KR101748867B1

KR101748867B1 - 조기 유방암 예후 예측 진단용 자동화 시스템

Info

Publication number: KR101748867B1
Application number: KR1020130043722A
Authority: KR
Inventors: 김영덕; 오은설; 조상래
Original assignee: 주식회사 젠큐릭스
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2017-06-20
Also published as: WO2014171800A1; KR20140125647A

Abstract

본 발명은 조기 유방암 예후 예측 진단용 자동화 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유방암 환자의 예후 예측 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로 부터 자동화 가능한 단계를 포함하는 유방암 예후 예측치를 산출하는 방법, 그 방법에 적합한 장치 및 컴퓨터 판독가능한 매체에 관한 것이다. 본 발명의 시스템은 자동화된 과정으로 유방암 환자 예후의 예측, 진단이 가능하므로 항암치료의 필요성 판단을 비롯하여 향후 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

조기 유방암 예후 예측 진단용 자동화 시스템{Automated system for prognosing or predicting early stage breast cancer}

본 발명은 조기 유방암 예후 예측 진단용 자동화 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유방암 환자의 예후 예측 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 자동화 가능한 단계를 포함하는 유방암 예후 예측치를 산출하는 방법, 그 방법에 적합한 장치 및 컴퓨터 판독가능한 매체에 관한 것이다.

유방암은 자가진단이 가능하고 자가진단의 중요성이 많이 홍보되면서 초기에 발견되는 경우가 많다. 이러한 초기 유방암 환자들에 대해 수술 후 항암치료의 여부를 결정하기가 어려웠다. 병리학적 관찰로 대략적인 예후를 예측할 수 있으나, 관찰결과에 대한 표준화와 정량화가 어렵고 예후예측에 대한 신뢰성이 낮아, 실제 임상에서는 대부분의 초기 유방암 환자에게 항암치료를 권하고 있다. 항암치료의 특성상 환자가 겪는 고통이 매우 크고 경제적 지출이 요구되는데, 초기 유방암의 경우, 항암치료가 필요하지 않은 환자가 절반 이상일 것으로 추측된다. 따라서, 초기 유방암의 특성을 분석하여 환자의 예후를 예측하여 불필요한 항암치료를 줄인다면, 환자의 삶의 질에 큰 도움이 될 것이다. 마이크로어레이를 이용하여 유방암의 수만 개의 유전자의 발현량에 대한 정보를 한 번에 얻을 수 있게 되면서, 분자수준에서 유방암을 분류하고 암의 발생과 발달에 대한 메커니즘을 밝히고자 하는 연구가 활발하게 수행되고 있다. 초기유방암 환자의 예후를 예측하는 것은 임상에서 중요한 일이고, 마이크로어레이를 이용하여 예후를 예측하는 유전자를 발굴하는 일은 이미 2000년대 초부터 시작되었다. 마이크로어레이를 이용한 연구가 고비용임에도 불구하고, 상당한 수의 유방암조직에 대한 발현 profiles이 생산되었고, 연구자들에게 공개되어왔다. 2002년, 78명의 초기유방암 조직과 10여 년 동안 추적된 환자의 생존정보를 분석하여 70개의 예후예측유전자가 발굴된 것을 시작으로 하여, 이후 십여 가지의 예후예측 유전자들이 발표되었고, 그 중 몇 가지는 이미 상용화되어 임상에서 활용되고 있다(Chang, H.Y., et al., Gene expression signature of fibroblast serum response predicts human cancer progression: similarities between tumors and wounds. PLoS Biol 2(2): p. E7(2004); van de Vijver, M.J., et al., A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 347(25):1999-2009(2002); van 't Veer, L.J., et al., Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 415(6871): 530-536(2002); Wang, Y., et al., Gene-expression profiles to predict distant metastasis of lymph-node-negative primary breast cancer. Lancet 365(9460): 671-679(2005); Buyse, M., et al., Validation and clinical utility of a 70-gene prognostic signature for women with node-negative breast cancer. J Natl Cancer Inst, 98(17):1183-92(2006); Paik, S., Development and clinical utility of a 21-gene recurrence score prognostic assay in patients with early breast cancer treated with tamoxifen. Oncologist 12(6):631-635(2007); Paik, S., et al., A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated, node-negative breast cancer. N Engl J Med 351(27) :2817-2826(2004); Sotiriou, C., et al., Gene expression profiling in breast cancer: understanding the molecular basis of histologic grade to improve prognosis. J Natl Cancer Inst 98(4):262-72(2006); Pawitan, Y., et al., Gene expression profiling spares early breast cancer patients from adjuvant therapy: derived and validated in two population-based cohorts. Breast Cancer Res 7(6):R953-964(2005); Miller, L.D., et al., An expression signature for p53 status in human breast cancer predicts mutation status, transcriptional effects, and patient survival. Proc Natl Acad Sci USA, 102(38):13550-13555(2005); Bild, A.H., et al., Oncogenic pathway signatures in human cancers as a guide to targeted therapies. Nature 439(7074):353-357(2006); Teschendorff, A.E., et al., A consensus prognostic gene expression classifier for ER positive breast cancer. Genome Biol 7(10):R101(2006); Desmedt, C., et al., Strong time dependence of the 76-gene prognostic signature for node-negative breast cancer patients in the TRANSBIG multicenter independent validation series. Clin Cancer Res 13(11): 3207-3214(2007)). 대표적으로 mammaprint(Agendia)와 Oncotype DX(genomic health)가 있으며 임상에서 현재 활용되고 있지만, 여전히 예후에 대한 하나의 참고 자료로서 사용되는 경우가 많은 실정이다 (van de Vijver, M.J., et al., A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 347(25):1999-2009(2002); Paik, S., et al., A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated, node-negative breast cancer. N Engl J Med 351(27) :2817-2826(2004)).

아울러, 상기 방법들은 고도로 숙련된 실험자에 의하지 않으면 결과의 신뢰성이 떨어지는 경우가 많다. Oncotype DX의 경우 central lab 방식으로 환자의 시료를 정해진 과정에 따라서 서비스 제공회사 (genomic health)에 제공하여야 비교적 의미있는 결과를 얻을 수 있다. 이와 같이 종래의 예후 예측 진단 방법은 실험자의 숙련도에 따라서 예후 예측 진단 결과에 오류가 생길 우려가 있어 안정적인 결과를 얻기 위하여 실험자의 관여가 가급적 배제된 방법이나 자동화 과정이 필요한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

이에 본 발명자들은 환자의 암세포를 포함하는 조직의 FFPE 시료를 이용하여 초기 유방암 환자에 대한 예후예측 및 항암치료 여부 등을 진단할 수 있는 유전자 진단 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 초기 유방암 조직으로부터 데이터와 임상정보를 수집 및 분석하여 예후예측과 관련된 유전자를 발굴하고, 이에 적합한 방법, 특히 자동화된 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 유방암 환자를 예후 예측 진단하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 유방암 환자의 예후 예측치 산출 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 유방암 환자의 예후 예측치를 산출하도록 하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유방암 환자를 예후 예측 진단하는 새로운 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유방암 환자의 예후 예측치 산출 장치를 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유방암 환자의 예후 예측치를 산출하도록 하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공한다.

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2ded.1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered.,1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 유방암 환자의 예후 예측 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측치를 산출하는 방법을 제공한다:

(a) 환자의 유방암 조직을 포함하는 포르말린 고정 파라핀 포매 (formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 시료에 파라핀 제거 및 세포용해용 버퍼를 처리하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 시료에 단백질분해효소 (proteinase)를 처리하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 시료에서 단백질 또는 세포 잔해물 (debris)을 제거하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계의 시료에 DNA 분해효소를 처리하여 RNA를 수득하는 단계;

(e) 상기 RNA를 검출 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 RT-qPCR 프리믹스와 혼합하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계의 혼합물에서 cDNA (complementary DNA)를 생성시키는 단계;

(g) 상기 cDNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 PCR 프라이머로 하여 PCR 반응을 수행하는 단계;

(h) PCR 반응에 대한 Cp 값을 측정하는 단계;

(i) 유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자에 대한 Cp값 및 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자에 대한 Cp값을 표준유전자의 Cp값으로 표준화하여 표준화된 발현 수준을 산출하는 단계;

(j) 표준화된 유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자의 표준화된 발현 수준이 낮을수록, 그리고 표준화된 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자의 표준화된 발현 수준이 높을수록 유방암 예후가 좋은 것으로 유방암 예후 예측치를 산출하는 단계.

본 발명은 방법은 바람직하게는 자동화 또는 반자동화된 방법이다. 상기에서 자동화는 샘플 (시료)의 투입; 추출, 분리, 반응이 완료된 기재 (예를 들어, 튜브, 플레이트)의 재배치 또는 이동; 시약, 버퍼의 스톡 (stock)에의 투입, 보충; 장비의 유지관리를 제외한 전부 또는 대부분 과정이 인간 이외의 수단 (예를 들어, 로봇)을 통해서 이루어지는 것을 의미한다.

이하에서 각 단계에 대해서 상세히 설명한다.

(a) 단계는 환자의 유방암 조직을 포함하는 포르말린 고정 파라핀 포매 (formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 시료에 파라핀 제거 및 세포용해용 버퍼를 처리하는 단계이다.

생검 후 환자에게서 얻은 조직은 통상적으로 포르말린(포름알데히드) 등에 의해서 고정화한다. 고정화한 생물학적 샘플은 일반적으로 탈수시키고, 파라핀 등의 고체 지지체에 포매하며, 이렇게 제조된 시료를 FFPE 시료라고 한다. FFPE 시료 상의 RNA는 고정된 세포에 존재하고, 단편화 되어 있거나 포르말린에 의해 교차 결합되어 있으므로 파라핀을 제거하고 고정된 세포를 용해하여 RNA를 비롯한 핵산을 세포 내에서 용출시킬 필요가 있다.

본 발명에 있어서 용어 “파라핀”은 형태학적, 면역조직화학적 및 효소조직화학적인 해석을 포함하는 모든 해석에 있어서 사용되는 생체시료의 포매 매체를 포괄적으로 말하는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서의 파라핀은 석유계 파라핀 왁스 단체(單體)여도 되고, 당해 석유계 파라핀 왁스를 기제(基劑)로 하여, 포매 매체의 품질향상 등의 목적으로 첨가될 수 있는 모든 다른 성분을 포함한 것이어도 된다. 여기서, 석유계 파라핀 왁스는 석유에 유래하는 상온에서 고형인 탄화수소류의 혼합물을 말한다.

본 발명에서는 바람직하게는 FFPE 처리된 유방암 환자의 검체를 회전식 미세톱 (rotary microtome)으로 5~10μm 의 두께로 절단한 다음 FFPE 용 버퍼(FFPE buffer, VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, siemens)를 혼합하고, 80℃에서 30분간 인큐베이션(incubation)하였다.

FFPE 시료의 양의 조절 및 시약과의 접촉의 용이성을 위하여 마이크로톱(microtome)을 사용하여 FFPE 시료를 절단할 수 있다. 절단 두께는 이에 한정되지는 않으나, 5 내지 15μm가 바람직하다. 절단된 FFPE 시료는 RNA 추출용 tube에 넣고 추출과정을 진행한다.

(b) 단계는 상기 (a) 단계의 시료에 단백질분해효소 (proteinase)를 처리하는 단계이다.

단백질분해효소의 작용으로 시료 내의 단백질이 분해되어 단편화된다. 바람직하게 본 발명에서 단백질분해효소는 단백질분해효소 K이다. 단백질분해효소 K (proteinase K, EC 3.4.21.64)는 곰팡이의 일종인 Engyodontium album에서 발견된 단백질 분해효소로 세린 단백질분해효소의 한 종류이다. 단백질분해효소 K의 처리는 바람직하게는 20 내지 40분, 45 내지 70℃, 더 바람직하게는 25 내지 35분, 60 내지 65℃, 가장 바람직하게는 30분, 65℃의 조건으로 처리한다. 상기 처리 조건의 하한값 미만의 처리는 단백질 분해 효율이 떨어져 궁극적으로 RNA 분리 효율이 감소되며, 상한값 초과의 처리는 분리 과정 중의 RNA의 분해로 RNA 분리 효율이 감소하고, 전체적인 분리 시간이 증가되어 생산성이 떨어지게 된다.

(c) 단계는 상기 (b) 단계의 시료에서 단백질 또는 세포 잔해물 (debris)을 제거하는 단계이다.

상기 (b) 단계의 단백질분해효소의 처리로 단편화된 단백질과 분해되지 않은 세포 잔해물을 RNA, DNA 등의 핵산과 분리하여 제거한다. 제거 과정은 마그네틱 비드와 결합시킨 다음 자기력을 부여하고, 침전되거나 한 쪽으로 모이지 않은 상등액을 수득하거나, 원심분리를 통해 침전물을 제거하고, 상등액만을 수득하는 과정에 의해서 수행될 수 있다.

(d) 단계는 상기 (c) 단계의 시료에 DNA 분해효소를 처리하여 RNA를 수득하는 단계이다.

(c) 단계까지의 분리를 통해 DNA와 RNA를 포함하는 핵산의 분리가 이루어진다. RNA 만을 분리하기 위하여 DNA 분해효소를 처리한다. DNA 분해효소는 바림직하게는 DNase I일 수 있다.

(e) 단계는 상기 RNA를 검출 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 RT-qPCR 프리믹스와 혼합하는 단계이다.

분리된 RNA는 RT-qPCR 반응을 위하여 프라이머 세트 및 RT-qPCR 프리믹스와 혼합된다. 프라이머 세트는 대상이 되는 타겟 유전자, 표준 유전자 또는 참조 유전자를 증폭할 수 있다. RT-qPCR 프리믹스는 역전사 반응을 위한 역전사 효소, PCR 반응을 위한 DNA 중합효소 (예를 들면, Tag polymerase), PCR 반응의 정량적 검출을 위한 염료 (예를 들면, 형광 염료), 역전사 반응 및 PCR 반응에 적합한 버퍼, dNTP 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

(f) 단계는 상기 (e) 단계의 혼합물에서 cDNA (complementary DNA)를 생성시키는 단계이다.

역전사 반응에 의해서 RNA로부터 cDNA를 합성한다. 합성에 필요한 효소, dNTP, 버퍼는 상기 RT-qPCR 프리믹스에 이미 포함되어 있다. cDNA의 합성은 PCR 전 단계로 바람직하게는 45 내지 55℃, 15 내지 30분, 더 바람직하게는 50℃, 20분의 조건으로 수행될 수 있으며, 상기 처리 조건의 하한값 미만의 처리는 cDNA 합성 효율이 떨어져 정확한 정량이 어려우며, 상한값 초과의 처리는 전체적인 분리 시간이 증가되어 생산성이 떨어지게 된다.

바람직하게는 cDNA 합성 이후 별도의 처리 없이 바로 PCR 반응이 진행된다.

(g) 단계는 상기 cDNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 PCR 프라이머로 하여 PCR 반응을 수행하는 단계이다.

합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 반응이 진행된다. PCR 반응은 정량적 PCR로 당업계에 공지된 방법이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 형광 신호 검출에 의할 수 있으며, UPL 프로브 (Hydrolysis probe : 5’-FAM, 3’-Dark quencher)의 형광을 측정하여, cycle에 따른 PCR 산물의 증폭량을 quencher가 제거될 때 발생하는 reporter dye의 형광물질을 통해 실시간 검출될 수 있다.

(h) 단계는 PCR 반응에 대한 Cp 값을 측정하는 단계이다.

형광신호를 활용한 정량적 PCR에서 Cp 값 (Cp value, Ct value와 같음, cross point value)은 계산된 기저 수준 (baseline, PCR 반응 초기 cycle의 신호)보다 훨씬 증가된 신호로 통계적으로 유의성을 보여주는 신호의 수준인 역치 값(threshold)과의 접점 시점에서의 싸이클 수를 나타낸다. Cp 값은 최초의 DNA copy number를 산출하는 데에 이용될 수 있다.

(i) 단계는 유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자에 대한 Cp값 및 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자에 대한 Cp값을 표준유전자의 Cp값으로 표준화하여 표준화된 발현 수준을 산출하는 단계이다.

본 발명에서의 검출 대상의 발현 수준은 대상 환자 또는 시료에 따라 전체적인 유전자 발현량 또는 발현 수준에 차이가 있을 수 있으므로 표준화가 필요하다. 표준화는 기본 발현량 또는 발현 수준의 차이를 나타낼 수 있는 유전자의 발현량 또는 발현 수준과의 차이를 통해 이루어지며, 바람직하게는 CTBP1 (C-terminal-binding protein 1), TBP (TATA-binding protein), HMBS (hydroxymethylbilane synthase), CUL1 (cullin 1) 및 UBQLN1 (Ubiquilin-1)에서 하나 내지 다섯의 유전자의 발현량 (또는 복수의 유전자가 선별된 경우 이들 발현량의 평균)을 측정하여 이에 대한 비를 산출하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 각 유전자에 대한 동의어 및 그 서열은 Genbank에서 검색할 수 있다.

표준화는 하기 식에 따라 산출될 수 있으며, 표준 유전자가 복수인 경우 이의 평균값, 바람직하게는 기하 평균값을 기준으로 표준화된 발현 수준을 산출한다.

표준화된 발현 수준 = 2^-( ^타겟 ^유전자 ^Cp ^값) / 2^{-(표준 유전자 평균} ^Cp ^값)

(j) 단계는 표준화된 유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자의 표준화된 발현 수준이 낮을수록, 그리고 표준화된 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자의 표준화된 발현 수준이 높을수록 유방암 예후가 좋은 것으로 유방암 예후 예측치를 산출하는 단계이다.

산출 알고리즘은 와이블, 대수로지스틱, 대수정규분포 등에 적용시킨 결과의 적합성에 따라 도출될 수 있으며, 본 발명에서는 AIC(Akaike’s information criterion)을 이용하여 대수정규분포에 따른 최종모델을 선택하였다. FFPE 시료 대신 본 발명에 상응하는 냉동 시료 (frozen sample)에 대한 최종 추정 모델은 다음과 같다.

log(T)= -0.689 x p.mean + 0.274 x i.mean + 3.219

위의 추정된 모델에 의하면, p.mean, 즉 증식은 생존시간 (T)과 음의 상관관계(-0.689, p값 = 2.47 x e-17)를 가지므로 증식이 활발할수록 생존시간은 짧아지게 된다. 반대로, i.mean은 생존시간과 양의 상관관계 (0.274, p 값 = 3.69 x e-11)를 가지는데, 면역반응이 활발할수록 생존시간이 길어지는 것을 뜻한다.

이와 같은 결과는 증식이 유방암의 예후에 결정적인 역할을 하며 활발할수록 예후가 나쁜 반면, 면역반응이 빠른 증식에 대한 방어 메커니즘으로 활동하는 것으로 결론지을 수 있으며, 이는 종래의 생물학적 지식과 잘 부합되는 것이다.

본 발명에서 유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자는 하기 표 1에 기재된 유전자에서 선택된 3개 이상의 유전자, 바람직하게는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 유전자일 수 있으며, 알고리즘에 적용되는 p.mean은 각 유전자의 발현 수준의 산술평균값이다. 이 때, 발현이 검출되지 않은 유전자는 계산에서 제외될 수 있다.

또한, 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자는 하기 표 2에 기재된 유전자에서 선택된 3개 이상의 유전자, 바람직하게는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 유전자일 수 있으며, 알고리즘에 적용되는 i.mean은 각 유전자의 발현 수준의 산술평균값이다. 이 때, 발현이 검출되지 않은 유전자는 계산에서 제외될 수 있다.

본 발명에서 유방암은 침윤 유방암, 또는 I기, II기 또는 III기 유방암일 수 있다. 또한, 본 발명의 유방암은 에스트로겐 수용체 양성 (Estrogen receptor positive, ER+)일 수 있다.

본 발명에서 “예후(prognosis)”는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 발병 또는 외과적 시술 후 일정 기간 내의 전이 여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후 예측 진단 (예후 진단 또는 예측 진단)은 특히 초기유방암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다. 예후 예측은 질환 치료제에 대한 환자의 반응, 치료 경과에 대한 예측도 포함한다.

본 발명에서 시료는 유방암 환자의 유방암 조직일 수 있다. 상기 유방암 조직에는 일부 정상 세포도 포함되어 있을 수 있으며, 바람직하게는 환자의 암세포를 포함하는 유방암 조직의 포르말린 고정 파라핀 포매 (formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 시료일 수 있다.

본 발명의 유방암 예후 예측 진단 마커의 검출은 대상 유전자에 대한 PCR (polymerase chain reaction) 증폭을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 대상 유전자의 검출은 바람직하게는 대상 유전자의 발현량의 검출, 더 바람직하게는 대상 유전자의 발현량의 정량적인 검출이다. 발현량의 검출을 위해서 시료 조직 내에서의 mRNA 분리 및 mRNA에서의 cDNA 합성과정이 필요할 수 있다. mRNA의 분리를 위해서는 당업계에 공지된 시료에서의 RNA 분리 방법이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 시료는 FFPE 시료이므로 FFPE 샘플에 적합한 mRNA의 분리방법일 수 있다. cDNA 합성과정은 mRNA를 주형으로 하여 이루어지는 당업계에 공지된 cDNA 합성 방법이 이용될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 유방암 예후 예측 진단 마커의 검출은 FFPE 시료에서의 mRNA 발현의 정량적 검출이므로 FFPE 시료에 대한 mRNA 분리방법 및 RT-qPCR (reverse transcriptation quantatative polymerase chain reaction) 방법에 의한 검출일 수 있다.

본 발명에서 검출은 mRNA 발현 수준(expression level)을 측정일 수 있다. 발현 수준의 측정은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으나, 리포터 형광 염료 및/또는 ?쳐 (quencher) 형광 염료로 표지된 프로브를 사용한 광학적 정량 분석 시스템에 의해서 측정될 수 있다. 상기 측정은 상업적으로 판매되는 장비, 예를 들어, ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™, Roche Molecular Biochemicals Lightcycler 및 이에 부속되는 소프트웨어 등의 시스템에 의해서 이루어질 수 있다. 이와 같은 측정 데이터는 측정값 또는 역치 사이클 (Ct 또는 Cp)로서 표현될 수 있다. 측정된 형광값이 처음으로 통계학적으로 유의한 것으로 기록될 때의 지점이 역치 사이클이며, 이는 검출 대상이 PCR 반응의 주형으로써 존재하는 초기값에 반비례하여 나타나므로 역치 사이클 값이 작은 경우 정량적으로 더 많은 검출 대상이 존재하는 것을 나타낸다.

한편, 본 발명은

(a) FFPE 시료에서 핵산을 분리하는 수단;

(b) 핵산, 버퍼, 시약을 정해진 시간에 정해진 위치로 정해진 양으로 분해하는 분배 수단;

(c) PCR 반응의 수행이 가능하며, 형광 신호 검출에 의한 Cp 값의 측정이 가능한 정량적 PCR(quantatative PCR, qPCR) 수단;

(d) 연산 처리장치; 및

(e) 연산 처리장치에 의해서 실행되며, 상기 Cp 값을 발현 수준으로 변환하고, 발현 수준의 평균값을 산출하며, 정해진 산식에 따라 유방암 예후 예측치를 산출하는 컴퓨터 판독가능한 매체

를 포함하는 유방암 예후 예측치 산출 장치를 제공한다.

본 발명의 장치는 자동화 또는 반자동화에 적합한 또는 자동화/반자동화된 장치이다.

한편, 본 발명은

qPCR 수단에서 측정된 Cp 값을 유전자 정보와 대응시키고,

유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자의 Cp 값과 표준유전자의 Cp 값의 기하평균 간의 비를 구하여 각각 표준화된 유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자의 발현 수준을 산출토록 하고,

유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자의 Cp 값과 표준유전자의 Cp 값의 기하평균 간의 비를 구하여 각각 표준화된 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자의 발현 수준을 산출토록 하고,

유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자의 평균 발현 수준과 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자의 평균 발현 수준을 산출토록 하고,

유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자의 평균 발현 수준과는 음의 상관관계로, 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자의 평균 발현 수준과는 양의 상관관계로 유방암 예후 예측치를 산출하도록 하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공한다.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990); Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997); Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987); De Andres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995); Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996); T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)).

따라서, 본 발명의 시스템은 자동화된 과정으로 유방암 환자 예후의 예측, 진단이 가능하므로 항암치료의 필요성 판단을 비롯하여 향후 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법의 개략적인 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 방법 중 FFPE 시료에서의 RNA 분리과정을 플로우 차트로 나타낸 것이다.
도 3은 16명의 환자 시료에서 9종의 유방암 예후 예측 증식 유전자 (P-gene), 6종의 유방암 예후 예측 면역 유전자 (I-gene), 5종의 표준유전자 (O-gene), 4종의 유방암 관련 공지 유전자 (R-gene)에서의 발현 여부 측정결과를 나타낸 것이다. 도면 중 적색 표시영역은 각 유전자별 개개인의 Cp 값이 측정된 영역이며, 녹색 표시영역은 발현되지 않거나, 아주 높은 Cp 값을 가지거나, 변곡점이 발생하는 등 Cp 값 측정이 기술적으로 불가능하여 Cp 값이 측정되지 않은 영역이다.
도 4는 멀티플렉스 Cp 측정 결과의 일례를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시 예 1>

FFPE 시료에서의 RNA 의 분리

FFPE 처리된 유방암 환자의 검체를 시료로 이용하였다. FFPE 시료를 회전식 미세톱 (rotary microtome)으로 5~10μm의 두께로 절단한 다음 FFPE용 버퍼(FFPE buffer, VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, siemens)를 혼합하고, 80℃에서 30분간 인큐베이션(incubation)하였다. 온도를 65℃로 낮추고, 단백질분해효소 K (proteinase K, VERSANT tissue preparation reagents, Box 2, siemens)를 혼합한 다음 30분간 인큐베이션 하였다. 마그네틱 비드 (magnetic beads, VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, siemens)를 혼합한 다음 65℃에서 15분간 인큐베이션 하여 세포 잔해물 (cell debris)가 부착되도록 하고, 튜브 하부에 자기력을 걸어 마그네틱 비드와 결합된 물질을 분리하고, 상부의 용액을 마그네틱 비드와 용해 버퍼 (lysis buffer, VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, siemens)가 미리 담겨 있는 새 튜브로 옮겼다. 이 때, 튜브 상부에 형성되어 있는 파라핀 층은 새 튜브로 옮겨지지 않도록 한다.

마그네틱 비드에 핵산 분자가 결합되도록 실온에서 10분간 인큐베이션 하였다. 튜브 하부에 자기력을 걸어 마그네틱 비드를 분리하고, 상등액을 제거한 다음 세척 버퍼 1, 2, 3(washing buffer 1, 2, 3, VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, siemens)로 세척하였다. 여기에 용출 버퍼 (elution buffer, VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, siemens)를 넣고, 70℃에서 10분간 인큐베이션 하여 핵산 분자가 용출되도록 하였다. 핵산 분자가 용출된 상등액을 따로 새 튜브로 옮겨 마그네틱 비드를 제거한 다음 DNase I (VERSANT tissue preparation reagents, Box 3, siemens)을 넣고 37℃에서 10분간 반응시켜 DNA를 제거하여, RNA 만을 분리하였다.

<실시예 2>

RT-qPCR (reverse transcriptation-quantative polymerase chain reaction)

상기 실시예 1에서 분리된 RNA를 RT-qPCR premix (quantifast multiplex RT-PCR kit, qiagen)와 혼합하였다. 상기 RT-qPCR premix는 cDNA 합성용 역전사 효소 (reverse transcriptase), PCR용 DNA polymerase, 형광 염료 (fluorescent dye), RT-PCR용 버퍼가 혼합되어 있다. 이를 각 유전자 별로 디자인된 PCR 프라이머가 미리 혼합된 384 well plate에 분주한 다음 plate 전체를 50℃ 20분의 cDNA 합성, 95℃ 5분의 전변성, 95℃ 15초, 60℃ 30초의 PCR 증폭 45 싸이클 (cycle), 40℃ 30초의 냉각 과정으로 RT-qPCR 과정을 수행하며, 각 유전자에 대한 Cp (Crossing point, Ct라고도 함) 값을 측정하였다 (LightCycle 480, Roche)

그 결과, 유전자 P1에 대한 Cp 값은 30.49, 유전자 P2에 대한 Cp 값은 27.03, 유전자 I1에 대한 Cp 값은 26.25, 유전자 I2에 대한 Cp 값은 25.83으로 측정되었다. 아울러, 표준 유전자 1, 2 및 3에 대해서 Cp 값은 각각 23.63, 22.56, 24.60으로 측정되었다.

< 실시예 3>

Cp 값을 이용한 유방암 예후 예측치 산출

산출된 Cp 값은 개개인의 발현 편차가 반영된 것이므로 이를 표준화 (normalization) 할 필요가 있다. 표준화를 위하여 우선 표준 유전자의 평균 Cp 값을 기하 평균 계산법으로 계산한 결과 23.58로 산출되었다. 각각의 타겟 유전자, 즉 P 유전자 (p-gene) 및 I 유전자 (i-gene)에 대한 표준화된 발현 수준은

으로 산출하였다. 상기 실시예 2에서의 P1, P2, I1, I2 타겟 유전자의 각각의 발현 수준은 0.008, 0.091, 0.157, 0.210으로 산출되었으며, 이 경우 I2 유전자는 P1 유전자에 비해서 26.25배 (0.210 / 0.008) 발현이 많이 된다고 할 수 있다.

데이터 세트의 생존정보와 선택된 p-gene과 i-gene을 이용하여 초기 유방암 환자의 전이에 대한 AFT 예후예측모델을 만들었다. 디스커버리 데이터 세트의 생존정보를 이용하여 1년 단위의 세대생명표를 작성하여 대략적인 위험도를 계산하였다.

세대생명표로 얻은 사망확률은 단봉 (unimodal)형태를 보이므로, 와이블, 대수로지스틱, 대수정규분포가 적합할 것으로 예측되었다. 예후예측모델에 포함될 공변수는 p.mean와 i.mean이다. p.mean 은 p-genes의 평균값이면, i.mean은 i-genes의 평균값이다.

3개의 모델에 대해 와이블, 대수로지스틱, 대수정규분포에 적용을 시킨 결과, 대수정규분포에 가장 적합하였다. AIC(Akaike’s information criterion)을 이용하여 대수정규분포에 따른 최종모델을 선택하였다. FFPE 시료 대신 본 발명에 상응하는 냉동 시료 (frozen sample)에 대한 최종 추정 모델은 다음과 같다.

log(T)= -0.689 x p.mean + 0.274 x i.mean + 3.219

위의 추정된 모델에 의하면, p.mean, 즉 증식은 생존시간 (T)과 음의 상관관계(-0.689, p값 = 2.47 x e-17)를 가지므로 증식이 활발할수록 생존시간은 짧아지게 된다. 반대로, i.mean은 생존시간과 양의 상관관계 (0.274, p 값 = 3.69 x e-11)를 가지는데, 면역반응이 활발할수록 생존시간이 길어지는 것을 뜻한다. 위의 추정된 변수들을 해석하면, 증식이 유방암의 예후에 결정적인 역할을 하며 활발할수록 예후가 나쁜 반면, 면역반응이 빠른 증식에 대한 방어 메커니즘으로 활동하는 것으로 결론지을 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 시스템은 자동화된 과정으로 유방암 환자의 예후 예측, 진단이 가능하므로 항암치료의 필요성 판단을 비롯하여 향후 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

유방암 환자의 예후 예측 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로 부터 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측치를 산출하는 자동화된(automated) 방법:
(a) 환자의 유방암 조직을 포함하는 포르말린 고정 파라핀 포매 (formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 시료에 파라핀 제거 및 세포용해용 버퍼를 처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 시료에 단백질분해효소 K (proteinase K)를 처리하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 시료에서 단백질 또는 세포 잔해물 (debris)을 제거하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 시료에 DNA 분해효소Ⅰ(DNase Ⅰ)를 처리하여 RNA를 수득하는 단계;
(e) 상기 RNA를 검출 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 RT-qPCR 프리믹스와 혼합하는 단계;
(f) 상기 (e) 단계의 혼합물에서 cDNA (complementary DNA)를 생성시키는 단계;
(g) 상기 cDNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 PCR 프라이머로 하여 PCR 반응을 수행하는 단계;
(h) PCR 반응에 대한 Cp 값을 측정하는 단계;
(i) 유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자에 대한 Cp값 및 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자에 대한 Cp 값을 CTBP1 (C-terminal-binding protein 1), TBP (TATA-binding protein), HMBS (hydroxymethylbilane synthase), CUL1 (cullin 1) 및 UBQLN1 (Ubiquilin-1)로 이루어진 군에서 둘 이상 선택된 표준유전자의 Cp 값의 기하평균(geomean)으로 표준화하여 표준화된 발현 수준을 산출하는 단계;
(j) 표준화된 유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자의 표준화된 발현 수준이 낮을수록, 그리고 표준화된 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자의 표준화된 발현 수준이 높을수록 유방암 예후가 좋은 것으로 유방암 예후 예측치를 산출하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 검출 유전자는 유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자, 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자 및 표준유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 RT-qPCR 프리믹스는 역전사 반응을 위한 역전사 효소, PCR 반응을 위한 DNA 중합효소, PCR 반응의 정량적 검출을 위한 형광 염료, 역전사 반응 및 PCR 반응에 적합한 버퍼 및 dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제2항에 있어서, 상기 유방암 예후 예측 진단용 증식 유전자는 PRC1, CCNB2, UBE2C, CDC20, KIF4A, TOP2A, RACGAP1, ASPM, BUB1B, CDC45, PTTG1, CENPF, FOXM1, KIF11, BLM, ZWINT, CDC7, KIF20A, TRIP13, FANC1, MAD2L1, MCM2, RRM2, NCAPG, KIF15, MLF1IP, GINS1, OIP5, NUSAP1, ADM, HMMR, AURKA, CCNA2, NME1, DLGAP5, ZDHHC13, HMGB3, TMED9, MT1H, MMP11, TTK, ENO2, GPR56, SPAG5, PBK, MMP1, MST4, EZH2, CDC25B, DSCC1, CDCA8, CEP55, HPSE, CENPM, CDK1, EYA2, TMSB15B, GGH, PSMD3, FGD1, ASF1B, SPAG16, SMC4, C11orf80, LSM1, PMEPA1, CDKN3, TOPBP1, CCT5, RAD51AP1, GPSM2, LIG1. NMU. KIAA1199. DTL, KIF2C, WDR45L, SLC16A3, MT1F, C18orf8, STMN1, HSPA1A, PUS7, GPR172A, SCRN1, AURKB, GALNT14, SPP1, NUP107, C21orf45, CTPS, GINS2, CCNE2, GSDMB, RIPK4, TMSB15A, MYBL1, KIF14, TK1, ABCC10, CIAPIN1, TXNRD1, GLDC, SAP30, TYMS, LLGL2, EPN3, DONSON, NCAPG2, C1orf135, CDCA3, MKI67, F12, ELM03, TMEM132A, SCRIB, EXO1, AP3M2, CYCS, NPM3로 이루어진 군에서 3개 이상 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 유방암 예후 예측 진단용 면역 유전자는 TRBV20-1, CCL19, CD52, SRGN, CD3D IGJ, HLA-DRA, LOC91316, IGF1, CYBRD1, TMC5, ALDH1A1, OGN, PDCD4, FRZB, CX3CR1 IGFBP6, GLA, LOC96610, IGLL3, ITPR1, SERPINA1, EPHX2, MFAP4, RNASET2, CCNG1, FBLN5, SORBS2, CCBL2, BTN3A2, TFAP2B, LTF, ITM2A, HLA-DPB1, HLA-DMA, RPL3, LOC100130100, FAM129A, ELOVL5, GBP2, RARRES3, GOLM1, RTN1, ICAM3, LAMA2, CXCL13, ZCCHC24, CD37, VTCN1, PYCARD, CORO1A, SH3BGRL, TPSAB1, TNFSF10, ACSF2, TGFBR2, DUSP4, ARHGDIB, TMPRSS3, DCN, LRIG1, FMOD, ZNF423, SQRDL, TPST2, CD44, MREG, GIMAP6, GJA1, IFITM3, BTG2, PIP, RPS9, HLA-DPA1, IMPDH2, TNFRSF17, C14orf139, SPRY2, XBP1, THYN1, APOD, C10orf116, VAV3, FAS, MYBPC1, CFB, TRIM22, ARID5B, PTGDS, TGFBR3, TNFAIP8, SEMA3C, TMEM135, ARHGEF3, PTGER4, ABCA8, ICAM2, HLA-DQB1, HSPA2, CD27, ARMCX1, POU2AF1, IGBP1, PDE4B, ADH1B, WLS, SUCLG2, PGR, STARD13, SORL1, ATP1B1, IFT46, SIK3, LIPT1, OMD, HBB, C3, FGL2, PEC1, RAC2, PDZRN2, CXCL12, DPYD, TXNDC15, STOM, EMCN, SCGB2A2, FAM176B, HIGD1A, ACSL5, RPS24, RGS10, RAI2, CNN3, FBXW4, SEPP1, SLC44A4, MGP, ABCD3, SETBP1, APOBEC3G, LCP2, HLA-DRB1, SCUBE2, DEPDC6, RPL15, SH3BP4, MSX2, CLU, DPT, ZNF238, HBP1, GSTK1, ZBTB16, CCDC69, ALDH2, SLC1A1, ARMCX2, HMGCS2, TSPAN3, FTO, PON2, C16orf62, QDPR, LRP2, PSMB8, HCLS1, FXYD1, OAT, SLC38A1, MAOA, LPL, C10orf57, SPARCL1, ERAP2, PDGFRL, RBP4, LRRC17, LHFP, BLNK, HBA2, CST7로 이루어진 군에서 3개 이상 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
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