KR101746025B1 - Composition for cryopreservating boer sperm comprising astaxanthin or curcumin - Google Patents

Abstract

본 발명은 통상적으로 사용되는 동결보존제에 더하여, 항산화제의 일종인 미세조류 유래의 아스타잔틴 또는 울금유래의 커큐민을 포함하는 돼지 정자 동결보존용 조성물 및 상기 조성물을 돼지 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 돼지 정자를 동결보존하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 돼지 정자 동결보존용 조성물을 이용하면, 우수한 품종의 돼지 정자의 동결보존시 돼지 정자의 손상을 최소화 할 수 있으므로, 돼지의 품종개량에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a composition for cryopreservation of swine sperm containing astaxanthin derived from microalgae or curcumin derived from microcysteine, which is a kind of antioxidant, and a composition for treating cryopreservation of swine sperm, The present invention relates to a method for cryopreserving a pig spermatozoon, The use of the composition for cryopreserving pig spermatozoa of the present invention can minimize the damage of pig spermatozoa when cryopreserved pig sperm of excellent variety is used, and thus it can be widely used for breeding pigs.

Description

아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 돼지 정자 동결보존용 조성물{Composition for cryopreservating boer sperm comprising astaxanthin or curcumin}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for cryopreserving boer sperm comprising astaxanthin or curcumin,

본 발명은 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 돼지 정자 동결보존용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 통상적으로 사용되는 동결보존제에 더하여, 항산화제의 일종인 미세조류 유래의 아스타잔틴 또는 울금유래의 커큐민을 포함하는 돼지 정자 동결보존용 조성물 및 상기 조성물을 돼지 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 돼지 정자를 동결보존하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for frozen sperm cryopreservation comprising astaxanthin or curcumin. More specifically, the present invention relates to a composition for frozen sperm cryopreservation comprising astaxanthin or curcumin. More specifically, the present invention relates to a cryoprotectant composition comprising astaxanthin or curcumin And a method for cryopreserving pig spermatozoa comprising the step of treating frozen sperm with the composition and cryopreserving the frozen spermatozoa.

정자의 동결과 저온 보관은 가축 등의 품종의 보존과 번식에 유용하며 생명공학 분야에서 활발히 연구되고 있는 분야이다. 특히, 동결 과정 중에 정자는 세포 내 빙정 형성, 삼투압의 차이 그리고 저온 스트레스에 의해 손상을 받게 되는데, 이러한 손상을 감소시키는 물질이 동결보존제이며 대표적인 물질로는 글리세롤(Glycerol)이 있다. 동결과정에 쓰이는 원 정액은 농도가 높기 때문에 희석액을 사용하여 묽히게 되는데, 희석 과정 중에 동결보존제가 희석액과 함께 투여된다. 글리세롤은 세포에 독성이 있는 물질이고 특히, 돼지의 정자는 다른 가축 동물의 정자보다 외부 자극에 대한 감수성이 높기 때문에 글리세롤에 의해 쉽게 손상을 받을 수 있다.Sperm freezing and cryopreservation are useful for the preservation and breeding of varieties such as livestock and are actively researched in biotechnology. In particular, during freezing, sperm are damaged by intracellular ice formation, osmotic pressure differences, and cold stress. Glycerol is a typical cryoprotectant. Since the concentration of the original semen used in the freezing process is diluted with a diluent, the cryopreservative is dispensed with the diluent during the dilution process. Glycerol is toxic to cells, and pig sperm can be easily damaged by glycerol because they are more susceptible to external stimuli than sperm of other livestock animals.

이러한 동결보존(cryopreservation)은 실험 및 인공수정(artificial insemination, AI)을 위한 정자 세포의 유용성을 확장시킨다. 다양한 기술적 제약에도 불구하고, 정자에의 접근가능성은 인공수정 및 시험관내 수정(in vitro fertilization, IVF)의 발전을 가능케 하였다. 그러나, 동결-융해된 정자는 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하는데, 이는 22℃에서 1℃로 냉각되는 동안 냉각 과정이 세포막 내 지질 및 단백질 재배열을 유도하기 때문이다. This cryopreservation extends the usefulness of sperm cells for experimental and artificial insemination (AI). Despite the various technical constraints, accessibility to sperm has allowed the development of artificial insemination and in vitro fertilization (IVF). However, frozen-thawed sperm do not have the same fertilizing potential as fresh sperm, which means that the cooling process leads to intracellular lipid and protein rearrangement during cooling from 22 ° C to 1 ° C Because.

이러한 변이는 저온에서 액상에서 겔상으로 변화하는 막에 의해 유도된다. 이는 동결보존 시 정자의 생존력 및 수정능을 감소시키는 주된 원인 중 하나이다. 그 중에서도 정자 막의 콜레스테롤/인지질 비율은 동결보존 시 막 유동성 및 안정성에 있어서 주요 결정인자이다. 인간 및 토끼 정자와 같은, 매우 높은 콜레스테롤/인지질 비율을 가지는 종에서 얻은 정자는 냉각될 때 이러한 막 손상을 겪지 않음이 보고되었다. 통상적으로, 막의 손상은 세포사멸에 대한 주요 원인 중 하나로 여겨지고 있다. 막의 주요 구성 요소인, 콜레스테롤은 막 기능의 조절과 같은 중요한 역할을 하고, 세포막에서 콜레스테롤은 막 유동성 및 투과성의 주요 결정인자로 알려져 있다. These variations are induced by membranes that change from liquid to gel at low temperatures. This is one of the main causes of reducing sperm viability and fertility during cryopreservation. Among them, cholesterol / phospholipid ratio of sperm membrane is the main determinant of membrane fluidity and stability in cryopreservation. It has been reported that sperm obtained from species with very high cholesterol / phospholipid ratios, such as human and rabbit sperm, do not experience this membrane damage upon cooling. Typically, membrane damage is thought to be one of the major causes of cell death. Cholesterol, a major component of the membrane, plays an important role, such as regulation of membrane function, and cholesterol in the cell membrane is known as a major determinant of membrane fluidity and permeability.

이러한 변이를 최소화하여, 동결보존시에 세포의 손상을 최소화하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, WO 01/037655에는 포유류 정자의 동결보존 방법에 사용되는 희석액이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2009-0024029호에는 아마이드를 포함하는 정자의 동결보존제가 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2011-0020066호에는 정액 특이적인 동결보존제를 사용하여 정액을 동결보존하는 방법이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2010-0117497호에는 자바리 정자의 냉동보존용 인공정장이 개시되어 있다.Studies have been actively carried out to minimize cell damage during cryopreservation by minimizing such mutations. For example, WO 01/037655 discloses a diluent used in a method for cryopreserving mammalian sperm, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2009-0024029 discloses a sperm cryopreservation agent containing amide, A method for cryopreserving semen using a semen-specific cryopreservation agent is disclosed in Korean Patent Application Publication No. 2011-0020066, and Korean Patent Laid-Open Publication No. 2010-0117497 discloses an artificial cryopreservation for cryopreservation of spermine sperm.

이처럼, 다양한 사육동물의 정자를 동결보존하기 위한 연구가 진행되고 있으나, 주요 가축 중의 하나인 돼지에 대한 연구는 거의 진행되지 못하고 있다. 그 이유는, 돼지 정자는 다른 축종에 비하여 정자의 세포막에 불포화 지방산이 높은 비율로 포함하고 있어 지질 과산화가 일어나기 쉽고, 자체적인 항산화 물질이 적기 때문에 저온 충격에 대한 저항성이 낮아서 급격한 온도 변화에 쉽게 그 기능이 소실되어 동결보존에 어려움이 있기 때문이다. 이에, 이러한 문제점을 해결하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있으나, 돼지 정자를 효과적으로 동결보존할 수 있는 방법은 아직까지 개발되지 않고 있는 실정이다.Thus, studies are underway to cryopreserve spermatozoa of various breeding animals, but research on pigs, one of the main livestock species, has hardly proceeded. The reason for this is that the spermatozoa of sows contain a high proportion of unsaturated fatty acids in the cell membranes of spermatozoa as compared with other types of spermatozoa, and they have low resistance to low-temperature impact because they have low lipid peroxidation and their own antioxidants. This is because the function is lost and it is difficult to preserve frozen. Various studies have been conducted to solve these problems, but a method for effectively cryopreserving pig sperm has not yet been developed.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 돼지 정자를 효과적으로 동결보존할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 항산화제의 일종인 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 조성물을 이용할 경우, 동결 및 해동시에 돼지 정자의 손상을 최소화하여 생존율을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the inventors of the present invention have made extensive efforts to develop a method for effectively cryopreserving pig sperm. As a result, when a composition containing astaxanthin or curcumin, which is a kind of antioxidant, is used, And the survival rate can be improved. Thus, the present invention has been completed.

본 발명의 하나의 목적은 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 돼지 정자의 동결보존용 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a composition for cryopreserving pig sperm containing astaxanthin or curcumin.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 돼지 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 돼지 정자를 동결보존하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for cryopreserving pig sperm comprising the step of treating the composition with a sperm porcine and cryopreserving the porcine sperm.

본 발명자들은 동결 및 해동시에 생성되는 과도한 산화물질과, 산화적 스트레스에 대하여 쉽게 손상되는 세포막을 포함하는 정자의 특성으로 인하여, 동결보존이 어려운 돼지 정자를 대상으로 하여, 정자의 손상을 최소화하면서 동결보존할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행하던 중, 항산화제의 일종인 아스타잔틴과 커큐민에 주목하게 되었다. 아스타잔틴은 수생동물 및 미생물에 널리 분포된 항산화활성을 갖는 카로티노이드 화합물의 일종으로서, 우수한 일중항산소 소거활성과 지질 과산화 억제활성을 나타내고, 커큐민은 생강과 식물인 울금, 강황 등에 포함된 항산화물질의 하나로서, 특유의 맛과 향으로 인하여 향신료로서 사용될 뿐만 아니라, 의학적으로는 항암제, 항바이러스제 등의 다양한 의약품의 유효성분으로서 사용되고 있다. 본 발명자들은 상기 아스타잔틴과 커큐민이 식용으로 사용될 수 있을 정도로 안전하면서도, 고온 고압등의 급격한 환경변화에도 내성을 나타낼 정도의 안정성을 나타내기 때문에, 정자의 급속동결과 같은 환경에서도 정상적인 항산화 활성을 나타낼 수 있을 것으로 기대하였다. 이에, 미세조류로부터 추출된 아스타잔틴 또는 울금으로부터 추출된 커큐민을 다양한 농도로 첨가한 동결보존액을 제조하고, 이를 사용하여 돼지의 정자를 동결 및 해동시킨 후, 정자의 운동성 및 정자 세포내에 포함된 산화물질(산소라디칼 또는 과산화수소라디칼)의 함량변화를 측정한 결과, 아스타잔틴은 산화물질을 효과적으로 제거하지 못하였음에도 불구하고, 다른 작용기작에 의하여 돼지 정자의 생존율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 동결 및 해동으로 인하여 야기되는 돼지 정자의 운동성 저하의 수준을 억제시킬 수 있음을 확인하였고, 커큐민은 돼지 정자의 동결 및 해동시에 증가하는 산화물질을 효과적으로 제거함으로써 돼지 정자의 생존율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 동결 및 해동으로 인하여 야기되는 돼지 정자의 운동성 저하의 수준을 억제시킬 수 있음을 확인하였다.The present inventors have studied spermatozoa which are difficult to be cryopreserved due to excessive oxidizing substances produced during freezing and thawing and sperm characteristics including cell membranes easily damaged by oxidative stress, In order to develop a method for cryopreservation, various researches have been focused on astaxanthin and curcumin, which are antioxidants. Astaxanthin is a kind of carotenoid compound having antioxidative activity widely distributed in aquatic animals and microorganisms. It has excellent monosaccharide oxygen scavenging activity and lipid peroxidation inhibitory activity, and curcumin exhibits antioxidant activity of ginger, , It is used not only as a spice because of its unique taste and flavor but also medically as an active ingredient of various medicines such as anticancer drugs and antiviral drugs. The present inventors have found that astaxanthin and curcumin are safe enough to be used for edible purposes and exhibit a stability enough to exhibit tolerance to rapid environmental changes such as high temperature and high pressure so that they exhibit a normal antioxidant activity even under the conditions of rapid freezing of sperm . Thus, frozen storage liquid prepared by adding curcumin extracted from microalgae at various concentrations of astaxanthin extracted from astaxanthin or cowpea was prepared, and frozen and thawed porcine spermatozoa were sieved, and then sperm motility and sperm cell viability As a result of measuring the content of oxidizing substances (oxygen radicals or hydrogen peroxide radicals), although astaxanthin did not effectively remove the oxidizing substances, not only could the survival rate of pig sperm be improved by other action mechanisms, It has been confirmed that the level of decrease in motility of pig sperm caused by thawing can be suppressed and curcumin can effectively improve the survival rate of pig sperm by effectively removing the oxidizing substance that increases during freezing and thawing of pig sperm, Decreased motility of pig sperm caused by freezing and thawing It was confirmed that the level can be suppressed.

따라서, 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 동결보존용 조성물은 돼지 정자의 효과적인 동결보존에 활용될 수 있고, 특히 아스타잔틴은 항산화활성이 아닌 다른 작용기작으로 인하여 동결보존에 활용될 수 있음을 알 수 있었다.Accordingly, it has been found that a composition for cryopreservation comprising astaxanthin or curcumin can be used for effective cryopreservation of pig spermatozoa, and astatanthin can be used for cryopreservation due to other action mechanisms other than antioxidant activity I could.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 (a) 동결보존제; 및 (b) 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 돼지 정자의 동결보존용 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, the present invention provides a method for preparing a cryoprotectant comprising: (a) a cryopreserving agent; And (b) astaxanthin or curcumin.

본 발명의 용어 "동결보존"이란, 냉동을 통해 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 행위를 의미한다. The term "cryopreservation" of the present invention means an operation of stably maintaining the cells for a long period of time through freezing.

본 발명에 있어서, 상기 동결보존은 돼지 정자의 동결보존을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.In the present invention, the cryopreservation can be interpreted to mean cryopreservation of porcine sperm.

본 발명의 용어 "동결보존제"란, 동결보호제라고도 하고, 생물세포를 동결상태에서 산채로 보존할 경우, 동해를 경감할 목적으로 매액(媒液)에 첨가시키는 물질을 의미한다. The term "cryopreservative " of the present invention means a substance to be added to the medium (liquid) for the purpose of alleviating the sea ice when preserving the living cells in a frozen state and alive for living.

본 발명의 목적상, 상기 동결보존제는 동해에 의한 정자의 손상을 방지하고, 정액의 농도를 저하시켜서, 동결보존시 정자간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 동결보존제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 염류, 항산화제, 당류, 유기산, 난황, 항생제 등을 포함하는 완충액이 될 수 있는데, 바람직하게는 시트르산염, 바이카보네이트염 등의 염류; 타우린(taurine), 하이포타우린(hypotaurine), 트레할로스(trehalose) 등의 항산화제; 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 프럭토스, 덱스트란 등의 당류; 히알루론산, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 난황단백질, 아미노산 등의 단백질류를 포함하는 완충액이 될 수 있고, 이들 각성분은 당업자가 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다.For the purpose of the present invention, the cryopreservative may be used to prevent damage to the spermatozoa caused by the East Sea and lower the concentration of semen, thereby preventing damage that may occur due to collision between sperm during cryopreservation. The cryopreservation agent may be a buffer solution including salts, antioxidants, saccharides, organic acids, egg yolk, antibiotics and the like, and is preferably a salt such as a citrate or a bicarbonate salt; Antioxidants such as taurine, hypotaurine, and trehalose; Sugars such as glycerol, glucose, sucrose, ethylene glycol, propylene glycol, fructose, and dextran; Organic acids such as hyaluronic acid, citric acid, acetic acid, butyric acid, palmitic acid, oxalic acid and tartaric acid; Antibiotics such as streptomycin, penicillin, ampicillin, and kanamycin; An egg yolk protein, an amino acid, and the like, and these components can be used by a person skilled in the art as needed.

본 발명의 용어 "아스타잔틴(astaxanthin)"이란, C₄₀H₅₂O₄의 화학식으로 표시되고, 596.84Da의 분자량을 갖으며, 항산화 활성을 나타내는 화합물을 의미한다.The term " astaxanthin " of the present invention means a compound represented by the formula of C ₄₀ H ₅₂ O ₄ , having a molecular weight of 596.84 Da and exhibiting antioxidative activity.

본 발명에 있어서, 상기 아스타잔틴은 돼지 정자 세포막의 지질과산화를 방지하고, 동결 및 해동시에 생성되는 산화물을 제거하여, 궁극적으로는 돼지 정자의 손상을 방지하는 역할을 수행하는 유효성분으로서 사용된다. 본 발명의 돼지 정자의 동결보존용 조성물에 포함된 아스타잔틴의 함량은 돼지 정자의 동결보존 효과를 나타내게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 100 내지 500μM, 보다 바람직하게는 500μM이 될 수 있다.In the present invention, astaxanthin is used as an active ingredient to prevent lipid peroxidation of porcine sperm cell membrane, to remove oxides formed during freezing and thawing, and ultimately to prevent damage to sperm porcine do. The content of astaxanthin contained in the composition for cryopreservation of porcine spermatozoa of the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit the effect of cryopreservation of porcine spermatozoa, but is preferably 100 to 500 μM, more preferably 500 μM .

본 발명의 용어 "커큐민(curcumin)"이란, C₂₁H₂₀O₆의 화학식으로 표시되고, 368.38Da의 분자량을 갖으며, 항산화 활성을 나타내는 화합물을 의미한다. The term " curcumin "of the present invention means a compound represented by the formula C ₂₁ H ₂₀ O ₆ , having a molecular weight of 368.38 Da and exhibiting antioxidative activity.

본 발명에 있어서, 상기 커큐민은 돼지 정자 세포막의 지질과산화를 방지하고, 동결 및 해동시에 생성되는 산화물을 제거하여, 궁극적으로는 돼지 정자의 손상을 방지하는 역할을 수행하는 유효성분으로서 사용된다. 본 발명의 돼지 정자의 동결보존용 조성물에 포함된 커큐민의 함량은 돼지 정자의 동결보존 효과를 나타내게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 10 내지 100μM, 보다 바람직하게는 10μM이 될 수 있다.In the present invention, the curcumin is used as an active ingredient to prevent lipid peroxidation of porcine sperm cell membrane, to remove oxides formed during freezing and thawing, and ultimately to prevent damage to porcine sperm. The content of curcumin contained in the composition for cryopreservation of porcine spermatozoa of the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit the effect of cryopreservation of porcine spermatozoa, but it is preferably 10 to 100 μM, more preferably 10 μM .

본 발명의 용어 "정자"란, 정충이라고도 하고, 정자는 웅성동물의 고환에서 생산되는 성세포를 의미하는데, 길이는 약 0.02㎜이며, 머리, 경부 및 긴 꼬리의 세 부분으로 구성된다. 머리 부분에는 웅성 동물의 DNA가 들어 있고, 머리 부분의 맨 앞쪽에 존재하는 첨체에는 난자의 난막을 녹일 수 있는 효소가 포함되어 있고; 상기 경부에는 에너지 저장고인 당분을 함유한 미토콘드리아가 포함되어 있으며; 상기 꼬리는 가는 실 묶음으로 되어 있는데 가는 실 묶음이 교묘하게 신축하여 꼬리를 움직이게 한다. The term "spermatozoa ", as used herein, is also referred to as spermatozoa, and spermatozoa means sex cells produced in male testes. The spermatozoa are about 0.02 mm in length and consist of three parts: head, neck and long tail. The head contains the DNA of the male animal, and the acrosome at the front of the head contains the enzyme that can melt the eggshell of the egg; Said neck comprising mitochondria containing an energy store sugar; The tail is a thin thread bundle, which allows the thread bundle to be elaborately stretched to move the tail.

본 발명에 있어서, 상기 정자는 세포막에 불포화지방산을 높은 함량으로 포함하고, 내재적 항산화물질을 적게 포함하는 특징을 나타내는 돼지 정자가 될 수 있다.In the present invention, the sperm may be a porcine sperm characterized by containing a high content of unsaturated fatty acids in the cell membrane and a low content of intrinsic antioxidants.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 울금으로부터 추출된 커큐민 또는 미세조류로부터 추출된 아스타잔틴을 돼지 정자에 다양한 농도로 처리하고, 상기 아스타잔틴 또는 커큐민이 처리된 돼지 정자를 동결시켰다(실시예 1). 상기 동결된 각 돼지 정자를 해동시키고, 이들의 운동성 및 이동속도를 측정하여, 아스타잔틴 또는 커큐민의 처리여부에 따른 효과를 분석한 결과, 아스타잔틴 또는 커큐민을 처리한 경우에 대체로 운동성 및 이동속도가 높은 수준을 나타내었으므로, 아스타잔틴 또는 커큐민이 동결된 정자를 해동할 경우, 정자의 생존율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 1, 도 2 및 표 1). 아울러, 상기 해동된 돼지 정자의 세포내에 포함된 산소라디칼의 수준을 측정한 결과, 아스타잔틴 또는 커큐민을 처리한 경우에는 산소라디칼 값이 저하됨을 확인하였으므로, 아스타잔틴 또는 커큐민이 산소라디칼을 제거하는 효과를 나타내고, 이로 인하여 사멸하는 정자의 수를 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 3, 도 4 및 표 2). 끝으로, 상기 해동된 돼지 정자의 세포내에 포함된 과산화수소라디칼의 수준을 측정한 결과, 커큐민을 처리한 경우에는 과산화수소라디칼 값이 저하되었으나, 아스타잔틴을 처리한 경우에는 과산화수소라디칼 값이 변화되지 않거나 오히려 증가함을 확인하였다. 따라서, 커큐민은 과산화수소라디칼을 제거하는 효과를 나타내고, 이로 인하여 사멸하는 정자의 수를 감소시키는 효과를 나타내는 반면, 아스타잔틴은 항산화 활성과는 별도의 작용기작에 의하여 동결 및 해동시에 정자의 사멸을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 분석되었다(도 5, 도 6 및 표 3).According to one embodiment of the present invention, astaxanthin extracted from curcumin or microalgae extracted from cowpea was treated at various concentrations in porcine sperm, and the astaxanthin or curcumin-treated porcine sperm was frozen (Example One). As a result of analyzing the effect of treatment with astaxanthin or curcumin, the frozen spermatozoa of each pig was thawed and the motility and the moving speed thereof were measured. As a result, it was found that when treated with astaxanthin or curcumin, (Fig. 1, Fig. 2, and Table 1), indicating that astrocyte or curcumin can thaw the frozen sperm. As a result of measuring the level of oxygen radicals contained in the cells of the frozen porcine spermatozoa, it was confirmed that when the astaxanthin or curcumin was treated, the oxygen radical value was lowered, and thus, astaxanthin or curcumin eliminated oxygen radical (Fig. 3, Fig. 4, and Table 2). Fig. Finally, the level of hydrogen peroxide radicals contained in the cells of the thawed pig sperm was measured. As a result, the value of hydrogen peroxide radical was lowered when curcumin was treated, but the value of hydrogen peroxide radical was not changed when astaxanthin was treated But rather increased. Thus, curcumin exhibits an effect of eliminating hydrogen peroxide radicals, thereby decreasing the number of spermatozoa that are killed, whereas astaxanthin has a different mechanism from that of antioxidant activity, resulting in the death of sperm at freezing and thawing (Fig. 5, Fig. 6 and Table 3).

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 상기 동결보존용 조성물과 돼지 정자를 혼합하여 동결보존 혼합물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는 돼지 정자의 동결보존방법을 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method for cryopreservation, comprising the steps of: (a) mixing a cryopreservation composition with a porcine sperm to obtain a cryopreserved mixture; And (b) freezing and preserving the mixture.

이때, 상기 동결보존용 조성물은 상술한 바와 동일하고; 상기 동결보존용 조성물에 포함되는 정자의 농도는 바람직하게는 동결보존액 단위부피(㎖)당 1 X 10¹⁰ 내지 10 X 10¹⁰개 이고, 보다 바람직하게는 단위부피(㎖)당 3 X 10¹⁰ 내지 7 X 10¹⁰개 이며, 가장 바람직하게는 단위부피(㎖)당 5 X 10¹⁰개 이고; 상기 동결 및 보존은 정자를 동결보존할 수 있는 한 공지된 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으나, 바람직하게는 액화질소를 사용하여 -196℃에서 동결 및 보존을 수행할 수 있고, 상기 동결된 정자는 반영구적으로 보존할 수 있다.At this time, the composition for cryopreservation is the same as described above; The concentration of the sperm contained in the composition for cryopreservation is preferably 1 × 10 ¹⁰ to 10 × 10 ¹⁰ per unit volume (㎖) of the cryopreservation solution, more preferably 3 × 10 ¹⁰ to ¹⁰ × 10 ¹⁰ per unit volume (ml) 7 X 10 ¹⁰ , and most preferably 5 X 10 ¹⁰ per unit volume (ml); The freezing and preserving may be performed by any means known in the art as long as it can freeze the spermatozoa. Preferably, liquefied nitrogen can be used to freeze and store at -196 DEG C, It can be preserved semi-permanently.

아울러, 본 발명의 방법은 상기 동결보존된 정자를 해동시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.In addition, the method of the present invention may further comprise thawing the cryopreserved sperm.

이때, 상기 해동방법은 상기 동결보존된 정자를 정상상태로 회복시킬 수 있다면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있는데, 바람직하게는 동결보존된 정자를 상온에서 일정시간 동안 정치시킴으로써 상기 정자에 포함된 냉매를 휘발시켜 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 1 내지 10℃의 물에 2 내지 10분 동안 침지하거나, 30 내지 60℃의 물에 10 내지 30초 동안 침지하거나 또는 60 내지 80℃의 물에 1 내지 5초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 동결보존된 정자를 4℃의 물에 5분 동안 침지하거나, 37℃의 물에 20초 동안 침지하거나, 70℃의 물에 3초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 동결보존된 정자를 50℃의 온수에서 10초 동안 침지함으로써 수행될 수 있다.In this case, the thawing method may be used as long as it can restore the frozen spermatozoa to a steady state. Preferably, the frozen spermatozoa are allowed to stand at room temperature for a predetermined time to volatilize the refrigerant contained in the spermatozoa The sperm from which the refrigerant has been removed is immersed in water at 1 to 10 DEG C for 2 to 10 minutes or in 10 to 30 seconds in water at 30 to 60 DEG C or in 1 to 10 DEG C in water at 60 to 80 DEG C, The sperm cryopreserved may be immersed in water at 4 캜 for 5 minutes or immersed in water at 37 캜 for 20 seconds or immersed in water at 70 캜 for 3 seconds And most preferably by immersing the cryopreserved spermatozoa in hot water at 50 DEG C for 10 seconds.

본 발명의 돼지 정자 동결보존용 조성물을 이용하면, 우수한 품종의 돼지 정자의 동결보존시 돼지 정자의 손상을 최소화 할 수 있으므로, 돼지의 품종개량에 널리 활용될 수 있을 것이다.The use of the composition for cryopreserving pig spermatozoa of the present invention can minimize the damage of pig spermatozoa when cryopreserved pig sperm of excellent variety is used, and thus it can be widely used for breeding pigs.

도 1은 정자의 운동성 및 속도에 대한 아스타잔틴의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 정자의 운동성 및 속도에 대한 커큐민의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 아스타잔틴이 처리되고 Yo-Pro-1/HE로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 4는 커큐민이 처리되고 Yo-Pro-1/HE로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 5는 아스타잔틴이 처리되고 PI/DCF로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 6은 커큐민이 처리되고 PI/DCF로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.Figure 1 is a graph showing the effect of astaxanthin on motility and speed of sperm.
Figure 2 is a graph showing curcumin effect on motility and speed of sperm.
Figure 3 shows flow cytometry results for pig sperm treated with astaxanthin and fluorescently labeled with Yo-Pro-1 / HE.
Figure 4 shows flow cytometric analysis of porcine spermatozoa treated with curcumin and fluorescently labeled with Yo-Pro-1 / HE.
Figure 5 shows the results of flow cytometry on porcine spermatozoa treated with astaxanthin and fluorescently labeled with PI / DCF.
Figure 6 shows flow cytometric analysis results for porcine spermatozoa treated with curcumin and fluorescently labeled with PI / DCF.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1: 돼지 정자의 채취 및 동결보존Example 1: Collection of pig sperm and cryopreservation

장기이식에 사용되는 미니돼지의 일종인 PWG miniature pig을 대상으로 음경 수압법을 적용하여 주 1회 돼지 정액을 채취하였다. 채취된 돼지 정액은 17~19℃에서 약 30분 정도 정치시키고, 이중에서 3㎕를 분취하여 37℃로 예열한 슬라이드(20 μM depth, Leja, Nieuw Vennep, The Netherlands)에 안치시켰으며, CASA(Hamilton Thorne, Inc., HTM-HELOS, Beverly, MA, USA)를 이용하여 정자의 수와 운동성을 측정하였다. 이 중에서, 정자의 80% 이상이 움직임을 보이고 그 중 70% 이상이 직진 운동을 보인 정자만을 시료로서 사용하였다.The pork semen was collected once a week by applying the penis hydrothermal method to the PWG miniature pig, a kind of mini pig used for organ transplantation. The semen samples were incubated at 17-19 ° C for about 30 min. 3 μl of each sample was placed in a slide (20 μM depth, Leja, Nieuw Vennep, The Netherlands) preheated to 37 ° C. Hamilton Thorne, Inc., HTM-HELOS, Beverly, Mass., USA). Of these, more than 80% of the sperm showed movement, and more than 70% of the sperm used only the sperm showing the linear motion.

상기 시료에 3배 부피의 희석제인 mMB(modified Modena B: 0.45g EDTA, 1.38g sodium citrate, 0.2g sodium bicarbonate, 1g Tris base, 0.5g citric acid, 0.01g cysteine, 0.8g BSA 및 0.06g kanamycin sulfate, pH 7)를 가하여 희석하고 원심분리(400×g, 10분, 20℃)하여 침전물을 수득하는 방식을 2 내지 5회 반복하여 상기 시료에 포함된 정장액, 정관내 탈락된 세포 잔류물 등의 불순물을 제거하고, 뭉쳐진 정자를 풀어주었다. 최종적으로 수득한 침전물에 1차 동결보존액인 LEY(lactose-egg yolk: 80%(v/v) lactose solution[310 mM], 20%(v/v) egg yolk 및 100㎍/㎖ kanamycin sulfate; pH 6.2)을 가하여 돼지 정자의 농도가 1×10⁹/㎖인 정자-LEY 혼합용액을 수득하고, 1시간 동안 온도를 서서히 저하시켜서 최종적으로 4℃가 되도록 하였다. To this sample was added mMB (modified Modena B: 0.45 g EDTA, 1.38 g sodium citrate, 0.2 g sodium bicarbonate, 1 g Tris base, 0.5 g citric acid, 0.01 g cysteine, 0.8 g BSA and 0.06 g kanamycin sulfate , pH 7) was added and diluted and centrifuged (400 x g, 10 min, 20 캜) to obtain a precipitate. This procedure was repeated 2 to 5 times to remove the formalin contained in the sample, Of the impurities, and released the spermatozoa. Ley (lactose-egg yolk: 80% (v / v) lactose solution [310 mM], 20% (v / v) egg yolk and 100 μg / ml kanamycin sulfate were added to the finally obtained precipitate 6.2) was added to obtain a sperm-LEY mixed solution having a concentration of porcine sperm of 1 x 10 < ⁹ > / ml, and the temperature was gradually lowered for 1 hour to finally reach 4 [deg.] C.

한편, LEYGO(LEY-glyserol-Orvus-ES-Paste: 89.5%(v/v) LEY, 9%(v/v) glycerol, 1.5%(v/v) OrvusESPate[OEP], 100mM trehalose)를 제조하고, 이에, 항산화제로서, 미세조류로부터 추출된 아스타잔틴 또는 울금으로부터 추출된 커큐민을 각각 0, 10, 100 또는 500 μM 이 되도록 가하여 각각의 2차 동결보존액을 수득하였다.LEYGO (LEY-glycerol-Orvus-ES-Paste: 89.5% (v / v) LEY, 9% (v / v) glycerol, 1.5% (v / v) OrvusESPate [OEP], 100 mM trehalose) , And as an antioxidant, curcumin extracted from astaxanthin or urokinase extracted from microalgae was added to 0, 10, 100 or 500 μM, respectively, to obtain respective secondary freezing preservative solutions.

상기 4℃로 유지된 정자-LEY 혼합용액에 동일 부피의 2차 동결보존액을 가하여 각각의 정자-LEYGO 혼합용액을 수득하고, 이를 0.5㎖ 튜브에 주입한 다음, 액체질소에 침지하여 2주일 이상의 시간동안 동결보존시켰다.A sperm-LEYGO mixed solution of the same volume was added to the sperm-LEY mixed solution maintained at 4 캜 to obtain each sperm-LEYGO mixed solution, which was then injected into a 0.5 ml tube and immersed in liquid nitrogen for 2 weeks or more Lt; / RTI >

실시예 2: 동결보존된 돼지 정자의 운동성 평가Example 2: Evaluation of motility of frozen-preserved pig sperm

상기 동결보존된 각각의 정자-LEYGO 혼합용액을 50℃ 수조에 10초 동안 침지하여 해동시키고, 해동된 용액에 10㎖ mMB용액을 가하여 각각의 희석액을 수득하였으며, 상기 수득한 각각의 희석액을 37℃ 수조에서 10분간 침지하여 37℃까지 승온시켰다. 상기 승온된 희석액을 원심분리(13,000rpm, 4분)하여 침지된 정자를 수득하고, 상기 수득한 정자에 mMB용액을 가하여 5×10⁷/㎖의 농도를 갖는 희석액을 수득하였다. 상기 수득한 희석액 3㎕를 분취하여 37℃로 예열한 Leja 슬라이드에 안치시키고 CASA(Hamilton Thorne, Inc., HTM-HELOS, Beverly, MA, USA)를 이용하여 정자의 이동시 연속사진을 45frame/sec의 속도로 촬영하고, 각 촬영된 영상을 컴퓨터 프로그램(HELOS software)에 적용하여, 정자머리의 위치 및 방향을 분석함으로써, 운동성을 나타내는 정자의 비율, 진척된 운동성을 나타내는 정자의 비율, 정자의 평균속도(Average-path velocity, VAP), 정자의 직선구간 속도(Straight-line velocity, VSL) 및 정자의 곡선구간 속도(Curvilinear velocity, VCL)를 각각 산출하였다(도 1, 도 2 및 표 1). 이때, 대조군으로는 동결보존을 수행하지 않은 정자를 사용하였다.Each of the cryopreserved sperm-LEGO mixed solution was immersed in a 50 ° C water bath for 10 seconds and thawed. 10 ml of the mMB solution was added to the thawed solution to obtain each diluted solution. Immersed in a water bath for 10 minutes, and then heated to 37 캜. To a concentration of the diluted solution to an elevated centrifugation to obtain a sperm by immersion (13,000rpm, 4 minutes), and was added to the resulting solution mMB sperm 5 × 10 ⁷ / ㎖ diluted solution was obtained. 3 μl of the obtained dilution was aliquoted and placed on a Leja slide preheated to 37 ° C. Continuous photographs of the spermatozoa using the CASA (Hamilton Thorne, Inc., HTM-HELOS, Beverly, MA, USA) And the images were applied to a computer program (HELOS software) to analyze the position and orientation of the sperm head to determine the ratio of sperm expressing motility, the ratio of sperm expressing progressive motility, the average speed of sperm (Figure 1, Figure 2, and Table 1) were calculated for the mean-path velocity (VAP), the systolic linear velocity (VSL) and the sperm curvilinear velocity (VCL). At this time, sperm that did not undergo cryopreservation were used as a control group.

정자의 운동성 및 속도에 대한 항산화제의 효과(평균±표준편차)Effect of antioxidants on motility and speed of sperm (mean ± standard deviation) 항산화제Antioxidant 운동성(%)motility(%) 진척된 운동성(%)Progressed mobility (%) VAP(㎛/s)VAP (占 퐉 / s) VSL(㎛/s)VSL (m / s) VCL(㎛/s)VCL (m / s) 처리군Treated group 농도
(μM)density
(μM) 대조군Control group -- 93.4±5.893.4 ± 5.8 71±9.271 ± 9.2 100.3±15.5100.3 ± 15.5 70.9±15.770.9 ± 15.7 182.6±30.8182.6 ± 30.8 커큐민
처리군Curcumin
Treated group 0
10
100
5000
10
100
500 42.7±5.5
50.4±2.9
45.7±3.8
37.4±8.342.7 ± 5.5
50.4 ± 2.9
45.7 ± 3.8
37.4 8.3 23±2.6
31.7±4
27±4
21.7±3.223 ± 2.6
31.7 ± 4
27 ± 4
21.7 ± 3.2 81.7±7.4
80.3±24.8
84.5±1.7
79.3±4.281.7 ± 7.4
80.3 ± 24.8
84.5 ± 1.7
79.3 ± 4.2 47.3±2.7
57±4.5
50.9±1.4
47.1±4.247.3 ± 2.7
57 ± 4.5
50.9 ± 1.4
47.1 ± 4.2 157.8±9.9
364.9±325.7
163.5±3.1
160.8±10157.8 ± 9.9
364.9 ± 325.7
163.5 ± 3.1
160.8 ± 10 아스타잔틴 처리군Astaxanthin treated group 0
10
100
5000
10
100
500 49.8±4
42±11.8
52.7±3
66±1.749.8 ± 4
42 ± 11.8
52.7 ± 3
66 ± 1.7 33.4±2.5
27±7.2
31±5.3
45.7±2.533.4 ± 2.5
27 ± 7.2
31 ± 5.3
45.7 ± 2.5 99.3±9.6
92.74±4.5
98.5±5
110.4±11.599.3 + - 9.6
92.74 ± 4.5
98.5 ± 5
110.4 ± 11.5 63.4±7.7
58.7±1.7
56.6±7.6
70.8±5.963.4 ± 7.7
58.7 ± 1.7
56.6 ± 7.6
70.8 ± 5.9 180.9±12.5
178.2±10.3
192.9±9.2
203.4±26180.9 ± 12.5
178.2 ± 10.3
192.9 + 9.2
203.4 ± 26

상기 도 1, 도 2 및 표 1에서 보듯이, 전체적으로 동결해동 절차를 수행한 정자는 동결해동 절차를 수행하지 않은 대조군의 정자에 비하여 대부분의 시험항목에서 낮은 값을 나타내었다. 또한, 동결해동 절차를 수행한 정자 중에서는 아스타잔틴 또는 커큐민을 처리한 경우에 대체로 각 시험항목의 측정값이 높은 수준을 나타냄을 확인하였다. 이는 아스타잔틴 또는 커큐민이 동결된 정자를 해동할 경우, 정자의 생존율을 향상시킬 수 있기 때문인 것으로 분석되었다.As shown in FIGS. 1, 2 and Table 1, the sperm that underwent the freeze-thawing procedure as a whole showed a lower value in most of the test items than the control sperm that did not perform the freeze-thawing procedure. Among the spermatozoa treated with frozen thawing, it was confirmed that the measured values of each test item showed a high level when treating astaxanthin or curcumin. This is because astaxanthin or curcumin can improve sperm survival rate when thawing frozen sperm.

또한, 커큐민은 10μM의 농도로 처리할 경우, 대체적으로 우수한 운동성 및 속도를 나타내고, 처리농도가 증가할 수록 운동성 및 속도가 감소되는 경향을 나타냄을 확인하였다. 이와는 달리, 아스타잔틴은 10μM의 농도로 처리할 경우, 아스타잔틴을 처리하지 않은 시료보다도 운동성 및 속도가 낮은 값을 나타내었으나, 아스타잔틴의 처리농도가 증가할 수록 운동성 및 속도가 증가되는 경향을 나타냄을 확인하였다.In addition, when curcumin was treated at a concentration of 10 μM, it showed generally excellent mobility and speed, and it was confirmed that mobility and speed decreased with increasing treatment concentration. On the contrary, when astaxanthin was treated at a concentration of 10 μM, mobility and speed were lower than those of astaxanthin-treated samples. However, as the treatment concentration of astaxanthin increased, mobility and speed were increased .

실시예 3: 동결보존된 돼지 정자에 포함된 산화물질에 미치는 항산화제의 효 과 Example 3: Effect of antioxidants on oxidizing substances contained in frozen-preserved porcine sperm

상기 실시예 2에서 운동성을 평가하기 위하여 사용된 시료를 유세포 분석에 적용하여 상기 각 시료에 포함된 산화물질의 수준과 분포를 분석하고자 하였다.In order to evaluate the mobility of the samples, the level and distribution of the oxides contained in the samples were analyzed by flow cytometry.

구체적으로, 대조군 및 항산화제 처리군(10, 100 및 500μM 처리군)의 정자에 mMB를 가하여 1×10³/㎖의 농도를 갖는 희석액을 수득하고, 상기 각 군의 희석액을 대상으로 산소라디칼의 양을 측정하기 위한 염색과 과산화수소라디칼의 양을 측정하기 위한 염색을 각각 개별적으로 수행하였다. Specifically, mMB was added to the sperm of the control group and the antioxidant treatment group (10, 100 and 500 μM treatment group) to obtain a dilution having a concentration of 1 × 10 ³ / ml. Dyeing for measuring the amount and dyeing for measuring the amount of the hydrogen peroxide radical were performed individually.

실시예 3-1: 동결보존된 돼지 정자에 포함된 산소라디칼에 미치는 항산화제 의 효과 Example 3-1: Effect of antioxidants on oxygen radicals contained in pig-frozen spermatozoa

산소라디칼의 양을 측정하기 위한 염색은 상기 각 희석액에 0.05 μM의 Yo-Pro-1 iodide 형광염료(Yo-Pro-1; Molecular Probes Inc.) 및 4 μM의 Hydroethidine 형광염료(HE; Mole-cular Probes Inc., Eugene, OR, USA)를 가하고, 37℃에서 40-60분간 반응시켜서 수행하였다. 상기 염색이 종료된 후, 각 시료를 원심분리(1,500 rpm, 3분)하여 침전된 정자를 수득하고, 이에 6㎖의 mMB를 가하여 희석액을 수득하였으며, 상기 희석액을 FACS (500 series, Beckman, Coulter, Inc., FL, USA)에 적용하여 유세포 분석을 수행하여, 사멸한 정자의 수와 정자 내 산화 물질의 양을 측정하였다(도 3, 도 4 및 표 2). 이때, 사멸세포는 이미 죽은 정자의 수를 나타내고, 빈사세포는 세포자멸에 의하여 죽어가는 세포의 수를 나타내며, V1 영역은 낮은 세포내 산소라디칼 값을 갖고 살아있는 정자의 수를 나타내며, V2 영역은 높은 세포내 산소라디칼 값을 갖고 살아있는 정자의 수를 나타내고, MFI total은 전체 정자에서 측정된 평균형광강도(mean fluorescence intensity)를 나타내며, MFI viable은 전체 정자 중에서 살아있는 정자에서 측정된 평균형광강도를 나타낸다.The dye for measuring the amount of oxygen radicals was added to each of the above dilutions with 0.05 μM Yo-Pro-1 iodide fluorescent dye (Yo-Pro-1; Molecular Probes Inc.) and 4 μM Hydroethidine fluorescent dye Probes Inc., Eugene, OR, USA) was added thereto, and the reaction was carried out at 37 ° C for 40-60 minutes. After completion of the staining, each sample was centrifuged (1,500 rpm, 3 minutes) to obtain precipitated sperm. 6 ml of mMB was added to obtain a diluted solution. The diluted solution was applied to a FACS (500 series, Beckman, Coulter , Inc., FL, USA). Flow cytometry was performed to determine the number of killed spermatozoa and the amount of oxidized spermatozoa (FIGS. 3, 4, and Table 2). At this time, the apoptotic cells represent the number of dead sperm, the vaginal cells represent the number of cells dying by apoptosis, the V1 region has a low intracellular oxygen radical value and the number of live spermatozoa, and the V2 region is high MFI total represents the mean fluorescence intensity measured in whole sperm and MFI viable represents the mean fluorescence intensity measured in living sperm among total sperm.

항산화제가 처리되고 Yo-Pro-1/HE로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과Flow cytometry analysis of porcine spermatozoa treated with antioxidants and fluorescently labeled with Yo-Pro-1 / HE 항산화제 Antioxidant 사멸세포Dead cell 빈사세포Dead cell V1 영역V1 region V2 영역V2 region MFI totalMFI total MFI viableMFI viable 처리군Treated group 농도
(μM)density
(μM) 커큐민Curcumin 0
10
100
5000
10
100
500 27.3±1.1
26.9±1.3
26.2±1.4
28.5±3.027.3 ± 1.1
26.9 ± 1.3
26.2 ± 1.4
28.5 ± 3.0 6.0±0.4
7.2±0.4
5.65±0.7
7.1±0.66.0 ± 0.4
7.2 ± 0.4
5.65 ± 0.7
7.1 ± 0.6 17.8±1.3
18.3±1.3
19.7±2.5
15.5±3.517.8 ± 1.3
18.3 ± 1.3
19.7 ± 2.5
15.5 ± 3.5 48.9±1.0
43.5±0.9
45.0±1.1
45.8±0.748.9 ± 1.0
43.5 ± 0.9
45.0 ± 1.1
45.8 ± 0.7 488.5±66.7
545.5±76.2
571.3±59.8
55.15±25.5488.5 + - 66.7
545.5 + 76.2
571.3 ± 59.8
55.15 ± 25.5 453.1±64.4
501.9±76.5
517.7±52.1
490.2±23.8453.1 + - 64.4
501.9 ± 76.5
517.7 ± 52.1
490.2 + - 23.8 아스타잔틴Astazanthin 0
10
100
5000
10
100
500 26.1±2.7
20.7±1.3
21.9±1.2
23.7±0.726.1 ± 2.7
20.7 ± 1.3
21.9 ± 1.2
23.7 ± 0.7 5.8±0.5
4.9±0.2
5.6±0.4
6.26±0.55.8 ± 0.5
4.9 ± 0.2
5.6 ± 0.4
6.26 ± 0.5 31.3±0.4
25.3±0.7
27.7±0.7
24.9±0.731.3 ± 0.4
25.3 ± 0.7
27.7 ± 0.7
24.9 ± 0.7 519.9±72.6
425.3±63.1
471.7±35.4
495.4±36.1519.9 ± 72.6
425.3 ± 63.1
471.7 ± 35.4
495.4 ± 36.1 31.5±1.8
44.4±1.0
41.14±0.9
40.8±0.131.5 ± 1.8
44.4 ± 1.0
41.14 ± 0.9
40.8 ± 0.1 486.2±61.5
406.4±50.9
436.7±30.8
457.4±24.9486.2 ± 61.5
406.4 ± 50.9
436.7 ± 30.8
457.4 ± 24.9

상기 도 3, 도 4 및 표 2에서 보듯이, 정자 세포내 산소라디칼의 값(Moribund+V2)은 전체적으로 항산화제를 처리하지 않은 정자에 비하여 각 아스타잔틴 또는 커큐민 처리군이 낮은 값을 나타내었으므로, 아스타잔틴 또는 커큐민이 산소라디칼을 제거하는 효과를 나타내고, 이로 인하여 사멸하는 정자의 수를 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, 아스타잔틴은 10 μM의 농도로 처리한 경우에 산소라디칼의 값을 최소화 시킬 수 있었고, 커큐민 역시 10 μM의 농도로 처리한 경우에 산소라디칼의 값을 최소화 시킬 수 있었다. As shown in FIGS. 3, 4 and Table 2, the value of oxygen radicals in the spermatids (Moribund + V2) was lower in astaxanthin or curcumin group than in sperm not treated with antioxidant Therefore, it was confirmed that astaxanthin or curcumin exerted an effect of removing oxygen radicals, thereby reducing the number of killed spermatozoa. In particular, astaxanthin was able to minimize the value of oxygen radicals when treated at a concentration of 10 μM, and to minimize the value of oxygen radicals when curcumin was also treated at a concentration of 10 μM.

한편, 커큐민의 경우에는 표 1 및 표 2의 결과가 서로 부합됨을 확인하였으나, 아스타잔틴의 경우에는 표 1 및 표 2의 결과가 서로 부합되지 않음을 알 수 있었다. 즉, 커큐민을 10 μM의 농도로 처리한 정자는 우수한 운동성 및 속도를 나타내고, 정자 세포내의 산소라디칼의 값을 최소화 시키는 반면, 아스타잔틴의 경우에는 500μM의 농도로 처리한 정자가 우수한 운동성 및 속도를 나타내고, 10 μM의 농도로 처리한 정자가 정자 세포내의 산소라디칼의 값을 최소화 시킴을 확인하였다.On the other hand, in the case of curcumin, it was confirmed that the results of Table 1 and Table 2 were consistent with each other. However, in the case of astaxanthin, the results of Table 1 and Table 2 were found to be incompatible with each other. In other words, spermatozoa treated with curcumin at a concentration of 10 μM exhibited excellent motility and speed and minimized the value of oxygen radicals in the sperm cells. On the other hand, in the case of astaxanthin, the sperm treated at a concentration of 500 μM showed excellent motility and speed And that sperm treated at a concentration of 10 μM minimized the value of oxygen radicals in sperm cells.

상기 결과는, 커큐민은 자체의 항산화활성만으로도 동결 및 해동시에 정자의 사멸을 억제할 수 있는 능력을 나타내는 반면, 아스타잔틴은 항산화활성과는 별도의 작용기작에 의하여 동결 및 해동시에 정자의 사멸을 억제할 수 있는 능력을 나타내는 것으로 분석되었다.The above results indicate that curcumin exhibits the ability to inhibit spermatogenesis upon freezing and thawing with its own antioxidant activity, whereas astaxanthin has the ability to inhibit spermatogenesis during freezing and thawing, The ability to inhibit the death was analyzed.

실시예 3-2: 동결보존된 돼지 정자에 포함된 과산화수소라디칼에 미치는 항 산화제의 효과 Example 3-2: Effect of antioxidants on hydrogen peroxide radicals contained in frozen-preserved pig sperm

과산화수소라디칼의 양을 측정하기 위한 염색은 상기 각 희석액에 0.76 μM의 Propidium Iodide 형광염료(PI; Sigma-Aldrich) 및 200 μM의 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate 형광염료(DCF; MolecularProbes, Inc.)를 가하고, 37℃에서 40-60분간 반응시켜서 수행하였다. 상기 염색이 종료된 후, 각 시료를 원심분리(1,500 rpm, 3분)하여 침전된 정자를 수득하고, 이에 6㎖의 mMB를 가하여 희석액을 수득하였으며, 상기 희석액을 FACS에 적용하여 유세포 분석을 수행하여, 사멸한 정자의 수와 정자 내 산화 물질의 양을 측정하였다(도 5, 도 6 및 표 3). 이때, 상기 PI/DCF 염색시 과산화수소라디칼 뿐만 아니라 산소라디칼도 함께 측정되며, 사멸세포, V1 영역, V2 영역, MFI total 및 MFI viable은 상기 실시예 3-1에서 정의한 바와 동일하고, V3 영역은 높은 세포내 과산화수소라디칼 값을 갖고 살아있는 정자의 수를 나타낸다.Dye for measuring the amount of hydrogen peroxide radical was prepared by adding 0.76 μM of Propidium Iodide fluorescent dye (PI; Sigma-Aldrich) and 200 μM of 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate fluorescent dye (DCF; Molecular Probes, Inc.) And the reaction was carried out at 37 ° C for 40-60 minutes. After completion of the staining, each sample was centrifuged (1,500 rpm, 3 minutes) to obtain precipitated sperm. 6 ml of mMB was added thereto to obtain a diluted solution. The diluted solution was applied to FACS to perform flow cytometry , And the number of killed spermatozoa and the amount of oxidized substance in sperm were measured (FIGS. 5, 6, and 3). In the PI / DCF staining, hydrogen peroxide radicals as well as oxygen radicals were also measured. The apoptotic cells, V1 region, V2 region, MFI total and MFI viable were the same as defined in Example 3-1, It represents the number of live sperm with the intracellular hydrogen peroxide radical value.

항산화제가 처리되고 PI/DCF로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과Flow cytometric analysis of porcine spermatozoa treated with antioxidants and fluorescently labeled with PI / DCF 항산화제 Antioxidant 사멸세포Dead cell V1 영역V1 region V2 영역V2 region V3 영역V3 area MFI totalMFI total MFI viableMFI viable 처리군Treated group 농도
(μM)density
(μM) 커큐민 Curcumin 0
10
100
5000
10
100
500 33.9±0.6
33.8±1.1
33.4±2.3
34.1±1.133.9 ± 0.6
33.8 ± 1.1
33.4 ± 2.3
34.1 ± 1.1 18.2±1.5
19.2±2.5
20.5±1.7
20.9±2.118.2 ± 1.5
19.2 ± 2.5
20.5 ± 1.7
20.9 ± 2.1 36.5±1.3
38.5±0.1
35.6±1.5
35.9±3.836.5 ± 1.3
38.5 ± 0.1
35.6 ± 1.5
35.9 ± 3.8 4.1±1.0
2.7±0.5
3.2±1.0
3.2±0.24.1 ± 1.0
2.7 ± 0.5
3.2 ± 1.0
3.2 ± 0.2 483.6±29.7
473.3±10.6
535.7±155.4
485.7±17.4483.6 ± 29.7
473.3 ± 10.6
535.7 ± 155.4
485.7 ± 17.4 440±21.6
435.3±10.4
514.0±108.4
445.6±15.2440 ± 21.6
435.3 + - 10.4
514.0 占 108.4
445.6 ± 15.2 아스타잔틴Astazanthin 0
10
100
5000
10
100
500 34.7±3.0
26.8±1.6
29.1±2.4
31.5±0.734.7 ± 3.0
26.8 ± 1.6
29.1 ± 2.4
31.5 ± 0.7 31.3±0.8
31.1±2.16
32.6±2.4
28.3±1.231.3 ± 0.8
31.1 ± 2.16
32.6 ± 2.4
28.3 ± 1.2 24.3±1.8
30.9±1.4
28.3±1.6
30.0±1.224.3 ± 1.8
30.9 ± 1.4
28.3 ± 1.6
30.0 ± 1.2 4.0±0.8
4.8±0.9
4.8±0.9
4.3±0.34.0 ± 0.8
4.8 ± 0.9
4.8 ± 0.9
4.3 ± 0.3 513.4±11.2
521.7±17.8
487.4±6.5
518.5±8.6513.4 ± 11.2
521.7 ± 17.8
487.4 ± 6.5
518.5 ± 8.6 467.0±11.9
471.4±13.8
448.9±3.5
473.8±5.4467.0 ± 11.9
471.4 ± 13.8
448.9 ± 3.5
473.8 + - 5.4

상기 도 5 및 표 3에서 보듯이, 아스타잔틴을 처리한 정자에서는, 정자 세포내 과산화수소라디칼의 값이 높은 수준을 나타내는 정자세포의 수(V3)가 전체적으로 아스타잔틴을 처리하지 않은 정자에 비하여 동등하거나 오히려 높은 값을 나타내었으므로, 아스타잔틴이 과산화수소라디칼을 제거하는 효과를 나타내지 못함을 확인하였다. 그러나, 사멸세포의 수를 비교하면, 전체적으로 아스타잔틴을 처리하지 않은 정자에 비하여 감소됨을 확인하였다. 상기 결과는 상기 표 2에 나타난 것과 유사한 결과로서, 아스타잔틴은 항산화활성과는 별도의 작용기작에 의하여 동결 및 해동시에 정자의 사멸을 억제할 수 있는 능력을 나타냄을 다시한번 확인할 수 있었다.5 and Table 3, in the sperm treated with astaxanthin, the number of sperm cells (V3) showing a high level of the hydrogen peroxide radical in the sperm cells was higher than that of the sperm not treated with astaxanthin as a whole It was confirmed that astaxanthin did not exhibit the effect of removing hydrogen peroxide radicals because it exhibited an equivalent or rather high value. However, comparing the number of apoptotic cells, it was confirmed that the total number of spermatozoa was decreased compared with the sperm not treated with astaxanthin. The results are similar to those shown in Table 2, and it was once again confirmed that astaxanthin exhibits an ability to inhibit spermatogenesis at the time of freezing and thawing by a mechanism different from antioxidant activity.

이에 반하여, 도 6 및 표 3에서 보듯이, 커큐민을 처리한 정자에서는, 정자 세포내 과산화수소라디칼의 값이 높은 수준을 나타내는 정자세포의 수(V3)가 전체적으로 커큐민을 처리하지 않은 정자에 비하여 낮은 값을 나타내었으므로, 커큐민이 과산화수소라디칼을 제거하는 효과를 나타내고, 이로 인하여 사멸하는 정자의 수를 감소시킬 수 있음을 확인하였다. On the other hand, as shown in FIG. 6 and Table 3, in the sperm treated with curcumin, the number of sperm cells (V3) showing a high level of hydrogen peroxide radical in sperm cells was lower than that of sperm not treated with curcumin , It was confirmed that curcumin exhibited an effect of removing hydrogen peroxide radicals, thereby reducing the number of dead spermatozoa.

Claims (5)

1) 70 내지 90%(v/v)의 락토오스 용액, 10 내지 30%(v/v)의 난황 및 50 내지 200 ㎍/㎖의 카나마이신 설페이트(kanamycin sulfate)로 구성된 1차 동결보존용 조성물과 돼지 정자를 혼합하여 돼지 정자의 농도가 1 X 10¹⁰ 내지 10 X 10¹⁰개/㎖가 되도록 동결보존 혼합물을 수득하는 단계;
2) 상기 1차 동결보존용 조성물, 1.0 내지 2.0%(v/v)의 글리세롤 및 50 내지 150 mM의 트레할로오스(trehalose)로 구성된 조성물을 수득하는 단계;
3) 상기 단계 2)에 아스타잔틴을 가하여 2차 동결보존용 조성물을 수득하는 단계;
4) 상기 단계 1)의 동결보존 혼합물에 상기 단계 3)의 2차 동결보존용 조성물을 가하여 혼합물을 수득하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 정자의 동결보존방법.
1) a composition for primary cryopreservation comprising 70 to 90% (v / v) of a lactose solution, 10 to 30% (v / v) of egg yolk and 50 to 200 / / ml of kanamycin sulfate, Mixing the spermatozoa to obtain a frozen storage mixture such that the concentration of porcine sperm is 1 x 10 ¹⁰ to 10 x 10 ¹⁰ cells / ml;
2) obtaining a composition comprising the primary cryopreservation composition, 1.0-2.0% (v / v) glycerol and 50-150 mM trehalose;
3) adding astaxanthin to the step 2) to obtain a second cryopreservation composition;
4) adding the second cryopreservation composition of step 3) to the cryopreservation mixture of step 1) to obtain a mixture; And
5) Freezing and preserving the mixture of step 4).
제1항에 있어서,
상기 동결 및 보존은 액화질소를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said freezing and storing is carried out using liquefied nitrogen.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 아스타잔틴의 농도는 100 내지 500uM인 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the concentration of astaxanthin is from 100 to 500 uM.
70 내지 90%(v/v)의 락토오스 용액, 10 내지 30%(v/v)의 난황 및 50 내지 200 ㎍/㎖의 카나마이신 설페이트를 포함하는 1차 동결보존용 조성물; 및
1차 동결보존용 조성물, 1.0 내지 2.0%(v/v)의 글리세롤, 50 내지 150 mM의 트레할로오스 및 아스타잔틴을 포함하는 2차 동결보존용 조성물을 포함하는 돼지 정자의 동결보존용 조성물.


A composition for primary cryopreservation comprising 70 to 90% (v / v) of a lactose solution, 10 to 30% (v / v) egg yolk and 50 to 200 占 퐂 / ml of kanamycin sulfate; And
For cryopreservation of pig sperm containing a composition for primary cryopreservation, a second cryopreservation composition comprising 1.0 to 2.0% (v / v) of glycerol, 50 to 150 mM of trehalose and astaxanthin Composition.

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