KR101776238B1 - Ibrutinib sensitivity related genes in patients with glioblastoma multiforme and Use Thereof - Google Patents

Ibrutinib sensitivity related genes in patients with glioblastoma multiforme and Use Thereof Download PDF

Info

Publication number
KR101776238B1
KR101776238B1 KR1020150083534A KR20150083534A KR101776238B1 KR 101776238 B1 KR101776238 B1 KR 101776238B1 KR 1020150083534 A KR1020150083534 A KR 1020150083534A KR 20150083534 A KR20150083534 A KR 20150083534A KR 101776238 B1 KR101776238 B1 KR 101776238B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
kit
ibrutinib
present
protein
Prior art date
Application number
KR1020150083534A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20160147182A (en
Inventor
남도현
이진구
유규하
신상
조희진
Original Assignee
사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사회복지법인 삼성생명공익재단 filed Critical 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority to KR1020150083534A priority Critical patent/KR101776238B1/en
Priority to PCT/KR2016/006006 priority patent/WO2016200120A1/en
Publication of KR20160147182A publication Critical patent/KR20160147182A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101776238B1 publication Critical patent/KR101776238B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

본 발명은 EGFRvⅢ 변이의 존재 여부를 검사하여 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성 또는 예후를 판단하는 방법 및 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성 예측용 키트를 제공한다. 본 발명을 이용하면 교모세포종 환자에서 BTK/BMX/BLK 특이적 억제제인 이브루티닙의 반응성을 예측할 수 있다. 본 발명은 EGFRvⅢ 변이 환자에게 이브루티닙을 투약할 수 있는 근거로 유용하게 이용될 수 있다.The present invention provides a method for determining the sensitivity or prognosis of ibrutinib in a patient with a glioblastoma by examining the presence of an EGFRvlll mutation, and a kit for predicting susceptibility to ibrutinib in a glioblastoma patient. Using the present invention, the reactivity of Ibtlutinib, a BTK / BMX / BLK specific inhibitor, can be predicted in patients with glioblastoma. The present invention can be usefully used as a basis for the administration of ibrutinib to patients with EGFRvIII mutations.

Description

교모세포종 환자에서 이브루티닙 감수성과 관련된 유전자 및 그 용도{Ibrutinib sensitivity related genes in patients with glioblastoma multiforme and Use Thereof}[0001] The present invention relates to genes involved in ibrutinib susceptibility in glioblastoma patients,

본 발명은 교모세포종 환자에서 이브루티닙 감수성과 관련된 유전자 및 그 용도에 관한 것이다. The present invention relates to genes involved in ibrutinib susceptibility in glioblastoma patients and their uses.

교모세포종은 가장 흔하고 치명적인 뇌암으로 원발성 뇌종양의 60%를 차지하며 현재까지 방사선 치료 및 테모졸로마이드 기반 치료에도 평균 생존률이 15개월 내외인 매우 예후가 나쁜 종양이다(1-3). 따라서, 혁신적인 교모세포종 치료 전략이 필요하다. 최근 TCGA 등의 대규모 종양 유전체 분석을 통해 교모세포종의 바이오마커가 발굴되었다. 그 중, 전체 교모세포종의 15% 내외에서 발견되는 EGFRvIII 변이는 대표적인 종양유발 유전자 변이로 알려져 있고 이 변이를 타깃으로 하는 치료법에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. Glioblastoma is the most common and fatal brain cancer, accounting for 60% of primary brain tumors. Radiotherapy and temozolomide-based therapies to date have a very poor prognosis with an average survival rate of around 15 months (1-3). Therefore, innovative glioblastoma treatment strategies are needed. Recently, biomarkers of glioblastomas have been discovered through large - scale tumor genome analysis such as TCGA. Among them, the EGFRvIII mutation, which is found in about 15% of all glioblastomas, is known as a typical tumor-induced gene mutation, and studies on a therapeutic method targeting this mutation are actively conducted.

이브루티닙(Ibrutinib)은 만성 림프구성 백혈병에 허가가 되어있는 BTK(Bruton’s tyrosine kinase)에 특이적 표적항암제로 최근, 이레사 치료 저항성 비소세포성폐암에 EGFR T790M 변이 특이적인 효능이 발굴되어 치료 표적 암종 및 유전자 바이오마커가 다양화되고 있다. Ibrutinib is a specific antitumor agent for BTK (Bruton's tyrosine kinase), which is approved for chronic lymphocytic leukemia. Recently, Efficacy of EGFR T790M mutation in Iressa therapy-resistant non-small cell lung cancer And gene biomarkers have been diversified.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

Wen, P.Y. & Kesari, S. The New England journal of medicine 359, 492-507 (2008).Wen, P.Y. & Kesari, S. The New England journal of medicine 359, 492-507 (2008). Stupp, R. et al. The New England journal of medicine 352, 987-996 (2005).Stupp, R. et al. The New England Journal of Medicine 352, 987-996 (2005). Ostrom, Q.T. et al. Neuro-oncology 16 Suppl 4, iv1-63 (2014).Ostrom, Q.T. et al. Neuro-oncology 16 Suppl 4, iv 1-63 (2014). Verhaak, R.G. et al. Cancer cell 17, 98-110 (2010).Verhaak, R.G. et al. Cancer cell 17,98-110 (2010). Brennan, C.W. et al. Cell 155, 462-477 (2013).Brennan, C.W. et al. Cell 155, 462-477 (2013). Cancer Genome Atlas Research, N. Nature 455, 1061-1068 (2008).Cancer Genome Atlas Research, N. Nature 455, 1061-1068 (2008). Lee, J. et al. Cancer cell 9, 391-403 (2006).Lee, J. et al. Cancer cell 9,391-403 (2006). Pollard, S.M. et al. Cell stem cell 4, 568-580 (2009).Pollard, S.M. et al. Cell stem cell 4, 568-580 (2009). Rosen, J.M. & Jordan, C.T. Science 324, 1670-1673 (2009).Rosen, J.M. & Jordan, C.T. Science 324, 1670-1673 (2009). Reya, T., Morrison, S.J., Clarke, M.F. & Weissman, I.L. Nature 414, 105-111 (2001).Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M.F. & Weissman, I. L. Nature 414, 105-111 (2001). Singh, S.K. et al. Nature 432, 396-401 (2004).Singh, S.K. et al. Nature 432, 396-401 (2004). Gan, H.K., Kaye, A.H. & Luwor, R.B. official journal of the Neurosurgical Society of Australasia 16, 748-754 (2009).Gan, H. K., Kaye, A. H. & & Luwor, R.B. Official Journal of the Neurosurgical Society of Australasia 16, 748-754 (2009). Fan, Q.W. et al. Cancer cell 24, 438-449 (2013).Fan, Q.W. et al. Cancer cell 24, 438-449 (2013). Nathanson, D.A. et al. Science 343, 72-76 (2014).Nathanson, D.A. et al. Science 343, 72-76 (2014). Fenstermaker, R.A. & Ciesielski, M.J. Oncogene 19, 4542-4548 (2000).Fenstermaker, R.A. &Amp; Ciesielski, M.J. Oncogene 19,4542-4548 (2000). Huang, P.H., Xu, A.M. & White, F.M. Science signaling 2, re6 (2009).Huang, P. H., Xu, A. M. & White, F.M. Science signaling 2, re6 (2009). Ivanescu, A.M., Oprea, M., Turbatu, A., Colita, A. & Lupu, A.R. Maedica 9, 217-218 (2014).Ivanescu, A. M., Oprea, M., Turbatu, A., Colita, A. & Maedica 9, 217-218 (2014). Rushworth, S.A., MacEwan, D.J. & Bowles, K.M. The New England journal of medicine 369, 1277-1278 (2013).Rushworth, S. A., MacEwan, D.J. &Amp; Bowles, K.M. The New England Journal of Medicine 369, 1277-1278 (2013). Byrd, J.C. et al. The New England journal of medicine 369, 32-42 (2013).Byrd, J.C. et al. The New England Journal of Medicine 369, 32-42 (2013). Wang, M.L. et al. The New England journal of medicine 369, 507-516 (2013).Wang, M.L. et al. The New England journal of medicine 369, 507-516 (2013). Gao, W. et al. Journal of the National Cancer Institute 106 (2014).Gao, W. et al. Journal of the National Cancer Institute 106 (2014). Baras, A., Yu, Y., Filtz, M., Kim, B. & Moskaluk, C.A. Oncogene 28, 2919-2924 (2009).Baras, A., Yu, Y., Filtz, M., Kim, B. & Moskaluk, C.A. Oncogene 28,2919-2924 (2009). DePristo, M.A. et al. Nature genetics 43, 491-498 (2011).DePristo, M.A. et al. Nature genetics 43, 491-498 (2011). Cibulskis, K. et al. Nature biotechnology 31, 213-219 (2013).Cibulskis, K. et al. Nature Biotechnology 31, 213-219 (2013). Banerji, S. et al. Nature 486, 405-409 (2012).Banerji, S. et al. Nature 486, 405-409 (2012).

본 발명자들은 교모세포종 환자에서 이브루티닙의 감수성과 관련된 유전자군을 선별하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 선별된 EGFRvⅢ(epidermal growth factor receptor variant 3) 변이가 교모세포종 환자에서 이브루티닙의 반응을 예측할 수 있는 인자인 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made extensive efforts to select a gene group related to the susceptibility of ibrutinib in a glioblastoma patient. As a result, the present inventors completed the present invention by confirming that the selected EGFRvIII (epidermal growth factor receptor variant 3) mutation is a predictor of the response of ibrutinib in a glioblastoma patient.

따라서, 본 발명의 목적은 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성 또는 예후의 판단에 유용한 정보를 제공하기 위해 EGFRvⅢ 변이의 존재 여부를 검사하는 방법을 제공하는데 있다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for testing the presence or absence of an EGFRvlll mutation in order to provide information useful for judging susceptibility or prognosis to ibrutinib in a glioblastoma patient.

본 발명의 다른 목적은 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성 예측용 키트를 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a kit for predicting susceptibility to ibrutinib in a glioblastoma patient.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다. Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention and claims.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 교모세포종(glioblastoma multiforme) 환자의 이브루티닙(ibrutinib)에 대한 감수성 또는 예후의 판단에 유용한 정보를 제공하기 위해 EGFRvⅢ 변이의 존재 여부를 검사하는 방법을 제공한다: The present invention provides a method for testing the presence or absence of an EGFRvllll mutation to provide information useful for determining susceptibility or prognosis to ibrutinib in a glioblastoma multiforme patient comprising the steps of:

(a) 대상자로부터 분리한 생물학적 시료로부터 핵산 분자 또는 단백질을 분리하는 단계; 및 (a) separating the nucleic acid molecule or protein from the biological sample separated from the subject; And

(b) (i) 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열목록 제1서열의 폴리뉴클레오타이드 또는 (ⅱ) 상기 분리된 단백질로부터 서열목록 제2서열의 단백질을 검출하는 단계로 상기 서열목록 제1서열의 폴리뉴클레오타이드 또는 서열목록 제2서열의 아미노산이 검출되는 경우, 상기 대상자는 증가된 이브루티닙 감수성을 갖는다. (b) detecting the polynucleotide of Sequence Listing 1 sequence from the separated nucleic acid molecule or (ii) detecting the protein of Sequence Listing Sequence 2 from the separated protein, wherein the polynucleotide of Sequence Listing 1 sequence Or when the amino acid of the second sequence of the sequence listing is detected, said subject has increased ibterutinib susceptibility.

본 발명자들은 교모세포종 환자에서 이브루티닙의 감수성과 관련된 유전자군을 선별하기 위해 예의 연구 노력하였고, 그 결과, 선별된 EGFRvⅢ 변이가 교모세포종 환자에서 이브루티닙의 반응을 예측할 수 있는 인자인 것을 규명하였다. The present inventors have made intensive efforts to select genes related to the sensitivity of ibrutinib in patients with glioblastoma and as a result, found that the selected EGFRvIII mutation is a predictor of the response of ibrutinib in patients with glioblastoma Respectively.

하기 실시예에서 확인하는 바와 같이, 환자유래 교모세포종 표적항암제 스크리닝을 통하여 교모세포종 EGFRvⅢ 변이에서 이브루티닙의 특이적 감수성을 확인하였고, 이를 통하여 이브루티닙에 대한 민감도를 예측할 수 있다. As confirmed in the following examples, the patient-specific glioblastoma target anticancer screening confirmed the specific susceptibility of ibrutinib to the glioblastoma EGFRvlll mutation, and thereby it is possible to predict the sensitivity to ibrutinib.

본 명세서에서 사용되는 용어 “이브루티닙 감수성”은 이브루티닙에 대한 반응성을 나타내며, EGFRvⅢ 변이를 갖는 교모세포종 환자는 이브루티닙에 대하여 증가된 감수성을 나타내어 EGFRvⅢ 변이를 갖지 않는 교모세포종 환자와 비교하여 이브루티닙에 의한 치료 효과가 우수하게 나타난다. As used herein, the term " ibrutinib susceptibility " refers to reactivity to ibrutinib, and patients with glioblastoma with EGFRvlll mutations exhibit increased susceptibility to ibrutinib and are comparable to patients with glioblastoma that do not have the EGFRvlll mutation The efficacy of ivermitib is excellent.

본 명세서에서 용어 “생물학적 시료”는 체외로 분리된 교모세포종 환자의 생체 시료로서, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 세포, 모발 또는 조직 시료를 의미한다. As used herein, the term " biological sample " refers to a biological sample of a glioblastoma patient isolated from the body of the patient, and refers to blood, plasma, serum, urine, cell, hair or tissue sample.

본 명세서에서 용어 “핵산분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term " nucleic acid molecule " has the meaning inclusive of DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules. In the nucleic acid molecule, the nucleotide which is a basic constituent unit is not only a natural nucleotide, Also included are analogues (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).

본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).When the starting material in the method of the present invention is gDNA, the separation of gDNA can be carried out according to conventional methods known in the art (Rogers & Bendich (1994)).

출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)에서 서열목록 제1서열의 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. When the starting material is mRNA, the total RNA is isolated by a conventional method known in the art (see Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (1987); and Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162: 156 (1987)). The isolated total RNA is synthesized by cDNA using reverse transcriptase. Since the total RNA is isolated from animal cells, it has a poly-A tail at the end of the mRNA. In the method of the present invention using the above-mentioned sequence characteristics, in the step (b) Can be carried out by applying various methods known in the art.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열의 폴리뉴클레오타이드의 검출은 PCR(Polymerase Chain Reaction), 혼성화(hybridization), 시퀀싱(sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 또는 NGS(next generation sequencing) 방식을 이용하여 실시할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the detection of the polynucleotide of the first sequence of Sequence Listing can be performed by PCR (Polymerase Chain Reaction), hybridization, sequencing, pyrosequencing, or next generation sequencing (NGS) Method can be used.

또한, 본 발명에서 서열목록 제1서열의 폴리뉴클레오타이드의 검출에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)) 및 유전자 증폭 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. Also, techniques that can be applied to the detection of the polynucleotide of the first sequence of the sequence listing in the present invention include fluorescence in situ hybridization (FISH), direct DNA sequencing, PFGE analysis, Southern blot analysis, single-stranded conformation analysis Genomics, 7: 167 (1990)), dot blot analysis, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE, Wartell et al., PNAS, USA 86: 2776 (1989)), RNase protection assay (Finkelstein et al. (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25: 2699 (1990)) using a protein recognizing a nucleotide mismatch (e.g., mutS protein of E. coli ) 229-253 (1991)) and gene amplification methods.

상기 단계 (b)에서 서열목록 제2서열의 단백질 검출은 생물학적 시료에서 상기 EGFRvⅢ 변이 단백질의 존재 여부를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 항원-항체 반응 방식으로 실시할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA:Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다.The detection of the protein of the second sequence of the sequence listing in the step (b) is a process for confirming the presence of the EGFRvIII mutant protein in the biological sample. Preferably, the antigen is an antigen that specifically binds to the protein of the gene - antibody reaction method. Methods for this analysis include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), and Protein Chip are examples of immunoprecipitation, protein immunoassay, immunohistochemical staining, The method of analysis of the invention is not limited.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열목록 제2서열의 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer), 또는 (ⅱ) 서열목록 제1서열의 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 교모세포종(glioblastoma multiforme) 환자의 이브루티닙(ibrutinib)에 대한 감수성 예측용 키트를 제공한다. In accordance with another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a polypeptide comprising: (i) an oligopeptide, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a ligand, For example, a peptide nucleic acid (PNA) or an aptamer, or (ii) a primer or probe that binds to a polynucleotide of the first sequence of SEQ ID NO: 1, for a glioblastoma multiforme patient A kit for predicting susceptibility is provided.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성 예측용 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, a kit for predicting susceptibility to ibrutinib in a glioblastoma patient of the present invention may be a kit for immunoassay.

상기 면역분석용 키트는 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 EGFRvⅢ 변이 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다. The immunoassay kit may be carried out by an immunoassay method, that is, an antigen-antibody reaction method. In this case, an antibody or an aptamer that specifically binds to the mutant EGFRvIII protein of the present invention described above is used.

본 발명에서 “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.&Quot; Antibody " in the present invention means a specific protein molecule directed against an antigenic site. For purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to the protein, and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다.The antibody used in the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody. Antibodies can be produced using methods commonly practiced in the art, such as the fusion method (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), the recombinant DNA method (US Patent No. 4,816,56) Or phage antibody library methods (Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)). General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; And Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley / Greene, NY, 1991, the disclosures of which are incorporated herein by reference. For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing an immortalized cell line with an antibody-producing lymphocyte, and the techniques necessary for this process are well known and readily practicable by those skilled in the art.

폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.Polyclonal antibodies can be obtained by injecting a protein antigen into a suitable animal, collecting the antiserum from the animal, and then separating the antibody from the antiserum using a known affinity technique.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성을 예측하는데 이용될 수 있다.When the method of the present invention is carried out using an antibody or an aptamer, the present invention can be carried out according to a conventional immunoanalytical method and used to predict susceptibility to ibrutinib in a glioblastoma patient.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.Such immunoassays can be performed according to various quantitative or qualitative immunoassay protocols developed in the past. The immunoassay format may include, but is not limited to, radioimmunoassays, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), capture-ELISA, inhibition or hardwood analysis, sandwich analysis, flow cytometry, But are not limited to, fluorescent staining and immunoaffinity purification. Methods of immunoassay or immunostaining are described in Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; And Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, which is incorporated herein by reference.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커로서 EGFRvⅢ 변이 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다.For example, if the method of the present invention is carried out according to the method radioactive immunoassay, radioactive isotope EGFRvⅢ mutant protein as the antibody, the marker of the present invention labeled with (e. G., C 14, I 125, P 32 and S 35) / RTI >

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.When the method of the present invention is carried out by an ELISA method, a specific embodiment of the present invention comprises the steps of (i) coating the surface of a solid substrate with an unknown cell sample lysate to be analyzed; (Ii) reacting the cell lysate with an antibody to a marker as a primary antibody; (Iii) reacting the result of step (ii) with an enzyme-conjugated secondary antibody; And (iv) measuring the activity of the enzyme.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.Suitable as said solid substrate are hydrocarbon polymers (e.g., polystyrene and polypropylene), glass, metal or gel, and most preferably microtiter plates.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfat e)과 같은 기질이 이용될 수 있다.The enzyme bound to the secondary antibody may include an enzyme catalyzing a chromogenic reaction, a fluorescence reaction, a luminescent reaction, or an infrared reaction, but is not limited thereto. For example, an alkaline phosphatase,? -Galactosidase, Radish peroxidase, luciferase, and cytochrome P450. When alkaline phosphatase is used as an enzyme that binds to the secondary antibody, it is preferable to use, as a substrate, bromochloroindole phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1 chromophore and ECF (enhanced chemifluorescence) are used. When horseradish peroxidase is used, chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenox), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine ), ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronin, glucose oxidase and nitroblue tetrazolium and m-PMS methosulfate < RTI ID = 0.0 > e) < / RTI & The.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 마커 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.When the method of the present invention is carried out in the Capture-ELISA mode, a specific embodiment of the present invention comprises the steps of (i) coating an antibody against the marker of the present invention as a capturing antibody on the surface of a solid substrate; (Ii) reacting the capture antibody with the sample; (Iii) reacting the result of step (ii) with a detecting antibody which is labeled with a signal generating label and specifically reacts with a marker protein; And (iv) measuring a signal originating from said label.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.The detection antibody has a label that generates a detectable signal. Wherein the label is a chemical (e.g., biotin), an enzyme (alkaline phosphatase, β- galactosidase, horseradish peroxidase, and cytochrome P450), the radioactive material ((e.g., 14 C, 125 I, P 32 and S 35 ), fluorescent materials (e.g., fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent materials and fluorescence resonance energy transfer (FRET). The various labels and labeling methods are described in Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우 에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.In the ELISA method and the capture-ELISA method, measurement of the activity of the final enzyme or measurement of the signal can be performed according to various methods known in the art. If biotin is used as a label, it can be easily detected by streptavidin. When luciferase is used, luciferin can easily detect a signal.

본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.According to another variant of the invention, an aptamer which specifically binds to the marker of the invention can be used in place of the antibody. Aptamers are oligonucleic acid or peptide molecules, and the general contents of aptamers are described in Bock LC et al., Nature 355 (6360): 5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78 (8): 42630 (2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95 (24): 142727 (1998).

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널을 분석함으로써, 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성을 예측할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 나오는 경우에는 이브루티닙에 대하여 증가된 감수성을 갖는 것으로 판단된다.By analyzing the final signal by the above immunoassay procedure, the susceptibility to ibrutinib in a glioblastoma patient can be predicted. That is, when a signal for the marker of the present invention appears in the sample, it is judged to have an increased susceptibility to ibrutinib.

본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.Examples of the kit in the present invention include an immunochromatography strip kit, a lumenex assay kit, a protein microarray kit, an ELISA kit, or an immunological dot kit. The kind is not limited.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성 예측용 키트는 마이크로어레이용 키트일 수 있다. According to another embodiment of the present invention, a kit for predicting susceptibility to ibrutinib in a glioblastoma patient of the present invention may be a microarray kit.

본 발명의 감수성 예측용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건 하에서 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.The probe or primer used in the susceptibility prediction kit of the present invention has a sequence complementary to the nucleotide sequence of the first sequence of the sequence listing. As used herein, the term " complementary " means having complementarity enough to selectively hybridize to the nucleotide sequence of the first sequence of the sequence listing under any particular hybridization or annealing conditions. Thus, the term " complementary " has a different meaning than the term complementary, and the primer or probe of the present invention may be one or more of the following sequences, so long as it is capable of selectively hybridizing to the nucleotide sequence of the first sequence of the sequence listing: It may have more mismatch nucleotide sequences.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에 서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.As used herein, the term " primer " refers to a primer that can act as a starting point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (i.e., four other nucleoside triphosphates and polymerization enzymes) Means single-stranded oligonucleotides. The suitable length of the primer is typically 15-30 nucleotides, although it varies with various factors such as temperature and use of the primer. Short primer molecules generally require lower temperatures to form a sufficiently stable hybrid complex with the template.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.The sequence of the primer does not need to have a sequence completely complementary to a partial sequence of the template, and it is sufficient if the primer has sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template and acting as a primer. Therefore, the primer of the present invention does not need to have a perfectly complementary sequence to the nucleotide sequence of the first sequence of the sequence listing as a template, and it is sufficient if the primer has sufficient complementarity within the range capable of hybridizing with the gene sequence to perform the primer action Do. The design of such a primer can be easily carried out by those skilled in the art with reference to the nucleotide sequence of Sequence Listing 1 above, for example, using a program for primer design (e.g., PRIMER 3 program).

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보 뉴클레오티드를 포함하고 타깃 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프로브는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA,2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-,아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.As used herein, the term " probe " refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides and can specifically hybridize to a target nucleotide sequence, Present or artificially synthesized. The probe of the present invention is preferably a single strand, and is an oligodioxyribonucleotide. The probes of the present invention may include naturally occurring dNMPs (i.e., dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), nucleotide analogs or derivatives. In addition, the probe of the present invention may also include a ribonucleotide. For example, the probes of the present invention can be used in the form of nucleotides modified with nucleotides such as peptide nucleic acid (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365: 566-568 (1993)), phosphorothioate DNA, phosphorodithioate DNA 2-O-methyl RNA, 2'-O-methyl RNA, alpha-DNA and methylphosphonate DNA, sugar modified nucleotides such as 2'-O-methyl RNA, 2'- 2'-O-alkyl DNA, 2'-O-allyl DNA, 2'-O-alkynyl DNA, hexose DNA, pyranosyl RNA, and anhydrohexitol DNA, and nucleotides with base modifications such as C-5 substituted pyrimidines wherein the substituents are fluoro, bromo, chloro, iodo-, methyl-, ethyl-, vinyl-, formyl-, (Including fluorine, bromine, chlorine, bromine, chlorine, bromine, and iodine) with a C-7 substituent, Iodo-, methyl-, Butyl -, vinyl -, formyl -, alkynyl -, alkenyl-, quinolyl and quinoxalyl thiazol-, quinolyl and quinoxalyl imidazolidin -, pyridyl-), inosine, and may include a diamino purine.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate)상에 고정화된다.In the microarray of the present invention, the probe is used as a hybridizable array element and immobilized on a substrate.

바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성 화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또 한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.Preferred gases include, for example, membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic beads or non-magnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries, as suitable rigid or semi-rigid supports. The hybridization array elements are arranged and immobilized on the substrate. Such immobilization is carried out by a chemical bonding method or a covalent bonding method such as UV. For example, the hybridization array element may be bonded to a glass surface modified to include an epoxy compound or an aldehyde group, and may also be bound by UV on a polylysine coating surface. In addition, the hybridization array element can be coupled to the gas via a linker (e.g., ethylene glycol oligomer and diamine).

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.On the other hand, the sample DNA to be applied to the microarray of the present invention can be labeled and hybridized with the array elements on the microarray. Hybridization conditions can be varied. The detection and analysis of the hybridization degree can be variously carried out according to the labeling substance.

본 발명의 이브루티닙에 대한 감수성 예측용 키트는 혼성화(hybridization)에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다. 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 이브루티닙에 대한 민감도 여부를 판단할 수 있다. 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labellingsystems booklet,"Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology,65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.The kit for predicting susceptibility to ibrutinib of the present invention can be carried out on the basis of hybridization. In this case, a probe having a sequence complementary to the nucleotide sequence of the first sequence of the sequence listing is used. Hybridization-based analysis may be performed using a probe hybridized to the nucleotide sequence of the first sequence of the Sequence Listing to determine sensitivity to ibuLutinib. The label of the probe may provide a signal to detect hybridization, which may be linked to an oligonucleotide. Suitable labels include fluorescent moieties (e.g., fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia)), chromophores, chemiluminescent moieties, magnetic particles, (Such as P32 and S35), mass labels, electron dense particles, enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), joins, substrates for enzymes, heavy metals such as gold and antibodies, streptavidin, biotin , Hapten having specific binding partners such as digoxigenin and chelating groups. Markers may be obtained using a variety of methods routinely practiced in the art such as the nick translation method, the Multiprime DNA labellingsystems booklet (Amersham, 1989) and the kaination method (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65: 499 (1986)). The label provides signals that can be detected by fluorescence, radioactivity, color measurement, weighing, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, hybridization high frequency, and nanocrystals.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. The nucleic acid sample to be analyzed can be prepared using mRNA obtained from various biological samples.

프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.Instead of the probe, the cDNA to be analyzed may be labeled and subjected to a hybridization reaction-based analysis.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다.When a probe is used, the probe is hybridized with the cDNA molecule. In the present invention, suitable hybridization conditions can be determined by a series of procedures by an optimization procedure.

이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.This procedure is performed by a person skilled in the art in a series of procedures to establish a protocol for use in the laboratory. Conditions such as, for example, temperature, concentration of components, hybridization and washing time, buffer components and their pH and ionic strength depend on various factors such as probe length and GC amount and target nucleotide sequence. Detailed conditions for hybridization are described in Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001); And M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc .; N.Y. (1999). For example, high stringency conditions were hybridized under conditions of 0.5 M NaHPO4, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 1 mM EDTA at 65 ° C, followed by hybridization in 0.1 x SSC (standard saline citrate) /0.1% SDS at 68 Lt; 0 > C. Alternatively, high stringency conditions means washing at < RTI ID = 0.0 > 48 C < / RTI > in 6 x SSC / 0.05% sodium pyrophosphate. Low stringency conditions mean, for example, washing in 0.2 x SSC / 0.1% SDS at 42 ° C.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl andpyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성을 예측하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성을 판단할 수 있다. 즉, 서열목록 제1서열에 대한 혼성화 시그널이 나오는 경우, 이브루티닙에 대하여 증가된 감수성을 나타내는 것으로 판단된다.After the hybridization reaction, a hybridization signal generated through the hybridization reaction is detected. The hybridization signal can be carried out in various ways depending on, for example, the type of label attached to the probe. For example, when a probe is labeled with an enzyme, the substrate of the enzyme can be reacted with the result of hybridization reaction to confirm hybridization. Combinations of enzymes / substrates that may be used include, but are not limited to, peroxidases (such as horseradish peroxidase) and chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis- Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2, 2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronine; (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate, and ECF substrate; alkaline phosphatase and bromochloroindoleyl phosphate; Glucose oxidase and t-NBT (nitroblue tetrazolium) and m-PMS (phenzaine methosulfate). When the probe is labeled with gold particles, it can be detected by a silver staining method using silver nitrate. Therefore, when a method of predicting susceptibility to ibrutinib in a glioblastoma patient of the present invention is carried out based on hybridization, specifically (i) a probe having a sequence complementary to the nucleotide sequence of the first sequence of the sequence listing Hybridizing to a nucleic acid sample; (ii) detecting whether the hybridization reaction has occurred. By analyzing the intensity of the hybridization signal by the hybridization process, the susceptibility to ibrutinib of the glioblastoma patient can be judged. That is, when the hybridization signal for the first sequence of the sequence listing appears, it is judged to exhibit increased susceptibility to ibrutinib.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성 예측용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, a kit for predicting susceptibility to ibrutinib in a glioblastoma patient of the present invention may be a gene amplification kit.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(realtime)PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller,S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 본 발명의 진단용 키트를 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드의 존재 여부를 조사한다. 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.The term " amplification " as used herein refers to a reaction that amplifies a nucleic acid molecule. A variety of amplification reactions have been reported in the art, including polymerase chain reaction (PCR) (US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,800,159), reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) (Sambrook et al., Molecular Cloning. (LCR) (see, for example, A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), Miller, HI (WO 89/06700) and Davey, C. et al (EP 329,822) 17,18), Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (TMA) 19 (WO 88/10315) (US Ser. No. 6,410, 276), self-sustained sequence replication (20) (WO 90/06995), selective amplification of target polynucleotide sequences (U.S. Patent No. 6,410,276), consensus sequence priming polymerase chain The consensus sequence primed polymerase chain reaction (CPPCR) (U.S. Patent No. 4,437,975), random (US Pat. Nos. 5,413,909 and 5,861, 245), nucleic acid sequence based amplification (NASBA) (US Pat. No. 5,130,238, 5,409,818, 5,554,517 and 6,063,603), strand displacement amplification (21,22) and loop-mediated isothermal amplification (21,22). (LAMP) 23, but is not limited thereto. Other amplification methods that may be used are described in U.S. Patent Nos. 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617 and U.S. Patent No. 09 / 854,317. PCR is the most well-known nucleic acid amplification method, and many variations and applications thereof have been developed. For example, touchdown PCR, hot start PCR, nested PCR and booster PCR have been developed by modifying traditional PCR procedures to enhance the specificity or sensitivity of PCR. In addition, real-time PCR, differential display PCR (DD-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), multiplex PCR, inverse polymerase chain reaction : IPCR), vectorette PCR and TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR) have been developed for specific applications. For more information on PCR, see McPherson, M.J., and Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000), the teachings of which are incorporated herein by reference. When the diagnostic kit of the present invention is carried out using a primer, a gene amplification reaction is carried out to investigate the presence or absence of a nucleotide of the first sequence of Sequence Listing. In principle, the present invention uses a mRNA in a sample as a template and performs a gene amplification reaction using a primer that binds to mRNA or cDNA.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al. Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.To obtain mRNA, total RNA is isolated from the sample. The isolation of total RNA can be carried out according to conventional methods known in the art (see Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001); Tesniere , John Willey & Sons (1987) and Chomczynski, P. et al., ≪ RTI ID = 0.0 > et al., Plant Mol. Biol. Anal. Biochem. 162: 156 (1987)). For example, Trizol can be used to easily isolate total RNA in a cell. Next, cDNA is synthesized from the separated mRNA, and this cDNA is amplified. Since the total RNA of the present invention is isolated from a human sample, it has a poly-A tail at the end of the mRNA, and the cDNA can be easily synthesized using the oligo dT primer and the reverse transcriptase using such a sequence characteristic ( (1989), and Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Vol. (2001)). Next, the synthesized cDNA is amplified through gene amplification reaction.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.The primer used in the present invention is hybridized or annealed at one site of the template to form a double-stranded structure. Nucleic acid hybridization conditions suitable for forming such a double-stranded structure can be found in Nucleic Acid Hybridization < RTI ID = 0.0 > (" , A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.A variety of DNA polymerases can be used in the amplification of the present invention, and E. coli &Quot; Clenow " fragment of DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase and bacteriophage T7 DNA polymerase. Preferably, the polymerase is a thermostable DNA polymerase obtainable from a variety of bacterial species, including Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, and Pyrococcus furiosus (Pfu) .

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.When performing the polymerization reaction, it is preferable to provide the reaction vessel with an excessive amount of the components necessary for the reaction. The excess amount of the components required for the amplification reaction means an amount such that the amplification reaction is not substantially restricted to the concentration of the component. To provide joinja, dATP, dCTP, dGTP and dTTP, such as Mg + 2 to the reaction mixtures to have a desired degree of amplification can be achieved is required. All enzymes used in the amplification reaction may be active under the same reaction conditions. In fact, buffers make all enzymes close to optimal reaction conditions. Therefore, the amplification process of the present invention can be carried out in a single reaction without changing the conditions such as the addition of reactants.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격 조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.In the present invention, annealing is carried out under stringent conditions that allow specific binding between the target nucleotide sequence and the primer. The stringent conditions for annealing are sequence-dependent and vary with environmental variables.

상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드에 대한 존재 여부를 조사한다. 이러한 증폭반응을 통하여 생물학적 시료에서 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드가 존재하는 것으로 나오는 경우 이브루티닙에 대하여 증가된 감수성을 나타내는 것으로 판단된다. 따라서 본 발명의 이브루티닙에 대한 감수성 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함한다.The result of the amplification reaction described above is subjected to gel electrophoresis and the resultant band is observed and analyzed to examine the presence of the nucleotide sequence of Sequence Listing 1 on the nucleotide. It is judged that this amplification reaction shows an increased susceptibility to ibrutinib when the nucleotide of the first sequence of the sequence listing appears in the biological sample. Therefore, when the method for detecting a susceptibility marker to ibrutinib of the present invention is carried out based on an amplification reaction using cDNA, specifically (i) a primer annealed to the nucleotide sequence of Sequence Listing 1 is used to amplify ; And (ii) analyzing the product of the amplification reaction to determine the presence or absence of the nucleotide sequence of the first sequence listing.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.The kit of the present invention may further include other components in addition to the above components. For example, when the kit of the present invention is applied to a PCR amplification process, the kit of the present invention may optionally comprise reagents necessary for PCR amplification, such as a buffer, a DNA polymerase (e.g., Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus Thermostable DNA polymerases obtained from Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis or Pyrococcus furiosus (Pfu)), DNA polymerase joins and dNTPs. The kit of the present invention may be made from a number of separate packaging or compartments containing the above reagent components.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(ⅰ) 본 발명은 EGFRvⅢ 변이의 존재 여부를 검사하여 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성 또는 예후를 판단하는 방법 및 교모세포종 환자의 이브루티닙에 대한 감수성 예측용 키트를 제공한다. (I) The present invention provides a kit for assessing the sensitivity or prognosis of ibrutinib in a patient with a glioblastoma by examining the presence of an EGFRvlll mutation, and a kit for predicting susceptibility to ibrutinib in a glioblastoma patient.

(ⅱ) 본 발명을 이용하면 교모세포종 환자에서 BTK/BMX/BLK 특이적 억제제인 이브루티닙의 반응성을 예측할 수 있다.(Ii) Using the present invention, the reactivity of Ibtlutinib, a BTK / BMX / BLK specific inhibitor, can be predicted in patients with glioblastoma.

(ⅲ) 본 발명은 EGFRvⅢ 변이 환자에게 이브루티닙을 투약할 수 있는 근거로 유용하게 이용될 수 있다.(Iii) The present invention can be usefully used as a basis for administering ibrutinib to patients with EGFRvIII mutations.

도 1은 이브루티닙에 대한 감수성을 EGFRvⅢ 변이를 가진 환자유래 세포 및 무변이 세포에서 측정한 결과이다(p=0.0001).
도 2는 이브루티닙 처리에 의해 EGFRvⅢ 변이 세포의 종양구(Tumor sphere) 형성능이 감소하는 것을 확인한 결과이다.
도 3은 이브루티닙 처리에 의해 EGFR 관련 신호계(pEGFR, pAKT, pS6K)의 활성이 감소하는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 EGFRvⅢ 유전자 주입 세포에서 대조군에 비해 이브루티닙의 감수성이 증가하는 것을 확인한 결과이다. Figure 1 shows the sensitivity to ibrutinib measured in patient-derived cells and unchanged cells with EGFRvlll mutations (p = 0.0001).
Fig. 2 shows the results of confirming that the ability of the EGFRvIII mutant cells to form a tumor sphere is reduced by the treatment with ibrutinib.
Fig. 3 shows the results of confirming that the activity of the EGFR-related signal system (pEGFR, pAKT, pS6K) is reduced by ibutoritin treatment.
FIG. 4 shows the results of confirming that the sensitivity of ibrutinib is increased in the EGFRvllll gene-injected cells as compared with the control group.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험방법Experimental Method

1. 교모세포종 세포 1. Glioblastoma cells

교모세포종 시료 및 임상 기록은 IRB(Institutional Review Boards)에 따라 삼성 메디컬 센터에서 수술을 받은 교모세포종 환자로부터 수득하였다. 유전적 분석을 위해 약 5×5×5 mm3의 외과 샘플을 액체 질소를 이용하여 동결시켰다. 외과 샘플의 일부는 종래에 알려진 면역세포 제거 방법에 따라 효소를 이용하여 단일 세포로 분리하였다(7). 종양세포는 N2 및 B27(0.5X each; Invitrogen), 인간 재조합 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor, 20 ng/ml each; R&D systems)를 추가적으로 포함하는 신경세포 배지에서 배양하였다. 종양구 형성 인 비트로 제한희석 어세이를 포함하는 표준 어세이 및 면역블롯은 종래에 알려진 방법에 따라 실시하였다(7). Glioblastoma specimens and clinical records were obtained from glioblastomas operated by Samsung Medical Center according to Institutional Review Boards (IRB). Surgical samples of approximately 5 x 5 x 5 mm 3 were frozen using liquid nitrogen for genetic analysis. Some of the surgical samples were separated into single cells using enzymes according to conventional immunocytochemical methods (7). Tumor cells were cultured in neuronal cell culture medium supplemented with N2 and B27 (0.5X each; Invitrogen), human recombinant bFGF (basic fibroblast growth factor) and EGF (epidermal growth factor, 20 ng / ml each; R & D systems). Standard assays and immunoblots involving a limited dilution assay with a bit-by-tumor dilation assay were performed according to methods known in the art (7).

2. 전체 엑솜 시퀀싱2. Whole exome sequencing

얼라인먼트Alignment

Burrows- Wheeler Aligner(version 0.6.2)를 이용하여 FASTQ 파일을 인간 지놈 어셈블리(hg19)에 얼라인하였다(22). SAMtools, Picard(version 1.73,http://picard.sourceforge.net) 및 Genome Analysis ToolKit(GATK, version 2.5.2)을 이용해 분석 이전에 초기 얼라인 BAM 파일에 대하여 분류, 중복 판독 제거, 작은 삽입/결실(INDELs) 주위 서열에 대한 부분적인 재얼라인 판독 및 베이스 퀄리티 스코어의 재보정을 실시하였다(23). The FASTQ file was aligned to the human genome assembly (hg19) using the Burrows-Wheeler Aligner (version 0.6.2) (22). Classification, redundant read-out, small insert / delete for early-aligned BAM files prior to analysis using SAMtools, Picard (version 1.73, http://picard.sourceforge.net) and Genome Analysis ToolKit (GATK, version 2.5.2) Partial reallocation of the indelible sequence (INDELs) and recalculation of the base quality score (23).

돌연변이 Mutation 콜링Calling (mutation calling)(mutation calling)

종양 및 정상 조직으로부터 체세포 돌연변이 콜링은 MuTect (version 1.1.4) 및 Somatic Indel Detector(GATK version 2.2)를 이용하여 실시하였다(24, 25). Variant Effect Predictor(VEP, version 73)는 콜링된 체세포 돌연변이에 대하여 생물학적 정보를 추출하는데 사용되었다. 본 발명에서 비유사(nonsynonymous) 체세포 돌연변이는 MAF(minor allele frequency) >0.20 및 돌연변이 대립유전자에 대한 판독 숫자가 >2인 경우, 추후 분석을 위해 콜링되었다. Somatic mutation calling from tumors and normal tissues was performed using MuTect (version 1.1.4) and Somatic Indel Detector (GATK version 2.2) (24, 25). The Variant Effect Predictor (VEP, version 73) was used to extract biological information about the callered somatic mutation. In the present invention, a nonsynonymous somatic mutation was called for further analysis if the minor allele frequency (MAF) > 0.20 and the reading number for the mutant allele were> 2.

카피 수 변화Number of copies

ngCGh 파이썬(python) 패키지는 매치된 정상 WES 데이터와 비교하여 종양 WES 데이터의 카피 수 변화를 측정하기 위해 사용되었다. 측정한 DNA 카피 수 분할을 R 패키지 “DNAcopy” (version 1.30.0)를 이용하여 실시하였고, 각 유전자의 카피 수는 유전자의 모든 엑손 세그먼트의 평균 카피 수로 계산하였다. 정상군에 대한 종양군의 로그2 비율이 0.5 이상 또는 -0.5 이하일 경우, 카피 수는 각각 “증폭” 또는 “삭제”된 것으로 추정하였다. The ngCGh Python package was used to measure changes in copy number of tumor WES data compared to matched normal WES data. The number of copies of DNA measured was determined using the R package "DNAcopy" (version 1.30.0) and the number of copies of each gene was calculated as the average number of copies of all exon segments of the gene. When the log 2 ratio of the tumor group to the normal group was 0.5 or more or -0.5 or less, the copy number was estimated to be "amplified" or "deleted", respectively.

엑손 스키핑 & 유전자 융합 분석Exon skipping & gene fusion analysis

싱글-엔드 맵핑 모드에서 GSNAP은 스플라이싱을 허용하는 hg19에 절단되지 않은 서열에 대한 판독 결과를 얼라인하기 위해 사용되었다. 비정규(non-canonical) 스플라이싱 연접을 스패닝하는 “스플리트(Split)” 판독을 분리하고, 스플리트 판독 수가 2 이상일 경우 엑손-스키핑 이벤트를 콜링하였다. 유전자 융합 분석을 위해 엑손-스키핑 분석과 같은 방법을 이용하여 스팬 융합 연접을 분리하고, 융합 이벤트를 콜링하였다. In the single-end mapping mode, GSNAP was used to align the readout results to the uncloned sequences in hg19, allowing splicing. Split " readings spanning non-canonical splicing concatenates were separated, and exon-skipping events were called when the number of split reads was two or more. For gene fusion analysis, span fusion junctions were isolated using methods such as exon-skipping analysis, and fusion events were called.

3. RNA 시퀀싱3. RNA sequencing

어떠한 미스매치, 삽입/결실 또는 스플라이싱을 허용하지 않고, GSNAP (version 2012-12-20)를 이용하여 hg19 상에 30 nt-절단된 서열 판독을 맵핑하였다. 얼라인먼트 SAM 파일 및 bedTools(bamToBed, version 2.16.2)로 분류된 SAMtools는 BED 파일로 정리하는데 사용되었다. RPKM 값은 R 패키지 DEGseq를 이용하여 측정하였다. A 30 nt-truncated sequence reading was mapped onto hg19 using GSNAP (version 2012-12-20), without any mismatch, insertion / deletion or splicing allowed. Alignment SAM files and SAMTools classified as bedTools (bamToBed, version 2.16.2) were used to organize them into BED files. RPKM values were measured using the R package DEGSEQ.

4. 세포 기반 HTS 약물 스크리닝4. Cell-based HTS drug screening

무혈청 배지에서 배양한 1차 교모세포종 세포를 384-웰 플레이트에 웰당 500개 세포씩 시딩하였다. 플레이팅 2시간 후, Janus Automated Workstation (PerkinElmer)를 이용하여 4배 및 7-포인트 단계 희석 방법으로 약물을 세포에 처리하였다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 6일간 배양한 다음, 파이어플라이 루시퍼라아제(ATPLite™ 1step, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 기초로 한 아데노신 3인산염 모니터링 시스템을 이용하여 세포 생존능을 분석하였다. 생존 세포는 EnVision Multilabel Reader(PerkinElmer)를 이용하여 측정하였다. 인 비트로 약물 스크리닝에서 세포 및 DMSO(vehicle) 만을 포함하는 대조군 웰이 각 어세이 플레이트에 포함되도록 하였다. 이러한 대조군은 플레이트에서 상대적인 세포 생존능을 계산하고, 플레이트 당 데이터를 정규화하기 위해 사용하였다. 데이터는 PRISM(Graphpad USA)를 이용하여 곡선화하였으며, 곡선하면적을 계산하였다. Primary glioblastoma cells cultured in serum-free medium were seeded into 384-well plates at 500 cells per well. Two hours after plating, the drug was treated with cells using a Janus Automated Workstation (PerkinElmer) in a 4-fold and 7-point stepwise dilution. The cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 6 days and then analyzed for cell viability using an adenosine triphosphate monitoring system based on firefly luciferase (ATPLite ™ 1step, PerkinElmer, Waltham, MA, USA) . Survival cells were measured using EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). In in vitro drug screening, control wells containing only cells and DMSO (vehicle) were included in each assay plate. These controls were used to calculate relative cell viability in the plate and to normalize the data per plate. Data were curved using PRISM (Graphpad USA), and curves were calculated.

5. 약물 반응 및 유전자 변화 연관성 분석5. Analysis of Drug Reaction and Genetic Change Associations

점 돌연변이, 삽입/결실, 엑손 스키핑, 유전자 융합 및 카피 수 변화(“증폭”, “결실” 및 “야생형”)와 같은 별개의 이벤트에 대한 약물 반응성 및 유전적 변화 사이의 연관성을 분석하기 위해 정규분포(Kolmogorov-Smirnov) 검정(null hypothesis: uniform distribution) 및 Wilcoxon 순위합검정을 실시하였다. 약물 반응성 및 유전자 발현 사이의 관계를 분석하기 위해 피어슨 상관 검정을 이용하였다. To analyze the association between drug reactivity and genetic changes to distinct events such as point mutations, insertion / deletion, exon skipping, gene fusion and copy number changes ("amplification", "deletion" and "wild type" The null hypothesis (uniform distribution) and the Wilcoxon rank sum test were performed. Pearson correlation test was used to analyze the relationship between drug reactivity and gene expression.

6. 웨스턴 블롯6. Western blot

환자 유래 교모세포종 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일(Thermo scientific)을 포함하는 용해 버퍼(150 mM 염화나트륨, 1% 트리톤 X-100, 1% 소듐 디옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCL 및 2mM EDTA)를 처리한 다음 수득하였다. 불용해성 물질은 4℃에서 15분간 12,000 rpm으로 원심분리하여 제거하였다. 단백질은 SDS-PAGE로 분리하였다. 면역블롯팅은 pEGFR(Y1068), EGFR, pAKT(S473), AKT, pERK(T202/Y204), ERK, pSTAT3(Y705) 및 STAT3(all from Cell Signaling Technology)에 특이적인 항체를 이용하여 실시하였다. Patient-derived glioma cells were washed with cold PBS and resuspended in lysis buffer (150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS (pH 7.5) containing protease and phosphatase inhibitor cocktail , 50 mM Tris-HCL and 2 mM EDTA). Insoluble materials were removed by centrifugation at 12,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. Proteins were separated by SDS-PAGE. Immunoblotting was performed using antibodies specific for pEGFR (Y1068), EGFR, pAKT (S473), AKT, pERK (T202 / Y204), ERK, pSTAT3 (Y705) and STAT3 (all from Cell Signaling Technology).

7. 종양구(Tumorsphere) 형성 어세이7. Tumorsphere formation assay

교모세포종 환자 시료로부터 유래한 교모세포종 세포 및 이종 이식 종양은 단일세포 현탁으로 분리하였고, 그 다음 다양한 시딩 농도(웰당 1-500 세포)로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 1-2주 동안 배양하였다. 각 웰에 대하여 신경구-유사 세포군 형성을 측정하였다. 통계학적 유의성은 Extreme Limiting Dilution Analysis(ELDA; Walter+Eliza Hall Bioinformatics)를 이용하여 계산하였다. Glioblastoma cells and xenograft tumors derived from glioblastoma patient samples were separated into single cell suspensions and then plated in 96-well plates at various seeding concentrations (1-500 cells per well). Cells were incubated at 37 ° C for 1-2 weeks. The neural-like cell group formation was measured for each well. Statistical significance was calculated using Extreme Limiting Dilution Analysis (ELDA; Walter + Eliza Hall Bioinformatics).

실험결과Experiment result

1. 이브루티닙에 높은 감수성을 나타낸 EGFRvⅢ 변이군1. EGFRvII mutants showing high sensitivity to ibrutinib

교모세포종 환자유래세포 50종을 이용하여 이브루티닙의 약물 감수성을 7 용량으로 관찰 후(20 μM - 5 nM), 약물 처리 6일째 DMSO 대조군 대비 세포 생존률(%) 값을 이용하여 DRC(Dose response curve)를 구한 후 곡선하면적(Area under curve) 값을 기준으로 측정하였다. EGFRvⅢ 변이를 갖는 세포와 무변이 세포군으로 분류 후 이브루티닙 반응을 비교해 보았을 때, 유의하게 EGFRvⅢ 변이 군에서 이브루티닙에 높은 감수성을 나타냈다(Wilcox P=0.0001)(도 1). (20 μM - 5 nM), and the cell survival rate (%) compared to the DMSO control group on the 6th day after the drug treatment, DRC (Dose response The curve under the curve was measured based on the area under curve. Compared with the EGFRvlll mutated cell and the unchanged cell group, the ibterutinib response showed a high sensitivity to ibrutinib (Wilcox P = 0.0001) in the EGFRvllll mutant group (Fig. 1).

2. EGFRvⅢ 변이에 따른 종양구 형성능 변화2. Changes in tumorigenicity by EGFRvII mutation

EGFR WT(GBM591) 및 EGFRvⅢ 변이 세포주(NS626 및 GBM352R)에 DMSO 또는 이브루티닙(100 또는 500 nM)을 처리하고 종양구 형성능을 Limiting Dilutiion Assay를 이용하여 관찰하였다. 24웰 플레이트에 다양한 농도(웰당 1-250 세포)로 세포를 플레이팅하고 2주간 배양한 다음, 종양구의 형성 유무를 관찰하였다. 세포의 대표 이미지는 도 2에 나타냈다. EGFR WT 세포(GBM591)에서는 이브루티닙 처리에 따른 종양구 형성능에 차이가 없지만, EGFRvⅢ 세포(NS626, GBM352R)에서는 이브루티닙 농도 의존적으로 유의한 종양구 형성 억제 효과가 나타났다.EGFR WT (GBM591) and EGFRvII mutant cell lines (NS626 and GBM352R) were treated with DMSO or ibrutinib (100 or 500 nM) and tumorigenicity was monitored using Limiting Dilution Assay. Cells were plated in 24-well plates at various concentrations (1-250 cells per well) and cultured for 2 weeks, and then tumor formation was observed. Representative images of the cells are shown in Fig. In EGFR WT cells (GBM591), there was no difference in the ability of tumor formation by ibrutinib treatment, but EGFRvIII cells (NS626, GBM352R) showed a significant inhibitory effect on ibrutinib concentration.

3. EGFRvⅢ 변이에 따른 EGFR 신호계 활성 변화3. EGFR signaling activity changes according to EGFRvll mutation

GBM591 및 NS626 세포에 이브루티닙(0, 100 및 500 nM)을 처리하고 24시간 후 세포를 수거하여 용해시킨 다음, pEGFR(Y1068), EGFR, pAKT, AKT, pS6K 및 S6K에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 베타-액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다(도 3). EGFR 및 pAKT 및 pSTAT3와 같은 다운스트림 시그널이 이브루티닙 처리에 의해 EGFRvⅢ 세포(NS626)에서 농도 의존적으로 현저히 감소하였다. GBM591 and NS626 Cells were treated with ibrutinib (0, 100, and 500 nM), and after 24 hours, the cells were harvested and lysed and then treated with Western blot using antibodies specific for pEGFR (Y1068), EGFR, pAKT, AKT, pS6K and S6K Respectively. Beta-actin was used as a loading control (Figure 3). Downstream signals such as EGFR and pAKT and pSTAT3 were significantly reduced in concentration-dependent manner in EGFRvIII cells (NS626) by ibrutinib treatment.

4. EGFRvⅢ 유전자 주입 세포에서 이브루티닙의 감수성4. Sensitivity of ibrutinib in EGFRvIII gene-injected cells

pLenti 대조군 벡터 또는 EGFRvⅢ(서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드)를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 GBM352L 세포에 주입하였다. GBM352L-벡터 또는 -EGFRvⅢ 주입 세포에 이브루티닙(20 μM - 5 nM에서 7가지 용량)을 6일간 처리하였다. 세포 생존율은 ATPlite cell viability 키트를 이용하여 측정하였으며, 생존율은 DMSO 대조군 생존율과 비교하여 평가하였다(도 4). 이브루티닙에 대한 감수성은 EGFR WT 세포(GBM352L)에 EGFRvⅢ를 주입한 경우, 현저히 증가하였다. pLenti control vector or EGFRvIII (nucleotide of Sequence Listing 1 sequence) was injected into GBM352L cells using a lentiviral system. GBL352L-vector or -EGFRvIII injected cells were treated with ibrutinib (7 μl at 20 μM - 5 nM) for 6 days. Cell viability was measured using the ATPlite cell viability kit, and the survival rate was evaluated in comparison with the DMSO control survival rate (FIG. 4). Sensitivity to ibrutinib was significantly increased when EGFRvIII was injected into EGFR WT cells (GBM352L).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Ibrutinib sensitivity related genes in patients with glioblastoma multiforme and Use Thereof <130> PN150209 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1595 <212> DNA <213> EGFRvIII nucleotide <400> 1 ccccggcgca gcgcggccgc agcagcctcc gccccccgca cggtgtgagc gcccgacgcg 60 gccgaggcgg ccggagtccc gagctagccc cggcggccgc cgccgcccag accggacgac 120 aggccacctc gtcggcgtcc gcccgagtcc ccgcctcgcc gccaacgcca caaccaccgc 180 gcacggcccc ctgactccgt ccagtattga tcgggagagc cggagcgagc tcttcgggga 240 gcagcgatgc gaccctccgg gacggccggg gcagcgctcc tggcgctgct ggctgcgctc 300 tgcccggcga gtcgggctct ggaggaaaag aaagtttgcc aaggcacgag taacaagctc 360 acgcagttgg gcacttttga agatcatttt ctcagcctcc agaggatgtt caataactgt 420 gaggtggtcc ttgggaattt ggaaattacc tatgtgcaga ggaattatga tctttccttc 480 ttaaagacca tccaggaggt ggctggttat gtcctcattg ccctcaacac agtggagcga 540 attcctttgg aaaacctgca gatcatcaga ggaaatatgt actacgaaaa ttcctatgcc 600 ttagcagtct tatctaacta tgatgcaaat aaaaccggac tgaaggagct gcccatgaga 660 aatttacagg aaatcctgca tggcgccgtg cggttcagca acaaccctgc cctgtgcaac 720 gtggagagca tccagtggcg ggacatagtc agcagtgact ttctcagcaa catgtcgatg 780 gacttccaga accacctggg cagctgccaa aagtgtgatc caagctgtcc caatgggagc 840 tgctggggtg caggagagga gaactgccag aaactgacca aaatcatctg tgcccagcag 900 tgctccgggc gctgccgtgg caagtccccc agtgactgct gccacaacca gtgtgctgca 960 ggctgcacag gcccccggga gagcgactgc ctggtctgcc gcaaattccg agacgaagcc 1020 acgtgcaagg acacctgccc cccactcatg ctctacaacc ccaccacgta ccagatggat 1080 gtgaaccccg agggcaaata cagctttggt gccacctgcg tgaagaagtg tccccgtaat 1140 tatgtggtga cagatcacgg ctcgtgcgtc cgagcctgtg gggccgacag ctatgagatg 1200 gaggaagacg gcgtccgcaa gtgtaagaag tgcgaagggc cttgccgcaa agtgtgtaac 1260 ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac 1320 ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt 1380 gactccttca cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta 1440 aaggaaatca caggtttgag ctgaattatc acatgaatat aaatgggaaa tcagtgtttt 1500 agagagagaa cttttcgaca tatttcctgt tcccttggaa taaaaacatt tcttctgaaa 1560 ttttaccgtt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1595 <210> 2 <211> 405 <212> PRT <213> EGFRvIII amino acid <400> 2 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Leu Ser 405 <110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Ibrutinib sensitivity related genes in patients with glioblastoma          multiforme and Use Thereof <130> PN150209 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1595 <212> DNA <213> EGFRvIII nucleotide <400> 1 ccccggcgca gcgcggccgc agcagcctcc gccccccgca cggtgtgagc gcccgacgcg 60 gccgaggcgg ccggagtccc gagctagccc cggcggccgc cgccgcccag accggacgac 120 aggccacctc gtcggcgtcc gcccgagtcc ccgcctcgcc gccaacgcca caaccaccgc 180 gcacggcccc ctgactccgt ccagtattga tcgggagagc cggagcgagc tcttcgggga 240 gcagcgatgc gaccctccgg gacggccggg gcagcgctcc tggcgctgct ggctgcgctc 300 tgcccggcga gtcgggctct ggaggaaaag aaagtttgcc aaggcacgag taacaagctc 360 acgcagttgg gcacttttga agatcatttt ctcagcctcc agaggatgtt caataactgt 420 gaggtggtcc ttgggaattt ggaaattacc tatgtgcaga ggaattatga tctttccttc 480 ttaaagacca tccaggaggt ggctggttat gtcctcattg ccctcaacac agtggagcga 540 attcctttgg aaaacctgca gatcatcaga ggaaatatgt actacgaaaa ttcctatgcc 600 ttagcagtct tatctaacta tgatgcaaat aaaaccggac tgaaggagct gcccatgaga 660 aatttacagg aaatcctgca tggcgccgtg cggttcagca acaaccctgc cctgtgcaac 720 gtggagagca tccagtggcg ggacatagtc agcagtgact ttctcagcaa catgtcgatg 780 gacttccaga accacctggg cagctgccaa aagtgtgatc caagctgtcc caatgggagc 840 tgctggggtg caggagagga gaactgccag aaactgacca aaatcatctg tgcccagcag 900 tgctccgggc gctgccgtgg caagtccccc agtgactgct gccacaacca gtgtgctgca 960 ggctgcacag gcccccggga gagcgactgc ctggtctgcc gcaaattccg agacgaagcc 1020 acgtgcaagg acacctgccc cccactcatg ctctacaacc ccaccacgta ccagatggat 1080 gtgaaccccg agggcaaata cagctttggt gccacctgcg tgaagaagtg tccccgtaat 1140 tatgtggtga cagatcacgg ctcgtgcgtc cgagcctgtg gggccgacag ctatgagatg 1200 gggaagacg gcgtccgcaa gtgtaagaag tgcgaagggc cttgccgcaa agtgtgtaac 1260 ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac 1320 ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt 1380 gactccttca cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta 1440 aaggaaatca caggtttgag ctgaattatc acatgaatat aaatgggaaa tcagtgtttt 1500 agagagagaa cttttcgaca tatttcctgt tcccttggaa taaaaacatt tcttctgaaa 1560 ttttaccgtt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaa 1595 <210> 2 <211> 405 <212> PRT <213> EGFRvIII amino acid <400> 2 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala   1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln              20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe          35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn      50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys  65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val                  85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr             100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn         115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu     130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met                 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro             180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln         195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg     210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp                 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro             260 265 270 Thr Thr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly         275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His     290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val                 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn             340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp         355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr     370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Leu Ser                 405

Claims (8)

다음의 단계를 포함하는 교모세포종(glioblastoma multiforme) 환자의 이브루티닙(ibrutinib)에 대한 감수성 또는 예후의 판단에 유용한 정보를 제공하기 위해 EGFRvⅢ 변이의 존재 여부를 검사하는 방법:
(a) 대상자로부터 분리한 생물학적 시료로부터 핵산 분자 또는 단백질을 분리하는 단계; 및
(b) (i) 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열목록 제1서열의 폴리뉴클레오타이드 또는 (ⅱ) 상기 분리된 단백질로부터 서열목록 제2서열의 단백질을 검출하는 단계로 상기 서열목록 제1서열의 폴리뉴클레오타이드 또는 서열목록 제2서열의 단백질이 검출되는 경우, 상기 대상자는 증가된 이브루티닙 감수성을 갖는다.
A method for testing the presence or absence of an EGFRvlll mutation to provide information useful for determining susceptibility or prognosis to ibrutinib in a glioblastoma multiforme patient comprising the steps of:
(a) separating the nucleic acid molecule or protein from the biological sample separated from the subject; And
(b) detecting the polynucleotide of Sequence Listing 1 sequence from the separated nucleic acid molecule or (ii) detecting the protein of Sequence Listing Sequence 2 from the separated protein, wherein the polynucleotide of Sequence Listing 1 sequence Or when the protein of the second sequence of the sequence listing is detected, said subject has increased ibrutinib susceptibility.
제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제1서열의 폴리뉴클레오타이드의 검출은 PCR(Polymerase Chain Reaction), 혼성화(hybridization), 시퀀싱(sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 또는 NGS(next generation sequencing) 방법으로 실시하는 것을 특징으로 방법.
2. The method according to claim 1, wherein the detection of the polynucleotide of the first sequence is carried out by PCR (Polymerase Chain Reaction), hybridization, sequencing, pyrosequencing or NGS . &Lt; / RTI &gt;
제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제2서열의 단백질의 검출은 항원-항체 반응 방식으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. The method according to claim 1, wherein the detection of the protein of the second sequence is carried out by an antigen-antibody reaction method.
제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 세포, 모발 또는 조직 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the biological sample is blood, plasma, serum, urine, cells, hair or tissue samples.
(ⅰ) 서열목록 제2서열의 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer), 또는 (ⅱ) 서열목록 제1서열의 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 교모세포종(glioblastoma multiforme) 환자의 이브루티닙(ibrutinib)에 대한 감수성 예측용 키트.
(I) an oligopeptide, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a ligand, a peptide nucleic acid (PNA) or an aptamer that specifically binds to the protein of the second sequence of the sequence listing, , Or (ii) a primer or probe that binds to a polynucleotide of the first sequence of SEQ ID NO: 1, in a glioblastoma multiforme patient.
제 5 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
6. The kit according to claim 5, wherein the kit is an immunoassay kit.
제 5 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
The kit according to claim 5, wherein the kit is a microarray kit.
제 5 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 키트.6. The kit according to claim 5, wherein the kit is a gene amplification kit.
KR1020150083534A 2015-06-12 2015-06-12 Ibrutinib sensitivity related genes in patients with glioblastoma multiforme and Use Thereof KR101776238B1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150083534A KR101776238B1 (en) 2015-06-12 2015-06-12 Ibrutinib sensitivity related genes in patients with glioblastoma multiforme and Use Thereof
PCT/KR2016/006006 WO2016200120A1 (en) 2015-06-12 2016-06-07 Gene associated with ibrutinib susceptibility in glioblastoma patients, and use therefor

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150083534A KR101776238B1 (en) 2015-06-12 2015-06-12 Ibrutinib sensitivity related genes in patients with glioblastoma multiforme and Use Thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160147182A KR20160147182A (en) 2016-12-22
KR101776238B1 true KR101776238B1 (en) 2017-09-12

Family

ID=57504182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150083534A KR101776238B1 (en) 2015-06-12 2015-06-12 Ibrutinib sensitivity related genes in patients with glioblastoma multiforme and Use Thereof

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101776238B1 (en)
WO (1) WO2016200120A1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102080384B1 (en) * 2018-02-28 2020-02-21 주식회사 마크로젠 Cancer stem cell-specific biomarkers

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6506555B2 (en) * 2011-10-19 2019-04-24 ファーマサイクリックス エルエルシー Use of Breton-type tyrosine kinase (Btk) inhibitors
AU2013293087B2 (en) * 2012-07-24 2017-08-31 Pharmacyclics Llc Mutations associated with resistance to inhibitors of Bruton's tyrosine kinase (BTK)
BR112016021717A2 (en) * 2014-03-21 2018-07-10 Abbvie Inc anti-egfr antibodies and antibody-drug conjugates

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Neoplasia. 2011 Dec;13(12):1113-21

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160147182A (en) 2016-12-22
WO2016200120A1 (en) 2016-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8574832B2 (en) Methods for preparing sequencing libraries
ES2324751B1 (en) METHODS AND KITS FOR DIAGNOSING AND / OR FORECASTING THE STATE OF TOLERANCE IN THE LIVER TRANSPLANT.
KR101848064B1 (en) Biomarkers for osteoarthritis and osteoarthritis diagnostic or prognostic kit using thereof
KR101997320B1 (en) Methods and compositions for determining resistance of cancer treatment
KR101270944B1 (en) Biomarkers Indicative of Cancer and Diagnosis Using The Same
CN115335535A (en) Immune repertoire biomarkers in autoimmune diseases and immunodeficiency disorders
KR101776238B1 (en) Ibrutinib sensitivity related genes in patients with glioblastoma multiforme and Use Thereof
KR101704533B1 (en) Err as the biomaker to liver cancer and use thereof
KR101192295B1 (en) Biomarkers Indicative of Colon Cancer and Metastasis and Diagnosis and Screening Therapeutics Using the Same
KR102419635B1 (en) SORD as a biomarker for prognosis of liver cancer
JP5760247B2 (en) Composition and method for predicting postoperative prognosis or metastatic potential of cancer patients
KR20180100812A (en) Atopic Dermatitis PTGR2 Gene Specifically Expressed in Intestinal Epithelial Cell
KR20200102746A (en) Composition for Diagnosing Pancreatic Cancer
KR101874632B1 (en) Biomarker Indicative of Crohn&#39;s disease and Diagnosis Using the Same
KR20090025898A (en) Marker, kit, microarray and method for predicting the risk of lung cancer recurrence
KR101345374B1 (en) Marker for classifying substage of stage 1 lung cancer patient, kit comprising primer for the marker, microarray comprising the marker or antibody against the marker, and method for classifying substage of stage 1 lung cancer patient
KR101709980B1 (en) Biomarker Indicative of Prostate Cancer Metastasis and Uses Thereof
WO2008049022A2 (en) Methods for detection of cancer
KR101683961B1 (en) Recurrence Marker for Diagnosis of Bladder Cancer
KR20190037071A (en) Biomarker for Diagnosis of Anticancer drug Resistance of Colon Cancer and Uses thereof
KR101968962B1 (en) Compositions for diagnosing obesity resistance
KR101835589B1 (en) Novel Biomarkers for Discrimination of Cattle Milk Productvity and Their Uses
US20230111706A1 (en) Mest as biomarker for cancer diagnosis and prognosis and method for using thereof
EP4332242A1 (en) Method for predicting prognosis of gastric cancer
KR20170124683A (en) Fusion genes and proteins as a novel biomarker for diagnosis of biliary trat cancer

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant