KR101753374B1

KR101753374B1 - 풍미 및 부피 팽창력이 우수한 증편 제조용 사카로마이세스 세레비지애 및 락토바실러스 브레비스 균주 혼합물

Info

Publication number: KR101753374B1
Application number: KR1020160102910A
Authority: KR
Inventors: 임철한; 유승진; 서기원
Original assignee: 주식회사 창억
Priority date: 2016-08-12
Filing date: 2016-08-12
Publication date: 2017-07-04

Abstract

본 발명은 풍미 및 부피 팽창력이 우수한 증편 제조용 사카로마이세스 세레비지애 및 락토바실러스 브레비스 균주 혼합물에 관한 것으로, 본 발명의 증편 제조용 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) YJM993 YDS02 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) JCM1059 YDS01 균주는 증편 반죽의 부피 증대 및 풍미를 개선시키고, GABA 생산능이 우수하여, 본 발명에서 선발한 균주를 혼합 첨가하여 제조한 증편 제조용 액종을 이용하여 제조된 증편은 증편 특유의 발효취 및 이취가 나지 않으면서 부피 증진 효과와 향미 및 기호도가 우수하고, 기능성 성분이 증진된 증편으로 제조할 수 있는 이점을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 선발한 2종의 균주는 증편 제조용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

풍미 및 부피 팽창력이 우수한 증편 제조용 사카로마이세스 세레비지애 및 락토바실러스 브레비스 균주 혼합물{Mixture of Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus brevis strain for making steamed rice-cake having excellent flavor and volume expansion ability}

본 발명은 풍미 및 부피 팽창력이 우수한 증편 제조용 사카로마이세스 세레비지애 및 락토바실러스 브레비스 균주 혼합물에 관한 것이다.

현대 식품산업의 핵심 키워드로 웰빙전통식품이 크게 부각되고 있다. 웰빙 전통식품이란 기존의 전통식품의 개념을 뛰어 넘는 고부가, 고기능성 유용물질을 생산하는 제품을 의미한다. 사용하는 소재(원료)와 제조방식에 따라 구분하면 식물발효기술, 양조기술, 수산발효기술 및 가공식품 제조기술로 분류되며, 제품군의 범위로는 절임제품, 양조제품, 튀김제품, 발효제품, 가열추출농축제품으로 분류된다. 예다손에서는 전통식품인 떡류를 생산 가공하여 전국적인 체인점 유통망을 바탕으로 대한민국 업계순이 1~2위를 다투는 기업으로 전통식품 중에서 핵심 키워드인 발효식품으로는 증편 또는 기정떡을 생산 가공하여 유통하고 있다.

증편은 술떡이라고도 불리며 막걸리에 포함되어 있는 효모균주를 활용하여 알콜 발효시 발생되는 기포를 이용하여 떡을 부풀린 후 스팀에 쪄내는 제품이다. 기정떡의 특징으로는 일반떡에 비해 부피가 크고 가벼우며 알콜 또는 효모균주의 우점이나 길항작용으로 인해서 여름철에도 쉽게 변질되지 않는 특징을 갖고 있다. 하지만 그 특유의 이취로 인해 소비자들에게 호불호가 갈리는 특징을 보이는 제품이기도 하다.

최근 들어 다양한 연구진들에 의해서 발효기술의 발달과 발효효율에 대한 기술들이 개발되어 많은 발전이 되었으나 그 기술은 제빵 기술에 비하면 아직 초기단계에 머물러있어 증편 발효 종균의 확보와 발효 기술 개발이 절실히 필요하다 할 수 있다. 따라서, 천연 발효 효모를 스크리닝하고 종균화하여 발효 효율의 향상, 종균의 특성에 의한 기능성의 추가, 이취 제거 및 향미 증진 등 다양한 연구가 절실히 필요하다고 할 수 있다.

한편, 한국등록특허 제1642177호에서는 '누룩과 효모를 이용한 증편의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1187227호에서는 '유산균과 효모의 복발효법을 이용한 미나리음료 및 그 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 풍미 및 부피 팽창력이 우수한 증편 제조용 사카로마이세스 세레비지애 및 락토바실러스 브레비스 균주 혼합물에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 15종의 과실 발효액 중에서 배 발효액으로부터 풍미와 부피 팽창력이 우수한 사카로마이세스 세레비지애 YJM993 YDS02 균주를 분리하였고, 한국 전통 음식으로부터 풍미, 부피 팽창력 및 GABA(gamma-aminobutyric acid) 생산능이 우수한 락토바실러스 브레비스 JCM1059 YDS01 균주를 분리하였다.

상기 사카로마이세스 세레비지애 YJM993 YDS02 균주 및 락토바실러스 브레비스 JCM1059 YDS01 균주를 동시에 접종하여 재료 배합 및 발효 조건 등을 최적화하여 증편 제조용 액종을 제조하고, 상기 액종을 이용하여 증편을 제조할 경우 대조구에 비해 발효취 및 이취가 나지 않으면서 부피 증진 효과와 향미 및 기호도가 우수하고, 기능성 성분(GABA)을 증진시킬 수 있는 증편 제조용 액종의 제조방법을 확립함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 풍미 및 부피 팽창력이 우수한 증편 제조용 사카로마이세스 세레비지애 및 락토바실러스 브레비스 균주 혼합물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 혼합물을 유효성분으로 함유하는 풍미 및 부피 팽창력이 우수한 증편 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 증편 제조용 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) YJM993 YDS02 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) JCM1059 YDS01 균주는 증편 반죽의 부피 증대 및 풍미를 개선시키고, GABA 생산능이 우수하여, 본 발명에서 선발한 균주를 혼합 첨가하여 제조한 증편 제조용 액종을 이용하여 제조된 증편은 증편 특유의 발효취 및 이취가 나지 않으면서 부피 증진 효과와 향미 및 기호도가 우수하고, 기능성 성분이 증진된 증편으로 제조할 수 있는 이점을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 선발한 2종의 균주는 증편 제조용으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 누룩(A), 습식쌀가루(B), 건조쌀가루(C), 원종(D) 및 액종(E) 생산 공정을 도식화한 것이다.
도 2는 종래의 증편(기존기정)과 본 발명의 증편(신기정)의 제조공정을 비교한 것이다.
도 3은 본 발명의 액종 생산 과정을 도식화한 것이다.
도 4는 본 발명의 과일을 이용하여 제조된 15종의 액종 사진이다.
도 5는 본 발명의 과일 액종으로부터 분리한 효모를 증편 반죽에 각각 접종한 후 발효한 사진이다.
도 6은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) YJM993 YDS02 균주의 농도를 달리하여 증편 반죽에 각각 접종한 후 발효하여 증편 반죽 부피 증가율을 비교한 사진 및 그래프이다.
도 7은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) YJM993 YDS02 균주를 YM 배지, MRS 배지, PDB 배지 및 생감자 배지에 각각 접종하고 배양한 균주를 원심분리한 후 배지를 제거하고 멸균수로 희석하여 각각 증편 반죽에 접종한 후 발효하여 증편 반죽 부피 증가율을 비교한 사진 및 그래프이다.
도 8은 장류 및 젓갈류에서 분리한 유산균으로부터 BCP 배지 상에서 균체 주변에 형광색 환을 나타내는 61종의 균주를 1차로 선별하고(A), 선별된 균주 중 높은 GABA 변환율을 나타내는 균주를 2차로 34종을 선별하고, 선별된 2차 균주 중 25 및 35℃ 조건에서 모두 높은 GABA 변환율을 나타내는 7종의 균주를 선별하고(B), 상기 선별된 균주 중 GABA 변환 대표 균주로 선발된 2-1, 9-10, 7-3의 균주로 GABA 변환율을 비교한 결과(C)이다.
도 9는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) JCM1059 YDS01 균주 배지 조성에 따른 GABA 변환율(A)과 배지에 MSG 첨가량에 따른 GABA 변환율(B)을 비교한 결과이다.
도 10은 증편 반죽에 막걸리 또는 유산균 및 효모 혼합 접종하여 제조된 증편의 저장기간에 따른 경도를 비교한 그래프이다.
도 11은 쌀가루 멸균 유무, 배양 조건과 쌀가루 및 액종 혼합 비율에 따른 부피 증가력(A, B) 및 이취 발생 정도(C)와 호기 배양시 사용하는 공기펌프(D)를 보여준다.
도 12는 액종 제조 시 사용하는 당 종류 및 첨가량에 따른 증편의 부피 증가 정도를 비교한 사진이다. 1: 올리고당 5 g, 2: 올리고당 10 g, 3: 올리고당 15 g, 4: 올리고당 20 g, 5: 올리고당 30 g, 6: 설탕 20 g, 7: 맥아 물엿 20 g

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 풍미 및 부피 팽창력이 우수한 증편 제조용 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주 혼합물을 제공한다.

상기 사카로마이세스 세레비지애 균주는 15종의 과실 발효액 중에서 배 발효액으로부터 풍미와 부피 팽창력이 우수한 사카로마이세스 세레비지애 YJM993 YDS02 균주를 분리한 것으로, 한국미생물보존센터에 2016년 07월 22일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11871P).

상기 락토바실러스 브레비스 균주는 한국 전통 음식으로부터 풍미, 부피 팽창력 및 GABA(gamma-aminobutyric acid) 생산능이 우수한 락토바실러스 브레비스 JCM1059 YDS01 균주를 분리한 것으로, 한국미생물보존센터에 2016년 07월 22일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11870P).

본 발명에서 분리한 사카로마이세스 세레비지애 YJM993 YDS02 균주 및 락토바실러스 브레비스 JCM1059 YDS01를 cfu(colony forming unit) 기준으로 2:1의 비율로 동시에 접종된 증편 반죽과 막걸리를 사용한 증편 반죽을 가지고 제조된 증편의 저장기간에 따른 노화 정도를 조사한 결과, 효모와 유산균 동시접종 증편이 막걸리 단독보다 약 하루 정도 노화가 지연됨을 확인할 수 있었다.

또한, 배양 배지 중에서 감자 배지는 다른 배지에 비해 상대적으로 저렴하면서 락토바실러스 브레비스 JCM1059 YDS01 및 사카로마이세스 세레비지애 YJM993 YDS02 균주의 발효 특성이 우수하고, 락토바실러스 브레비스 JCM1059 YDS01의 경우 다른 배지에 비해 GABA 변환율이 우수한 이점이 있다. 또한, 상기 감자 배지에 MSG(monosodium glutamate)을 0.1~0.5% 첨가한 후 락토바실러스 브레비스 JCM1059 YDS01 균주를 배양하는 것이 배양액 내 잔존 MSG 함량이 낮으면서 GABA 함량이 우수한 배양액으로 준비할 수 있었다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 균주 혼합물은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) YJM993 YDS02 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) JCM1059 YDS01 균주가 CFU(colony forming unit) 기준으로 1.5~2.5:0.5~1.5로 혼합하여 제조된 것일 수 있고, 바람직하게는 2:1로 혼합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 효모균 선발

(가) 한국 농산물 내 토종 효모균 선발

분리시료인 15종의 과실(메론, 배, 키위, 바나나, 참외, 감, 적포도, 블루베리, 파인애플, 청포도, 오렌지, 사과, 건포도, 산딸기, 딸기)을 잘게 분쇄 후 각 과실 30 g에 300 mL 증류수와 30 g 설탕을 넣고 3~4일 동안 배양(30℃)을 실시함으로써 효모 분리를 위한 발효액을 준비하였고, 각 과실의 발효액 100 ㎕를 취하여 10^-1~10^-5까지 멸균수에 십진 희석한 후 PDA 배지에 도말하여 배양하였다. 그 다음, 형성되는 효모형 콜로니만을 선별 1차 분리한 후 이를 계대 순수분리(3세대, PDA)하여 분리과정을 완료하였다.

(나) 선발효모동정 및 유전자원 확보(18S rRNA 판정)

계대 순수분리효모균의 동정은, 마크로젠에 의뢰하였으며, 실험 방법은 Diversilab 시스템 및 Kit(Model : Saccharomyces Kit)를 사용하여 권장방법에 따라 분석하였다. PCR 분석 및 18S rRNA 염기서열 분석은, 분리 균주 DNA 염기서열 분석을 위하여 200U Lyticase(Sigma, L4025)를 처리하고 Dneasy Blood & Tissue kit (QIAGEN, 69504)를 이용하여 효모의 게놈 DNA를 순수분리한 후, 18S rRNA 및 28S rRNA spacer region을 분석하기 위하여 정방향 프라이머로 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3' : 서열번호 1)를 역방향 프라이머로 ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT G-3' : 서열번호 2)를 이용하여 초기 변성(95℃, 2min.), 변성(95℃, 45sec), 어닐링(55℃, 45sec), 확장(72℃, 45sec, 33회) 그리고 최종 확장 반응(72℃, 10min)의 조건으로 PCR을 실시하여 밴드패턴을 확인하고, 18S rRNA의 염기서열을 CLUSTAL　2.0.11을 이용하여 Multiple sequence aligment를 실시하여 비교한 뒤, 염기서열을 이용한 BLAST tool(NCBI)을 이용하여, 비교 동정을 실시하였다.

(다) 분리 효모의 발효 특성 측정(부피)

동정된 효모들의 부피 증가 정도를 측정하기 위해서 반죽 후 부풀어 오르는 정도 비교 실험을 실시하였다. 반죽의 조성으로는 멥쌀가루 100 g, 과일 효모종 3 g, 설탕 17 g, 소금 0.22 g을 첨가한 후 잘 저어주고 건조를 막기 위해 랩을 씌워 30℃에서 발효시킨 후 부피 증가 정도를 확인하였다.

(라) 선발효모의 배양 및 배지조건 확립

동정된 효모를 증편 생산에 적용하기 위해서는 일정농도 이상의 효모로 배양이 필요하다. 가장 저렴하고 배양효율이 좋은 배지 선발을 위해서 상품화된 배지인 YM, MRS, 생감자 배지에서 각각 배양한 효모를 이용하여 증편의 부피를 측정하였다. 반죽의 조성으로는 멥쌀 100 g, 효모배양액 3 g, 설탕 17 g, 소금 0.22 g을 첨가한 후 잘저어주고 랩을 씌워 30℃에서 발효시킨 후 부피 증가 정도를 확인하였다.

2. 유산균 선발

(가) 한국 장류 및 젓갈류에서 유용 유산균 분리

토속 젓갈 및 김치발효 균주를 분리하기 위해 가정, 음식점, 젓갈 시장 등에서 시료 토속젓갈 26종과 국내 가정에서 담근 김치를 시료로 수집하여 사용하였다. 수집된 각 시료 5 g을 시험관에 넣고, 멸균된 증류수 10 mL를 가한 후 교반하여 충분히 혼합한 뒤 30분간 방치하였다. 방치된 시료의 상등액에 멸균된 증류수를 가하여 10^-6~10^-7까지 단계별로 희석하여 유산균을 분리 실험에 사용하였다. 유산균을 분리하기 위한 선택배지로 BCP(Bromocresol purple)을 함유한 BCP agar 배지를 사용하였으며, 준비된 시료를 마쇄한 후 평판희석 도말법을 이용하여 BCP agar 배지에 도말하였다. 시료를 도말한 배지를 25~37℃에서 24~37시간 배양하면서 균체 주변에 형광색환을 형성하는 균주를 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주들은 다시 MRS broth (Difco Co., U.S.A)에 접종하여 25℃ 또는 35℃에서 48시간 배양하였다. 배양액을 TLC를 이용하여 GABA(γ-Aminobutyric acid) spot을 확인하였으며, 이들 균주 중에 GABA spot이 크고 진한 균주들을 GABA 생산 균주로 최종 선발하였다.

(나) GABA 생산 균주의 동정

분리 균주들의 정확한 동정을 위하여 16S rRNA 서열을 비교 분석하였다. 염기서열 분석을 통하여 얻어진 분리 균주의 부분 염기서열은 Blast network service를 이용하여 GenBank에 등록된 다른 미생물의 염기서열과 비교함으로써 계통분류학적 유연관계를 분석하였다.

(다) GABA 의 분석

생성된 GABA 및 글루탐산은 TLC(thin layer chromatography; Silica gel 60 F254, Merck co.) 검정과 아미노산 분석을 실시하여 확인하였다. GABA 및 글루탐산의 함량 변화는 배양액을 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 0.45 ㎛ 멤브레인(Milipore Co.)으로 여과한 후, 상등액을 분석용 시료로 하였다. 배양액에 함유된 GABA의 TLC 검정에 사용한 전개용매는 n-부탄올:아세트산:물(5:2:2, v:v:v)을 사용하였고, 발색시약으로 1.5% 닌하이드린을 용매에 녹여 함께 전개시켰다. 전개 완료 후 105℃에서 5분간 발색시켜 확인하였다.

(라) 증편 첨가용 미생물 배양 배지 조성 설정 실험

증편 첨가용 배지로는 영양학적으로 가치가 높은 미강과 PDB 배지를 활용하였다. 미강을 물에 첨가하고 121℃에서 15분간 고압멸균을 실시하였다. 멸균된 미강배지를 6,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액만을 취하였다. 상등액에 실험에 따라 MSG(monosodium glutamate)를 첨가하거나 당류(설탕, 흑설탕, Sucrose) 또는 효모 추출물을 첨가하고 재차 멸균하였다. 멸균된 배지에 유산균을 접종하고 3일 동안 30℃에서 현택배양하였다. 이후 GABA 함량은 GABA 분석법을 따랐다.

3. 실험방법

(가) 경도 측정

증편의 물성을 측정하기 위하여 일정 크기로 절단한 다음 직경이 10 mm인 프로브를 이용하여 압착실험을 수행하였다. 조직감 분석기(Sun Rheo Meter Compac-100 II, Japan)를 이용하여 견고성(Hardness)를 측정하여 경도를 측정하였다. 측정 조건값으로는 Test type - TPA, measuring Type - 2 bite compession test, Distance format - 50% strain, Load cell - 5 kg, Plunger diameter - 75 mm, Test speed - 1.00 mm/sec, Pre-test speed - 5.00 mm/sec, Post-test speed - 1.00 mm/sec, sample size(W×L×H) - 20×20×20 mm로 측정하였다.

(나) 관능평가

증편 제품의 2×2×2 cm로 잘라 흰 접시에 놓고 각 시료의 접시에 난수표를 사용한 세자리 수의 라벨을 붙여 표시하였다. 시료는 물과 함께 실온에서 동시에 제시하고 하나의 시료를 평가한 뒤에는 입안을 물로 헹군 후 다른 시료를 평가하도록 하였고, 관능평가는 2회 반복하여 실시하였다.

실시예 1: 한국 농산물 내 토종 효모균 선발

효모는 전통적으로 전통 주류나 장류 등의 생산에 활용되어왔다. 효모는 값이 저렴한 배지에서도 쉽게 배양할 수 있는 단세포 진핵생물로 단백질을 과량 발현시키는 생물전환 기술에도 널리 활용되고 있다. 우리나라의 자연환경에 서식하고 있는 새로운 효모들을 분리, 동정하여 이들을 자원화하고, 이들로부터 고부가가치의 의약산업이나 건강식품산업 등에 활용할 수 있는 신소재 개발 응용연구들이 매우 중요하며 최근 생물전환기술의 발달로 여러 산업현장에서 활용되고 있다. 식물은 효모의 공통적인 서식처로 잘 알려져 있기 때문에, 다양한 효모들이 나무껍질, 잎, 꽃, 또는 과실에서 발견되고 있다. 식물체에 있는 효모의 독특한 발효특성을 활용하여 국내 제빵에 활용하고자 다양한 효모균들을 선발 및 특성조사를 실시하여 산업현장에 적용하고 있다.

천연과일 효모를 활용하여 풍미가 있는 증편을 개발해 보고자 시장에서 판매되고 있는 생과일 총 15종의 액종을 만들었다(도 4). 3일의 숙성기간을 거쳐 발효가 된 액종에서 효모를 순수 분리하였으며 균주의 발효특성을 1차적으로 확인하였다(도 5). 좋은 부피 증가 능력을 보이는 효모 균주를 ITS 검정을 통해서 동정하였으며 동정된 효모의 학명은 표 1과 같으며 2개의 소스에서 동정된 균주에서는 Wickerhamomyces로 유해 미생물이 분리되었으며 대부분 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 균주들이 분리되었다. 발효 특성 확인결과 배에서 분리된 사카로마이세스 세레비지애 YJM993 YDS02(Saccharomyces cerevisiae YJM993 YDS02) 균주가 가장 좋은 풍미와 부피팽창을 가져 다음 실험에는 배에서 분리 동정한 상기 효모를 사용하였고, 상기 균주는 한국미생물보존센터에 2016년 07월 22일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11871P).

천연과일 종 및 누룩에서 분리된 효모균

유래 품명	학명	비고
배	Saccharomyces cerevisiae YJM993 YDS02	효모
키위	Saccharomyces cerevisiae	효모
적포도	Saccharomyces cerevisiae YKM993	효모
블루베리	Wickerhamomyces EG2(Pichia anomala)	유해효모
청포도	Saccharomyces cerevisiae Sc24	효모
사과	Saccharomyces cerevisiae W46	효모

실시예 2: 분리 효모의 발효 특성 측정

동정 균주의 발효특성과 공정 적용 특이성을 확인하기 위하여 효모의 농도에 따른 반죽의 부피증가 능력(도 6)과 배양 배지에 따른 증편의 부피(도 7)를 확인하였다. 적정 효모 첨가 농도 설정을 위하여 효모 투입 농도별 부피증가 실험을 실시하였다. 그 결과 예상대로 효모의 농도 증가에 따른 부피 증가 정도는 확연하게 차이를 보였으며 특히 4×10¹¹ CFU/ml의 효모 농도에서는 400%에 달하는 부피 증가를 보였다. 하지만 효모 농도는 2×10¹¹ CFU/ml의 농도가 가장 적정한 부피와 풍미를 보여 추후 적정 효모의 농도는 2×10¹¹ CFU/ml의 농도가 가장 적정함을 확인하였다(도 6).

균주의 대량생산 확보시 필요한 최적 배양 배지 선발을 위해 YM 배지, MRS 배지, PDA 배지, 생감자 배지를 가지고 확인하였으며 각 배지에서 배양한 균주를 원심분리한 후 배지를 제거하고 멸균수로 희석하여 접종하였다. 그 결과 YM, MRS 배지에 비해 상대적으로 저렴한 생감자 배지에서 자란 효모의 발효특성이 떨어지지 않는 것을 확인하여 추후 생감자 배지를 대량 배양용 배지로 최종 선발하였다(도 7).

실시예 3: 한국 장류 및 젓갈류에서 유용 유산균 분리

분리동정된 배 유래 효모의 발효 특성과 기존 막걸리를 사용하는 전통적인 방법에 비해 어떠한 차이를 보이는지 확인해보고자 비교실험을 실시하였으나 막걸리 단독에 비해서 특별한 부피 증가는 확인되지 못했다. 증편의 생산공정상 2배까지의 부풀리는 1차 발효의 시간은 공정 단축에 매우 중요한 역할을 하므로 이를 증가시키기 위해서는 효모 단독보다는 유산균을 서로 공생시켜 보다 증가된 제품의 부피와 풍미 향상을 시키고자 하였다. 뿐만 아니라 현대인들의 불규칙하고 부적절한 식습관과 환경 오염, 스트레스 증가 및 생활수준이 급속하게 발전하여 다양한 기능성 성분에 대한 관심이 증가하고 있으며 다양한 건강 보조 식품이 활발하게 소비되고 있다. 기능성 성분 중에는 GABA(γ-Aminobutyric acid)는 자연계에 널리 분포하는 비단백질 구성 아미노산으로서, 사람에 있어서는 신경계, 혈액에 함유되어 있으나, 대부분은 뇌의 골수에 존재하여 아세틸콜린(acetyl choline)이라 불리는 신경전달 물질을 증가시키고, 뇌기능을 촉진시키는 등의 생리작용뿐 아니라, 혈압 저하 작용, 이뇨작용, 항산화 작용, 성장 호르몬의 분비 조절에도 관여하며, 통증 완화에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 실험에서는 부피 증가와 GABA 변환에 따른 기능성 추가라는 두가지 목표를 가지고 유산균 선발에 들어가게 되었으며 1차적으로 GABA 전환 균주를 선발하고 선발된 균주를 활용하여 부피 증가 효과를 추가 조사하여 두가지 항목에 최적 균주를 선발하고자 하였다. 30여 종의 젓갈과 김치시료를 각각 1 mL를 취한 후 멸균 생리식염수를 이용하여 단계별로 희석한 다음 BCP 배지에 도말하였다. BCP 배지상에서 균체주변으로 형광색환을 나타내는 61종의 균주를 1차적으로 선별하였다(도 8의 A). 선별된 균주들을 MRS agar 배지에 2회 계대 배양하여 순수분리된 균주들을 MRS broth에 접종하여 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양후 얻은 배양액을 silica gel TLC상에 점적하여 표준품인 GABA와 Rf 치가 같으며 높은 GABA 변환율을 나타내는 균주 34종을 2차 선발하였다. 선행연구에서 25℃와 35℃에서 각기 다른 반응을 나타내는 균주가 많은 것을 확인하고 선발에서도 다음 두가지 배양조건에서 GABA 변환율을 확인하였다(도 8의 B). 다음 결과에서 25℃와 35℃ 조건 모두에서 높은 GABA 변환율을 나타내는 균주들을 추가 비교하였으며 최종적으로 1, 2, 3, 12, 26, 27, 28번 균주가 선발되었으며, 그 중 1번은 2-1, 12번은 9-10, 26번은 7-3으로 GABA 변환 대표 균주로 선발되었다. 다음 선발된 유산균의 GABA 치환능력을 확인하고자 Positive control(GABA 변환 균주)로 KACC14481과 Negative control(GABA 비변환 균주)로 KCTC3105를 사용하여 각각 25℃, 30℃ 그리고 35℃에서 다음 각각의 균들을 2일간 배양하여 배지를 점적하여 TLC를 진행하였다(도 8의 C). 그 결과 7-3 균주가 가장 높은 GABA 치환능력을 보여주었으며 이미 보고된 균주 K1(KACC14481)보다도 오히려 25~35℃로 넓은 범위의 온도조건에서도 활력의 변화없이 일정한 GABA 변환율을 가져 추가 실험에 대표 균주로 사용하였다.

GABA 생산 균주로 선별된 7-3의 16S rDNA 부분 염기서열을 분석하여 얻은 450 bp의 염기서열을 NCBI의 Genebank에 등록된 nucleotide data base와 비교하여 본 결과 락토바실러스 브레비스 H11(Lactobacillus brevis H11)의 동일 영역 염기서열과 99%의 유사도를 나타내어, 락토바실러스 브레비스 JCM1059 YDS01(Lactobacillus brevis JCM1059 YDS01)로 명명하였고, 상기 균주는 한국미생물보존센터에 2016년 07월 22일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11870P).

실시예 4: 증편 첨가용 유산균 배양 배지 조성 설정 실험

식품소재로 활용하기 위해서는 식품 원료를 활용한 배지 조성의 구성이 가장 안전하며 효율적이므로 선행연구 등에서 제시하고 있는 효율적 배지 조성으로 미강과 기본배지 PDB를 비교하였다. GABA 변환 촉진을 위해 0.5%의 MSG와 추가적인 양분원으로 설탕, 흑설탕 그리고 수크로스를 사용해 보았으며 비교대상으로 일반 감자전분 배지(PDB)를 사용하였다. 그 결과 일반 배지 PDB에 비해 미강추출물 배지의 경우 매우 낮은 GABA 치환율을 나타내었으며 이는 아마 직접 활용할 수 있는 양분의 공급이 제대로 이루어지지 못해 균 생육이 저해되고 이로 인해 GABA 변환율도 낮아진 것으로 판단된다. 이 결과로 인해 미강을 활용하는 방안은 추가적인 연구가 더욱더 필요할 것으로 판단되며 추후 실험 및 제품 생산에 기본 배지인 PDB를 유산균 초기생육 및 접종 배지로 사용하였다(도 9의 A).

또한, GABA 직접 증가를 위해서는 다양한 방법들이 고안되고 있지만 가장 쉽고 이상적인 방법은 아직까지는 글루타메이트(glutamate)를 인위적으로 넣어주는 방법 또는 글루타메이트(glutamate) 다량 함유 식품을 넣어주는 방법이 있다. 하지만 본 연구에서는 글루타메이트 대신에 MSG(monosodium glutamate)를 넣어 100% 치환되어 잔량의 MSG가 발생되지 않는 조건을 설정하고자 하였다. 본 실험에서는 미생물 배양 기본 배지 내에서 미생물의 생육과 MSG 집적량을 TLC를 통해서 확인하였다(도 9의 B). 그 결과 확연한 GABA 증가가 확인되는 첨가량은 1% 이후 첨가구로 2일까지 배양하였을 때 잔존 MSG량이 확인되어 그 이하로의 설정이 필요할 것으로 판단되었다. 이러한 이유에서 잔존 MSG 함량과 GABA 함량의 절충안으로 0.1~0.5%대의 MSG 첨가를 허용가능 범위로 설정하였다.

실시예 5: 효모 및 유산균을 적용한 증편의 노화 지연 효과

효모와 유산균이 cfu(colony forming unit) 기준으로 2:1의 비율로 동시에 접종된 증편 반죽과 막걸리를 사용한 증편 반죽을 가지고 제조된 증편의 저장기간에 따른 노화 정도를 비교해 보았다. 그 결과 막걸리만을 사용한 증편에서는 2일까지가 측정 최대치의 경도 1646±202.01 g을 나타내었으며 효모와 유산균을 접종한 증편에서는 저장 3일에서 막걸리 단독의 경도 1646±202.01 g보다 오히려 낮은 1533.67±74.8 g을 나타내었으며, 일원배치 분산분석을 실시해본 결과 막걸리 증편 저장 2일과 효모 및 유산균 증편 저장 3일의 경도가 유의성이 있다고 나와 효모와 유산균 동시접종 증편이 막걸리 단독보다 약 하루 정도 노화가 지연됨을 확인할 수 있었다(도 10).

실시예 6: 액종 제조 시 배양방법 설정

천연발효 빵 및 식품 제조에 있어 여러가지 방법들이 고안되었으며 대표적으로 샤워종 및 액종 시스템이 대표적이다. 본 발명에서는 샤워종(Sour dough) 시스템보다는 액종(Liquid-starter) 시스템을 선택하였다. 그 이유로는 제빵과 증편의 생산 공정상 제품의 풍미 및 품질에 미치는 영향에 기인하는데 산소공급 없이 배양할 경우 샤워종과 액종의 시스템 모두에서는 알코올 발효가 이루어지며 이 제품에서 생산되는 증편에서는 술취가 강하게 남아있는 반면 제빵에서는 술취는 굽는 과정에서 증발되어 사라지게 된다. 이런 이유로 인해서 알코올 발효를 억제시킬 수 있는 배양방법이 필요했으며 그 대안으로 액종 발효에 공기주입을 하는 방법이 최적임을 확인하였다. 본 연구에서는 이처럼 액종에서 호기 조건과 혐기 조건으로 생산된 액종이 제품의 풍미 및 품질에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 일반 습식 쌀가루와 건조 멸균 쌀가루 그리고 호기 배양 조건과 혐기 배양 조건을 서로 비교해 보았다. 발효액은 각각의 조건으로 1일 배양하였으며 발효액 대비 쌀가루 양을 얼마까지 첨가하여도 발효속도에 큰 영향을 안 주는가 확인하고자 조건별로 액종을 첨가 및 쌀가루를 추가하여 발효가 완료되는 시점인 1.3배까지 부풀어 오르는 정도에 도달하는 시간을 측정하였다. 쌀가루 투입비에 따라서 발효가 늦어지는 경향을 보이지만 건조 멸균쌀가루에 호기적 배양조건의 액종은 8배까지도 1.3배까지 도달하는 시간이 거의 일정하게 유지되었다. 이 결과로 볼 때 부피증가력에 가장 효율적인 배양 조건은 멸균쌀가루 사용과 호기적 배양을 하는 것이 가장 이상적인 것을 확인 할 수 있었다(도 11의 A 및 B). 추가적으로 각 배양조건, 쌀가루 조건 및 액종과 쌀가루 배합조건에 따라서 제품 풍미에 미치는 영향을 확인하고자 최종 제품에서 나타나는 이취 정도를 확인하였다. 그 결과 일반쌀가루와 혐기 조건에서 배양한 액종이 가장 이취가 심했으며 이와 반대로 멸균쌀가루와 호기 배양 조건의 경우 쌀가루와 액종의 혼합 비율에 관계없이 이취가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 11의 C).

이 결과로 미루어 볼때 액종의 생산에 있어서 배양조건으로는 쌀가루의 멸균이 필요하며 그 조건으로는 건조 및 멸균기 사용이 후보로 거론되었으나 최종적으로는 건조가 시간적 및 장비적으로 효율적이므로 추후 멸균쌀가루는 건조쌀가루로 사용하여 실험에 사용하였다. 그리고 배양조건으로는 혐기 배양보다는 호기 배양을 위해 모든 배양에 공기펌프를 사용하여 공기를 주입하였으며 조면 및 실제 적용 사례는 도 11의 D에 제시하였다. 이와 같은 이유는 효모 및 유산균의 혐기적 생육과 호기적 생육에 기인하는 것으로 판단되며 혐기적 배양조건에서의 경우 젖산발효나 알코올 발효가 진행되며 호기적 배양 조건에서는 단순 일반 호흡이 촉진되기 때문으로 판단된다.

실시예 7: 액종 제조 시 당 종류 설정

효모와 유산균을 접종하여 액종을 배양하기 위해서는 원활한 양분 공급이 우선시 되어야 한다. 적정 농도 이상의 효모 및 유산균이 확보되어야 최종 제품에서 최적 부피 증가를 확보할 수 있기 때문에 다음 균들의 당분 공급원으로 설탕, 올리고당, 맥아 물엿, 흑설탕을 활용하여 배양한 액종을 활용한 제품의 부피 증가를 확인하였다. 실험방법은 건조쌀가루 120 g에 원종, 누룩 및 물과 당을 첨가한 후 발효하여 부피 증가를 비교하였다(도 12). 그 결과, 올리고당 30 g과 설탕 20 g 첨가구에서 가장 좋은 부피증가 효율을 나타내었으나, 원가 및 부피 증가 등을 고려하여 설탕이 액종 생산에 가장 적합한 당분으로 적합하다는 결론을 내렸다.

실시예 8: 액종 제조 시 당 분해 효소원 종류 설정

일반적으로 효모의 경우 전분을 당 공급원으로 사용할 수 없다. 이런 이유로 인해서 배양 배지에 인위적으로 설탕 등을 넣어주거나 맥아를 넣어주어 맥아효소에 의해서 당화가 이루어지게 하는 방법 등이 제빵에서 사용되고 있는 일반적인 방법이다. 한국 전통적인 식품 제조에서는 막걸리 제조시 효모의 에너지 공급원으로 당화를 위해 누룩을 사용하여 효모에 영양분을 공급하여 효모에 의한 발효가 이루어지도록 하고 있다.

본 실험에서는 이러한 영양분 공급원으로서 설탕을 공급할 수 있지만 원가절감을 꾀하며 추가적으로 액종 배양시 설탕 대량 첨가를 막아 최종 제품에서 단맛의 변화도를 최소화하고자 하였다. 후보 효소원으로서 밀누룩, 쌀누룩, 엿기름 추출물을 사용하여 최종 제품의 적정 부피 도달 정도를 통해서 효모의 발육 정도를 확인해 보았다. 추가적으로 선발 유산균 첨가 유무를 함께 비교함으로써 효모와 유산균 동시 배양이 가능한지도 확인하였다(표 2). 그 결과 최적 부피 증가인 2배까지 도달하는 시간으로는 쌀누룩이 가장 우수하였으며 나머지 처리구도 거의 비슷한 부피와 발효시간을 보였으나 밀누룩의 경우 밀 특유 갈색 색상으로 인하여 최종 제품에 영향을 미쳐 후보에서 제외되었고 엿기름은 부드러운 식감을 부여해주는 특징이 있으나 엿기름 첨가 함량이 많을수록 제품에 탄성이 없어져 버려서 식감을 해치는 정도가 되어 후보에서 제외되었다. 추후 실험에는 개량 쌀누룩을 직접 제조하여 롤밀제분한 누룩 가루를 첨가하여 사용하였다.

발효조를 이용한 효모 및 유산균의 배양 배지 조성 설정

	발효시간(hr)	부피	이취	특징
밀누룩	72±5.21	1.85±0.02	+++	제품의 변색(갈색화)
쌀누룩	65±3.09	2.00±0.00	+	고유의 흰색 유지
엿기름	74±3.39	1.84±0.04	+	씹힘성 매우 약해짐
엿기름+유산균	73±4.78	1.89±0.09	+	씹힘성 매우 약해짐

^*발효시간: 처음 부피에 2배 도달하는 데 걸리는 시간

^*부피: 모든 실험구 중에 처음으로 2배에 도달하는 시간대의 부피비(현재 부피/처음 부피)

^*+: 약, ++: 중, +++: 강

실시예 9: 액종 제조조건 설정

상기 실험결과들을 바탕으로 개발 효모와 유산균의 산업적 활용을 위하여 다음 경제성과 활용성 등을 감안하여 미강, 습식 제분 쌀가루, 건조쌀가루 등을 활용한 액체 배지 제조 조건 설정 실험을 실시하였다. 액종을 사용하는 액체발효법은 제빵에서 제빵 기계의 발달로 연속적으로 균일한 제품을 대량생산하기 위하여 1950년대 이후 고안되었다. 액체발효법은 중종법을 간략히 변형시킨 방법으로 액종을 만들어 식빵, 햄버거, 롤빵 등을 생산에 이용되었고, 특히 곡물 빵에 응용이 우수하였다. 증편의 경우 예로부터 막걸리를 활용하여 생산하였는데 이는 다른 의미에서 액종을 활용하여 제품을 생산하는 시스템과 유사하다고 할 수 있다. 본 실험에서는 막걸리를 활용하는 액종 개념을 바로 적용하되 액종 생산에 선발된 효모와 유산균을 접종하고 배양시켜 기능성과 풍미를 증가시고자 하였다. 본 실험에서는 총 3번에 걸쳐 액종을 생산하며 첫번째는 동정된 유산균과 효모를 순수배양하는 단계, 둘째로 순수배양된 배양액을 활용하여 원종을 생산하는 단계, 그리고 세번째로 원종을 활용하여 대량으로 액종을 만들어내는 단계로 구분된다. 각 과정의 분리는 각 공정별 종의 오염을 줄이기 위해서 고안되었으며 잡균 오염을 초기단계에서 차단하기 위한 첫번째 단계인 순수 배양단계, 술밥으로 찐쌀을 활용하는 두번째 단계, 그리고 제품의 풍미에 영향을 가장 적게 미치며 잡균 오염의 억제가 가능한 건조 쌀가루를 활용하여 대량 배양하는 세번째 단계로 이루어져 있다.

개발 효모의 대량배양을 위한 액종 생산에 있어 발효시간이 미치는 영향을 분석하여 최적 발효 시간을 설정하고자 하였다. 액종 배양시간은 12시간부터 72시간까지 배양한 후 제품생산에 첨가하였다. 액종 배양시간에 대한 설정을 하고자 배양물과 원종까지는 기존 고정 레시피를 따라 제조하였으며 그 균수는 배양물 1.0×10⁷CFU/ml이었으며 원종의 경우 1.7×10⁸CFU/ml였다. 다음 효모 수는 일반적으로 제빵 반죽에서 제시되는 1.0×10⁹~1.0×10¹⁰CFU/ml의 범위보다 미달되어 있으며 원종을 제품생산에 사용해본 결과 발효는 진행되지만 2배 이상의 부풀어오르는 정도를 달성하기까지 약 1시간 가량이 더 소요되었다. 본 실험에서는 원종을 활용하여 액종을 제조하였으며 각 배양시간에 따른 효모균 수와 제품생산시 발효율을 측정해보았다. 그 결과 액종의 효모균 수는 12시간에서 24시간까지는 어느 정도 증가 곡선을 보이지만 24시간 이후에서도 효모 수의 증가는 확인되었으나 뚜렷한 균수 변화는 확인되지 않았다. 반죽과 증숙 직전의 효모 농도를 확인해 본 결과 12시간을 제외한 시간대별 샘플에서 1.0×10⁹~1.0×10¹⁰CFU/ml 내 또는 그 이상의 효모균 수가 확인되었으며 발효율은 12시간을 100%로 할 때 24~72시간에서 시간이 길어질수록 높은 발효율을 보이지만 시간 투자에 비해 증가율은 미미하여 최적 액종 배양시간은 24시간이 가장 적당한 것을 확인하였다(표 3).

액종 배양 시간에 따른 생산 단계별 효모균 수(CFU/ml) 및 증편 발효율

액종 배양시간	배양물	원종	액종	반죽혼합	증숙 직전	발효율(%)
12	1.0×10⁷	1.7×10⁸	1.4×10⁸	5.8×10⁷	4.7×10⁹	100
24	1.0×10⁷	1.7×10⁸	6.1×10⁹	6.7×10⁷	1.7×10¹⁰	118
48	1.0×10⁷	1.7×10⁸	6.0×10⁹	2.1×10⁸	1.9×10¹⁰	122
72	1.0×10⁷	1.7×10⁸	7.1×10⁹	1.9×10⁸	1.8×10¹⁰	120

실시예 10: 액종을 이용한 증편 제조 최적화

생산된 액종을 활용하여 제품 개발에 필요한 첨가량을 설정하기 위하여 다음 표 4와 같이 습식쌀가루와 액종의 첨가량을 달리하면서 발효시간과 맛의 변화를 관찰하였다. 그 결과 발효시간은 액종 첨가량 감소에 비례하여 발효소요시간은 증가하였으나 전체적인 제품에 대한 기호도는 습식쌀가루와 액종을 6:1의 비율로 첨가하는 것이 가장 높게 나타났다. 이를 바탕으로 습식쌀가루와 액종 첨가비율을 6:1(w:v) 비율로 결정하였다.

액종 첨가량 설정을 위한 증편 배합 조성표(g)

	1	2	3	4	5	6	7	8
습쌀	600	600	600	600	600	600	600	600
액종	264	200	175	150	125	100	75	50
설탕	95	95	95	95	95	95	95	95
물	0	64	89	114	139	164	189	214
소금	10	10	10	10	10	10	10	10
발효시간 (분)	61±3.3	62±1.1	66±2.9	69±3.1	78±2.4	90±1.2	105±4.2	131±5.7
기호도	4.00±0.25	4.08±0.32	4.17±0.02	4.19±0.11	4.27±0.02	4.38±0.02	3.16±0.11	3.20±0.19

^*발효시간: 처음 부피에 2배 도달하는 데 걸리는 시간(분)

^*맛: 액종 첨가량에 따른 증편 제품의 관능평가에서 매우 좋음: 5점, 좋음: 4점, 보통: 3점, 나쁨: 2점, 매우 나쁨: 1점

실시예 11: 증편의 GABA 함량

본 발명의 증편 최종제품에서 GABA 함량이 2.73 mg/100 g으로 일반 백설기 0.37 mg/100 g 보다 약 7.4배 정도 높게 나와, 본 발명의 증편이 GABA 함량이 증진됨을 확인할 수 있었다(표 5).

증편의 GABA 함량

구분	GABA 함량(mg/100 g)
증편	2.73±0.06
백설기	0.37±0.00

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11870P

20160722

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11871P

20160722

<110> CHANGEOK CO.,LTD. <120> Mixture of Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus brevis strain for making steamed rice-cake having excellent flavor and volume expansion ability <130> PN16283 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcctccgctt attgatatg 19

Claims

풍미 및 부피 팽창력이 우수한 증편 제조용의 기탁번호가 KCCM11871P인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) YJM993 YDS02 및 기탁번호가 KCCM11870P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) JCM1059 YDS01 균주 혼합물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) JCM1059 YDS01 균주는 GABA(gamma-aminobutyric acid) 생산능이 우수한 균주인 것을 특징으로 하는 균주 혼합물.
제1항에 있어서, 상기 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) YJM993 YDS02 균주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) JCM1059 YDS01 균주는 CFU(colony forming unit) 기준으로 1.5~2.5:0.5~1.5로 혼합하는 것을 특징으로 하는 균주 혼합물.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 균주 혼합물을 유효성분으로 함유하는 풍미 및 부피 팽창력이 우수한 증편 제조용 조성물.