KR101747038B1 - Nanopolymer Having Heteromorphic Polymer Structure, Preparation Method Thereof, Nucleic Acid Reaction Composition Containing Thereof, and Method of Detecting or Quantifying Nucleic Acid Using Nucleic Acid Reaction Composition Containing Thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머, 이의 제조방법, 이를 포함하는 핵산반응 조성물, 및 이를 포함하는 핵산반응 조성물을 이용한 핵산의 검출 또는 정량 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 2개 이상의 서로 다른 다당체(polysaccharide)의 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머를 제조한 다음, 상기 나노폴리머를 사용하여 핵산반응 조성물에 포함된 원료물질들의 표면을 코팅시킨 후 결정화시킴으로써 원료물질들의 물리적 상호 접촉, 산화 또는 가수분해를 억제하여 원료물질들의 활성을 실온에서 장기간 동안 유지 가능한 핵산반응 조성물과 상기 핵산반응 조성물을 이용한 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a nanopolymer having a heteropolymer structure, a method for producing the same, a nucleic acid reaction composition containing the same, and a method for detecting or quantifying a nucleic acid using the nucleic acid reaction composition. More particularly, A nanocopolymer having a heteropolymer structure of a polysaccharide is prepared and then the surface of the raw materials contained in the nucleic acid reaction composition is coated with the nanopolymer and then crystallized to thereby physically contact each other, To maintain the activity of raw materials at room temperature for a long period of time, and a method for detecting or quantifying a target nucleic acid using the nucleic acid reaction composition.
Description
본 발명은 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머, 이의 제조방법, 이를 포함하는 핵산반응 조성물, 및 이를 포함하는 핵산반응 조성물을 이용한 핵산의 검출 또는 정량 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 2개 이상의 서로 다른 다당체(polysaccharide)의 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머를 제조한 다음, 상기 나노폴리머를 사용하여 핵산반응 조성물에 포함된 원료물질들의 표면을 코팅시킨 후 결정화시킴으로써 원료물질들의 물리적 상호 접촉, 산화 또는 가수분해를 억제하여 원료물질들의 활성을 실온에서 장기간 동안 유지 가능한 핵산반응 조성물과 상기 핵산반응 조성물을 이용한 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a nanopolymer having a heteropolymer structure, a method for producing the same, a nucleic acid reaction composition containing the same, and a method for detecting or quantifying a nucleic acid using the nucleic acid reaction composition. More particularly, A nanocopolymer having a heteropolymer structure of a polysaccharide is prepared and then the surface of the raw materials contained in the nucleic acid reaction composition is coated with the nanopolymer and then crystallized to thereby physically contact each other, To maintain the activity of raw materials at room temperature for a long period of time, and a method for detecting or quantifying a target nucleic acid using the nucleic acid reaction composition.
일반적으로 효소단백질은 생물체의 내부에서 생성된다. 그리고 인위적인 방법으로는 분자생물학적 기술을 통하여 시험관에서 재조합으로 합성되어 진다. 두 가지 방법 모두 효소단백질을 생성할 수 있는 방법이나 같은 효소활성을 나타낸다고 할 수 있다. 이렇게 생성된 효소단백질은 각각의 목적에 따라 정제되어 실험용, 의료용 및 산업용 등으로 다양하게 사용된다. 그러나 이렇게 정제된 효소단백질은 생물체내에 있을 때와 달리 시험관 등에 완충액과 함께 혼합된 상태로 보관되기 때문에 효소활성이 지속적으로 저하하게 된다. 이러한 효소활성을 저하하기 위하여 동결하여 보존하게 되는데 동결과정에서 단백질이 얼음결정에 의해 파괴되는 것을 방지하기 위하여 글리세롤 같은 응결방지제를 첨가하여 보관하게 된다. 또 다른 방법으로는 동결건조 방법을 통하여 수분을 완벽하게 제거함으로써 보관 및 활성을 장기간 유지하는 방법을 사용하고 있다. 그러나 이러한 동결건조는 건조과정에서 통상적으로 효소의 활성이 10~50%가 저하된다고 알려져 있다. Generally, enzyme proteins are produced inside an organism. And artificial methods are synthesized recombinantly in vitro through molecular biology techniques. Both methods can produce enzymatic proteins or exhibit the same enzymatic activity. The enzyme protein thus produced is purified according to each purpose and is used variously for experimental, medical and industrial purposes. However, since the purified enzyme protein is stored in the test tube in a mixed state with the buffer solution, the enzyme activity is continuously decreased. In order to reduce the enzymatic activity, it is preserved by freezing. In order to prevent the protein from being destroyed by ice crystals in the freezing process, an anti-caking agent such as glycerol is added and stored. Another method is to completely remove moisture through freeze-drying to maintain storage and activity for a long period of time. However, it is known that such freeze-drying generally reduces enzyme activity by 10 to 50% during the drying process.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 장기간 동안 실온에서 보관 시 나타날 수 있는 핵산반응 조성물의 변성에 따른 성능저하를 최소화할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 2개 이상의 서로 다른 다당체의 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머를 제조한 다음, 상기 나노폴리머를 사용하여 핵산반응 조성물에 포함된 원료물질들(효소단백질 또는 핵산 등)의 표면을 코팅시키고, 결정화시킴으로써 원료물질들의 물리적 상호 접촉, 산화 또는 가수분해를 억제시켜 원료물질의 활성을 실온에서 최소 1년 동안 유지할 수 있음을 확인하였으며, 최소 1년 동안 실온에서 보관된 핵산반응 조성물을 핵산의 검출 또는 정량 방법으로 검증한 결과 냉동된 핵산반응 조성물과 동등한 수준으로 핵산의 증폭 성능을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Under these technical backgrounds, the present inventors have made extensive efforts to develop a method capable of minimizing degradation of the nucleic acid reaction composition due to denaturation, which may occur during storage at room temperature for a long period of time. As a result, Oxidation or hydrolysis of raw materials by coating the surface of the raw materials (such as enzyme protein or nucleic acid) contained in the nucleic acid reaction composition by using the nanopolymer and crystallizing the same, And the activity of the raw material can be maintained for at least one year at room temperature. The nucleic acid reaction composition stored at room temperature for at least one year was verified by detecting or quantifying the nucleic acid. As a result, , And that the present invention It was completed.
본 발명의 목적은 핵산반응 조성물에 포함된 원료물질(효소단백질, 핵산, 등)을 코팅하고 결정화함으로써 핵산반응 조성물의 산화, 가수분해, 변성에 의한 활성 및 성능저하를 방지하고, 효소기질과의 물리적 상호 접촉을 억제시키는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머, 이의 제조방법, 이를 포함하는 핵산반응 조성물, 및 이를 포함하는 핵산반응 조성물을 이용한 핵산의 검출 또는 정량 방법을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to prevent oxidation and hydrolysis and degradation of activity and performance of a nucleic acid reaction composition by coating and crystallizing a raw material (enzyme protein, nucleic acid, etc.) contained in the nucleic acid reaction composition, The present invention provides a nanopolymer having a heteropolymer structure that inhibits physical mutual contact, a method for producing the same, a nucleic acid reaction composition containing the same, and a method for detecting or quantifying nucleic acid using the nucleic acid reaction composition.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
The problems to be solved by the present invention are not limited to the above-mentioned problem (s), and another problem (s) not mentioned can be understood by those skilled in the art from the following description.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object,
(a) 2개 이상의 서로 다른 다당체(polysaccharide)를 알코올을 함유하는 증류수와 혼합하고, 45~55℃에서 2.5~3.5시간 동안 가열시킨 다음, 1차 혼합물로 수득하는 단계;(a) mixing two or more different polysaccharides with distilled water containing alcohol, heating at 45 to 55 캜 for 2.5 to 3.5 hours, and then obtaining a first mixture;
(b) 상기 1차 혼합물을 카제인 인산 펩티드(Casein phosphoric acid peptide), 아미노산 및 저분자량의 폴리아미드와 혼합한 후 pH를 6.0~6.5로 조절하고, 55~65℃에서 10~14시간 동안 가열시킨 다음, 2차 혼합물로 수득하는 단계; 및(b) mixing the primary mixture with a casein phosphoric acid peptide, an amino acid and a low molecular weight polyamide, adjusting the pH to 6.0 to 6.5, heating the mixture at 55 to 65 ° C for 10 to 14 hours Followed by obtaining as a secondary mixture; And
(c) 상기 2차 혼합물을 10~14시간 동안 2~4회 투석하고, 10~14시간 동안 건조시킨 다음, 2개 이상의 서로 다른 다당체의 결합에 의해 형성되는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머로 회수하는 단계;를 포함하는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머의 제조방법을 제공한다. (c) dialyzing the secondary mixture for 2 to 4 times for 10 to 14 hours, drying for 10 to 14 hours, and then recovering the nanopolymer having a heteropolymer structure formed by binding of two or more different polysaccharides The method comprising the steps of: preparing a nanopolymer having a modified polymer structure;
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 다당체는 키틴(Chitin), 전분(Starch), 셀룰로오스(Cellulose), 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan), 이눌린(Inulin), 아밀로펙틴(Amylopectin), 글리코겐(Glycogen), 펙틴(Pectin), 덱스트란(Dextran), 잔탄 검(Xanthan Gum), 풀루란(Pullulan), 헤미셀룰로오스(Hemicellulose), 폴리덱스트로스(Polydextrose), 베타-글루칸(Beta-glucan), 사일리움 허스크 점질물(Psyllium husk mucilage), 갈락토만난(Galactomannan), 글루코만난(Glucomannan), 카라야 검(Karaya Gum), 아라비노자일란(Arabinoxylan), 겔란 검(Gellan Gum), 잔탄(Xanthan), 아가-아가(Agar-Agar), 알긴산(Alginate) 및 카라기난(Carrageenan)으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 한다.The polysaccharide may be selected from the group consisting of Chitin, Starch, Cellulose, Glycosaminoglycan, Inulin, Amylopectin, Glycogen, Pectin, Dextran Dextran, Xanthan Gum, Pullulan, Hemicellulose, Polydextrose, Beta-glucan, Psyllium husk mucilage, Galactomannan Galactomannan, glucomannan, karaya gum, arabinoxylan, gellan gum, xanthan, agar-agar, alginate and carrageenan (Carrageenan). ≪ / RTI >
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 알코올을 함유하는 증류수는 2.5~25%(v/v) 에탄올인 것을 특징으로 한다.The distilled water containing the alcohol is characterized by being 2.5 to 25% (v / v) ethanol.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 (b) 단계에서 가열된 1차 혼합물에 혼합한 카제인 인산 펩티드(Casein phosphoric acid peptide): 아미노산의 중량 비율은 15~60:9~36이고, 가열된 1차 혼합물에 혼합한 저분자량 폴리아미드는 0.25~1%(w/v)로 첨가되는 것을 특징으로 한다.The weight ratio of the casein phosphoric acid peptide: amino acid mixed in the primary mixture heated in the step (b) is 15 to 60: 9 to 36, and the low molecular weight polyamide mixed with the heated primary mixture Is added in an amount of 0.25 to 1% (w / v).
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 저분자량의 폴리아미드는 PVP K30, PVP K15, PVP K12 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 한다.The low molecular weight polyamide is characterized in that it is at least one selected from the group consisting of PVP K30, PVP K15, PVP K12 and mixtures thereof.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 아미노산은 히스티딘 및 프롤린으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.Wherein the amino acid comprises at least one selected from the group consisting of histidine and proline.
본 발명은 또한,The present invention also relates to
상기 방법으로 제조된 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머를 제공한다.A nanopolymer having a heteropolymer structure prepared by the above method is provided.
본 발명은 또한,The present invention also relates to
핵산 증폭용 시약 및 상기 방법으로 제조된 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머를 포함하는 핵산반응 조성물을 제공한다.There is provided a nucleic acid reaction composition comprising a nucleic acid amplification reagent and a nanopolymer having a heteropolymer structure prepared by the above method.
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머는 상기 핵산 증폭용 시약에 포함된 원료물질들의 표면을 코팅시킴으로써 원료물질들의 물리적 상호 접촉, 산화 또는 가수분해를 억제하는 것을 특징으로 한다.The nanopolymer having the above-mentioned modified polymer structure is characterized by inhibiting physical contact, oxidation or hydrolysis of raw materials by coating the surface of raw materials contained in the nucleic acid amplification reagent.
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 원료물질들은 효소단백질 또는 핵산인 것을 특징으로 한다.Wherein the raw materials are enzyme proteins or nucleic acids.
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 효소단백질은 중합효소 또는 역전사효소인 것을 특징으로 한다.The enzyme protein is characterized by being a polymerase or a reverse transcriptase.
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 핵산은 프라이머, 프로브 및 데옥시뉴클레오티드(deoxynucleotide triphosphate, dNTP) 및 뉴클레오티드(nucleotide triphosphate, NTP)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.Wherein the nucleic acid comprises at least one selected from the group consisting of a primer, a probe, and deoxynucleotide triphosphate (dNTP) and a nucleotide triphosphate (NTP).
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 핵산반응 조성물은 -45℃ 내지 -35℃에서 145~155mmHg의 압력으로 6~24시간 동안 탈수반응으로 결정화된 것을 특징으로 한다The nucleic acid reaction composition is characterized in that it is crystallized by dehydration reaction at a temperature of -45 ° C to -35 ° C at a pressure of 145 to 155 mmHg for 6 to 24 hours
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 탈수반응은 나노폴리먼간의 물리적 결합을 유도함으로써 상기 핵산반응 조성물이 고형의 타블릿 형태로 결정화되는 것을 특징으로 한다.The dehydration reaction is characterized in that the nucleic acid reaction composition is crystallized in the form of a solid tablet by inducing physical bonding between the nanopallones.
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 고형의 타블릿 형태로 결정화된 핵산반응 조성물은 비정형의 미세 타공들이 포함되는 입체형 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.The nucleic acid reaction composition crystallized in the form of a solid tablet has a three-dimensional structure including amorphous micropores.
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 비정형의 미세 타공들이 포함되는 입체형 구조는 핵산반응 조성물에 포함된 핵산 증폭용 시약의 원료물질들을 일정한 간격으로 고정시킴으로써 원료물질들의 물리적 상호 접촉을 억제시켜 원료물질들이 상호반응하지 못하도록 하여 원료물질의 활성을 유지하는 것을 특징으로 한다.The three-dimensional structure including the amorphous fine pores prevents nucleic acid amplification reagents contained in the nucleic acid reaction composition from being fixed at fixed intervals, thereby preventing physical interactions between the raw materials, thereby preventing mutual reaction of the raw materials, Thereby maintaining the activity.
본 발명은 또한,The present invention also relates to
(a) 시료로부터 표적 핵산을 분리한 다음, 상기 분리한 핵산을 상기 핵산반응 조성물과 혼합하여 핵산 증폭 반응물을 준비하는 단계; 및(a) separating a target nucleic acid from a sample and preparing a nucleic acid amplification reaction by mixing the separated nucleic acid with the nucleic acid reaction composition; And
(b) 상기 핵산 증폭 반응물을 사용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계;를 포함하는, 핵산반응 조성물을 이용한 핵산의 검출 또는 정량 방법을 제공한다.(b) amplifying the target nucleic acid using the nucleic acid amplification reagent, and detecting or quantifying the nucleic acid using the nucleic acid reaction composition.
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), 역전사반응(Reverse Transcription), 상보적 DNA 합성(Complementary DNA Synthesis), LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification), NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), SDA(Strand Displacement Amplification), MDA(Multiple Displacement Amplification), RCA(Rolling Circle Amplification), LCR(Ligase Chain Reaction), HDA(Helicase Dependent Amplification) 및 RAM(Ramification Amplification Method)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 한다.
The amplification can be carried out using polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time PCR, reverse transcription Transcription, Complementary DNA Synthesis, Loop-Mediated Isothermal Amplification, Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, SDA Strand Displacement Amplification, Amplification, LCR (Ligase Chain Reaction), HDA (Helicase Dependent Amplification), and RAM (Ramification Amplification Method).
본 발명에 따른 방법으로 제조된 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머를 이용하여 핵산반응 조성물에 포함된 원료물질(효소단백질, 핵산, 등)을 코팅한 다음, 결정화하면, 상기 핵산반응 조성물에 포함된 원료물질의 활성을 최소 1년 동안 실온에서 안정하게 유지할 수 있고, 상기 핵산반응 조성물을 감염성 질환 또는 암질환의 분자진단에 유용하게 적용할 수 있다.
When the raw material (enzyme protein, nucleic acid, etc.) contained in the nucleic acid reaction composition is coated and then crystallized using the nanopolymer having the heteropolymer structure prepared by the method according to the present invention, The activity of the substance can be stably maintained at room temperature for at least one year and the nucleic acid reaction composition can be usefully applied to molecular diagnosis of infectious diseases or cancer diseases.
도 1은 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머를 이용하여 결정화된 핵산반응 조성물을 PCR 튜브에 넣은 것을 나타낸 것이다.
도 2는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머로 결정화된 핵산반응 조성물을 25℃ 또는 37℃에 보관하면서 3개월 간격으로 총 12개월간 핵산반응 조성물의 활성도 변화를 측정한 것으로, 주형 DNA(1,262bp의 절편된 b-actin 유전자가 포함되도록 제조됨)를 PCR을 이용하여 증폭한 후 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머로 결정화된 핵산반응 조성물을 25℃ 또는 37℃에 보관하면서 3개월 간격으로 총 12개월간 핵산반응 조성물의 활성도 변화를 측정한 것으로, 주형 DNA(610bp의 절편된 b-actin 유전자가 포함되도록 제조됨)를 PCR을 이용하여 증폭 여부를 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머가 포함된 핵산반응 조성물에 프라이머를 첨가하거나 프라이머와 TaqMan 프로브를 같이 첨가한 다음, 나노폴리머로 결정화하고, 결정화 전·후의 핵산반응 조성물의 활성도(핵산 증폭 성능)를 Real-Time PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 핵산반응 조성물에 프라이머를 첨가하거나 프라이머와 TaqMan 프로브를 같이 첨가한 다음, 결정화하고, 상기 결정화된 핵산반응 조성물을 25℃ 및 37℃에 보관하면서 3개월 간격으로 총 12개월간 결정화된 핵산반응 조성물의 활성도(핵산 증폭 성능)를 Real-Time PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 2개의 서로 다른 다당체를 이용한 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머를 나타낸 모식도이다.Figure 1 shows a nucleic acid reaction composition crystallized using a nanopolymer having a heteropolymer structure in a PCR tube.
FIG. 2 shows changes in the activity of the nucleic acid reaction composition over a period of 12 months at intervals of 3 months while the nucleic acid reaction composition crystallized with the nanopolymer having a heteropolymer structure was stored at 25 ° C or 37 ° C. The template DNA (fragment of 1,262 bp (Prepared so as to contain the b-actin gene) was amplified by PCR and electrophoretically analyzed on an agarose gel.
FIG. 3 is a graph showing changes in activity of the nucleic acid reaction composition over a total of 12 months at intervals of 3 months while the nucleic acid reaction composition crystallized with a nanopolymer having a heteropolymer structure was stored at 25 ° C or 37 ° C. The template DNA (fragment of 610 bp b-actin gene) was amplified by PCR on an agarose gel.
FIG. 4 is a graph showing the relationship between the activity of the nucleic acid reaction composition before and after the crystallization (the nucleic acid amplification performance ) Was confirmed by Real-Time PCR.
FIG. 5 is a graph showing the results of a total of 12 months of nucleic acid reaction crystallization at 3-month intervals while the primer and primer and TaqMan probe were added to the nucleic acid reaction composition, followed by crystallization and storing the crystallized nucleic acid reaction composition at 25 & The activity of the composition (nucleic acid amplification performance) was confirmed by Real-Time PCR.
6 is a schematic view showing a nanopolymer having a heteropolymer structure using two different polysaccharides.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The advantages and features of the present invention and the manner of achieving it will become apparent with reference to the embodiments described in detail below with reference to the accompanying drawings.
그러나 본 발명은 이하에 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art. To fully disclose the scope of the invention to those skilled in the art, and the invention is only defined by the scope of the claims.
또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기술 등이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그에 관한 자세한 설명은 생략하기로 한다.In the following description, well-known functions or constructions are not described in detail since they would obscure the invention in unnecessary detail.
본 발명은 핵산반응 조성물에 포함된 원료물질(효소단백질, 핵산, 등)을 코팅하고 결정화함으로써 핵산반응 조성물의 산화, 가수분해, 변성에 의한 활성 및 성능저하를 방지하고, 효소기질과의 물리적 상호 접촉을 억제시키는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머, 이의 제조방법, 이를 포함하는 핵산반응 조성물, 및 이를 포함하는 핵산반응 조성물을 이용한 핵산의 검출 또는 정량 방법을 제공하는 데 있다.The present invention relates to a method for preventing the degradation of activity and performance by oxidation, hydrolysis and denaturation of a nucleic acid reaction composition by coating and crystallizing a raw material (enzyme protein, nucleic acid, etc.) contained in the nucleic acid reaction composition, A method for producing the same, a nucleic acid reaction composition containing the same, and a method for detecting or quantifying nucleic acid using the nucleic acid reaction composition comprising the nanopolymer.
핵산반응 조성물에 포함된 효소단백질은 반응하는 기질인 데옥시뉴클레오티드(deoxynucleotide triphosphate, dNTP), 계면활성제 및 반응버퍼 등 다수의 화합물질과 혼합된 상태로 존재하기 때문에 이들 혼합물을 실온에서 장기간 보관할 경우에 혼합물간의 상호 접촉(상호 반응), 산화 또는 가수분해에 의해 성분이 변성되거나 효소활성이 급격하게 저하되게 된다. Since the enzyme protein contained in the nucleic acid reaction composition exists in a state mixed with a large number of compounds such as deoxynucleotide triphosphate (dNTP), a surfactant, and a reaction buffer, which are substrates to be reacted, The components are denatured by mutual contact (mutual reaction), oxidation or hydrolysis of the mixture, or enzyme activity is rapidly lowered.
여기서, "핵산반응 조성물"이란 중합효소 및 핵산 증폭에 필요한 원료물질을 포함하는 핵산 증폭 반응물로서 이중가닥 또는 단일가닥의 핵산(DNA 또는 RNA)(예컨대, 유전자)를 주형으로 증폭시켜 주형 핵산과 상보적인 핵산을 합성하는 데 사용되는 조성물을 의미한다.As used herein, the term "nucleic acid reaction composition" refers to a nucleic acid amplification reaction product containing a polymerase and a raw material necessary for nucleic acid amplification, wherein double stranded or single stranded nucleic acid (DNA or RNA) ≪ / RTI > nucleic acid.
본 발명의 일 실시예에서는 나노폴리머를 포함하는 핵산반응 조성물을 탈수하여 결정화시킨 핵산반응 조성물(즉, 타블렛형 핵산반응 조성물)의 활성도를 핵산 증폭 여부로 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 주형 DNA의 크기(1,262bp, 610bp)와 무관하게 보관 온도 및 보관 시간에 따른 핵산반응 조성물의 활성도 차이는 크지 않았다(실시예 1~실시예 3 참조). In one embodiment of the present invention, the activity of a nucleic acid reaction composition (i.e., a tablet-like nucleic acid reaction composition) obtained by dehydrating and crystallizing a nucleic acid reaction composition containing a nanopolymer was confirmed by amplifying the nucleic acid. As a result, as shown in FIG. 2 and FIG. 3, there was no significant difference in activity of the nucleic acid reaction composition depending on storage temperature and storage time, regardless of the size (1,262 bp, 610 bp) of the template DNA (Examples 1 to 3 Reference).
본 발명의 다른 실시예에서는 프라이머 및 프로브를 포함하고, 결정화된 핵산반응 조성물(즉, 프라이머 및 프로브를 포함하는 타블렛형 핵산반응 조성물)의 활성도를 핵산 증폭 여부로 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 핵산반응 조성물에 프라이머를 첨가하거나 프라이머와 프로브를 같이 첨가한 경우, 핵산반응 조성물의 핵산 증폭 성능에는 변화가 없는 것으로 나타났다(실시예 4 참조).In another embodiment of the present invention, the activity of the crystallized nucleic acid reaction composition (that is, the tablet-like nucleic acid reaction composition including the primer and the probe), including the primer and the probe, was confirmed by amplifying the nucleic acid. As a result, as shown in Fig. 4, when the primer was added to the nucleic acid reaction composition or when the primer and the probe were added together, there was no change in the nucleic acid amplification performance of the nucleic acid reaction composition (see Example 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 프라이머 및 프로브를 포함하고, 결정화된 핵산반응 조성물(즉, 프라이머 및 프로브를 포함하는 타블렛형 핵산반응 조성물)의 보관 온도에 따른 활성도를 핵산 증폭 여부로 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Real-Time PCR를 수행하는데 있어 나노폴리머를 이용하여 결정화된 핵산반응 조성물은 실온(25℃) 및 고온(37℃)에서 1년 이상 보관하더라도 냉동된 핵산반응 조성물과 차이가 없음을 확인할 수 있었다(실시예 5 참조).In another embodiment of the present invention, the activity of the crystallized nucleic acid reaction composition (that is, the tablet-like nucleic acid reaction composition including the primer and the probe) containing the primer and the probe according to the storage temperature was determined by amplifying the nucleic acid. As a result, as shown in FIG. 5, in the real-time PCR, the nucleic acid reaction composition crystallized by using the nanopolymer was stored for more than one year at room temperature (25 ° C.) and high temperature (37 ° C.) It was confirmed that there was no difference from the composition (see Example 5).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, Thus, the present invention, in one aspect,
(a) 2개 이상의 서로 다른 다당체(polysaccharide)를 알코올을 함유하는 증류수와 혼합하고, 45~55℃에서 2.5~3.5시간 동안 가열시킨 다음, 1차 혼합물로 수득하는 단계;(a) mixing two or more different polysaccharides with distilled water containing alcohol, heating at 45 to 55 캜 for 2.5 to 3.5 hours, and then obtaining a first mixture;
(b) 상기 1차 혼합물을 카제인 인산 펩티드(Casein phosphoric acid peptide), 아미노산 및 저분자량의 폴리아미드와 혼합한 후 pH를 6.0~6.5로 조절하고, 55~65℃에서 10~14시간 동안 가열시킨 다음, 2차 혼합물로 수득하는 단계; 및(b) mixing the primary mixture with a casein phosphoric acid peptide, an amino acid and a low molecular weight polyamide, adjusting the pH to 6.0 to 6.5, heating the mixture at 55 to 65 ° C for 10 to 14 hours Followed by obtaining as a secondary mixture; And
(c) 상기 2차 혼합물을 10~14시간 동안 2~4회 투석하고, 10~14시간 동안 건조시킨 다음, 2개 이상의 서로 다른 다당체의 결합에 의해 형성되는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머로 회수하는 단계;를 포함하는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머의 제조방법에 관한 것이다.(c) dialyzing the secondary mixture for 2 to 4 times for 10 to 14 hours, drying for 10 to 14 hours, and then recovering the nanopolymer having a heteropolymer structure formed by binding of two or more different polysaccharides And a method for producing a nanopolymer having a modified polymer structure.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 다당체는 키틴(Chitin), 전분(Starch), 셀룰로오스(Cellulose), 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan), 이눌린(Inulin), 아밀로펙틴(Amylopectin), 글리코겐(Glycogen), 펙틴(Pectin), 덱스트란(Dextran), 잔탄 검(Xanthan Gum), 풀루란(Pullulan), 헤미셀룰로오스(Hemicellulose), 폴리덱스트로스(Polydextrose), 베타-글루칸(Beta-glucan), 사일리움 허스크 점질물(Psyllium husk mucilage), 갈락토만난(Galactomannan), 글루코만난(Glucomannan), 카라야 검(Karaya Gum), 아라비노자일란(Arabinoxylan), 겔란 검(Gellan Gum), 잔탄(Xanthan), 아가-아가(Agar-Agar), 알긴산(Alginate) 및 카라기난(Carrageenan)으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 2개 이상의 서로 다른 다당체 중 하나는 키틴이다.The polysaccharide may be selected from the group consisting of Chitin, Starch, Cellulose, Glycosaminoglycan, Inulin, Amylopectin, Glycogen, Pectin, Dextran Dextran, Xanthan Gum, Pullulan, Hemicellulose, Polydextrose, Beta-glucan, Psyllium husk mucilage, Galactomannan Galactomannan, glucomannan, karaya gum, arabinoxylan, gellan gum, xanthan, agar-agar, alginate and carrageenan (Carrageenan). However, it is not limited thereto, and preferably one of two or more different polysaccharides is chitin.
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 알코올을 함유하는 증류수는 2.5~25%(v/v) 에탄올일 수 있으며, 바람직하게는 5~25%(v/v)인 것을 특징으로 할 수 있다.The distilled water containing the alcohol may be 2.5 to 25% (v / v) ethanol, preferably 5 to 25% (v / v).
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 (a) 단계에서 3개의 서로 다른 다당체를 알코올을 함유하는 증류수와 혼합하는 경우, 3개의 서로 다른 다당체의 중량 비율은 1:2:1인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.When the three different polysaccharides are mixed with the distilled water containing alcohol in the step (a), the weight ratio of the three different polysaccharides may be 1: 2: 1, but the present invention is not limited thereto.
상기 저분자량 폴리아미드는 중량 평균 분자량(MW)이 200,000 미만(예컨대, 100,000 미만, 예컨대 70,000 미만)인 폴리아미드를 의미하고, 저분자량 폴리아미드의 예로는 PVP K30, PVP K15, 및 PVP K12를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 PVP K30이다.The low molecular weight polyamide means a polyamide having a weight average molecular weight (MW) of less than 200,000 (for example, less than 100,000, for example, less than 70,000), and examples of the low molecular weight polyamide include PVP K30, PVP K15, and PVP K12 But is not limited thereto, and preferably PVP K30.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 (b) 단계에서 가열된 1차 혼합물에 혼합한 카제인 인산 펩티드(Casein phosphoric acid peptide): 아미노산의 중량 비율은 15~60:9~36이고, 가열된 1차 혼합물에 혼합한 저분자량 폴리아미드는 0.25~1%(w/v)로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있다.The weight ratio of the casein phosphoric acid peptide: amino acid mixed in the primary mixture heated in the step (b) is 15 to 60: 9 to 36, and the low molecular weight polyamide mixed with the heated primary mixture May be added in an amount of 0.25 to 1% (w / v).
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 카제인 인산 펩티드는 우유에 트립신 등의 단백질 분해효소를 처리하여 수득한 유단백가수분해물로 카제인 포스포펩티드(Casein phosphopeptide, CPP)라고도 한다.The casein phosphopeptide is a milk protein hydrolyzate obtained by treating proteinase such as trypsin in milk and is also referred to as casein phosphopeptide (CPP).
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 아미노산은 히스티딘 및 프롤린으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.The amino acid may include at least one selected from the group consisting of histidine and proline.
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 (c) 단계에서 건조는 진공오븐에서 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The drying in the step (c) may be performed in a vacuum oven, but is not limited thereto.
본 발명은 다른 관점에서, The present invention, in another aspect,
상기 방법으로 제조된 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머에 관한 것이다.To a nanopolymer having a heteropolymer structure prepared by the above method.
본 발명은 또 다른 관점에서,The present invention, in another aspect,
핵산 증폭용 시약 및 상기 방법으로 제조된 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머를 포함하는 핵산반응 조성물에 관한 것이다.A nucleic acid amplification reagent and a nanopolymer having a heteropolymer structure prepared by the above method.
여기서, 상기 핵산반응 조성물에 포함된 상기 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머의 함량은 핵산 증폭용 시약의 원료물질의 종류 및 함량에 따라 조절 가능하며, 상기 핵산반응 조성물의 총 부피가 1ml인 경우, 상기 핵산반응 조성물에 포함된 상기 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머는 0.01~0.5mg, 바람직하게는 0.05~0.15mg이다.Here, the content of the nanopolymer having the heteropolymer structure included in the nucleic acid reaction composition may be adjusted according to the kind and content of the raw material of the nucleic acid amplification reagent. When the total volume of the nucleic acid reaction composition is 1 ml, The nano-polymer having the above-mentioned releasing polymer structure contained in the nucleic acid reaction composition is 0.01 to 0.5 mg, preferably 0.05 to 0.15 mg.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머는 상기 핵산 증폭용 시약에 포함된 원료물질들의 표면을 코팅시킴으로써 원료물질들의 물리적 상호 접촉, 산화 또는 가수분해를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The nanopolymer having the above-mentioned modified polymer structure may be characterized in that the surface of the raw materials contained in the nucleic acid amplification reagent is coated to inhibit physical contact, oxidation or hydrolysis of the raw materials, but the present invention is not limited thereto .
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 원료물질들은 효소단백질 또는 핵산인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The raw materials may be enzymatic proteins or nucleic acids, but are not limited thereto.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 효소단백질은 중합효소 또는 역전사효소인 것을 특징으로 할 수 있다.The enzyme protein may be a polymerase or a reverse transcriptase.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 핵산은 프라이머, 프로브 및 데옥시뉴클레오티드(deoxynucleotide triphosphate, dNTP) 및 뉴클레오티드(nucleotide triphosphate, NTP)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The nucleic acid may include at least one selected from the group consisting of primers, probes and deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) and nucleotides (nucleotide triphosphates, NTP), but the present invention is not limited thereto.
상기 프라이머는 주형 핵산(template nucleic acid)에 대해 정방향 또는 역방향의 염기서열을 가지며, 주형 핵산의 특이적 염기서열과 전체 또는 부분적으로 상보성을 가지는 짧은 단일가닥의 DNA를 의미하며, 이는 핵산의 증폭에 필요한 원료물질에 해당된다. The term "primer" refers to short single-stranded DNA having a base sequence in a forward or reverse direction with respect to a template nucleic acid and having a total or partial complementarity with a specific base sequence of the template nucleic acid, It corresponds to necessary raw material.
본 발명에서 사용가능한 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피온 프로브(scorpion probe), TaqMan 프로브, 형광 PNA 프로브 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Probes usable in the present invention include, but are not limited to, molecular beacon probes, scorpion probes, TaqMan probes, and fluorescent PNA probes.
상기 형광 PNA 프로브는 양말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 가지는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 양 말단에는 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching) 할 수 있는 소광자(quencher)가 결합될 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The fluorescent PNA probe preferably has a reporter and a quencher at both ends. That is, in the PNA probe according to the present invention, a reporter and a quencher capable of quenching the reporter fluorescence may be combined at both ends. The reporter may be selected from the group consisting of 6-carboxyfluorescein, Texas red, HEX (2 ', 4', 5 ', 7', -tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) And the quencher may be at least one selected from the group consisting of TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 and Dabcyl, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 핵산반응 조성물은 -45℃ 내지 -35℃에서 145~155mmHg의 압력으로 6~24시간 동안 탈수반응으로 결정화된 것을 특징으로 할 수 있다.The nucleic acid reaction composition may be characterized in that it is crystallized by dehydration reaction at a temperature of -45 ° C to -35 ° C at a pressure of 145 to 155 mmHg for 6 to 24 hours.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 탈수반응은 나노폴리먼간의 물리적 결합을 유도함으로써 상기 핵산반응 조성물이 고형의 타블릿 형태로 결정화되는 것을 특징으로 할 수 있다.The dehydration reaction may be characterized in that the nucleic acid reaction composition is crystallized in the form of a solid tablet by inducing physical binding between the nanopallone.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 고형의 타블릿 형태로 결정화된 핵산반응 조성물은 비정형의 미세 타공들이 포함되는 입체형 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.The nucleic acid reaction composition crystallized in the form of a solid tablet may have a three-dimensional structure including amorphous micropores.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 비정형의 미세 타공들이 포함되는 입체형 구조는 핵산반응 조성물에 포함된 핵산 증폭용 시약의 원료물질들을 일정한 간격으로 고정시킴으로써 원료물질들의 물리적 상호 접촉을 억제시켜 원료물질들이 상호반응하지 못하도록 하여 원료물질의 활성을 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다.The three-dimensional structure including the amorphous fine pores prevents nucleic acid amplification reagents contained in the nucleic acid reaction composition from being fixed at fixed intervals, thereby preventing physical interactions between the raw materials, thereby preventing mutual reaction of the raw materials, And the activity is maintained.
본 발명의 조성물은 키트의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 상기 키트는 앞서 언급된 조성물의 구성성분(원료물질)들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.The composition of the present invention may be provided in the form of a kit, which kit comprises a buffer, a DNA polymerase joiner and a reagent (s) required to carry out a target amplification PCR reaction (e. G., PCR reaction) such as deoxyribonucleotide-5-triphosphate As shown in FIG. In addition, the kit may include various polynucleotide molecules, reverse transcriptase, buffer and reagents, and antibodies that inhibit DNA polymerase activity. In addition, the kit may be readily determined by those skilled in the art having the teachings herein to determine the optimal amount of reagent used in a particular reaction. Typically, the kit may be made in a separate package or compartment containing the components (raw materials) of the aforementioned composition.
본 발명은 또 다른 관점에서, The present invention, in another aspect,
(a) 시료로부터 표적 핵산을 분리한 다음, 상기 분리한 핵산을 상기 핵산반응 조성물과 혼합하여 핵산 증폭 반응물을 준비하는 단계; 및(a) separating a target nucleic acid from a sample and preparing a nucleic acid amplification reaction by mixing the separated nucleic acid with the nucleic acid reaction composition; And
(b) 상기 핵산 증폭 반응물을 사용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계;를 포함하는, 핵산반응 조성물을 이용한 핵산의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.(b) amplifying the target nucleic acid using the nucleic acid amplification reagent, and a method for detecting or quantifying nucleic acid using the nucleic acid reaction composition.
본 발명에 있어서,In the present invention,
상기 시료는 인간을 포함하는 동물의 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 상기 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 상기 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. The sample may be derived from a specific tissue or organ of an animal, including a human. Representative examples of such tissues include binding, skin, muscle or nervous tissue. Representative examples of the above-mentioned organs include, but are not limited to, eyes, brain, lung, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, small intestine, testis, , Lines and inner blood vessels.
상기 시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. The sample includes any cell, tissue, fluid, or any other medium that can be well analyzed by the present invention from a biological source, which can be used for the consumption of human, animal, human or animal Samples from the prepared food are included. In addition, the sample to be analyzed includes a body fluid sample, which may be a sputum, blood, serum, plasma, lymph, milk, urine, feces, eye milk, saliva, semen, brain extract Spleen and tonsil tissue extracts.
본 발명에서 "표적 핵산"이란 단일가닥이나 이중가닥의 DNA, RNA와 그 화학적 수식체를 의미하는데, 이러한 수식은 선별된 핵산의 증폭을 간섭하지 않는것으로, 백본(backbone) 수식, 메틸화, 이상 염기상 조합, 5-브로모-우라실의 치환 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the term "target nucleic acid" means a single stranded or double stranded DNA or RNA and a chemically modified material thereof. Such a formula does not interfere with the amplification of the selected nucleic acid, and includes backbone modification, methylation, Metaphase combination, 5-bromo-uracil substitution, and the like.
초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일가닥으로, 또는 부분적인 단일가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예: 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook et al,, Molecular Cloning, 2001에 개시되어 있다.When the nucleic acid as the starting material is a double strand, it is preferable to make the two strands into a single strand, or a partial single strand form. Methods known to separate strands include, but are not limited to, heat, alkaline, formamide, urea and glycocalse treatment, enzymatic methods such as helicase action, and binding proteins. For example, the strand separation can be achieved by heat treatment at a temperature of 80 to 105 ° C. A general method of treatment as described above is disclosed in Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, 2001.
본 발명의 '표적 핵산'은 검출/판별하고자 하는 유전자 또는 특정 유전자형의 핵산 서열(SNP(single nucleotide polymorphism) 포함)을 의미하며, 바람직하게는 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.The 'target nucleic acid' of the present invention refers to a gene to be detected / discriminated or a nucleic acid sequence (SNP (single nucleotide polymorphism)) of a specific genotype, preferably a target gene encoding a protein having a physiological / biochemical function &Apos; and is annealed or hybridized with the primer or probe under hybridization, annealing or amplification conditions.
본 발명에서 사용되는 표적 핵산의 증폭을 위한 표적 핵산, 프라이머, 프로브 등을 포함하는 핵산 증폭 반응물에 포함된 핵산반응 조성물의 원료물질의 농도(또는, 함량)는 통상적인 증폭반응(중합효소연쇄반응 등)에서 사용되는 농도(또는, 함량)를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The concentration (or the content) of the raw material of the nucleic acid reaction composition contained in the nucleic acid amplification reaction including the target nucleic acid, primer, probe, etc. for amplification of the target nucleic acid used in the present invention may be determined by a conventional amplification reaction (Or the content thereof) used in the present invention may be used, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, In the present invention,
상기 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), 역전사반응(Reverse Transcription), 상보적 DNA 합성(Complementary DNA Synthesis), LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification), NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), SDA(Strand Displacement Amplification), MDA(Multiple Displacement Amplification), RCA(Rolling Circle Amplification), LCR(Ligase Chain Reaction), HDA(Helicase Dependent Amplification) 및 RAM(Ramification Amplification Method)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The amplification can be carried out using polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time PCR, reverse transcription Transcription, Complementary DNA Synthesis, Loop-Mediated Isothermal Amplification, Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, SDA Strand Displacement Amplification, Amplification, LCR (Ligase Chain Reaction), HDA (Helicase Dependent Amplification), and RAM (Ramification Amplification Method). However, the present invention is not limited thereto.
상기 중합효소연쇄반응은 94℃의 변성(denaturation), 45~67℃의 결합(annealing) 및 72℃의 신장(extension)의 세 단계가 1 사이클로, 증폭산물이 생성되기까지 일정 사이클 동안 중합반응이 반복될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The polymerase chain reaction was carried out in three cycles of denaturation at 94 ° C, annealing at 45 ° C to 67 ° C and extension at 72 ° C for a predetermined cycle until amplification products were generated. But is not limited thereto.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 정상 대조군과 돌연변이(SNP 포함) 사이에서 염기서열의 변이 유무를 분석할 수 있다.In the real-time PCR, the fluorescent substance is interchelated in a double strand DNA chain in the PCR process, and the PCR product is amplified and the temperature is raised to loosen the DNA double strand, (Tm) at which the melting curve (denaturation) of the DNA, particularly the DNA, is analyzed to analyze the presence or absence of the nucleotide sequence between the normal control and the mutation (including the SNP) .
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples illustrate the contents of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
실시예Example 1: One: 나노폴리머의Nano-polymer 제조 Produce
먼저, 나노폴리머를 제조하고자 100g의 키틴(Chitin), 50g의 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan) 및 100g의 녹말에 60ml의 증류수 및 15ml의 25%(v/v) 에탄올을 첨가하여 총 부피가 75ml인 혼합물을 준비하고, 상기 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 가열시킨 다음, 1차 혼합물로 수득하였다. First, 100 g of chitin, 50 g of glycosaminoglycan and 100 g of starch were added to 60 ml of distilled water and 15 ml of 25% (v / v) ethanol to prepare a nanopolymer. The total volume was 75 ml Was prepared and the mixture was heated at 50 < 0 > C for 3 hours and then taken as the primary mixture.
상기 1차 혼합물에 30mg의 카제인 인산 펩티드(Casein phosphoric acid peptide), 아미노산으로서 10mg의 히스티딘(Histidine), 3mg의 프롤린(Proline) 및 25ml의 0.5%(w/v) PVP K30(저분자량 폴리아미드)을 첨가하여 총 부피가 100ml인 혼합물을 준비하고, 상기 혼합물의 pH를 6.2로 조절하고, 60℃에서 12시간 동안 가열시킨 다음, 2차 혼합물로 수득하였다. 상기 2차 혼합물을 12시간 동안 3회 투석시키고, 진공오븐에서 12시간 동안 건조시킨 다음, 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머로 회수하였다.To the primary mixture was added 30 mg casein phosphoric acid peptide, 10 mg histidine as amino acid, 3 mg proline and 25 ml 0.5% (w / v) PVP K30 (low molecular weight polyamide) To prepare a mixture having a total volume of 100 ml, the pH of the mixture was adjusted to 6.2, heated at 60 캜 for 12 hours, and then obtained as a secondary mixture. The secondary mixture was dialyzed three times for 12 hours, dried in a vacuum oven for 12 hours, and then recovered as a nanopolymer having a release polymer structure.
실시예Example 2: 2: 타블렛형Tablet type 핵산반응 조성물의 제조 Preparation of nucleic acid reaction composition
실시예 1에서 제조된 나노폴리머를 핵산 증폭용 시약(핵산 증폭에 필요한 반응시약으로 원료물질인 효소단백질, 버퍼 등을 포함함)과 혼합하여 핵산반응 조성물로 제조하였다(표 1 참조). 필요한 경우, 상기 핵산반응 조성물을 0.2ml PCR 튜브에 각각 10μl씩 분주한 후 -40℃에서 150mmHg의 압력으로 6~24시간 동안 탈수하여 결정화시킨 타블렛형 핵산반응 조성물로 제조하였다.The nanopolymer prepared in Example 1 was mixed with a reagent for nucleic acid amplification (a reaction reagent necessary for nucleic acid amplification, including an enzyme protein, a buffer, etc. as a raw material) to prepare a nucleic acid reaction composition (see Table 1). If necessary, 10 μl of each of the nucleic acid reaction compositions was dispensed into 0.2 ml PCR tubes, and then dehydrated at -40 ° C. under a pressure of 150 mmHg for 6 to 24 hours for crystallization, thereby preparing a tablet-like nucleic acid reaction composition.
표 1은 핵산반응 조성물을 나타낸 것이다.Table 1 shows the nucleic acid reaction composition.
실시예Example 3: 보관 온도 및 보관 시간에 따른 핵산반응 조성물의 핵산 증폭 성능 3: Nucleic acid amplification performance of nucleic acid reaction composition according to storage temperature and storage time
실시예 2에서 제조된 핵산반응 조성물(또는 타블렛형 핵산반응 조성물)의 핵산 증폭 성능(활성)을 시험하고자, 다양한 온도 조건에서 보관된 핵산반응 조성물에 주형 DNA 및 프라이머를 첨가한 다음, 핵산 증폭 반응을 수행하였다.To test the nucleic acid amplification performance (activity) of the nucleic acid reaction composition (or tablet type nucleic acid reaction composition) prepared in Example 2, the template DNA and the primer were added to the nucleic acid reaction composition stored at various temperature conditions, Respectively.
본 실시예의 주형 DNA는 서로 다른 크기(1262bp 또는 610bp)의 사람 beta-actin 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA(plasmid DNA, pDNA)를 사용하였다.Plasmid DNA (pDNA) containing human beta-actin gene of different size (1262 bp or 610 bp) was used as the template DNA of this example.
필요한 경우, 상기 주형 DNA는 위즈바이오솔루션의 WizPure gDNA Mini Kit(Blood)를 이용하여 사람의 혈액으로부터 추출한 genomic DNA를 사용할 수 있으나, DNA의 소스는 이에 한정되는 것은 아니다.If necessary, the template DNA can be genomic DNA extracted from human blood using WizPure gDNA Mini Kit (Blood) of WizBio solution, but the source of DNA is not limited thereto.
상기 핵산반응 조성물은, (i) 액상 상태의 핵산반응용액을 냉동보관한 핵산반응 조성물, (ii) 건조된 핵산반응용액을 25℃에서 보관한 핵산반응 조성물, 및 (iii) 건조된 핵산반응용액을 37℃에서 보관한 핵산반응 조성물로 준비하였다. (Ii) a nucleic acid reaction composition in which the dried nucleic acid reaction solution is stored at 25 DEG C, and (iii) a nucleic acid reaction composition in which the dried nucleic acid reaction solution Lt; RTI ID = 0.0 > 37 C. < / RTI >
상기 핵산반응 조성물은 각 온도 조건(냉동, 25℃, 37℃)에서 1년간 보관하면서 1개월 단위로 성능시험을 수행하였다. 각 성능시험은 표 2의 프라이머를 사용하여 표 3의 조건으로 PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소증폭반응)을 수행하였으며, 실험표준물질(대조군)은 액상상태의 핵산반응 조성물을 냉동보관하여 사용하였다. 여기서, 주형은 1262bp 또는 610bp 크기를 가지는 플라스미드 DNA를 희석하여 사용하였으며, 상기 플라스미드 DNA의 용량을 달리하여 100pg(lane 1), 10pg(lane 2), 1pg(lane 3), 100fg(lane 4), 10fg(lane 5), 1fg(lane 6)을 사용하여 PCR 후 1% 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동(100V, 20분)을 수행하였다(도 2 및 도 3 참조; M은 100bp DNA size marker임).
The nucleic acid reaction composition was subjected to a performance test every month for one year at each temperature condition (frozen, 25 ° C, 37 ° C). For each performance test, PCR (Polymerase Chain Reaction, Polymerase Chain Reaction) was performed under the conditions shown in Table 3 using the primers shown in Table 2, and the test substance (control group) . In this case, the plasmid DNA having a size of 1262 bp or 610 bp was used as a template, and 100 pg (lane 1), 10 pg (lane 2), 1 pg (lane 3), 100 fg The PCR was performed on 1% agarose gel electrophoresis (100 V, 20 min) using 10 fg (lane 5) and 1 fg (lane 6) marker).
표 2는 PCR에 사용된 프라이머의 서열을 나타낸 것이다.Table 2 shows sequences of the primers used in the PCR.
표 3은 PCR 조건을 나타낸 것이다.Table 3 shows the PCR conditions.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 핵산반응 조성물(핵산반응 용액)의 활성도 변화를 PCR를 이용하여 핵산 증폭 여부로 총 12개월간 확인 시 주형 DNA의 크기(1,262bp, 610bp)와 무관하게 보관 온도 및 보관 시간에 따른 핵산반응 조성물의 활성도 차이는 크지 않았다. 따라서, 나노폴리머가 포함된 핵산반응 조성물을 상온 이상에서 장시간 동안 보관하여도 냉동보관된 핵산반응 조성물과 동등하고 안정적인 핵산 증폭이 가능한 것으로 확인되었다.
As a result, as shown in FIG. 2 and FIG. 3, the change in the activity of the nucleic acid reaction composition (nucleic acid reaction solution) was confirmed regardless of the size of the template DNA (1,262 bp, 610 bp) The difference in the activity of the nucleic acid reaction composition by storage temperature and storage time was not significant. Therefore, even when the nucleic acid reaction composition containing the nanopolymer is stored at room temperature or longer for a long time, it is confirmed that the nucleic acid amplification is equivalent to the nucleic acid reaction composition that is cryopreserved and can be stably amplified.
실시예Example 4: 4: 프라이머primer 및 And 프로브가The probe 포함된 included 타블렛형Tablet type 핵산반응 조성물의 제조 Preparation of nucleic acid reaction composition
실시예 1에서 제조된 나노폴리머를 핵산 증폭용 시약(핵산 증폭에 필요한 반응시약)과 혼합 시 표 4의 프라이머 및 프로브를 첨가하여 핵산반응 조성물로 제조하였다(표 1 참조). 필요한 경우, 상기 핵산반응 조성물은 추가로 0.1ml Real-Time PCR 튜브에 각각 10μl씩 분주한 후 -40℃ 이하의 초저온 상태에서 150mmHg의 압력으로 6~24시간 동안 탈수하여 결정화시킨 타블렛형 핵산반응 조성물로 제조하였다. When the nanopolymer prepared in Example 1 was mixed with a nucleic acid amplification reagent (reaction reagent necessary for nucleic acid amplification), a primer and a probe of Table 4 were added to prepare a nucleic acid reaction composition (see Table 1). If necessary, the nucleic acid reaction composition is further divided into 10 ml of each of 0.1 ml Real-Time PCR tubes, and then dehydrated and crystallized at a low temperature of -40 ° C or less under a pressure of 150 mmHg for 6 to 24 hours to obtain a tablet- .
여기서, Real-Time PCR용 핵산 증폭 반응물로는, (1) 음성 대조군: 프라이머 및 프로브를 포함하지 않은 핵산반응 조성물(도 4의 청색선: 액상 핵산반응용액), (2) 비교군 1: 프라이머 및 프로브를 포함하지 않고 결정화시킨 핵산반응 조성물(도 4의 녹색선: 건조된 핵산반응용액), (3) 비교군 2: 프라이머만 포함하고 결정화시킨 핵산반응 조성물(도 4의 적색선: 건조된 핵산반응용액), 또는 (4) 실험군: 프라이머 및 프로브를 포함하고 결정화시킨 핵산반응 조성물(도 4의 황색선: 건조된 핵산반응용액)에 표적 핵산(사람 beta-actin 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA; 실시예 3 참조)을 첨가하여 사용하되, 비교군 1은 결정화 후 프라이머 및 프로브를 추가로 첨가하고, 비교군 2는 결정화 후 프로브를 추가로 첨가한 다음, 표 5의 조건으로 Real-Time PCR(CFX96, Bio-Rad)을 수행한 후 (1)~(4) 핵산반응 조성물의 PCR 정도를 비교하였다.
Here, the nucleic acid amplification reagents for real-time PCR include (1) negative control: a nucleic acid reaction composition (blue line: liquid nucleic acid reaction solution) containing no primer and probe; (2) (A green line in FIG. 4: a dried nucleic acid reaction solution), (3) a comparison group 2: a nucleic acid reaction composition containing only a primer and crystallized (red line in FIG. 4: dried nucleic acid (A plasmid DNA containing a human beta-actin gene) was added to a nucleic acid reaction composition (yellow line in FIG. 4: dried nucleic acid reaction solution) containing a primer and a probe and crystallized. (Comparative Example 1), and
표 4는 Real-Time PCR에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 나타낸 것이다.Table 4 shows sequences of primers and probes used in Real-Time PCR.
표 5는 Real-Time PCR 조건을 나타낸 것이다.Table 5 shows the Real-Time PCR conditions.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 프라이머만 포함하고 결정화시킨 핵산반응 조성물(도 4의 적색선: 건조된 핵산반응용액), 또는 프라이머 및 프로브를 포함하고 결정화시킨 핵산반응 조성물(도 4의 황색선: 건조된 핵산반응용액)은 프라이머 및 프로브를 포함하지 않고 결정화시킨 핵산반응 조성물(도 4의 녹색선: 건조된 핵산반응용액)과 비교했을 때 핵산 증폭의 성능 차이가 없는 것으로 나타났으므로 핵산반응 조성물에 포함된 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머는 프라이머 및 프로브의 활성을 안정하게 유지하는 것으로 확인되었다.
As a result, as shown in Fig. 4, the nucleic acid reaction composition (red line: dried nucleic acid reaction solution) containing only the primer and crystallized, or the nucleic acid reaction composition containing the primer and probe and crystallized : Dried nucleic acid reaction solution) showed no difference in nucleic acid amplification performance compared to the nucleic acid reaction composition (green line: dried nucleic acid reaction solution) crystallized without containing the primer and the probe, Nanopolymers having a heteropolymer structure included in the composition were found to stably maintain the activity of primers and probes.
실시예Example 5: 5: 프라이머primer 및 And 프로브를The probe 포함하고, 결정화된 핵산반응 조성물의 보관 온도에 따른 Real-Time , And the ratio of the real-time PCRPCR 성능 Performance
실시예 4에서 준비한 프라이머 및 프로브를 포함하고, 결정화된 핵산반응 조성물(핵산반응 용액)을 각 온도 조건(냉동, 25℃, 37℃)에서 1년간 보관하면서 1개월 단위로 성능비교시험을 수행하였다. 각 성능비교시험은 표 5의 조건으로 Real-Time PCR(CFX96, Bio-Rad)을 수행하였으며, 실험표준물질(대조군)은 액상상태의 핵산반응 조성물을 냉동보관하여 사용하였다. 상기 Real-Time PCR로부터 회수된 시험 데이터는 분석프로그램을 이용하여 핵산반응 조성물의 PCR 정도를 비교하였다.Performance comparative tests were performed on a monthly basis, including the primers and probes prepared in Example 4, and the crystallized nucleic acid reaction composition (nucleic acid reaction solution) was stored at each temperature condition (frozen, 25 ° C, 37 ° C) for one year . Real-Time PCR (CFX96, Bio-Rad) was performed under the conditions shown in Table 5 for each performance comparison test, and the nucleic acid reaction composition in the liquid state was used as an experimental standard (control group). The test data recovered from the Real-Time PCR was compared with the PCR degree of the nucleic acid reaction composition using an analysis program.
여기서, Real-Time PCR용 핵산 증폭 반응물로는, (1) 음성 대조군: 프라이머 및 프로브를 포함하지 않은 핵산반응 조성물(도 5의 청색선: 액상 핵산반응용액(-20℃ 보관)), (2) 실험군 1: 프라이머 및 프로브를 포함하고 결정화시킨 핵산반응 조성물(도 5의 녹색선: 건조된 핵산반응용액(25℃ 보관)), 또는 (3) 실험군 2: 프라이머 및 프로브를 포함하고 결정화시킨 핵산반응 조성물(도 5의 적색선: 건조된 핵산반응용액(37℃ 보관))에 표적 핵산(사람 beta-actin 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA; 실시예 3 참조)을 첨가하여 사용하되, 표 5의 조건으로 Real-Time PCR(CFX96, Bio-Rad)을 수행한 후 (1)~(3) 핵산반응 조성물의 PCR 정도를 비교하였다. The nucleic acid amplification reagent for real-time PCR (1) negative control: a nucleic acid reaction composition (blue line: liquid nucleic acid reaction solution (-20 ° C storage) ) Experimental group 1: nucleic acid reaction composition containing the primer and probe and crystallized (green line in Fig. 5: dried nucleic acid reaction solution (stored at 25 캜)) or (3) experimental group 2: nucleic acid containing the primer and probe and crystallized The target nucleic acid (plasmid DNA containing the human beta-actin gene; see Example 3) was added to the reaction composition (red line in FIG. 5: dried nucleic acid reaction solution (stored at 37 ° C) After performing Real-Time PCR (CFX96, Bio-Rad), the degree of PCR of the nucleic acid reaction compositions (1) to (3) was compared.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Real-Time PCR를 수행하는 데 있어 나노폴리머를 이용하여 결정화된 핵산반응 조성물은 실온(25℃) 및 고온(37℃)에서 1년 이상 보관하더라도 냉동된 핵산반응 조성물과 차이가 없음을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 5, the nucleic acid reaction composition crystallized using the nanopolymer in performing real-time PCR showed that even when stored at room temperature (25 ° C.) and high temperature (37 ° C.) It was confirmed that there was no difference from the reaction composition.
결국, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머를 이용하여 핵산반응 조성물에 포함된 원료물질(효소단백질, 핵산 등)을 코팅한 다음, 결정화하면, 상기 핵산반응 조성물에 포함된 원료물질의 활성을 최소 1년 동안 실온에서 안정하게 유지할 수 있었다.As a result, when the raw material (enzyme protein, nucleic acid, etc.) contained in the nucleic acid reaction composition is coated and then crystallized using the nanopolymer having a heteropolymer structure prepared by the method according to the present invention, The activity of the raw material can be stably maintained at room temperature for at least one year.
지금까지 본 발명에 따른 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머, 이의 제조방법, 이를 포함하는 핵산반응 조성물, 및 이를 포함하는 핵산반응 조성물을 이용한 핵산의 검출 또는 정량 방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, It will be apparent that various modifications may be made without departing from the scope of the present invention.
그러므로 본 발명의 범위에는 설명된 실시예에 국한되어 전해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.Therefore, the scope of the present invention should not be limited to the above-described embodiments, but should be determined by the scope of the appended claims and equivalents thereof.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.It is to be understood that the foregoing embodiments are illustrative and not restrictive in all respects and that the scope of the present invention is indicated by the appended claims rather than the foregoing description, It is intended that all changes and modifications derived from the equivalent concept be included within the scope of the present invention.
Claims (18)
(b) 상기 1차 혼합물을 카제인 인산 펩티드(Casein phosphoric acid peptide), 아미노산 및 폴리아미드와 혼합한 후 pH를 6.0~6.5로 조절하고, 55~65℃에서 10~14시간 동안 가열시킨 다음, 2차 혼합물로 수득하는 단계; 및
(c) 상기 2차 혼합물을 10~14시간 동안 2~4회 투석하고, 10~14시간 동안 건조시킨 다음, 2개 이상의 서로 다른 다당체의 결합에 의해 형성되는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머로 회수하는 단계;를 포함하는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머의 제조방법.
(a) mixing two or more different polysaccharides with distilled water containing alcohol, heating at 45 to 55 캜 for 2.5 to 3.5 hours, and then obtaining a first mixture;
(b) mixing the primary mixture with casein phosphoric acid peptide, amino acid and polyamide, adjusting pH to 6.0 ~ 6.5, heating at 55 ~ 65 ℃ for 10 ~ 14 hours, Lt; / RTI >mixture; And
(c) dialyzing the secondary mixture for 2 to 4 times for 10 to 14 hours, drying for 10 to 14 hours, and then recovering the nanopolymer having a heteropolymer structure formed by binding of two or more different polysaccharides The method comprising the steps of: preparing a nanopolymer having a modified polymer structure;
상기 다당체는 키틴(Chitin), 전분(Starch) 및 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan)으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the polysaccharide is at least one selected from the group consisting of chitin, starch, and glycosaminoglycan. 10. The method of claim 1, wherein the polysaccharide is at least one selected from the group consisting of chitin, starch and glycosaminoglycan.
상기 알코올을 함유하는 증류수는 2.5~25%(v/v) 에탄올인 것을 특징으로 하는, 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the alcohol-containing distilled water is 2.5 to 25% (v / v) ethanol.
상기 (b) 단계에서 가열된 1차 혼합물에 혼합한 카제인 인산 펩티드(Casein phosphoric acid peptide): 아미노산의 중량 비율은 15~60:9~36이고, 가열된 1차 혼합물에 혼합한 폴리아미드는 0.25~1%(w/v)로 첨가되는 것을 특징으로 하는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머의 제조방법.
The method according to claim 1,
The weight ratio of casein phosphoric acid peptide: amino acid mixed in the primary mixture heated in step (b) was 15-60: 9-36, and the polyamide mixed in the heated primary mixture was 0.25 To about 1% (w / v) of the total weight of the nanopolymer.
상기 폴리아미드는 PVP K30인 것을 특징으로 하는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the polyamide is PVP K30.
상기 아미노산은 히스티딘, 프롤린 또는 이들을 혼합한 것을 특징으로 하는, 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the amino acid is histidine, proline, or a mixture thereof.
상기 1차 혼합물을 카제인 인산 펩티드(Casein phosphoric acid peptide), 아미노산 및 폴리아미드와 혼합한 후 pH를 6.0~6.5로 조절하고, 55~65℃에서 10~14시간 동안 가열시킨 다음, 2차 혼합물로 수득하며,
상기 2차 혼합물을 10~14시간 동안 2~4회 투석하고, 10~14시간 동안 건조시킨 다음, 2개 이상의 서로 다른 다당체의 결합에 의해 형성되는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머.
Two or more different polysaccharides are mixed with distilled water containing alcohol and heated at 45 to 55 DEG C for 2.5 to 3.5 hours and then obtained as a primary mixture,
The primary mixture is mixed with casein phosphoric acid peptide, amino acid and polyamide, and the pH is adjusted to 6.0 to 6.5, heated at 55 to 65 ° C for 10 to 14 hours, Lt; / RTI >
The nanocopolymer having a modified polymer structure formed by bonding the two or more different polysaccharides by dialysis of the secondary mixture for 2 to 4 times for 10 to 14 hours, followed by drying for 10 to 14 hours.
2개 이상의 서로 다른 다당체(polysaccharide)를 알코올을 함유하는 증류수와 혼합하고, 45~55℃에서 2.5~3.5시간 동안 가열시킨 다음, 1차 혼합물로 수득하고,
상기 1차 혼합물을 카제인 인산 펩티드(Casein phosphoric acid peptide), 아미노산 및 폴리아미드와 혼합한 후 pH를 6.0~6.5로 조절하고, 55~65℃에서 10~14시간 동안 가열시킨 다음, 2차 혼합물로 수득하며,
상기 2차 혼합물을 10~14시간 동안 2~4회 투석하고, 10~14시간 동안 건조시킨 다음, 2개 이상의 서로 다른 다당체의 결합에 의해 형성되는 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머;
를 포함하는 핵산반응 조성물.
A nucleic acid amplification reagent; And
Two or more different polysaccharides are mixed with distilled water containing alcohol and heated at 45 to 55 DEG C for 2.5 to 3.5 hours and then obtained as a primary mixture,
The primary mixture is mixed with casein phosphoric acid peptide, amino acid and polyamide, and the pH is adjusted to 6.0 to 6.5, heated at 55 to 65 ° C for 10 to 14 hours, Lt; / RTI >
A nanopolymer having a heteropolymer structure formed by bonding the two or more different polysaccharides by dialysis of the secondary mixture for 2 to 4 times for 10 to 14 hours, followed by drying for 10 to 14 hours;
≪ / RTI >
상기 이형 폴리머 구조를 가지는 나노폴리머는 상기 핵산 증폭용 시약에 포함된 원료물질들의 표면을 코팅시킴으로써 원료물질들의 물리적 상호 접촉, 산화 또는 가수분해를 억제하는 것을 특징으로 하는, 핵산반응 조성물.
9. The method of claim 8,
Wherein the nanopolymer having the heteropolymer structure inhibits physical interactions, oxidation or hydrolysis of the raw materials by coating the surface of the raw materials contained in the nucleic acid amplification reagent.
상기 원료물질들은 효소단백질 또는 핵산인 것을 특징으로 하는, 핵산반응 조성물.
10. The method of claim 9,
Wherein the raw materials are enzyme proteins or nucleic acids.
상기 효소단백질은 중합효소 또는 역전사효소인 것을 특징으로 하는, 핵산반응 조성물.
11. The method of claim 10,
Wherein the enzyme protein is a polymerase or reverse transcriptase.
상기 핵산은 프라이머, 프로브 및 데옥시뉴클레오티드(deoxynucleotide triphosphate, dNTP) 및 뉴클레오티드(nucleotide triphosphate, NTP)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산반응 조성물.
11. The method of claim 10,
Wherein the nucleic acid comprises at least one selected from the group consisting of a primer, a probe, and deoxynucleotide triphosphate (dNTP) and a nucleotide triphosphate (NTP).
상기 핵산반응 조성물은 -45℃ 내지 -35℃에서 145~155mmHg의 압력으로 6~24시간 동안 탈수반응으로 결정화된 것을 특징으로 하는, 핵산반응 조성물.
9. The method of claim 8,
Wherein the nucleic acid reaction composition is crystallized by dehydration reaction at a pressure of 145 to 155 mmHg at -45 캜 to -35 캜 for 6 to 24 hours.
상기 탈수반응은 나노폴리먼간의 물리적 결합을 유도함으로써 상기 핵산반응 조성물이 고형의 타블릿 형태로 결정화되는 것을 특징으로 하는, 핵산반응 조성물.
14. The method of claim 13,
Wherein the dehydration reaction induces physical binding between the nanopallones so that the nucleic acid reaction composition crystallizes in the form of a solid tablet.
상기 고형의 타블릿 형태로 결정화된 핵산반응 조성물은 비정형의 미세 타공들이 포함되는 입체형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는, 핵산반응 조성물.
15. The method of claim 14,
Wherein the nucleic acid reaction composition crystallized in the solid tablet form has a three-dimensional structure including amorphous micropores.
상기 비정형의 미세 타공들이 포함되는 입체형 구조는 핵산반응 조성물에 포함된 핵산 증폭용 시약의 원료물질들을 일정한 간격으로 고정시킴으로써 원료물질들의 물리적 상호 접촉을 억제시켜 원료물질들이 상호반응하지 못하도록 하여 원료물질의 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는, 핵산반응 조성물.
16. The method of claim 15,
The three-dimensional structure including the amorphous fine pores prevents nucleic acid amplification reagents contained in the nucleic acid reaction composition from being fixed at fixed intervals, thereby preventing physical interactions between the raw materials, thereby preventing mutual reaction of the raw materials, ≪ / RTI > activity of the nucleic acid.
(b) 상기 핵산 증폭 반응물을 사용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계;를 포함하는, 핵산반응 조성물을 이용한 핵산의 검출 또는 정량 방법.
(a) separating the target nucleic acid from the sample, and then mixing the separated nucleic acid with the nucleic acid reaction composition of any one of claims 8 to 16 to prepare a nucleic acid amplification reaction; And
and (b) amplifying the target nucleic acid using the nucleic acid amplification reagent.
상기 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), 역전사반응(Reverse Transcription), 상보적 DNA 합성(Complementary DNA Synthesis), LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification), NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), SDA(Strand Displacement Amplification), MDA(Multiple Displacement Amplification), RCA(Rolling Circle Amplification), LCR(Ligase Chain Reaction), HDA(Helicase Dependent Amplification) 및 RAM(Ramification Amplification Method)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 하는, 핵산의 검출 또는 정량 방법.18. The method of claim 17,
The amplification can be carried out using polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time PCR, reverse transcription Transcription, Complementary DNA Synthesis, Loop-Mediated Isothermal Amplification, Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, SDA Strand Displacement Amplification, Wherein at least one selected from the group consisting of Amplification, LCR (Ligase Chain Reaction), HDA (Helicase Dependent Amplification) and RAM (Ramification Amplification Method) is used.
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| US20120288533A1 (en) | 2011-03-01 | 2012-11-15 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Protein-polysaccharide conjugates and use for encapsulating nutraceuticals for clear beverage applications |
| JP2014525753A (en) | 2011-08-17 | 2014-10-02 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Compositions and methods for RT-PCR comprising anionic polymers |
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2016
- 2016-06-27 KR KR1020160080299A patent/KR101747038B1/en active IP Right Grant
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