KR101769546B1 - Cosmetic composition comprising daphnin and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
상처 치료용 약학적 조성물, 염증성 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물, 개체의 상처를 치료하는 방법, 염증성 질환을 치료하는 방법 및 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.It relates to a pharmaceutical composition for treating wounds, a pharmaceutical composition for treating an inflammatory disease, a method of treating a wound of an individual, a method of treating an inflammatory disease, and a cosmetic composition for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging. .
피부는 외부로부터 신체를 보호하는 방어막으로서 역할을 한다. 피부에 상처가 생기면 생체의 자연 치유 작용에 의해 상처자리를 혈액이 채우게 되고 혈소판의 과립감소와 하게만 인자(hageman factor)의 활성화가 시작되어 상처 치유 과정이 진행된다. 혈액의 응고는 임시 방어 작용으로서, 노출된 상처 조직들을 보호하고 치유 과정 동안 세포들이 이동할 수 있는 기반을 제공한다. The skin acts as a barrier to protect the body from the outside. When a wound occurs on the skin, blood fills the wound site by the natural healing action of the living body, and the reduction of the granules of platelets and activation of the hageman factor begins, and the wound healing process proceeds. Blood clotting is a temporary defense, protecting exposed wound tissue and providing a basis for cells to move during the healing process.
상처 치료 및/또는 치유는 크게 3개의 단계로 일어난다. 첫 번째 단계는 외상 부위에서의 염증을 특징으로 하는 염증기(inflammatory phase)이다. 염증기는 중대한 감염이 없는 상태에서 일반적으로 짧게 진행될 수 있다. 두 번째 단계는 증식기(proliferative phase)이며, 이는 상피화, 혈관형성, 육아 조직 형성 및 콜라게 침착을 특징으로 한다. 새로운 모세관 형성을 수반하는 혈관형성은 영양소를 전달하고 육아조직 형성을 유지하는데 사용된다. 상처 내로 새로운 모세관의 형성 없이 필수 영양소가 상처에 도달하지 못하여 만성적으로 치유되지 않는 상처를 생성시킨다. 손상된 상처의 표면이 각질형성세포(keratinocytes) 층에 의해 덮이면서 새로운 표피가 생성되고 상피층이 재건되는 재상피화가 일어난다. 재상피화가 완료되면 결합조직의 증가와 재편성을 통해 상처 면적이 감소되는 일련의 과정이 진행된다. 상처 치유의 최종 단계는 섬유아세포(fibroblast)가 콜라겐으로 분화하는 성숙기(maturational phase)이다. 성숙기 동안 회복기 조직의 엉긴 세포와 모세혈관이 조금씩 사라지게 되는데, 이러한 조직의 세포와 모세혈관이 과형성되거나 정상적으로 분해되지 않는 경우 흉터가 생길 수 있다. Wound healing and/or healing takes place in three major steps. The first stage is the inflammatory phase, which is characterized by inflammation at the site of the trauma. The inflammatory phase can usually progress briefly in the absence of significant infection. The second phase is the proliferative phase, which is characterized by epithelialization, angiogenesis, granulation tissue formation and collagen deposition. Angiogenesis, accompanied by the formation of new capillaries, is used to deliver nutrients and maintain granulation tissue formation. Without the formation of new capillaries into the wound, essential nutrients fail to reach the wound, creating a chronically incurable wound. As the surface of the damaged wound is covered by a layer of keratinocytes, a new epidermis is created and re-epithelialization takes place in which the epithelial layer is reconstructed. When re-epithelialization is completed, a series of processes in which the wound area is reduced through the increase and reorganization of connective tissue proceeds. The final stage of wound healing is the maturational phase in which fibroblasts differentiate into collagen. During the maturation period, the congested cells and capillaries of the convalescent tissue gradually disappear. If the cells and capillaries of these tissues are overformed or are not decomposed normally, scars may occur.
상처 치유과정에서 상처를 신속하게 치료할 뿐만 아니라 부작용이나 흉터 없이 치료하는 것이 중요하기 때문에, 이러한 효능을 가지는 물질을 찾고자 하는 노력이 계속되고 있다. In the wound healing process, since it is important not only to quickly heal the wound, but also to heal without side effects or scars, efforts to find a substance having such an effect are continuing.
제1 양상은 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다. A first aspect provides a pharmaceutical composition for treating wounds.
제2 양상은 염증성 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. A second aspect provides a pharmaceutical composition for treating an inflammatory disease.
제3 양상은 개체의 상처를 치료하는 방법을 제공한다. A third aspect provides a method of treating a wound in an individual.
제4 양상은 개체의 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.A fourth aspect provides a method of treating an inflammatory disease in a subject.
제5 양상은 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다. A fifth aspect provides a cosmetic composition for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging.
제6 양상은 상처의 개선, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지를 위한 화장 방법을 제공한다. A sixth aspect provides a cosmetic method for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging.
제1 양상은 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 유효 성분으로서 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
The first aspect is one or more compounds selected from the group consisting of daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin, pharmaceutically acceptable thereof. It provides a pharmaceutical composition for wound treatment comprising a possible salt or solvate as an active ingredient.
제2 양상은 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 유효 성분으로서 포함하는 염증성 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
The second aspect is one or more compounds selected from the group consisting of daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin, pharmaceutically acceptable thereof. It provides a pharmaceutical composition for treating an inflammatory disease comprising a possible salt or solvate as an active ingredient.
제1 및 제2 양상에 있어서, 상기 화합물은 β-카테닌의 전사 활성을 증가시키는 것, 및/또는 콜라겐 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. β-카테닌의 전사 활성의 증가는 상처 치유 촉진과 관련된다. 예를 들면, Fathke C 등, BMC Cell Biol. 2006 Jan 20;7:4는 상처에서 리튬 클로리드에 의하여 베타-카테닌 의존적 Wnt 신호를 이소성 활성화(ectopic activation)시키면 상피낭(epithelial cysts) 및 때때로 진피 내에서 기본적 모낭(hair follicle) 구조를 생기게 한다는 것을 보고하였다. 또한, Bielefeld KA 등, Cell Mol Life Sci. 2013 Jun;70(12):2059-81은 Wnt 및/또는 베타-카테닌 신호전달 경로가 상처 치유에 중요한 역할을 한다는 것을 보고하고 있다.
In the first and second aspects, the compound may increase the transcriptional activity of β-catenin and/or increase the expression of a collagen gene. Increased transcriptional activity of β-catenin is associated with promoting wound healing. For example, Fathke C et al., BMC Cell Biol. 2006 Jan 20;7:4 shows that ectopic activation of beta-catenin-dependent Wnt signaling by lithium chloride in wounds results in epithelial cysts and sometimes basic hair follicle structures in the dermis. Reported. In addition, Bielefeld KA et al., Cell Mol Life Sci. 2013 Jun;70(12):2059-81 reports that Wnt and/or beta-catenin signaling pathways play an important role in wound healing.
제1 및 제2 양상에 있어서, 상기 화합물 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린은 각각 다음 구조를 갖는 것일 수 있다. In the first and second aspects, the compounds daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin each have the following structures: I can.
다프닌: 
다프네틴-8-β-글루코시드:
루타렌신: 
다프노레틴: 
다프네틴:. 
차마에크로모네:
이소쿼르시트린: 
상기 다프닌은 8-히드록시-2-옥소-2H-크로멘-7-일-β-D-글루코피라노시드일 수 있다. 다프네틴은 7,8-디히드록시쿠마린일 수 있다. 루타렌신은 3-히드록시-3-메틸-5-옥소-5-[[3,4,5-트리히드록시-6-[6-메톡시-2-옥소-3-(2-옥소크로멘-7-일) 옥시크로멘-7-일]옥시옥산-2-일]메톡시]펜탄산일 수 있다. 다프노레틴은 7-히드록시-6-메톡시-3-(2-옥소크로멘-7-일) 옥시크로멘-2-오네일 수 있다. 차마에크로모네는 (+)-3-[1-[비스(4-히드록시페닐)메틸]-2-옥소-2-(2,4,6-트리히드록시페닐)에틸]-5,7-디히드록시-4H-1-벤조피란-4-오네일 수 있다. 이소쿼르시트린은 2-(3,4-디히드록시페닐)-5,7-디히드록시-3-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-트리히드록시-6-(히드록시메틸)옥산-2-일]옥시크로멘-4-오네일 수 있다.The daphnine may be 8-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-7-yl-β-D-glucopyranoside. Daphnetine may be 7,8-dihydroxycoumarin. Rutarensin is 3-hydroxy-3-methyl-5-oxo-5-[[3,4,5-trihydroxy-6-[6-methoxy-2-oxo-3-(2-oxochromene] -7-yl) oxychromen-7-yl]oxyoxan-2-yl]methoxy]pentanoic acid. Daphnoretin may be 7-hydroxy-6-methoxy-3-(2-oxochromen-7-yl) oxychromen-2-one. Chamaecromone is (+)-3-[1-[bis(4-hydroxyphenyl)methyl]-2-oxo-2-(2,4,6-trihydroxyphenyl)ethyl]-5,7 -Dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one. Isoquarcitrine is 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy- 6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxychromen-4-one.
상기 조성물에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 한 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 바람직한 무기산염의 예에는 염산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염을 들 수 있으며, 바람직한 유기산염의 예에는 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캄실산염 또는 에디실염을 들 수 있고, 금속염의 예에는 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염 또는 칼륨염을 들 수 있다.
In the composition, the pharmaceutically acceptable salt is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, but may be preferably an inorganic acid salt, an organic acid salt, or a metal salt. Examples of preferred inorganic acid salts include hydrochloride, phosphate, sulfate or disulfate, and examples of preferred organic acid salts include malate, maleate, citrate, fumarate, besylate, camsylate or edicyl salt. Examples include calcium salt, sodium salt, magnesium salt, strontium salt or potassium salt.
상기 조성물에 있어서, 용어 "상처(wound)"는 조직이 잘려지거나(cut), 찢어지거나(torn), 부서지거나(broken), 타거나(burned), 또는 외상을 입거나(traumatized), 또는 이러한 손상을 유발하는 장애 또는 질환으로부터 발생된 인체에 대한 손상(injury)을 의미한다. 용어 "조직"은 함께 집단을 이루어 특정 기능을 형성하는 인체 중의 세포의 덩어리를 나타낸다. 조직에는 눈, 점액, 폐, 신장, 심장, 내장, 힘줄(tendon), 혈관조직, 뼈, 피부, 결합조직, 및 신경, 예컨대 척수가 포함될 수 있다. 상기 상처는 표면이 개방된 개방된 상처(open wound), 또는 표면이 개방되지 않은 폐쇄된 상처(closed wound)일 수 있다. 상기 상처의 일예는 피부에 있는 개방된 상처일 수 있다. 상기 상처는 병변(lesion), 헌데(sore), 괴사(necrosis), 및 궤양(ulcer)을 포함할 수 있다. 상기 괴사는 감염, 손상 또는 경색으로부터 생성되는 죽은 조직과 관련된 것일 수 있다. 상기 궤양은 괴사 조직의 탈피에 의해 생성된, 기관 또는 조직의 표면의 국소적인 결함 또는 패임일 수 있다. In the above composition, the term "wound" means that the tissue is cut, torn, broken, burned, or traumatized, or It refers to an injury to the human body resulting from a disorder or disease that causes damage. The term “tissue” refers to a mass of cells in the human body that group together to form a specific function. Tissues may include eyes, mucus, lungs, kidneys, heart, intestines, tendons, vascular tissues, bones, skin, connective tissues, and nerves such as spinal cord. The wound may be an open wound with an open surface, or a closed wound with an open surface. An example of such a wound may be an open wound on the skin. The wound may include a lesion, sore, necrosis, and ulcer. The necrosis may be associated with dead tissue resulting from infection, injury or infarction. The ulcer may be a local defect or a dent on the surface of an organ or tissue, produced by dislodging of necrotic tissue.
상기 상처의 일 예는 피부의 표피(epidermis); 진피(dermis); 표피 및 진피; 또는 표피, 진피 및 피하지방층이 손상된 상처일 수 있다. An example of the wound is the epidermis of the skin; Dermis; Epidermis and dermis; Alternatively, it may be a wound in which the epidermis, dermis and subcutaneous fat layer are damaged.
또한, 상기 상처의 예는 베임(cut), 절개(incisions)(예, 수술적 절개), 찰과상(abrasions), 열상 또는 찢김(lacerations), 골절(fracture), 타박상(contusions), 화상(burns), 또는 절단(amputations)을 포함할 수 있다. In addition, examples of such wounds include cuts, incisions (e.g., surgical incisions), abrasions, lacerations or lacerations, fractures, contusions, and burns. , Or amputations.
본 발명에 의하여 제공되는 "치료(treat)"는 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 상처가 치유되는 것을 제공하는 것일 수 있다. 상기 치료는 상처의 개선 및/또는 완화를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료는 상처 및/또는 상처와 관련된 질환의 치료를 모두 포함하는 것일 수 있다. 상기 치료는 상처로부터 유발되는 손상된 조직의 치유 및/또는 재생을 의미할 수 있다. 상기 상처 치료는 피부 재생의 의미를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료는 상기 손상된 조직의 원래 조성을 유지하는 것일 수 있다. 또한, 상기 치료는 상처와 관련된 질환의 합병증 및/또는 흉터를 최소화하면서 상기 손상된 조직을 치유 및/또는 재생을 촉진하는 것일 수 있다. The "treat" provided by the present invention may be to provide a wound healing in a shorter time compared to natural healing. The treatment may include amelioration and/or alleviation of the wound. In addition, the treatment may include all treatments of wounds and/or wound-related diseases. The treatment may refer to the healing and/or regeneration of damaged tissue resulting from the wound. The wound treatment may include the meaning of skin regeneration. In addition, the treatment may be to maintain the original composition of the damaged tissue. In addition, the treatment may be to promote healing and/or regeneration of the damaged tissue while minimizing complications and/or scars of diseases related to wounds.
상기 조성물은 상처 치유 과정의 전단계를 촉진하기 위한 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 상처 치유 단계 중 증식기 및/또는 성숙기를 촉진하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 증식기 및/또는 성숙기에 있는 상처를 치료하기 위한 것일 수 있다. The composition may be for facilitating the entire stage of the wound healing process. In addition, the composition may promote proliferation and/or maturation during the wound healing step. Accordingly, the composition may be for treating wounds in the proliferative and/or maturity phase.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 상기 화합물을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 투여 1 단위당 0.01 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.01 mg 내지 100 mg, 0.01 mg 내지 50 mg, 0.01 mg 내지 10 mg, 0.01 mg 내지 1 mg, 또는 0.01 mg 내지 0.5 mg의 상기 화합물을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상기 화합물 외의 다른 화합물을 유효 성분으로 포함하지 않는 것일 수 있다.
The composition is from 0.001% to 80% by weight based on the total weight of the composition, for example, from 0.01% to 60% by weight, from 0.01% to 40% by weight, from 0.01% to 30% by weight, from 0.01% to 20% by weight %, 0.01% to 10%, 0.01% to 5%, 0.05% to 60%, 0.05% to 40%, 0.05% to 30%, 0.05% to 20%, 0.05% to 10% by weight, 0.05% to 5% by weight, 0.1% to 60% by weight, 0.1% to 40% by weight, 0.1% to 30% by weight, 0.1% to 20% by weight, 0.1% by weight % To 10% by weight, or 0.1% to 5% by weight of the compound. The composition is 0.01 mg to 1,000 mg per unit of administration, for example, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.01 mg to 50 mg, 0.01 mg to 10 mg, 0.01 mg to 1 mg, or 0.01 mg to 0.5 mg of the compound may be included. The composition may not contain other compounds other than the above compounds as an active ingredient.
상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.The composition may contain a pharmaceutically acceptable diluent or carrier. The diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, or mannitol, and as a lubricant, magnesium stearate, talc, or a combination thereof. The carrier may be an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, or a combination thereof. The excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof. The disintegrant may be calcium carboxymethylcellulose, sodium starch glycolate, anhydrous calcium monohydrogen phosphate, or a combination thereof. The binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof. The lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
상기 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 마스크 팩, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. The composition may be formulated as a parenteral dosage form. The parenteral dosage form may be an injection or an external preparation for skin. The external preparation for skin may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal patch, mask pack, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof.
상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다.The above skin external preparations are ingredients commonly used in external preparations for skin such as cosmetics and pharmaceuticals, such as aqueous ingredients, oily ingredients, powder ingredients, alcohols, moisturizers, thickeners, ultraviolet absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, fragrances. , Colorants, various skin nutrients, or a combination thereof and may be appropriately formulated according to need.
상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류도 적절하게 배합할 수 있다.The external preparations for the skin include metal sequestering agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, bellapamil, licorice extract, glavidine, and caline Hot-water extract of fruit, various herbal medicines, drugs such as tocopherol acetate, glytilithic acid, tranexamic acid and derivatives or salts thereof, vitamin C, ascorbic acid magnesium phosphate, ascorbic acid glucoside, arbutin, kojic acid, glucose, fructose, Sugars such as trehalose can also be appropriately blended.
상기 조성물은 세포 중의 콜라겐 유전자의 발현을 촉진하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 콜라겐의 발현을 증가시킬 수 있거나, 또는 상기 조성물에 의해 생성된 콜라겐의 활성을 증가시킬 수 있다. 상기 조성물은 또한 콜라겐을 생성시키는 상류(up-stream)의 효소 또는 단백질의 활성 또는 발현을 증가시킬 수 있다. 상기 조성물은 콜라겐의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 상처 치료 효능을 갖는 것일 수 있다. 상기 콜라겐은 1형 콜라겐(collagen, type I) 또는 3형 콜라겐(collagen, type III)일 수 있다. 상기 콜라겐을 코딩하는 유전자는 COL1A1 및 COL3A1로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
The composition may be for promoting the expression of a collagen gene in cells. The composition may increase the expression of collagen, or may increase the activity of collagen produced by the composition. The composition may also increase the activity or expression of up-stream enzymes or proteins that produce collagen. The composition may have a wound healing effect by increasing the expression and/or activity of collagen. The collagen may be
제3 양상은 상처를 치료하기에 유효한 양의 상기한 제1 양상의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법을 제공한다. A third aspect provides a method of treating a wound in a subject comprising administering to the subject an amount of the composition of the first aspect described above in an amount effective to treat the wound.
제4 양상은 염증성 질환을 치료하기에 유효한 양의 상기한 제2 양상의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. A fourth aspect provides a method of treating an inflammatory disease in a subject comprising administering to the subject an amount of the composition of the second aspect described above in an amount effective to treat the inflammatory disease.
상기 조성물에 대해서는 상술한 바와 동일하다. The composition is the same as described above.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 상처가 존재하는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다. Administration can be administered by a method known in the art. Administration can be administered directly to a subject by any means, for example by routes such as intravenous, intramuscular, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. . The administration can be administered systemically or locally. The administration may be topically administered to the area where the wound is present.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.The subject may be a mammal, for example a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
상기 투여는 상기 화합물을 개체당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다.
The administration is 0.1 mg to 1,000 mg of the compound per individual, for example, 0.1 mg to 500 mg, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 25 mg, 1 mg to 1,000 mg, 1 mg To 500 mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1,000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 5 mg to 25 mg , 10 mg to 1,000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg may be administered.
제5 양상은 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화합물에 대해서는 상술한 바와 동일하다. The fifth aspect is at least one compound selected from the group consisting of daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin, and its pharmaceutically acceptable It provides a cosmetic composition for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging, including possible salts or solvates as an active ingredient. The compound is the same as described above.
용어 "상처의 개선용"은 상처의 정도를 낮추어주거나 완화시키는 용도를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 상처 개선은 이미 발생한 상처의 정도를 낮추거나 완화시키는 것일 수 있다. The term "for improving a wound" may include use to reduce or alleviate the severity of a wound. For example, the wound improvement may be to reduce or alleviate the degree of a wound that has already occurred.
상기 화합물은 섬유아세포에서 콜라겐의 생성을 촉진한다. 콜라겐은 피부 진피층의 주요 성분으로서 탄력 단백질로 수분과 결합하는 힘이 강한 성질을 가지고 있다. 즉, 콜라겐은 피부에 탄력성을 부여하는 성질을 가지고 있고, 그에 따라 주름이 생기는 것을 방지하는 효과를 가진다. 사람이 나이가 들어감에 따라서, 피부의 콜라겐의 양이 줄어들고 피부는 탄력성을 잃고 주름이 생기되는 노화 과정을 거치게 된다. 따라서, 상기 화합물을 포함하는 청구된 발명의 조성물은 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물로서 사용될 수 있다.
This compound promotes the production of collagen in fibroblasts. Collagen is an elastic protein that is a major component of the dermal layer of the skin. In other words, collagen has the property of imparting elasticity to the skin, and thus has the effect of preventing wrinkles from occurring. As a person ages, the amount of collagen in the skin decreases, and the skin loses its elasticity and undergoes an aging process that causes wrinkles. Accordingly, the composition of the claimed invention comprising the compound can be used as a cosmetic composition for improving skin wrinkles or preventing skin aging.
상기 화장료 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 마스크 팩 또는 시트, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.The cosmetic composition may be provided in any formulation suitable for topical application. For example, a solution, an emulsion obtained by dispersing an oil phase in an aqueous phase, an emulsion obtained by dispersing an aqueous phase in an oil phase, a suspension, a solid, a gel, a powder, a paste, a mask pack or sheet, a foam or an aerosol composition Can be. Compositions of such formulations can be prepared according to conventional methods in the art.
상기 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제를 더 포함할 수 있다. 상기 보습제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.The cosmetic composition may further include a moisturizing agent, an emollient agent, an ultraviolet absorber, a preservative, a bactericide, an antioxidant, a pH adjuster, an organic and inorganic pigment, a fragrance, a cooling agent or a limiting agent. The blending amount of additional ingredients such as the moisturizing agent can be easily selected by a person skilled in the art within a range that does not impair the object and effect of the present invention, and the blending amount is 0.01 to 5% by weight, specifically 0.01 to 3, based on the total weight of the composition. It may be weight percent.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 상기 화합물을 포함할 수 있다.
The composition is from 0.001% to 80% by weight based on the total weight of the composition, for example, from 0.01% to 60% by weight, from 0.01% to 40% by weight, from 0.01% to 30% by weight, from 0.01% to 20% by weight %, 0.01% to 10%, 0.01% to 5%, 0.05% to 60%, 0.05% to 40%, 0.05% to 30%, 0.05% to 20%, 0.05% to 10% by weight, 0.05% to 5% by weight, 0.1% to 60% by weight, 0.1% to 40% by weight, 0.1% to 30% by weight, 0.1% to 20% by weight, 0.1% by weight % To 10% by weight, or 0.1% to 5% by weight of the compound.
제6 양상은 제5 양상에 따른 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 개체의 피부에 적용하는 단계를 포함하는, 피부를 화장하기 위한 방법을 제공한다. A sixth aspect provides a method for making up the skin, comprising applying the cosmetic composition for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging according to the fifth aspect on the skin of an individual.
상기 방법은 상처를 개선시키거나, 피부 주름을 개선시키거나, 또는 피부 노화를 방지하는 것일 수 있다.The method may be to improve wounds, improve skin wrinkles, or prevent skin aging.
상기 방법에 있어서, 상기 화장료 조성물은 두피를 포함하여 피부, 입술 및 모발의 수많은 처리, 특히 미용 처리에서 적용된다. In the above method, the cosmetic composition is applied in numerous treatments of skin, lips and hair, especially cosmetic treatments, including the scalp.
일 양상에 따른 상처를 치료하기 위한 조성물에 의하면, 개체의 상처를 효율적으로 치료하는데 사용될 수 있다.According to the composition for treating a wound according to an aspect, it can be used to efficiently treat a wound of an individual.
일 양상에 따른 상처를 치료하는 방법에 의하면, 개체의 상처를 효율적으로 치료할 수 있다.According to the method of treating a wound according to an aspect, it is possible to efficiently treat a wound of an individual.
일 양상에 따른 염증성 질환을 치료하기 위한 조성물에 의하면, 개체의 염증성 질환을 효율적으로 치료하는데 사용될 수 있다.According to the composition for treating an inflammatory disease according to an aspect, it can be used to efficiently treat an inflammatory disease in an individual.
일 양상에 따른 개체의 상처를 치료하는 방법에 의하면, 개체의 상처를 효율적으로 치료할 수 있다.According to the method of treating a wound on an individual according to an aspect, it is possible to efficiently heal the wound on the individual.
일 양상에 따른 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 의하여, 효율적으로 상처의 개선, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지에 사용될 수 있다. By the cosmetic composition for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging according to an aspect, it can be efficiently used for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging.
일 양상에 따른 피부를 화장하기 위한 방법에 의하면, 효율적으로 상처를 개선시키거나, 피부 주름을 개선시키거나, 또는 피부 노화를 방지할 수 있다.According to the method for making up skin according to an aspect, it is possible to efficiently improve wounds, improve skin wrinkles, or prevent skin aging.
도 1은 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린의 존재가 세포에서 베타-카테닌 활성에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 2는 7개 화합물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 전기영동 사진이다.
도 3은 7개 화합물이 섬유아세포에서 COL1A1 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 4는 7개 화합물이 섬유아세포에서 COL3A1 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 5는 7개 화합물이 대식세포에서 프로스타글란딘 E2 생성에 미치는 영향을 나타낸다.
도 6은 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린의 존재가 각질형성세포의 이동을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 7은 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린의 존재가 MMP-1의 발현 수준에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 8은 UVB 조사된 사람 섬유아세포에서 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린이 타입-1 프로콜라겐의 발현 미치는 정도를 측정한 결과를 나타낸다.Figure 1 shows the presence of seven compounds, i.e. daphne, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin, on beta-catenin activity in cells. It is a diagram showing the effect.
2 is an electrophoresis picture showing the effect of 7 compounds on the expression of COL1A1 and COL3A1 genes in fibroblasts.
3 is a diagram showing the effect of 7 compounds on the expression of the COL1A1 gene in fibroblasts.
4 is a diagram showing the effect of 7 compounds on the expression of the COL3A1 gene in fibroblasts.
5 shows the effect of 7 compounds on prostaglandin E2 production in macrophages.
6 shows the presence of seven compounds, namely, daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin, promoting the migration of keratinocytes. This is the result of confirming that it is.
Figure 7 shows the presence of 7 compounds, i.e. daphne, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin in the expression level of MMP-1. This is the result of checking the impact.
Figure 8 is the expression of type-1 procollagen of daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin in UVB-irradiated human fibroblasts. The result of measuring the degree of impact is shown.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1: 7개 화합물의 상처 치유 관련 활성의 확인 1: Confirmation of wound healing-related activity of 7 compounds
본 실시예에서는 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린에 대하여 인 비트로 상처 치유 및 염증 억제 효능을 확인하였다. 상기 화합물은 상업적으로 구입하여 사용하였다.
In this Example, in vitro wound healing and inflammation suppression against seven compounds, i.e. daphne, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin. The efficacy was confirmed. The compound was purchased and used commercially.
1. 베타-1. Beta- 카테닌Catenin (β-(β- catenincatenin ) 활성화 효능 확인) Confirmation of activation efficacy
HaCaT 인체 각질세포를 우태아 혈청이 2.5(v/v)%로 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) 배지가 들어있는 24공 플레이트의 웰에서 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 후 배양된 세포에 TOPflash(optimal Tcf binding site reporter gene) 혹은 FOPFlash(far-from-optimal Tcf binding site reporter gene) 및 베타-카테닌 전사 벡터(pRL-CMV reporter 플라스미드)를 Fugene 6(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 사용하여 형질감염(transfection)시키고 동일한 조건에서 24 시간 배양하였다. 상기한 7가지 화합물을 각각 농도별로 첨가하고 동일한 조건에서 48시간 동안 배양한 후, 세포를 파쇄(lysis)시킨 후 루시페린(luciferin)을 첨가하여 발생한 발광(luminescence)을 측정하였다. 대조군으로서, 동일한 양의 용매 즉, 디메틸술폭시드(DMSO)를 사용하였다.HaCaT human keratinocytes were cultured in a well of a 24-hole plate containing DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) medium containing 2.5(v/v)% fetal calf serum in 37°C and 5% CO 2 incubator for 24 hours. I did. Then, TOPflash (optimal Tcf binding site reporter gene) or FOPFlash (far-from-optimal Tcf binding site reporter gene) and beta-catenin transcription vector (pRL-CMV reporter plasmid) were added to the cultured cells. Indianapolis, IN) was used for transfection and cultured for 24 hours under the same conditions. After each concentration of the above seven compounds was added and cultured for 48 hours under the same conditions, the cells were lysed, and then luciferin was added to measure luminescence. As a control, the same amount of solvent, that is, dimethyl sulfoxide (DMSO) was used.
그 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.The results are shown in Table 1 and FIG. 1.
(대조군 대비 배수)Luciferase activity
(Multiples compared to the control group)
도 1은 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린의 존재가 세포에서 베타-카테닌 활성에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 1에서, A, B, C, D, E, F, 및 G는 각각 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린를 나타낸다. Figure 1 shows the presence of seven compounds, i.e. daphne, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin, on beta-catenin activity in cells. It is a diagram showing the effect. In FIG. 1, A, B, C, D, E, F, and G are respectively daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and iso Represents quarkcitrin.
표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린의 존재가 세포에서 베타-카테닌 전사 활성을 현저하게 증가시켰다. 이러한 결과는, 이들 7개 화합물이 상처 치유에 효과가 있다는 것을 나타낸다.
As shown in Table 1 and Figure 1, the presence of daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin in cells is beta-catenin. Significantly increased transcriptional activity. These results indicate that these 7 compounds are effective in wound healing.
2. 섬유아세포에서 2. In fibroblasts COL1A1COL1A1 및 And COL3A1COL3A1 유전자의 발현에 미치는 영향 Effects on gene expression
상기 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린이 인간 섬유아세포에서 콜라겐 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 아래와 같이 확인하였다. Whether the above seven compounds, i.e. daphne, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin, promote the expression of collagen genes in human fibroblasts. Whether it was confirmed as follows.
우태아 혈청이 2.5(v/v)%로 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) 배지 2 ml이 들어있는 6-웰 평판 배양기(6-well microtiter plate)의 웰에 인체의 섬유아세포 Hs68을 2×106 세포/웰이 되도록 넣고 컨플루언시가 80%가 될 때까지 상기한 바와 동일한 조건에서 배양하였다.Human fibroblast Hs68 was added to the well of a 6-well microtiter plate containing 2 ml of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) medium containing 2.5(v/v)% fetal bovine serum. It was put so as to be 2×10 6 cells/well and cultured under the same conditions as described above until the confluency reached 80%.
이렇게 배양한 세포에 상기 화합물을 지정된 농도로 첨가하고 24 시간 동안 상기한 바와 동일한 조건에서 배양시켰다. 음성 대조군으로는 상기 추출물을 녹이는데 사용한 DMSO를 동량을 사용하였다. 24시간 후, RT-PCR 어세이를 통해 콜라겐 유전자 발현의 정도를 확인하였다. 구체적으로, 24시간 경과한 다음 세포로부터 TRIzol시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 수확하여 역전사시킨 후, RT-PCR을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA를 역전사 효소(reverse transcriptase)를 사용하여 역전사시켰다. RT-PCR은 다음의 특정 프라이머를 프라이머로 사용하여 수행하였다. 각 유전자의 상대적인 mRNA 발현량 값은 β-액틴 값으로 표준화하였다.The above compound was added to the cultured cells at a designated concentration and cultured for 24 hours under the same conditions as described above. As a negative control, the same amount of DMSO used to dissolve the extract was used. After 24 hours, the level of collagen gene expression was confirmed through RT-PCR assay. Specifically, after 24 hours elapsed, total RNA was harvested and reverse transcribed from the cells using a TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and then RT-PCR was performed as follows. First, for cDNA synthesis, the RNA was reverse transcribed using a reverse transcriptase. RT-PCR was performed using the following specific primers as primers. The value of the relative mRNA expression level of each gene was normalized to the β-actin value.
도 2는 7개 화합물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 전기영동 사진이다.2 is an electrophoresis picture showing the effect of 7 compounds on the expression of COL1A1 and COL3A1 genes in fibroblasts.
도 3은 7개 화합물이 섬유아세포에서 COL1A1 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 4 및 도 5의 결과는 도 2의 전기 영동 사진으로부터 분석한 결과이다.3 is a diagram showing the effect of 7 compounds on the expression of the COL1A1 gene in fibroblasts. The results of FIGS. 4 and 5 are analysis results from the electrophoresis picture of FIG. 2.
도 4에 나타낸 바와 같이, 차마에크로모네, 다프네틴, 다프닌, 및 다프네틴-8-β-글루코시드는 콜라겐 합성 관련 인자인 COL1A1 유전자의 발현을 활성화시키는 효과가 현저하다는 것을 알 수 있었다.As shown in Fig. 4, it was found that chamaecromone, daphnetin, daphnine, and daphnetin-8-β-glucoside have a remarkable effect of activating the expression of the COL1A1 gene, a factor related to collagen synthesis.
도 5는 7개 화합물이 섬유아세포에서 COL3A1 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린은 콜라겐 합성 관련 인자인 COL3A1 유전자의 발현을 활성화시키는 효과가 현저하다는 것을 알 수 있었다.5 is a diagram showing the effect of 7 compounds on the expression of the COL3A1 gene in fibroblasts. As shown in Fig. 5, daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin express the COL3A1 gene, a factor related to collagen synthesis. It was found that the activating effect was remarkable.
3. 대식 세포에서 프로스타글란딘 E 2 ( prostaglandin E 2 : PGE 2 ) 생성에 미치는 영향 3. In the macrophage prostaglandin E 2 (prostaglandin E 2: PGE 2) Effects of the creation
상기 7개 화합물의 존재하에서 대식세포(macrophage)가 염증 생성 촉진 인자인 프로스타글란딘 E2의 생성 미치는 영향을 확인하였다.In the presence of the above seven compounds, it was confirmed that the effect of macrophages on the production of prostaglandin E 2, which is a factor promoting inflammation production.
대식세포는 RAW 264.7(ATCC TIB-71)를 사용하였다. 이 세포는 생쥐의 아벨슨 생쥐 백혈병 바이러스-유도된 종양(Abelson murine leukemia virus-induced tumor)로부터 만들어진 것으로서, 단핵세포 및 대식세포 형상을 갖고 부착하여 성장하는 특성을 갖는다. RAW 264.7 세포를 우태아 혈청이 10(v/v)%로 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) 배지가 들어있는 24-웰 평판 배양기(24-well microtiter plate)의 웰에 넣고 24 시간 동안 상기한 바와 동일한 조건에서 배양하였다. 그 후 상기 7개 각 화합물을 배지에 지정된 농도(uM)로 첨가하고, 24시간 동안 동일한 조건에서 배양하였다. 그 후, 세포를 배양한 배지를 수득하여 배지로 분비된 PGE2의 생성 정도를 PGE2 ELISA assay kit를 이용하여 측정하였다. 음성 대조군은 동일한 양의 DMSO를 사용하였고, 양성 대조군은 리포폴리사카리드(LPS)를 사용하였다. Macrophages were used as RAW 264.7 (ATCC TIB-71). These cells are produced from Abelson murine leukemia virus-induced tumors of mice, have mononuclear cells and macrophages, and have the characteristics of adhering and growing. RAW 264.7 cells were placed in the wells of a 24-well microtiter plate containing DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) medium containing 10 (v/v)% fetal bovine serum for 24 hours. It was cultured under the same conditions as described above. Thereafter, each of the seven compounds was added to the medium at a specified concentration (uM), and cultured under the same conditions for 24 hours. Thereafter, a medium in which the cells were cultured was obtained, and the degree of production of PGE 2 secreted into the medium was measured using a PGE2 ELISA assay kit. The same amount of DMSO was used as the negative control, and lipopolysaccharide (LPS) was used as the positive control.
도 9는 7개 화합물이 대식세포에서 프로스타글란딘 E2 생성에 미치는 영향을 나타낸다. 도 9에서 세로축은 배양액으로 방출된 프로스타글란딘 E2의 양을 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 7개 화합물은 대조군에 비하여 프로스타글란딘 E2의 생성을 현저하게 억제하였다. 이들 중 다프노레틴, 차마에크로모네, 및 다프네틴의 억제 효과가 특히 우수하였다.
9 shows the effect of 7 compounds on prostaglandin E2 production in macrophages. In Figure 9, the vertical axis represents the amount of prostaglandin E 2 released into the culture medium. As shown in Figure 9, the seven compounds significantly inhibited the production of prostaglandin E2 compared to the control. Among these, the inhibitory effects of daphnoretin, chamaecromone, and daphnetin were particularly excellent.
4. 인체 각질형성세포의 이동에 미치는 영향4. Effect on the migration of human keratinocytes
상기 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린이 인체 각질형성세포가 이동(migration)하는 것을 증가시키는지 여부를 아래와 같이 확인하였다.
The seven compounds, i.e., daphne, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin, prevent the migration of human keratinocytes. Whether to increase or not was confirmed as follows.
우태아 혈청이 2.5(v/v)%로 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) 배지 1 ml이 들어있는 24-웰 평판 배양기(24-well microtiter plate)의 웰에 HaCaT 인체 각질형성세포를 2×105 세포/웰이 되도록 넣었다. 다음으로, 상기 각질형성세포를 컨플루언시가 80%로 될 때까지 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 배양시킨 후, 배지 중의 세포 단일층을 p10 피펫 팁으로 긁어서 "긁힘-손상"을 유도하였다. HaCaT human keratinocytes were added to the wells of a 24-well microtiter plate containing 1 ml of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) medium containing 2.5(v/v)% fetal bovine serum. It was put so as to be 2×10 5 cells/well. Next, the keratinocytes were cultured in a 37°C and 5% CO2 incubator until the confluency reached 80%, and then a single layer of cells in the medium was scraped with a p10 pipette tip to induce "scratch-damage". .
다음으로, 상기 긁어진 세포 단일층 상에 무혈청 DMEM 200㎕와 상기 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린을 20 μM 배지의 농도로 첨가하였다. 그 후, 상기한 배양 조건과 동일한 조건에서 인체 각질형성세포를 24시간 동안 배양시켰다. 음성 대조군으로는 상기 추출물을 녹이는데 사용한 DMSO를 동량 처리하였다. 이 후, 크리스탈 비올렛(crystal violet) 시약으로 세포층을 염색한 후 긁힘 상처가 회복되는 정도를 확인하였다. Next, 200 µl of serum-free DMEM and the seven compounds, namely, daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone on the scratched cell monolayer. , And isoquarcitrin were added at a concentration of 20 μM medium. Thereafter, human keratinocytes were cultured for 24 hours under the same conditions as those described above. As a negative control, the same amount of DMSO used to dissolve the extract was treated. Thereafter, after staining the cell layer with a crystal violet reagent, the degree of recovery of the scratches was confirmed.
도 6은 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린의 존재가 각질형성세포의 이동을 촉진함을 확인한 결과이다. 6 shows the presence of seven compounds, namely, daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin, promoting the migration of keratinocytes. This is the result of confirming that it is.
도 6에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군이 처리된 세포의 긁힘 손상은 24시간 후에 상대적으로 치유되지 않은 채로 남아 있었는데 반해, 다프닌, 이소쿼르시트린, 및 다프네틴-8-β-글루코시드가 처리된 세포에서는 상처 가장자리의 세포 증식과 이동으로 긁힘-손상이 치유되어 24시간 후 긁힌 면적이 감소되었다.
As shown in Figure 6, the scratch damage of the cells treated with the negative control remained relatively unhealed after 24 hours, whereas daphnine, isoquarcitrin, and daphnetin-8-β-glucoside were treated. In the cells, the scratch-damage was healed by cell proliferation and migration at the wound edge, and the scratched area was reduced after 24 hours.
5. UV에 의하여 노화가 유도된 섬유아세포에서 콜라겐 분해효소-1 분비 억제 측정 실험5. Measurement of inhibition of collagenase-1 secretion in aging-induced fibroblasts by UV
상기 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린의 콜라겐 분해효소-1(Matrix Metalloproteinase-1, MMP-1)의 생성 억제 효능을 측정하였다.The seven compounds, namely, daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and collagenase-1 of isoquarcitrin (Matrix Metalloproteinase-1, The efficacy of inhibiting the production of MMP-1) was measured.
먼저, 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지가 들어있는 24-공 평판배양기에 사람 섬유아세포를 1×105 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 컨플루언시 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 7개 화합물을 각각 10 μM농도로 24시간 동안 첨가한 후, UV 조사기를 이용하여 UVB 즉 15 mJ을 조사하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 7개 화합물을 각각 10 μM 농도로 추가로 첨가하였다. 24시간이 경과한 다음 세포 배양액을 채취하여 원심분리하고 상등액만 수확하였다. First, put human fibroblasts at 1×10 5 cells/well in a 24-hole plate incubator containing DMEM medium containing 2.5% fetal bovine serum, until they grow up to about 90% confluency. Cultured. Thereafter, the seven compounds dissolved in serum-free DMEM medium were added at a concentration of 10 μM for 24 hours, respectively, and then UVB, that is, 15 mJ, was irradiated using a UV irradiator. Thereafter, the seven compounds dissolved in serum-free DMEM medium were additionally added at a concentration of 10 μM, respectively. After 24 hours, the cell culture was collected, centrifuged, and only the supernatant was harvested.
이후, 채취한 상등액으로부터 콜라겐 MMP-1 ELISA 키트(QIA55, Merck & Co., 미국)를 이용하여 상기 상등액 중 MMP-1의 수준을 측정하였다. 먼저, 1차 항체로 마우스 항-MMP-1 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)의 웰에 상기 상등액을 넣고 2시간 동안 상온에서 인큐베이션하여 항원-항체 복합체가 형성되도록 하였다. 2시간 후 발색단으로서 호스래디스 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)가 접합된 항-MMP-1 항체를 96-공 평판의 웰에 넣고 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 1시간 후 기질인 테크라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)을 넣어 실온에서 30분간 인큐베이션시켜 발색을 유발시킨 후 다시 종결 버퍼를 넣어 반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다. 노란색을 띠는 96-공 평판의 웰의 흡광도를 흡광계를 이용하여 450/540 nm에서 측정하였다. Thereafter, the level of MMP-1 in the supernatant was measured using a collagen MMP-1 ELISA kit (QIA55, Merck & Co., USA) from the collected supernatant. First, the supernatant was added to a well of a 96-well plate uniformly coated with a mouse anti-MMP-1 antibody as a primary antibody, and incubated at room temperature for 2 hours to form an antigen-antibody complex. . After 2 hours, an anti-MMP-1 antibody conjugated with horseradish peroxidase as a chromophore was placed in a well of a 96-hole plate and incubated for 1 hour. After 1 hour, add tetramethylbenzidine as a substrate and incubate for 30 minutes at room temperature to induce color development, and then add a terminating buffer to stop the reaction.The color of the reaction solution becomes yellow. The degree was different. The absorbance of the well of the 96-hole plate with yellow color was measured at 450/540 nm using an absorbance meter.
도 7은 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린의 존재가 MMP-1의 발현 수준에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린이 MMP-1 생성 억제 효능에 뛰어난 효과를 가짐을 알 수 있었다. 특히 이소쿼르시트린이 가장 효능이 뛰어남을 확인하였다. 양성 대조군으로는 에피칼로카테킨(Epigallocatechin gallate: EGCG)을 사용하였다.
Figure 7 shows the presence of 7 compounds, i.e. daphne, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin in the expression level of MMP-1. This is the result of checking the impact. As a result, as shown in FIG. 7, daphne, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin are excellent in inhibiting MMP-1 production. It can be seen that it has an effect. In particular, it was confirmed that isoquarcitrin is the most effective. As a positive control, epigallocatechin gallate (EGCG) was used.
6. UV에 의하여 노화가 유도된 섬유아세포에서 콜라겐 발현 촉진 측정 실험6. Experiment to measure collagen expression promotion in aging-induced fibroblasts by UV
상기 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린이 타입-1 프로콜라겐(Type-1 procollagen)의 발현을 촉진하는지를 확인하였다.
The seven compounds, namely, daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin are type-1 procollagen. It was confirmed whether it promotes the expression of.
먼저, 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 24-공 평판배양기에 사람 섬유아세포를 1×105 세포/ 공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 컨플루언시로 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 7개 화합물을 각각 10 μM 농도로 첨가한 24시간 동안 배양한 후, UV 조사기를 이용하여 UVB 즉 15 mJ을 조사하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 7개 화합물을 각각 10 μM 농도로 추가로 첨가하고 동일하게 배양하였다. UV 조사전 첨가는 전처리(pretreatment)이고 UV 조사 후 첨가는 후처리(posttreatment)로 시료의 예방 및 치료 효능을 확인하기 위해 두 번 첨가하였습니다. 24 시간 경과한 다음 세포 배양액을 채취하여 원심분리하고 상등액만 수확하고, 프로콜라겐 타입 I C-펩티드 EIA 키트 (Procollagen Type I C-Peptide (PIP)EIA Kit)(Cat. #MK101, Takara Bio Ink., 일본)를 사용하여 수확된 상등액 중 프로콜라겐 타입-I C-펩티드(procollagen type-I C-peptide, PIP)의 수준을 측정하였다. PIP는 생체 내에서 콜라겐을 합성하는 과정에서 프로콜라겐으로부터 콜라겐으로 전환되는 과정에서 잘려 나오는 펩티드로서 PIP의 수준은 콜라겐의 수준과 비례하기 때문에 당업계에서 콜라겐 수준을 확인하는데 지표로서 사용되고 있는 펩티드이다.
First, put human fibroblasts to 1×10 5 cells/well in a 24-hole plate incubator containing DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media) medium containing 2.5% fetal bovine serum, It was incubated until it grew into fluency. Thereafter, the seven compounds dissolved in a serum-free DMEM medium were each added at a concentration of 10 μM and cultured for 24 hours, and then UVB, that is, 15 mJ, was irradiated using a UV irradiator. Thereafter, the seven compounds dissolved in serum-free DMEM medium were additionally added at a concentration of 10 μM, and cultured in the same manner. The addition before UV irradiation was pretreatment, and the addition after UV irradiation was posttreatment, which was added twice to check the preventive and therapeutic efficacy of the sample. After 24 hours, the cell culture was collected, centrifuged, and only the supernatant was harvested. Procollagen Type I C-Peptide (PIP) EIA Kit (Cat. # MK101, Takara Bio Ink. , Japan) was used to measure the level of procollagen type-I C-peptide (PIP) in the harvested supernatant. PIP is a peptide that is cut off in the process of conversion from procollagen to collagen in the process of synthesizing collagen in vivo. Since the level of PIP is proportional to the level of collagen, it is a peptide that is used as an index to confirm the level of collagen in the art.
구체적으로 보면, 마우스 항-PIP 단클론 항체가 균일하게 코팅된 96-공 평판의 웰에 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)(POD)가 접합된 마우스 항-PIP 단클론 항체("항체-POD 접합체"라고도 함)를 첨가하고, 그 후 상기 세포 배양액 및 표준 용액(standard solution)을 각각 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 두었다. 그 후 웰을 세척하고 히드로겐 퍼옥시드와 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)을 포함한 기질 용액을 첨가하고 실온에서 15분 인큐베이션하였다. 그 후 웰에 반응 중지 용액(stop solution)을 넣어 반응을 중지시키고 흡광계(plate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Specifically, a mouse anti-PIP monoclonal antibody conjugated with horseradish peroxidase (POD) to a well of a 96-hole plate uniformly coated with a mouse anti-PIP monoclonal antibody ("antibody-POD conjugate ") was added, and then the cell culture solution and standard solution were added, respectively, and left at 37° C. for 3 hours. Thereafter, the wells were washed, and a substrate solution containing hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine was added, followed by incubation at room temperature for 15 minutes. Thereafter, a stop solution was added to the well to stop the reaction, and absorbance was measured at 450 nm using a plate reader.
도 8은 UVB 조사된 사람 섬유아세포에서 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린이 타입-1 프로콜라겐의 발현 미치는 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 7개 화합물은 타입-1 프로콜라겐 발현을 촉진하였으며, 특히 다프닌, 이소쿼르시트린, 다프네틴-8-β-글루코시드, 및 루타렌신이 크게 타입-1 프로콜라겐 발현을 촉진하였다. 다프네틴-8-β-글루코시드는 가장 크게 타입-1 프로콜라겐 발현을 촉진하였다.
Figure 8 is the expression of type-1 procollagen of daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin in UVB-irradiated human fibroblasts. The result of measuring the degree of impact is shown. As a result, as shown in FIG. 8, 7 compounds promoted the expression of type-1 procollagen, and in particular, daphnine, isoquarcitrin, daphnetin-8-β-glucoside, and rutarensin were largely type-1 pro. It promoted collagen expression. Daphnetin-8-β-glucoside most greatly promoted type-1 procollagen expression.
상기한 실시예에 의하면, 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린은 상처 치유 촉진 및 염증 억제 효과가 우수하였다.According to the above examples, 7 compounds, i.e. daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaecromone, and isoquarcitrin, promote wound healing and inflammation. The inhibitory effect was excellent.
또한, 상기한 실시예에 의하면, 자외선이 조사된 조건에서 7개 화합물 즉, 다프닌, 다프네틴-8-β-글루코시드, 루타렌신, 다프노레틴, 다프네틴, 차마에크로모네, 및 이소쿼르시트린은 사람 섬유아세포로부터 MMP-1의 발현을 감소시키고 콜라겐 발현을 촉진시키는 것으로 확인되었다. 즉, 상기 7개 화합물은 사람 섬유아세포에서 자외선이 조사된 조건에서 콜라겐 분해 효소의 발현은 감소시키면서 콜라겐의 발현은 촉진하였다. 따라서, 상기 7개 화합물은 사람 섬유아세포를 포함하는 조직에서, 예를 들면 피부에서 콜라겐 합성을 촉진하여 그 조직의 탄력성을 유지하고 촉진할 수 있다. 따라서, 상기 7개 화합물은 사람 섬유아세포를 포함하는 조직, 예를 들면, 피부 주름을 개선시키거나, 또는 피부 노화를 방지하는데 효과가 있다.In addition, according to the above examples, 7 compounds, i.e., daphnine, daphnetin-8-β-glucoside, rutarensin, daphnoretin, daphnetin, chamaechromone, and iso It has been found that quarkcitrin reduces the expression of MMP-1 and promotes collagen expression from human fibroblasts. That is, the seven compounds promoted the expression of collagen while reducing the expression of collagen-degrading enzyme in human fibroblasts irradiated with ultraviolet rays. Accordingly, the seven compounds can promote collagen synthesis in tissues including human fibroblasts, for example, in the skin to maintain and promote the elasticity of the tissues. Accordingly, the seven compounds are effective in improving tissues including human fibroblasts, for example, skin wrinkles, or preventing skin aging.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
<120> Cosmetic composition comprising daphnin and use thereof
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