKWKK) [SEQ ID NO: 2]을 포함한다.
다른 차단 펩티드에는 오토캄티드 (autocamtide)-2 관련된 저해 펩티드 (AIP)가 포함된다. 이러한 합성 펩티드는 Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II (CaMKII)의 고도로 특이적이고 강력한 저해물질이다. AIP는 CaMKII에 대한 고도로 선별적 펩티드 기질인 오토캄티드-2의 비-인산화가능 유사체이다. AIP는 CaMKII를 100 nM의 IC50으로 저해한다 (IC50은 50% 저해를 획득하기 위하여 요구되는 저해물질의 농도이다). AIP 저해는 syntide-2 (CaMKII 펩티드 기질)와 ATP에 대하여 비-경쟁적이지만 오토캄티드-2에 대하여 경쟁적이다. 이러한 저해는 Ca2+/칼모듈린의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받지 않는다. CaMKII 활성은 AIP (1 μM)에 의해 경쟁적으로 저해되는 반면, PKA, PKC와 CaMKIV는 영향을 받지 않는다. AIP의 아미노산 서열은 KKALRRQEAVDAL (Lys-Lys-Ala-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Val-Asp-Ala-Leu) [SEQ ID NO: 3]이다.
다른 차단 펩티드에는 세포 분열 단백질 키나아제 5 (Cdk5) 저해 펩티드 (CIP)가 포함된다. Cdk5는 p25와 결합할 때, 알츠하이머병-특이적 포스포-에피토프에서 미세소관 단백질 tau를 인산화시킨다. p25는 절두된 활성인자인데, 이는 아밀로이드 β (A↓) 펩티드에 노출 시에 생리학적 Cdk5 활성인자 p35로부터 생산된다. CIP로 뉴런 감염 시에, CIP는 p25/Cdk5 활성을 선별적으로 저해하고 피질 뉴런 내에서 비정상 tau 인산화를 억제한다. CIP가 보여주는 특이성에 대한 이들 이유는 완전하게 이해되지 못하고 있다.
추가의 차단 펩티드가 세포외-조절된 키나아제 2 (ERK2), ERK3, p38/HOG1, 단백질 키나아제 C, 카세인 키나아제 II, Ca2+/칼모듈린 키나아제 IV, 카세인 키나아제 II, Cdk4, Cdk5, DNA-의존성 단백질 키나아제 (DNA-PK), 세린/트레오닌-단백질 키나아제 PAK3, 포스포이노시티드 (PI)-3 키나아제, PI-5 키나아제, PSTAIRE (cdk 고도로 보존된 서열), 리보솜 S6 키나아제, GSK-4, 배심 (germinal center) 키나아제 (GCK), SAPK (스트레스-활성화된 단백질 키나아제), SEK1 (스트레스 신호전달 키나아제), 그리고 국소 유착 키나아제 (FAK)에 대하여 조사되었다.
3.4. 단백질 형질도입 도메인
단백질 형질도입 도메인 (PTD)은 포유동물 세포의 원형질 막 (plasma membrane)을 침투하고 다양한 유형과 분자량의 화합물을 상기 막을 넘어서 수송할 수 있는 일 부류의 펩티드이다. 이들 화합물에는 작동체 분자, 예를 들면, 단백질, DNA, 접합된 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 그리고 소형 입자, 예를 들면, 리포좀이 포함된다. PTD가 다른 단백질에 화학적으로 연결되거나 융합될 때, 결과의 융합 단백질은 여전히 세포에 들어갈 수 있다. 비록 형질도입의 정확한 기전이 알려져 있진 않지만, 이들 단백질의 내재화는 수용체-매개된 또는 수송체-매개된 것으로 생각되지 않는다. PTD는 일반적으로, 10-16개 아미노산 길이를 갖고 그들의 조성, 예를 들면, 아르기닌 및/또는 리신이 풍부한 펩티드에 따라 분류될 수 있다.
작동체 분자를 세포 내로 수송할 수 있는 PTD의 이용은 이들이 화물 분자의 세포 유입을 촉진하기 때문에, 약물의 설계에서 더욱 매력적으로 부상하고 있다. 이들 세포-침투 펩티드는 일반적으로, 그들의 서열에 따라 친양쪽성 (극성과 비극성 단부를 모두 보유) 또는 양이온성으로 분류되고 거대분자에 대한 비-침해성 전달 기술을 제공한다. PTD는 또한, "Trojan 펩티드", "막 투과 서열", 또는 "세포 침투성 단백질" (CPP)로서 지칭된다. PTD는 또한, 신규한 HSP27 키나아제 저해물질이 세포 막을 침투하도록 보조하는데 이용될 수 있다 (참조: U.S. Application Ser. No. 11/972,459, "Polypeptic Inhibitors of HSP27 Kinase and Uses Thereof," 2008년 1월 10일 제출됨, 그리고 Ser. No. 12/188,109, "Kinase Inhibitors and Uses Thereof," 2008년 8월 7일 제출됨).
3.4.1. 바이러스 PTD 포함 단백질
형질도입 특성을 갖는 것으로 기술되는 첫 번째 단백질은 바이러스 기원이었다. 이들 단백질은 여전히, PTD 작용을 위한 가장 일반적으로 수용되는 모형이다.
HIV-I 전사 교차활성인자 (TAT)와 HSV-I VP 22 단백질은 가장 특성화된 바이러스 PTD 포함 단백질이다.
TAT (HIV-I 교차활성인자 유전자 산물)는 86개-아미노산 폴리펩티드인데, 이는 통합된 HIV-I 게놈의 강력한 전사 인자로서 기능한다. TAT는 잠복성으로 감염된 세포에서 바이러스 게놈 자극 바이러스 복제에 작용한다. TAT 단백질의 전위 특성은 상기 단백질이 무활동 감염 세포를 활성화시킬 수 있도록 하고, 그리고 이는 사이토킨을 비롯하여 다수의 세포 유전자를 조절함으로써 차후 감염을 위한 감염되지 않은 세포의 프라이밍 (priming)에 관여할 수 있다. TAT의 최소 PTD는 9개 아미노산 단백질 서열 RKKRRQRRR (TAT49-57) [SEQ ID NO: 4]이다. TAT의 더욱 긴 단편을 이용한 연구는 최대 120 kDa까지 융합 단백질의 성공적인 형질도입을 증명하였다. 복합 TAT-PTD 및 합성 TAT 유도체의 첨가는 막 전위를 매개하는 것으로 증명되었다. TAT PTD 포함 융합 단백질은 암, 사멸-단백질의 세포 내로 수송, 그리고 신경변성 질환의 질환 모형을 수반하는 실험에서 치료 모이어티로서 이용되고 있다.
VP22는 HSV 비리온의 구조적 일부분인 HSV-I 외피 단백질이다. VP22는 수용체 독립된 전위가 가능하고 핵 내에 축적된다.
VP22의 이러한 특성은 상기 단백질을 PTD 포함 펩티드로서 분류시킨다. 전장 VP22를 포함하는 융합 단백질은 원형질막을 넘어서 효율적으로 전위되었다.
3.4.2, 세포간 전위 특성을 갖는 호메오단백질
호메오단백질은 고도로 보존되고, 형태학적 과정에 관여하는 전사 인자를 전사활성화 (transactivation)시킨다. 이들은 60개 아미노산의 특이적 서열을 통해 DNA에 결합한다. DNA-결합 호메오도메인은 호메오단백질의 가장 고도로 보존된 서열이다. 여러 호메오단백질이 PTD-유사 활성을 나타내는 것으로 기술되었다; 이들은 세포 유형 특이성 없이, 에너지-독립된 및 엔도시토시스-독립된 방식으로 세포 막을 넘어서 효과적인 전위가 가능하다.
안테나피디어 단백질 (Antp)은 세포 막을 넘어서 전위할 수 있는 전사활성화 인자이다; 전위가 가능한 최소 서열은 상기 단백질의 호메오도메인 (HD)의 세 번째 나선에 상응하는 16개 아미노산 펩티드이다. 상기 나선의 내재화는 4℃에서 발생하는데, 이는 상기 과정이 엔도시토시스 의존성이 아니라는 것을 암시한다. 최대 100개 아미노산의 펩티드가 AntpHD 침투성 세포 막과의 융합 단백질로서 생산되었다. 전위할 수 있는 다른 호메오도메인에는 Fushi tarazu (Ftz)와 Engrailed (En) 호메오도메인이 포함된다. 많은 호메오도메인은 고도로 보존된 세 번째 나선을 공유한다.
3.4.3. 합성 PTD
여러 PTD 펩티드가 합성되었다. 이들 합성 펩티드 중에서 상당수는 기존의 충분히 증명된 펩티드에 기초하는 반면, 다른 것들은 PTD 기능에 결정적인 것으로 생각되는 염기성 잔기 및/또는 양성 전하 (positive charge)에 대하여 선택된다. 합성 펩티드에는 PTD-4 (YARAAARQARA) [SEQ ID NO: 5]; PTD-5 (RRQRRTSKLMKR) [SEQ ID NO; 6]; MST-1 (AAVLLPVLLAAR) [SEQ ID NO: 7]; L-R9 (RRRRRRRRR) [SEQ ID NO: 8]; 그리고 펩티드 2 (SGWFRRWKK) [SEQ ID NO: 9]가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
3.4.4. 인간 PTD
인간 PTD는 인간 환자 내로 도입 시에 잠재적인 면역원성 문제를 회피할 수 있다. PTD 서열을 포함하는 펩티드에는 Hoxa-5, Hox-A4, Hox-B5; Hox-B6, Hox-B7, HOX-D3, GAX, MOX-2, 그리고 FtzPTD가 포함된다. 이들 단백질은 모두 AntpPTD에서 관찰되는 서열을 공유한다 (RQIKIWFQNRRMKWKK) [SEQ ID NO; 10]. 다른 PTD에는 Islet-1, 인터류킨-1β, 종양 괴사 인자, 그리고 에너지-, 수용체-, 그리고 엔도시토시스-독립된 전위가 가능한 Kaposi-섬유아세포 성장 인자 (K-FGF 또는 FGF-4) 신호 펩티드로부터 소수성 서열이 포함된다. 확증되지 않은 PTD에는 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 집단의 구성원이 포함된다.
4. 질환: 염증성 질환
본 명세서에서, 용어 "염증"은 혈관 발달된 조직이 손상에 반응하는 생리학적 과정을 지칭한다 (참조: FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 4th Ed., William E. Paul, ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia (1999), 1051-1053, 본 발명에 참조로서 편입됨). 염증성 과정 동안, 해독과 수복에 관여하는 세포가 염증성 매개인자에 의해 약화된 부위로 동원된다. 염증은 종종, 염증 부위에서 백혈구, 특히 호중구 (다형핵 세포)의 강한 침윤으로 특징된다. 이들 세포는 혈관 벽에서 또는 손상되지 않은 조직 내에서 독성 물질을 방출함으로써 조직 손상을 촉진한다. 전통적으로, 염증은 급성과 만성 반응으로 구분된다.
본 명세서에서, 용어 "급성 염증"은 유체, 혈장 단백질, 그리고 호중구성 백혈구의 축적으로 특징되는 급성 손상에 대한 급속하고 단명(수분 내지 수일)의 상대적으로 균일한 반응을 지칭한다. 급성 염증에서, 자극의 제거는 염증 조직 내로 단핵구 (이는 적절한 활성화 하에 대식세포가 된다)의 보충을 중단시키고, 그리고 기존 대식세포가 림프관을 통해 조직을 빠져나간다. 급성 염증을 유발하는 유해한 작인의 실례에는 병원균 (가령, 세균, 바이러스, 기생충), 외인성 (가령, 아스베스토) 또는 내인성 (가령, 요산염 결정, 면역 복합체) 출처로부터 이물질, 그리고 물리적 (가령, 화상) 또는 화학적 (가령, 부식성) 작인이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "만성 염증"은 더욱 오랫동안 지속되고 종결이 애매하고 불명확한 염증을 지칭한다. 만성 염증은 최초 염증성 작인의 불완전한 제거를 통하여, 또는 동일한 위치에서 발생하는 복합 급성 이벤트의 결과로써, 급성 염증이 지속될 때, 급성 염증에서 이어진다. 림프구와 대식세포의 유입, 그리고 섬유아세포 성장을 수반하는 만성 염증은 연장된 또는 반복된 염증성 활성의 부위에서 조직 반흔을 유발할 수 있다. 만성 염증에서, 기존 대식세포는 한 장소에 구속되고, 그리고 대식세포의 증식이 촉진된다.
최초 작인에 상관없이, 급성 염증에 동반되는 생리학적 변화는 4가지 주요 특징을 포함한다: (1) 혈류에서 순 증가를 유발하는 혈관 확장 (vasodilation)은 급송 조직 손상에 대한 가장 초기의 신체 반응 중의 하나이다; (2) 염증성 자극에 응하여, 내피 세포가 소정맥 칸트랙트 (venule contract)에 정렬하고, 세포내 연접 (intracellular junction)을 확대하여 갭 (gap)을 발생시키고, 혈장 단백질과 혈액 세포의 혈관 외부로의 누출을 가능하게 하는 증가된 혈관 침투성 (vascular permeability)을 유발한다; (3) 염증은 종종, 염증 부위에서 백혈구, 특히 호중구 (다형핵 세포)의 강한 침윤으로 특징된다. 이들 세포는 혈관 벽에서 또는 손상되지 않은 조직 내에서 독성 물질을 방출함으로써 조직 손상을 촉진한다; 그리고 (4) 특이적 자극에 응하여 백혈구로부터 방출된 발열원에 의해 발생된 발열.
염증성 과정 동안, 염증성 반응의 가용성 염증성 매개인자는 신체 고통을 유발하는 작인을 억제하고 제거하는 시도에서, 체계적인 방식으로 세포 성분과 협력한다. 본 명세서에서, 용어 "염증성 매개인자"는 염증성 과정의 분자 매개인자를 지칭한다. 이들 가용성 확산성 분자는 조직 손상과 감염의 부위, 그리고 더욱 먼 부위 둘 모두에서 국소적으로 작용한다. 일부 염증성 매개인자는 염증성 과정에 의해 활성화되는 반면, 다른 것들은 급성 염증에 응하여, 또는 다른 가용성 염증성 매개인자에 의해, 세포 출처로부터 합성되고 및/또는 방출된다. 염증성 반응의 염증성 매개인자의 실례에는 혈장 프로테아제, 보체, 키닌, 응고와 섬유소분해 단백질s, 지질 매개인자, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 혈소판-활성화 인자 (PAF), 히스타민, 세로토닌, 그리고 신경펩티드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 펩티드와 아민, 그리고 인터류킨-1, 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-8 (1L-8), 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론-감마, 그리고 인터류킨 12 (IL- 12)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 친염증성 사이토킨이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
염증과 연관된 여러 질환은 다양한 질환의 기초가 된다. 이들에는 천식, 자가면역 질환, 만성 전립선염, 사구체신염, 염증성 장 질환 (IBD), 골반 염증성 질환 (PID), 재관류 손상, 류머티스성 관절염, 맥관염, 그리고 과민증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
천식
천식은 호흡계에 관련된 만성 질환인데, 여기서 기도가 산발적으로 수축하고, 염증이 발생하고, 그리고 종종, 하나 이상의 유인에 응하여 과도한 양의 점액으로 채워진다. 이들 유인에는 환경 자극인자, 예를 들면, 알레르기원, 연기, 차갑거나 뜨거운 공기, 향기, 동물 비듬, 습한 공기, 운동 또는 힘든 작업 또는 감정적 고통에 노출이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 기도 협착 (airway narrowing)은 쌕쌕거림, 가쁜 숨, 흉부 압박, 기침, 호흡 곤란, 그리고 천명이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 증상을 나타낸다. 정상적인 대조 개체와 비교하여 천식 개체에서 IL-6의 상승된 혈청 수준은 기관지 천식의 병태생리학에 관련되었다 (Yokoyama, A. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 151(5): 1354-58 (1995)). 여러 연구에서 천식 환자의 기관지폐세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 유의한 수준의 TNF-α와 IL-6이 검출되는 반면, 무증후성 천식을 앓는 환자의 BALF에서 유의한 수준의 IL-1β가 검출된다는 관찰 결과에 기초하여, 폐포 대식세포와 T 세포의 활성화가 암시되었다 (Broide, D.H., et al. J. Allergy Clin. Immunol. 89(5):958-67, 1992).
자가면역 질환
강직성 척추염 (AS, Bechterew's disease, Bechterew syndrome, Marie Strumpell disease)은 만성 염증성 관절염과 자가면역 질환이다. 이는 주로, 척주 내에 관절 및 골반 내에 천장관절에 영향을 주고 척주의 궁극적인 융합을 유발한다. 여러 연구에서 TNF-α와 IL-6이 AS 환자에서 증가하고 (IL-1β 수준은 그렇지 않음) IL-6이 상기 질환의 활성과 밀접하게 상관되는 것으로 보고되었다 (Gartacos, J., et al. Br. J. Rheumatol. 33(10):927-931. 1994). AS의 증상에는 종종, 한쪽 또는 다른 쪽 엉덩이, 또는 천장 관절로부터 넓적다리의 뒷면으로 지시되는 통증과 함께, 척주의 아래쪽 부분 또는 때때로, 전체 척주에서 만성 통증과 경직, 붉어짐을 유발하는 눈의 염증 (홍채섬모체염, 포도막염), 눈 통증, 시력 상실, 비문증 (floaters), 수명 (photophobia), 피로, 메스꺼움, 대동맥염, 정상 폐 섬유증 (apical lung fibrosis), 그리고 천골 신경 뿌리 수초 (sacral nerve root sheath)의 확장증 (ectasia)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
I형 당뇨병은 췌장의 도 세포 (islet cell)가 T-세포로부터 공격을 받고, 따라서 신체가 인슐린을 생산할 수 없게 되는 자가면역 질환이다. β-세포 파괴성 췌도염 (insulitis)은 IL-1과 TNF-α의 증가된 발현과 연관되는 것으로 보고되었다. 게다가, 비-당뇨병-경향 생쥐와 비-비만성 당뇨병 (NOD) 생쥐의 췌장 도 β-세포 내에서 사이토킨의 외래유전자도입 발현은 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM) 발생에서 IFNα, IFNγ, IL-2와 IL-10에 대한 병원성 역할, 그리고 IL-4, IL-6과 TNF-α에 대한 보호성 역할을 암시하였다 (Rabinovitch, A. Diabetes Metab. Rev. 14:129-151, 1998). I형 당뇨병의 증상에는 다뇨증 (polyuria), 조갈증 (polydispia)과 체중 감소가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
길랑 바레 증후군은 급성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (말초 신경계에 영향을 주는 자가면역 질환)이다. 이는 빈번하게, 심각하고, 그리고 통상적으로, 심부건 반사 (deep tendon reflex)의 완전한 상실과 함께, 상지 (upper limb)와 얼굴까지 확산되는 다리에서 허약으로 확인되는 상행 마비 (ascending paralysis)로서 나타난다. 여러 연구에서 상기 질환의 동물 모형에서 IL-1β, IL-6, 그리고 TNF-α의 차별적 발현은 이들 사이토킨의 주요한 역할을 입증하는 것으로 보고되었다 (Zhu, J., et al. Clin. Immunol. Immunopathol, 84(l):85-94. 1997). 길랑 바레 증후군의 증상에는 통상적으로, 하지 (lower limb)에 먼저 영향을 주고, 그리고 상행 방식으로 급속하게 진행되는 대칭적 허약 (symmetrical weakness), 감각장애 (dysesthesias)와 함께 또는 감각장애 없이 "러브 레그 (rubbery leg)", 안구 허약 (bulbar weakness) (구강인두 연하곤란, oropharyngeal dysphagia), 호흡 곤란, 안면 허약 (facial weakness), 감각 상실 (sensory loss) (자기수용감각), 혈압에서 폭넓은 변동, 기립성 저혈압 (orthostatic hypotension), 그리고 심장 부정맥 (cardiac arrhythmias)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
루푸스는 신체의 모든 부위에 영향을 주고, 염증과 조직 손상을 유발하는 만성 자가면역 연결 조직 질환이다. 루푸스는 가장 빈번하게는, 심장, 관절, 피부, 폐, 혈관, 간, 신장, 그리고 신경계를 손상시킨다. 여러 연구에서 IL-6과 TNF-α는 루푸스 신염을 앓는 환자의 신장에서 활발하게 합성되는 것으로 밝혀졌다 (Herrera-Esparza, R., et al. Lupus. 7(3): 154-158, 1998). 추가의 연구에서 TNF-α와 IL-1β의 발현이 루푸스 신염의 동물 모형에서 상승되는 것으로 보고되었다 (Boswell, J., et al. J. Immunol. 141(9):3050-3054, 1988). 루푸스의 증상에는 피로, 열병, 체중 증가 또는 감소, 관절 통증, 경직, 부종, 안면에서 협부 발진 (malar rash), 피부 병소, 입병 (mouth sore), 탈모증, 숨 가쁨, 흉부 통증, 안구 건조증과 레이노 현상이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
다발성 경화증 (MS)은 뇌와 척추의 수초화된 뉴런에 영향을 주는 자가면역 질환이다. MS는 수초 (myelin sheath)에 손상에 의해 유발된다; 신경 충동 (nerve impulse)은 이러한 덮개가 손상될 때 느려지거나 중단된다. 여러 연구에서 MS 증례에서 TNF-α의 증가된 발현 (Cannella, D., et al. Ann. Neurol. 37(4):424-435, 2004) 및 MS 환자로부터 병소에서 IL-6의 증가된 발현 (Lock, C, et al. Nature Medicine, 8:500-508, 2002)이 보고되었다. 다발성 경화증의 증상에는 균형 상실, 근육 경련, 임의의 부위에서 저린감 또는 비정상적인 감각, 팔 또는 다리의 이동과 보행에서 문제, 하나 이상의 팔 또는 다리에서 진전, 변비, 대변 누출, 실금, 복시 (double vision), 안구 불편, 안면 통증, 그리고 청력 상실이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
건선은 피부와 관절에 영향을 주는 만성적인 비-전염성 자가면역 질환이다. 이는 통상적으로, 피부에서 나타나는 적색의 비늘모양 반점을 유발한다. 이들 건선적 플라크 (psoriatic plaque)는 염증과 과도한 피부 생산의 부위이다. 피부는 이들 부위에서 급속하게 축적되고 은백색 외형을 나타낸다. 플라크는 팔꿈치, 무릎, 머리가죽, 그리고 성기를 비롯한 임의의 부위에 영향을 줄 수 있다. 여러 연구에서 건선 환자에서 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 상승된 수준이 보고되었다 (Mizutani, H.; et al. J. Dermatol. Sci, 14(2); 145-153. 1997).
경피증은 피부, 혈관, 근육과 내부 장기에서 변화를 수반하는 만연된 연결 조직 질환이다. 여러 연구에서 IL-6은 대조로부터 혈청에서보다 경피증 환자로부터 혈청에서 더욱 빈번하게 검출되고, 그리고 TNF-α는 양쪽 환자 군에서 동일한 수준으로 검출되는 반면, IL-1β는 어느 군으로부터도 검출되지 않는 것으로 보고되었다 (Needleman, B. W., et al. Arthritis Rheum. 35(l):67-72, 1992). 피부 증상에는 열과 냉기에 응하여 손가락과 발가락의 창백, 푸름, 또는 붉음 (레이노 현상), 탈모, 피부 쓰라림, 비정상적으로 어둡거나 밝은 피부, 피부 비대 (skin thickening)와 번들거리는 손과 팔뚝, 그리고 손가락 또는 발가락에서 궤양화가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 골과 근육 증상에는 관절 통증, 발에서 저린감과 통증, 통증, 손가락과 관절의 경직과 부종, 손목 통증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 추가의 증상에는 변비, 설사, 마른 기침, 쌕쌕거림, 그리고 삼킴의 어려움이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
쇼그렌병 (Mikulicz disease, Sicca syndrome)은 면역 세포가 눈물과 타액을 생산하는 외분비선 (exocrine gland)을 공격하고 파괴하는 자가면역 질환이다. 여러 연구에서 IL-1β, IL-6과 TNF-α 수준은 쇼그렌병을 앓는 환자와 정상적인 건강한 대조 간에 현저하게 상이한 것으로 밝혀졌다 (Szodoray, P., et al. Scand. J, Immunol, 59(6):592-599). 쇼그렌병의 증상에는 구강 건조증, 안구 건조증, 피부 건조증, 코 건조증, 그리고 질 건조증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
사구체신염
사구체신염 (glomerular neprhitis, GN)은 신장의 작은 혈관(사구체)의 염증으로 특징되는 신장 질환이다. 여러 연구에서 염증성 사이토킨 IL-1과 TNF-α가 각각, 사구체신염에서 면역/염증성 과정에서 일정한 역할을 수행하고 이들의 작용 차단이 질환을 감소시키는 것으로 보고되었다 (Atkins, R.C.. Nephrology. 7(sl):S2-S6, 2007); Johnson, RJ., Nephron. 73(4):506-514, 1996). 추가의 연구에서 IL-6 역시 사구체신염에서 일정한 역할을 하는 것으로 보고되었다 (Takemura, T., et al. Virchows Archiv. 424(5):459-464, 1994). 사구체신염의 증상에는 부종, 고혈압, 그리고 소변에서 적혈구 세포의 존재가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
비뇨기과 만성 골반 통증
비뇨기과 만성 골반 통증 증후군은 방광 (즉, 간질성 방광염 (IC), 고통스런 방광 증후군 (PBS)) 및 전립선 (만성 전립선염 (CP), 만성 골반 통증 증후군 (CPPS))과 연관된 통증 증후군을 지칭한다. 만성 전립선염/만성 골반 통증 증후군 (CP/CPPS)은 요로 감염의 증거 없이 3개 이상 동안 지속되는 골반 또는 회음 통증으로 특징된다. 여러 연구에서 IL-1β, TNF- α와 IL-6의 수준이 대조 군과 비교하여 염증성과 비-염증성 CPPS를 앓는 군에서 현저하게 상승되는 것으로 보고되었다 (Orhan, L, et al. Int. J. Urol. 8(9):495-9, 2001; Alexander, R.B., et al. Urology. 52(5):744-749, 1998; Jang, T.L., and Schaeffer, AJ1, World J. Urol. 21(2):95-99, 2003). 이들 증후군의 증상은 강해지고 약해질 수 있다. 통증은 가벼운 불편함에서부터 허약까지 변할 수 있고, 그리고 등과 직장으로부터 방사상으로 펴져 앉아있는 것을 어렵게 만들 수 있다. 배뇨 곤란 (힘들거나 고통스러운 배뇨), 관절통 (관절에서 통증), 근육통 (근육에서 통증), 설명되지 않는 피로, 비정상적인 통증, 음경에서 지속적인 작열통, 그리고 빈발이 모두 나타날 수 있다. 빈번한 배뇨 및 증가된 급박은 간질성 방광염 (전립선보다는 방광에 집중되는 염증)을 암시할 수 있다. 사정 (ejaculation)이 고통스러울 수 있는데, 그 이유는 신경-과 근육-매개된 사출후 통증이 더욱 일반적이긴 하지만, 전립선이 정액의 방출 동안 수축하기 때문이다. 일부 환자는 낮은 성적 충동, 성적 기능장애 및 발기의 어려움을 보고한다. 사정 이후에 통증은 양성 전립선 과형성 (benign prostatic hyperplasia, BPH)을 앓는 남성 또는 정상적인 남성으로부터 CP/CPPS를 구별하는 매우 특징적인 몸의 부조이다.
염증성 장 질환 (IBD)
용어 "염증성 장 질환 (IBD)"은 대장과 소장의 일군의 염증성 질환을 지칭한다. IBD에는 크론병 (CD) 및 궤양성 대장염 (UC)이 포함된다. 다른 형태의 IBD에는 교원성 대장염, 림프성 대장염, 허혈성 대장염, 전환성 대장염, 베체트 증후군, 감염성 대장염 및 불확정 대장염이 포함된다. 이들 질환 중에서 대부분은 복통, 구토, 설사, 혈변배설 (hematochezia) (대변에서 밝게 빛나는 적혈구), 체중 감소 및 다양한 연관된 몸의 부조 또는 질환, 예를 들면, 관절염, 괴저성 농피증 (pyoderma gangrenosum), 그리고 원발성 경화성 담관염 (primary sclerosing cholangitis)의 증상을 나타낼 수 있다. 진단은 일반적으로, 결장 내시경술 (colonoscopy)에 의한 병리학적 병소의 생검으로 달성된다. 여러 연구에서 사이토킨, 예를 들면, IL-6, IL-1과 TNF-α가 장 면역계의 조절에서 중심적인 역할을 수행하고, 그리고 많은 친-염증성과 항염증성 사이토킨의 점막과 전신 농도가 IBD에 상승되는 것으로 보고되었다 (Rogler, G., and Andus, T. World J. Surg. 22(4):382-9, 1998). 또한, 여러 연구에서 크론병 환자에서 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 수준이 상승되고, 그리고 생검 배양액의 상층액에서 IL-1β와 IL-6의 농도가 내시경 등급매기기와 조직학적 등급매기기에 의해 측정된 조직 침입 (tissue involvement)의 정도와 양으로 상관되는 것으로 밝혀졌다 (Reimund, J., et al. Gut, 39:684-689, 1996).
골반 염증성 질환 (PID)
골반 염증성 질환 (PID)은 여성의 자궁, 나팔관, 및/또는 난소의 염증을 지칭하는데, 그 이유는 상기 질환이 인근 조직과 장기에 유착으로, 반흔 형성으로 진전되기 때문이다. PID는 조직 괴사와 종기 형성을 유발할 수 있다. 여러 연구에서 IL-1β, IL-6과 TNF-α가 항생제 처리 이전에 (처리 이후와 비교하여) PID 환자에서 현저하게 상승되고, 그리고 이들 사이토킨이 PID의 병인에서 중요한 역할을 수행할 수 있는 것으로 보고되었다 (Lee, S. A., et al. Clin. Chem. Lab, Med. 46(7):997-1003, 2008).
재관류 손상
재관류 손상은 일정 기간의 허혈후 혈액 공급이 조직에 재개될 때 유발되는 조직에 대한 손상을 지칭한다. 혈액으로부터 산소와 영양분의 부재는 순환의 복원이 정상적인 기능의 복원이 아닌 산화 스트레스의 유도를 통한 염증과 산화 손상을 유발하는 상태를 발생시킨다. 여러 연구에서 IL-6이 TNF-α의 하향 조절을 통하여 간의 온허혈 (warm ischemia)/재관류 손상을 예방하는 것으로 보고되었다 (Camargo, C, et al. Hepatology. 26(6): 1513-1520, 2003). 증상에는 상승된 백혈구 세포 수준, 아폽토시스 (apoptosis), 그리고 유리 라디칼 축적이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
류머티스성 관절염 (RA)
류머티스성 관절염 (RA)은 가장 일반적으로, 빈혈과 함께 관절 (관절염)과 건초 (tendon sheath)에서 염증과 조직 손상을 유발하는 만성적인 전신 자가면역 질환이다. RA는 또한, 폐, 심낭, 늑막, 그리고 눈의 공막에서 미만성 염증을 발생시키고, 또한 피부 아래 피하 조직에서 가장 일반적인 결절성 병소 (nodular lesion)를 발생시킨다. RA는 고통스러운 불능화 질환이고, 이는 기능과 가동성의 실질적인 상실을 유발할 수 있다. 여러 연구에서 IL-1β, IL-6과 TNF-α의 수준이 RA와 소아 관절염 환자의 혈청에서 상승되는 것으로 보고되었다 (Ziolkowska, M., et al. J. Immunol. 164:2832-2838, 2000). RA의 증상은 관절 (부종, 통증, 압통, 국소 온기의 감각, 경직 및 제한된 움직임); 피부 (rheumatoid nodule); 폐 (섬유증, 카플란 증후군, 흉막 유출); 신장 (신장 아밀로이드증); 심장과 혈관 (동맥경화증, 심근 경색, 뇌졸중); 그리고 눈 (상공막염, 건성 각결막염)에서 나타날 수 있다.
맥관염
"맥관염"은 혈관 (동맥과 정맥)의 염증성 파괴로 특징되는 질환을 지칭한다. 여러 연구에서 TNF-α, IL-1, 그리고 IL-6이 전신 맥관염의 치료를 위한 잠재적인 생물학적 표적인 것으로 보고되었다 (Levine, S. M., and Stone, J.H. Best Prac. Res. Clin. Rheumatol. 15(2):315-333, 2001). 맥관염의 증상은 통상적으로, 단일 또는 다발성장기 기능장애로 전신성이다. 이들 증상에는 피로, 허약, 열병, 관절통s, 복통, 고혈압, 신부전, 그리고 신경학적 기능장애가 포함될 수 있다. 추가의 증상에는 다발성 단신경염 (mononeuritis multiplex), 붉은 자반 (피부 상에 진홍색 반점) 및 폐-신장 증후군이 포함된다. 과민성 맥관염 (HSV)은 외인성 물질에 대한 면역 반응에 기인한 이차 맥관염이다. 여러 연구에서 혈청 IL-6과 TNF-α가 건강한 대조 군에서보다 활성 HSV 환자에서 훨씬 높은 것으로 보고되었다 (Nalbant, S., et al. Rheumatol. Int. 22(6):244-248, 2002).
5. 질환: 섬유증
섬유증은 일부분의 손상 또는 염증, 또는 이의 혈액 공급의 간섭의 결과로써 장기 또는 조직 내에서 과도한 섬유성 연결 조직의 형성 또는 발달이다. 이는 반흔에 이르는 정상적인 치유 반응의 결과이거나, 또는 비정상적인 반응 과정일 수 있다.
췌장과 폐의 낭포성 섬유증, 주사 섬유증, 심근내막 섬유증, 폐의 특발성 폐 섬유증, 종격동 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 그리고 신원성 전신 섬유증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 여러 유형의 섬유증이 존재한다.
낭포성 섬유증 (CF, mucovidosis, mucovisidosis)은 상염색체 열성 유전 질환이다. 이는 미국에서 가장 일반적인 치명적 유전 질환 중의 하나이고, 대략 30,000만 명의 개체에 영향을 주며, 그리고 3,300명의 신생아마다 1명의 비율로 백인 개체군에서 가장 우세하다. 1989년에 확인된 낭포성 섬유증에 관련되는 유전자는 낭포성 섬유증 막통과 전도성 조절자 (CFTR)로 불리는 단백질을 코딩한다. CFTR은 통상적으로, 신체 전역에서 외분비 상피세포에 의해 발현되고 세포 내외로 염화물 이온, 중탄산염 이온과 글루타티온의 움직임을 조절한다. 낭포성 섬유증 환자에서, CFTR 유전자에서 돌연변이는 CFTR 단백질 기능의 변경 또는 완전 상실로 이어지고, 외분비 (exocrine secretion)의 오스몰농도 (osmolarity), pH와 산화환원 특성에서 결함을 유발한다. 폐 내에서, CF는 기도를 방해하는 진한 점액 분비의 존재에 의해 자신을 나타낸다. 다른 외분비 장기, 예를 들면, 땀샘 (sweat gland)에서, CF는 폐쇄성 표현형이 아닌 분비물의 비정상적인 염 조성 (따라서 CF 환자를 검출하기 위한 임상적 땀 오스몰농도 검사 (clinical sweat osmolarity test)에 의해 자신을 나타낼 수 있다. 낭포성 섬유증 환자에서 질환과 사망의 유력한 원인은 진행성 폐 질환이다. 기도를 차단하는 CF 점액의 농후는 분비물의 오스몰농도에서 비정상, 그리고 호중구로 불리는 염증성 세포의 하위집단으로부터 기원하는 대량의 DNA, 액틴, 프로테아제 및 단백산화 효소의 존재에 기인하는 것으로 생각된다. 실제로, CF 폐 질환은 바이러스와 세균 병원체 둘 모두에 조기, 과민성 호중구-매개된 염증성 반응으로 특징된다. CF 폐의 이러한 과염증성 증후군은 여러 원인을 갖는데, 이들 중에서 친-염증성 케모킨, 특히 IL-8, 그리고 항-염증성 사이토킨, 특히 IL-10 사이에 불균형이 주요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다 (참조: Chmiel et al. Clin Rev 알레르기 Immunol. 3(l):5-27 (2002)). 여러 연구에서 TNF-α, IL-6와 IL-1β의 수준이 정상적인 대조 기관지 폐 세척액보다 낭포성 섬유증 환자의 기관지 폐 세척액에서 더욱 높은 것으로 보고되었다 (Bondfield, T.L., et al. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 152(1):211 1-2118, 1995).
주사 섬유증 (IF)은 유아와 어린이의 대퇴사두근 (quadriceps), 삼두근 (triceps)과 둔부근 (gluteal muscle)에서 종종 발생하는 근육내 주사의 합병증이고, 여기서 개체는 영향을 받은 근육을 완전하게 구부릴 수 없다. 이는 전형적으로, 통증이 없지만 진행성이다. 여러 연구에서 당단백질 오스테오폰틴 (OPN)이 조직 재구축에서 일정한 역할을 하고 (Liaw, L., et al. J. Clin. Invest. 101(7):1469-1478, 1998), 그리고 이러한 친염증성 매개인자가 인간 단핵구에서 IL-1β 상향-조절 및 TNF-α와 IL-6의 수반하는 강화된 생산을 유도하는 (Naldini, A., et al. J. Immunol. 177:4267-4270, 2006; Weber, G.F., and Cantor, H. Cytokine Growth Factor Reviews. 7(3):241~248, 1996) 것으로 보고되었다.
심장내막 질환 (과호산구성 증후군 (HS))은 혈액 내에서 지속적으로 상승된 호산구 수 (>1500개 호산구/mm3)로 특징되는 질환 과정이다. HS는 많은 장기에 동시에 영향을 준다. 여러 연구에서 IL-1β, IL-6과 TNF-α가 바이러스-유도된 심근염 환자에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 보고되었다 (Satoh, M,, et al. Virchows Archiv. 427(5):503-509, 1996). 증상에는 심근증, 피부 병소, 혈전색전증, 폐 질환, 신경장애, 간비장비대 (간과 비장의 동시 비대), 그리고 감소된 심실 크기를 포함될 수 있다. 치료는 호산구 수준을 감소시키기 위하여 코르티코스테로이드를 이용하는 것을 포함할 수 있다.
특발성 폐 섬유증 (IPF, 잠재성 섬유화 폐포염)은 원인 미상의 만성 진행성 간질성 폐 질환이다. 이는 통상적인 간질성 폐렴의 조직학적 패턴과 연관되고, 그리고 최소 연관된 염증과 함께 폐 간질 (pulmonary interstitium)에서 섬유성 조직의 비정상적이고 과도한 침착으로 특징될 수 있다. 여러 연구에서 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 앓는 환자에서 TNF-α와 IL-6 방출에서 현저한 증가가 보고되었고 (Zhang, Y., et al. J. Immunol. 150(9):4188-4196, 1993), 이는 IL-1β의 발현 수준에 기인하였다 (KoIb, M., et al. J. Clin. Invest. 107(12): 1529-1536, 2001). 증상에는 호흡곤란 (호흡의 어려움)뿐만 아니라, 마른 기침, 곤봉형성 (손가락의 변형), 그리고 딱딱 소리 (흡입 동안 폐 내에서 딱딱 소리)가 포함된다.
종격동 섬유증 (MF)은 주요 혈관과 기도를 차단하는 림프절에 집중되는 침해성 석회화 섬유증으로 특징된다. MF는 히스토플라스마증 (histoplasmosis)의 후기 합병증이다. 섬유증의 뮤린 모형을 이용한 여러 연구에서, IL-1β와 TNF-α는 현저하게 상승되는 것으로 보고되었다 (Ebrahimi, B., et al. Am. J. Pathol. 158:2117-2125, 2001).
골수섬유증 (골수성 변질형성, 만성 특발성 골수섬유증, 원발성 골수섬유증)은 골수에서 섬유증이 진행되는 골수 질환이다. 골수섬유증은 진행성 골수 부전을 유발한다. 평균 생존은 5년이고 사망의 원인에는 감염, 출혈, 장기 부전, 문맥 고혈압, 그리고 백혈병성 전환 (leukemic transformation)이 포함된다. TNF-α와 IL-6 수준은 바이러스-유도된 골수섬유증의 동물 모형에서 상승되는 것으로 보고되었다 (Bousse-Kerdiles, M., et al. Ann. Hematol. 78:434-444, 1999).
복막후 섬유증 (Ormond's disease)은 후복막강 (retroperitoneum) 내에서 섬유성 조직의 증식을 특징으로 하는 질환이다. 후복막강은 신장, 대동맥, 신장 관 (renal tract), 그리고 기타 구조를 포함하는 신체 구획 (body compartment)이다. IL-1, IL-6과 TNF-α는 복막후 섬유증의 병인에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 보고되었다 (Demko, T., et al. J. Am. Soc. Nephrol. 8:684-688, 1997). 복막후 섬유증의 증상에는 요통, 신부전, 고혈압, 그리고 심정맥 혈전증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
신원성 전신 섬유증 (NSF, 신원성 섬유 피부질환)은 피부, 관절, 눈과 내부 장기의 섬유증을 수반한다. NSF는 가돌리늄에 노출과 연관될 수 있다. 환자는 섬유성 결절과 플라크를 포함하는 넓은 부위의 경화된 피부가 발생한다. 움직임 범위의 동반한 제한으로 굴곡 구축 (flexion contracture) 역시 발생할 수 있다. NSF는 피부 섬유아세포와 수상돌기 세포의 증식, 무성한 콜라겐 묶음, 증가된 탄성 섬유, 그리고 점액소의 침전물을 보인다. 일부 보고서는 친염증성 상태가 신원성 전신 섬유증을 유발하는 선행 인자를 제공하고 (Saxena, S., et al. Int. Urol. Nephrol. 40:715-724, 2008), 그리고 TNF-α의 수준이 신원성 전신 섬유증의 동물 모형에서 상승된다고 제안하였다 (Steger-Hartmann, T., et al. Exper. Tox. Pathol. 61(6):537-552, 2009).
6. 질환: 내피 세포 기능장애
내피 세포 기능장애 (endothelial dysfunction)는 내피에 의해 수행되는 정상적인 생화학적 과정, 예를 들면, 응고, 혈소판 유착, 면역 기능, 그리고 혈관내와 혈관외 공간의 부피와 전해질 함량의 조절의 중재의 생리학적 기능장애를 지칭한다. 내피 기능장애는 질환 과정, 예를 들면, 패혈성 쇼크, 고혈압, 과콜레스테롤혈증, 그리고 당뇨병에 기인할 수 있고, 또한 환경 인자, 예를 들면, 담배 제품 흡연에 기인할 수 있다. 여러 연구에서 사이토킨, 예를 들면, IL-6, IL-1β, 그리고 TNF-α의 영향 하에, 내피-의존성 확장이 손상될 수 있고, 그리고 내피가 순환 호르몬 또는 체내 분비물 (autacoid)에 반응하는 능력을 상실할 수 있는 것으로 보고되었다. 이러한 효과는 혈관 경련 (vessel spasm), 혈전증 (thrombosis) 또는 죽종형성 (atherogenesis)으로의 소인을 뒷받침할 수 있다 (Vila, E. and Salaices, M. Am. J, Physiol. Heart Circ. Physiol. 288:H1016-H1021, 2005). 이에 더하여, 여러 연구에서 IL-1β와 TNF-α에 의해 조절되는 바와 같은 IL-6의 과다발현은 내피 세포 기능장애에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 암시되었다 (Kornman, K. et al. J. Perio. Res. 34(7):353-357 (2006); Libby, P., et al. Circulation. 86 (6 Suppl): III47-52 (1992)).
내피 기능장애는 적절한 자극에 응하여 완전하게 확장하는 동맥과 소동맥의 능력 없음으로 특징될 수 있다. 가령, 기능장애성 내피 세포 (감소된 혈관확장을 가짐)는 건강한 내피 세포와 동일한 정도로 산화질소 (NO)를 생산할 수 없다. 이러한 차이는 아세틸콜린의 이온삼투요법, 다양한 혈관작용제의 동맥내 투여, 피부의 국소 가열, 그리고 혈압 가압대를 높은 압력으로 팽창시킴으로써 일시적인 동맥 폐쇄를 비롯한 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 조사는 또한, 관상 동맥 자체에서 수행될 수 있지만, 이러한 침해성 절차는 관상동맥내 카테터삽입 (intracoronary catheterization)을 위한 임상적 이유가 존재하는 경우가 아니라면 통상적으로 수행되지 않는다. 이들 기술은 NO를 방출하도록 내피를 자극하는 것으로 생각되고, 방출된 NO는 주위 혈관 내로 확산하여 혈관확장을 유발한다.
생물학적 활성 재조합 단백질과 펩티드 치료제의 전달을 가능하게 하는 시스템은 많은 연구의 주제이다. 치료제의 국소 전달을 위한 시스템은 더욱 높은 효능을 달성하기 위한 이들 작용제의 생물학적 효과를 가능하게 한다.
재조합 단백질을 생체내에서 원하는 표적으로 전달하는 과제는 여전히 해결되지 않고 있다. 단백질 형질도입 펩티드의 분야에서 발달에도 불구하고, 아데노-관련된 바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 포진 바이러스 벡터, 그리고 플라스미드 발현 벡터를 통한 단백질-코딩 유전자의 고전적인 전달 방법은 단백질의 발현을 위한 여전히 선호되는 선택이다.
바이러스 벡터-매개된 유전자 발현은 특이적 유전자를 복제허용성 세포로 전달하는 이들 벡터의 자연적인 능력으로 인하여, 유사분열에서 활성인 또는 유사분열후 차단된 세포 유형에서 기능적 단백질을 de novo 발현하기 위한 가장 효율적이고 신뢰성 있는 접근법인 것으로 간주된다. 그럼에도 불구하고, 바이러스 벡터는 의도된 단백질의 치료 발현 수준을 달성하기 위하여 반드시 대량으로 요구된다. 게다가, 바이러스 벡터는 숙주 크로마틴 물질과 통합할 수 있다. 이들 특성은 숙주 유전자 체계에 장기적인 효과를 발휘하고, 따라서 이들의 궁극적인 임상 적용에서 안정성이 여전히 심각한 문제로 남아있다.
더욱 안전한 대안적인 접근법은 재조합 단백질을 외인적으로 생산하고, 이후 이들을 표적 장기 내로 전신적으로 또는 국소 주입 (injection)에 의해 전달하는 것이다. 하지만, 세포 또는 조직 내로 재조합 단백질의 전달과 생체이용효율은 더욱 개선을 필요로 한다. 비록 여러 연구에서 약물 발견에서 PTD의 잠재력 및 상이한 세포 내로 최대 120 kDa까지 단백질의 형질도입이 암시되긴 했지만, PTD 매개된 단백질 형질도입의 효능에 관한 의문은 여전히 해결되지 않고 있다. 실제로, 일부 연구에서 시험관내에서/생체내에서 PTD-매개된 융합 단백질 형질도입에서 실패, 그리고 면역 반응을 유도하는 능력 없음이 증명되었다. 게다가, 일부 연구에서 PTD 융합 단백질 또는 다른 비-분비성 단백질의 세포내 발현이 재조합 단백질과 동일한 생체내분포 (biodistribution)를 달성하지 못하고, 그리고 뇌-혈관 장벽 (blood-brain barrier)을 통한 PTD의 진입이 여전히 달성되기 어려운 것으로 밝혀졌다.
본 발명에서는 키나아제의 저해를 위한 치료적 저해물질 펩티드, 키나아제 활성의 저해물질로서 치료 도메인과 단백질 형질도입 도메인을 포함하는 일 부류의 펩티드의 용도, 그리고 다양한 질환에 대한 치료제로서 PTD의 용도를 제시한다.
요약
본 발명에서는 최소한 하나의 키나아제 효소를 저해하는 치료적 저해물질 펩티드의 치료 효과량을 포함하는 키나아제 저해 조성물, 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환을 치료하는 방법, 그리고 이들 키나아제 저해 조성물을 이용하여 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제시한다.
한 측면에 따라서, 본 발명에서는 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환을 치료하기 위한 키나아제 저해 조성물을 제시하고, 상기 조성물은 아래의 성분을 포함한다: (a) 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드, 여기서 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 최소한 하나의 키나아제 효소를 저해하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 첫 번째 도메인 및 두 번째 도메인을 포함하고, 여기서 첫 번째 도메인은 단백질 형질도입 도메인을 포함하고 두 번째 도메인의 근위에 위치하며, 여기서 두 번째 도메인은 치료 도메인을 포함하고 첫 번째 도메인의 근위에 위치하며, 그리고 (b) 제약학적으로 허용되는 담체, 여기서 상기 조성물은 최소한 하나의 염증성 사이토킨의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시킨다. 한 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열이 아미노산 서열 YARRAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 71]에 실질적인 동일성을 갖는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGVAA [SEQ ID NO; 13]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 FAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 43]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 KAFAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 44]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열이 아미노산 서열 KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15]에 실질적인 동일성을 갖는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 그리고 SEQ ID NO: 15 중에서 최소한 하나에 최소한 90% 동일하고 TNF-α 배출을 저해하는 최소한 하나의 변이체를 포함한다. 다른 구체예에 따라서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 그리고 SEQ ID NO: 15 중에서 최소한 하나에 최소한 90% 동일하고 IL-1β 배출을 저해하는 최소한 하나의 변이체를 포함한다. 다른 구체예에 따라서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 그리고 SEQ ID NO: 15 중에서 최소한 하나에 최소한 90% 동일하고 IL-6 배출을 저해하는 최소한 하나의 변이체를 포함한다. 다른 구체예에 따라서, 상기 키나아제 효소는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제이다. 다른 구체예에 따라서, 상기 키나아제 효소는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제 2이다. 다른 구체예에 따라서, 상기 키나아제 효소는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제 3이다. 다른 구체예에 따라서, 상기 키나아제 효소는 Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제이다. 다른 구체예에 따라서, 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환은 천식, 강직성 척추염, I형 당뇨병, 길랑 바레 증후군, 루푸스, 건선, 경피증, 쇼그렌병, 만성 전립선염, 사구체신염, 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류머티스성 관절염, 맥관염, 과민성 맥관염, 내독성 쇼크, 췌장염, 국소 염증성 질환, 동맥경화증, 알츠하이머병, 허혈, 혈관내막 비대, 협착증, 재협착증, 평활근종, 평활근 연축, 협심증, 프린즈메탈 협심증, 서맥, 고혈압, 심장 비대, 신부전, 뇌졸중, 폐 고혈압, 임신 중독증, 레이노 질환, 용혈성 요독증, 치열, 이완불능증, 발기불능, 편두통, 혈관병증, 울혈성 심부전, 기절 심근, 확장기 기능장애, 신경아교종, 만성 폐쇄성 폐 질환, 골감소증, 퇴행성 관절염, 부패증, 경변증, 간질성 폐섬유증, 대장염, 충수염, 위염, 후두염, 수막염, 이염, 외상성 뇌 손상, 척추 손상, 말초 신경병증, 다발성 경화증, 심혈관대사 증후군, 비알코올 지방간염, 췌장과 폐의 낭포성 섬유증, 주사 섬유증, 심근내막 섬유증, 폐의 특발성 폐 섬유증, 종격동 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 유방암, 전립선암 및 내피 세포 기능장애로 구성된 군에서 선택되는 최소한 하나의 질환이다. 다른 구체예에 따라서, 최소한 하나의 염증성 사이토킨은 IL-6, TNFα, 그리고 IL-1β 중에서 최소한 하나이다. 다른 구체예에 따라서, 조성물은 생물의학 장치 상에 또는 내에 배치된다.
다른 측면에 따라서, 본 발명에서는 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 키나아제 저해 조성물을 제공하는 단계, 여기서 키나아제 저해 조성물은 (i) 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드, 여기서 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 최소한 하나의 키나아제 효소를 저해하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 첫 번째 도메인 및 두 번째 도메인을 포함하고, 여기서 첫 번째 도메인은 단백질 형질도입 도메인을 포함하고 두 번째 도메인의 근위에 위치하며, 여기서 두 번째 도메인은 치료 도메인을 포함하고 첫 번째 도메인의 근위에 위치하며, 그리고 (ii) 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하고; (b) 상기 키나아제 저해 조성물을 병든 개체에 투여하여 최소한 하나의 키나아제 효소를 저해하는 단계; 그리고 (c) 최소한 하나의 염증성 사이토킨의 발현을 감소시켜 상기 질환을 치료하는 단계. 한 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열이 아미노산 서열 YARRAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 71]에 실질적인 동일성을 갖는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGVAA [SEQ ID NO; 13]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 FAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 43]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 KAFAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 44]에 실질적인 동일성을 갖는다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열이 아미노산 서열 KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15]에 실질적인 동일성을 갖는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 그리고 SEQ ID NO: 15 중에서 최소한 하나에 최소한 90% 동일하고 TNF-α 배출을 저해하는 최소한 하나의 변이체를 포함한다. 다른 구체예에 따라서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 그리고 SEQ ID NO: 15 중에서 최소한 하나에 최소한 90% 동일하고 IL-1β 배출을 저해하는 최소한 하나의 변이체를 포함한다. 다른 구체예에 따라서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 그리고 SEQ ID NO: 15 중에서 최소한 하나에 최소한 90% 동일하고 IL-6 배출을 저해하는 최소한 하나의 변이체를 포함한다. 다른 구체예에 따라서, 상기 키나아제 효소는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제이다. 다른 구체예에 따라서, 상기 키나아제 효소는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제 2이다. 다른 구체예에 따라서, 상기 키나아제 효소는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제 3이다. 다른 구체예에 따라서, 상기 키나아제 효소는 Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제이다. 다른 구체예에 따라서, 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환은 천식, 강직성 척추염, I형 당뇨병, 길랑 바레 증후군, 루푸스, 건선, 경피증, 쇼그렌병, 만성 전립선염, 사구체신염, 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류머티스성 관절염, 맥관염, 과민성 맥관염, 내독성 쇼크, 췌장염, 국소 염증성 질환, 동맥경화증, 알츠하이머병, 허혈, 혈관내막 비대, 협착증, 재협착증, 평활근종, 평활근 연축, 협심증, 프린즈메탈 협심증, 서맥, 고혈압, 심장 비대, 신부전, 뇌졸중, 폐 고혈압, 임신 중독증, 레이노 질환, 용혈성 요독증, 치열, 이완불능증, 발기불능, 편두통, 혈관병증, 울혈성 심부전, 기절 심근, 확장기 기능장애, 신경아교종, 만성 폐쇄성 폐 질환, 골감소증, 퇴행성 관절염, 부패증, 경변증, 간질성 폐섬유증, 대장염, 충수염, 위염, 후두염, 수막염, 이염, 외상성 뇌 손상, 척추 손상, 말초 신경병증, 다발성 경화증, 심혈관대사 증후군, 비알코올 지방간염, 췌장과 폐의 낭포성 섬유증, 주사 섬유증, 심근내막 섬유증, 폐의 특발성 폐 섬유증, 종격동 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 유방암, 전립선암 및 내피 세포 기능장애로 구성된 군에서 선택되는 최소한 하나의 질환이다. 다른 구체예에 따라서, 최소한 하나의 염증성 사이토킨은 IL-6, TNFα, 그리고 IL-1β 중에서 최소한 하나이다. 다른 구체예에 따라서, 단계 (a)는 생물의학 장치를 이식함으로써 수행되고, 여기서 조성물은 생물의학 장치 상에 또는 내에 배치된다. 다른 구체예에 따라서, 단계 (a)는 비경구로 수행된다.
상세한 설명
본 발명에서는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제를 저해하는데 유용한 치료 키나아제 저해 조성물과 방법을 제시한다.
용어
아미노산에 대하여 본 명세서에서 이용된 약어는 편의하게 이용되는 약어이다: A=Ala=알라닌; R=Arg=아르기닌; N=Asn=아스파라긴; D=Asp=아스파르트산; C=Cys=시스테인; Q=Gln=글루타민; E=Glu=글루타민산; G=Gly=글리신; H=His=히스티딘; I=Ile=이소류신; L=Leu=류신; K=Lys=리신; M=Met=메티오닌; F=Phe=페닐알라닌; P=Pro=프롤린; S=Ser=세린; T=Thr=트레오닌; W=Trp=트립토판; Y=Tyr=티로신; V=Val=발린. 아미노산은 L- 또는 D-아미노산일 수 있다. 아미노산은 펩티드의 반감기를 증가시키기 위하여, 또는 펩티드의 효능을 증가시키기 위하여, 또는 펩티드의 생체이용효율을 증가시키기 위하여 변경되는 합성 아미노산에 의해 대체될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "투여한다"는 투약하거나, 공급하거나, 적용하거나, 제공하거나, 분배하거나, 또는 기여하는 것을 지칭한다. 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 동의어로서 이용되고 탈체에서 조직에 직접적인 투여뿐만 아니라 생체내에서 투여를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 전통적인 비독성 제약학적으로 허용되는 담체, 어쥬번트, 그리고 원하는 경우에 운반제를 포함하는 투약 단위 제제 (dosage unit formulation)에서 경구, 협측, 비경구, 국소, 흡입 (즉, 입 또는 코를 통하여), 또는 직장으로 전신 투여되거나, 또는 주입, 이식, 조직 이식, 국소 적용, 또는 비경구가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 수단에 의해 국소 투여될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "비경구"는 예로써, 피하 (즉, 피부 아래 주입), 근육내 (즉, 근육 내로 주입), 정맥내 (즉, 정맥 내로 주입), 척수강내 (즉, 척추 주변 공간 내로 또는 뇌의 거미막 (arachnoid membrane) 아래 주입), 흉골내 주입 또는 주사 기술을 비롯한 주입 (즉, 주입에 의한 투여)의 방법으로 체내 도입을 지칭한다. 비경구 투여된 조성물은 바늘, 예를 들면, 외과 바늘을 이용하여 전달된다. 본 명세서에서, 용어 "외과 바늘"은 유체 (즉, 유동가능) 조성물의 선택된 해부학적 구조 내로의 전달을 위하여 적합되는 임의의 바늘을 지칭한다. 주입가능 제조물, 예를 들면, 예를 들면, 무균 주입가능 수성 또는 유성 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용하여 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다.
추가의 투여는 예로써, 정맥내, 심장주위, 경구, 임플란트 경유, 경점막, 경피, 근육내, 피하, 복막내, 척수강내, 림프내, 병소내, 또는 경막외로 수행될 수 있다. 투여는 예로써, 1회, 수회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "국소 투여" 및 "국소적으로 적용하는"은 펩티드, 핵산, 또는 상기 펩티드 또는 핵산을 포함하는 벡터를 상피 표면을 비롯한 조직 또는 세포의 하나 이상의 표면으로 전달하는 것을 지칭하는 동의어로서 이용된다.
경피 투여와 대조적으로, 국소 투여는 일반적으로, 전신 효과보다는 국소 효과를 제공한다. 본 명세서에서, 용어 "국소 투여" 및 "경피 투여"는 달리 명시되거나 암시되지 않으면, 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 용어 "연관시킨다" 및 이의 다양한 문법적 형태는 직접적으로, 간접적으로, 활성적으로, 비활성적으로, 불활성으로, 비-불활성으로, 완전하게 또는 불완전하게 결합, 연결 또는 통합을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "생체적합성"은 임상적 위험/이익 평가에 기초하여, 생존 조직에 임상적으로 관련된 조직 자극, 손상, 독성 반응, 또는 면역학적 반응을 유발하지 않는다는 것을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "생체분해성"은 단순한 화학적 과정에 의해, 신체 효소의 작용에 의해, 또는 인체 내에서 다른 유사한 기전에 의해 시간의 흐름에서 능동적으로 또는 수동적으로 분해되는 물질을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "담체"는 자연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 지칭하고, 활성 성분은 이들과 결합하여, 생물체에 현저한 자극을 유발하지 않고 본 발명의 조성물의 생물학적 활성과 특성을 소멸시키지 않는 적용이 용이하게 달성될 수 있다. 담체는 치료되는 개체에 투여에 그들을 적합하게 만들 만큼 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 담체는 불활성이거나, 또는 제약학적 이익물질, 미용적 이익물질 또는 둘 모두를 보유할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "질환"은 다양한 건강 상태를 지칭하고, 그리고 임의의 기초 기전 또는 질환, 손상, 그리고 건강한 조직과 장기의 증진에 의해 유발되는 질환 또는 장애를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서, 용어 "접촉시키는"은 접촉시키는 것을 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 "접촉시킨다"는 접촉, 또는 인접 또는 공간적 근접의 상태 또는 조건을 지칭한다. 조성물을 표적 목적지, 예를 들면, 장기, 조직, 세포, 또는 종양에 접촉시키는 것은 당업자에게 공지된 임의의 투여 수단에 의해 진행될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "제어가능 조절 요소"는 핵산의 발현을 달성할 수 있는 핵산 서열, 또는 이들의 펩티드 또는 단백질 산물을 지칭한다. 제어가능 조절 요소는 본 발명의 핵산, 펩티드, 또는 단백질에 작동가능하게 연결될 수 있다. 제어가능 조절 요소, 예를 들면, 조절 서열은 이들이 발현을 주동하는 기능을 한다면, 이들에 의해 발현이 조절되는 핵산, 펩티드, 또는 단백질과 인접할 필요가 없다. 따라서 비번역되지만 전사되는 개재성 서열이 프로모터 서열과 본 발명의 핵산 사이에 존재할 수 있고, 그리고 상기 프로모터 서열은 코딩 서열에 여전히 "작동가능하게 연결되는" 것으로 간주될 수 있다. 다른 이와 같은 조절 서열에는 폴리아데닐화 신호, 종결 신호, 그리고 리보솜 결합 부위가 포함되지만 이들이 국한되지 않는다.
용어 "조절 방출"은 약물 방출의 방식과 프로필이 조절되는 임의의 약물-포함 제제를 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 즉시와 비-즉시 방출 제제를 지칭하고, 비-즉시 방출 제제에는 지속 방출 제제와 지연 방출 제제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "사이토킨"은 다른 세포에 다양한 효과를 나타내는, 세포에 의해 분비되는 작은 가용성 단백질 물질을 지칭한다. 사이토킨은 성장, 발달, 상처 치유, 그리고 면역 반응을 비롯한 많은 중요한 생리학적 기능을 매개한다. 이들은 세포 막 내에 위치하는 그들의 세포-특이적 수용체에 결합함으로써 기능하고, 이는 별개의 신호 형질도입 캐스케이드가 세포 내에서 시작될 수 있도록 하고, 이는 궁극적으로, 표적 세포에서 생화학적 및 표현형적 변화를 유발할 것이다. 일반적으로, 사이토킨은 국지적으로 작용한다. 이들에는 다수의 인터류킨과 여러 조혈 성장 인자를 비롯한 I형 사이토킨; 인터페론과 인터류킨-10을 비롯한 II형 사이토킨; TNFα와 림포톡신을 비롯한 종양 괴사 인자 ("TNF")-관련된 분자; 인터류킨 1 ("IL-1")을 비롯한 면역글로불린 대집단 구성원; 그리고 매우 다양한 면역 기능과 염증성 기능에서 결정적인 역할을 수행하는 분자 집단인 케모킨이 포함된다. 동일한 사이토킨이 세포의 상태에 따라, 세포에 대한 상이한 효과를 나타낼 수 있다. 사이토킨은 종종, 다른 사이토킨의 발현을 조절하고 이들의 캐스케이드를 유인한다.
본 명세서에서, 용어 "지연 방출"은 전통적인 의미에서, 제제의 투여 및 이로부터 약물의 방출 사이에 시간 지연이 존재하는 약물 제제를 지칭한다. "지연 방출"은 연장된 기간에 걸쳐 약물의 점진적인 방출을 수반하거나 수반하지 않을 수 있고, 따라서 "지속 방출"이거나 아닐 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "질환" 또는 "장애"는 일반적으로, 건강의 손상, 또는 비정상적인 기능의 상태를 지칭한다. 본 발명에 관련된 질환에는 염증성 질환, 섬유증, 내독성 쇼크, 췌장염, 천식, 국소 염증성 질환, 죽상경화성 심혈관 질환, 알츠하이머병, 종양 질환, 신경 허혈, 류머티스성 관절염, 크론병, 염증성 장 질환, 혈관내막 비대, 협착증, 재협착증, 동맥경화증, 평활근 세포 종양과 전이, 평활근 연축, 협심증, 프린즈메탈 협심증, 허혈, 서맥, 고혈압, 심장 비대, 신부전, 뇌졸중, 폐 고혈압, 임신 중독증, 조산, 자간전증, 자간, 레이노 질환 또는 현상, 용혈성 요독증, 치열, 이완불능증, 발기불능, 편두통, 평활근 연축과 연관된 허혈성 근육 손상, 혈관병증, 서맥, 울혈성 심부전, 기절 심근, 폐 고혈압, 확장기 기능장애, 신경아교종 (성상세포의 증식을 의미함, 이는 중추신경계의 손상된 부위에서 세포외 기질 (ECM)의 침착을 포함할 수 있음), 만성 폐쇄성 폐 질환 (기도 폐쇄 또는 제한으로 특징되는 호흡기 질환을 의미함; 만성 기관지염과 기종이 포함되지만 이들에 국한되지 않음), 골감소증, 내피 기능장애, 염증, 퇴행성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌병, 길랑 바레 질환, 전염성 질환, 부패증, 내독소혈증성 쇼크, 건선, 방사선 장염, 경피증, 경변증, 간질성 폐섬유증, 대장염, 충수염, 위염, 후두염, 수막염, 췌장염, 이염, 재관류 손상, 외상성 뇌 손상, 척추 손상, 말초 신경병증, 다발성 경화증, 루푸스, 알레르기, 심혈관대사 질환, 비만, II형 당뇨병, I형 당뇨병, 그리고 NASH/경변증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "도메인"은 다소간 독립적으로 접힘되어 구형 밀집 구조를 형성하는 단백질의 구조 단위를 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 "약물"은 질환의 예방, 진단, 경감, 치료, 또는 치유에 이용되는 치료제, 또는 식품 이외의 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "혼성화"는 염기 대합 (base paring)을 통한 2개의 단일 가닥 핵산 분자의 상호 결합을 지칭한다. 뉴클레오티드는 정상적인 조건 하에 그들의 보체에 결합하고, 따라서 2개의 완전하게 상보적인 가닥은 서로 용이하게 결합 (또는 '어닐링(annealing))할 것이다. 하지만, 이들 뉴클레오티드의 상이한 분자 결합구조 (molecular geometry)로 인하여, 이들 2개의 가닥 사이에 단일 불일치는 그들 사이에 결합을 에너지 측면에서 더욱 불리하게 만들 것이다. 염기 비양립성 (base incompatibility)의 효과는 2개의 가닥이 어닐링하는 비율을 정량함으로 측정될 수 있고, 이는 어닐링되는 이들 2개의 가닥 사이에 염기 서열에서 유사성에 관한 정보를 제공할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "수화겔"은 젤라틴 모양 또는 젤리-유사 덩어리를 생산하기 위하여 필요한 수성 성분을 포함하는 고형, 반고형, 의소성, 또는 소성 구조를 발생시키는 물질을 지칭한다. 수화겔은 상당한 양의 H2O를 통합하고 유지하며, 이는 궁극적으로, 수성 환경의 존재에서 평형 함량 (equilibrium content)에 도달할 것이다.
본 명세서에서, 용어 "친수성"은 극성 물질에 대한 친화성을 갖는 재료 또는 물질, 예를 들면, 물을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "체내에서", "공극 부피 (void volume)", "절제 포켓 (resection pocket)", "함요 (excavation)", "주사 부위", "침착 부위" 또는 "이식 부위"는 제한 없이 신체의 모든 조직을 포함하는 것으로 의도되고, 그리고 주사, 외과적 절개, 종양 또는 조직 제거, 조직 손상, 종기 형성으로부터 그 내부에 형성된 공간, 또는 무제한적 실례로서 질환 또는 병리에 대한 임상적 평가, 치료 또는 생리학적 반응의 작용에 의해 형성된 임의의 다른 유사한 구멍, 공간, 또는 포켓을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "저해하는", "저해한다" 또는 "저해"는 임의의 과정의 양 또는 비율을 감소시키거나, 이러한 과정을 완전히 중단시키거나, 또는 이의 작용 또는 기능을 감소, 제한, 또는 차단하는 것을 지칭하는데 이용된다. 저해는 참고 물질과 비교할 때, 양, 비율, 작용 기능, 또는 과정의 최소한 5%, 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 감소를 포함하고, 여기서 참고 물질은 저해되지 않은 물질이다.
본 명세서에서, 용어 "손상"은 물리적 또는 화학적인 외부 작인 또는 힘에 의해 유발된 신체의 구조 또는 기능에 손상 또는 해악을 지칭한다.
용어 "분리된"은 (1) 자연 발생 환경에서 관찰되는 바와 같이 정상적으로 동반되거나 상호작용되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질, 예를 들면, 핵산, 펩티드, 또는 단백질을 지칭한다. 용어 "실질적으로 또는 본질적으로 없는"은 자연 발생 환경에서 관찰되는 바와 같이 정상적으로 동반되거나 상호작용되는 성분이 최소한 80% 없는 물질을 지칭하는데 이용된다. 분리된 물질은 선택적으로, 자연 환경에서 상기 물질과 함께 관찰되지 않는 물질을 포함한다; 또는 (2) 물질이 자연 환경에 존재하면, 상기 물질은 조성에 계획적인 인간 개입에 의해 합성적으로 (비-자연적으로) 변형되고 및/또는 상기 환경에서 관찰되는 물질에 고유하지 않는 세포 내에 위치 (가령, 게놈 또는 세포내 세포소기관)에 배치된다. 합성 물질을 산출하기 위한 변경은 자연 상태 내에서, 또는 자연 상태로부터 이전된 상기 물질에서 수행될 수 있다. 가령, 자연 발생 핵산은 이러한 핵산이 기원하는 세포 내에서 수행된 인간 개입에 의해 변경되거나, 또는 변경된 DNA로부터 전사되면, 분리된 핵산이 된다. 예로써, Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, U.S. Pat. No. 5,565,350; In Vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling et al., PCT/US93/03868를 참조한다. 유사하게, 자연 발생 핵산 (가령, 프로모터)은 상기 핵산에 고유하지 않은 게놈의 좌위에 비-자연 발생 수단에 의해 도입되면 분리된다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이 "분리된" 핵산은 또한, "이종성" 핵산으로 지칭된다.
본 명세서에서, 용어 "키나아제"는 포스페이트 기를 높은 에너지 공여자 분자에서 특이적 표적 분자 또는 기질로 이전하는 효소 유형을 지칭한다. 높은 에너지 공여자 기에는 ATP가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "키나아제 활성"은 키나아제 기질의 키나아제 매개된 인산화를 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "키나아제 기질"은 키나아제에 의해 인산화될 수 있는 기질을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "불안정한"은 다양한 문법적 형태에서, 변화되기 쉽거나 변화될 가능성이 있음을 지칭한다. 불안정한 화합물은 상태를 변화시키거나, 또는 비활성화될 수 있는 것이다.
본 명세서에서, 용어 "친유성"은 극성 또는 수성 환경에 비하여, 비-극성 환경에 대한 친화성을 선호하거나 갖는 것을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "장기 방출"은 이식물이 최소한 7일, 또는 대략 30일 내지 대략 60일 동안 치료 수준의 활성 성분을 전달하도록 구성되고 정렬된다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "포유동물 세포"는 포유류 과의 동물로부터 유래된 세포를 지칭한다. 본 명세서에서, 포유동물 세포에는 정상, 비정상, 그리고 형질전환된 세포가 포함된다. 본 발명에 이용되는 포유동물 세포의 실례에는 뉴런, 상피 세포, 근육 세포, 혈액 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 골세포, 내피 세포와 미분화 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "조정한다"는 일정한 치수 또는 비율로 조절, 변경, 개조, 또는 조정한다는 것을 의미한다.
용어 "정상적인"은 다수 군의 표준, 모형, 중앙 값 또는 평균을 지칭한다.
용어 "정상적인 건강한 개체"는 염증성 질환의 증상 또는 기타 증거를 나타내지 않는 개체를 지칭한다.
용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태에서 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭하고, 그리고 달리 제한되지 않으면, 이들이 자연 발생 뉴클레오티드 (가령, 펩티드 핵산)에 유사한 방식으로 단일-가닥 핵산에 혼성화된다는 점에서, 자연 뉴클레오티드의 본질적인 성질을 갖는 공지된 유사체를 포함한다.
용어 "뉴클레오티드"는 헤테로환형 염기, 당, 그리고 하나 이상의 포스페이트 기로 구성되는 화학적 화합물을 지칭한다. 가장 일반적인 뉴클레오티드에서, 염기는 퓨린 또는 피리미딘의 유도체이고, 그리고 당은 펜토오스 디옥시리보오스 또는 리보오스이다. 뉴클레오티드는 핵산의 단량체이고, 핵산을 형성하기 위하여 3개 또는 그 이상의 결합을 보유한다. 뉴클레오티드는 RNA, DNA, 그리고 CoA, FAD, DMN, NAD와 NADP가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 여러 보조인자의 구조 단위이다. 퓨린에는 아데닌 (A), 그리고 구아닌 (G)이 포함된다; 피리미딘에는 시토신 (C), 티민 (T), 그리고 우라실 (U)이 포함된다.
구(句) "작동가능하게 연결되는"은 첫 번째 서열(들) 또는 도메인이 두 번째 서열 또는 도메인의 제어 하에 두 번째 서열(들) 또는 도메인 또는 영역에 영향력을 발휘할 수 있도록, 두 번째 서열(들) 또는 도메인에 충분히 가깝게 배치되는 첫 번째 서열(들) 또는 도메인을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "입자"는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 키나아제 저해 조성물을 전체적으로 또는 부분적으로 포함하는 극히 작은 성분 (가령, 나노입자, 마이크로입자, 또는 일부 경우에 더욱 큰 입자)을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결되는 2개 또는 그 이상의 아미노산을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "폴리펩티드", "펩티드"와 "단백질" 은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 동의어로서 이용된다. 이들 용어는 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 자연 발생 아미노산의 이런 유사체의 본질적인 성질은 단백질 내로 통합될 때, 상기 단백질이 동일한 단백질에 대하여 유도되지만 자연 발생 아미노산으로만 구성되는 항체에 특이적으로 반응성이라는 것이다. 용어 "폴리펩티드" , "펩티드"와 "단백질"은 또한, 당화, 지질 부착, 황산화, 글루타민산 잔기의 감마-카르복실화, 히드록실화와 ADP-리보실화가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 변형을 고려한다. 당분야에 널리 공지되고 앞서 기술된 바와 같이, 폴리펩티드는 완전한 선형이 아닐 수도 있다. 가령, 폴리펩티드는 유비퀴틴화의 결과로서 가지화 (branching)될 수 있고, 그리고 이들은 일반적으로, 자연적으로 발생하지 않는 인간 조작에 의해 수행되는 자연적인 가공 이벤트(들)를 비롯한 번역후 이벤트의 결과로써 가지화되거나 가지화되지 않은 원형일 수 있다. 원형, 가지형, 그리고 가지화된 원형 폴리펩티드는 또한, 비-번역 자연 과정 및 전적으로 합성 방법에 의해 합성될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "펩티드유사체"는 펩티드를 모방하도록 설계된 작은 단백질-유사 사슬을 지칭한다. 펩티드유사체는 전형적으로, 분자의 특성을 변경하기 위하여 기존 펩티드의 변형으로부터 발생한다.
본 명세서에서, 용어 "제약학적으로 허용되는 담체"는 인간 또는 다른 척추 동물에 투여하기 적합한 하나 이상의 양립성 고형 또는 액상 충전제, 희석액 또는 캡슐화 물질을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "중합체"는 서로 연결된 더욱 작은 동일한 분자 (단량체로 불림)로 만들어지는 임의의 다양한 화학적 화합물을 지칭한다. 중합체는 일반적으로, 높은 분자량을 갖는다. 분자가 서로 연결되어 중합체를 형성하는 과정은 "중합화"로 불린다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 디옥시리보폴리뉴클레오티드, 리보폴리뉴클레오티드, 또는 이들이 엄격한 혼성화 조건 하에, 자연 발생 뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 혼성화되고 및/또는 자연 발생 뉴클레오티드(들)와 동일한 아미노산(들)으로 번역을 가능하게 한다는 점에서, 자연 리보뉴클레오티드의 본질적인 성질을 갖는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 고유 또는 이종성 구조 또는 조절 유전자의 전장 또는 하위서열일 수 있다. 달리 지시되지 않으면, 상기 용어는 명시된 서열, 그리고 이들의 상보적인 서열에 대한 지시를 포함한다. 따라서 안정성 또는 다른 이유로 변형된 골격을 보유하는 DNA 또는 RNA는 상기 용어가 본 명세서에서 의도되는 바와 같이 "폴리뉴클레오티드"이다. 게다가, 예로써, 특별한 염기, 예를 들면, 이노신, 또는 변형된 염기, 예를 들면, 트리틸화된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA는 상기 용어가 본 명세서에서 의도되는 바와 같이 폴리뉴클레오티드이다. 당업자에게 공지된 많은 유용한 목적을 만족시키는 다양한 변형이 DNA와 RNA에 만들어지고 있다. 용어 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드의 이런 화학적으로, 효소적으로 또는 물질대사적으로 변형된 형태, 그리고 특히, 단순한 세포와 복잡한 세포를 비롯하여 바이러스와 세포에 특징적인 DNA와 RNA의 화학적 형태를 포괄한다.
본 명세서에서, 용어 "일차 서열"은 아미노산 서열을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "프로드러그"는 비활성 형태이고, 그리고 개체에 투여 이후에 생물학적 전환에 의해 활성 형태로 전환되는 펩티드 또는 유도체를 의미한다.
본 명세서에서, 아래의 용어는 2개 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 사이에 서열 상관관계를 설명하기 위하여 이용된다: (a) "참고 서열", (b) "비교 창", (c) "서열 동일성", (d) "서열 동일성 비율", 그리고 (e) "실질적인 동일성".
용어 "참고 서열"은 서열 비교를 위한 기초로서 이용되는 서열을 지칭한다. 참고 서열은 명시된 서열의 부분집합 또는 전체일 수 있다; 예로써, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 단편, 또는 완전 cDNA 또는 유전자 서열로서.
용어 "비교 창"은 폴리뉴클레오티드 서열의 연속적인 명시된 단편을 지칭하고, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 참고 서열에 비교되고, 그리고 여기서 비교 창 내에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 두 서열의 최적 정렬을 위하여 참고 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함하지 않는다. 일반적으로, 비교 창은 최소한 20개 연속 뉴클레오티드 길이를 갖고, 그리고 선택적으로, 최소한 30개 연속 뉴클레오티드 길이, 최소한 40개 연속 뉴클레오티드 길이, 최소한 50개 연속 뉴클레오티드 길이, 최소한 100개 연속 뉴클레오티드 길이, 또는 그 이상의 길이를 가질 수 있다. 당업자는 폴리뉴클레오티드 서열 내에 갭의 포함으로 인한 참고 서열에 높은 유사성을 피하기 위하여, 전형적으로 갭 페널티 (gap penalty)가 도입되고 매치 (match)의 총수로부터 감수된다는 것을 인지할 것이다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해; of Needleman and Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci, 85:2444 (1988)의 유사성 검색 방법에 의해; Intelligenetics, Mountain View, Calif에 의한 PC/Gene 프로그램에서 CLUSTAL; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., USA에서 GAP, BESTFIT5 BLAST, FASTA, 그리고 TFASTA; CLUSTAL 프로그램은 Higgins and Sharp, Gene 73:237-244 (1988)에서 충분히 기술된다; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992), 그리고 Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 이들 알고리즘의 컴퓨터화 임플러먼테이션 (computerized implementation)에 의해 수행될 수 있다. 데이터베이스 유사성 검색에 이용될 수 있는 BLAST 계통의 프로그램에는 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대비하여 뉴클레오티드 쿼리 서열에 대한 BLASTN; 단백질 데이터베이스 서열에 대비하여 뉴클레오티드 쿼리 서열에 대한 BLASTX; 단백질 데이터베이스 서열에 대비하여 단백질 쿼리 서열에 대한 BLASTP; 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대비하여 단백질 쿼리 서열에 대한 TBLASTN; 그리고 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대비하여 뉴클레오티드 쿼리 서열에 대한 TBLASTX가 포함된다 (참조: Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds,, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).
달리 명시되지 않으면, 본 명세서에 제공된 서열 동일성/유사성 값은 디폴트 파라미터 (default parameter)를 이용하여 BLAST 2.0 프로그램을 이용하여 획득된 값을 지칭한다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 예로써, National Center for Biotechnology-Information ()를 통해 공개적으로 가용하다. 상기 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열 내에서 동일한 길이의 단어 (word)로 정렬될 때, 다소의 양성-평가된 역치 스코어 T에 조화되거나, 또는 이를 충족시키는, 쿼리 서열 내에서 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 고득점 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 단계를 필요로 한다. T는 이웃 단어 스코어 역치 (neighborhood word score threshold)로 지칭된다 (Altschul et al., supra). 이들 최초 이웃 단어 히트는 이들을 포함하는 더욱 긴 HSP를 찾아내는 검색을 시작하기 위한 종자로서 기능한다. 이들 단어 히트는 이후, 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있으면, 각 서열을 따라 양쪽 방향으로 신장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열의 경우에, 파라미터 M (한 쌍의 정합 (matching) 잔기에 대한 보상 스코어; 항상>0)과 N (미스매치 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상<0)을 이용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우에, 누적 스코어를 계산하기 위하여 득점 매트릭스 (scoring matrix)가 이용된다. 각 방향에서 단어 히트의 신장은 누적 정렬 스코어가 최대 달성된 값으로부터 X 양(量) 감소할 때 중단된다; 누적 스코어는 하나 이상의 음성-득점 잔기 정렬의 누적으로 인하여 0 또는 그 미만으로 떨어진다; 또는 어느 한쪽 서열의 단부가 도달된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 그리고 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서, 11의 단어 길이 (W), 10의 기대값 (E), 100, M=5, N=-4의 컷오프, 그리고 양쪽 가닥의 비교를 이용한다. 아미노산 서열의 경우에, BLASTP 프로그램은 디폴트로서, 3의 단어 길이 (W), 10의 기댓값 (E), 그리고 BLOSUM62 득점 매트릭스를 이용한다 (참조: Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).
서열 동일성 비율을 계산하는 것에 더하여, BLAST 알고리즘은 또한, 두 서열 사이에 유사성의 통계학적 분석을 수행한다 (참조: Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이에 정합이 우연히 발생하는 확률의 시도 (indication)를 제공하는 최소 합계 확률 (smallest sum probability) (P(N))이다. BLAST 검색은 단백질이 무작위 서열로서 모형화될 수 있다고 추정한다. 하지만, 많은 실제 단백질은 동종중합성 구역, 짧은-기간 반복부위, 또는 하나 이상의 아미노산이 농축된 영역일 수 있는 비-무작위 서열의 영역을 포함한다. 이런 낮은 복합성 영역은 단백질의 다른 영역이 완전히 상이함에도 불구하고, 관계없는 단백질 간에 정렬될 수 있다. 이런 낮은 복합성 정렬을 감소시키기 위하여 다수의 낮은 복합성 필터 프로그램이 이용될 수 있다. 가령, SEG (Wooten and Federhen, Comput. Chem., 17:149-163 (1993)) 및 XNU (Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) 낮은 복합성 필터가 단독으로 또는 조합으로 이용될 수 있다.
본 명세서에서, 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 배경에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정된 비교 창에서 최대 대응 (maximum correspondence)을 위하여 정렬될 때, 동일한 이들 두 서열 내에 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비율이 단백질과 관련하여 이용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종, 보존성 아미노산 치환 (즉, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (가령, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체된다)에 의해 상이하고, 따라서 상기 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 서열이 보존성 치환에 의해 상이한 경우에, 서열 동일성 비율은 치환의 보존적 성질을 보정하기 위하여 상향 조정될 수 있다. 이런 보존성 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 일컬어진다. 이러한 조정을 만들기 위한 수단은 당분야에 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 이는 완전한 미스매치 보다는 부분적인 미스매치로서 보존성 치환을 기록하여 서열 동일성 비율을 증가시키는 단계를 필요로 한다. 따라서 예로써, 동일한 아미노산은 1의 스코어가 제공되고 비-보존성 치환은 0의 스코어가 제공되는 경우에, 보존성 치환은 0과 1 사이의 스코어가 제공된다. 보존성 치환의 득점은 예로써, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., USA)에서 수행된 바와 같이, Meyers and Miller, Computer Applic. Biol, Sci., 4:11-17 (1988)의 알고리즘에 따라서 계산된다.
본 명세서에서, "서열 동일성 비율"은 비교 창에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 의미하고, 여기서 비교 창 내에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 이들 두 서열의 최적 정렬을 위하여 참고 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함하지 않는다. 상기 비율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 총수를 결정하여 정합된 위치의 총수를 산출하고, 정합된 위치의 총수를 비교 창 내에서 위치의 총수로 나눗셈하고, 그리고 획득된 결과를 100으로 곱셈하여 서열 동일성 비율을 산출함으로써 계산된다.
폴리뉴클레오티드 서열의 용어 "실질적인 동일성"은 표준 파라미터를 이용하여 기술된 정렬 프로그램 중에서 한 가지를 이용하여, 폴리뉴클레오티드가 참고 서열과 비교하여 최소한 70% 서열 동일성, 최소한 80% 서열 동일성, 최소한 90% 서열 동일성 및 최소한 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 당업자는 이들 값이 코돈 축퇴성 (codon degeneracy), 아미노산 유사성, 해독 틀 위치 등을 고려함으로써 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질의 상응하는 동일성을 결정하기 위하여 적절하게 조정될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이들 목적을 위한 아미노산 서열의 실질적인 동일성은 통상적으로, 최소한 60%, 또는 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 90%, 또는 최소한 95%의 서열 동일성을 의미한다. 뉴클레오티드 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 암시는 2개의 분자가 엄격한 조건 하에 서로 혼성화되는 것이다. 하지만, 엄격한 조건 하에 서로 혼성화되지 않는 핵산은 이들이 인코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하면, 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예로써, 핵산의 사본이 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 이용하여 산출될 때 발생할 수 있다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 한 가지 암시는 첫 번째 핵산이 인코딩하는 폴리펩티드가 두 번째 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응하는 것이다.
펩티드의 배경에서 용어 "실질적인 동일성"은 펩티드가 특정된 비교 창에서 참고 서열에 최소한 70% 서열 동일성, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 지시한다. 선택적으로, 최적 정렬은 Needleman and Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘을 이용하여 수행된다. 2개의 펩티드 서열이 실질적으로 동일하다는 암시는 한쪽 펩티드가 두 번째 펩티드에 대하여 발생된 항체와 면역학적으로 반응하는 것이다. 따라서 한쪽 펩티드는 예로써, 2개의 펩티드가 보존성 치환에 의해서만 상이한 경우에, 두 번째 펩티드에 실질적으로 동일하다. "실질적으로 유사한" 펩티드는 동일하지 않은 잔기 위치가 보존성 아미노산 변화에 의해 달라지는 점을 제외하고, 앞서 언급된 바와 같이 서열을 공유한다.
본 명세서에서, 용어 "단백질 형질도입 도메인" (일명, "PTD", "Trojan 펩티드", "막 투과 서열", "세포 침투성 단백질", "CPP")은 일반적으로, 포유동물 세포의 원형질막을 침투할 수 있는 일 부류의 펩티드를 지칭한다. PTD는 일반적으로, 10-16개 아미노산 길이를 갖고, 그리고 많은 유형과 분자량의 화합물을 포유동물 세포를 넘어서 수송할 수 있다. 이들 화합물에는 작동체 분자, 예를 들면, 단백질, DNA, 접합된 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 그리고 소형 입자, 예를 들면, 리포좀이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. PTD가 다른 단백질에 화학적으로 연결되거나 융합되어 융합 단백질을 형성할 때, 이들 융합 단백질은 여전히, 원형질막을 침투하고 세포에 들어갈 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "감소시킨다" 또는 "감소시키는" 는 정도, 강도, 상태, 조건, 또는 크기에서 하락 또는 감소를 지칭한다.
용어 "조절 서열" (일명, "조절 영역" 또는 "조절 요소")은 DNA의 프로모터, 인핸서 또는 다른 단편을 지칭하고, 여기서 조절 단백질, 예를 들면, 전사 인자는 우선적으로 결합하여 유전자 발현 및 결과로써, 단백질 발현을 조절한다.
용어 "개체" 또는 "환자"는 생쥐, 쥐, 고양이, 염소, 양, 말, 햄스터, 흰족제비, 오리너구리, 돼지, 개, 기니 피그, 토끼와 영장류, 예를 들면, 원숭이, 유인원, 또는 인간이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 포유동물 기원의 동물 종의 구성원을 지칭하는 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 용어 "지속 방출" (일명, "연장된 방출")은 통상적인 의미에서, 연장된 기간에 걸쳐 약물의 점진적인 방출을 제공하고, 그리고 반드시 그러한 것은 아니지만 바람직하게는, 연장된 기간에 걸쳐 약물의 실질적으로 일정한 혈액 수준을 결과하는 약물 제제를 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "증상"은 특히, 정상적인 기능, 감각, 또는 외형으로부터 변화로서 개체에 의해 경험될 때, 질환 또는 장애의 증후 또는 징후를 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "증후군"은 일부 질환 또는 장애를 나타내는 증상의 패턴을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "치료제"는 치료 효과를 제공하는 약물, 분자, 핵산, 단백질, 대사물질, 펩티드, 조성물 또는 기타 물질을 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 "활성"은 의도된 치료 효과를 책임지는 본 발명의 조성물의 원료, 성분 또는 구성물을 지칭한다. 용어 "치료제"와 "활성제"는 본 명세서에서 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 용어 "치료 성분"은 일정한 비율의 개체군에서 특정한 질환 증상을 제거하거나, 감소시키거나, 또는 이의 진행을 예방하는 치료 효과적 투약 (즉, 투여량과 투여 빈도)을 지칭한다. 통상적으로 이용되는 치료 성분의 실례는 50%의 개체군에서 특정한 질환 증상에 치료 효과적인 특정한 투약 동안 용량을 기술하는 ED50이다.
본 명세서에서, 용어 "치료 도메인"은 펩티드 KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13], 또는 이의 단편에 실질적인 동일성을 갖는 펩티드, 펩티드 단편, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 지칭한다. 치료 도메인은 일반적으로, 포유동물 세포의 원형질막을 침투할 수 없고, 그리고 키나아제 효소와 접촉될 때, 키나아제 효소의 키나아제 활성이 감소되도록 키나아제 효소를 저해한다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 99%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 95%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 90%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 85%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 80%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 75%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 70%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 80%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 75%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 70%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 65%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 60%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 55%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 50%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 45%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 40%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 35%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 30%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 25%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 20%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 15%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 10%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 9%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 8%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 7%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 6%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 5%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 4%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 3%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 2%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 1%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 0.1%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다. 치료 도메인은 키나아제 효소의 활성이 저해되지 않은 키나아제 효소의 활성의 대략 0.01%가 되도록 키나아제 효소를 저해할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "치료적 저해물질 펩티드"는 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인으로 구성되는 펩티드를 지칭한다. 첫 번째 도메인은 단백질 형질도입 도메인 (PTD)을 포함하고 두 번째 도메인의 근위에 위치한다. 두 번째 도메인은 첫 번째 도메인의 근위에 위치하고 치료 도메인을 포함한다. 본 명세서에서, 용어 "근위"는 공간, 시간 또는 순서에서 매우 가까움 또는 그 다음을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "치료 효과"는 바람직하고 유익한 것으로 판단되는 치료의 결과를 지칭한다. 치료 효과는 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 증상의 중기, 감소, 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 증상의 진행의 중지, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 가지 이상의 활성제의 용어 "치료 효과량" 또는 "효과량"은 치료 효과를 제공할 만큼 충분한 양이다. 일반적으로, 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 활성제의 효과량은 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg 범위이다. 하지만, 투약 수준은 손상의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별과 병력, 장애의 심각도, 투여 경로, 그리고 이용되는 특정 활성제를 비롯한 다양한 인자에 기초된다. 따라서 투약 섭생 (dosage regimen)은 폭넓게 변할 수 있지만, 표준 방법을 이용하여 의사에 의해 일과적으로 결정될 수 있다.
세포 내로 핵산의 형질도입과 형질감염을 위한 방법이 존재한다. 본 명세서에서, 용어 "형질도입" 또는 "형질도입한다"는 생물학적 막을 넘는 과정을 지칭하는 동의어로서 이용된다. 생물학적 막을 넘는 것은 한쪽 세포에서 다른 세포로, 세포외 환경에서 세포내 환경으로, 또는 세포 막 또는 핵 막을 가로질러 달성될 수 있다. 형질도입을 겪는 물질에는 단백질, 융합 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 아미노산, 바이러스 DNA, 그리고 세균 DNA가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "치료한다" 또는 "치료하는"은 아래 중에서 한 가지 이상을 달성하는 것을 지칭한다: (a) 질환의 심각도 감소; (b) 치료되는 질환의 특징적인 증상의 발생 제한; (c) 치료되는 질환의 특징적인 증상의 악화 제한; (d) 이전에 질환을 앓았던 환자에서 질환의 재발 제한; 그리고 (e) 이전에 질환의 증상이 있었던 환자에서 증상의 재발 제한
본 명세서에서, 용어 "변이체" 및 이의 다양한 문법적 형태는 각각, 참고 뉴클레오티드 서열 또는 참고 아미노산 서열에 실질적인 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 서열에서 이들 차이는 서열 또는 구조 내에서 자연적인 또는 의도적인 변화의 결과일 수 있다. 자연적인 변화는 자연에서 특정 핵산 서열의 정상적인 복제 또는 중복의 과정 동안 발생할 수 있다. 의도적인 변화는 특정 목적을 위하여 특이적으로 설계되고 서열 내로 도입될 수 있다. 이런 특이적인 변화는 다양한 돌연변이 기술을 이용하여 시험관내에서 만들어질 수 있다. 특이적으로 산출된 이들 서열 변이체는 최초 서열의 "돌연변이체" 또는 "유도체"로 지칭될 수 있다.
당업자는 유사하게, 단일 또는 복수 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 대체를 보유하는 폴리펩티드 변이체를 생산할 수 있다. 이들 변이체에는 특히, (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존성 또는 비-보존성 아미노산으로 치환되는 변이체; (b) 하나 이상의 아미노산이 추가되는 변이체; (c) 최소한 하나의 아미노산이 치환기를 포함하는 변이체; (d) 표적 단백질이 이러한 표적 단백질, 예를 들면, 항체에 대한 에피토프에 유용한 특성을 공여하는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들면, 융합 상대, 단백질 태그 또는 기타 화학적 모이어티와 융합되는 변이체가 포함된다. 유전적 (억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적, 그리고 효소적 기술을 비롯하여 이런 변이체를 수득하는 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "돌연변이"는 부모 유형에서 관찰되지 않는 새로운 특성 또는 특징의 산출을 결과하는 생물체의 유전자 또는 염색체 내에서 DNA 서열의 변화, 또는 유전자를 코딩하는 DNA의 뉴클레오티드 서열에서 변경을 통하여 또는 염색체의 물리적 정렬에서 변화를 통하여 이런 변화가 염색체 내에서 발생하는 과정을 지칭한다. 돌연변이의 3가지 기전에는 치환 (한 염기 쌍의 다른 염기 쌍으로의 교체), 부가 (서열 내로 하나 이상의 염기의 삽입), 그리고 결실 (하나 이상의 염기 쌍의 상실)이 포함된다.
본 명세서에서, 용어 "치환"은 DNA 내에서 염기(들)가 다른 염기 또는 염기로 교체되는 것을 지칭하는데 이용된다. 치환은 유의성 치환 또는 비-유의성 치환일 수 있다. 본 명세서에서, "유의성 치환"은 생산되는 아미노산 서열이 변형되지 않도록, 단백질을 코딩하는 유전자의 엑손 내에서 한 염기의 다른 염기로의 치환을 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 "비-유의성 치환"은 생산되는 아미노산 서열이 변형되도록, 단백질을 코딩하는 유전자의 엑손 내에서 한 염기의 다른 염기로의 치환을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "결실"과 "결실 돌연변이"는 염기(들)가 DNA로부터 상실되는 것을 지칭하는 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 용어 "부가"는 서열 내로 하나 이상의 염기, 또는 하나 이상의 아미노산의 삽입을 지칭한다.
아래는 서로에 대한 보존성 치환인 아미노산의 기를 표시한다: 1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루타민산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민산 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 그리고 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).
조성물: 치료 키나아제 저해물질 펩티드
한 측면에 따라서, 본 발명에서는 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환을 치료하기 위한 키나아제-저해 조성물을 제시하고, 상기 조성물은
(a) 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드를 포함하고, 여기서 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 최소한 하나의 키나아제 효소를 저해하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 첫 번째 도메인 및 두 번째 도메인을 포함하고, 여기서 첫 번째 도메인은 단백질 형질도입 도메인 (PTD)을 포함하고 두 번째 도메인의 근위에 위치하며, 여기서 두 번째 도메인은 첫 번째 도메인의 근위에 위치하고 치료 도메인을 포함하며, 여기서 상기 조성물은 최소한 하나의 염증성 사이토킨의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시킨다. 한 구체예에 따라서, 첫 번째 도메인은 두 번째 도메인의 5'에 위치한다. 다른 구체예에 따라서, 두 번째 도메인은 첫 번째 도메인의 3'에 위치한다.
한 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 0.00001 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 0.0001 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 0.001 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 0.01 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 0.1 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 1 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 10 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 20 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 30 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 40 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 50 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 60 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 70 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 80 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료 저해 펩티드는 대략 90 mg/체중 kg 내지 대략 100 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 90 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 80 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 70 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 60 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 50 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 40 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 30 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 20 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 10 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 1 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 0.1 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 0.1 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 0.01 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 0.001 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 0.0001 mg/체중 kg의 양이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 대략 0.000001 mg/체중 kg 내지 대략 0.00001 mg/체중 kg의 양이다.
다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]을 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARQARAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 16]을 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALARQLAVA [SEQ ID NO: 17]을 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 18]을 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 19]을 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 20]을 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 21]을 보유하는 펩티드이다.
다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KAANRQLGVAA [SEQ ID NO: 22]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALARQLGVAA [SEQ ID NO: 23]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNAQLGVAA [SEQ ID NO: 24]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRALGVAA [SEQ ID NO; 25]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQAGVAA [SEQ ID NO: 26]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 27]을 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGAAA [SEQ ID NO: 28]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGVA [SEQ ID NO: 29]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KKKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 30]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KAANRQLGVAA [SEQ ID NO: 22]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNAQLGVAA [SEQ ID NO: 24]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQAGVAA [SEQ ID NO: 26]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGAAA [SEQ ID NO: 28]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALARQLGVAA [SEQ ID NO: 23]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRALGVAA [SEQ ID NO: 25]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 27]를 보유하는 도메인이다.
다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 WLRRIKA [SEQ ID NO: 32]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR [SEQ ID NO; 33]을 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRI [SEQ ID NO: 34]을 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 FAKLAARLYR [SEQ ID NO: 35]을 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 KAFAKLAARLYR [SEQ ID NO: 36]을 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 FAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 43]을 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 KAFAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 44]를 보유하는 도메인이다.
다른 구체예에 따라서, 첫 번째 도메인은 두 번째 도메인의 5'에 위치한다. 다른 구체예에 따라서, 두 번째 도메인은 첫 번째 도메인의 3'에 위치한다. 다른 구체예에 따라서, 첫 번째 도메인은 두 번째 도메인에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예에 따라서, 두 번째 도메인은 첫 번째 도메인에 작동가능하게 연결된다.
다른 구체예에 따라서, 키나아제 효소는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제이다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 키나아제 효소는 MK2이다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 키나아제 효소는 MK3이다. 다른 구체예에 따라서, 키나아제 효소는 CaMK이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 섬유증이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 내피 세포 기능장애이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 내독성 쇼크이다. 내독성 쇼크 (septic shock)는 순환계가 염증성 물질의 존재로 인하여 신체 조직에 적절한 순환을 제공할 수 없는 질환이다. 여러 연구에서 TNF-α의 혈청 수준이 내독성 쇼크의 치명적인 또는 비-치명적인 과정을 결정하고 (Mozes, T., et al. Immunol. Lett. 27(2): 157-62, 1991), 반면 패혈성 쇼크 환자에서 IL-6 수준이 현저하게 상승되는 (Waage, A., et al. J. Exp. Med. 169:333-338, 1989) 것으로 보고되었다. 내독성 쇼크의 증상에는 경미한 열병, 배고픔의 결핍, 경미한 정신적 및 육체적 저하, 증가된 심장 박동, 낮은 맥압, 탈수, 그리고 설사가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 췌장염이다. 췌장염은 췌장의 염증이다. 급성 췌장염은 급작스러운 반면, 만성 췌장염은 지방변증 또는 당뇨병을 동반하거나 동반하지 않는 재발성 또는 지속성 복통으로 특징된다. 친염증성 사이토킨 (가령, TNF-α, IL-1β)은 급성 췌장염의 병태생리학에서 중심적인 역할을 수행하고, 그리고 IL-6과 IL-8을 비롯한 다른 매개인자의 생산을 유도하는 근위 매개인자로서 기능함으로써 급성 췌장염의 전신 합병증을 매개할 수 있다는 것을 증명하는 상당한 증거가 존재한다. IL-1β와 TNF-α는 질환의 진행을 유발하는 작인으로서 관련되고, 그리고 IL-6과 IL-8은 심각도의 지시자로서 관련되었다 (Pooran, N., et al. J. Clin. Gastroenterol. 37(3):263-266, 2003). 췌장염의 증상에는 등까지 방사상으로 심각한 상복부 통증, 메스꺼움, 구토, 혈압에서 변동 (높음 또는 낮음), 상승된 심장 박동, 상승된 호흡수, 복부 압통이 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 그리고 장음 (bowel sound)이 감소될 수 있다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 천식이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 국소 염증성 질환이다. 여러 연구에서 순환하는 IL-6과 TNF-α가 국소 염증성 반응의 유도에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다 (Xing, Z. J. Clin, Invest 101 (2):311-320, 1998).
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 죽상경화성 심혈관 질환 (동맥경화증, ASVD)이다. ASVD는 지방 물질, 예를 들면, 콜레스테롤의 증가의 결과로써 동맥 벽이 두꺼워지는 질환이다. 이는 부분적으로, 대식세포 백혈구 세포의 축적에 기인하고, 그리고 기능적 고밀도 지방단백질에 의한 대식세포로부터 지방과 콜레스테롤의 적절한 제거 없이 저밀도 지방단백질에 의해 증진되는, 동맥 혈관에 영향을 주는 증후군이다 (동맥의 벽에서 만성 염증성 반응). 여러 연구에서 IL-1β는 동맥경화증의 발생과 임상적 결과에서 조절 단백질로서 암시되었다 (Moyer, C.F., et al. Am. J. Pathol. 138(4);951-960, 1991). 추가의 연구에서 IL-6과 TNF-α 역시 동맥경화증 위험 인자와 연관되는 것으로 보고되었다 (Haddy, N., et al. Atherosclerosis. 70(2):277-283. 2003). 죽상경화성 심혈관 질환의 증상에는 심장 마비, 돌연한 심장사 (증상의 발생후 1시간 이내에 사망), 말초 동맥 폐쇄성 질환, 죽종형성 (죽종 플라크의 발생 과정)과 협착증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 알츠하이머병이다. 알츠하이머병 (AD)은 치매의 한 가지 형태이다. AD는 대뇌 피질 및 일정한 피질하 영역 내에서 뉴런과 시냅스의 상실로 특징된다. 이러한 상실은 측두엽 (temporal lobe)과 두정엽 (parietal lobe), 그리고 전두피질 (frontal cortex)과 대상이랑 (cingulate gyrus)의 일부에서 변성을 비롯하여, 영향을 받는 영역의 전반적인 위축 (gross atrophy)을 유발한다. AD의 원인과 진행은 충분히 알려져 있진 않지만 일반적으로, 신경섬유의 다발성 병변 (neurofibrillary tangle)과 아밀로이드-β를 수반하는 것으로 생각된다. 일부 연구에서 AD에서 아밀로이드 생성 (amyloidogenesis)이 뇌 내에서 IL-1β/IL-6 매개된 급성 단계 반응에 기인하는 것으로 암시되었다 (Vandenabeele, P. and Fiers, W. Immunol. Today. 12(7):217-9. 1991). 추가의 연구에서 TNF-α와 IL-1β의 발현 수준과 인식 손상 사이에 상관관계가 암시되었다 (Alvarez, X., et al. MoI. Chem. Neuropathol. 29(2-3):237-252. 1996). AD의 증상에는 기억 상실, 혼동, 자극 반응성, 공격성, 기분 변화, 그리고 사망이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 종양 질환이다. 종양 질환에는 상피-유래된 암, 예를 들면, 유방암과 전립선암이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에 따라서, 질환은 유방암이다. 일부 구체예에 따라서, 질환은 전립선암이다.
유방암은 유방의 조직, 통상적으로 도관 (duct) (모유를 유도로 운반하는 관) 및 소엽 (lobule) (모유를 만드는 샘)에서 형성되는 암이다. 4가지 단계의 유방암이 존재한다. 단계 0 (상피내 암종)은 상피내 소엽성 암종 (lobular carcinoma in situ, "LCIS") 및 관상 피내 암종 (ductal carcinoma in situ, "DCIS")을 포함하고, 여기서 암성 세포는 각각, 소엽 또는 도관의 내막에 존재한다. 단계 1은 침입성 유방암의 초기 단계이고, 여기서 종양은 직경으로 2 cm 이하이고, 그리고 암 세포가 유방을 넘어서 확산되지 않는다. 단계 II에서, 종양은 (i) 직경으로 2 cm 이하이고, 그리고 암 세포가 팔 아래 림프절로 확산될 수 있고; (ii) 직경이 2-4 cm 이고, 그리고 암 세포가 팔 아래 림프절로 확산될 수 있고; 또는 (iii) 직경으로 5 cm 이상이고, 그리고 암 세포가 팔 아래 림프절로 확산되지 않는다. 단계 III은 대형 종양이긴 하지만, 암 세포가 유방과 인근 림프절을 넘어서 확산되지 않는다. 이는 국소 진전된 암이다. 단계 IIIA에서, 종양은 직경으로 5 cm 또는 그 이상일 수 있고 팔 아래 림프절로 확산된다. 단계 IIIB에서, 종양은 흉벽 (chest wall) 또는 유방의 피부 내로 성장하고, 그리고 암 세포가 흉골 (breastbone) 뒤에 림프절까지 확산된다. 단계 IIIC에서, 종양은 임의의 크기이고 팔 아래, 흉골 뒤에, 그리고 쇄골 아래 또는 위에 림프절까지 확산된다. 단계 IV는 원위 전이성 암이고, 여기서 암 세포는 신체의 다른 부분까지 확산된다. 여러 연구에서 IL-6 수준이 전이성 유방암을 앓는 환자에서 상승되고 (Zhang, GJ., and Adachi, I. Anticancer Res. 19(2B):1427-1432, 1999), 그리고 TNF-α가 유방 종양에서 에스트로겐 합성을 촉진하는 IL-6의 능력을 강화시킬 수 있는 (Reed, MJ., and Purohit, A. Endocrine Rev. 18(5):701-715, 1997) 것으로 보고되었다. 추가의 연구에서 종양-관련된 IL-1β가 종양 미세환경 (tumor microenvironment) 내에 존재하고 유방 종양 성장과 전이를 조절함에 있어 중추적인 역할을 수행할 수 있는 것으로 보고되었다 (Kurtzman, S. H., et al. Oncology Reports. 6(l):65-70, 1998).
전립선암은 전립선 (방광 아래에, 그리고 직장의 정면에서 관찰되는 남성 생식계 내에서 샘)의 조직 내에서 형성되는 암이다. 4가지 단계의 전립선암이 존재한다. 단계 1에서, 암은 직장 수지 검사 (digital rectal exam) 동안 느껴지지 않고, 그리고 소노그래프 (sonogram)에서 관찰되지 않는다. 이는 다른 이유로 수술이 수행될 때 우연히 발견된다. 단계 1 암은 전립선 내에만 존재하고 등급이 G1 (또는 Gleason 스코어가 4 이하이다). 단계 II에서, 종양은 단계 1보다 더욱 진전되거나, 또는 등급이 더욱 높지만 전립선을 넘어서 확장되지 않는다. 이는 직장 수지 검사 동안 느껴지거나, 또는 소노그래프에서 관찰될 수 있다. 단계 III에서, 종양은 전립선을 넘어서 확장되고 정낭 (seminal vesicle)을 침입할 수 있지만, 림프절까지 확산되지 않는다. 단계 IV에서, 종양은 방광, 직장, 또는 인근 구조 (정낭을 넘어서)를 침입할 수 있다. 이는 림프절, 뼈 또는 신체의 다른 부위까지 확산될 수 있다. 여러 연구에서 IL-6과 TNF-α의 혈청 수준이 국소 질환을 앓는 환자에서보다 전이성 질환을 앓는 환자에서 훨씬 높고, 그리고 양쪽 사이토킨의 수준이 상기 질환의 정도에 직접적으로 상관되는 것으로 보고되었다 (Michalaki, V., et al. Br. J. Cancer. 90(12):2312-6, 2004). 추가의 연구에서 IL-1β가 상이한 종양 세포의 생체내에서 혈관신생과 침입성을 위하여 요구되는 것으로 보고되었다 (Voronov, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(5):2645-2650, 2003). 전립선암을 앓는 남성은 증상이 없을 수도 있다. 증상을 보이는 남성의 경우에, 공통의 증상에는 요도계 장애, 발기불능, 소변 또는 정액에서 혈액, 그리고 허리, 히프 또는 대퇴 (upper thigh)에서 빈번한 통증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 허혈이다. 허혈은 일반적으로, 혈관에서 인자에 기인한 혈액 공급에서 제한이고, 결과적으로 조직 기능장애가 발생한다. 여러 연구에서 IL-6, IL-1β와 TNF-α의 수준이 허혈후 초기 재순환 기간 동안 증가되는 것으로 보고되었다 (Saito, K., et al. Neurosci. Lett. 206(2-3): 149- 152, 1996). 허혈의 증상에는 혈액 공급에서 산소와 글루코오스의 부족이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 질환은 신경 허혈이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 류머티스성 관절염 (RA)이다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 크론병이다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 염증성 장 질환이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 혈관내막 비대이다. 혈관내막 비대는 재건 절차 또는 동맥내막절차 (endarterectomy) (향상된 혈액 순환을 위하여 동맥을 개방하거나 확대하기 위하여 지방-가피되고 비대해진 동맥 내막의 외과적 벗겨냄)의 합병증으로서 혈관의 내막 (Tunica intima) (동맥 또는 정맥의 가장 깊숙한 층)의 비대이다. 이는 증식, 이동과 세포외 기질 침착을 유발하는 세포 활성화의 프로그램을 유도하기 위하여 기계적 인자, 세포 인자와 체액 인자에 의한 평활근 세포의 조화된 자극을 필요로 한다. 혈관내막 비대는 손상에 대한 혈관의 보편적인 반응이다. 여러 연구에서 IL-1β와 TNF-α에 의해 조절되는 바와 같은 IL-6의 과다발현이 아테롬-관련된 세포에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다 (Kornman, K. et al. J. Perio. Res. 34(7):353-357. 2006; Libby, P., et al. Circulation. 86(6 Suppl):III47-52. 1992)).
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 협착증이다. 협착증은 혈관 또는 다른 관상 장기 또는 구조에서 비정상적인 협착이다. 결과의 증후군은 영향을 받는 구조에 좌우된다. 여러 연구에서 IL-1β와 TNF-α에 의해 조절되는 바와 같은 IL-6의 과다발현이 아테롬-관련된 세포에서 중요한 역할을 수행하는 보고되었다 (Id). 협착증의 증상에는 청색증 (cyanosis) (피부와 점막의 파란색 착색), 위축 변화, 예를 들면, 머리카락과 윤나는 피부의 상실, 감소된 체온, 감소된 맥박, 감각이상, 그리고 마비가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 질환은 재협착증 (협착증의 재발)이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 평활근 세포 종양과 전이이다. 여러 평활근 세포 종양, 그리고 이들의 전이가 조사되었다. 이들에는 평활근종이 포함된다. 이들 신생물은 일반적으로, 전암상태가 아니고, 그리고 임의의 장기, 예를 들면, 자궁, 소장과 식도에서 발생할 수 있는 양성 평활근 신생물이다. 자궁 유섬유종 (fibroid)은 자궁 평활근의 평활근종증 (leiomyomata)이다. 비록 양성이긴 하지만, 자궁 유섬유종이 과도한 월경 출혈 (menstrual bleeding), 빈혈증과 불임증을 유발할 수 있다. 피부의 평활근종에는 단발성 피부 평활근종, 입모근 (arrectores pilorum muscle)으로부터 발생하는 다발성 피부 (또는 모(毛)) 평활근종, 혈관평활근종 (vascular leiomyoma), 생식기, 유륜과 유두의 음낭근 (dartos muscle)에서 기원하는 육양 (dartoic) (또는 생식기) 평활근종, 그리고 혈관지방평활근종이 포함된다. 여러 연구에서 평활근종, 샘근육종과 자궁내막 용종 군에서 자궁강이 상승된 수준의 사이토킨, 예를 들면, IL-1β와 TNF-α를 포함하는 것으로 보고되었다 (Inagaki, N., et al. Eur. J. Obst. Gyn. 11 1(2): 197-203, 2003). 추가의 연구에서 IL-6 역시 평활근종에서 발현되는 것으로 보고되었다 (Luo, X et al., Endocrinology. 146(3): 1097-1118, 2005).
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 평활근 연축이다. 평활근 연축은 평활근 (또는 근육의 그룹)의 돌연한 무의식적 수축이다. 여러 연구에서 저항 동맥 (resistance artery)에서 혈관 반응성 (vascular reactivity)이 IL-1β, IL-6과 TNF-α 사이에 균형에 관련되는 것으로 보고되었다 (Vila, E. and Salaices, M. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288:H1016-H1021, 2005).
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 협심증 (angina pectoris)이다. 협심증은 심근 허혈에 기인한 심각한 흉부 통증이다. 여러 연구에서 IL-6의 상승된 수준이 불안정한 협심증에서 공통적이고 불량한 예후와 연관되는 것으로 보고되었다 (Biasucci, L., et al. Circulation. 94: 874-877. 1996). 부가적으로, 여러 연구에서 IL-6과 TNF-α의 발현 수준 및 관상동맥질환 사망률 (coronary mortality) 간에 연관이 보고되었다 (Koukkunen, H., et al. Annals Med. 33(l):37-47. 2001). 협심증의 증상에는 흉부 불편감, 흉부 통증, 압박, 중압감, 긴장, 압박감, 흉부와 상복부 (epigastrium)에서 작열감 또는 질식감, 등에서 통증, 목 부위에서 통증, 턱에서 통증, 어깨에서 통증, 메스꺼움, 구토, 그리고 창백이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 프린즈메탈 협심증 (변이체 협심증)이다. 프린즈메탈 협심증은 정상적인 관상 동맥 또는 극소 동맥경화증을 갖는 환자에서 발생한다. 증상에는 협심증의 증상이 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 그리고 이들 증상은 전형적으로, 주기에서 휴식기 (힘든 작업 동안 보다는)에서 발생한다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 서맥 (서맥부정맥)이다. 서맥은 분당 60회 미만 고동의 휴식기 심장 박동을 지칭한다. 여러 연구에서 IL-1β, IL-6과 TNF-α의 증가된 수준이 서맥과 연관되는 것으로 보고되었다 (Fukuhara, Y., et al. Toxicol. 41(l):49-55. 2003). 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 서맥부정맥이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 고혈압이다. 고혈압은 상승된 혈압 (높은 혈압)을 지칭한다. 여러 연구에서 IL-1β, IL-6과 TNF-α의 증가된 수준이 서맥과 연관되는 것으로 보고되었다 (Fukuhara, Y., et al. Toxicol. 41(l):49-55. 2003). 고혈압의 증상에는 두통, 졸림, 혼란, 시각 장애, 메스꺼움, 구토, 발작, 자극 반응성, 그리고 호흡 곤란이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 심장 비대 (심장 확장)이다. 심실 비대는 심장 내에서 심실의 확장이다. 심실 비대는 일반적으로, 고혈압 (또는 다른 질환 상태)에 기인한 병리학적 변화와 연관된다. 여러 연구에서 IL-1β와 TNF-α가 비대성 성장 반응을 자극하는데 충분한 것으로 보고되었고, 그리고 IL-6의 과다발현이 심장 비대를 유발할 수 있는 것으로 암시되었다 (Yokoyama, T., et al. Circulation. 95:1247-1252. 1997). 심장 비대의 증상에는 두통, 졸림, 혼란, 시각 장애, 메스꺼움, 구토, 발작, 자극 반응성, 그리고 호흡 곤란이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 신부전이다. 신부전 (kidney failure)은 신장이 적절하게 기능하지 못할 때 발생한다. 여러 연구에서 IL-1β와 TNF-α (Descamps-Latscha, B., et al. J. Immunol. 154(2):882-892. 1995) 및 증가된 IL-6 (Herbelin, A., et al. Kidney Internat'l. 39:954-960. 1991)과 신부전과의 연관이 보고되었다. 신부전의 증상에는 혈액 내에서 높은 수준의 요소, 혈액 내에서 포스페이트의 축적, 메스꺼움, 구토, 체중 감소, 야간 배뇨, 가려움, 불규칙한 심박동, 다리, 발목 또는 발의 부종, 그리고 등 또는 측면 통증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 뇌졸중이다. 뇌졸중은 뇌에 대한 혈액 공급에서 교란으로 인한 뇌 기능의 상실이다. 여러 연구에서 IL-6과 TNF-α의 혈청 수준이 뇌졸중 이후 증가하고 (Ferrarese, C, et al. J. Cerebral Blood Flow Metabol. 19: 1004-1009, 1999), 그리고 IL-1β의 발현 수준이 국소 뇌 허혈 이후에 상향 조절되는 (Wang, X., et al. Stroke. 28:155-162, 1997) 것으로 보고되었다. 뇌졸중의 증상에는 반신불수, 저린감, 지각 또는 진동 감각에서 감소, 이후 (altered smell), 힘없는 눈꺼풀, 균형 장애, 실어증, 운동 신경 장애, 기억 손상과 현기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 폐 고혈압이다. 폐 고혈압은 폐 동맥, 폐 정맥, 또는 폐 모세관에서 혈압 증가를 지칭한다. 여러 연구에서 TNF-α 수준이 폐 고혈압을 앓는 환자에서 IL-6의 혈청 수준에서 차이 없이, 상승되는 것으로 보고되었다 (Joppa, P., et al. Chest. 130(2):326-333. 2006). 폐 고혈압의 증상에는 숨 가쁨, 어지러움, 졸도, 말초 부종, 그리고 심부전이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 임신 중독증이다. 임신 중독증 (임신의 고혈압 질환)은 집합적으로, 자간전증과 자간을 지칭한다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 자간전증이다. 자간전증은 고혈압이 소변 내에서 상당한 양의 단백질과 연관하여 임심 중에 발생하는 질환이다. 여러 연구에서 IL-6과 TNF-α의 혈장 수준이 정상적인 임신 제3분기 (third-trimester pregnancy) 중인 여성에 비하여 자간전증을 앓는 여성에서 증가되는 것으로 보고되었다 (Conrad, K. et al. Am. J. Repro. Immunol. 40(2): 102-111, 1998). 게다가, IL-1β의 수준은 개체 군 간에 변화가 없는 것으로 보였다 (Id.). 증상에는 상승된 혈압, 모체 내피, 신장, 그리고 간에 전신성 손상 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 자간이다. 자간은 긴장-간대성 (tonic-clonic) 발작 (대발작)의 출현으로 특징된다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 조산이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 레이노 질환/현상이다. 레이노 질환은 차가운 온도에 노출될 때, 또는 심리학적 스트레스에 응하여 사지 (손가락, 발가락, 코와 귀)에 대한 혈류에 영향을 주는 혈관 질환이다. 여러 연구에서 IL-6과 TNF-α (Rychlik, W., et al., Int. Angiol. 25(4):436. 2006)가 레이노 현상의 병인에서 일정한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다. 레이노 질환의 증상에는 청색증, 그리고 창백이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 레이노 질환은 이들 증상이 특발성이면 진단되는 반면, 레이노 현상은 매우 다양한 다른 조건, 예를 들면, 연결 조직 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 관절염, 그리고 기타 류머티즘 질환에 부수적으로 발생한다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 용혈성 요독증이다. 여러 연구에서 TNF-α와 IL-1이 용혈 요독 증후군 동안 염증성 매개인자 베로세포독소 (verocytotoxin)-1의 유도에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다 (van de Kar, N.C., et al. Blood. 80(11):2755-2764, 1992). 추가의 연구에서 IL-6의 수준 역시 상승되는 것으로 보고되었다 (Karpman, D., et al. Ped. Nephrol. 9(6)::694-699, 1995). 용혈성 요독증은 용혈성 빈혈 (적혈구 세포의 비정상적인 파괴), 급성 신부전 (요독증) 및 적은 혈소판 수 (혈소판감소증)로 특징되는 질환이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 치열이다. 치열은 항문관 (anal canal)의 피부에서 자연적인 갈라짐 또는 찢어짐이다. 대부분의 치열은 능력을 초과하여 항문 점막의 뻗침에 의해 유발된다. 표면 또는 얕은 치열은 일반적으로, 자기-치유될 것이다. 일부 치열은 만성화되고 깊어지며 치유되지 않을 것이다. 비-치유의 가장 일반적인 원인은 항문 점막에 대한 손상된 혈액 공급을 유발하는 내부 항문 괄약근의 경련이다. 여러 연구에서 직장 점막 IL-1β, IL-6과 혈청 IL-6 및 TNF-α가 소장 크론병을 앓는 환자 및 건강한 대조에서보다 항문주위 크론병을 앓는 환자에 더욱 높은 것으로 보고되었다 (Ruffolo, C, et al. Infl. Bowel Dis. 14(10):1406-1412, 2008).
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 이완불능증이다. 이완불능증 (식도 이완불능증, 분문 이완불능증, 들문연축, 식도 무연동증)은 식도 운동 장애이다. 식도의 평활근 층이 정상적인 연동을 상실하고, 그리고 하부 식도 괄약근이 연하 (swallowing)에 응하여 적절하게 이완되지 못한다. 여러 연구에서 IL-6과 IL-1β가 대조 환자에 비하여 식도염 환자의 점막에서 훨씬 많은 양으로 생산되는 것으로 보고되었다 (Rieder, F., et al. Gastroenterol. 132(1):154-165, 2007). 증상에는 연하 곤란, 역류, 체중 감소, 기침과 흉부 통증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 발기불능이다. 발기 기능장애 (ED)는 음경의 발기를 발생시키거나 유지하는 능력 없음으로 특징되는 성적 기능장애이다. 발기는 음경 내에 스펀지-유사 몸체에 들어가고 여기에 유지되는 혈액으로 인한 수압 효과 (hydraulic effect)로서 발생한다. 여러 연구에서 ED 환자에서 IL-6, IL-1β와 TNF-α의 증가된 혈액 수준이 성적 능력과 부정적으로 상관되는 것으로 보고되었다 (Vlachopoulos, C, et al. Eur. Heart. J. 27(22):2640-2648. 2006). ED는 심혈관 질환의 증상일 수 있다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 편두통이다. 편두통은 심한 두통, 메스꺼움 및 변화된 신체 지각 (bodily perception)으로 특징되는 신경학적 증후군이다. 여러 연구에서 편두통 발병 동안 IL-6과 TNF-α의 혈청 수준이 증가되는 것으로 보고되었다 (Peterlin, B., et al, Cephalagia. 27(5);435-446. 2007). 편두통 두통은 한쪽에 국한되고, 맥동성이고, 4시간 내지 72시간 동안 지속된다; 증상에는 메스꺼움, 구토, 수명, 그리고 음성 공포증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 평활근 연축과 연관된 허혈성 근육 손상이다. 여러 연구에서 IL-1, IL-6과 TNF-α가 부정적인 수축촉진 효과 (inotropic effect)를 유발하고 허혈-재관류에 종속된 심근에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 보고되었다 (Saini, H.K., et al. Exp. Clin. Car디올. 10(4):213-222, 2005).
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 혈관병증이다. 혈관병증은 혈관의 염증성 파괴로 특징되는 질환의 이질성 군을 지칭한다. 동맥과 정맥 모두 영향을 받을 수 있다. 여러 연구에서 IL-6이 심장 이식 관련된 관상동맥 혈관병증에 대한 중요한 위험 인자인 것으로 보고되었다 (Densem, C., et al. J. Heart Lung Transpl, 24(5):559-565, 2005). 혈관병증의 증상에는 열병, 체중 감소, 자반병, 망창성 피반 (livedo reticularis), 근육통 또는 근육염, 관절통 또는 관절염, 다발성 단신경염 (mononeuritis muliplex), 두통, 뇌졸중, 이명, 감소된 시력, 급성 시력 상실, 심근 경색, 고혈압, 괴저, 코피, 피섞인 기침, 폐 침윤병소, 복통, 혈변, 그리고 사구체신염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 울혈성 심부전 (CHF)이다. 울혈성 심부전은 심장이 체내에서 혈액의 적절한 순환을 유지할 수 없는 장애이다. 여러 연구에서 CHF를 앓는 환자는 정상적인 건강한 개체와 비교할 때 IL-6과 TNF-α의 증가된 수준을 갖는 것으로 보고되었다 (Aukrust, P. et al. Am. J. Cardiol. 83(3):376-382. 1999). CHF의 전형적인 증상에는 숨 가쁨, 기침, 발과 발목의 부종, 복부의 부종, 체중 증가, 불규칙한 또는 급한 맥박, 피로, 허약, 부정맥, 빈혈증, 그리고 갑상샘과다증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 기절 또는 동면 심근이다. 본 명세서에서, 용어 "만성 심근 허혈 (CMI)"은 감소된 재관류에 조화되고, 따라서 세포 생존능을 보존하고 심근 괴사를 예방하기 위하여, 심근이 "동면하는", 다시 말하면, 심근이 수축력 (contractility), 그리고 결과적으로 심근 산소 요구를 하향 조절하거나 감소시키는 관상동맥 혈관의 협착에 기인한 심근 허혈의 연장된 아급성 또는 만성 상태를 지칭한다. 이러한 동면 심근은 적절한 혈액 공급의 복원 시에 정상적인 또는 정상에 가까운 기능으로 돌아갈 수 있다. 하지만, 일단 관상동맥 혈류가 정상적으로 또는 정상에 가깝게 복원되고 허혈이 해결된 이후에도, 동면 심근은 여전히 수축하지 않는다. 허혈의 해결후 심장 기능의 느린 복원을 유발하는 이러한 유동-기능 미스매치는 기절 (stunning)로 불린다. 기능이 복원될 때까지의 시간 길이는 수일 내지 수개월의 범위에서 매우 가변적이고, 그리고 최초 허혈성 손상의 지속 기간, 최초 손상 동안 허혈의 심각도, 그리고 동맥 혈류의 복원의 적절성을 비롯한 다수의 파라미터에 의존성이다. 다수의 연구가 동면 심근에서 염증에 대한 증가를 제공하였다 (Heusch, G. et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288: 984-99 (2005)). 여러 연구에서 또한, 친염증성 사이토킨, 예를 들면, IL-6과 TNF-α가 합병증을 수반하지 않는 관상동맥 재혈관화 이후에 상승되고, 그리고 수술후 심근 허혈과 국소 벽 기형 (segmental wall abnormality)의 원인이 될 수 있는 것으로 보고되었다 (Rankin, J. J. Thorac. Cardiovas. Surg. 108:626-35. 1994).
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 확장기 기능장애이다. 확장기 기능장애는 심확장기 동안 심장 (즉, 좌심실)의 충전 동안 비정상을 지칭한다. 심확장기는 심장 (즉, 심실)이 수축하지 않지만, 실제로 이완되고 신체로부터 (우심실 내로) 또는 폐로부터 (좌심실 내로) 심장으로 되돌려지는 혈액으로 충전되는 심장 주기 (cardiac cycle)의 단계이다. 여러 연구에서 11-6, IL-1β와 TNF-α가 전신 부패증 및 다른 형태의 심장 기능장애에서 심근기능 저하 (mycocardial depression)를 매개하는 것으로 암시되었다 (Kelly, R., and Smith, T. W. Circulation, 95:778-781, 1997). 증상에는 폐 부종, 고혈압, 대동맥 협착증, 반흔 심장 조직, 그리고 당뇨병이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 신경아교종 (중추신경계의 손상된 부위 내에서 세포외 기질 (ECM)의 침착을 포함하는 성상세포의 증식을 의미함)이다. 여러 연구에서 IL-1과 IL-6은 신경교성 반흔 (glial scar) 형성을 증가시키는 반면, IL-6 방출을 유도하지 않는 TNF-α는 신경아교종을 유도하지 않는 것으로 보고되었다 (Woiciechowsky, C, et al. Med. Sci. Monit. 10(9):BR325-330. 2004).
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) (기도 폐쇄 또는 제한으로 특징되는 호흡기 질환을 의미함; 여기에는 만성 기관지염과 기종이 포함되지만 이들에 국한되지 않음)이다. 증가된 수준의 IL-6, IL-1β와 TNF-α가 COPD를 앓는 환자의 타액에서 측정되었다 (Chung, K. Eur. Respir. J. 18:50s-59S, 2001).
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 골감소증이다. 골감소증은 골밀도 (bone mineral density) (이는 골이 얼마나 밀집하고 강한 지를 지시한다)가 정상적인 건강한 개체의 것보다 낮긴 하지만 골다공증 (osteoporosis)으로 분류될 만큼 낮지는 않은 질환이다. 골감소증은 이중-에너지 X-선 흡수계측 (DEXA)에 의한 측정에서, -1.0 내지 -2.5의 골밀도 T 스코어로서 정의될 수 있다. 여러 연구에서 IL-1β, IL-6와 TNF-α가 골 재흡수 (bone resorption)의 유도에서 일정한 역할을 하는 것으로 보고되었다 (Rifas, L. Calcif. Tissue Int. 64:1-7. 1999).
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 퇴행성 관절염 (골관절염, OA)이다. 골관절염은 하나 이상의 관절의 연골의 파괴와 궁극적인 상실에 의해 유발되는 관절염의 한 유형이다. 골관절염은 통상적으로, 손, 발, 척주 및 큰 체중-지지 관절, 예를 들면, 히프와 무릎에 영향을 준다. 여러 연구에서 친염증성 사이토킨 (IL-1α, IL-1β, TNF-α)의 생산으로 인한 만성 염증성 변화가 초기 OA 환자로부터 활액 막의 특징인 것으로 보고되었다 (Smith, M.D., et al., J. Rhematol. 24(2):365-371, 1997). 골관절염의 증상에는 반복적 이용후 영향을 받은 관절(들)에서 통증, 부종, 열기, 그리고 영향을 받은 관절(들)의 삐걱거리는 소리가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 강직성 척추염이다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 쇼그렌병이다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 길랑 바레 증후군이다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 경피증이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 부패증이다. 부패증은 전신 염증 상태 (전신 염증성 반응 증후군 (SIRS)), 그리고 공지되거나 의심되는 감염의 존재로 특징되는 질환이다. 신체는 혈액, 소변, 폐, 피부 또는 기타 조직 내에서 미생물에 대하여 이러한 염증성 반응을 발생시킬 수 있다. 여러 연구에서 IL-6과 TNF-α가 부패증과 연관된 염증, 이환, 그리고 사망에서 핵심 매개인자로서 암시되었다 (Leon, L, et al. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 275:R269-R277. 1998). 부패증의 증상에는 전신에서 나타나는 급성 염증, 열병, 상승된 백혈구 세포 수, 메스꺼움과 구토, 상승된 심장 박동, 그리고 증가된 호흡수가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 질환은 내독소혈증성 쇼크이다. 패혈증은 감염의 국소 환부로부터 유래하는 독력 세균에 의한 혈류의 침입에 기인한 독성으로 유발되는 전신 질환이다. 증상에는 한기, 열병, 그리고 피로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 건선이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 방사선 장염이다. 방사선 장질환 (방사선 장염)은 방사선 요법에 기인한 소장의 내막의 염증 (부종)이다. 여러 연구에서 IL-1β와 TNF-α mRNA의 수준이 방사선 요법후 증가하고, 그리고 IL-6의 발현이 상승되는 것으로 보고되었다 (Linard, C, et al. Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phy.58(2):427-434. 2004). 방사선 장염의 증상에는 식욕부진, 설사, 메스꺼움, 구토와 체중 감소가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 경변증이다. 경변증은 만성 간 질환 (CLD)의 결과로써 간의 반흔 및 불량한 간 기능이다. 여러 연구에서 IL-1β, TNF-α와 IL-6의 혈청 수준이 만성 간 질환을 앓는 환자에서 상승되고, 그리고 CLD 환자의 경변증 군이 비-경변증 증례에서보다 IL-1β, IL-6과 TNF-α의 더욱 높은 혈청 수준을 보이는 것으로 보고되었다 (TiIg, H., et al. Gastroenterology. 103(l):264-74. 1992). 경변증의 증상에는 출혈성 치질, 혼란, 발기불능, 황달, 메스꺼움과 구토, 체중 감소, 위 확대증, 복수 소화장애, 열병, 복통, 그리고 감소된 소변 배출량이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 간질성 폐섬유증이다. 간질성 폐 질환, 또는 ILD는 만성, 비-악성 (비-암성), 그리고 비-전염성인 180가지 이상의 만성 폐 질환을 포함한다. 간질성 폐 질환은 섬유증 (반흔)에 의해 영향을 받는 조직인, 간질 (interstitium)로 불리는 폐의 폐포 (air sac) 사이에 조직의 이름을 따서 명명된다. 간질성 폐 질환은 또한, 간질성 폐 섬유증 또는 폐 섬유증으로 불린다. 여러 연구에서 IL-1β의 높은 발현 수준이 IL-6과 INF-α의 국소 증가, 그리고 조직 손상의 증거와 함께 활발한 급성 염증성 조직 반응을 동반하는 것으로 보고되었다 (KoIb, M., et al. J. Clin. Invest 107(12):1529-1536, 2001). 이들 각 질환의 증상과 과정은 개체마다 달라질 수 있지만, 많은 형태의 ILD 사이에 공통 고리는 이들 모두 염증, 예를 들면, 세기관지염 (세기관지 (소기도)에 영향을 주는 염증); 폐포염 (폐포에 영향을 주는 염증); 또는 맥관염 (작은 혈관 (모세관)에 영향을 주는 염증)으로 시작된다는 점이다. 간질성 폐 질환 중에서 80% 이상이 진폐증, 약물-유도된 질환, 또는 과민성 폐렴으로서 진단된다. 다른 유형은 유사 육종증; 특발성 폐 섬유증; 폐쇄성 기관지염; 조직구증 X; 만성 호산구성 폐렴; 콜라겐 혈관 질환; 육아종성 맥관염; 굿파스튜어 증후군, 그리고 폐 폐포 단백증이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 대장염이다. 대장염은 대장의 염증 (부종)이다. 대장염은 많은 상이한 원인, 예를 들면, 급성과 만성 감염, 염증성 질환 (궤양성 대장염, 크론병, 림프구성과 콜라겐성 대장염), 혈류의 부족 (허혈성 대장염) 및 대장의 과거 방사선요법에 기인할 수 있다. 여러 연구에서 대장염의 동물 모형에서 TNF-α의 저해가 IL-1과 IL-6의 감소된 수준, 그리고 대장염의 감소된 심각도를 유발하는 것으로 보고되었다 (Neurath, M., et al. Eur. J. Immunol. 27(7): 1743-1750, 2005). 대장염의 증상에는 복부 출혈, 복통, 혈변, 탈수, 설사 및 증가된 장내 가스가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 충수염이다. 충수염은 충수의 염증이다. 충수는 대장에 붙어 있는 작은 주머니이다. 여러 연구에서 IL-6의 상승된 수준이 급성 충수염의 진단에서 최선의 경향을 보이는 것으로 보고되었다 (Paajanen, H., et al. Scan. J. Clin. Lab. Invest. 62(8):579-584, 2002). 추가의 연구에서 TNF-α가 충수돌기염을 앓는 환자의 복수 내에서 낮은 수준의 IL-6과 함께 나타나는 것으로 보고되었다 (Fernando, A., et al. Ann. Surg. 237(3):408-416, 2003). 충수염의 증상에는 복통, 열병, 감소된 식욕, 메스꺼움, 구토, 한기, 그리고 변비가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 위염이다. 위염은 위의 내막의 염증이다. 위염의 일반적인 원인에는 예로써, 알코올, 흡연, 그리고 세균 감염이 포함된다. 여러 연구에서 인간 위점막에 의한 TNF-α와 IL-6의 생산이 조직학적으로 정상적인 위점막으로 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 음성인 환자에서보다 만성 위염을 앓는 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)로 감염된 환자에서 훨씬 높은 것으로 보고되었다 (Crabtree, J., et al. Gut. 32: 1473-1477, 1991). 위염의 증상에는 복통, 복부 소화장애, 거무스름한 대변, 식욕 상실, 메스꺼움, 구토, 그리고 구토 혈액 또는 갈아놓은 커피 같은 물질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 후두염이다. 후두염은 후두 (목소리 상자)의 염증이다. 후두염은 통상적으로, 목소리 상실의 쉰소리와 연관된다. 후두는 호흡관의 정상에 위치하고 성대를 포함한다. 성대는 흥분되거나 감염될 때 팽창한다. 이는 쉰소리를 유발할 수 있고, 그리고 때때로 기도를 차단한다. 여러 연구에서 IL-1β, IL-6과 TNF-α가 후두염이 코경유위삽관 (nasogastric intubation)에 의해 유도되는 경우에 증가되는 것으로 보고되었다 (Lima-Rodrigues, M., et al. Larynscope.118(l):78-86. 2008). 후두염의 증상에는 열병, 쉰소리, 그리고 목 내에서 팽창된 림프절 또는 샘이 포함된다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 수막염이다. 수막염은 뇌척수액 (cerebrospinal fluid)에 영향을 주는, 뇌와 척추를 둘러싸는 막의 염증이다. 여러 연구에서 IL-6과 TNF-α의 재조합 형태가 수막염 또는 뇌 혈관 장벽 손상을 유도할 수 있는 것으로 보고되었고, 그리고 뇌척수액 내에서 IL-1의 in situ 생산 (TNF와 함께 또는 TNF 없이)이 다양한 중추신경계 감염에서 관찰되는 뇌막 염증 및 뇌 혈관 장벽 손상을 모두 매개할 수 있는 것으로 암시된다 (Quagliarello, V., et al. J. Clin. Invest, 87(4): 1360-1366, 1991). 수막염의 증상에는 열병과 한기, 정신 상태 변화, 메스꺼움과 구토, 수명, 심한 두통, 수막자극증, 동요, 그리고 빠른 호흡이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 이염이다. 이염은 귀의 감염 또는 염증을 지칭한다. 이염은 귀의 내부 또는 외부에 영향을 줄 수 있다. 상기 질환은 짧은 기간 동안 돌연하게 발생하는 지 (급성), 또는 장기간에 걸쳐 반복적으로 발생하는 지 (만성)에 따라 분류된다. 여러 연구에서 IL-1β와 TNF-α의 수준이 중이염의 동물 모형에서 상승되는 것으로 보고되었다 (Sato, K., et al. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 108(6):559-63, 1999). 추가의 연구에서 유출물과 함께 중이염을 앓는 환자에서 IL-6의 상승된 수준이 보고되었다 (Jang, C. and Kim, Y. Int. J. Ped. Otorhinol. 66(1 ):37, 2002). 증상에는 한기, 설사, 귀로부터 배농, 귀앓이, 귀 울음 또는 윙윙거림, 열병, 청력 상실, 자극 반응성, 메스꺼움과 구토가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 재관류 손상이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 외상성 뇌 손상이다. 외상성 뇌 손상은 머리에 타격 또는 충격에 의해, 또는 뇌의 정상적인 기능을 교란시키는 침투성 머리 손상에 의해 유발된다. 머리에 타격 또는 충격이 모두 외상성 뇌 손상을 유발하는 것은 아니다. 외상성 뇌 손상의 심각도는 "경등도"(정신 상태 또는 의식에서 짧은 변화) 내지 중증도 (손상 이후에 연장된 기간의 무의식 또는 기억 상실) 범위이다. 여러 연구에서 IL-6과 TNF-α 둘 모두의 수준이 심각한 외상성 뇌 손상을 앓는 환자에서 상승되는 것으로 보고되었다 (Csuka, E., et al. J. Neuroimmunol. 101(2):21 1-21, 1999). 외상성 뇌 손상의 증상에는 두통 또는 목 통증, 기억, 집중 또는 결정의 어려움, 피로, 기분 변화, 메스꺼움, 수명, 흐린 시력, 귀에서 울림, 그리고 미각 또는 후각의 상실이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 척추 손상이다. 척추 외상 또는 손상은 척수 자체에 직접적인 손상으로부터, 또는 주변 골, 조직, 또는 혈관에 손상으로부터 간접적으로 기인하는 척추에 대한 손상이다. 여러 연구에서 TNF-α, IL-6과 IL-1β의 발현 수준이 손상된 척추에서 상승되는 것으로 보고되었다 (Hayashi, M., et al. J. Neurotrauma. 17(3):203-18, 2000). 척추 손상의 증상에는 손상 지점에서와 아래에서 허약과 감각 상실, 호흡 곤란, 정상적인 내장과 방광 제어의 상실, 저린감, 경직, 그리고 통증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 말초 신경병증이다. 용어 "말초 신경병증"은 말초 신경계에 손상을 지칭한다. IL-6은 실험적 악소토미 (axotomy) 이후에 과다발현되고, 그리고 IL-1과 TNF-α 수준이 손상 (신경 압좌) 이후에 점진적으로 증가하는 것으로 보고되었다 (Creange, A., et al. Eur. Cytokine Network. 8(2): 145-51, 1997). 증상은 영항을 받는 신경의 유형에 관련되고 수일, 수주 또는 수년의 기간에 걸쳐 관찰될 수 있다. 근육 허약은 운동 신경 손상의 가장 일반적인 증상이다. 다른 증상에는 고통스런 경련과 연축현상 (fasciculation) (피부 아래에서 보이는 통제되지 않는 근육 경련), 근육 상실, 골 변성, 그리고 피부, 머리카락과 손톱에서 변화가 포함된다. 감각 신경 손상은 더욱 복잡한 범위의 증상을 유발하는데, 그 이유는 감각 신경이 더욱 넓고 더욱 전문화된 범위의 기능을 갖기 때문이다. 미엘린 내에 포함된 더욱 큰 감각 섬유는 진동, 가벼운 접촉, 그리고 위치 감각 (position sense)을 표시한다. 더욱 큰 감각 섬유에 손상은 진동과 접촉을 감지하는 능력을 감소시켜, 특히 손과 발에서 저린감의 전반적인 감각을 유발한다. 수초가 없는 더욱 작은 감각 섬유는 통증과 온도 감각을 전송한다. 자율신경 손상의 증상은 다양하고 어떤 장기 또는 샘이 영향을 받는 지에 좌우된다. 자율신경 손상의 일반적인 증상에는 열불내성(heat intolerance)을 유발할 수 있는 정상적으로 발한하는 능력 없음; 감염 또는 실금을 유발할 수 있는 방광 제어의 상실; 그리고 안정된 혈압 수준을 유지하기 위하여 혈관을 확장하거나 수축시키는 근육을 제어하는 능력 없음이 포함된다. 혈압에서 제어 상실은 개체가 앉은 자세에서 선 자세로 갑자기 움직일 때 어지러움, 머리가 어질어질함, 또는 심지어 졸도 (자세 또는 기립성 저혈압으로 알려져 있는 질환)를 유발할 수 있다. 위장 증상이 빈번하게, 자율신경병증에 동반한다. 장내 근육 수축을 제어하는 신경이 종종 제대로 작동하지 않고, 설사, 변비, 또는 실금이 유발된다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 다발성 경화증이다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 루푸스 (전신성 홍반성 루푸스)이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 심혈관대사 증후군이다. 심혈관대사 증후군 (증후군 X, CMS)은 아래의 조건 중에서 3가지의 존재로서 정의된다: (i) 허리 주변에 과도한 체중; (ii) 높은 수준의 트리글리세리드; (iii) 낮은 수준의 HDL (좋은 콜레스테롤); (iv) 높은 혈압; 그리고 (v) 높은 공복시 혈액 글루코오스 수준. CMS의 증가하는 이환율은 많은 연령대에서 증가하고 있는 비만에 관련된다. 현재, CMS는 심혈관질환 사망 및/또는 II형 당뇨병의 발생을 예언하는 것으로 인정된다. CMS는 신체 조성에서 변형과 지방 이상분배 (fat redistribution)에 의해 더욱 복잡해지고, 그리고 변경된 인슐린 민감성과 종종 연관된다. 당뇨병을 앓는 많은 사람들은 이들 조건 중에서 여러 가지를 동시에 갖는다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 비만이다. 비만은 National Institutes of Health (NIH)에 의해, 30 이상의 체질량지수 (body mass index, BMI)로서 정의된다. 체질량지수는 체중 대(對) 신장의 표준화된 비율이고, 그리고 종종, 건강의 보편적인 지시자로서 이용된다. BMI는 체중(kg)을 신장 (미터)의 제곱으로 나눗셈함으로써 계산될 수 있다. 18.5 내지 24.9의 BMI는 대부분의 성인에서 정상적인 것으로 간주된다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 II형 당뇨병이다. II형 당뇨병 (비-인슐린-의존성 당뇨병 (NIDDM), 성체 발병 당뇨병)은 일차적으로, 인슐린 내성 (인슐린이 존재할 때에도 세포가 적절하게 반응하지 않는다), 상대적인 인슐린 결핍 및 고혈당증으로 특징되는 물질대사 질환이다. IL-6은 인슐린 민감성을 손상시킬 뿐만 아니라, C-반응성 단백질 (이러한 염증성 마커의 가장 중요한 출처)의 간 생산의 주요 결정인자이다. II형 당뇨병 환자에서 수행된 한 연구에서 IL-6의 순환 수준이 내장 지방 (visceral fat area, VFA)과 강하게 상관하고, 그리고 경동맥의 경직 (동맥경화증의 지수)이 VFA, 그리고 IL-6과 C-반응성 단백질의 수준 둘 모두와 상관하는 것으로 밝혀졌고, 이는 복부내 지방세포-유래된 IL-6이 II형 당뇨병 환자의 가속화된 동맥경화증에 관련될 수 있다는 것을 암시하였다 (Despres, J, Eur. Heart J. Suppl. 8(B):B4-B12, 2006). II형 당뇨병의 증상에는 다뇨증과 조갈증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 I형 당뇨병이다.
이와 같은 일부 구체예에 따라서, 염증성 질환은 비알코올 지방간염 (NASH)이다. NASH는 과도한 음주에 기인하지 않을 때, 간의 지방 염증이다. NASH에서, 지방은 간 내에 축적되고 궁극적으로 반흔 조직을 유발한다. NASH는 경변증을 유발할 수 있다. 여러 연구에서 TNF-α 수준이 NASH를 앓는 환자에서 증가되는 것으로 보고되었다 (Bahceicoglu, H., et al. Hepatoenterology. 52(65): 1549-53, 2005). 추가의 연구에서 NASH 환자에서 상승된 IL-6 수준 (Kugelmas, M., et al. Hepatology. 38(2):413-9; 2003) 및 IL-1β 수준 (Brun, P., et al. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292:G518-G525, 2007)이 보고되었다. NASH의 증상에는 피로, 으스스한 느낌, 그리고 둔한 우상복부 불쾌감이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13]에 실질적인 동일성을 갖는 도메인이다.
다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALARQLGVAA [SEQ ID NO: 23]에 실질적인 동일성을 갖는 도메인이다.
다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRlKA [SEQ ID NO: 31]에 실질적인 동일성을 갖는 도메인이다.
다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRI [SEQ ID NO: 34]에 실질적인 동일성을 갖는 도메인이다 .
다른 측면에 따라서, 본 발명에서는 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산을 제시하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 86% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 87% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 88% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 89% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 91% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 92% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 94% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 96% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 97% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 치료적 저해물질 펩티드에 최소한 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 키나아제 효소의 키나아제 활성을 저해한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14] 서열을 보유하는 치료적 저해물질 펩티드는 제어가능 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]을 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 KAF AKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARQARAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 16]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALARQLAVA [SEQ ID NO: 17]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 18]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 19]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 20]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 21]를 보유하는 펩티드이다.
다른 구체예에 따라서, 키나아제 저해 조성물은 이러한 조성물을 국소 전달하는 것이 바람직한 경우에, 주입, 예를 들면, 일시 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 조제될 수 있다. 주입용 제제는 첨가된 보존제를 포함하는 단위 제형 (unit dosage form), 예를 들면, 앰플 또는 복수-투약 용기에 담겨 제공될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액, 또는 유성 또는 수성 운반제에서 에멀젼과 같은 형태를 취하고, 그리고 조제 약품 (formulatory agent), 예를 들면, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제약학적 제제에는 물-용해성 형태에서 활성 화합물의 수성 용액이 포함된다. 부가적으로, 이들 활성 화합물의 현탁액이 적절한 유성 주입 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 운반제에는 지방 오일, 예를 들면, 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레산염 또는 트리글리세리드, 또는 리포좀이 포함된다. 수성 주입 현탁액은 현탁액의 점성도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 포함할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한, 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는, 이들 화합물의 용해도를 증가시키는 적절한 안정화제 또는 작용제를 포함할 수 있다. 대안으로, 활성 화합물은 사용에 앞서, 적절한 운반제, 예를 들면, 무균 발열원-없는 물로 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
제약학적 조성물 (즉, 키나아제 저해 조성물)은 또한, 적절한 고형 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이런 담체 또는 부형제의 실례에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 그리고 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
적절한 액상 또는 고형 제약학적 제조 형태는 예로써, 미세캡슐화되고, 그리고 적절한 경우에, 하나 이상의 부형제로, 달팽이 껍질처럼 되거나, 현미경적 금 입자 상에 코팅되거나, 조직 내로 이식을 위한 펠릿인 리포좀 내에 포함되거나, 또는 조직 내로 문질러지는 물체 상에서 건조된다. 이런 제약학적 조성물은 또한, 과립, 비드, 분말, 정제, 코팅된 정제, (미세)캡슐, 좌약, 시럽, 에멀젼, 현탁액, 크림, 점안약, 또는 활성 화합물을 장기적으로 방출하는 제조물의 형태일 수 있고, 이러한 제조에서 부형제와 첨가제 및/또는 보조제, 예를 들면, 붕해제, 접합제, 코팅제, 팽창제, 윤활제, 또는 용해화제가 앞서 기술된 바와 같이 관례적으로 이용된다. 제약학적 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 이용하기 적합하다. 약물 전달을 위한 방법의 짧은 검토를 위하여, Langer 1990 Science 249, 1527-1533을 참조한다.
본 발명의 키나아제 저해 조성물, 그리고 선택적으로, 다른 치료제는 그 자체로 (순수하게) 또는 제약학적으로 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있다. 의약품으로 이용될 때, 이들 염은 제약학적으로 허용되어야 하지만, 비-제약학적으로 허용되는 염이 이들의 제약학적으로 허용되는 염을 제조하는데 편의하게 이용될 수 있다. 이런 염에는 아래의 산으로부터 제조된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 설폰산, 주석산, 구연산, 메탄 설폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-설폰산, 그리고 벤젠 설폰산. 또한, 이런 염은 카르복실산 기의 알칼리성 금속 염 또는 알칼리성 토류 염, 예를 들면, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염으로 제조될 수 있다. "제약학적으로 허용되는 염"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간과 하등 동물의 조직과의 접촉 시에 이용하기 적합하고 합리적인 이익/위험 비율로 균형 잡힌 염을 의미한다. 제약학적으로 허용되는 염은 당분야에 널리 공지되어 있다. 가령, P, H. Stahl 등은 "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" (Wiley VCH, Zurich, Switzerland: 2002)에서 제약학적으로 허용되는 염을 상세하게 기술한다. 이들 염은 본 발명에서 기술되거나, 또는 유리 염기 기능기를 적절한 유기 산과 반응시킴으로써 분리된 화합물의 최종 분리와 정제 동안 in situ 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가염에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 2-히드록시에탄설포네이트 (isethionate), 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 중탄산염, p-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 또한, 염기성 질소-보유 기는 저급 알킬 할로겐화합물, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 그리고 부틸 염화물, 브롬화물과 요오드화물; 디알킬 설페이트, 예를 들면, 디메틸, 디에틸, 디부틸과 디아밀 설페이트; 긴 사슬 할로겐화합물, 예를 들면, 데실, 라우릴, 미리스틸과 스테아릴 염화물, 브롬화물과 요오드화물; 아릴알킬 할로겐화합물, 예를 들면, 벤질과 펜에틸 브롬화물 등과 같은 약품으로 4가화될 수 있다. 따라서 물 또는 오일-용해성 또는 분산성 산물이 획득된다. 제약학적으로 허용되는 산 부가염 염을 형성하기 위하여 이용될 수 있는 산의 실례에는 염화수소산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기 산, 그리고 옥살산, 말레산, 숙신산 및 구연산과 같은 유기 산이 포함된다. 염기 부가염은 카르복실산-보유 모이어티를 제약학적으로 허용되는 금속 양이온의 적절한 염기, 예를 들면, 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염과 반응시키거나, 또는 암모니아 또는 유기 일차, 이차 또는 삼차 아민과 반응시킴으로써 본 발명에 기술된 화합물의 최종 분리와 정제 동안 in situ 제조될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 염에는 알칼리성 금속 또는 알칼리성 토류 금속, 예를 들면, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘과 알루미늄 염 등에 기초된 양이온, 그리고 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민 등을 비롯한 비독성 4가 암모니아와 아민 양이온이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 염기 부가염의 형성에 유용한 다른 대표적인 유기 아민에는 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 피페라진 등이 포함된다. 또한, 제약학적으로 허용되는 염은 예로써, 충분히 염기성인 화합물, 예를 들면, 아민을 적절한 산과 반응시켜 생리학적으로 허용되는 음이온을 제공함으로써, 당분야에 널리 공지된 표준 절차를 이용하여 획득될 수 있다. 카르복실산의 알칼리성 금속 (가령, 나트륨, 칼륨 또는 리튬) 또는 알칼리성 토류 금속 (가령, 칼슘 또는 마그네슘) 염 역시 만들어질 수 있다.
이들 제제는 단위 제형으로 편의하게 제공되고, 그리고 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법은 키나아제 저해 펩티드, 또는 이의 제약학적으로 허용되는 에스테르, 염, 수화물, 용매화합물 또는 프로드러그 ("활성 화합물")를 하나 이상의 보조제로 구성되는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이들 제제는 활성제를 액상 담체 또는 미세하게 분할된 고형 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 결합시키고, 이후 필요한 경우에, 생성된 산물을 원하는 제제로 형체지음으로써 제조된다.
제약학적 작용제, 또는 이의 제약학적으로 허용되는 에스테르, 염, 수화물, 용매화물, 또는 프로드러그는 원하는 작용을 손상시키지 않는 다른 활성 물질, 또는 원하는 작용을 보충하는 물질과 혼합될 수 있다. 비경구, 피내, 피하, 척수강내, 또는 국소 적용에 이용되는 용액 또는 현탁액은 예로써, 아래의 성분을 포함하지만 이들에 국한되지 않는다; 무균 희석액, 예를 들면, 주입용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예를 들면, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산 또는 아황산나트륨; 킬레이트화제, 예를 들면, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액, 예를 들면, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 그리고 장성 (tonicity)의 조정을 작용제, 예를 들면, 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 제조물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 복수 투약 바이알 내에 동봉될 수 있다. 정맥내 투여되면, 특정한 담체는 생리학적 염수 또는 인산염 완충된 염수 (PBS)이다.
비경구 주입을 위한 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는 무균 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 그리고 무균 주입가능 용액 또는 분산액으로 재구성을 위한 무균 분말을 포함한다. "용액"은 일반적으로, 2개 또는 그 이상의 물질의 균질한 혼합물로서 간주된다. 이는 반드시 그러한 것은 아니지만 빈번하게, 액체이다. 용액 내에서, 용질 (또는 용해된 물질)의 분자는 용매 전체에 균일하게 분포된다. 본 명세서에서, "분산된 시스템" 또는 "분산액"은 2가지-상 시스템을 지칭하고, 여기서 한쪽 상은 두 번째, 또는 연속 상 내에서 입자 또는 비말로서 분포된다. 본 명세서에서, 용어 "현탁액"은 액상 운반제에 분산된 미세하게 분할되고 용해되지 않은 물질의 제조를 지칭한다. 현탁액의 미립자 물질은 상기 물질이 분산되는 액체 운반제로부터 천천히 가라앉는다; 이런 이유로, 현탁액은 운반제 내에서 고체의 균일한 분포 및 이로써, 균일하고 적절한 투약을 담보하기 위하여, 사용에 앞서 충분히 흔들어져야 한다. 본 명세서에서, "에멀젼"은 분산된 상과 분산 매체 둘 모두가 혼화성 액체인 콜로이드 시스템을 지칭하고, 여기서 분산된 액체는 분산액 매체 액체의 조직체 전역에서 작은 소구체 내에 분포된다. 안정한 염기성 에멀젼은 최소한 2가지 액체와 유화제를 포함한다. 에멀젼의 일반적인 유형은 수중유이고, 여기서 오일은 분산된 액체이고, 그리고 수성 용액, 예를 들면, 물은 분산 매체이고, 그리고 유중수이고, 여기서 역으로, 수성 용액이 분산된 상이다. 또한, 비-수성인 에멀젼을 제조하는 것이 가능하다.
적절한 수성과 비-수성 담체, 희석액, 용매 또는 운반제의 실례에는 물, 에탄올, 폴리올 (프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 등), 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일 (가령, 올리브 오일) 및 주입가능 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레산염이 포함된다. 적절한 유동성은 예로써, 코팅, 예를 들면, 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한, 보존제, 습윤제, 유화제, 그리고 분산제를 비롯한 어쥬번트를 포함할 수 있다. 미생물의 작용 예방은 다양한 항균제와 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 담보될 수 있다. 또한, 등장성제, 예를 들면, 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주입가능 제약학적 형태의 연장된 흡수는 흡수 지연제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트와 젤라틴의 이용에 의해 달성될 수 있다.
현탁액은 활성 화합물에 더하여, 현탁화제, 예를 들면, 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨과 소르비탄 에스테르, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천-한천, 트래거캔스, 그리고 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
주입가능 저장소 형태는 생체분해성 중합체, 예를 들면, 폴리락티드-폴리글리콜리드 내에서 약물의 미세캡슐화된 매트릭스를 형성함으로써 만들어진다. 약물 대(對) 중합체의 비율 및 이용되는 특정 중합체의 성질에 따라, 약물 방출의 비율이 조절될 수 있다. 이런 장기 작용 제제는 적절한 중합성 또는 소수성 물질 (가령, 허용되는 오일에서 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지로 조제되거나, 또는 난용성 유도체, 예를 들면, 난용성 염으로서 조제될 수 있다. 다른 생체분해성 중합체의 실례에는 폴리(오르토에스테르)와 폴리(무수물)이 포함된다. 저장소 주입가능 제제는 또한, 신체 조직과 양립하는 리포좀 또는 마이크로에멀젼 내에 약물을 트랩함으로서 제조된다.
국소 주입가능 제제는 예로써, 세균-유지 필터를 통한 여과에 의해, 또는 사용 직전에 무균 물 또는 다른 무균 주입가능 매체에 용해되거나 분산될 수 있는 무균 고형 조성물의 형태로 멸균제를 통합함으로써 멸균될 수 있다. 주입가능 제조물, 예를 들면, 무균 주입가능 수성 또는 유성 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용하여 공지된 기술에 따라 조제될 수 있다. 무균 주입가능 제조물은 또한, 비-독성, 비경구로 허용되는 희석액 또는 용매에서 무균 주입가능 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 예를 들면, 1,3-부탄디올에서 용액일 수 있다. 이용될 수 있는 허용되는 운반제와 용매에는 물, 링거액, U. S. P. 및 등장성 염화나트륨 용액이 포함된다. 이에 더하여, 무균 고정유가 관례적으로, 또는 용매 또는 현탁 매체로서 이용된다. 이러한 목적으로, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 비롯한 임의의 온후한 고정유가 이용될 수 있다. 이에 더하여, 지방산, 예를 들면, 올레산이 주입가능물질의 제조에 이용된다.
비경구 (피하, 피내, 근육내, 정맥내, 척수강내와 관절내가 포함되지만 이들에 국한되지 않음) 투여를 위한 제제에는 항-산화제, 완충액, 정균제 및 상기 제제가 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 내포하는 수성과 비-수성 무균 주입 용액; 그리고 현탁화제와 농후제를 내포하는 수성과 비-수성 무균 현탁액이 포함된다. 이들 제제는 단일-투약 또는 복수-투약 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀과 바이알에 담겨 제공되고, 그리고 사용 직전에, 무균 액상 담체, 예를 들면, 염수, 주입용수의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조된 상태로 보관될 수 있다. 즉석 주입 용액과 현탁액은 앞서 기술된 종류의 무균 분말, 과립과 정제로부터 제조될 수 있다.
본 명세서에 기술된 조성물의 다른 조제 방법은 본 명세서에 기술된 화합물을 수성 용해도를 강화시키는 중합체에 접합시키는 단계를 필요로 한다. 적절한 중합체의 실례에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-(d-글루타민산), 폴리-(1-글루타민산), 폴리-(1-글루타민산), 폴리-(d-아스파르트산), 폴리-(1-아스파르트산), 폴리-(1-아스파르트산) 및 이들의 공중합체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 대략 5,000 내지 대략 100,000의 분자량, 대략 20,000 내지 대략 80,000의 분자량, 그리고 대략 30,000 내지 대략 60,000의 분자량을 갖는 폴리글루타민산이 이용될 수 있다. 중합체는 본 발명에 참조로서 편입되는 U.S. Pat. No. 5,977,163에 의해 본질적으로 기술된 프로토콜을 이용하여, 본 발명의 치료적 저해물질 펩티드의 하나 이상의 히드록실에 에스테르 연쇄를 통해 접합된다.
적절한 완충제에는 아세트산과 염 (1-2% w/v); 구연산과 염 (1-3% w/v); 붕산과 염 (0.5-2.5% w/v); 그리고 인산과 염 (0.8-2% w/v)이 포함된다. 적절한 보존제에는 염화벤잘코늄 (0.003-0.03% w/v); 클로로부탄올 (0.3-0.9% w/v); 파라벤 (0.01-0.25% w/v) 및 티메로살 (0.004-0.02% w/v)이 포함된다.
일부 구체예에서, 키나아제 저해 조성물은 제약학적 조성물이다. 본 발명에서에 기술된 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 내에 포함되는 치료 효과량의 키나아제 저해 조성물 및 선택적으로, 다른 치료제를 포함한다. 활성 성분은 키나아제 저해 조성물, 치료적 저해물질 펩티드, PTD, 또는 치료 도메인, 또는 이들의 조합이다. 제약학적 조성물의 이들 성분은 또한, 원하는 제약학적 효율을 실질적으로 손상시키는 상호작용이 존재하지 않도록 하는 방식으로 혼합될 수 있다.
키나아제 저해 조성물을 비롯한 치료제(들)는 입자로 제공될 수 있다. 이들 입자는 코팅에 의해 둘러싸인 코어 내에 치료제(들)를 포함할 수 있다. 치료제(들)는 또한, 입자 전역에 분산될 수 있다. 치료제(들)는 또한, 이들 입자의 최소한 하나의 표면 상에 흡착될 수 있다. 이들 입자는 영차 방출, 일차 방출, 이차 방출, 지연 방출, 지속 방출, 즉시 방출 등, 그리고 이들의 임의의 조합을 비롯한 임의의 순차 방출 동역학을 가질 수 있다. 상기 입자는 치료제(들)에 더하여, 침식성, 비-침식성, 생체분해성, 또는 비-생체분해성 물질 또는 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 약학과 의약 분야에서 일과적으로 이용되는 임의의 물질을 포함할 수 있다. 이들 입자는 용액에서 또는 반-고체 상태에서 키나아제 저해 조성물을 포함하는 미세캡슐일 수 있다. 이들 입자는 실질적으로 임의의 형상일 수 있다.
비-생체분해성과 생체분해성 중합성 물질 둘 모두 치료제(들)를 전달하기 위한 입자의 제조에 이용될 수 있다. 이런 중합체는 자연 또는 합성 중합체일 수 있다. 중합체는 방출이 요구되는 기간에 기초하여 선택된다. 특히 주목되는 생체결합성 중합체에는 Sawhney et al in Macromolecules (1993) 26, 581-587에 의해 기술된 생체부식성 수화겔이 포함되고, 이의 교시는 본 발명에 참조로서 편입된다. 이들에는 폴리히알루론산, 카세인, 젤라틴, 글루틴, 폴리무수물, 폴리아크릴산, 알기네이트, 키토산, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸 메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실 메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 그리고 폴리(옥타데실 아크릴레이트)가 포함된다.
치료제(들)는 조절 방출 시스템 내에 포함될 수 있다. 약물의 효과를 연장하기 위하여, 피하, 척수강내, 또는 근육내 주입으로부터 약물의 흡수를 지연시키는 것이 종종 바람직하다. 이는 불량한 물 용해도를 갖는 결정성 또는 무정형 물질의 액상 현탁액의 이용에 의해 달성될 수 있다. 약물의 흡수 속도는 이후, 이의 분해 속도에 좌우되고, 이는 차례로, 결정 크기와 결정성 형태에 좌우될 수 있다. 대안으로, 비경구 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 오일 운반제에 약물을 용해시키거나 현탁함으로써 달성된다.
장기 지속 방출 임플란트의 이용은 만성 질환의 치료에 특히 적합할 수 있다. 장기 지속 방출 임플란트는 당업자에게 널리 공지되어 있고 본 명세서에 기술된 방출 시스템 중에서 일부를 포함한다.
다른 구체예에서, 키나아제 저해 조성물은 겔, 느린-방출 고형 또는 반고형 화합물을 더욱 포함하고, 여기서 겔, 느린-방출 고형 또는 반고형 화합물은 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드 및 코팅을 포함한다. 코팅은 임의의 원하는 물질, 바람직하게는 중합체 또는 상이한 중합체의 혼합물로 구성될 수 있다. 선택적으로, 중합체는 활성 성분의 원하는 방출 패턴을 획득하기 위하여 활성 성분과의 매트릭스를 형성하는 과립화 단계 동안 이용될 수 있다. 겔, 느린-방출 고형 또는 반고형 화합물은 원하는 기간에 걸쳐 활성제를 방출할 수 있다. 겔, 느린-방출 고형 또는 반고형 화합물은 원하는 위치에 가깝게 이식될 수 있고, 여기서 활성제의 방출이 국소 약리학적 효과를 발생시킨다.
다른 구체예에서, 키나아제 저해 조성물은 국소 치료 효과를 촉진하기 위하여 신체 내에 또는 신체 상에 주입, 침착 또는 이식을 위한 반고형, 생체분해성, 생체적합성 생체분해성 전달 시스템에 분산되고 현탁된 반고형, 생체분해성, 생체적합성 전달 시스템 또는 생체분해성, 생체적합성 다중미립자 (multiparticulate)를 이용하는 반고형 전달 시스템을 더욱 포함한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 키나아제 저해 조성물, 치료적 저해물질 펩티드, PTD, 치료 도메인, 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염이다.
다른 구체예에서, 반고형 전달 시스템은 부분적으로 또는 완전하게 생체적합성, 생체분해성, 점성 반고체를 포함하고, 여기서 반고체는 수화겔을 포함한다. 한 구체예에서, 이후 GMO로 지칭되는 글리세릴 모노올레산염이 의도된 반고형 전달 시스템 또는 수화겔이다. 하지만, 점성도/강성률에 대하여 유사한 물리적/화학적 특성을 갖는 많은 수화겔, 중합체, 탄화수소 조성물과 지방산 유도체가 반고형 전달 시스템으로서 기능할 수 있다. 가령, 황산화된 폴리사카라이드, 예를 들면, 헤파린이 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 겔 시스템은 GMO를 융점 (melting point) (40-50℃) 이상으로 가열하고, 그리고 뜨거운 수성-기초된 완충액 또는 전해질 용액, 예를 들면, 인산염 완충액 또는 정상적인 염수를 첨가하여 3-차원 구조를 산출함으로써 생산된다. 상기 수성-기초된 완충액은 반-극성 용매를 포함하는 다른 수성 용액 또는 조합으로 구성될 수 있다.
GMO는 주로 지질-기초된 수화겔을 제공하고, 이는 친유성 물질을 통합하는 능력을 갖는다. GMO는 친수성 화합물을 통합하고 전달하는 내부 수성 채널을 더욱 제공한다. 실온 (대략 25℃)에서, 이러한 겔 시스템은 넓은 범위의 점성도 치수를 갖는 서로 다른 상을 나타내는 것으로 인정된다.
한 구체예에서, 2개의 겔 시스템 상은 실온과 생리학적 온도 (대략 37℃)에서 특성 및 pH (대략 7.4)로 인하여 이용된다. 이러한 2개의 겔 시스템 상 내에서, 첫 번째 상은 대략 5% 내지 대략 15% H2O 함량 및 대략 95% 내지 대략 85% GMO 함량의 라멜라 (lamellar) 상이다. 이러한 라멜라 상은 쉽게 조작되고, 부어지고, 주입되는 온건한 점성 액체이다. 두 번째 상은 대략 15% 내지 대략 40% H2O 함량 및 대략 85%-60% GMO 함량으로 구성되는 입방 상이다. 이는 중량으로 대략 35% 내지 중량으로 대략 40%의 평형 물 함량을 갖는다. 본 명세서에서, 용어 "평형 물 함량"은 과도한 물의 존재에서 최대 물 함량을 지칭한다. 따라서 입방 상은 중량으로 대략 35% 내지 중량으로 대략 40%의 물을 통합한다. 입방 상은 고도로 점성이다. 점성도는 예로써, Brookfield 점도계를 통해 측정될 수 있다. 점성도는 1.2 백만 센티푸아즈 (centipoise) (cp)를 초과한다; 여기서 1.2 백만 cp는 Brookfield 점도계의 컵-원통 (cup and bob) 배열을 통해 획득될 수 있는 점성도의 최대치이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제가 이의 지속된 연속 전달을 위한 시스템을 제공하기 위하여 반고체 내로 통합될 수 있다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 치료적 저해물질 펩티드이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 PTD이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 치료 도메인이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 다른 치료제, 생물학적 활성제, 약물, 약제 및 비활성제가 다양한 방출 속도로 체내에서 국소 생물학적, 생리학적, 또는 치료적 효과를 제공하기 위하여 반고체 내로 통합될 수 있다.
일부 구체예에서, 반고체의 친유성 성질이 변화되거나, 또는 대안으로, 반고체 내에 포함된 수성 채널이 변화되도록, 대안적 반고체, 변형된 제제 및 생산 방법이 이용된다. 따라서 다양한 농도에서 다양한 치료제가 서로 다른 속도로 반고체로부터 확산되거나, 또는 반고체의 수성 채널을 통해 시간의 흐름에서 이로부터 방출될 수 있다. 점성도, 유동성, 표면 장력 또는 수성 성분의 극성의 변경으로 반고체 경도 또는 치료제 방출을 변경하기 위하여 친수성 물질이 이용될 수 있다. 가령, 단일 결합보다 지방산 모이어티의 탄소 9와 탄소 10에서 이중 결합을 제외하고, GMO에 구조적으로 동일한 글리세릴 모노스테아레이트 (GMS)는 GMO에서와 같이, 가열 및 수성 성분의 첨가 시에 겔화되지 않는다. 하지만, GMS는 계면활성제이기 때문에, 대략 20% 중량/중량까지 H2O에 혼합된다. 본 명세서에서, 용어 "계면활성제"는 표면 활성제를 지칭하고, 따라서 제한된 농도에서 H2O, 그리고 극성 물질에서 혼화성이다. 가열과 교반 시에, 80% H2O/20% GMS 조합은 핸드 로션에서와 유사한 경도를 갖는 퍼짐가능 페이스트를 생산한다. 이후, 페이스트는 앞서 언급된 바와 같은 높은 점성도를 갖는 입방 상 겔을 형성하기 위하여 용해된 GMO와 결합된다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 치료적 저해물질 펩티드이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 PTD이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 치료 도메인이다.
다른 구체예에서, 수성 성분을 변경하기 위하여 가수분해된 젤라틴, 예를 들면, 상업적으로 가용한 Gelfoam™이 이용된다. 중량으로 대략 6.25% 내지 12.50% 농도의 Gelfoam™이 중량 또는 다른 수성 기초된 완충액으로 각각, 대략 93.75% 내지 87.50% 농도의 H2O에 배치될 수 있다. 가열과 교반 시에, H2O (또는 다른 수성 완충액)/Gelfoam™ 조합은 짙은 젤라틴성 물질을 생산한다. 생성된 물질은 GMO와 결합되고, 여기서 이렇게 형성된 산물은 팽창하고 순수한 GMO 겔 단독에 비하여 전성 (malleability)이 덜한 고도 점성의 반투명 겔을 형성한다.
다른 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 약물 용해화를 보조하기 위하여 수성 성분을 변경하는데 이용될 수 있다. 중량으로 대략 0.5% 내지 40% 농도의 PEG (PEG 분자량에 따라)가 각각, 중량으로 또는 다른 수성 기초된 완충액으로 대략 99.5% 내지 60% 농도의 H2O가 배치된다. 가열과 교반 시에, H2O (또는 다른 수성 완충액)/PEG 조합은 점성 액체 내지 반고체 물질을 생산한다. 생성된 물질은 GMO와 결합되고, 여기서 이렇게 형성된 산물은 팽창하고 고도 점성의 겔을 형성한다.
이론에 한정됨 없이, 치료제는 아마도 이중상 (biphasic) 방식으로 확산을 통하여 반고체로부터 방출되는 것으로 가정된다. 첫 번째 상은 예로써, 친유성 막 내에 포함된 친유성 약물의 수성 채널 내로의 확산을 수반한다. 두 번째 상은 수성 채널로부터 약물의 외부 환경으로의 확산을 수반한다. 친유성인 약물은 이의 제안된 지질 이중층 구조 내에서 GMO 겔로 자신을 지향시킬 수 있다. 따라서 중량으로 대략 7.5% 이상의 약물, 예를 들면, 키나아제 저해 조성물을 GMO 내로 통합하면, 3-차원 구조의 일체성의 상실이 유발되고, 여기서 겔 시스템은 반고형 입방 상을 더 이상 유지하지 못하고, 그리고 점성 라멜라 상 액체로 복귀한다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 치료적 저해물질 펩티드이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 PTD이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 치료 도메인이다. 다른 구체예에서, 중량으로 대략 1 내지 대략 45%의 치료제가 정상적인 3-차원 구조의 파괴 없이 생리 온도에서 GMO 겔 내로 통합된다. 결과적으로, 이러한 시스템은 약물 투약 시에 현저하게 증가된 융통성의 능력을 가능하게 한다. 이러한 전달 시스템은 전성이기 때문에, 체내에서 벽, 공간, 또는 다른 틈의 윤곽에 부착하고 적합하며, 그리고 존재하는 모든 틈을 완전하게 충전하기 위하여, 이식 부위 내에서 전달되고 조작될 수 있다. 이러한 전달 시스템은 임플란트 부위 전역에서 약물 분포 및 균일한 약물 전달을 담보한다. 공간 내에서 이러한 전달 시스템의 전달과 조작의 용이함은 반고형 전달 장치를 통해 용이하게 된다. 반고형 전달 장치는 이러한 전달 시스템의 표적화되고 제어된 전달을 용이하게 한다.
한 구체예에서, 다중미립자 성분은 논파레일 (nonpareil), 펠릿, 결정, 덩어리, 미세구체, 또는 나노입자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 고형 구조를 생산하는데 이용되는 생체적합성, 생체분해성, 중합성 또는 비-중합성 시스템으로 구성된다.
다른 구체예에서, 다중미립자 성분은 폴리(락틱-코-글리콜리드) (PLGA)로 구성된다. PLGA는 체내에서 제어되고 연장된 치료제 전달에 이용되는 생체분해성 중합체 물질이다. 이런 전달 시스템은 빈번한 주기적인 전신 투약에 비하여 향상된 치료 효능 및 감소된 전체 독성을 제공한다. 이론에 한정됨 없이, 서로 다른 몰 비율의 단량체 아단위로 구성되는 PLGA 시스템은 중합체 분해의 비율에서 변경을 통하여, 표적화된 치료제 전달을 수용하기 위한 정확한 방출 프로필의 실행에서 더욱 큰 융통성을 조장할 것으로 가정된다.
한 구체예에서, PLGA 조성물은 생체적합성이고, 그리고 생체내분해 시에 생체적합성을 유지할 만큼 충분히 순수하다. 한 구체예에서, PLGA 중합체는 치료제 또는 약물이 그 내부에 트랩된 미세구체로 설계되고 형성되고, 여기서 치료제는 차후에, 이로부터 방출된다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 키나아제 저해제이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 치료적 저해물질 펩티드이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 PTD이다. 이와 같은 일부 구체예에서, 치료제는 치료 도메인이다.
다른 구체예에서, 다중미립자 성분은 폴리 d,l(락틱-코-카프로락톤)로 구성된다. 이는 PLGA 중합체의 것과 유사한 약물 방출 기전으로 체내에서 제어되고 연장된 치료제 전달에 이용되는 생체분해성 중합체 물질을 제공한다. 한 구체예에서, 이들 다중미립자 미세구체는 또한, 생체분해성 및/또는 생체적합성 비-중합성 물질, 예를 들면, GMS를 이용하여 생산된다.
다른 구체예에서, 다중미립자 성분은 동일하거나 상이한 약물 물질을 포함하는 동일한 조성물의 중합체, 동일하거나 상이한 약물 물질을 포함하는 상이한 중합체, 또는 약물 없음, 동일한 약물, 상이한 약물, 또는 복수 약물 물질을 포함하는 복수 계층화 (layering) 과정을 이용하여 다중미립자 성분을 캡슐화하거나 코팅하는데 이용되는 방법에 의해 더욱 변형된다. 이는 단일 약제 또는 동시에 복수 약제에 대한 넓은 범위의 약물 방출 프로필을 갖는 다중-층 (캡슐화된) 다중미립자 시스템의 생산을 가능하게 한다. 다른 구체예에서, 다중미립자로부터 물리적 약물 확산의 속도를 제어하는 코팅 물질이 단독으로, 또는 전술한 구체예 및 계획된 구체예와 협력하여 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 키나아제 저해 조성물은 PLGA를 이용하는 전달 시스템을 더욱 포함한다. PLGA 중합체는 에스테르 결합을 보유하고, 이들 결합은 가수분해에 불안정하다. H2O가 PLGA 중합체에 침투할 때, 이의 에스테르 결합이 가수분해되고, 그리고 물 수용성인 단량체가 PLGA 중합체로부터 제거되고, 따라서 예로써, 키나아제 저해 조성물이 포함되지만 이에 국한되지 않는 트랩된 약물의 물리적 방출이 시간의 흐름에서 조장된다. 이와 같은 일부 구체예에서, 무제한적 실례로서 연장되는 폴리무수물, 폴리포스페이트, 폴리디옥사논, 셀룰로오스 화합물 및 아크릴을 비롯한 합성 생체분해성, 생체적합성 중합체의 다른 부류가 체내에서 제어되고 연장된 치료제 전달에 이용될 수 있다. 이와 같은 일부 구체예에서, 무제한적 실례로서 연장되는 스테롤, 수크로오스 지방산 에스테르, 지방산, 그리고 콜레스테릴 에스테르가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 비-중합성 물질이 체내에서 제어되고 연장된 치료제 전달에 이용될 수 있다.
다른 측면에서, 키나아제 저해 조성물은 반고형 전달 시스템을 더욱 포함하고, 이러한 시스템은 치료제의 국소 전달을 위한 운반제로서 기능하고, 그리고 물 함량에 기초된 가변 점성도의 젤라틴성 조성물을 생산하기 위하여 융점 이상으로 가열되고, 이후 뜨거운 수성 성분이 첨가되는 친유성, 친수성 또는 양성 (amphophilic), 고형 또는 반고형 물질을 포함한다. 치료제(들)는 반고형 시스템의 혼합과 형성에 앞서, 용해된 친유성 성분 또는 수성 완충액 성분 내로 통합되고 분산된다. 젤라틴성 조성물은 후속 배치, 또는 침착을 위하여 반고형 전달 장치 내에 배치된다. 전성인 이러한 겔 시스템은 임플란트 부위 내에서 반고형 전달 장치를 통해 용이하게 전달되고 조작되며, 여기서 이는 체내에서 이식 부위, 공간, 또는 다른 틈의 윤곽에 부착하고 적합하며, 그리고 존재하는 모든 틈을 완전하게 충전한다. 대안으로, 생체적합성 중합성 또는 비-중합성 시스템으로 구성되는 다중미립자 성분이 치료제가 그 내부에 트랩된 미세구체를 생산하는데 이용된다. 최종 가공 방법에 따라서, 이들 미세구체는 반고형 시스템 내로 통합되고, 그리고 차후에, 이로부터 임플란트 부위 또는 필적하는 공간 내로 용이하게 전달되도록 하기 위하여 반고형 전달 장치 내에 배치되고, 여기서 치료제가 (a) 약물 방출 기전(들)에 의해 이로부터 차후에 방출된다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 최소한 하나의 분리된 치료적 저해물질 펩티드를 포함하는 생물의학 장치를 더욱 제공하고, 여기서 하나 이상의 분리된 치료적 저해물질 펩티드가 상기 장치 상에 또는 장치 내에 배치된다. 이와 같은 일부 구체예에서, 최소한 하나의 치료적 저해물질 펩티드는 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14], FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12], KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15], YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11], YARAAARQARAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 16], YARAAARGQRAKALARQLAVA [SEQ ID NO: 17], YARAAARGQRAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 18], YARAAARGQRAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 19], YARAAARGQRAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 20], 그리고 YARAAARGQRAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 21]의 아미노산 서열을 보유하는 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 보유하는 최소한 하나의 펩티드이다.
다른 측면에 따라서, 본 발명에서는 PTD 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 mRNA에 특이적으로 혼성화되는 분리된 핵산을 제시한다. 본 명세서에서, 용어 "특이적으로 혼성화된다"는 핵산이 이러한 핵산과 원래 대합되지 않는 DNA의 최소한 하나의 가닥의 상보적인 영역과의 염기 쌍을 특이적으로, 또는 한정적으로 형성하는 과정을 지칭한다. 가령, CPP 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 세포의 mRNA의 최소한 일부분에 결합하거나 혼성화되는 핵산이 특이적으로 혼성화되는 핵산인 것으로 간주될 수 있다. 선별적으로 혼성화되는 핵산은 엄격한 혼성화 조건 하에, 비-표적 핵산 서열에 대한 혼성화보다 검출가능하게 더욱 높고 (가령, 배경보다 최소한 2-배), 그리고 비-표적 핵산이 실질적으로 배제되는 정도로, 특정된 핵산 표적 서열에 대한 핵산 서열의 혼성화를 겪는다. 선별적으로 혼성화되는 서열은 전형적으로, 서로에 대략 최소한 80% 서열 동일성, 최소한 90% 서열 동일성, 또는 최소한 100% 서열 동일성을 갖는다 (즉, 상보적이다). 다른 구체예에 따라서, 본 발명에서는 치료적 저해물질 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 mRNA에 특이적으로 혼성화되는 분리된 핵산을 제시한다.
RNA의 추출 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고 예로써, J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y,, 1989), vol. 1, ch. 7, "Extraction, Purification, and Analysis of Messenger RNA from Eukaryotic Cells,"에서 기술된다. 다른 분리와 추출 방법 역시 널리 공지되어 있고 예로써, F. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, 2007)에서 기술된다. 전형적으로, 분리는 비록 다른 세제와 추출 약품이 대안적으로 이용될 수 있긴 하지만, 무질서유발제 (chaotropic agent), 예를 들면, 구아니디늄 염화물 또는 구아니디늄 티오시안산염의 존재에서 수행된다. 전형적으로, mRNA는 올리고(dT)-셀룰로오스, 또는 mRNA 분자의 폴리아데닐화된 3'-부분에 결합하는 능력을 갖는 다른 크로마토그래피 매체 위에서 크로마토그래피에 의해 전체 추출된 RNA로부터 분리된다. 덜 바람직하긴 하지만 대안으로, 전체 RNA가 이용될 수 있다. 하지만, 일반적으로, 포유동물 출처로부터 폴리(A)+RNA를 분리하는 것이 바람직하다.
방법: 사이토킨을 활성화시키는 키나아제를 저해하는 방법
다른 측면에 따라서, 본 발명에서는 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 키나아제 저해 조성물을 제공하는 단계, 여기서 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 최소한 하나의 키나아제 효소를 저해하고, 여기서 상기 키나아제 저해 조성물은 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드를 포함하고, 여기서 치료적 저해물질 펩티드는 첫 번째 도메인 및 두 번째 도메인을 포함하고, 여기서 첫 번째 도메인은 단백질 형질도입 도메인 (PTD)을 포함하고 두 번째 도메인의 근위에 위치하며, 여기서 두 번째 도메인은 치료 도메인을 포함하고 첫 번째 도메인의 근위에 위치하며; (b) 상기 키나아제 저해 조성물을 병든 개체에 투여하여 최소한 하나의 키나아제 효소를 저해하는 단계; 그리고 (c) 최소한 하나의 염증성 사이토킨의 발현을 감소시켜 염증성 질환을 치료하는 단계.
한 구체예에 따라서, 병태생리학이 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 염증성 질환은 천식, 강직성 척추염, I형 당뇨병, 길랑 바레 증후군, 루푸스, 건선, 경피증, 쇼그렌병, 만성 전립선염, 사구체신염, 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류머티스성 관절염, 맥관염, 과민성 맥관염, 내독성 쇼크, 췌장염, 국소 염증성 질환, 동맥경화증, 알츠하이머병, 허혈, 혈관내막 비대, 협착증, 재협착증, 평활근종, 평활근 연축, 협심증, 프린즈메탈 협심증, 서맥, 고혈압, 심장 비대, 신부전, 뇌졸중, 폐 고혈압, 임신 중독증, 레이노 질환, 용혈성 요독증, 치열, 이완불능증, 발기불능, 편두통, 혈관병증, 울혈성 심부전, 기절 심근, 확장기 기능장애, 신경아교종, 만성 폐쇄성 폐 질환, 골감소증, 퇴행성 관절염, 부패증, 경변증, 간질성 폐섬유증, 대장염, 충수염, 위염, 후두염, 수막염, 이염, 외상성 뇌 손상, 척추 손상, 말초 신경병증, 다발성 경화증, 심혈관대사 증후군, 비알코올 지방간염, 췌장과 폐의 낭포성 섬유증, 주사 섬유증, 심근내막 섬유증, 폐의 특발성 폐 섬유증, 종격동 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 유방암, 전립선암, 그리고 내피 세포 기능장애로 구성된 군에서 선택되는 최소한 하나의 질환이다.
다른 구체예에 따라서, 첫 번째 도메인은 두 번째 도메인의 5'에 위치한다. 다른 구체예에 따라서, 두 번째 도메인은 첫 번째 도메인의 3'에 위치한다. 다른 구체예에 따라서, 첫 번째 도메인은 두 번째 도메인에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예에 따라서, 두 번째 도메인은 첫 번째 도메인에 작동가능하게 연결된다.
다른 구체예에 따라서, 키나아제 효소는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 키나아제이다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 키나아제 효소는 MK2이다. 이와 같은 일부 구체예에 따라서, 키나아제 효소는 MK3이다. 다른 구체예에 따라서, 키나아제 효소는 CaMK이다.
다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13]에 실질적인 동일성을 갖는 도메인이다.
다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALARQLGVAA [SEQ ID NO: 23]에 실질적인 동일성을 갖는 도메인이다.
다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인의 아미노산 서열은 KAANRQLGVAA [SEQ ID NO: 22]이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALARQLGVAA [SEQ ID NO: 23]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNAQLGVAA [SEQ ID NO: 24]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRALGVAA [SEQ ID NO: 25]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQAGVAA [SEQ ID NO: 26]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 27]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGAAA [SEQ ID NO: 28]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGVA [SEQ ID NO: 29]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KKKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 30]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KAANRQLGVAA [SEQ ID NO: 22]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNAQLGVAA [SEQ ID NO: 24]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQAGVAA [SEQ ID NO: 26]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGAAA [SEQ ID NO: 28]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALARQLGVAA [SEQ ID NO: 23]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRALGVAA [SEQ ID NO: 25]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 아미노산 서열 KALNRQLAVAA [SEQ ID NO: 27]를 보유하는 도메인이다 .
다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31]에 실질적인 동일성을 갖는 도메인이다.
다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 단백질 형질도입 도메인은 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRI [SEQ ID NO: 34]에 실질적인 동일성을 갖는 도메인이다.
다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 WLRRIKA [SEQ ID NO: 32]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR [SEQ ID NO: 33]을 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRI [SEQ ID NO: 34]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 FAKLAARLYR [SEQ ID NO: 35]을 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 KAF AKLAARLYR [SEQ ID NO: 36]을 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 FAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 43]를 보유하는 도메인이다. 다른 구체예에 따라서, 치료 키나아제 저해물질 펩티드의 PTD는 아미노산 서열 KAFAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 44]를 보유하는 도메인이다.
다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARQARAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 16]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALARQLAVA [SEQ ID NO: 17]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 18]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 19]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 20]를 보유하는 펩티드이다. 다른 구체예에 따라서, 치료적 저해물질 펩티드는 아미노산 서열 YARAAARGQRAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 21]를 보유하는 펩티드이다.
다른 구체예에 따라서, 키나아제 저해 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체를 더욱 포함한다.
다른 구체예에 따라서, 키나아제 저해 조성물은 비경구 투여된다. 다른 구체예에 따라서, 키나아제 저해 조성물은 최소한 하나의 분리된 치료적 저해물질 펩티드를 포함하는 생물의학 장치를 통해 투여되고, 여기서 하나 이상의 분리된 치료적 저해물질 펩티드가 상기 장치 상에 또는 장치 내에 배치된다. 이와 같은 일부 구체예에서, 최소한 하나의 치료적 저해물질 펩티드는 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14], FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12], KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15], YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11], YARAAARQARAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 16], YARAAARGQRAKALARQLAVA [SEQ ID NO: 17], YARAAARGQRAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 18], YARAAARGQRAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 19], YARAAARGQRAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 20], 그리고 YARAAARGQRAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 21]로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 보유하는 최소한 하나의 펩티드이다.
본 발명에 유용한 분자 유전학 및 유전자 조작에서 일반적인 방법은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed, (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), 그리고 Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. EJ. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.)에서 기술된다. 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터, 그리고 키트는 상업적 제조업체, 예를 들면, BioRad, Stratagene, Invitrogen, ClonTech 및 Sigma-Aldrich Co로부터 가용하다.
범위의 값이 제공되는 경우에, 달리 명시되지 않으면, 상기 범위의 상한선과 하한선, 그리고 상기 규정된 범위 내에 임의의 다른 규정된 또는 개재성 값 사이에, 하한선의 단위의 소수점 첫째자리까지 각 개재성 값 역시 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 더욱 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있는 이들 더욱 작은 범위의 상한과 하한 역시 본 발명에 포함되고 규정된 범위 내에 임의의 명확하게 배제된 한계에 종속된다. 규정된 범위가 이들 한계 중에서 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 경우에, 이들 포함된 한계 중에서 어느 한쪽 또는 양쪽을 배제하는 범위 역시 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에서 기술된 것들에 유사하거나 동등한 임의의 방법과 물질 역시 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있긴 하지만, 선호되는 방법과 물질이 여기서 기술된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물은 이들 간행물이 인용되는 방법 및/또는 물질과 관련하여 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하기 위하여 본 발명에 참조로서 편입된다.
본 명세서에서, 그리고 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 본문에서 달리 명시되지 않으면, 복수 참조물을 포괄한다. 본 명세서에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 개시된 간행물은 본 발명의 출원일에 앞서 그들의 개시 목적으로만 제공된다. 본 명세서에서 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의하여 이런 간행물에 앞서지 못함을 인정하는 것으로 간주되지 않는다. 게다가, 제공된 간행물의 일자는 독립적으로 확인이 요구되는 실제 공개 일자와 상이할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1에서는 활성 (대조에 상대적인 %) 대(對) 저해물질 펩티드 농도 (μM)의 플롯을 도시한다. 도 1에서는 각각, 출연하는 순서로 SEQ ID NO: 5, 30, 67-70과 16을 보여준다.
도 2에서는 활성 (대조에 상대적인 %) 대(對) 저해물질 펩티드 농도 (μM)의 플롯을 도시한다. 도 2에서는 각각, 출연하는 순서로 SEQ ID NO: 14, 12, 15, 11과 16을 보여준다.
도 3에서는 반응 속도 (RFU/s) 대(對) MK2 저해물질 펩티드의 농도 (μM)의 플롯을 도시한다. RFU/s = 상대적 형광 단위/second. 도 3에서는 각각, 출연하는 순서로 SEQ ID NO: 22-28과 13을 보여준다.
도 4에서는 반응 속도 (RFU/s) 대(對) MK2 저해물질 펩티드의 농도 (μM)의 플롯을 도시한다. RFU/s = 상대적 형광 단위/second. 도 4에서는 SEQ ID NO: 13으로서 'KALNRQLGVAA'를 보여준다.
도 5에서는 반응 속도 (RFU/s) 대(對) MK2 저해물질 펩티드의 농도 (μM)의 플롯을 도시한다. RFU/s = 상대적 형광 단위/second. 도 5에서는 각각, 출연하는 순서로 SEQ ID NO: 29-30, 14와 13을 보여준다.
도 6에서는 반응 속도 (RFU/s) 대(對) MK2 저해물질 펩티드의 농도 (μM)의 플롯을 도시한다. RFU/s = 상대적 형광 단위/second. 도 6에서는 각각, 출연하는 순서로 SEQ ID NO: 32, 31, 33, 5와 13을 보여준다.
도 7에서는 시간의 흐름에서 IL-6 (pg/㎖/105개 세포)의 평균 농도의 플롯을 도시한다. YARA = YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]. † = 1 ng/㎖ IL-1β 처리된 시료보다 훨씬 높음. * = 1 ng/㎖ IL-1β 처리된 시료보다 훨씬 낮음. 오차 막대는 3가지 시료 사이에 표준 편차를 나타낸다.
도 8에서는 시간의 흐름에서 IL-6 (pg/㎖/105개 세포)의 평균 농도의 플롯을 도시한다. YARA = YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]; FAK = FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]. * = 1 ng/㎖ TNF-α 처리된 시료보다 훨씬 낮음. 오차 막대는 3가지 시료 사이에 표준 편차를 나타낸다.
도 9에서는 시간의 흐름에서 IL-6 (pg/㎖/105개 세포)의 평균 농도의 플롯을 도시한다. YARA = YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]; FAK = FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]. * = 10 ng/㎖ TNF-α 처리된 시료보다 훨씬 낮음. 오차 막대는 3가지 시료 사이에 표준 편차를 나타낸다.
도 10에서는 각 처리 군 (i) TNF-α (5 ng/㎖)와 함께 1 mM MK2i (치료적 저해물질 펩티드 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]); (ii) TNF-α (5 ng/㎖)와 함께 3 mM MK2i; (iii) TNF-α (10 ng/㎖)와 함께 1 mM MK2i; 그리고 (iv) TNF-α (10 ng/㎖)와 함께 3 mM MK2i로부터 평균 IL-1β 농도 (pg/㎖)의 그래프를 도시한다.
도 11에서는 각 처리 군 (i) 음성 대조 (배지 단독); (ii) TNF-α (5 ng/㎖); (iii) TNF-α (10 ng/㎖); (iv) TNF-α (5 ng/ℓ)와 MK2i (1 mM 치료적 저해물질 펩티드 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]); (v) TNF-α (10 ng/㎖)와 MK2i (1 mM); (vi) TNF-α (5 ng/㎖)와 MK2i (3 mM); 그리고 (vii) TNF-α (10 ng/㎖)와 MK2i (3 mM)로부터 평균 IL-6 농도 (pg/㎖)의 그래프를 도시한다.
실시예
아래의 실시예는 본 발명을 어떻게 창조하고 이용하는 지에 관한 완전한 개시와 설명을 당업자에게 제공하기 위하여 제시되고, 그리고 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않고, 또한 이들 실시예는 하기 실험이 수행된 전체 또는 유일한 실험임을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 이용된 수치에 관하여 (가령, 양, 온도 등) 정확성을 담보하기 위한 노력이 이루어지긴 했지만 일부 실험 오차와 편차가 고려되어야 한다. 달리 명시되지 않으면, 분율(part)은 중량분율(part by weight)이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 그리고 압력은 대기압 또는 대기압에 가깝다.
방법
펩티드 합성과 정제
펩티드는 Symphony® 펩티드 합성장치 (Protein Technologies, Inc.)에서 표준 FMOC 화학을 이용하여 Rink-아미드 또는 Knorr-아미드 수지 (Synbiosci Corp.)에서 합성되었다. 이들 아미노산에 대한 결합제 (Synbiosci Corp.)는 2-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오르포스페이트/N-메틸 말레이미드 (HBTU/NMM)이었다. 합성후, 펩티드는 트리플루오르아세트산-기초된 칵테일로 수지로부터 절단되고, 에테르에서 침전되고, 그리고 원심분리에 의해 회수되었다. 회수된 펩티드는 진공에서 건조되고, MiIIiQ 정제수에서 재현탁되고, 그리고 22/250 C18 prep-scale 칼럼 (Grace Davidson)으로 구비된 신속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)(AKTA Explorer, GE Healthcare)를 이용하여 정제되었다. 일정한 농도의 0.1% 트리플루오르아세트산 또는 0.1% 아세트산으로 아세토니트릴 구배가 정제를 달성하는데 이용되었다. 원하는 분자량은 4800 Plus MALDI TOF/TOFTM 분석기 (Applied Biosystems)를 이용한 비행 시간 매트릭스 공조 레이저 탈착 이온화 (time-of-flight matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) 질량 분석법에 의해 확증되었다.
실시예 1. MK2의 치료적 저해물질 펩티드의 필수 아미노산의 결정
MK2의 치료적 저해물질 펩티드의 필수 아미노산은 Ala 및 D-아미노산 치환을 이용하여 확인되었다. 100 μM의 KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13]는 MK2 활성의 73%를 저해하였다. 먼저, 치료 도메인 (KALNRQLGVAA) [SEQ ID NO: 13] 내에서 각 아미노산은 독립적으로, Ala로 대체되었다. 이후, 상기 펩티드의 치료 도메인 내에서 각 아미노산은 독립적으로, 이의 D-아미노산으로 대체되었다.
형광-기초된 키나아제 활성 분석
MAPKAP-K2 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 대한 Omnia® 키나아제 분석은 표 1에 열거된 각 펩티드의 존재와 부재에서 MK2에 대한 반응 속도를 결정하는데 이용되었다. 상기 키트는 독점 반응 완충액을 포함하고, 여기에 1 mM ATP, 0.2 mM DTT, 10 μM MAPKAP-K2 Sox-변형된 펩티드 기질, 5 ng MK2, 그리고 목적되는 저해물질 펩티드 (50 ㎕의 최종 부피)가 첨가되었다 (최종 농도가 제공된다). 인간 MK2는 Invitrogen으로부터 구입되었다. 이들 반응은 키트와 함께 제공된 낮은-단백질-결합 96-웰 평판의 웰 내에서 30℃에서 수행되고, 그리고 형광 판독 (여기 = 360 rm, 방출 = 485 nm)은 SpectraMax M5 분광광도계 (Molecular Devices)를 이용하여 20분 동안 30초 마다 수행되었다. 반응 속도는 상대적 형광 단위 대(對) 시간의 플롯 (plot)의 기울기로부터 각 반응 웰에 대하여 결정되었다. 각 저해물질 펩티드는 최소한 4가지 농도, 12.5, 25, 50과 100 μmol에서 삼중으로 조사되었다.
표 1에서, "a"는 모든 펩티드에 대하여 100 μM에서 도시된 결과를 표시한다; "b"는 100 μM의 농도에서 치환되지 않은 펩티드 (KALNRQLGVAA) [SEQ ID NO: 13]와 대비하여 MK2 반응 속도에서 변화 비율을 표시한다; "c"는 3가지 시료 사이에 표준 편차로서 보고된 오차를 표시한다.
Figure 112011052945157-pct00001
D-아미노산과 Ala 스캔은 Asn이 MK2 저해에 필수적이지 않다는 것을 증명하였다 (표 1, 도 3과 도 4 참조).
도 3에서는 반응 속도 (형광 단위/second) (RFU/s)) 대(對) MK2 저해물질 펩티드의 농도 (μM)의 플롯을 도시하고, 여기서 이들 저해물질 펩티드는 알라닌 치환을 통합한다. Asp와 Ala을 대체하면, MK2 저해가 강화되었다. Ala의 Gly로의 치환은 저해를 약간 증가시켰다. Ala 스캔은 또한, Arg, Gln과 Val이 MK2 저해에 필수적이라는 것을 증명하였다. 2개의 Leu이 덜 필수적인 아미노산이긴 하지만, 이들의 제거는 치료적 저해물질 펩티드의 효능을 감소시켰다.
도 4에서는 반응 속도 (RFU/s)) 대(對) MK2 저해물질 펩티드의 농도 (μM)의 플롯을 도시하고, 여기서 이들 저해물질 펩티드는 D 아미노산 치환을 통합한다. 어떤 D-아미노산 치환도 MK2 저해를 실질적으로 강화시키지 못하였다; 대부분의 D-아미노산 치환은 MK2 저해물질 펩티드의 효능을 실질적으로 감소시켰다.
도 5에서는 반응 속도 (RFU/s)) 대(對) MK2 저해물질 펩티드의 농도 (μM)의 플롯을 도시하고, 여기서 상기 저해물질 펩티드는 변형되었다. 표 1과 도 5에서는 MK2 저해가 C-말단 Ala (100 μM)에 의해 강화되지 않고, 그리고 저해가 저해물질 펩티드 내에서 2개의 추가 Lys에 의해 약간 증가된다는 것을 증명한다. 하지만, MK2 저해는 C-말단 Ala의 제거 또는 2개의 N-말단 Lys의 추가 시에, 더욱 낮은 농도의 저해물질 펩티드에서 감소한다.
실시예 2. MK2의 PTD 저해
PTD에 의한 MK2 저해는 3가지 PTD: 1) WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31]; 2) YGRKKRRQRRR [SEQ ID NO: 33]; 그리고 3) YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5]를 이용하여 증명되었다.
도 6에서는 반응 속도 (RFU/s)) 대(對) MK2 저해물질 펩티드의 농도 (μM)의 플롯을 도시하고, 여기서 상기 저해물질 펩티드는 단백질 형질도입 도메인이다. 표 1과 도 4에서는 MK2 저해가 PTD 펩티드 농도에 상관없이, PTD 펩티드 YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5]에 의해 최소한의 영향을 받는다는 것을 증명한다. MK2 활성은 넓은 범위의 PTD 펩티드 농도 (100 μM PTD에서 61% 저해 내지 25 μM PTD에서 48% 저해) 전역에서 PTD 펩티드 YGRKKRRQRRR [SEQ ID NO: 33]에 의해 저해되었다. MK2는 PTD 펩티드 WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31]에 의해 강하게 저해되었다; 이러한 PTD 펩티드는 치료 도메인 펩티드보다 MK2의 더욱 높은 저해를 제공하였다. 표 1에서는 PTD 펩티드 WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31]와 치료 도메인 KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13]의 조합이 상승적 저해 효과를 제공한다는 것을 더욱 증명한다.
실시예 3. 치료 도메인에 변형은 IC 5O 에 영향을 준다
치료적 저해물질 펩티드의 치료 도메인은 IC50 값에 영향을 주도록 변형되었다. 변형된 치료적 저해물질 펩티드는 이후, 면역방사정량법으로 분석되었다.
면역방사정량 IC 50 및 키나아제 활성 결정
결합된 형질도입 도메인과 치료 도메인을 포함하는 펩티드 (이후, "완전 펩티드")의 특이성과 효능을 조사하기 위하여 상업적 면역방사정량 분석 서비스 (Millipore, Billerica, MA)가 이용되었다. 이들 분석에서, 키나아제가 저해물질 펩티드에 의해 저해되지 않으면, 양으로 하전된 기질이 ATP로부터 방사성표지된 포스페이트 기로 인산화되었다. 양으로 하전된 기질은 음으로 하전된 필터 막에 유인되고, 섬광 계수기로 정량되고, 그리고 100% 활성 대조에 비교되었다. ATP에 대한 15 μM의 겉보기 Km 내에서 ATP 농도가 선택되었는데, 그 이유는 Km에 가까운 ATP 농도가 키나아제가 동일한 상대적인 양의 인산화 활성을 갖도록 할 수 있기 때문이다.
표 2에서는 스크린에 포함된 키나아제에 대한 완충액 조성물을 제시한다; (h) = 인간, (m) = 생쥐, (r) = 쥐, 그리고 (y) = 효모.
Figure 112011052945157-pct00002
각 키나아제 분석을 위한 프로토콜은 아래와 같다:
(1) AbI (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, AbI (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 50 μM EAIYAAPFAKKK (SEQ ID NO: 48), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(2) AMPK (r)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, AMPK (r) (5-10 mU)는 32 mM HEPES pH 7.4, 0.65 mM DTT, 0.012% Brij-35, 200 μM AMP, 200 μM AMARAASAAALARRR (SEQ ID NO: 49), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(3) Aurora-A (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, Aurora-A (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 200 μM LRRASLG (Kemptide) (SEQ ID NO: 50), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 50 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(4) BTK (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, BTK (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 250 μM KVEKIGEGTYGVVYK (Cdc2 펩티드) (SEQ ID NO: 51), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(5) CaMKI (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, CaMKI (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM CaCl2, 16 ㎍/㎖ 칼모듈린, 250 μM KKLNRTLSFAEPG (SEQ ID NO: 52), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(6) CDK1/cyclinB (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, CDK1/cyclinB (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.O, 0.2 mM EDTA, 0.1 mg/㎖ 히스톤 H1, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(7) CHK1 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, CHK1 (h) (5-10 mU)은 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 200 μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR (SEQ ID NO: 53), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(8) CK1δ (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, CK1δ (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 200 μM KRRRALS(p)VASLPGL (SEQ ID NO: 54), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(9) CK2 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, CK2 (h) (5-10 mU)는 20 mM HEPES pH 7.6, 0.15 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-1OO, 165 μM RRRDDDSDDD (SEQ ID NO: 55), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(10) c-Kit (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, c-Kit (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 10 mM MnCl2, 0.1 mg/㎖ 폴리(Glu, Tyr) 4:1, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 filtermat A 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(11) DYRK2 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, DYRK2 (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 2 mg/㎖ 카세인, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(12) EGFR (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, EGFR (h) (5-10 mU)은 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 10 mM MnCl2, 0.1 mg/㎖ 폴리(Glu, Tyr) 4:1, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 filtermat A 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(13) EphA2 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, EphA2 (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 0.1 mg/㎖ 폴리(Glu, Tyr) 4:1, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 filtermat A 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(14) FGFR1 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, FGFR1 (h) (5-10 mU)은 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 250 μM KKKSPGEYVNIEFG (SEQ ID NO: 56), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(15) FIt3 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, Flt3 (h) (5-10 mU)은 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 50 μM EAIYAAPFAKKK (SEQ ID NO: 48), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(16) GSK3β (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, GSK3β (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 20 μM YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQS(p)EDEEE (포스포 GS2 펩티드) (SEQ ID NO: 57), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 50 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(17) IGF-1R (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, IGF-1R (h) (5-10 mU)은 50 mM Tris pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM Na3VO4, 0,1% β-메르캅토에탄올, 250 μM KKKSPGEYVNIEFG (SEQ ID NO: 56), 10 mM MnCl2, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(18) IRAK4 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, IRAK4 (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 0.33 mg/㎖ 미엘린 염기성 단백질, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(19) JAK3 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, JAK3 (h) (5-10 mU)은 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 500 μM GGEEEEYFELVKKKK (SEQ ID NO: 58), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(20) KDR (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, KDR (h) (5-10 mU)은 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 0.33 mg/㎖ 미엘린 염기성 단백질, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(21) Lck (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, Lck (h) (5-10 mU)는 50 mM Tris pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM Na3VO4, 250 μM KVEKIGEGTYGVVYK (Cdc2 펩티드) (SEQ ID NO: 51), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(22) LIMK1 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, LIMK1 (h) (5-10 mU)은 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 0.6 mg/㎖ 코필린, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(23) MAPK1 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, MAPK1 (h) (5-10 mU)은 25 mM Tris pH 7.5, 0.02 mM EGTA, 250 μM 펩티드, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다,
(24) MEK1 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, MEK1 (h) (1-5 mU)은 50 mM Tris pH 7.5, 0.2 mM EGTA, 0.1% β-메르캅토에탄올, 0.01% Brij-35, 1 μM 비활성 MAPK2 (m), 10 mM Mg아세테이트 및 차가운 ATP (필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 5 ㎕의 항온처리 혼합물이 MAPK2 (m) 분석을 시작하는데 이용된다.
(25) Met (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, Met (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 250 μM KKKSPGEYVNIEFG (SEQ ID NO: 56), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ- P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(26) MLCK (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, MLCK (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM CaCl2, 16 ㎍/㎖ 칼모듈린, 250 μM KKLNRTLSFAEPG (SEQ ID NO: 52), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(27) PDGFRβ (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, PDGFRβ (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 0.1 mg/㎖ 폴리(Glu, Tyr) 4:1, 10 mM MnCl2, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 filtermat A 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(28) PhKγ2 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, PhKγ2 (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 250 μM KKLNRTLSFAEPG (SEQ ID NO: 52), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(29) Pim-1 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, Pim-1 (h) (5-10 mU)은 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 100 μM KKRNRTLTV (SEQ ID NO: 59), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(30) PKA (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, PKA (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 30 μM LRRASLG (Kemptide) (SEQ ID NO: 50), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 50 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(31) PKBβ (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, PKBβ (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 30 μM GRPRTSSFAEGKK (SEQ ID NO: 60), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(32) PKCβI (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, PKCβI (h) (5-10 mU)는 20 mM HEPES pH 7.4, 0.03% Triton X-100, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mg/㎖ 포스파티딜세린, 10 ㎍/㎖ 디아실글리세롤, 0.1 mg/㎖ 히스톤 H1, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(33) PKCδ (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, PKCδ (h) (5-10 mU)는 20 mM HEPES pH 7.4, 0.03% Triton X-100, 0.1 mg/㎖ 포스파티딜세린, 10 ㎍/㎖ 디아실글리세롤, 50 μM ERMRPRKRQGSVRRRV (SEQ ID NO: 61), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(34) PKG1α (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, PKG1α (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 10 μM cGMP, 200 μM RRRLSFAEPG (SEQ ID NO: 62), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(35) PKG1β (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, PKG1β (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 10 μM cGMP, 200 μM RRRLSFAEPG (SEQ ID NO: 62), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(36) Ret (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, Ret (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 250 μM KKKSPGEYVNIEFG (SEQ ID NO: 56), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(37) ROCK-I (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, ROCK-I (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 30 μM KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK (SEQ ID NO: 63), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(38) Rsk2 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, Rsk2 (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 30 μM KKKNRTLSVA (SEQ ID NO: 64), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(39) SAPK2a (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, SAPK2a (h) (5-10 mU)는 25 mM Tris pH 7.5, 0.02 mM EGTA, 0.33 mg/㎖ 미엘린 염기성 단백질, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(40) SRC (1-530) (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, SRC (1-530) (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 500 mM GGEEEEYFELVKKKK (SEQ ID NO: 58), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/ pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(41) Syk (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, Syk (h) (5-10 mU)는 50 mM Tris pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM Na3VO4, 0.1% β-메르캅토에탄올, 0.1 mg/㎖ 폴리(Glu, Tyr) 4:1, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33PATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 filtermat A 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(42) Tie2 (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, Tie2 (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM MnCl2, 0.1 mg/㎖ 폴리(Glu, Tyr) 4:1, 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 filtermat A 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(43) TrkA (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, TrkA (h) (5-10 mU)는 8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 250 μM KKKSPGEYVNIEFG (SEQ ID NO: 56), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 75 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
(44) PRAK (h)
25 ㎕의 최종 반응 부피에서, PRAK (h) (5-10 mU)는 50 mM Na β-글리세로포스페이트 pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 30 μM KKLRRTLSVA (SEQ ID NO: 65), 10 mM Mg아세테이트 및 [γ-33P-ATP] (비활성 대략 500 cpm/pmol, 필요에 따라 농축)와 함께 항온처리된다. 반응은 MgATP mix의 첨가에 의해 시작된다. 실온에서 40분 동안 항온처리후, 반응은 5 ㎕의 3% 인산 용액의 첨가에 의해 중단된다. 이후, 10 ㎕의 반응물이 P30 filtermat 상에 스폿팅 (spotting)되고 50 mM 인산에서 5분 동안 3회, 그리고 건조와 섬광 계측에 앞서 메탄올에서 1회 세척된다.
저해물질 펩티드에 대한 IC5O 값은 Millipore의 IC50 Profiler Express 서비스를 이용하여 결정되었다. IC50 값은 절반 로그 희석도 (one-half log dilution)의 10-포인트 곡선으로부터 추정되었다. 특이성에 대하여 조사된 펩티드의 경우에, MK2 활성의 대략 95%를 저해하는 펩티드의 농도는 MilliporeKinaseProfiler 서비스로부터 MK2, 세포 생존능, 또는 인간 질환에 관련된 한 조의 키나아제에 대한 프로필에 선택되었다. 양쪽 분석에서, 화합물은 디메틸 설폭시드 (DMSO)로 공급되었다. 모든 키나아제 활성 측정은 이중으로 수행되었다.
도 1에서는 독립된 PTD 펩티드 YARAAARGQARA [SEQ ID NO: 37] 및 독립된 치료 도메인 펩티드 KKKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 30]와 비교하여 동일한 PTD (YARAAARGQARA) [SEQ ID NO: 37]를 보유하는 치료적 저해물질 펩티드 변이체에 대한 IC50 곡선과 값을 도시한다. 모든 치료적 저해물질 펩티드 변이체는 치료 도메인 펩티드 KKKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 30]보다 낮은 IC50 값을 보였다. Asn의 Ala로의 치환 및/또는 Gly의 Ala으로의 치환은 치료적 저해물질 펩티드에 대한 IC50 값에서 경미한 변화를 발생시켰다. 말단 Ala의 제거는 IC50 값에서 경미한 증가를 제공하였다.
실시예 4. PTD는 치료적 저해물질 펩티드의 효능에 영향을 준다.
PTD는 치료적 저해물질 펩티드의 효능에 대한 상이한 영향을 주었다. 각각의 PTD는 그들의 개별 치료 도메인과 결합될 때, 치료적 저해물질 펩티드의 저해 효과와 상이한 수준의 상승 작용 (synergism)을 제공하였다. 도 2에서는 동일한 치료 도메인 (KALNRQLGVAA) [SEQ ID NO: 13]을 보유하지만 PTD가 상이한 치료적 저해물질 펩티드 변이체에 대한 IC50 곡선과 값을 도시한다. PTD 펩티드 WLRRRIKAWLRRI [SEQ ID NO: 38]를 통합하는 치료적 저해물질 펩티드는 PTD 펩티드 YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5]를 통합하는 치료적 저해물질 펩티드보다 더욱 낮은 IC50 값 (30-배 이상 낮음)을 가졌다.
실시예 5. PTD 및 아미노산 치환은 치료적 저해물질 펩티드의 특이성에 영향을 준다.
치료적 저해물질 펩티드는 MK2, 세포 생존능, 또는 인간 질환에 관련된 인간 키나아제에 대한 활성에 대하여 분석되었다. 이들 분석은 정상적인 MK2 활성의 2% 내지 8%를 산출하는 치료적 저해물질 펩티드의 농도를 이용하여 수행되었다. 오차는 2가지 시료 사이에 표준 편차로서 보고되고, 그리고 "c"는 쥐 AMPK인 반면, 이용된 다른 모든 키나아제는 인간 키나아제이다.
표 3과 표 4에서는 PTD 펩티드 FAKLAARLYR [SEQ ID NO: 35] 및 KAFAKLAARLYR [SEQ ID NO: 36]을 보유하는 치료적 저해물질 펩티드가 PTD 펩티드 WLRRIKAWLRRI [SEQ ID NO: 34]를 보유하는 치료적 저해물질 펩티드보다 일정한 키나아제에 대한 더욱 높은 특이성을 갖는다는 것을 증명한다.
Figure 112011052945157-pct00003
Figure 112011052945157-pct00004
Figure 112011052945157-pct00005
Figure 112011052945157-pct00006
추가의 치료적 저해물질 펩티드 변이체는 여러 키나아제 집단을 대표하는 여러 인간 키나아제에 대한 활성에 대하여 분석되었다. 이들 키나아제에는 MK2; MK3; CaMKI (칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제); PRAK (p38 조절된/활성화된 단백질 키나아제, 일명 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제 활성화된 단백질 키나아제 5 (MAPKAPK5)); SAPK2a (p38α); IRAK4 (IL-1 수용체 (IL-1R)-관련된 키나아제); MLCK (미오신 경쇄 키나아제); PKBβ (단백질 키나아제 B); PCKδ (단백질 키나아제 C); 그리고 ROCK-I (Rho-관련된 세린/트레오닌 키나아제)이 포함되었다. 선택된 농도는 IC50 데이터에 기초하여 0-10% MK2 활성을 산출하였다; YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]가 약간 더 높은 농도로 존재할 수 있고, 그리고 모든 키나아제 저해가 열거된 농도에서 예상되는 것보다 클 수 있다; 오차는 2가지 시료 사이에 표준 편차로서 보고된다.
표 5에서는 치료적 저해물질 펩티드 간에 특이성에서 차이를 도시한다. 모든 치료적 저해물질 펩티드는 MK2, MK3과 CaMKI를 모두 저해하였다. Asn이 Ala으로 치환된 치료적 저해물질 펩티드 변이체는 MK2보다 CaMKI의 더욱 큰 저해를 보였다. 치료적 저해물질 펩티드는 PRAK 활성에 대한 최소 효과를 보였다. 펩티드 FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]는 SAPK2a의 활성을 저해하였다. 치료적 저해물질 펩티드 WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]는 최소 특이성을 보였다.
Figure 112011052945157-pct00007
PTD 펩티드 YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5]를 통합하지만 치료 도메인 내에서 Asn이 Ala으로 치환된 점에서 상이한 치료적 저해물질 펩티드 변이체는 Asn 치환을 보유하는 변이체보다 키나아제 IRAK4, PKBβ, MLCK, ROCK-I와 p38α의 더욱 큰 저해를 제공하였다.
실시예 6. 인터류킨-6과 종양 괴사 인자-α에 대한 치료적 저해물질 펩티드 활성
사이토킨 인터류킨-6 (IL-6)과 종양 괴사 인자-α (TNF-α)에 대한 치료적 저해물질 펩티드의 저해 활성이 결정되었다.
6.1. 펩티드 합성
펩티드는 Symphony® 펩티드 합성장치 (Protein Technologies, Inc., Tuscon, AZ)에서 표준 FMOC 화학을 이용하여 Rink-아미드 또는 Knorr-아미드 수지 (Synbiosci Corp., Livermore, CA)에서 합성되었다. 이들 아미노산에 대한 결합제 (Synbiosci Corp.)는 HBTU/NMM (Anaspec, Freemont, CA/Sigma, St. Louis, MO)이었다. 합성후, 펩티드는 트리플루오르아세트산-기초된 칵테일 (95% 트리플루오르아세트산, 2.5% 물, 1.25% 트리이소프로필실란, 그리고 1.25% 에탄디올)로 수지로부터 절단되고, 에테르에서 침전되고, 그리고 원심분리에 의해 회수되었다. 회수된 펩티드는 진공에서 건조되고, MiIIiQ 정제수에서 재현탁되고, 그리고 22/250 C18 prep-scale 칼럼 (Grace Davidson, Columbia, MD)으로 구비된 신속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) (AKTA Explorer, GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 이용하여 정제되었다. 정제를 달성하기 위하여 아세트산이 이용되었다. 원하는 분자량은 4800 Plus MALDI TOF/TOFTM 분석기 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 비행 시간 매트릭스 공조 레이저 탈착 이온화 (time-of-flight matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) 질량 분석법에 의해 확증되었다
6.2. 중피 세포 배양과 처리
흉막 중피 세포의 세포주 (CRL-9444)는 American Type Culture Collection으로부터 구입되었다. 세포는 Earle의 BSS와 0.75 mM L-글루타민 (Mediatech, Inc., Manassa, VA), 1.25 g/ℓ 중탄산나트륨 (Sigma, St. Louis, MO), 3.3 nM 상피 성장 인자 (MBL International, Woburn, MA), 40 nM 하이드로코르티손 (Sigma), 870 nM 인슐린 (MBL International), 20 mM HEPES (Sigma), 미량 원소 혼합물 B (Mediatech, Inc.), 10% 소 태아 혈청 (FBS) (Hyclone, Waltham, MA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech, Inc.)을 포함하는 배지 199에서 유지되고 접종되었다. 세포를 치료적 저해물질 펩티드로 처리하기에 앞서, 세포는 사이토킨 및/또는 저해물질 펩티드로 처리에 앞서 24시간 동안, Earle의 BSS, L-글루타민, 중탄산나트륨, HEPES, 미량 원소 혼합물 B, 그리고 페니실린/스트렙토마이신 (농도와 공급업체는 앞서 기술된 바와 동일)을 포함하는 배지 199로만 구성되는 혈청-없는 배지에서 순응되었다. 저해물질 펩티드 또는 상업적으로 가용한 단백질 키나아제 저해물질 Rotterlin (IC5O=5 μM) (Tocris Bioscience, Ellisville, MO))와 함께 또는 이러한 물질 없이, 사이토킨 역시 이러한 배지 제제에 항상 동시에 첨가되었다. 모든 세포 배양 실험에서, 세포-침투성 MK2 저해물질 펩티드 서열 YARAAARQ ARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]이 이용되었다.
6.3. 인터류킨-6 분석
일반적으로, 친염증성 사이토킨, 예를 들면, 인터류킨 (IL)-1, IL-6과 종양 괴사 인자-α (TNF-α)는 복부 수술후, 복강 내로 방출되는 것으로 생각된다. 이들 사이토킨은 유착 형성/재형성에서 일정한 역할을 할 수 있다. 여러 연구에서 IL-1과 TNF-α는 둘 모두, 상처 치유의 초기 단계에서 중요한 친-염증성 사이토킨이고 복수 내에서 활성화된 대식세포에 의해 생산되는 반면, IL-6은 활성화된 대식세포에 의해 발현되고 이의 생산이 염증 과정 동안 IL-1에 의해 상향-조절되는 것으로 보고되었다. 게다가, 여러 연구에서 IL-1과 TNF-α 둘 모두, IL-6의 강력한 유도물질인 것으로 보고되었다. 이들 사이토킨은 그들이 섬유소분해 경로와 광범위하게 상호작용하고 세포외 기질의 재구축에 직접적으로 또는 간접적으로 기여할 수 있기 때문에 중요한 것으로 생각된다. 여러 연구에서 IL-1β와 TNF-α 둘 모두, 중피 세포 내에서 IL-6과 IL-8의 발현 수준을 상향조절하는 것으로 보고되었다. 부가적으로, IL-1β는 대식세포 내에서 TNF-α, IL-6과 IL-8의 발현 수준을 상향조절하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 중피 세포 또는 대식세포 내에서 IL-1β 또는 TNF-α에 의해 유도된 IL-6의 발현 수준의 정량은 치료적 저해물질 펩티드의 활성을 결정하기 위한 모형 분석 시스템으로서 이용된다.
IL-6 분석은 IL-6 ELISA 키트 (PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ)로 수행되었다. 간단히 말하면, 평판은 아래와 같이 준비되었다. 포획 항체 (capture 항체) (항원-친화성 정제된 염소 항-hIL-6 + 2.5 mg D-만니톨)는 1 ㎍/㎖의 농도로 인산염 완충된 염수 (PBS)로 희석되고 평판의 각 웰에 첨가되었다. 평판은 밀봉되고 실온에서 하룻밤동안 항온처리되었다. 웰은 이후, 액체를 제거하기 위하여 흡출되고, 그리고 세척 완충액 (PBS에서 웰당 300 ㎕의 0.05% Tween-20)을 이용하여 4회 세척되었다. 최종 세척후, 평판은 잔여 완충액을 제거하기 위하여 뒤집어지고, 그리고 페이퍼 타월 상에 블롯팅 (blotting)되었다. 차단 완충액 (PBS에서 웰당 300 ㎕의 1% BSA)이 첨가되고, 그리고 평판은 실온에서 최소한 1시간 동안 항온처리되고, 흡출되고, 4회 세척되었다.
표준 (2 ng/㎖ 내지 제로) 및 시료는 희석액에서 준비되고, 각 웰에 삼중으로 즉시 첨가되고, 그리고 300 rpm으로 조정된 평판 교반기 상에서 최소한 실온에서 2시간 동안 항온처리되었다. 웰은 이후, 흡출되고, 4회 세척되고, 검출 항체 (비오틴화된 항원-친화성 정제된 염소 항-hIL-6 + 2.5 mg D-만니톨; 0.25 ㎍/㎖) (100 ㎕)가 각 웰에 첨가되고, 그리고 평판은 300 rpm으로 조정된 평판 교반기 상에서 실온에서 2시간 동안 항온처리되었다. 항온처리후, 평판은 흡출되고, 4회 세척되고, 아비딘-양고추냉이 과산화효소 (HRP) 접합체 ((5.5 ㎕:10994.5 ㎕ 희석액) (100 ㎕)가 각 웰에 첨가되고, 300 rpm으로 조정된 평판 교반기 상에서 실온에서 30분 동안 항온처리되고, 흡출되고, 그리고 4회 세척되었다. 각 웰에, 이후 ABTS 액체 기질 용액 (Sigma) (100 ㎕)이 첨가되었다. 평판은 300 rpm으로 조정된 평판 교반기 상에서 현색 (color development)을 위하여 실온에서 항온처리되었다. 흡광도 (absorbance)는 50분 동안 5분 마다 Spectramax M5 Microplate Reader (Molecular Devices)를 이용하여 405 nm와 650 nm에서 측정되었다 (650 nm는 각 405 nm 치수로부터 뺄셈된 파장 보정 (wavelength correction)이었다). DNA 양에 기초하여 세포 수를 정량하는데 Hoeschst 33342 핵 염색 (nuclear stain) (Invitrogen)이 이용되었다. 모든 결과는 삼중으로 작성되고 세포 수에 표준화되었다.
결과는 평균±표준 편차로서 제공된다. 목적되는 파라미터에서 통계학적으로 유의한 증가 또는 감소를 결정하는데 일원 ANOVA 분석이 이용되었다. 유의한 차이는 Tukey HSD 사후 비교 (post hoc comparison)로 분석되었다. α = 0.05의 유의성 수준이 사이토킨 분석에 이용되었다.
6.4. IL-1β에 의한 유도로 IL- 6 발현의 조절
중피 세포는 IL-1β (1 ng/㎖) (IL-6 발현을 유도하기 위하여) 및/또는 상이한 농도의 치료적 저해물질 펩티드와 함께 배양되었다. 상업적으로 가용한 단백질 키나아제 저해물질 Rottlerin이 MK2와 PRAK 둘 모두의 저해물질로서 도입되었다.
도 7에서는 시간의 흐름에서 IL-6 (pg/㎖/105개 세포)의 평균 농도의 플롯을 도시한다. 이들 결과는 중피 세포 내에서 치료적 저해물질 펩티드 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]가 IL-1β 유도된 IL-6 발현을 저해한다는 것을 증명한다. 이들 결과는 치료적 저해물질 펩티드 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11] (3 mM)와 Rottlerin (1 μM)의 최고 농도가 IL-1β 유도된 IL-6 발현을 유의미하게 감소시킨다는 것을 더욱 증명한다. 이들 결과는 또한, 치료적 저해물질 펩티드 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11] (3 mM)에 의한 IL-1β 유도된 IL-6 발현의 유의미한 감소 (6시간)가 Rottlerin에 의해 유도된 감소 (12시간)보다 더욱 조기에 발생한다는 것을 증명한다.
6.5. TNF-α에 의한 유도로 IL-6 발현의 조절
중피 세포는 TNF-α (IL-6 발현을 유도하기 위하여) 및/또는 상이한 농도의 치료적 저해물질 펩티드 (YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11] 또는 FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12])와 함께 배양되었다. 상업적으로 가용한 단백질 키나아제 저해물질 Rottlerin이 MK2의 저해물질로서 이용되었다.
도 8에서는 시간의 흐름에서 IL-6 (pg/㎖/105개 세포)의 평균 농도의 플롯을 도시한다. 이들 결과는 양쪽 치료적 저해물질 펩티드가 TNF-α (1 ng/㎖)에 의해 유도된 IL-6의 발현 수준을 감소시킨다는 것을 증명하고, 또한 이들 치료적 저해물질 펩티드의 효과가 용량 의존성일 수 있다는 것을 암시한다. 이들 결과는 또한, 단백질 키나아제 저해물질 Rottlerin이 TNF-α (1 ng/㎖)에 의해 유도된 IL-6의 발현 수준을 감소시키는데 무효하다는 것을 증명한다.
도 9에서는 시간의 흐름에서 IL-6 (pg/㎖/105개 세포)의 평균 농도의 플롯을 도시한다. 이들 결과는 양쪽 치료적 저해물질 펩티드가 TNF-α (10 ng/㎖)에 의해 유도된 IL-6의 발현 수준을 감소시킨다는 것을 증명하고, 또한 이들 치료적 저해물질 펩티드의 효과가 용량 의존성일 수 있다는 것을 암시한다. 이들 결과는 또한, 단백질 키나아제 저해물질 Rottlerin이 초기에 (6-12시간부터) TNF-α (10 ng/㎖)에 의해 유도된 IL-6의 발현 수준의 최소 감소에 영향을 준다는 것을 증명한다.
실시예 7. IL-1β 생산에 대한 MK2i의 효과
IL-1β 생산에 대한 아미노산 서열 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]을 보유하는 치료 저해물질 단백질의 저해 효과는 신경 세포에서 조사되었다.
일차 피질 성상세포 배양액이 확립되었다. 일차 쥐 성상세포는 18일 태아 Sprague Dawley 쥐 피질로부터 분리되었다. 세포는 제안된 Brain Bits 프로토콜에 따라 분리되고 폴리-리신 (PDL) 100 mm 페트리 접시에서 합류 수준 (confluency)으로 성장되었다. 간단히 말하면, 쥐 피질은 큰 피질 조각 중에서 대부분이 분산될 때까지 1 ㎖ 피펫 보조기구 (pipet aid)로 분쇄되었다. 더욱 큰 조직 단편이 가라앉도록 한 이후, 상층액은 15 ㎖ 코니칼 튜브 내에 수집되고, 그리고 1100 rpm에서 1분 동안 원심분리에 의해 펠릿으로 만들어졌다. 생성된 상층액은 버려지고, 그리고 펠릿은 neurobasal 배지 (10% 말 혈청, 3 mM 글루타민)에서 재현탁되었다. 이들 성상세포는 이후, 페트리 접시에 접종되고, 그리고 합류될 때까지 (80-95%) 성장되고, 이후 계대되었다. 성상세포는 1:4 계대되고, 80-95% 합류 수준으로 성장되고, 이후 PBS로 2회 헹굼되었다. 상이한 처리 유형이 18-22시간 동안 각각의 상응하는 페트리 접시에 적용되었다. 각 페트리 접시 내에 총 1 ㎖의 배지 (10% 말 혈청, 3 mM 글루타민을 포함하는 neurobasal 배지) + 처리가 존재하였다. 양성 대조는 이들 세포를 TNF-α (5 ng/㎖ 또는 10 ng/㎖)로 처리하는 것으로 구성되었다; 음성 대조로서, 이들 세포는 임의의 처리 없이 세포 배지에 노출되었다. 처리 군은 (i) TNF-α (5 ng/㎖)와 함께 1 mM MK2i (치료적 저해물질 펩티드 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]); (ii) TNF-α (5 ng/㎖)와 함께 3 mM MK2i; (iii) TNF-α (10 ng/㎖ TNF-α)와 함께 1 mM MK2i; 그리고 (iv) TNF-α (10 ng/㎖)와 함께 3 mM MK2i로 구성되었다. 치료적 저해물질 펩티드와 함께 또는 이러한 펩티드 없이 사이토킨은 이러한 배지 제제에서 항상 동시에 첨가되었다.
18-22시간후, 이들 세포는 PBS로 헹굼되고, 용해 완충액 (8 M 요소, 4% CHAPS, 10 mM DTT)을 이용하여 작은 원심분리 튜브 내로 긁어 벗겨지고, 그리고 2시간 동안 Disruptor Genie™ (Scientific Industries, Bohemia, NY)을 이용함으로써 파괴되었다. 이들 세포는 17 krpm에서 15분 동안 원심분리에 의해 펠릿으로 만들어지고, 상층액 (세포 용해물)이 수집되고, 그리고 총 단백질 농도가 정량되었다 (Pierce BCA 단백질 분석 키트, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL).
도 10에서는 각 처리 군 (i) TNF-α (5 ng/㎖)와 함께 1 mM MK2i (치료적 저해물질 펩티드 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]); (ii) TNF-α (5 ng/㎖)와 함께 3 mM MK2i; (iii) TNF-α (10 ng/㎖)와 함께 1 mM MK2i; 그리고 (iv) TNF-α (10 ng/㎖)와 함께 3 mM MK2i로부터 평균 IL-1β 농도 (pg/㎖)의 그래프를 도시한다. 이들 결과는 TNF-α가 예상된 바와 같이, IL-1β 농도를 증가시키고, 그리고 상기 치료적 저해물질 펩티드가 용량-의존성 방식으로 쥐 일차 피질 성상세포 배양액에서 IL-1β의 발현 수준을 저해할 수 있다는 것을 증명한다. 이들 결과는 상기 치료적 저해물질 펩티드가 유도된 염증성 사이토킨 발현에 기인하는 신경교성 반흔 (glial scarring)을 능동적으로 제한할 것이라는 것을 암시한다.
실시예 8. IL-6 생산에 대한 MAPKAP 키나아제 2 저해 (MK2i)의 효과
IL-6 생산에 대한 아미노산 서열 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]를 보유하는 치료 저해물질 단백질의 저해 효과는 뉴런, 성상세포와 소교세포로 구성되는 삼중 배양액에서 조사되었다. 세포 배지는 아래와 같이 준비되었다. 간단히 말하면, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (6.68 g) 및 중탄산나트륨 (1.85 g)이 증류되고 탈-이온화된 (DDi) 물 (500 ㎖)에 첨가되었다; 현탁액은 필터 여과되고, 이후 페니실린/스트렙토마이신 (500 ㎕), 소 태아 혈청 (FBS) (50 ㎖), 그리고 인간 혈청 (HS) (50 ㎖)으로 보충되었다. 준비된 배지 (1 ㎖)는 조직에 첨가되고, 그리고 상기 조직은 무균 피펫 팁을 통해 30초에 걸쳐 10회 분쇄되었다. 세포 현탁액은 나일론 필터를 통해 여과되고 수집되었다. 여과된 현탁액은 1100 rpm에서 1분 동안 원심분리되고, 그리고 펠릿은 재현탁되었다. 뉴런, 성상세포와 소교세포로의 분화를 뒷받침하기 위하여 E18 세포가 도말되었다 (1 x 106개 세포/㎖). 1주 배양후, 일부 세포는 고정되고, 그리고 3가지 세포 유형 모두의 존재를 확인하기 위하여 β-3 튜불린 (뉴런에 대한 생물마커), 아교 섬유 산성 단백질 (GFAP, 성상세포에 대한 생물마커), 그리고 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba1, 소교세포에 대한 생물마커)에 대하여 탐침되었다. 이용된 일차 항체에는 토끼 항-Iba1 (1:200; Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, VA), 닭 항-GFAP (1:200; Millipore Corp., Billerica, MA), 그리고 Alexa Fluor 488 (1:200; Millipore Corp., Billerica, MA)에 접합된 생쥐 항-β-3-튜불린이 포함되었다. 이차 항체에는 Alexa Fluor 633 염소 항-토끼 (1:200; Invitrogen, Carlsbad, CA), 그리고 Alexa Fluor 555 염소 항-닭 (1:200; Invitrogen, Carlsbad, CA)이 포함되었다. 핵은 Hoescht 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 표지되었다. 양성 대조는 이들 세포를 TNF-α (5 ng/㎖ 또는 10 ng/㎖)로 처리하는 것으로 구성되었다; 음성 대조로서, 이들 세포는 임의의 처리 없이 세포 배지에 노출되었다. 처리 군은 (i) TNF-α (5 ng/㎖)와 함께 1 mM MK2i (치료적 저해물질 펩티드 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]); (ii) TNF-α (5 ng/㎖)와 함께 3 mM MK2i; (iii) TNF-α (10 ng/㎖ TNF-α)와 함께 1 mM MK2i; 그리고 (iv) TNF-α (10 ng/㎖)와 함께 3 mM MK2i로 구성되었다. 치료적 저해물질 펩티드와 함께 또는 이러한 펩티드 없이 사이토킨은 이러한 배지 제제에서 항상 동시에 첨가되었다.
도 11에서는 각 처리 군 (i) 음성 대조 (배지 단독); (ii) TNF-α (5 ng/㎖); (iii) TNF-α (10 ng/㎖); (iv) TNF-α (5 ng/ℓ)와 MK2i (1 mM 치료적 저해물질 펩티드 YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11]); (v) TNF-α (10 ng/㎖)와 MK2i (1 mM); (vi) TNF-α (5 ng/㎖)와 MK2i (3 mM); 그리고 (vii) TNF-α (10 ng/㎖)와 MK2i (3 mM)로부터 평균 IL-6 농도 (pg/㎖)의 그래프를 도시한다. 이들 결과는 TNF-α (5 ng/㎖)가 세포 배양액 내에서 IL-6의 발현 수준을 증가시키고, 그리고 상기 치료적 저해물질 펩티드로 처리된 모든 세포 배양액이 IL-6의 발현 수준을 감소시킨다는 것을 증명한다.
본 발명이 특정한 구체예에 관련하여 기술되긴 했지만, 당업자는 다양한 변화가 만들어질 수 있고, 그리고 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 등가물이 대용될 수 있음을 인지할 것이다. 이에 더하여, 본 발명의 객관적인 사상과 범위에 특정한 상황, 재료, 물질의 조성, 공정, 또는 공정 단계(들)를 채용하는 다수의 변형이 만들어질 수 있다. 모든 이런 변형은 본 명세서에 첨부된 특허청구범위 내에 있는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> PURDUE RESEARCH FOUNDATION <120> CELL-PERMEANT PEPTIDE-BASED INHIBITOR OF KINASES <130> 3220-216631 <140> <141> <150> PCT/US2009/067378 <151> 2009-12-09 <150> 61/121,396 <151> 2008-12-10 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 1 Gly Met Pro Lys Lys Lys Pro Thr Pro Ile Gln Leu Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 2 Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 3 Lys Lys Ala Leu Arg Arg Gln Glu Ala Val Asp Ala Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 4 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 5 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala 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MOD_RES <222> (21)..(21) <223> (p)Ser <400> 57 Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ser Arg His Ser 1 5 10 15 Ser Pro His Gln Ser Glu Asp Glu Glu Glu 20 25 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 58 Gly Gly Glu Glu Glu Glu Tyr Phe Glu Leu Val Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 59 Lys Lys Arg Asn Arg Thr Leu Thr Val 1 5 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 60 Gly Arg Pro Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Gly Lys Lys 1 5 10 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 61 Glu Arg Met Arg Pro Arg Lys Arg Gln Gly Ser Val Arg Arg Arg Val 1 5 10 15 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 62 Arg Arg Arg Leu Ser Phe Ala Glu Pro Gly 1 5 10 <210> 63 <211> 32 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 63 Lys Glu Ala Lys Glu Lys Arg Gln Glu Gln Ile Ala Lys Arg Arg Arg 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ala Ser Thr Ser Lys Ser Gly Gly Ser Gln Lys 20 25 30 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 64 Lys Lys Lys Asn Arg Thr Leu Ser Val Ala 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 65 Lys Lys Leu Arg Arg Thr Leu Ser Val Ala 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 66 Lys Ala Phe Ala Lys Leu Ala Ala Arg Leu 1 5 10 <210> 67 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 67 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Lys Ala Leu Ala Arg 1 5 10 15 Gln Leu Ala Val Ala 20 <210> 68 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 68 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Lys Ala Leu Ala Arg 1 5 10 15 Gln Leu Gly Val Ala 20 <210> 69 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 69 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Lys Ala Leu Asn Arg 1 5 10 15 Gln Leu Ala Val Ala 20 <210> 70 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 70 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Lys Ala Leu Asn Arg 1 5 10 15 Gln Leu Gly Val Ala 20 <210> 71 <211> 23 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Mammalian peptide <400> 71 Tyr Ala Arg Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Lys Ala Leu Ala 1 5 10 15 Arg Gln Leu Gly Val Ala Ala 20

Claims (15)

  1. 염증성 사이토킨 발현을 포함하는 병리상태를 가진 염증성 질환용 키나아제 저해 조성물에 있어서, 아래의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
    (a) 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드, 여기서 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 2(MK2), 유사분열물질-활성화된 단백질 키나아제-활성화된 단백질 3(MK3), Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 I(CaMK1) 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 키나아제 효소를 저해하는데 효과적이며,
    여기서 치료적 저해물질 펩티드는 단백질 형질도입 도메인과 치료 도메인을 포함하고,
    여기서 상기 치료 도메인은 아미노산 서열 FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12] 또는 KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO:15]에서 선택된 최소한 하나의 아미노산 서열이며,
    (b) 무균 수용액을 포함하는 제약학적으로 허용되는 담체, 그리고
    (c) 상기 조성물을 위한 단위-투여 또는 다중-투여 용기,
    여기서 상기 조성물은 IL-6, TNF-α, 그리고 IL-1β로 구성된 군에서 선택되는 최소한 하나의 염증성 사이토킨의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키는데 효과적이다.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 치료적 저해물질 펩티드의 아미노산 서열은 FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 치료적 저해물질 펩티드의 아미노산 서열은 KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO:15]인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 TNF-α 배출을 저해하는데 효과적인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 IL-1β 배출을 저해하는데 효과적인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 치료 효과량의 치료적 저해물질 펩티드는 IL-6 배출을 저해하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 치료적 저해물질 펩티드는 분리된 펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 보존제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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