KR101761168B1 - 재조합 ｆｓｈ 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 여포 자극 호르몬(FSH) 또는 재조합 FSH 변이체의 정제 방법에 관한 것이다. 이 방법은 재조합 FSH 또는 재조합 FSH 변이체를 함유하는 액체를 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계, 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, 및 염료 친화성 크로마토그래피하는 단계를 포함하며, 이 크로마토그래피 단계는 임의의 순서로 수행될 수 있고, 이 방법은 약 음이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 포함하지 않는다. 이 정제 방법에 의하면 바람직한 정도의 순도를 갖는 재조합 FSH의 높은 수율에 이른다. 얻어진 FSH는 FSH 제제가 유용한 치료로 여겨지는 이상 및 의학적 적응증의 예방 및 치료에 특히 유용하다.
Description
본 발명은 재조합 여포 자극 호르몬 (FSH) 또는 재조합 FSH 변이체(variant)의 정제 방법에 관한 것이다. 이 방법은 재조합 FSH 또는 재조합 FSH 변이체를 함유하는 액체를, 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 및 염료 친화성 크로마토그래피(dye affinity chromatography)하는 단계를 포함하며, 이러한 크로마토그래피 단계는 임의의 순서로 수행될 수 있고, 이 방법은 약 음이온 교환 크로마토그래피(weak anion exchange chromatography) 및 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)를 포함하지 않는다. 이 정제 방법에 의하여 바람직한 정도의 순도를 갖는 재조합 FSH를 높은 수율로 얻게 된다. 얻어진 FSH는 FSH 제제가 유용한 치료로 여겨지는 이상 및 의학적 적응증의 예방 및 치료에 특히 유용하다.
여포 자극 호르몬(Follicle stimulating hormone, FSH)은 하수체 전엽(anterior pituitary)의 생식선자극성세포(gonadotropic cells)로부터 생성되고, 순환계로 방출된다. FSH는 여성의 난모 세포 성숙 및 남성의 정자 생성의 제어에 있어서 황체 형성 호르몬(luteinising hormone, LH)과 함께 작용한다. FSH 및 LH는 개별적인 유전자에 의하여 코딩되는 2개의 비공유적으로 연결된(non-covalently linked) α- 및 β-사슬로 이루어진 헤테로다이머 당단백질(heterodimeric glycoproteins)의 군에 속한다. α- 및 β-사슬은 모두 글리코실화된다(glycosylated). α-서브유닛은 92개 아미노산 잔기로 이루어진 반면에, β-서브유닛은 111개 아미노산 잔기로 이루어지며, 이들 각각은 2개의 잠재적인 아스파라긴-연결 글리코실화 자리(asparagine-linked glycosylation sites)를 갖는다.
인간 FSH는 무배란 여성의 치료, 다난포 발생(과배란)의 자극, 및 IVF, ICSI, GIFT 또는 CIFT과 같은 보조 수정(assisted conception)용 제제에 이용된다. 또한, 인간 FSH는 FSH를 낮게 생성하거나 또는 생성하지 못하는 여성의 여포 성숙을 자극하고, 정자과소증을 앓는 남성의 정자생성을 자극하는데 이용된다.
배란 유도를 위한 전형적인 치료계획에서, 환자는 약 6일에서 약 12일 동안 FHS 또는 변이체(약 75 내지 450 IU FSH/일)를 매일 주사로 투여받는다. 과배란 유도(controlled ovarian hyperstimulation)를 위한 전형적인 치료계획에서, 환자는 약 6일에서 약 12일 동안 FSH 또는 변이체(약 150 내지 600 IU FSH/일)를 매일 주사로 투여받는다.
정자 생성의 자극을 위하여, 1주일에 3번 150 IU FSH를 1주일에 2번 2.500 IU hCG와 결합하여 이용하는 치료계획은 저고나도트로핀성 성기능저하증을 앓고 있는 남성의 정자수 측정에서 향상을 이루는데 성공적이었다.
1980년대까지, 인간 FSH의 주요 근원은 가임기 여성의 소변으로부터 분리된 소변-유래 FSH이었다. 고순도의 소변-유래 FSH의 더 정제된 형태는 1990년대에 도입되었고, 1998년 이래 마침내 재조합 FSH가 개발되어 광범위하게 이용되었다. 재조합 DNA 기술의 출현으로, α- 및 β-사슬을 코딩하는 핵산 서열로 형질감염된(transfected) 세포 배양물에서 인간 FSH를 생산할 수 있게 되었다. α- 및 β-사슬을 코딩하는 DNA 서열 및 재조합 FSH의 제조방법은 예를 들어, WO 88/10270, WO 86/04589 및 EP 0 735 139에 개시되었다.
최근, 독일 시장에서 시판되는 2종의 재조합 인간 FSH 제품(products)으로 GONAL-f® 및 Puregon®이 있으며, 이들은 모두 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster ovary, CHO) 세포에서 인간 야생형 α- 및 β-사슬을 코딩하는 DNA 서열의 발현에 의하여 제조된다.
생식 이상 치료에 있어서 FSH의 중요성 때문에, 고순도 및 고특이적 활성의 재조합 FSH 제공이 바람직하다. FSH 치료는 반복적인 주사를 필요로 한다. 고도로 정제된 FSH 제제는 피하로 투여될 수 있어, 환자에 의한 자기-투여를 가능하게 함으로써 환자 편의성 및 순응성을 높일 수 있다.
국제공개공보 WO 2006/051070 A1(Ares Trading S. A.)는 하기 단계: 1) 염료 친화성 크로마토그래피, 2) 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및 3) 역상 크로마토그래피를 포함하는 재조합 FSH의 정제 방법을 기재한다. 또한, WO 2006/051070 A1은 FSH를 1) 음이온 교환 크로마토그래피, 2) 염료 친화성 크로마토그래피, 3) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 4) 역상 크로마토그래피 및 5) 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 FSH의 정제 방법을 개시한다.
국제공개공보 WO 2005/063811 A1(Ares Trading S. A.)는 (1) 이온교환 크로마토그래피; (2) 고정된 금속 이온 크로마토그래피(immobilized metal ion chromatography); 및 (3) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계를 포함하는 재조합 인간 FSH의 정제 방법에 관한 것이다.
WO 2007/065918 A2(Ares Trading S.A.)는 임의의 순서로 수행될 수 있는, 크로마토그래피 단계: 염료 친화성 크로마토그래피, 약 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 강 음이온 교환 크로마토그래피(strong anion exchange chromatography)를 포함하는 FSH 정제 방법을 기재한다.
재조합 FSH 및 FSH 변이체의 새로운 정제 방법에 대한 계속 진행중인 요구가 있다. 특히, 역상 크로마토그래피 단계 이용을 피하는 정제 방법에 대한 요구가 있다. 또한, 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography)에 의존하지 않고, 이러한 비용집약적 단계 없이 수행될 수 있는 정제 방법을 이루는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 이러한 문제 및 다른 문제들은 독립항의 특징에 의하여 해결된다. 유리한 실시형태는 종속항에 정의되어 있다.
본 발명의 목적은 재조합 FSH 또는 재조합 FSH 변이체를 정제하는 신규하고 이로운 방법을 제공하는 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 임의의 순서로 수행될 수 있는,
- 음이온 교환 크로마토그래피 단계,
- 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계, 및
- 염료 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하는
조(crude) FSH를 함유하는 액체로부터 출발하는 재조합 인간 FSH 또는 FSH 변이체의 정제 방법을 제공하며, 이 방법은 임의의 약 음이온 교환 크로마토그래피 및 임의의 역상 크로마토그래피를 피한다.
다른 실시형태에서, 다른 크로마토그래피 단계가 하기 순서로 수행된다: (1) 음이온 교환 크로마토그래피, (2) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 (3) 염료 친화성 크로마토그래피. 음이온 교환 크로마토그래피(AEC)는 샘플 중의 단백질과 수지에 고정된 전하 사이의 전하-전하 상호작용에 의존한다. 음이온 교환 크로마토그래피에서, 단백질의 결합 이온은 음전하이며, 고정된 기능기는 양전하이다. 통상적으로 이용되는 음이온 교환 수지는 Q-수지, 4급 아민, DEAE 수지(디에틸아미노에탄)이다. 그러나, 일반적으로, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 모든 통상적인 시판 음이온 교환 수지 또는 막에 의하여 수행될 수 있다. 음이온 교환 수지는 미리 부어진(pre-poured) 컬럼 형태로 이용될 수 있다. 대안으로, 컬럼은 자기-제조(self-prepared)될 수 있다. 보통의 것 이외에 컬럼의 용량 및 기하학적 구조에 대해서는 특정한 제한이 없다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 이용되는 음이온 교환 수지의 양이 포획 단계(capture step)에서 컬럼에 적용되는, 세포 배양액 또는 다른 유체, 예를 들면, 선행 크로마토그래피 단계의 용리액의 전체 단백질 함량에 의존하는 것을 알고 있다.
본 발명의 목적을 위하여 이용될 수 있는 전형적인 강 음이온 교환 수지는 하기와 같은 기능기를 포함한다: 4급 아미노에틸(QAE) 부분, 수지는 예를 들면 Toyopearl QAE (Tosoh Bioscience, Germany로부터 입수 가능), Selectacel QAE (셀룰로오스의 4급 아미노에틸 유도체, Polysciences Inc., Pennsylvania USA로부터 입수 가능) 등을 포함하며; 4급 암모늄(Q) 부분, 수지는 예를 들면 Q Sepharose XL, Q Sepharose FF, Q Sepharose HP(GE Healthcare, Germany로부터 입수 가능), Resource Q(GE Healthcare, Germany로부터 입수 가능), Macro Prep High Q(Bio-Rad, California, USA), Toyopearl Super Q(Tosoh Bioscience, Germany로부터 입수가능), UNOsphere Q(Bio-Rad, California, USA로부터 입수 가능)을 포함하며; 및 트리메틸암모늄에틸(TMAE) 기, 수지는 예를 들면 Fractogel EMD TMAE(Merck, Germany로부터 입수 가능)을 포함한다.
음이온 교환 크로마토그래피는 -N+(CH3)3 기능기를 갖는 강 음이온 교환 수지 또는 유사한 특성을 갖는 수지를 이용하여 수행되는 강 음이온 교환 크로마토그래피가 바람직하다.
본 발명의 목적을 위하여 이용될 수 있는 강 음이온 교환 수지의 바람직한 예는 UNOsphere Q, Q Sepharose HP로 기술분야에 알려져 있는 4급 암모늄 강 음이온 교환체 수지 및 4급 암모늄(Q) 부분을 갖는 다른 수지이다.
강 음이온 교환체 UNOsphere Q의 특성은 하기와 같다:
기능기 -N+(CH3)3
총 이온 용량 120 μeq/㎖
동적 결합 용량(dynamic binding capacity)
150 ㎝/hr 180 ㎎/㎖
600 ㎝/hr 125 ㎎/㎖
수송 상대이온(shipping counter ion)
Cl-
중앙 입자 크기(Median particle size)
120 ㎛
권장 선형 유속 범위(Recommended linear flow rate range)
50-1200 ㎝/hr
화학적 안정성
1.0 M NaOH (2O℃) 2,000 시간 이하
1.0 M HCl (2O℃) 200 시간 이하
부피 변화
pH 4-10 <5%
0.01-1.0 M NaCl <5%
pH 안정성 1-14
강 음이온 교환체 Q Sepharose HP의 특성은 하기와 같다:
이온 용량 0.14-0.20 mmol Cl-/㎖
동적 용량 70 ㎎ BSA/㎖ 매질
권장 유속 30-150 ㎝/h
작동 중 충전층에 대한 최대 압력(Max. pressure over the Packed bed during operation) 3 bar (42 psi, 0.3 ㎫)
하이로드 컬럼 하드웨어 압력 한계(HiLoad hardware pressure limit)
5 bar (73 psi, 0.5 ㎫)
평균 입자 크기 34 ㎛
배제 한계(Exclusion limit)(Mr) 약 4 x 106 구상 단백질
매트릭스 가교결합 아가로오스, 6%
pH 안정성 2-12 (작동 및 장기간),
1-14 (단기간)
화학적 안정성 모든 통상적으로 이용되는 완충액에서 안정함
기능기로서 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 디메틸아미노에틸(DMAE)에 기초하는 것과 같은 약 음이온 교환 수지의 이용을 피하는 것이 바람직하다.
음이온 교환 크로마토그래피 단계는 미알칼리성(mildly alkaline) pH, 예를 들면 7.0 또는 약 7.0 내지 9.0 또는 약 9.0, 또는 7.5 또는 약 7.5 내지 8.5 또는 약 8.5의 pH를 갖는 완충액을 이용하여 수행하는 것이 바람직하다. 적절한 완충액은, 예를 들면, 보레이트 완충액, 트리에탄올아민/이미노디아세트산 Tris, 암모늄 아세테이트, 트리신(tricine), 바이신(bicine), TES, HEPES, TAPS를 포함한다. Tris 완충액의 이용이 바람직하다. 음이온 교환 수지로부터 용리는 염, 바람직하게는 염화나트륨의 첨가를 통하여, 이동상의 전도도를 증가시킴으로써 일반적으로 이루어진다.
본 발명의 방법의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 상대적으로 약한 소수성 표면(역상 수지의 훨씬 더 강한 소수성 표면과 비교하여)을 갖는 HIC 수지를 이용하여 수행될 수 있다. 소수성 표면 특성을 갖는 단백질은 통상적으로 에테르, 페닐, 부틸 또는 헥실기를 갖는 그러한 수지에 끌린다.
HIC는 모든 통상적인 시판 HIC 수지에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여 이용될 수 있는 HIC 수지는 Butyl, Phenyl, Propyl 또는 Octyl Sepharose, SOURCE 15(GE Healthcare, Germany로부터 입수 가능), Macro-Prep Methyl 또는 t-butyl HIC 지지체(Bio-Rad, Germany) 또는 프로필 또는 페닐 리간드를 갖는 Frutogel EMD(Merck AG, Germany), Toyopearl Butyl 650 M 및 유사한 HIC 수지(Tosoh Bioscience)와 같은 Toyopearl HIC 수지와 같은 매트릭스를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐, 부틸 또는 옥틸기로 유도체화된(derivatized) 가교결합 아가로오스 비드(cross-linked agarose beads)로 이루어진 수지, 또는 유사한 특성을 갖는 수지를 이용하여 수행된다. Phenyl Sepharose 6 FF(GE Healthcare)의 특성은 하기에 주어진다:
리간드 밀도
Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow (low sub) 25 ㎛ol/㎖ 매질
Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow (high sub) 40 ㎛ol/㎖ 매질
결합 용량
Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow (low sub) 10 ㎎ IgG/㎖ 매질
24 ㎎ HSA/㎖ 매질
Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow (high sub) 30 ㎎ IgG/㎖ 매질
36 ㎎ HSA/㎖ 매질
압력/flow spec. 200-400 ㎝/h, 1 bar XK 50/60 컬럼, 층 높이(bed height) 25 ㎝
pH 안정성 2-14 (단기), 3-13 (장기)
화학적 안정성 통상적인 완충액, 카오트로픽제(chaotropic agents), 세제 및 극성 유기 용매에서 안정함
평균 입자 크기 90 ㎛
저장 20% 에탄올
저장 온도 4℃ 내지 30℃
HIC 수지에 대한 결합은 염(예를 들면, NaCl, (NH4)2SO4 또는 Na2SO4)의 첨가를 통하여 얻어지는, 높은 전도도를 갖는 완충액에서 이루어진다. HIC 단계에서 용리는 5 또는 약 5 내지 9 내지 약 9, 더욱 바람직하게는 6 또는 약 6 내지 8 또는 약 8, 가장 바람직하게는 7 또는 약 7 내지 8 또는 약 8의 pH를 갖는 완충액을 이용하여, 이동상의 전도도를 감소시킴으로써(즉, 염 농도를 감소시킴으로써) 일반적으로 수행된다.
평형 완충액, 세척 완충액 및 용리 완충액은 HIC에 대하여 일반적으로 이용되는 모든 완충액 형태를 포함할 수 있다. 따라서, 완충제는 인산나트륨, 아세트산나트륨, Tris/HCl, HEPES, 또는 다른 완충제를 포함한다. 또한, 완충액이 평형, 세척 또는 용리에 이용되는지에 따라, 완충액은 0.5 mM 내지 3 M의 NaCl, KCl 또는 다른 적절한 염을 함유할 수 있다. 평형 및 세척 완충액은 용리 완충액보다 더 높은 농도의 전술한 염을 포함한다.
HIC 단계에서 특히 바람직한 완충액은 염화나트륨을 함유하는 Tris/HCl이다.
본 발명의 방법의 염료 친화성 크로마토그래피는 고정된 리간드로서, 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 염료 화합물, 즉 Cibacron Blue F3G-A를 갖는 수지를 이용하여 수행될 수 있다. 용어 "고정된(immobilized)"은 통상의 기술자에게 잘 이해되는 것으로, 수지에 화학적으로 결합된다는 점에서 리간드가 유도체화된 것을 의미한다.
바람직한 실시형태에서, 염료 친화성 크로마토그래피는 임의의 매트릭스, 예를 들면 아가로오스 매트릭스에 공유결합된, 리간드로서 Cibacron Blue F3G-A에 의하여 수행된다. 바람직하게는, 염료 친화성 크로마토그래피는 Blue Sepharose FF (GE Healthcare, Germany로부터 입수 가능)로 알려진 수지를 이용하여 수행된다. Blue Sepharose FF의 기술적 특징은 하기에 주어진다:
리간드 Cibacron Blue F3G-A
리간드 결합 방법 트리아진 결합(Triazine coupling)
결합 용량 > 18 ㎎ 인간 혈청 알부민/㎖ 매질
리간드 밀도 ≒ 7 ㎛ol Cibacron Blue/㎖ 매질
매트릭스 고 가교결합 아가로오스, 6%
평균 입자 크기 90 ㎛
pH 안정성 4-12 (장기), 3-13 (단기)
저장 20% 에탄올, 0.1 M 인산칼륨 완충액, pH 8.0
저장 온도 4℃ 내지 30℃
화학적 안정성 70% 에탄올, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 8 M 요소에서 7일 동안 4O℃
본 발명의 방법의 염료 친화성 크로마토그래피는 유사한 특성을 갖는 대안적인 수지에 의해서 수행될 수 있는 것으로 이해된다. 대안적인 수지의 예는 Toyopearl AF-blue-HC-650M(Tosoh Biosciences), Blue Cellthru BigBead(Sterogene), SwellGel Blue(Pierce), Cibachrome blue 3GA-Agarose 100(Sigma), Affi-Gel Blue(Bio-Rad), Econo-Pac blue cartridges(Bio-Rad), Cibacron Blue 3GA(Sigma)를 포함한다.
고정된 염료 친화성 크로마토그래피의 단계에서 용리는 Tris/HCl 완충액 또는 인산염 완충액을 이용하여 수행되는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 것은 염화나트륨을 함유하는 Tris/HCl 완충액이다. 용리액의 pH는 바람직하게는 7 또는 약 7 내지 9 또는 약 9이며, 가장 바람직한 pH는 7 내지 9의 범위이다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 또는 FSH 변이체의 정제 방법은 상기 FSH 또는 FSH 변이체를 함유하는 액체를 임의의 순서로 수행될 수 있는,
- 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계,
- 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계,
- 염료 친화성 크로마토그래피하는 단계, 및
추가적으로 양이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하며, 이 방법은 임의의 약 음이온 교환 크로마토그래피 및 임의의 역상 크로마토그래피를 피한다.
일 실시형태에서, 단계들은 하기 순서로 수행된다: (1) 음이온 교환 크로마토그래피, (2) 소수성 상호작용 크로마토그래피, (3) 염료 친화성 크로마토그래피, 및 (4) 양이온 교환 크로마토그래피.
양이온 교환 크로마토그래피(CEC)는 샘플 중의 단백질과 수지에 고정된 전하 사이의 전하-전하 상호작용에 의존한다. 양이온 교환 크로마토그래피에서, 단백질의 결합 이온은 양전하이며, 고정된 기능기는 음전하이다. 통상적으로 이용되는 양이온 교환 수지는 S-수지, 황산염 유도체, 및 CM(카르복시메틸) 수지, 카르복실화 유래 이온(carboxylated derived ions)이다.
그러나, 일반적으로 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 모든 통상적인 시판 양이온 교환 수지 또는 막에 의하여 수행될 수 있다. 양이온 교환 수지는 기능기, 예를 들면, 술폰산이 고정된 미리 부어진(pre-poured) 컬럼 또는 막 형태로 이용될 수 있다. 대안으로 컬럼은 자기-제조(self-prepared)될 수 있다. 보통의 것 이외에 컬럼의 용량 및 기하학적 구조에 대하여는 특정한 제한이 없다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 이용되는 양이온 교환 수지의 양이 세포 배양액 또는 임의의 다른 유체, 예를 들면, 선행하는 크로마토그래피 단계의 용리액의 전체 단백질 함량에 의존하는 것을 알고 있다.
본 발명의 목적을 위하여 이용될 수 있는 전형적인 양이온 교환 수지는 GE Healthcare 및 이온 크로마토그래피 악세서리 및 컬럼의 다른 제조사로부터 입수 가능하다. 통상적으로, CEC는 4 내지 7의 pH인 완충액을 이용하여 수행된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법의 양이온 교환 단계는 막 양이온 교환(membrane cation exchange)으로 수행된다. 바람직하게는, 양이온 교환 단계는 막에 고정된 강산성 양이온 교환체인 술폰산, 또는 유사한 특성을 갖는 교환체에 의하여 수행된다.
본 발명의 양이온 교환 단계에 이용되는 적절한 막 흡착제는 기술분야에 알려져 있으며, 몇몇 공급자로부터 입수 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 방법의 양이온 교환 크로마토그래피는 재생 셀룰로오스로 만들어지고, 셀룰로오스 골격에 형성된 술폰산의 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 막을 이용하여 수행될 수 있다. 유용한 막 흡착제의 예는 Sartorius로부터 판매되는 Sartobind S membrane Adsorbers이다. Sartobind S membrane Adsorbers의 기술적 데이터는 하기에 주어진다.
명칭 Sartobind SingleSep® (강산 양이온 교환체 S)
리간드 술폰산(R-CH2-SO3 -)
정적 결합 용량(static binding capacity)
≥ 0.8 ㎎/㎠(29 ㎎/㎖), 소 혈청 알부민 및 계란 리소자임으로 측정됨
이온 용량 4-6 μeq/㎠
막
기초 물질 안정화된 강화 셀룰로오스
막 두께 275 ㎛
공칭공경(Nominal pore size) > 3 ㎛
캡슐
설계 원통형, 층의 공칭수: 15
층 높이 4 ㎜
캡슐 물질 폴리프로필렌(FDA)
최대 압력 0.4 ㎫ (4 bar, 58 psi)
pH 안정성 3-14 (단기)
저장 1회 사용후 폐기
화학적 안정성 크로마토그래피에 통상적으로 사용되는 모든 완충액, 1 M NaOH(20℃에서 30-60분), 8 M 요소, 8 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 에탄올, 아세톤, 및 100% 아세토니트릴에서 안정함. 산화제를 피해야 함.
CEC 단계는 제조자의 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면 Tris-HCl 완충액은 pH 7.0에서 이용될 수 있다.
CEC 단계, 바람직하게는 양이온 막 흡착제 단계는 공정 시간은 짧게 유지하면서 모든 분자 크기의 숙주 세포 단백질을 제거하는 것으로 발견되었다. FSH는 pH 7.0에서 흡착제에 결합하지 않기 때문에 약 95%의 수율이 매우 유리하다.
일반적으로, 크로마토그래피 막 형태의 양이온 교환 크로마토그래피는 재조합 FSH 또는 FSH 변이체의 정제에 매우 유용한 것으로 발견되었다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 FSH 또는 FSH 변이체의 정제 방법에서의 양이온 막 흡착제의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 양이온 막 흡착제는 재생 셀룰로오스로 만들어지고, 셀룰로오스 골격에 형성된 술폰산의 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 양이온 교환체 흡착제, 바람직하게는 강 양이온 교환 흡착제이다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 또는 FSH 변이체의 정제 방법은 상기 FSH 또는 FSH 변이체를 함유하는 액체를 임의의 순서로 진행될 수 있는,
- 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계,
- 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계,
- 염료 친화성 크로마토그래피하는 단계,
- 선택적인 양이온 교환 크로마토그래피하는 단계, 및
추가적인 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 더 포함하며, 이 방법은 임의의 약 음이온 교환 크로마토그래피 및 임의의 역상 크로마토그래피를 피한다.
일 실시형태에서, 단계들은 하기 순서로 수행된다: 제1 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 염료 친화성 크로마토그래피, 선택적인 양이온 교환 크로마토그래피, 및 제2 음이온 교환 크로마토그래피.
제2 음이온 교환 크로마토그래피는 제1 음이온 교환 크로마토그래피와 관련하여 전술한 전형적인 음이온 교환 수지를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 제2 음이온 교환 크로마토그래피는 -N+(CH3)3 기능기를 갖는 강 음이온 교환 수지 또는 유사한 특성을 갖는 수지를 이용하여 수행되는 강 음이온 교환 크로마토그래피인 것이 바람직하다. 본 발명의 목적을 위하여 이용될 수 있는 강 음이온 교환 수지의 바람직한 예는 UNOsphere Q, Q Sepharose HP 및 4급 암모늄 (Q) 부분을 갖는 다른 수지로 기술분야에 알려진 4급 암모늄 강 음이온 교환체 수지이다. 강 음이온 교환체 UNOsphereQ 및 Q Sepharose HP의 특성은 제1 음이온 교환 크로마토그래피와 관련하여 상기한 바와 같다. 또한, 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서, 기능기로서 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 디메틸아미노에틸(DMAE)에 기초하는 것과 같은 약 음이온 교환 수지의 이용을 피하는 것이 바람직하다.
음이온 교환 크로마토그래피 단계는 미알칼리성 pH, 예를 들면 7.0 또는 약 7.0 내지 9.0 또는 약 9.0, 또는 7.5 또는 약 7.5 내지 8.5 또는 약 8.5의 pH를 갖는 완충액을 이용하여 수행하는 것이 바람직하다. 적절한 완충액은 예를 들면 보레이트 완충액, 트리에탄올아민/이미노디아세트산 Tris, 암모늄 아세테이트, 트리신, 바이신, TES, HEPES, TAPS를 포함한다. Tris 완충액의 이용이 바람직하다. 음이온 교환 수지로부터의 용리는 염, 바람직하게는 염화나트륨의 첨가를 통하여 이동상의 전도도를 증가시킴으로써 일반적으로 이루어진다.
일 실시형태에서, 제2 음이온 교환 크로마토그래피는 7.0 내지 9.0 범위의 pH에서 용리액으로서 Tris-HCl / 염화나트륨 완충액을 이용하여 수행된다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 또는 FSH 변이체의 정제 방법은 상기 FSH 또는 FSH를 함유하는 액체를 임의의 순서로 수행될 수 있는
- 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계,
- 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, 및
- 염료 친화성 크로마토그래피하는 단계를 포함하며, 이 방법은 임의의 약 음이온 교환 크로마토그래피 및 임의의 역상 크로마토그래피를 피하며, 이 방법은 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 더 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 또는 FSH 변이체의 정제 방법은 상기 FSH 또는 FSH 변이체를 함유하는 액체를 임의의 순서로 수행될 수 있는
- 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계,
- 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계,
- 염료 친화성 크로마토그래피하는 단계,
- 선택적인 양이온 교환 크로마토그래피하는 단계,
- 선택적인 추가적 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계, 및
- 크기 배제 크로마토그래피하는 단계를 포함하며, 이 방법은 임의의 약 음이온 교환 크로마토그래피 및 임의의 역상 크로마토그래피를 피한다.
일 실시형태에서, 단계들은 하기 순서로 수행된다: 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 염료 친화성 크로마토그래피, 선택적인 양이온 교환 크로마토그래피, 선택적인 추가적 음이온 교환 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 하기 단계들을 하기 순서로 포함한다: 제1 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 염료 친화성 크로마토그래피, 선택적인 양이온 교환 크로마토그래피, 선택적인 제2 음이온 교환 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피.
겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)로도 알려진 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 입자, 예를 들면, 단백질과 다른 바이오분자들이 그 크기에 기초하여 분리되는 크로마토그래피 방법이다. SEC에 대한 전형적인 겔 매질은 폴리아크릴아미드, 덱스트란, 아가로오스 또는 그 혼합물이다. SEC 매트릭스는 크로마토그래피 악세서리 및 컬럼의 다양한 제조자, 예를 들면, Tosoh Bioscience LLC 또는 GE Healthcare로부터 입수 가능하다.
크기 배제 크로마토그래피는 가교결합 아가로오스 및 덱스트란의 구형 복합체의 매트릭스를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.
유용한 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 예는 예를 들면, GE Healthcare로부터 입수 가능한 Superdex 75 pg로 알려져 있는 매트릭스이다. Superdex 75 pg 컬럼에 의하여, 크기에 따라 단백질, 펩타이드, 및 다른 바이오분자들의 고분리도(high-resolution) 분리가 가능해진다. 일반적으로, 크기 배제 컬럼은 정제 과정에서 폴리싱(polishing) 단계에 대하여 이상적이다.
Superdex 75 pg 매트릭스의 기술적 사양은 하기와 같다:
배제 한계(Mr) 1 × 105 구상 단백질
분리 범위(Mr) 3000-70000 구상 단백질
매트릭스 가교결합 아가로오스 및 덱스트란의 구형 복합체
평균 입자 크기 34 ㎛
화학적 안정성 모든 통상적인 완충액:
1 M 아세트산, 8 M 요소,
6 M 구아니딘 하이드로클로라이드,
30% 이소프로필 알코올, 70% 에탄올,
1 M NaOH (제자리 세정(cleaning in place)용)
pH 안정성 3-12 (작동 및 장기), 1-14 (단기)
Superdex™ 10/300 GL 컬럼 (Tricorn)*
층 치수(Bed mensions) 10 × 300 ㎜
권장 샘플 부피 25-250 ㎕
층 부피(Bed volume) 24 ㎖
최대 압력 18 bar (261 psi, 1.8 ㎫)
최대 유속(25℃에서 H2O) 1.5 ㎖/min
이론적 플레이트(Theoretical plates) > 30000 m-1
Superdex™ PC 3.2/30 컬럼
층 치수 3.2 × 300 ㎜
층 부피 2.4 ㎖
권장 샘플 부피 2-25 ㎕
최대 압력 24 bar (348 psi, 2.4 ㎫)
최대 흐름 속도(25℃에서 H2O) 0.100 ㎖/min
이론적 플레이트 > 30000 m-1
저장 20% 에탄올
저장 온도 4℃ 내지 30℃
SEC 단계는 제조자의 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 인산나트륨 완충액은 pH 6 내지 8, 바람직하게는 약 pH 7.0에서 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다: 제1 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 염료 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 제2 음이온 교환 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법의 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 막 양이온 교환으로 수행된다. 바람직하게는, 양이온 교환 단계는 막에 고정된 강산성 양이온 교환체 술폰산, 또는 유사한 특성을 갖는 교환체에 의하여 수행된다.
또한, 본 발명의 방법은 일 이상의 한외여과(ultrafiltration) 및/또는 나노여과(nanofiltration) 단계를 포함한다. 한외여과는 유체정역학적 압력이 액체를 반투과성 막으로 미는 막 여과의 형태이다. 고분자량의 현탁된 고체 및 용질은 보유되고, 반면에 물 및 저분자량 용질은 막을 통과한다. 한외여과는 거대분자 용액, 특히 단백질 용액의 정제 및 농축에 통상적으로 이용되는 방법이다. 한외여과는 나노여과와 유사하나, 보유하는 분자 크기 측면에서 차이가 있다. 본 발명의 틀에서, 10 kDa의 분자량 컷오프(cut off)가 바람직하다(10 kDa UF). UF 막은 반복적이거나 연속적인 희석 및 재농축을 통하여 용액으로부터 염 및 다른 미세종들을 제거하기 위한 정용여과(diafiltration)에 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 정제 방법은 일 이상의 한외여과/정용여과 및/또는 나노여과 단계를 포함한다. 이러한 여과 단계는 시판 여과 장치, 예를 들면, GE Healthcare 또는 Sartoriusese로부터 입수 가능한 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
한외여과는 Sartorius에 의하여 판매되는 Sartocon 카세트 및 Sartocon Slice 카세트를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.
막 폴리에테르술폰(PESU) 또는 Hydrosart®
분자량 컷오프 1O kD
필터 영역 0.02 내지 0.7 ㎡
주입 압력 4 bar (58 psi) 최대
pH 안정성 1-14
작동 온도 5O℃ 최대, 20℃에서
세정 1 M NaOH, 40℃
소독 1 M NaOH, 40-50℃, 30분
저장 0.1 M NaOH
Sartorius에 의해 판매되는 직교류 카세트(crossflow cassettes)에 이용되는 폴리에테르술폰 막(PESU)은 광범위한 pH 및 온도 범위를 특징으로 하는 안정한 막 중합체이다.
Sartorius에 의해 판매되는 Hydrosart® 한외여과 카세트도 이용될 수 있다. Hydrosart는 생명공학 적용에 최적화된 안정화된 셀룰로오스 기반 막이다. Hydrosart 한외여과 막 및 카세트는 하기 분자량 컷오프로 이용가능하다: 2 kD, 5 kD, 10 kD 및 3O kD.
바람직한 실시형태에서, 정제 방법은 나노여과 단계를 포함한다. 나노여과는 임의의 유용한 나노-필터 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 나노여과는 Asahi Kasei Medical Co., Ltd.로부터 입수 가능한 플라노바 필터(Planova filter)를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.
플라노바 필터는 생물 약제와 같은 바이오치료 의약품 제조 중에 바이러스를 제거하도록 설계된다. 이들은 좁은 기공 분포를 갖는, 천연 소수성 쿠프르암모늄(cuprammonium) 재생 셀룰로오스로 구성된 중공섬유 미세다공성 막(hollow-fiber microporous membrane)에 기초한다. 플라노바 필터는 15 ㎚, 19 ㎚, 35 ㎚, 및 72 ㎚의 4개의 평균 기공 크기의 1회용(single-use), 독립된(self-contained) 모듈로 이용가능하다(각각 Planova 15N, 2ON, 35N, 및 75N). 본 발명의 방법에서, Planova 15N 필터, 즉 15 ㎚의 평균 기공 크기를 갖는 필터를 이용하는 것이 바람직하다. 필터는 공급자의 프로토콜에 따라 이용된다.
본 발명에 따른 FSH 정제 방법은 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 방법은 면역친화성 크로마토그래피를 피하는 것이 바람직하다. 면역친화성 크로마토그래피 단계가 없는 FSH의 정제는 항체 제조로부터 유래되는 불순물 또는 감염원과 FSH 화합물의 가능한 간섭을 제거한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 상기 FSH 또는 FSH 변이체를 함유하는 액체를 막 양이온 교환체에 적용하는 단계를 포함하는, 재조합 FSH 또는 재조합 FSH 변이체의 정제 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시형태에서, 막 양이온 교환체는 막에 고정된 강산성 양이온 교환체 술폰산, 또는 유사한 특성을 갖는 교환체이다.
본 발명의 방법에 이용되는 적절한 막 흡착제는 기술분야에 알려져 있고, 몇몇 공급자로부터 입수 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 방법의 양이온 교환 크로마토그래피는 재생 셀룰로오스로 만들어지고, 셀룰로오스 골격에 형성된 술폰산의 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 막을 이용하여 수행될 수 있다. 유용한 막 흡착제의 예는 Sartorius에 의해 판매되는 Sartobind S membrane Adsorbers이다. 그 기술적 사양은 상기한 바와 같다.
다른 실시형태에서, FSH를 함유하는 액체를 막 양이온 교환체에 적용하는 단계를 포함하는 재조합 FSH 또는 재조합 FSH 변이체의 정제 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 더 포함한다.
본 발명의 방법의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 상기 FSH 또는 FSH 변이체를 함유하는 액체를 임의의 순서로 수행될 수 있는 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계, 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, 및 염료 친화성 크로마토그래피하는 단계를 포함하며, 약 음이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 포함하지 않는 재조합 FSH 또는 재조합 FSH 변이체의 정제 방법 및 그의 바람직한 실시형태에 관하여 전술한 바와 같이 수행될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐 또는 부틸기로 유도체화된 가교결합 아가로오스 비드로 이루어진 수지, 또는 유사한 특성을 갖는 수지를 이용하여 수행된다.
다르게 표시되지 않으면, 하기 정의는 본 발명의 설명하기 위하여 사용된 다양한 용어의 의미 및 범위를 예증하고 정의하기 위한 것으로 의도된다.
용어 "FSH"는 재조합적으로 제조되었든지, 또는 폐경후 여성의 소변과 같은 인간 근원으로부터 분리된 것이든지, 인간 FSH 또는 "hFSH"를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 전장 성숙 단백질로서 여포 자극 호르몬 폴리펩타이드를 나타낸다. 인간 당단백질의 단백질 서열 및 인간 FSH β-서브유닛의 단백질 서열은 과학적 문헌 및 특허문헌(예를 들면, WO 2004/087213 참조)으로부터 통상의 기술자에게 알려져 있다.
인간 FSH의 α-사슬의 아미노산 서열은 본 명세서에 첨부된 서열식별번호 1로 나타내어지며, 인간 FSH의 β-사슬의 아미노산 서열은 본 명세서에 첨부된 서열식별번호 2로 나타내어진다. 이 아미노산 서열은 각각 EMBL database에 수탁번호 J 00152, 및 NCBI database에 수탁번호 NM 000510로 수탁된 인간 FS의 α-사슬 및 β-사슬의 야생형 아미노산 서열에 상응한다.
인간 FSH을 코딩하는 야생형 핵산 서열은 서열식별번호 3(α-사슬) 및 서열식별번호 4(β-사슬)로 나타내어진다.
재조합 FSH는 인간에서 자연적으로 발견되는 야생형 핵산 서열에 의하여 코딩될 수 있거나, 또는 그 발현이 야생형 아미노산 서열을 갖는 FSH, 즉 인간에서 자연적으로 발견되는 야생형 단백질 서열에 이르게 되는 변형된 핵산 서열에 의하여 코딩될 수 있다.
인간 FSH를 코딩하는 핵산 서열은 예를 들면, 인간 FSH의 α- 및 β-사슬을 코딩하는 핵산의 하나 또는 양쪽이 숙주 세포에서 재조합 FSH의 발현 수준 및 수율을 증가시키기 위하여, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 코돈 선호도(codon usage)에 적응되는 방식으로 변형될 수 있다.
인간 FSH를 코딩하고, CHO 세포에서 코돈 선호도에 관하여 변형된 핵산 서열의 예는 국제공개공보 WO 2009/000913에 기재되어 있다. 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열은 서열식별번호 5로 나타내어진 핵산 서열의 코딩 영역(coding region)이고(서열식별번호 5에서, 코딩 영역은 뉴클레오타이드 56에서 시작하여, 뉴클레오타이드 442까지 연장됨), 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 변형된 핵산 서열은 서열식별번호 6으로 나타내어진 핵산 서열의 코딩 영역이다(서열식별번호 6에서, 코딩 영역은 뉴클레오타이드 19에서 시작하여 뉴클레오타이드 366까지 연장됨). 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 제1 변형 핵산 서열 및 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 제2 변형 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 함유하는 CHO 세포주는 수탁번호 DSM ACC2833로 Braunschweig의 DSMZ에 2007년 3월 28일자에 기탁되었다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 FSH 액체 포뮬레이션은 인간 FSH의 β-사슬 및 인간 FSH의 α-사슬에 대하여 CHO 세포에서 코돈 선호도에 관하여 변형된 FSH 핵산 서열로부터 재조합 유전자 발현에 의해 얻어진 재조합 인간 야생형 FSH를 함유한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 재조합 FSH는 WO 2009/000913에 개시된 FSH 핵산 서열로부터 발현에 의해 얻어진다.
표현 "FSH 변이체"는 인간 FSH와 아미노산 서열, 글리코실화 패턴, 또는 서브유닛간 연결(inter-subunit linkage)이 상이하나, FSH 활성을 나타내는 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 예는 LaPoIt et al. (1992) Endocrinology, 131, 2514-2520 또는 Klein et al. (2003) Human Reprod., 18, 50-56에 기재된, 야생형 α-서브유닛, 및 hCG의 카르복시 말단 펩타이드가 FSH의 β-서브유닛의 C-말단에 융합된(fused) 하이브리드 β-서브유닛으로 이루어진 지속작용성(long-acting) 변형 재조합 FSH인 CTP-FSH를 포함한다. 또한, Klein et al. (2002) Fertility & Sterility, 77, 1248-1255에 기재된 단일 사슬 분자인 단일-사슬 CTP-FSH도 포함된다. FSH 변이체의 다른 예는 WO 01/58493에 개시된 α- 및/또는 β-서브유닛에 포함된 부가적인 글리코실화 자리를 갖는 FSH 분자, 및 WO 98/58957에 개시된 서브유닛간(inter-subunit) S-S 결합을 갖는 FSH 분자를 포함한다. FSH 변이체의 다른 예는 WO 2004/087213에 개시되어 있으며, 이는 β-서브유닛의 카르복시 말단 결실(deletions)을 특징으로 한다. FSH 변이체의 다른 예는 부가적인 글리코실화 자리가 도입되거나, 자연 발생 글리코실화 자리가 결실되는, 단백질의 아미노산 서열의 변화에 기인하여 야생형 FSH에 비하여 변화된 정도의 글리코실화를 갖는 FSH 분자를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 FSH 또는 FSH 변이체는 화학적 부분(chemical moiety)에 의해 변형된 FSH 분자일 수 있다. 그러한 FSH 컨주게이트(conjugates)는 예를 들면, 폴리알킬렌글리콜(PEG 등), 하이드록시알킬 전분(HES 등) 또는 다른 중합체 부분을 포함한다.
FSH 헤테로다이머(heterodimers) 또는 FSH 변이체 헤테로다이머는 재조합 등과 같은 임의의 적절한 방법에 의하여, 천연 근원으로부터의 분리 또는 정제에 의하여, 또는 화학 합성에 의하여, 또는 그 임의의 조합에 의하여 제조될 수 있다.
용어 "재조합"의 이용은 재조합 DNA 기술의 이용을 통하여 제조된 FSH 또는 FSH 변이체의 제조를 나타낸다(예를 들면 WO 85/01958 참조). FSH의 게놈 및 cDNA 클론의 서열은 몇몇 종의 α- 및 β-서브유닛에 대하여 알려져 있다. 재조합 기술을 이용하여 재조합 FSH 또는 FSH 변이체를 제조하는 다양한 방법은 선행기술에 기재되어 있으며, 예를 들면 유럽특허출원 EP 0 711 894 및 유럽특허출원 EP 0 487 512를 참조한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 정제된 FSH는 서열식별번호 1에 따른 알파 서브유닛 및 서열식별번호 2에 따른 베타 서브유닛을 갖는다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 정제 방법에 의하여 얻어진 정제된 FSH 또는 FSH 변이체 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 정제된 FSH 또는 FSH 변이체 및 약학적으로 허용가능한 부형제(excipient)를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 약학적 조성물은 보존제를 함유하고, 다중-용량 투여(multi-dose administration)에 이용될 수 있다. 바람직한 약학적 조성물은 PCT/EP2009/051451에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 생식 장애(fertility disorders) 치료를 위한, 본 발명의 방법을 이용하여 정제된 FSH 또는 FSH 변이체의 용도, 또는 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합된 상기 FSH 또는 FSH 변이체를 포함하는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
재조합 인간 FSH는 본 발명의 방법에 의하여 숙주 세포 배양 상청액으로부터 정제된다. 재조합 인간 FSH 또는 FSH 변이체는 WO 2009/000913에 기재된 바와 같이 제조되는 것이 바람직하다.
FSH는 가장 바람직하게는, 재조합적으로 제조된, 특히 바람직하게는 서열식별번호 3 및 4(= 야생형 핵산 서열)에 의하여, 또는 서열식별번호 5 및 6(= 코돈-최적화(codon-optimized) 핵산 서열)에 의하여 코딩된 FSH의 인간 당단백질 α- 및 β-서브유닛을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터 또는 벡터들로 형질감염된(transfected) 중국 햄스터 난소 세포에서 제조된 인간 FSH이다. α- 및 β-서브유닛을 코딩하는 DNA는 동일하거나 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
재조합 FSH는 그의 소변 대응물에 비하여 몇몇 이점을 갖는다. 재조합 세포를 이용하는 배양 및 분리 기술은 배취(batches) 간에 일관성(consistency)이 가능해진다. 반대로, 소변 FSH는 순도, 글리코실화 패턴, 서브유닛의 시알산화(sialylation) 및 산화와 같은 특징에 있어서 배취간에 매우 다르다. 더 높은 배취-대-배취 일관성 및 재조합 FSH의 순도에 의하여, 호르몬은 등전 집중법(isoelectric focussing(IEF))과 같은 기술을 이용하여 확인 및 정량화될 수 있다. 재조합 FSH의 확인 및 정량화의 간편성에 의하여 생분석에 의한 주입(filling by bioassay)보다 호르몬 질량에 의한 유리병의 주입(fill-by-mass)이 가능하게 된다.
용어 "FSH 활성"은 Steelman-Pohley 분석에서의 난소 중량 증가(Steelman et al. (1953) Endocrinology 53, 604-616), 또는 여성 환자의 여포 성장과 같은 FSH와 관련된 생물학적 반응을 유도하는 FSH 제제의 능력을 나타낸다. 여성 환자의 여포 성장은 예를 들면, 자극 8일째에 약 16 ㎜의 평균 직경을 갖는 여포의 수 측면에서 초음파에 의하여 평가될 수 있다. 생물학적 활성은 FSH에 대하여 허용되는 표준에 대하여 평가된다.
재조합 FSH의 특정한 생체 내(in vivo) 생활성(bioactivity)은 일반적으로 약 8,000 IU FSH/㎎ 단백질 내지 약 16,000 IU FSH/㎎ 단백질의 범위이다. 예를 들면 시판 제품 Puregon(Organon)에서 재조합 인간 FSH는 약 10,000 IE/㎎ 단백질의 특정 생활성을 가지며, Serono로부터 Gonal-f에 대하여 재조합 인간 FSH의 생활성은 약 13,600 IE/㎎ 단백질이다.
FSH 활성은 FSH 및 다른 생식선자극호르몬에 관련된 공지 방법에 의해 결정될 수 있다. 그러한 방법은 예를 들면 효소 면역활성 분석(enzyme immunoactivity assay(EIA)) 또는 리포터 유전자 분석(reporter gene assays)을 포함한다. 생활성은 소변 유래 FSH에 대하여, 유럽약전 5판(European Pharmacopoeia, 5th Edition)에 기재된 생분석에 의하여 일반적으로 결정되며, 생활성은 융모막 생식선자극호르몬으로 치료받은 미성숙 쥐의 난소 확대에 있어서 FSH의 효과를 표준 제제의 동일한 효과와 비교함으로써 산출된다.
FSH 또는 FSH 변이체의 생물학적 활성은 소정 조건 하에서, 융모막 생식선자극호르몬으로 치료받은 미성숙 쥐의 난소 확대에 있어서의 효과를 국제 표준 제제(International Standard preparation)를 이용하거나 또는 국제 단위(International Units)로 보정된 참조 제제의 동일한 효과와 비교함으로써 평가될 수 있다(유럽 약전, 5판).
시험관 내에서 FSH 활성의 측정은 예를 들면, Albanese et. al. (1994) Mol. Cell Endocrinol. 101:211-219에 의해 기재되어 있다.
본 발명의 방법에 의해 얻어진 FSH 또는 FSH 변이체의 순도는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 99%보다 크다. 순도의 정도는 HPLC 분석에 의하여 결정될 수 있다. 그러한 분석을 수행하기 위한 적절한 재료 및 프로토콜은 Vydac 또는 TOSOH Bioscience와 같은 상업적 공급자로부터 얻어질 수 있다.
하기 실시예들은 단지 본 발명의 정제 방법을 더욱 분명히 나타내기 위하여 제공된다. 본 발명의 범위는 하기 실시예로만 이루어지는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1
재조합 기술에 의한 재조합 인간 FSH의 제조
재조합 인간 FSH는 표준 방법에 의하여 형질감염된 CHO 숙주 세포에서 제조된다. 이 방법은 인간 FSH의 α-사슬 및 β-사슬을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로부터 재조합 인간 FSH를 제조하는 CHO 세포 클론의 생성, 및 적절한 조건 하에서 숙주 세포의 배양(cultivation)을 포함한다. 다음으로, 재조합 인간 FSH는 본 발명에 따라 세포 배양물로부터 정제된다.
바람직한 실시형태에서, 재조합 인간 FSH는 WO 2009/000913에 기재된 바와 같이 제조된다.
실시예 2
세포 배양물로부터 FSH의 정제
정제 계획은 하기와 같다:
음이온 교환 크로마토그래피 단계
↓
HIC 단계
↓
염료 친화성 단계
↓
바이러스 비활성화
↓
10 kDa UF/DF
↓
양이온 막 흡착제
↓
음이온 교환 크로마토그래피 단계
↓
1O kDa UF
↓
크기 배제 크로마토그래피 단계
↓
나노여과
발효 기간은 28일이었고, 발효 부피는 30 ℓ이었다. 수확물은 여과된 0.22 ㎛이었고, RO 수(water)로 3.5배로 희석되었다.
음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계:
희석된 세포 배양 상청액 수확물은 UNOsphere Q로 기술분야에 알려진 4급 암모늄 강 음이온 교환체 수지를 이용하는 음이온 교환 크로마토그래피에 적용되었다. 이 매트릭스는 BioRad로부터 입수 가능하다.
50 mM Tris-HCl, pH 7.6의 3개의 컬럼 부피(column volume(CV))가 평형에 이용되었다. 컬럼에 수확물(RO 수로 1:3.5로 희석됨; 수확물 적정농도(titer)는 약 1.8 ㎍ FSH/㎖)임)을 적재하고, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6(5 CV)로 후세척하였다. 다음으로, 컬럼을 50 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, pH 7.6(5 CV)로 세척하고, 단백질을 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7.6(8 CV)를 이용하여 용리하였다. 단계 수율은 90 % 이상이었다.
HIC 단계:
HIC는 페닐로 유도체화된 가교결합 아가로오스 비드로 이루어진 수지를 이용하여 수행되었다. Phenyl Sepharose 6 FF(GE Healthcare로부터 입수 가능)는 아가로오스에 기초하는 고 가교결합 유도체(highly cross-linking derivated)이다. 이는 물리적 및 화학적으로 안정하여 높은 유속 및 증가된 수지 수명을 가능하게 한다. 이 수지의 기술적 사양은 상기에 주어진다.
8개의 AEC 용리액을 모아서, 50 mM Tris-HCl, 4.5 NaCl, pH 7.6로 3배 희석하였다. HIC 컬럼을 50 mM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7.6(4 CV)로 평형시키고, 1:3 희석된 AEC 용리액을 적재하였다. 다음으로, 컬럼을 50 mM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7.6(3 CV)로 후세척하고, 50 mM Tris-HCl, 1.8 M NaCl, pH 7.6(5 CV)로 세척하였다. 1.8 M NaCl을 갖는 세척 완충액은 검출가능한 FSH 손실 없이 우수한 제거율(clearance potential)을 갖는 것으로 나타났다. 다음으로, 단백질을 50 mM Tris-HCl, 0.8 M NaCl, pH 7.6(6 CV)로 용리하였다.
HIC 단계의 FSH 수율은 적재 중에 현저한 손실 없이 95%를 넘었고, 약 10배의 우수한 총 단백질 제거율을 나타내었다. 이 데이터는 개발된 HIC 단계가 상당한 수율 및 생성물 품질을 갖는 매우 효율적인 정제 단계임을 나타낸다.
염료 친화성 크로마토그래피 단계:
GE Healthcare로부터 입수 가능한 Blue Sepharose FF가 염료 친화성 크로마토그래피 단계에 이용되었다. HIC 용리액을 50 mM Tris-HCl, pH 7.6로 4배로 희석하였다. 컬럼을 50 mM Tris-HCl, pH 7.6(3 CV)를 이용하여 평형시키고, 1:4 희석된 HIC 용리액을 적재하였다. 컬럼을 50 mM Tris-HCl, pH 7.6(3 CV)로 후세척하고, FSH 단백질을 50 mM Tris-HCl, 4 M NaCl, pH 7.6(6 CV)로 용리하였다.
친화성 크로마토그래피 후에, 2시간 동안 15 % 2-프로판올에서 용리액을 배양함으로써 바이러스 비활성화 단계를 수행하였다. 이 목적을 위하여, 염료 친화성 크로마토그래피 용리액을 50 mM Tris-HCl, 30 % 2-propanol, pH 7.6로 2배 희석하여, 50 mM Tris-HCl, 15 % 2-propanol, 2 M NaCl, pH 7.6에 이르렀다. 2시간 동안 배양한 후, 바이러스 비활성화된 염료 친화성 크로마토그래피 용리액을 20 mM Tris-HCl, pH 7.0로 2배 희석하였다.
10 kDa UF/DF:
한외여과 및 정용여과는 표준 프로토콜에 따라 일반적으로 수행되었다. 유용한 UF/DF 장치는 Sartorius로부터의 Sartocon ultrafiltration/diafiltration cassettes(폴리에테르술폰 (PESU), 10 kD)이다(필터 영역: 14,000 ㎠, UF 계수: 13-20, DF 계수: 8-10, 적재(load): 0.1 내지 0.5 ㎎ FSH/㎠). UF/DF 장치에 의한 정용여과는 한외여과(농도) 계수 13 내지 20, 및 정용여과 계수 8 내지 10으로 일반적으로 수행되었다.
바이러스 비활성화 염료 친화성 크로마토그래피 용리액을 Tris-HCl 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.0)로 정용여과하고, 양이온 막 흡착제 상에 직접적으로 적재하였다.
양이온 막 흡착제 단계:
본 발명의 방법의 양이온 교환 크로마토그래피는 재생 셀룰로오스로 만들어지고, 셀룰로오스 골격 상에 형성된 술폰산의 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 막을 이용하여 수행되었다. 그러한 막 흡착제는 상표명 Sartobind S membrane adsorber로 Sartorius로부터 입수 가능하다. Sartobind S membrane adsorber는 리간드가 고정화된 몇몇 막층을 갖는 캡슐이다. 막 흡착제는 짧은 공정 시간 및 적은 완충액 부피의 이점을 갖는다. 확인(validation) 비용 및 시간은 단일-사용 아이디어에 기인하여 무시할 수 있다.
막 흡착제를 20 mM Tris-HCl, pH 7.0(200 ㎖)로 평형시키고, 10 kDa UF/DF 농축물(retentate)(약 100 ㎖)을 적재하였다. 흡착제를 20 mM Tris-HCl, pH 7.0(200 ㎖)로 후세척하였다.
막 흡착제 상의 공정은 공정 시간을 단축시키는 이동 모드(flowthrough mode)이다. 또한, 다음 공정 단계(음이온 교환 크로마토그래피)에 대해서 어떠한 적재 조건도 필요하지 않다. 이동(flowthrough)에서 생성물 수율은 매우 우수하였다. 상이한 완충액 시스템에서 pH 6.0, 6.5 및 7.0에서 Sartobind S 모듈에서의 공정 중에 생성물 손실은 사실상 없었다.
양이온 막 흡착제 단계는 HCP (숙주 세포 단백질) 제거(clearance)에 매우 유리하다. 정제되는 FSH는 20 mM Tris-HCl 완충액 시스템에서 pH 7.0에서 흡착제에 결합되지 않기 때문에, 90 내지 95% 수율이 매우 바람직하다.
음이온 교환 크로마토그래피 단계:
제2 음이온 교환 크로마토그래피는 Q Sepharose HP로 기술분야에 알려진 4급 암모늄 강 음이온 교환체 수지를 이용하여 수행되었다. 이 수지는 GE Healthcare로부터 입수 가능하다.
AEC 컬럼을 20 mM Tris-HCl, pH 7.0(3 CV)로 평형시켰다. 막 흡착제 이동 풀(flowthrough pool)을 컬럼(3 CV)에 적재하고, 컬럼을 20 mM Tris-HCl, pH 7.0(2 CV)로 1차 세척한 후, 20 mM Tris-HCl, pH 8.5(3 CV)로 세척하고, 마지막으로 20 mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, pH 8.5(5 CV)로 세척하였다. 다음으로, FSH를 20 mM Tris-HCl, 130 mM NaCl, pH 8.5(6 CV)로 용리하였다.
Q Sepharose HP 용리액은 시판 제품 GONAL-f®과 비교하여 매우 높은 순도를 갖는다.
1O kDa UF:
10 kDa 한외여과를 Sartorius로부터의 Sartocon Ultrafiltreation cassette(PESU, 10 kD)를 이용하여 표준 프로토콜에 따라 수행하였다(필터 영역: 3,000 ㎠, UF 계수: 10-30, 적재: 0.2 내지 1.0 ㎎ FSH/㎠). 한외여과는 한외여과 (농도) 계수 10 내지 30에 의하여 일반적으로 수행되었다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 단계:
크기 배제 크로마토그래피는 GE Healthcare로부터 입수 가능한 Superdex 75 pg를 이용하여 수행되었다. 컬럼을 50 mM Na-PO4, pH 7.0(2 CV)을 이용하여 평형시켰다. 10 kDa UF 농축물(retentate)을 컬럼(0.025 CV)에 적재하고, 컬럼을 50 mM Na-PO4, pH 7.0(2 CV)로 후세척하였다.
SEC 용리액은 시판 제품 GONAL-f®과 동일한 범위의 높은 순도를 갖는다.
나노여과:
마지막으로, SEC 용리액을 평균 기공 크기 15 ㎚인, Asahi Kasei Medical Co., Ltd.에 의해 판매되는 Planova 15N 필터를 이용하여 나노여과하였다. 목표 적재 최대값(load maximum)은 2.5 ㎖/㎠이었다. 여과는 공급자의 프로토콜에 따라 수행되었다.
정제된 FSH의 순도는 SE-HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 측정되었다. 수득된 FSH의 순도 및 특정 불순물은 하기와 같다:
SE-HPLC(다이머 및 고분자량의 관련 물질) < 1 %
SDS-PAGE red. (콜로이드) 순도>97%
HCP (포괄) < 10 ppm
DNA < 0.006 pg/IU FSH
재조합 인간 FSH의 생활성은 적어도 약 10,000 IU/㎎인 것으로 결정되었다. 바람직하게는 재조합 인간 FSH 또는 FSH 변이체의 생활성은 약 10,000 IU/㎎ 내지약 17,000 IU/㎎의 범위이고, 더욱 바람직하게는 생활성은 적어도 약 12,000 IU/㎎이고, 가장 바람직하게는 생활성은 적어도 약 15,000 IU/㎎이다.
서열목록:
서열식별번호 1 : 인간 FSH의 α-사슬의 아미노산 서열
서열식별번호 2: 인간 FSH의 β-사슬의 아미노산 서열
서열식별번호 3: 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 야생형 핵산 서열
서열식별번호 4: 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 야생형 핵산 서열
서열식별번호 5: 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 코돈 최적화된 핵산 서열
서열식별번호 6: 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 코돈 최적화된 핵산 서열
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<213> Homo sapiens
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<221> CHAIN
<222> (1)..(116)
<223> alfa-chain of human FSH
<400> 1
Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro
20 25 30
Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro
35 40 45
Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro
50 55 60
Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu
65 70 75 80
Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly
85 90 95
Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr
100 105 110
Tyr His Lys Ser
115
<210> 2
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(129)
<223> beta-chain of human FSH
<400> 2
Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile
1 5 10 15
Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys
20 25 30
Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly
35 40 45
Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys
50 55 60
Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg
65 70 75 80
Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val
85 90 95
Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys
100 105 110
Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys
115 120 125
Glu
<210> 3
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cttaattaag ccgccagcat ggattactac agaaaatatg cagctatctt tctggtcaca 60
ttgtcggtgt ttctgcatgt tctccattcc gctcctgatg tgcaggattg cccagaatgc 120
acgctacagg aaaacccatt cttctcccag ccgggtgccc caatacttca gtgcatgggc 180
tgctgcttct ctagagcata tcccactcca ctaaggtcca agaagacgat gttggtccaa 240
aagaacgtca cctcagagtc cacttgctgt gtagctaaat catataacag ggtcacagta 300
atggggggtt tcaaagtgga gaaccacacg gcgtgccact gcagtacttg ttattatcac 360
aaatcttaa 369
<210> 4
<211> 474
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
aggatccccg ggctacctcc ccgcggggag gcgcgcccct taattaagcc gccaccatga 60
agacactcca gtttttcttc cttttctgtt gctggaaagc aatctgctgc aatagctgtg 120
agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc ataagcatca 180
acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag gacccagcca 240
ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca gtgagagtgc 300
ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc cagtgtcact 360
gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg cccagctact 420
gctcctttgg tgaaatgaaa gaataaacat gccatggcat gcgagctcga attc 474
<210> 5
<211> 471
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized nucleic acid sequence coding for the beta-chain
of human FSH
<400> 5
aggatccccg ggtacctccc cgcggggagg cgcgcccctt aattaagccg ccaccatgaa 60
gaccctgcag ttcttcttcc tgttctgctg ctggaaggcc atctgctgca acagctgcga 120
gctgaccaac atcaccatcg ccatcgagaa ggaggagtgc aggttctgca tcagcatcaa 180
caccacctgg tgcgccggat actgctacac cagggacctg gtgtacaagg accccgccag 240
gcccaagatc cagaagacct gcaccttcaa ggagctggtg tacgagaccg tgagggtgcc 300
cggctgcgcc caccacgccg acagcctgta cacctacccc gtggccaccc agtgccactg 360
cggcaagtgc gacagcgaca gcaccgactg caccgtgagg ggcctgggcc ccagctactg 420
cagcttcggc gagatgaagg agtaatgacc atggcatgcg agctcgaatt c 471
<210> 6
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized nucleic acid sequence coding for the alfa-chain
of human FSH
<400> 6
cttaattaag ccgccagcat ggactactac aggaagtacg ccgccatctt cctggtgacc 60
ctgagcgtgt tcctgcacgt gctgcacagc gccccagacg tgcaggactg ccccgagtgc 120
accctgcagg agaacccatt cttcagccag cccggagccc ccatcctgca gtgcatgggc 180
tgctgcttca gcagggccta ccccaccccc ctgaggagca agaagaccat gctggtgcag 240
aagaacgtga ccagcgagag cacctgctgc gtggccaaga gctacaacag ggtgaccgtg 300
atgggcggct tcaaggtgga gaaccacacc gcctgccact gcagcacctg ctactaccac 360
aagagctaat ga 372
Claims (27)
- 재조합 FSH 또는 재조합 FSH 변이체의 정제 방법으로서,
상기 방법은
재조합 FSH 또는 재조합 FSH 변이체를 함유하는 액체를, 임의의 순서로 수행되는,
- 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계,
- 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, 및
- 염료 친화성 크로마토그래피하는 단계를 포함하며,
상기 방법은 약 음이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 포함하지 않는
방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계들은 하기 순서:
a) 음이온 교환 크로마토그래피
b) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및
c) 염료 친화성 크로마토그래피
로 수행되는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 -N+(CH3)3 기능기를 갖는 강 음이온 교환 수지 또는 유사한 특성을 갖는 수지를 이용하여 수행되는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐 또는 부틸기로 유도체화된 가교결합 아가로오스 비드로 이루어진 수지, 또는 유사한 특성을 갖는 수지를 이용하여 수행되는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 염료 친화성 크로마토그래피는 임의의 매트릭스에 공유결합된, 리간드로서 Cibacron Blue 3G에 의하여 수행되는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 크로마토그래피는 7.0 내지 9.0 범위의 pH에서 용리액으로서 Tris-HCl / 염화나트륨 완충액을 이용하여 수행되는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 방법은 양이온 교환 크로마토그래피를 더 포함하는
방법.
- 제7항에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피는 막에 고정된 강산성 양이온 교환체 술폰산, 또는 유사한 특성을 갖는 교환체에 의하여 수행되는
방법.
- 제7항에 있어서,
상기 단계들은 하기 순서:
a) 음이온 교환 크로마토그래피,
b) 소수성 상호작용 크로마토그래피,
c) 염료 친화성 크로마토그래피, 및
d) 양이온 교환 크로마토그래피
로 수행되는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
추가적인 음이온 교환 크로마토그래피를 더 포함하는
방법.
- 제10항에 있어서,
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 -N+(CH3)3 기능기를 갖는 강 음이온 교환 수지 또는 유사한 특성을 갖는 수지를 이용하여 수행되는
방법.
- 제10항에 있어서,
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 7.0 내지 9.0 범위의 pH에서 용리액으로서 Tris-HCl / 염화나트륨 완충액을 이용하여 수행되는
방법.
- 제10항에 있어서,
상기 단계들은 하기 순서:
a) 제1 음이온 교환 크로마토그래피,
b) 소수성 상호작용 크로마토그래피,
c) 염료 친화성 크로마토그래피,
d) 선택적인 양이온 교환 크로마토그래피, 및
e) 제2 음이온 교환 크로마토그래피
로 수행되는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 방법은 크기 배제 크로마토그래피를 더 포함하는
방법.
- 제14항에 있어서,
상기 크기 배제 크로마토그래피는 가교결합된 아가로오스 및 덱스트란의 구형 복합체의 매트릭스를 이용하여 수행되는
방법.
- 제14항에 있어서,
상기 단계들은 하기 순서:
a) 제1 음이온 교환 크로마토그래피,
b) 소수성 상호작용 크로마토그래피,
c) 염료 친화성 크로마토그래피,
d) 선택적인 양이온 교환 크로마토그래피,
e) 선택적인 제2 음이온 교환 크로마토그래피, 및
f) 크기 배제 크로마토그래피
로 수행되는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 방법은 추가적인 음이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 더 포함하며, 하기 단계를 하기 순서:
a) 제1 음이온 교환 크로마토그래피,
b) 소수성 상호작용 크로마토그래피,
c) 염료 친화성 크로마토그래피,
d) 이온 교환 크로마토그래피,
e) 제2 음이온 교환 크로마토그래피, 및
f) 크기 배제 크로마토그래피
로 포함하는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
일 이상의, 한외여과 단계, 나노여과 단계, 또는 한외여과 단계 및 나노여과 단계의 양자 모두를 더 포함하는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
금속 이온 친화성 크로마토그래피가 수행되지 않는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
면역친화성 크로마토그래피가 수행되지 않는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 FSH는 서열식별번호 1에 따른 α-서브유닛 및 서열식별번호 2에 따른 β-서브유닛을 갖는
방법.
- 재조합 인간 FSH의 제조방법으로서,
인간 FSH의 α-사슬 및 β-사슬을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질감염된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 클론에서 FSH를 제조하는 단계; 및 제1항 의 방법에 따라 세포 배양물로부터 재조합 인간 FSH를 정제하는 단계를 포함하는
방법.
- 제22항에 있어서,
a) 인간 FSH의 α-사슬 및 β-사슬을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로부터 재조합 인간 FSH를 생산하는 CHO 세포 클론을 생성하는 단계;
b) 적합한 조건 하에서 CHO 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
c) 제1항의 방법에 따라 세포 배양물로부터 재조합 인간 FSH를 정제하는 단계를 포함하는
방법.
- 제22항에 있어서,
상기 FSH를 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 약학적 조성물의 형태로 제제화하는 단계를 더 포함하는
방법.
- 제23항에 있어서,
상기 FSH를 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 약학적 조성물의 형태로 제제화하는 단계를 더 포함하는
방법.
- 삭제
- 삭제
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