KR101752961B1 - 인테그린 알파3 베타1 저해제를 유효량 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물 및 치료용 조성물 탐색 방법 - Google Patents

인테그린 알파3 베타1 저해제를 유효량 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물 및 치료용 조성물 탐색 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈관주변세포(pericyte)의 세포사멸(apoptosis)을 인테그린 알파3베타1(integrin alpha3beta1)의 저해제를 통하여 억제하여 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy)의 진행을 억제하는 치료용 조성물 또는 치료용 조성물의 탐색방법을 제공한다

Description

인테그린 알파3 베타1 저해제를 유효량 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물 및 치료용 조성물 탐색 방법{Composition for Treatment of Diabetic Retinopathy Comprising in Inhibitor of Integrin alpha3 or beta1 and Screening Method for the Composition}
본 발명은 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물에 관한 것이다.
당뇨병성 망막병증은 성인 실명의 가장 큰 원인이다. 황반부종과 혈관신생이 심각한 시력저하를 일으키며, 이때 혈관주변세포 소실은 당뇨병성 망막증의 초기에 발생하는 특징적인 변화라 할 수 있다.
망막병증(diabetic retinopathy)은 병변이 망막내에로 국한되는 비증식성 망막증(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)과 망막에서 유리체로 신생혈관이 생성, 유입되어 유리체 출혈과 심한 견인성 망막박리로 시력상실 등 심각한 시력 장애를 초래하는 증식성 망막증(proliferative diabetic retinopathy, PDR)로 분류된다. 망막병증의 진행은 초기 비증식성 망막증에서 증식성 망막증으로 진행이 된다(Khan et al., Cellular signaling and potential new treatment targets in Diabetic Retinopathy, Experimental Diabetes Research, Vol. 2007, Article ID 31867, 12 pages). 혈관신생성(angiogenesis)는 증식성 망막증의 병변이다. 초기의 비증식성 망막증은 병변으로는 혈관주변세포의 소실(pericyte loss),세포외기질의 비후화(extracellular matrix thickening), 미세동맥류(microaneurysm)이고, 이 시기에 혈관누수(vascular leakage)에 의한 황반부종(macular edema)이 일어난다(전기 Khan 등의 리뷰 논문 introduction 의 참조). Kato 등은 비증식성 망막병증에서 혈관주변세포의 소실이 직접적으로 미세동맥류(microaneurysm)과 관련되어 있다고 보고하고 있다(Kato et al, "Long-term treatment with fidarestat suppresses the development of diabetic retinopathy in STZ-induced diabetic rats, Journal of Diabetes and Its Complications 17 (2003) 374-379).
혈관주변세포는 모세혈관의 내피를 둘러싸서 망막 조직에 외부물질이 침투하는 것을 막아주는 혈관망막장벽(blood-retinal-barrier)을 보호하는데, 혈관주변세포가 소실되면 혈관내피세포가 정상이라도 혈관망막장벽이 약화되어 혈관누수(vascular leakage)와 모세혈관의 불안정(capillary instability)이 일어나게 된다. 또한 혈관주변세포가 소실된 곳에서는 미세동맥류(microaneurysm)와 함께 혈관내피세포가 증식하면서 신생혈관이 증식하게 된다. 혈관주변세포의 소실은 세포사멸(apoptosis)과 세포이동(migration)에 의해 일어나며, 황반부종과 신생혈관증식(angionensis)은 당뇨병성 망막병증에서 시력을 상실케 하는 두 요인이다.
삭제
이와 같이 혈관주변세포의 소실이 당뇨병성 망막증에 중요하지만, 고혈당에 의해 유발되는 혈관주변세포 소실의 기전에 대해서는 많이 알려져 있지 않고 다음과 같은 것이 알려져 있다. 고혈당 상태는 혈관주변세포의 소실을 야기하고 증식성 당뇨병성 망막병증 환자의 망막과 혈관내피세포에서 안지오포이틴 2(angiopoietin 2)를 증가시킨다. 안지오포이틴2는 정상 마우스 망막의 혈관주변세포의 소실도 일으키며, Ang2 과발현 마우스의 망막에서도 혈관주변세포의 소실이 관찰되었다.
안지오포이틴2에 대해서는 혈관내피세포에서 발현하는 Tie2 수용체에 결합한다는 것이 잘 알려져 있다. 안지오포이틴2는 Tie2 수용체의 리간드로 잘 알려진 Ang1 단백질과 비슷한 친화력을 가지고 결합하며, 안지오포이틴2가 Tie2 수용체와 결합하여 자가분비(autocrine) 방식으로 분비된 리간드(ligand)가 안지오포이틴1과 tie2 수용체의 결합에 대해 길항적으로 작용하여 안지오포이틴1-Tie2 신호축(signaling axis)을 조절하는 것으로 알려져 있다. 하지만 Tie2 수용체가 안지오포이틴2에 의한 혈관주변세포의 세포사멸에서 수용체로 작용하는지 여부가 명백히 밝혀진 것은 아니다.
지금까지는 안지오포이틴2와 Tie2 수용체가 결합하여 안지오포이틴1-Tie2 신호축(signaling axis)을 조절하는 것으로 생각되었다. 그래서 Tie2 수용체가 혈관생성에서도 중요한 역할을 한다고 생각됐다.
본 발명에서는 안티-인티그린 알파3 또는 베타 1 항체를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제1의 형태로 항-인테그린 알파3 항체를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 항-인테그린 알파3 항체는 p53 단백질의 인산화 경로를 저해하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물일 수 있다.
본 발명의 제2의 형태로 항-인테그린 베타1 항체를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 항-인테그린 베타1 항체는 p53 단백질의 인산화 경로를 저해하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물일 수 있다.
본 발명의 제3의 형태로 (a) 인테그린 알파3베타1을 갖는 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 세포에 잠재적 물질을 처리하는 단계; (c) 상기 인테그린 알파3베타1의 활성이 저해되는 것을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 동물세포이고, 보다 구체적으로는, 상기 동물세포는 마우스의 망막세포이다.
본 발명에 있어서, 상기 인테그린 알파3베타1의 활성을 저해하는 것을 측정하는 방법은 PCR, 면역침강법, 면역블로팅을 사용할 수 있다.
본 발명의 제4의 형태로 (a) 인테그린 알파3베타1을 갖는 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 세포에 잠재적 물질을 처리하는 단계; (c) 혈관주변세포의 세포사멸이 감소하는 것을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 동물세포이고, 보다 구체적으로는, 상기 동물세포는 마우스의 망막세포이다.
본 발명에 있어서, 상기 혈관주변세포의 세포사멸이 감소하는 것을 측정하는 방법은 MTT 분석법, 유세포분석법, FACS를 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 인테그린 알파3베타1의 억제를 탐색하는 방법을 제시함으로써, 항-인테그린 알파3 항체 또는 항-인테그린 베타1 항체를 사용한 당뇨병성 망막병증의 진행을 억제하는 치료제를 개발할 수 있다.
도1은 마우스에게 당뇨병을 유발하고 6개월 후 당뇨병이 있는 마우스와 당뇨병이 없는 대조군 마우스의 망막 분해 후 periodic acid Sciff 염색과 Hematoxylin 염색을 한 표본이다.
도2는 모세혈관 면적에 의해 보정된 망막의 혈관주변세포의 수를 나타낸다.
도3은 모세혈관 면적에 의해 보정된 무세포 모세혈관의 수를 나타낸다.
도4는 qRT-PCR을 통해 당뇨가 유발된 마우스의 망막에서의 안지오포이틴 2의 mRNA 수준을 같은 주령대의 정상 마우스의 mRNA 수준과 비교하였다.
도5는 안지오포이틴 2의 mRNA 전사가 인간 망막 미세혈관 내피세포에서 고포도당 조건에서 유도된다는 것을 보여준다.
도6은 안지오포이틴 2의 mRNA 전사가 혈관주변세포에서는 고포도당 조건에서 유도되지 않는다는 것을 보여준다.
도7은 안지오포이틴 2의 mRNA 전사가 성상세포에서는 고포도당 조건에서 유도되지 않는다는 것을 보여준다.
도8은 안지오포이틴 2는 고포도당 상태에서 혈관주변세포의 죽음을 유도함을 보여준다.
도9는 고포도당 상태는 혈관주변세포의 세포사멸을 유도하고, 안지오포이틴 2는 세포사멸을 촉진함을 보여준다.
도10은 안지오포이틴 2는 고포도당 상태에서 망막 미세혈관 내피세포의 죽음을 유도하지 않음을 보여준다.
도11은 안지오포이틴 2가 망막 미세혈관 내피세포의 세포사멸을 억제함을 보여준다.
도12는 정상 포도당 상태와 고만니톨, 고포도당 상태에서 안지오포이틴 2를 처리한 혈관주변세포의 용해물에서 Bax, BCL-2, BCL-xL, cleaved caspase-3, PARP, cleaved PARP의 활성화에 대한 웨스턴 블롯 분석이다.
도13은 고포도당 상태에서 안지오포이틴 2를 15분, 30분, 60분 처리한 혈관주변세포의 용해물에서 p53의 인산화에 대한 웨스턴 블롯 분석이다.
도14는 고포도당 상태에서 안지오포이틴 2를 24시간, 48시간 처리한 혈관주변세포의 용해물에서 p53의 인산화에 대한 웨스턴 블롯 분석이다.
도15는 혈관주변세포의 siRNA와 p53의 siRNA를 처리하고, 고포도당 상태에서 48시간 동안 안지오포이틴 2를 처리한 혈관주변세포의 용해물에서 p53에 대한 웨스턴 블롯이다.
도16은 siRNA를 처리한 혈관주변세포에 안지오포이틴 2를 처리하고 48시간 후 FACS 분석을 하여 얻은 세포사멸 수를 보여준다.
도17은 고포도당 상태에서 안지오포이틴 2를 5분, 15분, 30분, 60분 처리한 혈관주변세포에서 p-ERK, ERK, p-Akt, Akt에 대한 웨스턴 블롯 분석이다.
도18은 고포도당 상태에서 안지오포이틴 2를 처리하기 전에 ERK 억제제를 처리한 혈관주변세포에서 p-p53, p53, p-ERK, ERK,p-Akr, Akt에 대한 웨스턴 블롯 분석이다. 베타 튜불린은 대조군으로 분석됐다.
도19는 인간 제대정맥 내피세포와 혈관주변세포에서의 Tie-1과 Tie-2의 발현에 대한 웨스턴 블롯이다.
도20은 qRT-PCR에 의해 분석된 Tie1과 Tie2의 mRNA의 전사량을 보여준다.
도21은 인간 제대정맥 내피세포와 혈관주변세포에서 Tie2가 발현에 대한 유세포분석 결과를 보여준다.
도22는 고포도당 조건에서 15분간 안지오포이틴 2 또는 GRGDS를 처리한 혈관주변세포의 용해물에서 인산화-p53 단백질과 p53 단백질에 대한 웨스턴 블롯이다. 베타-tubulin은 대조군으로서 분석되었다.
도23은 고포도당 조건에서 15분간 안지오포이틴 2 또는 다양한 인테그린 차단 항체들을 처리한 혈관주변세포의 용해물에서 인산화-p53 단백질과 p53 단백질에 대한 웨스턴 블롯이다. 베타-tubulin은 대조군으로서 분석되었다.
도24는 고포도당 조건에서 24시간과 48시간동안 배양된 혈관주변세포에서 qRT-PCR에 의해 얻어진 인테그린 알파1과 인테그린 알파3와 인테그린 베타1의 mRNA 전사량을 보여준다.
도25는 고포도당 조건과 정상 포도당 조건에서 배양된 혈관주변세포의 용해물에서 인테그린 알파1, 인테그린 알파3, 인테그린 베타1의 발현에 대한 웨스턴 블롯이다.
도26은 혈관주변세포를 안지오포이틴 2와 인테그린 알파3베타1과 항-인테그린 알파3베타1을 처리하여 배양한 후의 공동면역침강 분석이다.
도27은 고포도당 조건에서 안지오포이틴 2, 항-인테그린 알파1 항체, 항-인테그린 알파3 항체, 항-인테그린 베타1 항체와 함께 배양한 혈관주변세포에 대하여, FACS 분석에 의한 혈관주변세포의 세포사멸 비율을 보여준다.
도28은 고포도당 조건에서 안지오포이틴 2, 항-인테그린 알파1 항체, 항-인테그린 알파3 항체, 항-인테그린 베타1 항체와 함께 배양한 혈관주변세포의 용해물에서 p53 단백질에 대한 웨스턴 블롯이다. 베타-tubulin은 대조군으로서 분석되었다.
도29는 모세혈관 면적으로 보정된 혈관주변세포의 수를 보여준다.
도30은 NG2(red)와 TUNEL(green)과 DAPI(blue)로 면역염색된 망막 분해 표본이다.
본 발명의 제 1 의 형태는 항-인테그린 알파3 항체를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물이다. 바람직하게는 상기 조성물은 p53 단백질의 인산화 경로를 억제하는 것이다.
본 발명의 제 2 의 형태는 항-인테그린 베타1 항체를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물이다. 바람직하게는 상기 조성물은 p53 단백질의 인산화 경로를 억제하는 것이다.
상기의 항-인테그린 알파3 항체 또는 항-인테그린 베타1 항체를 포함하는 치료용 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥, 근육을 포함한 여러 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 유효량이란, 치료용 조성물을 환자에게 투여하였을 때 예방 또는 치료 효과를 나타내는 화합물 또는 추출물의 양을 말한다. 본 발명의 치료용 조성물의 투여량은 투여 방법, 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 개체차, 질병상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물은 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 10㎍ 내지 10mg의 유효용량으로 하루 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 제 3 의 형태는 항-인테그린 알파3 항체를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료에 효과적인 건강기능 식품 조성물이다. 바람직하게는 상기 조성물은 p53 단백질의 인산화 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물이다.
본 발명의 제 4 의 형태는 항-인테그린 베타1 항체를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료에 효과적인 건강기능 식품 조성물이다. 바람직하게는 상기 조성물은 p53 단백질의 인산화 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물이다.
본 발명은 인티그린 알파3 또는 베타1의 활성 억제제를 포함하는 당뇨병성 망막병증에서의 시력 개선을 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 활성 억제제는 천연물질 또는 화합물일 수 있다. 이에 제한 되는 것은 아니나 보다 바람직하게는 항-인테그린 알파3 항체 또는 항-인테그린 베타1 항체 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 당뇨병성 망막병증에서의 시력 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 항-인테그린 알파3 항체 또는 항-인테그린 베타1 항체는 당뇨병성 망막병증의 예방 및 치료를 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 상기 항-인테그린 알파3 항체 또는 항-인테그린 베타1 항체를 포함하는 식품 및 음료로는 분말, 과립, 정제, 캡슐 등 각종 식품류의 형태가 사용될 수 있다. 상기 항-인테그린 알파3 항체 또는 항-인테그린 베타1 항체를 포함하는 음료는 필수 성분으로서 항-인테그린 알파3 항체 또는 항-인테그린 베타1 항체를 함유하는 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다.
본 발명의 제 5 의 형태는 인테그린 알파3을 갖는 세포를 배양하는 단계; 상기 세포에 잠재적인 물질을 처리하는 단계; 및 상기 인테그린 알파3의 활성이 저해되는 것을 측정하는 단계를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법이다.
본 발명의 제 6의 형태는 인테그린 베타1을 갖는 세포를 배양하는 단계; 상기 세포에 잠재적인 물질을 처리하는 단계; 및 상기 인테그린 베타1의 활성이 저해되는 것을 측정하는 단계를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법이다.
상기 인테그린 알파3또는 베타1의 활성이 저해되는 것을 측정하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, PCR, 면역침강법(Immunoprecipitation), 공동면역침강법(Co-immunoprecipitation), 면역블롯팅 및 웨스턴블롯팅(Immunoblotting or Western Blotting)으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 방법을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제 7 의 형태는 인테그린 알파3를 갖는 세포를 배양하는 단계; 상기 세포에 잠재적인 물질을 처리하는 단계; 및 혈관주변세포(Pericyte)의 세포사멸이 감소하는 것을 측정하는 단계를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법이다.
본 발명의 제 8 의 형태는 인테그린 베타1을 갖는 세포를 배양하는 단계; 상기 세포에 잠재적인 물질을 처리하는 단계; 및 혈관주변세포(Pericyte)의 세포사멸이 감소하는 것을 측정하는 단계를 포함하는 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법이다.
상기 혈관주변세포의 세포사멸이 감소하는 것을 측정하는 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, MTT 분석법(MTT Assay), 유세포분석법 또는 FACS 분석법(Flow Cytometry or FACS assay) 으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 동물세포이다. 보다 더 바람직하게는 상기 동물세포는 마우스의 망막세포일 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
세포 준비
인간 제대정맥 내피세포(HUVECs, Human Umbilical vein endothelial cells)와 인간 망막 미세혈관 내피세포(HRMECs, Human Retina Microvascular Endothelial Cells)와 인간 뇌 성상세포(Human Brain Astrocyte)와 인간 혈관주변세포(Human Pericyte)를 각각 EBM-2, M199 배지, 20% FBS가 첨가된 DMEM, 성장물질(growth factor)이 포함된 주변세포 배지에서 관리하며, 모두 95% O2와 5% CO2로 37℃의 인큐베이터에서 배양했다.
시약 및 항체 준비
재조합된 마우스와 인간의 안지오포이틴 2와 인간 인테그린 알파3베타1(human integrin α3β1), phycoerythrin(PE)-접합 항-Tie2 수용체 항체, 마우스 면역글로불린 G 항체(mouse IgG antiboies)를 R＆D systems로부터 구입하였다. 항-Bcl-2 족 항체는 EPTOMICS로부터 구입하였다. 항-phospho-p53 항체, 항-poly ADP ribose polymerase(PARP) 항체, 항-cleaved caspase-3 항체, 항-인테그린 베타1 항체는 cell signaling technology로부터 구입하였다. 항-p53 항체, 항-Tie1 항체, peroxidase-접합 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였다. 항-Tie2항체, H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-OH(GRGDS) 펩티드는 Millipore에서 구입하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 sigma-aldrich로부터 구입하였다. fluorescein isothiocyanate(FITC)-접합 annexin V/propidium iodide assay kit는 BD Biosciences에서 구입하였다. 항-neuron-glial 2(NG2)항체, 항-인테그린 알파3베타1 항체, 항-안지오포이틴 2 항체는 Abcam으로부터 구입하였다. TUNEL fluorescein kit은 Roche로부터 구입하였다. 항-인테그린 알파1 항체(clone FB12, MAB1973), 항-인테그린 알파3 항체(clone P1B5, MAB1952), 항-인테그린 베타1 항체(clone 6S6, MAB2253)와 α integrin blocking and IHC kit는 Millipore에서 구매하였다. p53에 대한 siRNA는 Bioneer에서 구입하였다.
실험동물 준비
모든 동물실험은 안과연구에 대한 동물사용규정과 서울대학교 동물관리사용위원회의 가이드라인을 준수하여 행하여졌다. 8주령의 무균 수컷 C57BL/6J 마우스를 Central Laboratory Animal Inc.로부터 구입하였다. 8주령의 C57BL/6J mice를 8시간 금식 후, streptozotocin을 180mg/kg의 농도로 10mmol/L의 citrate buffer(pH 4.5)에 녹여서 복강내 주사하여 당뇨를 유발하였다. 같은 연령의 대조군은 citrate buffer만을 복강 주사하였다. 4일 후 마우스의 혈당이 300mg/dL를 초과하는 경우 당뇨가 유발된 것으로 처리하여 실험하였다.
당뇨유발 마우스와 대조군 마우스는 당뇨유발 6개월 후 안락사하였다. 마우스의 눈을 마취상태에서 채취하여, ELISA에 쓰일 조직은 -80℃에서 냉동시켰고, 망막 분해(retinal digestion)에 쓰일 조직은 4% paraformaldehyde에서 고정시켰다.
혈당 수준과 체중은 지속적으로 모니터 되었으며, 당화 헤모글로빈은 안락사 직전에 측정하였다.
혈관주변세포와 무세포 모세혈관의 정량분석 실험
6주령 수컷 마우스에 100 ng의 안지오포이틴 2 단백질 또는 100 ng의 안지오포이틴 2 단백질과 500 ng의 항-인테그린 알파3 항체(clone P1B5) 또는 100ng의 안지오포이틴 2 단백질과 500ng의 항-인테그린 베타1 항체(clone 6S6)를 수면마취 후 유리체강내로 주사하였다. 대조군의 경우 멸균 PBS만 동량 주사하였다. 10일 경과 후 망막을 채취하여 망막 분해(Retinal Digestion)를 하였다.
망막의 전체 조직중에서 혈관부분만을 채취하기 위해 트립신 분해 방법(trypsin digestion technique)을 사용하였다. 망막 조직을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 최소 24시간 고정시키고, 물에서 1시간 동안 배양했다. 이것을 다시 2.5% 트립신(trypsin)에서 37℃로 1시간동안 처리하였다. 망막의 내경계막(inner limiting membrane)을 제거하고, 정제수(filerterd water)를 통해 망막 혈관(retinal vessel)을 분리해냈다. 망막 샘플은 건조한 후 periodic acid Schiff base에서 15분간 염색하고 hematoxylin에서 염색하였다.
이를 항-토끼 NG2 항체와 TUNEL 형광 kit를 사용하여 배양하였고, 핵은 DAPI로 대조염색하였다. TUNEL과 항-토끼 NG2항체에 모두 양성인 세포들은 세포사멸 여부를 형광현미경으로 확인하였다.
혈관주변세포와 무세포 모세혈관의 수를 파악하기 위해, 분해된 망막 조직을 분석하였다. 혈관주변세포는 그 형태와 모세혈관에 대한 상대적 위치를 확인하여 분석하였다. 망막 모세혈관 부위의 가운데 1/3지점에서 10개의 무작위로 선정된 구역을 400배 배율에서 측정하였다.
측정된 혈관주변세포와 무세포 모세혈관의 수는 모세혈관의 면적(mm2의 모세혈관 면적당 세포나 무세포 모세혈관의 수)에 따라 보정되었다. 모세혈관의 면적은 NIS-element AR 3.2 프로그램(Nikon)으로 계산하였다.
세포생존율 분석 실험
2.5 X 104개의 세포를 96-well plate에 분배하였다. 24시간후 세포에 안지오포이틴 1(300 ng/ml)과 안지오포이틴 2(300 ng/ml)를 정상 포도당(5mmol/L 포도당), 고포도당(25mmol/L 포도당), 그리고 대조군으로 고만니톨(5mmol/L 포도당과 20mmol/L 만니톨) 조건에서 48시간 동안 처리하였다. 세포 생존율은 MTT 분석법으로 측정되었으며, 3회 독립 시행하였다.
FACS 분석 실험
세포사멸 분석
세포사멸을 분석하기 위해, 5 X 105 개의 세포에 안지오포이틴 2(300 ng/ml) 단백질을 각각 정상 포도당, 고 만니톨, 고포도당 조건에 처치하고 48시간동안 37℃에서 배양하였다. 인테그린 억제 효과를 확인하기 위해, 항-인테그린 항체들(5 μg/ml)을 안지오포이틴 2 단백질을 처치하기 1시간 전에 전처치하였다. 세포들을 채취 후 PBS로 두 번 세척하였고, 이후 FITC annexin-V와 propidium iodide(PI)로 15분간 염색하였다. 세포분석은 flow cytometry로 분석하였고, Annexin V 양성/PI 음성 세포들을 세포사멸이 일어난 세포로 측정하였다
Tie2 발현 분석
Tie2 발현은 확인하기 위해, 혈관주변세포와 인간 제대정맥 내피세포(1 X 106)를 각 실험마다 PE-접합 항-Tie2 항체가 포함된 4℃의 25㎖의 완전배지에서 1시간 동안 부유배양하였다. 이에 대한 대조군으로서는 PE-접합 마우스 면역글로불린 G 항체가 사용되었다
정량 RT-PCR 실험
총 RNA는 RNeasy Plus Mini kit(Qiagen)을 사용하여 세포로부터 분리하였다. cDNA는 1㎍의 RNA에서 2.5μ㏖/L의 oligo-dT primer, 1m㏖/L의 deoxyribonucleotide triphosphates, murine leukemia virus RT를 사용하여 준비하였다. 정량 PCR 분석은 Apllied Biosystems의 SYBR green PCR master Mix를 사용하여 7900HT real-time PCR장비에서 수행하였다. qPCR의 반응 조건은 95℃에서 5초, 60℃에서 20초 동안 50 사이클을 하였다. 정량 real-time PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다.
안지오포이틴 2 (포워드: 5’-ACTGTGTCCTCTTCCACCAC-3’(서열번호 1) 및 리버스: 5’-GGATGTTTAGGGTCTTGCTTT-3 (서열번호 2));
Tie-2 (포워드: 5’-GCTTGCTCCTTTCTGGAACTGT-3’ (서열번호 3) 및 리버스: 5’-CGCCACCCAGAGGCAAT-3’(서열번호 4));
Tie-2 PCR에는 다른 프라이머도 사용되었다. (포워드: 5'-TGTTCCTGTGCCACAGGCTG-3' (서열번호 5) 및 리버스: 5'-CACTGTCCCATCCGGCTTCA-3' (서열번호 6)).
Tie-1 (포워드: 5’-AGAACCTAGCCTCCAAGATT-3’ (서열번호 7) 및 리버스: 5’-ACTGTAGTTCAGGGACTCAA-3’ (서열번호 8));
인테그린 알파1 (포워드: 5’-GGTTCCTACTTTGGCAGTATT-3’ (서열번호 9) 및 리버스: 5’- AACCTTGTCTGATTGAGAGCA-3’ (서열번호 10));
인테그린 알파3 (포워드: 5’-AAGGGACCTTCAGGTGCA-3’ (서열번호 11) 및 리버스: 5’-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3’ (서열번호 12));
인테그린 베타1 (포워드: 5’-GAAGGGTTGCCCTCCAGA-3’ (서열번호 13) 및 리버스: 5’-GCTTGAGCTTCTCTGCTGTT-3’ (서열번호 14));
β-actin (포워드: 5’-GCCGCCAGCTCACCAT-3’ (서열번호 15) 및 리버스: 5’-TCGATGGGGTACTTCAGGGT-3’ (서열번호 16)).
평균 발현양은 각 샘플당 3회 반복 실험과 실험 결과를 대조군 유전자에 보정하여 산출되었다. PCR 결과물은 1% 아가로스 겔에서 분리되어 자외선 투과 하에 Invitrogen의 SYBR Safe DNA Gel Stain을 이용하여 시각화되었다.
면역침강과 면역블로팅 실험
면역침강을 위해 안지오포이틴 2(500 ng), 인테그린 알파3베타1(500 ng), 항-인테그린 알파3베타1 항체(2 ㎍)를 4℃의 G-sepharose beads에서 밤새 배양하였다. 면역 단백질 복합체는 원심분리로 분리한 후 버퍼를 사용하여 3번 세척하였다. 면역블로팅을 위해서 세포를 채취하고, 단백질 분해효소 억제제가 포함된 방사성 면역 침전 분석 버퍼(radioimmunoprecipitation assay buffer)로 용해하였다. 단백질 용해물은 SDS PAGE로 전기영동하여 분리하고, 이를 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 니트로셀룰로스 막은 1:1000 비율의 일차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하고, 1:5000 비율의 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 막은 enhanced chemiluminescent substrate (Pierce)를 사용하여 단백질을 측정하였고, 이를 필름에 노출하여 결과를 확인하였다.
통계 분석
실험한 결과값은 standard two-tailed student t test로 분석하였고, P값이 0.01 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
망막 모세혈관의 혈관주변세포는 당뇨병 마우스의 망막에서 줄어든다.
스트렙토조톡신에 의해 당뇨가 유발된 마우스와 대조군인 같은 주령의 정상 마우스의 망막 분해(retina digestion) 조직에서 혈관주변세포와 무세포 모세혈관의 수를 비교하였다(도1). 망막 모세혈관 혈관주변세포는 당뇨병 유발 마우스의 망막(932.6±70.3)에서 대조군의 망막(1341.8±55.9, p<0.001)에 비해 유의하게 감소하였다(도2). 반면, 망막의 무세포 모세혈관은 당뇨병 유발 마우스의 망막(93.0±22.5)에서 대조군의 망막(28.1±11.5, p<0.001)에 비해 유의하게 증가하였다(도3). 다음 표는 실험군의 대사지표와 생체지표를 나타낸다.
비당뇨 당뇨 P값
몸무게(g) 32.46±3.22 18.97±0.69 <0.001
혈당(m㏖/L) 10.11±1.48 32.83±1.34 <0.001
HbA1c(%) 5.33±0.88 8.90±1.10 <0.001
HbA1c(m㏖/㏖) 34.75±9.74 73.75±11.95

안지오포이틴 2는 당뇨병의 망막에서 증가하며, 안지오포이틴 2의 원천은 혈관내피세포이다.
고혈당 상태가 안지오포이틴 2의 발현에 미치는 영향
정량 RT-PCR 실험에서, 6개월된 당뇨병 마우스의 망막에서의 안지오포이틴 2의 mRNA는 정상 마우스의 망막에서의 안지오포이틴 2에 비해 1.87배 증가하였다 (p=0.004; 도4). 또한 안지오포이틴 1의 mRNAsms 2.54(P=0.004)배, VEGF 알파의 mRNA는 1.6배(P=0.027) 증가하였다.
안지오포이틴 2의 원천
본 발명자들은 당뇨병 망막에서 안지오포이틴 2의 원천을 확인하기 위해 정량 real time PCT 실험을 통해 생체외에서(in vitro) 혈-망막 장벽(blood retinal barrier)의 주요 구성요소인 인간 망막 미세혈관 내피세포, 혈관주변세포, 성상세포의 안지오포이틴 2의 mRNA 전사량을 측정하였다. 고 포도당 조건의 인간 망막 미세혈관 내피세포에서 안지오포이틴 2의 mRNA 수준(1.52±0.09, P=0.003)은 정상 포도당 조건에 비해 1.5배 이상 증가하였다(도5). 반면, 삼투압 대조군인 고만니톨은 인간 망막 미세혈관 내피세포에서 안지오포이틴 2의 mRNA 발현(1.21±0.13, P=0.094)을 증가시키지 않았다(도5). 또한 고 포도당 조건의 혈관주변세포(1.13±0.22, P=0.418)와 성상세포(1.13±0.22, P=0.418)에서는 안지오포이틴 2의 mRNA 발현을 증가시키지 않았다(도6, 도7).
이 결과들은 안지오포이틴 2가 당뇨병이 있는 망막에서 증가하며, 안지오포이틴 2는 망막내 미세혈관의 혈관내피세포에서 유래한다는 것을 나타낸다.
안지오포이틴 2는 고 포도당 조건에서 혈관주변세포의 세포사멸을 증가시킨다.
본 발명가들은 세포생존율 분석 실험과 FACS 분석 실험을 통하여 고 포도당 조건에서 안지오포이틴 2가 세포의 생존율과 세포사멸에 미치는 영향을 분석하였다.
혈관주변세포 분석
세포생존율 분석 실험에서, 안지오포이틴 2 단독으로는 혈관주변세포의 생존율에 큰 영향을 주지 않았다(97.6±3.6%, P=0.221). 고 포도당 조건에서는 혈관주변세포의 생존율이 감소(89.4±7.9%, P=0.020)하였다(도8). 즉, 안지오포이틴 2는 고 포도당 조건에서 더 많은 혈관주변세포의 죽음(72.4±2.9%, P=0.002)을 유도하였다(도8).
FACS 분석 실험에서, 고 포도당 조건에서의 혈관주변세포의 세포사멸(7.7±0.3%, P<0.001)은 대조군에서의 혈관주변세포의 세포사멸(2.4±0.4%)에 비해 더 증가하였다. 더욱이 안지오포이틴 2는 고 포도당 유도의 혈관주변세포의 세포사멸을 더욱 가중시켰으나(25.9±0.4%, P<0.001), 정상 포도당 조건에서는 세포사멸을 유발하지 않았다(2.7±0.1%, P=0.298)(도9).
망막 미세혈관 내피세포 분석
세포생존율 분석 실험에서, 안지오포이틴 1과 안지오포이틴 2는 고 포도당 조건에서 모두 인간 망막 미세혈관 내피세포의 세포생존율을 증가시켰다(114.4±8.8%, P=0.014, and 109.5±2.3%, P=0.040)(도10).
FACS 분석 실험에서는 안지오포이틴 2에 의해 인간 망막 미세혈관 내피세포의 세포사멸이 유의하게 감소하였다(도11).
이러한 결과는 안지오포이틴 2가 고 포도당 조건에서 혈관주변세포의 세포사멸을 증가시키는 반면 망막 미세혈관 내피세포는 보호하는 역할을 함을 나타낸다.
안지오포이틴2는 고 포도당 조건에서 p53 인산화 경로를 통해 혈관주변세포의 세포사멸을 유발한다.
웨스턴 블롯 실험을 통해, 안지오포이틴 2가 고 포도당 조건에서는 잘 알려진 세포사멸 경로인 Bax, cleaved PARP, cleaved caspase-3의 활성화를 유도하지만, 정상 포도당 조건에서는 이러한 경로의 활성화를 유도하지 않았다(도12). 또한 고 포도당 조건에서 안지오포이틴 2가 p53 인산화와 그로 인한 p53 단백질의 축적을 일으켰다.
안지오포이틴 2에 의해 나타나는 혈관주변세포 세포사멸에 있어서 p53 인산화 경로가 가지는 역할을 확인하기 위해, 혈관주변세포에 두 종류의 p53 siRNA와 대조 siRNA를 처리하였다. p53 siRNA는 p53 단백질 발현을 감소시켰다(도15). 또한 FACS 분석 실험에서는 p53 siRNA가 안지오포이틴 2에 의한 혈관주변세포의 세포사멸도 감소시켰다(도16).
안지오포이틴 2는 Akt가 아닌 세포외 신호 관련 인산화효소(extracelluar signal-related kinase, ERK)의 인산화를 일으켰다(도17). 안지오포이틴 2에 의한 ERK의 인산화는 ERK 억제제인 PD98059에 의해 억제되는데, ERK 억제제를 사용하여 안지오포이틴 2에 의한 p53의 인산화를 감소시킬 수 있었다(도18).
이 결과는 고 포도당 조건에서 일어나는 안지오포이틴 2에 의한 혈관주변세포의 세포사멸이 p53 인산화 경로에 의해 유도된다는 것을 나타낸다.
고포도당 조건에서의 안지오포이틴2에 의한 혈관주변세포의 세포사멸은 Tie2 수용체가 아닌 인테그린이 중요하게 작용한다.
웨스턴 블롯 실험에서, 혈관주변세포는 Tie-2 와 Tie-1 수용체 모두에 발현하지 않은 반면, 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)는 두 수용체 모두에서 발현했다(도19).
이러한 결과는 정량 real time-PCR 실험에서도, Tie2의 mRNA와 Tie1의 mRNA모두 HUVEC보다 혈관주변세포에서 유의적으로 낮게 발현하였다(도20). 또한 FACS 분석에서, HUVEC에 비해 혈관주변세포는 Tie-2 수용체를 발현하지 않았다(도21).
고 포도당 조건에서의 혈관주변세포의 세포사멸에서 인테그린이 안지오포이틴 2에 대한 수용체인지 확인하기 위해, 본 발명가들은 혈관주변세포를 안지오포이틴 2, GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser) 펩티드와 함께 고 포도당 상태에서 15분 간 배양하였는데, GRGDS는 인테그린이 RGD(Arg-Gly-Asp) 서열과 결합하는 것을 억제한다. 실험 결과 GRGDS(0.5 mg/ml)는 안지오포이틴 2에 의한 p53 인산화를 감소시켰다(도22).
이러한 결과는 인테그린 신호전달 기전이 안지오포이틴 2에 의해 일어나는 p53의 인산화에 관여한다는 것을 보여준다. 즉, 고 포도당 조건에서 안지오포이틴 2에 의해 일어나는 혈관주변세포 세포사멸에서는 Tie-2 수용체가 아니라 인테그린이 안지오포이틴 2에 대한 수용체로써 중요하게 작용한다는 것을 나타낸다.
고 포도당 상태는 혈관주변세포의 인테그린 알파1, 알파3, 베타1의 발현을 증가시킨다.
인테그린을 통한 안지오포이틴 2 유도성의 혈관주변세포의 세포사멸은 정상 포도당 조건이 아닌 고포도당 조건에서만 일어났다. 본 발명가들은 고포도당 조건에서는 인테그린의 발현 패턴이 변화되면서 혈관주변세포가 안지오포이틴 2에 더 민감해질 것이라는 가설을 설정하였다. 어떠한 인테그린 subunit이 안지오포이틴 2 유도성의 혈관주변세포의 세포사멸에 관여하는 지를 확인하기 위해 인테그린 알파 subunit들(α1-6, αV)을 검색한 결과, 항-인테그린 알파1과 알파3 항체가 안지오포이틴 2 유도성의 p53의 인산화를 감소시켰다(도23).
고포도당 조건이 인테그린 수용체의 발현 패턴을 변화시키는지를 확인하기 위해, 인테그린 알파1, 알파3, 베타1에 대한 발현 변화를 정량 real time-PCR과 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 이 세가지 인테그린을 선택한 이유는 인테그린 알파1과 알파3는 인테그린 베타1과 유일하게 헤테로다이머(heterodimer)를 만들 수 있기 때문이다. 인테그린 알파1(1.86-fold and 2.20-fold, p<0.01), 인테그린 알파3(1.50-fold, 1.83-fold, p<0.01), 인테그린 베타1(1.50-fold, 1.43-fold, p<0.01)의 mRNA 모두 고포도당 조건에서 증가하였다(도24). 고포도당은 인테그린 알파1, 알파3, 베타1의 발현 역시 증가시켰다(도25). 그러나 인테그린 알파1원 인테그린 알파3에 비해 상당히 적은 발현양을 나타냈다.
면역침강 실험을 통해서 안지오포이틴 2 단백질이 인테그린 알파3베타1 단백질과 결합한다는 것을 확인하였다(도26).
인테그린 알파3베타1을 억제하면 안지오포이틴 2에 의한 혈관주변세포의 세포사멸이 감소한다.
고포도당 조건에서의 인테그린의 발현 결과를 통해 인테그린 알파1베타1이나 인테그린 알파3베타1이 안지오포이틴 2의 수용체라고 가정할 수 있다. 안지오포이틴 2에 의한 혈관주변세포의 세포사멸이 인테그린 알파1베타1 또는 인테그린 알파3베타1을 통해 일어나는 것인지를 확인하기 위해, 혈관주변세포를 25m㏖/L의 고포도당 조건에서 안지오포이틴 2, 항-인테그린 알파1 항체, 항-인테그린 알파3 항체, 항-인테그린 베타1 항체를 넣고 48시간 동안 배양하였다. 안지오포이틴 2에 의한 혈관주변세포의 세포사멸은 항-인테그린 알파3 항체와 항-인테그린 베타1 항체에 의해서는 억제되었지만 항-인테그린 알파1 항체에 의해서는 억제되지 않았다(도27).
이러한 결과는 웨스턴 블롯에 의한 p53 단백질의 발현 측정에 의해서도 확인되었다(도28). 안지오포이틴 2는 고포도당 조건에서 p53 단백질의 발현량을 증가시켰지만(2.7±0.2, p<0.01), 항-인테그린 알파1 항체, 항-인테그린 알파3 항체, 항-인테그린 베타1 항체에 의해서는 감소하였다(각 1.5±0.2, 1.0±0.1, and 0.7±0.1, p<0.01).
마우스의 유리체강내 주사 실험에서, 안지오포이틴 2를 안구내 주사한 경우 대조군인 PBS만을 주사한 마우스에 비해 혈관주변세포의 소실이 증가하였다(1047±52 cells/mm2, 1401±109cells/mm2, p<0.001). 안지오포이틴 2 유도성 혈관주변세포의 소실은 항-인테그린 알파3 항체나 항-인테그린 베타1 항체를 투여했을 때 유의하게 감소하였다(1354±148cells/mm2, 1380±66cells/mm2, p<0.001)(도29).
또한 안지오포이틴 2 유도성의 세포사멸이 일어난 TUNEL과 NG2 모두에 양성인 혈관주변세포 역시 항-인테그린 알파3 항체와 항-인테그린 베타1 항체가 주사된 마우스에서 감소하였다(도30).
이러한 생체내 실험결과는 안지오포이틴 2에 의한 혈관주변세포의 소실은 망막에서의 세포사멸을 통해 일어난다는 것을 나타낸다. 그리고 전체적으로 인테그린 알파3와 인테그린 베타1이 p53의 인산화 경로를 통한 안지오포인틴 2 유동성 혈관주변세포의 세포사멸에서 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다.
<110> SNU R&BD Foundation <120> Composition for Treatment of Diabetic Retinopathy Comprising in Inhibitor of Integrin alpha3 or beta1 and Screening Method for the Composition <130> PN140040 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angiopoietin 2 forward primer <400> 1 actgtgtcct cttccaccac 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angiopoietin 2 reverse primer <400> 2 ggatgtttag ggtcttgctt t 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tie-2 forward primer <400> 3 gcttgctcct ttctggaact gt 22 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tie-2 reverse primer <400> 4 cgccacccag aggcaat 17

Claims (24)

  1. 항-인테그린 알파3 항체를 포함하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항-인테그린 알파3 항체는 p53 단백질의 인산화 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물.
  3. 항-인테그린 베타1 항체를 포함하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 항-인테그린 베타1 항체는 p53 단백질의 인산화 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물.
  5. 항-인테그린 알파3 항체를 포함하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증에서의 시력 개선을 위한 건강기능식품.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 항-인테그린 알파3 항체는 p53 단백질의 인산화 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증에서의 시력 개선을 위한 건강기능식품.
  7. 항-인테그린 베타1 항체를 포함하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증에서의 시력 개선을 위한 건강기능식품.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 항-인테그린 베타1 항체는 p53 단백질의 인산화 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증에서의 시력 개선을 위한 건강기능식품.
  9. 인테그린 알파3을 갖는 세포를 배양하는 단계;
    상기 세포에 잠재적인 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 인테그린 알파3의 활성이 저해되는 것을 측정하는 단계를 포함하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 세포는 동물세포인 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 동물세포는 마우스의 망막세포인 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 인테그린 알파3의 활성이 저해되는 것을 측정하는 방법은 PCR, 면역침강법(Immunoprecipitation), 공동면역침강법(Co-immunoprecipitation), 면역블롯팅 및 웨스턴블롯팅(Immunoblotting or Western Blotting)으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  13. 인테그린 베타1을 갖는 세포를 배양하는 단계;
    상기 세포에 잠재적인 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 인테그린 베타1의 활성이 저해되는 것을 측정하는 단계를 포함하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 세포는 동물세포인 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 동물세포는 마우스의 망막세포인 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 인테그린 베타1의 활성이 저해되는 것을 측정하는 방법은 PCR, 면역침강법(Immunoprecipitation), 공동면역침강법(Co-immunoprecipitation), 면역블롯팅 및 웨스턴블롯팅(Immunoblotting or Western Blotting)으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  17. 인테그린 알파3를 갖는 세포를 배양하는 단계;
    상기 세포에 잠재적인 물질을 처리하는 단계; 및
    혈관주변세포(Pericyte)의 세포사멸이 감소하는 것을 측정하는 단계를 포함하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 세포는 동물세포인 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 동물세포는 마우스의 망막세포인 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 상기 혈관주변세포의 세포사멸이 감소하는 것을 측정하는 방법은 MTT 분석법(MTT Assay), 유세포분석법 또는 FACS 분석법(Flow Cytometry or FACS assay) 으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  21. 인테그린 베타1을 갖는 세포를 배양하는 단계;
    상기 세포에 잠재적인 물질을 처리하는 단계; 및
    혈관주변세포(Pericyte)의 세포사멸이 감소하는 것을 측정하는 단계를 포함하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 세포는 동물세포인 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 동물세포는 마우스의 망막세포인 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
  24. 제 21항에 있어서, 상기 혈관주변세포의 세포사멸이 감소하는 것을 측정하는 방법은 MTT 분석법(MTT Assay), 유세포분석법 또는 FACS 분석법(Flow Cytometry or FACS assay) 으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 혈관주변세포 소실로 인한 비증식성(non-proliferative) 당뇨병성 망막병증 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법.
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