KR101776613B1 - 식물성 유산균을 이용한 유산균 생성물질 제조방법 - Google Patents

식물성 유산균을 이용한 유산균 생성물질 제조방법 Download PDF

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Abstract

식물성유산균, 바실러스, 효모와 같은 종균을 액체 배양하여 농축 및 동결건조시켜 부형제를 첨가한 후 고농도의 미생물 분말을 만드는 단계와, 대두나 검정콩분말, 꽃송이버섯 분말, MgSO4, 글루코스 및 K2HPO4의 분말조성물을 만들어 3~10배로 가수 하여 고압멸균하고 식물성유산균, 바실러스균, 효모균을 농도별로 접종하여 배양하는 단계와, 발효가 종료된 유산균 생성물질을 고압멸균하여 열풍건조 또는 액상형태로 사용 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 생성물질의 제조한다. 상기에서 분말조성물은 대두나 검정콩분말(50~70%), 꽃송이버섯 분말(5~30%), MgSO4(0~10%), 글루코스(10~30%) 및 K2HPO4(0~10%)로 사용할 수 있다.

Description

식물성 유산균을 이용한 유산균 생성물질 제조방법{Manufacturing Method for Biogenics using Vegetable Lactobacllus}
본 발명은 콩발효 식품에서 분리한 식물유래 유산균인 식물성유산균 및 바실러스, 효모균을 투입하여 생리활성이 있는 소재를 주원료로 발효함으로써 다양한 생리활성 효능을 가지는 유산균 생성물질을 제조하는 방법이다. 보다 상세하게는 식물성유산균, 바실러스, 효모와 같은 종균을 액체 배양하여 농축 및 동결건조시켜 부형제를 첨가한 후 고농도의 미생물 분말을 만드는 단계와, 대두나 검정콩분말, 꽃송이버섯 분말, MgSO4, 글루코스(glucose), K2HPO4의 조성물을 만들어 3~10배수하여 고압멸균하고 식물성유산균, 바실러스균, 효모균을 농도별로 접종하여 배양하는 단계와, 배양이 종료된 유산균 생성물질을 분무나 동결건조 또는 열풍건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 생성물질의 제조방법이다.
본 발명은 면역력 증강 작용이 있는 베타글루칸 및 골다공증 예방효과가 있는 이소플라본 어글리콘이 다량 함유된 항 알레르기 효능을 가지는 유산균 생성물질을 제공한다.
대두나 검정콩에는 이소플라본의 한 종류인 다이드진(Daidzin)과 제네스틴(Genistin)이 다량 함유되어 있다. 이소플라본은 여성호르몬인 에스트로겐과 유사한 구조를 가지는 물질로 현재 여성호르몬 대체 효과 외에도 골다공증, 당뇨, 항암 등의 효과가 임상적으로 보고되고 있다. 이러한 대두나 검정콩의 이소플라본은 대부분 당 고리를 1개 이상 가지는 배당체 형태로 존재하는데 그 이유는 배당체 형태가 물에 쉽게 녹아 식물체 내부에서 운반이 편하기 때문이다. 하지만 사람이 이소플라본을 흡수하여 생리활성을 나타내려면 이러한 배당체를 끊고 비배당체 형태(Daidzein, Genistein)가 되어야 하는데 이때 개개인이 분비하는 소화효소의 양과 종류에 따라 비배당체 전환율이 서로 다르기 때문에 이소플라본을 섭취하더라도 효과를 보지 못하는 경우가 발생하게 된다. 이소플라본을 비배당체로 만들어 소화흡수를 높이기 위해서는 미생물로 발효과정을 거쳐야 하는데 이때 대두나 검정콩을 식물성 유산균으로 발효하게 되면 단순히 비배당체의 전환뿐만 아니라 유산균이 내뿜는 유산균 생성물질에 의하여 면역력이 증강되고 항 알레르기 효과를 볼 수 있는 시너지 효과를 얻을 수 있다.
흔히 프로바이오틱스로 잘 알려진 유산균은 사람의 장내에서 유해균의 증식을 억제하는 작용을 가지는데 직접 유해균을 저해하는 것이 아니라 생성물질 혹은 생산물질을 분비하여 유해균이 살 수 없는 환경을 만들어 유해균을 억제 시킨다. 유산균 생성물질은 일반적으로 작은 분자의 펩티드 혹은 폴리펩티드로 이루어져 있는데 분자량이 작고 결합이 매우 단단하기 때문에 열, 산 등에 매우 안정적이다. 따라서 유산균을 이용하여 대두나 검정콩을 발효하면 유산균으로 인해 배당체가 비배당체로 전환되어 흡수율이 좋아지고 유산균이 분비한 유산균 생성물질을 직접 섭취함에 따라 유산균을 섭취하지 않고도 안정적으로 장내의 유익균을 증식시킬 수 있는 환경을 만들 수 있다.
기존에 생물전환을 이용하여 이소플라본 어글리콘을 만드는 방법은 한국특허등록10-2001-0027341호(이소플라본의 아글리콘의 제조 방법)는 인체에 무해한 GRAS 등급의 미생물이 아닌 곰팡이류의 아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주 또는 트리코더마(Trichoderma)속의 균주를 사용하므로 제조공정 상으로도 미생물에 대한 생물학적 위협이 있고, 발효 후에도 여과막을 통과하여 걸러내야 하므로 그에 따른 고가의 비용 및 시설이 필요한 문제점이 있다.
또 다른 기술로 GRAS 등급의 미생물을 이용하여 대두액을 발효한 대두액을 이용한 발효조성물 및 이를 이용한 기능성 식품(등록번호 10-0788764) 특허도 있으나 이는 대두를 단순 배지로 사용했을 뿐 대두 본래의 생리활성에 대한 부분은 고려하지 못하였으며 대두를 쪄서 분쇄하여 착즙 후 버섯균을 투입하여 배양 후 다시 바실러스균 또는 유산균으로 2차배양을 진행 하는 등 공정이 복잡하기 때문에 실제 조성물을 얻는데 투자비용과 시간이 많이 들어가는 단점이 있다.
본 발명의 목적은 식물성 유산균과 바실러스 및 효모균을 이용하여 대두나 검정콩분말 및 꽃송이버섯을 주재료로 발효함으로써 면역기능 강화, 항 알레르기 및 골다공증에 효과가 있는 유산균 생성물질을 제조하는데 있다.
종래의 기술들은 대두나 검정콩에서 이소플라본만을 추출하기 위하여 곰팡이 속의 균주를 사용하므로 제조공정 상으로도 미생물에 대한 생물학적 위협이 있고, 발효 후에도 여과막을 통과시켜야 하므로 고가의 비용 및 시설이 필요하다. 또한 대두나 검정콩추출물을 단순 배지로만 이용하는데 그치고 있다. 그러나 본 발명은 제조방법이 간단하면서도 면역강화, 항 알레르기 및 골다공증에 효과가 있는 유산균 생성물질을 제조할 수 있다.
식물성유산균, 바실러스, 효모와 같은 종균을 액체 배양하여 농축 및 동결건조시켜 부형제를 첨가한 후 고농도의 미생물 분말을 만드는 단계와, 대두나 검정콩분말, 꽃송이버섯 분말, MgSO4, 글루코스, K2HPO4의 조성물을 만들어 3~10배로 가수하여 고압멸균하고 식물성유산균, 바실러스균, 효모균을 농도별로 접종하여 배양하는 단계와, 배양이 종료된 유산균 생성물질을 분무나 동결건조 또는 열풍건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 생성물질의 제조방법이다.
본 발명은 대두 혹은 검정콩, 꽃송이 버섯을 주원료로 하여 식물성유산균(균주기탁번호 KCCM10499), 바실러스, 효모균을 단일 또는 복합으로 접종하여 발효하여 면역증강 작용이 있고 이소플라본 어글리콘의 함량을 증가시켜 골다공증에 효과가 있으며 항 알레르기 효과를 가지는 유산균 생성물질을 제조할 수 있다.
통상적으로 유산균 생성물질은 대부분 유산균과 효모를 같이 사용하게 되면 초기에는 시너지 효과가 있지만, 발효시간이 길어짐에 따라 pH가 낮아지기 때문에 유용물질이 잘 생성하지 않는 경향이 있다. 본 발명은 이에 대한 보완방법으로 적정 농도의 바실러스균을 투입하여 pH를 5.0~6.0사이로 유지할 수 있도록 하여 지속적으로 유산균이 생성물질을 분비할 수 있는 환경을 조성하였다. 또한 면역증강 작용이 있는 꽃송이 버섯을 첨가함으로써 생산물질 외 베타글루칸으로 인하여 유도되는 면역증강 작용을 유도함으로써 생산물질과의 시너지 효과를 갖도록 하였다.
본 발명은 종래기술의 단점을 보완하기 위하여 식물성유산균, 바실러스, 효모를 동시에 접종하여 발효시키는 공정과 발효 배지로 대두나 검정콩 및 꽃송이 버섯을 사용함으로써 이소플라본 배당체를 비배당체로 전환시켜 체내 흡수율을 높일 수 있다. 따라서 골다공증에 도움을 주고 꽃송이 버섯의 베타글루칸으로 면역력을 증강시키며 생산물질로 인하여 면역력 증강과 항 알레르기 효과를 갖는 유산균 생성물질의 제조방법을 제공한다.
도 1은 다이드진 표준곡선이다.
도 2는 다이드제인 표준곡선이다.
도 3은 제니스틴 표준곡선이다.
도 4는 제니스테인 표준곡선이다.
도 5는 농도별 유산균 생성물질처리시 종양괴사인자-알파(TNF-α) 생성능 측정결과이다.
도 6은 농도별 유산균 생성물질처리시 인터류킨-1 베타(IL-1β) 생성능 측정결과이다.
도 7은 유산균 생성물질 분말 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase) 억제효과 시험 결과이다.
식물성유산균, 바실러스, 효모와 같은 종균을 액체 배양하여 농축 및 동결건조시켜 부형제를 첨가한 후 고농도의 미생물 분말을 만드는 단계와, 순수 꽃송이버섯 분말 또는 대두나 검정콩분말, 꽃송이버섯 분말, MgSO4, 글루코스 및 K2HPO4의 분말조성물을 만들어 3~10배로 가수 하여 고압멸균하고 식물성유산균, 바실러스균, 효모균을 농도별로 접종하여 배양하는 단계와, 발효가 종료된 유산균 생성물질을 고압멸균하여 열풍건조 또는 액상형태로 사용 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 생성물질의 제조한다. 상기에서 분말조성물은 대두나 검정콩분말(50~70%), 꽃송이버섯 분말(5~30%), MgSO4(0~10%), 글루코스(10~30%) 및 K2HPO4(0~10%)로 사용 할 수 있다.
상기에서 식물유래 유산균은 락토바실러스 퍼멘텀 제이에스(Lactobacillus fermentum JS 균주기탁번호 KCCM10499) 및 채소나 곡류발효 유래의 식물성유산균인 락토바실러스 사케이(L. sakei), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 류코노스톡 메센테로이드(Leuc. mesenteroides), 페디오코커스 펜토사세우스(Ped. pentosaceus), 락토바실러스 애시도필루스(L. acidophillus), 락토바실러스 락티스(L. lactis), 류코노스톡 락티스(Leuc. lactis), 류코노스톡 시트레움(Leuc. citreum), 락토바실러스 람노수스(L. rhamnosus) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기에서 바실러스는 발효식품 유래의 바실러스인 바실러스 서브틸리스(B. subtillis), 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis), 바실러스 코아귤란스(B. coagulans) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기에서 효모균은 발효식품 유래의 효모균인 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae), 피치아 클루이베리(Pichia kluyveri), 사카로마이세스 파스토리아누스(S. pastorianus), 사카로마이세스 인텀디우스(S. intermdius), 사카로마이세스 발리두스(S. validus) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기에서 접종시 식물성유산균+바실러스, 식물성유산균+효모, 식물성유산균+바실러스+효모, 바실러스+효모 의 조합으로 사용할 수 있다.
상기에서 분말조성물에 정제수를 3~10배 가한 용액에 식물성 유산균을 1×107~1×109cfu/ml로 바실러스를 1×107~1×109cfu/ml로 효모를 1×107~1×109cfu/ml로 각각 접종하여 35~45℃의 온도에서 24~168 시간 발효시킬 수 있다.
상기에서 발효가 종료되어 고압멸균된 유산균 생성물질은 70~130℃에서 감압 혹은 상압으로 열풍건조 할 수 있다.
상기에서 발효가 종료되어 고압멸균된 유산균 생성물질은 배양이 종료된 액상형태 그대로 사용될 수 있다.
이하 본 발명의 유산균생성물질 제조방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
종균을 배양하여 액체 식물성유산균, 바실러스, 효모균을 만들거나, 또는 그 식물성유산균, 바실러스, 효모균을 농축 및 동결건조시켜 부형제를 첨가한 후 고농도의 분말 식물성유산균, 바실러스, 효모균을 만드는 단계와 대두나 검정콩분말, 꽃송이버섯 분말, MgSO4, 글루코스, K2HPO4를 일정한 비율로 섞어 분말조성물을 만들고 분말조성물에 3~5배수 하여 멸균 후 식물성유산균, 바실러스균, 효모균을 종류·농도별로 접종하여 배양하는 단계와 배양된 유산균생성물질을 열풍건조 또는 액체상태 그대로 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균생성물질의 제조방법이다.
<실험예 1> 식물성유산균 종균의 배양
위에서 언급한 식물성 유산균들의 배양배지는 통상 드만 로고사 및 샤프(MRS) 배지를 사용하며 가열멸균은 통상의 미생물배지 살균조건인 121℃에서 15분이상 하며 유산균 접종량은 1×105~1×106cfu/ml, 40~45℃에서 12~18시간 배양하며 배양후의 식물성유산균의 생균수는 1×109~1×1010cfu/ml 범위를 나타내며 원심분리에 의해 농축한 식물성유산균의 생균수는 1×1011~5×1012cfu/ml을 나타낸다. 이를 동결건조하여 분말상의 식물성유산균을 사용할 경우는 통상 분말조성물에 사용되는 가수량의 1~10%(v/w)를 첨가하여 사용하며 이때 첨가된 식물성 유산균의 생균수는 1×107~1×109cfu/g으로 한다.
<실험예 2> 바실러스 종균의 배양
위에서 언급한 바실러스의 배양배지는 통상 뉴트리언트 브로쓰(Nutrient broth) 배지를 사용하며 가열멸균은 통상의 미생물배지 살균조건인 121℃에서 15분이상 하며 유산균 접종량은 1×105~1×106cfu/ml, 35~40℃에서 12~18시간 배양하며 배양후의 바실러스의 생균수는 1×109~1×1010cfu/ml 범위를 나타내며 원심분리에 의해 농축한 바실러스의 생균수는 1×1011~7×1012cfu/ml을 나타낸다. 이를 동결건조하여 분말상의 바실러스를 사용할 경우는 통상 분말조성물에 사용되는 가수량의 1~10%(v/w)를 첨가하여 사용하며 이때 첨가된 바실러스의 생균수는 1×107~1×109cfu/g으로 한다.
<실험예 3> 효모균 종균의 배양
위에서 언급한 효모균의 배양배지는 통상 이스트 말트 브로쓰(yeast malt broth) 배지를 사용하며 가열멸균은 통상의 미생물배지 살균조건인 121℃에서 15분이상 하며 효모균 접종량은 1×105~1×106cfu/ml, 20~26℃에서 40~48 시간 배양하며 배양후의 효모균의 생균수는 1×109~8×109cfu/ml 범위를 나타내며 원심분리에 의해 농축한 효모균의 생균수는 1×1011~2×1012cfu/ml을 나타낸다. 이를 동결건조하여 분말상의 효모균을 사용할 경우는 통상 분말조성물에 사용되는 가수량의 1~10%(v/w)를 첨가하여 사용하며 이때 첨가된 효모균의 생균수는 1×107~1×109cfu/g으로 한다.
<실험예 4> 배양액 제작
분말조성물은 대두나 검정콩분말(50~70%), 꽃송이버섯 분말(5~30%), MgSO4(0~10%), 글루코스(10~30%), K2HPO4(0~10%)로 사용되며 발효에 사용하는 균주에 따라 MgSO4 및 K2HPO4의 경우 사용하지 아니할 수 있으며 대두나 검정콩분말 및 꽃송이 버섯 분말은 생대두나 검정콩(함수량 8% 미만) 및 건조 꽃송이버섯(함수량 7% 미만)을 핀밀(pin mill)을 이용하여 50메쉬 이하의 크기로 분쇄하여 사용한다.
준비된 분말조성물에 증류수 혹은 정제수를 3~10배 가수하고 발효탱크 내부의 임펠러(Impeller)를 이용하여 분말조성물을 현탁 후 121℃에서 20분 이상 멸균한다.
<실험예 5> 접종 및 배양
멸균이 완료된 배양액을 35~40℃로 냉각하고 식물성유산균, 바실러스, 효모균의 동결건조 분말 혹은 종균배양액 희석액을 1×107~1×109cfu/ml이 되도록 하여 가수량의 1~10%(v/w)를 접종한다. 바람직하게 발효온도는 38℃ 발효시간은 72시간이 가장 적절하며 식물성유산균과 바실러스의 부피비가 1:1이 되도록 하여 접종한다.
<실험예 6> 멸균 및 가공
배양이 완료된 유산균 생성물질은 121℃에서 20분 이상 멸균하고 액상으로 사용할 경우는 바로 용기에 포장하여 사용하며 건조할 경우 30℃ 이하로 냉각후 감압열풍건조기 혹은 상압 열풍건조기를 이용하여 70~130℃에서 48시간 건조한다. 건조가 완료된 생성물질 조각은 핀밀(pin mill)을 이용하여 50 메쉬(mesh) 이하의 크기로 분쇄하여 사용한다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 제조한 유산균 생성물질을 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 더욱 자세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되지는 않는다.
<실시예 1> 식물성유산균 종균배양
식물성유산균인 락토바실러스 퍼멘텀 제이에스(Lactobacillus fermentum JS 균주기탁번호 KCCM10499), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 애시도필루스(L. acidophillus)를 각각 121℃에서 15분이상 멸균된 드만 로고사 및 샤프(MRS) 배지에 1×105~1×106cfu/ml로 접종하여 40℃에서 16시간 진탕배양(100rpm) 하였다. 배양이 끝난 식물성 유산균들은 원심분리를 이용하여 농축하여 동결건조 시킨 후 포도당, 유당 등의 당류를 첨가시켜 고농도의 식물성유산균 분말을 통상의 방법에 준하여 제조하였으며 이때 식물성유산균들의 개체수는 1.0~1.2×1011cfu/g 이었다. 이때 식물유래의 유산균인 식물성 유산균은 상기 실시예에서 사용된 균주 이외의 다른 식물성 유산균으로서 채소나 곡류발효 유래의 식물성유산균인 락토바실러스 사케이(L. sakei), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 류코노스톡 메센테로이드(Leuc. mesenteroides), 페디오코커스 펜토사세우스(Ped. pentosaceus), 락토바실러스 애시도필루스(L. acidophillus), 락토바실러스 락티스(L. lactis), 류코노스톡 락티스(Leuc. lactis), 류코노스톡 시트레움(Leuc. citreum), 락토바실러스 람노수스(L. rhamnosus) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
<실시예 2> 바실러스 종균배양
바실러스 서브틸리스(B. subtillis)를 121℃에서 15분 이상 멸균된 뉴트ㅜ리언트 브로쓰(Nutrient broth) 배지에 1×105~1×106cfu/ml로 접종하여 36℃에서 15hr 진탕배양(100rpm) 하였다. 배양이 끝난 바실러스는 원심분리를 이용하여 농축하여 동결건조시킨 후 포도당, 유당 등의 당류를 첨가시켜 고농도의 바실러스 분말을 통상의 방법에 준하여 제조하였으며 이때 바실러스의 개체수는 1.1×1011cfu/g 이었다. 이 때 바실러스는 상기 실시예에서 사용된 균주 이외의 다른 발효식품 유래의 바실러스인 바실러스 서브틸리스(B. subtillis), 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis), 바실러스 코아귤란스(B. coagulans) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
<실시예 3> 효모균 종균배양
사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae)를 121℃에서 15분이상 멸균된 ㅇ이스트 말트 브로쓰 배지에 1×105~1×106cfu/ml로 접종하여 25℃에서 40시간 진탕배양(100rpm) 하였다. 배양이 끝난 효모균은 원심분리를 이용하여 농축하여 동결건조 시킨 후 포도당, 유당 등의 당류를 첨가시켜 고농도의 효모균 분말을 통상의 방법에 준하여 제조하였으며 효모균의 개체수는 2.1×1011cfu/g 이었다. 이때 효모균은 상기에서 사용된 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae) 외 발효식품 유래의 효모균인 피치아 클루이베리(Pichia kluyveri), 사카로마이세스 파스토리아누스(S. pastorianus), 사카로마이세스 인텀디우스(S. intermdius), 사카로마이세스 발리두스(S. validus) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
<실시예4>배양액 제작
함수량 7%의 대두나 검정콩과 함수량 6.8%의 건조 꽃송이 버섯을 핀밀(pin mill)을 이용하여 50메쉬 이하로 분쇄하고 그 분말을 이용하여 대두나 검정콩분말 50%, 꽃송이버섯 분말 20%, 글루코스 30%로 조성된 분말조성물을 제작하여 증류수를 10배 가수했다. 발효탱크 내부의 임펠러(Impeller)를 80rpm으로 회전시켜 현탁 후 121℃에서 30분간 멸균했다.
<실시예 5> 접종 및 배양
멸균이 완료된 배양액을 38℃로 냉각하고 1.0×108cfu/g로 희석된 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) JS(균주기탁번호 KCCM10499) 1%, 락토바실러스 플라타룸(L. plantarum) 1%, 락토바실러스(L. casei) 1%, 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 1%, 락토바실러스 애시도필루스(L. acidophillus) 1%, 바실러스 서브틸리스(B. subtillis) 5%, 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae) 1%를 접종 후 38℃에서 72hr 배양한다.
<실시예 6> 멸균 및 가공
배양이 완료된 유산균 생성물질을 121℃에서 30분 멸균 후 30℃이하로 냉각했다. 냉각된 생성물질을 감압열풍 건조기에 넣고 130℃에서 48시간 건조하여 수분이 3% 미만이 될 때까지 건조하고 건조가 완료된 생성물질 조각은 핀밀(pin mill)을 이용하여 50메쉬 이하의 크기로 분쇄하여 유산균 생산물질을 얻었다.
<실시예 6-1> 멸균 및 가공(액상으로 사용)
배양이 완료된 유산균 생성물질은 121℃에서 30분 멸균하고 90℃까지 냉각 후 바로 용기에 포장하여 밀봉하여 액상형태의 유산균 생산물질을 얻었다.
<시험예> 발효 및 분석 조건
상기 실시예에서 실시한 바와 같은 조건으로 유산균 생산물질을 제조하며 매 24hr 마다 시료를 채취하여 유산균수, 바실러스수, 효모균수및 pH를 측정하였으며 최종적으로 얻은 열풍건조 유산균생산물질 분말에 대하여 수분함량, 총 베타글루칸 함량, 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase) 억제 효과, 이소플라본 어글리콘의 함량 등을 측정하였다. 측정 방법은 당업계에서 사용하는 통상적인 방법으로 수행하였다.
<방법>
1) 발효시료 채취
접종전, 24, 48, 72hr 배양중인 유산균 생성물질 시료를 스팀 노즐을 통하여 50ml 코니컬튜브에 각 30ml씩 채취하였다.
2) 유산균수 측정
유산균수 측정은 브로모크레졸 퍼플(BCP) 첨가 평판측정용 한천배지를 이용하여 측정하였으며, 90ml의 생리식염수 (NaCl 0.85%)를 담아 멸균한 사각병에 채취한 시료 10ml을 넣어 혼합한 용액에서 다시 1ml을 취해 생리식염수 9ml이 들어있는 멸균시험관에 넣어 희석하는 방식으로 각각 106, 107, 108배로 희석하여 37℃ 배양기에서 1~2일 뒤집어서 평판배양한 후 균수를 측정하였다.
3) 바실러스수 측정
바실러스수 측정은 뉴트리어느 아가(Nutriunt Agar) 배지를 이용하여 측정하였으며, 90ml의 생리식염수(NaCl 0.85%)를 담아 멸균한 사각병에 채취한 시료 10ml을 넣어 혼합한 용액에서 다시 1ml을 취해 생리식염수 9ml이 들어있는 멸균시험관에 넣어 희석하는 방식으로 각각 106, 107, 108배로 희석하여 37℃ 배양기에서 1~2일 뒤집어서 평판배양한 후 균수를 측정하였다.
4) 효모균 측정
효모균 측정은 이스트 말트 아가 배지를 이용하여 측정하였으며, 90ml의 생리식염수(NaCl 0.85%)를 담아 멸균한 사각병에 채취한 시료 10ml을 넣어 혼합한 용액에서 다시 1ml을 취해 생리식염수 9ml이 들어있는 멸균시험관에 넣어 희석하는 방식으로 각각 106, 107, 108배로 희석하여 25℃ 배양기에서 2일 뒤집어서 평판배양한 후 균수를 측정하였다.
5) pH 측정
유산균수 측정에 사용하고 남은 사각병의 혼합액을 pH meter로 측정하여 pH 값을 나타내었다
6) 시간별 아이소플라본 비배당체 전환율 측정
각 발효시간별로 채취된 시료를 130℃에서 48hr 건조하여 시료를 만들고 유산균 생산물질 시료에 9배의 80% 에탄올을 첨가한 후 약 30초간 보텍싱하고, 24시간 정치 추출하여 HPLC로 비배당체 이소플라본 함량을 측정하였다.
총 이소플라본 함량을 측정하기 위하여 발효가 끝난 유산균 생성물질 시료에 2 N HCl 10 mL 을 가하여 1시간 동안 환류 추출(refluxing)하였다. 산 가수분해 후 10 N NaOH를 첨가하여 pH를 6.0∼8.0 사이로 중화시키고 340 mL의 80% 에탄올을 가하여 추출하였다. 추출액의 상층액을 회수 후, 0.45 μm 여과막으로 통과시킨 여과액을 최종 분석시료로 사용하였다. HPLC 분석 조건은 아래의 표 1과 같다.
Agilent 1200 HPLC(Agilent Technologies, USA)
컬럼 Eclipse XDB-C18(4.6 × 250 mm)
주입부피 20μL
유속 1.2ml/min
디텍터 254nm
이동상 A - 아세트산 0.1 : H2O 99.9
B - 아세트산 0.1 : MeOH 99.9
시간(분) A(%) B(%)
0 93 7
25 93 7
50 85 15
75 75 25
80 65 35
90 65 35
7) 유산균 생산물질 건조
72시간 발효가 완료된 유산균 생산물질을 121℃에서 30분 멸균 후 30℃로 냉각 후 회수하여 감압열풍 건조기에 넣고 130℃에서 48시간 건조하여 수분이 3% 미만이 될 때까지 건조하고 건조가 완료된 생성물질 조각은 핀밀(pin mill)을 이용하여 50메쉬 이하의 크기로 분쇄하여 유산균 생산물질을 얻었다.
8) 면역활성(TNF-α, IL-1β 생성능) 측정
마이크로플레이트(Corning Laboratory Science Co., NY, USA)의 각 well에 마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포를 1×106의 세포가 들어가도록 분주한 후 증류수에 농도별로 희석한 유산균 생성물질을 처리하고 24시간 후 Bio Plex (Bio rad)를 이용하여 TNF-α와 IL-1β를 측정하였다. 1% BSA가 함유된 PBS 100μl을 각 웰(well)에 분주하여 cell을 적시고 표준(standard), 시료(sample), 레퍼런스(reference)와 블랭크(blank) 시약을 각 100 μl씩 분주한 후 상온에서 30 분간 쉐이킹을 하며 배양하였다. 배양된 플레이트를 1% BSA와 0.05% Tween20이 함유된 PBS 150μl로 3회 세척하여 혼합된 비오틴 부착 항체용액(Biotinylated Abs)을 웰당 50μl씩 분주하고 30분간 쉐이킹하며 상온에서 배양하였다. 배양 완료 후 PBS로 3회 세척하여 스트렙타비딘-피이(streptavidin-PE)를 넣어 10 분간 흡착하고 다시 PBS를 이용하여 3회 세척했다. 세척 후 1% BSA, 0.05% Tween 20이 함유된 PBS 120μl를 분주 하고 Bio-Plex array reader를 이용하여 측정하였다.
9) 비만세포의 알레르기 유발물질(β-hexosaminidase) 억제효과 확인
시료 1g에 70% EtOH 10ml를 넣고 24h 추출하였다. 비만세포를 24시간 배양하여 추출한 시료를 처리하고 1시간 후에 A23187/PMA로 30분 동안 자극한다. 자극이 완료되면 상층액 20ul와 기질 완충액(substrate buffer) 80ul를 주입하여 30분 간 방치하고 정지액(Stop solution) 200ul 넣은 후, 405nm에서 흡광도 측정한다.
이때 시료의 처리는 100, 200, 500, 1000ug/ml로 한다.
<시험결과>
배양시간별 pH 및 유산균, 바실러스, 효모 균수의 변화
배양시간 pH 균수(cfu/ml)
유산균 바실러스 효모
대조군(0시간) 6.00 - - -
24시간 5.74 1.3×108 2.3×108 1.2×108
48시간 5.12 2.1×109 1.4×109 3.1×109
72시간 5.30 1.5×108 4.2×108 2.3×108
배양 48시간에서 유산균, 바실러스 효모의 균수가 모두 증가하는 것을 알 수 있다.
발효시간별 비배당체 전환율
시료 다이드진
(ppm)		 다이드제인
(ppm)		 제니스틴
(ppm)		 제니스테인
(ppm)		 총이소
플라본
(ppm)		 총 배당체
(ppm)		 총
비배당체
(ppm)
손실률
(%)
접종전 304.4 25.3 155.4 37.4 522.5 459.8 62.7
(12.0%)		 0
24시간
발효		 240.7 77.1 133.2 49.6 500.6 373.9 126.7
(25.3%)		 4.2
48시간
발효		 191.1 135.1 112.1 61.2 499.5 303.2 196.3
(39.3%)		 4.4
72시간
발효		 183.5 160.0 81.8 70.6 495.9 265.3 230.6
(46.5%)		 5.1
다이드진(Daidzin)과 제니스틴(Genistin) 및 총 배당체는 배양시간이 길어짐에 따라 전환율이 낮아지고, 다이드제인(Daidzein)과 제니스테인(Genistein) 및 총 비배당체는 전환율이 높아지는 것을 알 수 있다. 전체 손실율은 발효시간이 길어짐에 따라 조금 높아진다.
본 발명은 이소플라본 배당체를 비배당체로 전환시켜 체내 흡수율을 높여 골다공증에 좋으며, 면역력 증강과 항 알레르기 효과를 갖는 유산균 생성물질의 제조방법으로서 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (11)

  1. 종균을 배양하여 액체 식물성 유산균, 바실러스, 효모를 농축 및 동결건조시켜 부형제를 첨가 후 고농도의 미생물 분말을 만드는 단계와 대두나 검정콩분말, 꽃송이버섯 분말, MgSO4, 글루코스 및 K2HPO4의 분말조성물을 만드는 단계와, 분말 조성물에 3~10배의 물을 가하여 고압멸균 하고 식물성유산균, 바실러스균, 효모균을 농도별로 접종하여 배양하는 단계와, 발효가 종료된 유산균 생성물질을 고압멸균하여 열풍건조 또는 액상형태로 사용하는 단계를 포함하고,
    상기 유산균 생성물질이 다이드제인 및 제니스테인을 포함하는 이소플라본 비배당체이며, 상기 유산균 생성물질은 사람의 면역기능 강화, 항 알레르기 및 골다공증 개선용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 유산균 생성물질의 제조방법
  2. 제 1항에 있어서, 식물성 유산균은 채소나 곡류발효 유래의 식물성유산균, 락토바실러스 퍼멘텀 제이에스(Lactobacillus fermentum JS 균주기탁번호 KCCM10499), 발효식품 유래의 바실러스균 및 효모균 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는 유산균 생성물질 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 채소나 곡류발효 유래의 식물성유산균은 락토바실러스 사케이(L. sakei), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 류코노스톡 메센테로이드(Leuc. mesenteroides), 페디오코커스 펜토사세우스(Ped. pentosaceus), 락토바실러스 애시도필루스(L. acidophillus), 락토바실러스 락티스(L. lactis), 류코노스톡 락티스(Leuc. lactis), 류코노스톡 시트레움(Leuc. citreum) 및 락토바실러스 람노수스(L. rhamnosus) 중에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 유산균 생성물질 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서, 발효식품 유래의 바실러스인 바실러스 서브틸리스(B. subtillis), 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis) 및 바실러스 코아귤란스(B. coagulans) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 균주를 포함하는 유산균 생성물질의 제조방법
  5. 제 2항에 있어서, 발효식품 유래의 효모균은 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae), 피치아 클루이베리(Pichia kluyveri), 사카로마이세스 파스토리아누스(S. pastorianus), 사카로마이세스 인텀디우스(S. intermdius) 및 사카로마이세스 발리두스(S. validus) 중에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 유산균 생성물질 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 종균은 접종시 식물성유산균+바실러스, 식물성유산균+효모, 식물성유산균+바실러스+효모 및 바실러스+효모의 조합에서 선택된 어느하나인 것을 특징으로 하는 식물성유산균 생성물질의 제조방법
  7. 제 1항에 있어서, 유산균 분말 조성물에 가수 및 멸균 처리하여 종균배양액 희석액 또는 동결건조분말 희석액의 균수를 1×107~1×109cfu/ml이 되도록 하여 가수량의 1~10%(v/w)가 되게 접종후 35~45℃ 온도에서 24~168hr 배양하는 식물성 유산균 생성물질의 제조방법
  8. 제 7항에 있어서, 종균배양액을 투입하여 pH 5.0~6.0으로 유지시켜 지속적으로 유산균 생성물질을 분비되는 것을 특징으로 하는 식물성유산균 생성물질의 제조방법
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