KR101745589B1 - Method for Preparing Astaxanthin by Induction Germination of Haematococcus pluvialis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 세포발아를 유도하는 것을 특징으로 하는 아스타잔틴의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 성숙한 포자형태의 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)에 높은 광도와 질소원을 제공하여 발아를 유도하고 세포 내 C/N(탄소/질소)비 조절을 통해 세포벽을 약화시켜 아스타잔틴 수득을 높이는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing astaxanthin which induces cell germination of Haematococcus pluvialis. More specifically, the present invention relates to a method for producing astaxanthin, which comprises culturing Haematococcus pluvialis ) To provide a high luminous intensity and a nitrogen source to induce germination and weaken the cell wall through regulation of intracellular C / N (carbon / nitrogen) ratio, thereby improving the yield of astaxanthin.
Description
본 발명은 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 배양 후, 세포발아를 유도하는 것을 특징으로 하는 아스타잔틴의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 성숙한 포자형태의 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)에 높은 광도와 질소원을 제공하여 발아를 유도하고 세포 내 C/N(탄소/질소)비 조절을 통해 세포벽을 약화시켜 아스타잔틴 수득을 높이는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing astaxanthin characterized by inducing cell germination after culturing of Haematococcus pluvialis. Specifically, the present invention relates to a method for producing astaxanthin in the form of mature spore-shaped hematococcus pluvialis (Haematococcus pluvialis) by providing a high luminous intensity and a nitrogen source to induce germination and weaken the cell wall through regulation of intracellular C / N (carbon / nitrogen) ratio to obtain astaxanthin.
헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)는 담수에서 서식하는 미세조류이고 카로테노이드인 아스타잔틴을 건 중량의 3~4%로 축적하는 능력이 있다. 헤마토코쿠스 플루비알리스는 영양 고갈, 강한 광에 노출, 염도 증가, 너무 낮거나 높은 온도와 같은 다양한 스트레스에 대항하기 위해 포자 구조를 생성한다. 이 과정에서 스트레스에 저항하기 위해 지질, 카로테노이드 등 2차 대사 산물을 축적하는데, 그 중 적색을 띄는 케토카로티노이드(Ketocarotenoid)인 아스타잔틴(Astaxanthin, 3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione)은 항산화 효과를 지닌 기능성 물질로 주목받고 있다(Bing Wang et al., Astaxanthin Accumulation in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) as an Active Photoprotective Process Under High Light Irradiance, J. Phycol. 39, 1116-1124 (2005)).Haematococcus pluvialis is a microalgae in freshwater and has the ability to accumulate astaxanthin, a carotenoid, at 3-4% of dry weight. Hematococcus pluvialis produces spore structures to counter various stresses such as nutrient depletion, exposure to intense light, increased salinity, too low or too high a temperature. In this process, secondary metabolites such as lipids and carotenoids are accumulated in order to resist stress. Astaxanthin, 3,3'-dihydroxy-β, β'-carotene (Ketocarotenoid) -4,4'-dione has been attracting attention as a functional material with antioxidant effect (Bing Wang et al., Astaxanthin Accumulation in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) as an Active Photoprotective Process Under High Irradiance, J. Phycol. 39, 1116-1124 (2005)).
아스타잔틴은 대표적인 항산화제인 비타민 E보다 500배, 베타-카로틴보다 20배 정도 높은 항산화 활성을 지닌다. 아스타잔틴의 항산화 능력은 UV 광산화, 염증반응, 암, Helicobacter pylori 감염, 노화로 인한 황반 변성(망막 신경조직 변성), 면역 반응에 있어서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 특유의 붉은색으로 인해 양식어류, 가금류에 색소로 쓰이고 우수한 항산화 능력으로 인해 식품첨가제, 영양보충제, 의약품 사업에서 이용될 가치가 높다.Astaxanthin has antioxidant activity 500 times higher than vitamin E and 20 times higher than beta-carotene. Antioxidant capacity of astaxanthin is known to play a key role in UV photoproposition, inflammation, cancer, Helicobacter pylori infection, macular degeneration due to aging (retinal nerve tissue degeneration), and immune response. In addition, due to its unique red color, it is used as a coloring agent for aquaculture fish and poultry, and its excellent antioxidant ability makes it highly valuable in food additives, nutritional supplements, and pharmaceuticals business.
헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)는 아스타잔틴의 생산에 있어서 가능성 있는 생물이고 생장기와 아스타잔틴을 축적하는 포자기, 두 개의 서로 다른 단계가 있다.(Kobayashi et al, Morphological Changes in the Life Cycle of the Green Alga Haematococcus pluvialis, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol 84, No.1 94-97, 1997) 헤마토코쿠스를 감싸고 있는 세포벽은 70%가 탄수화물(66% 헥소오스), 3% 셀룰로오스, 그리고 6% 단백질과 3%의 아세토기 분해 저항 물질로 이루어져 있다. 아스타잔틴은 헤마토코쿠스의 두꺼운 시스트(cyst) 세포벽 안에 축적된다. 두꺼운 세포벽은 스포로폴레닌(꽃가루 등을 둘러싸고 있는 화학적 저항성이 있는 표벽 구성 물질) 같은 물질, 알가닌으로 이루어져 있는데 이는 아스타잔틴의 용매 추출을 막는다(Hagen et al., Ultrastructural and chemical changes in the cell wall of Haematococcus pluvialis(Volvocales, Chlorophyta) during aplanospore formation, Eur. J. Phycol. (2002), 37 : 217-226).Haematococcus pluvialis is a potential organism in the production of astaxanthin, and there are two distinct stages, the phloem that accumulates the growth and astaxanthin (Kobayashi et al, Morphological Changes in 70% of carbohydrates (66% hexose), 3% of carbohydrates (3%) were present in the cell wall surrounding the hematococzus, Cellulose, and 6% protein and 3% acetyl digestion-resistant material. Astaxanthin accumulates in the thick cyst cell wall of Hematococcus. The thick cell walls consist of a material, such as sporopollenin (a chemically resistant barrier surrounding the pollen), such as alginine, which prevents solvent extraction of astaxanthin (Hagen et al., Ultrastructural and chemical changes in the cell wall of Haematococcus pluvialis (Volvocales, Chlorophyta) during aplanospore formation, Eur. J. Phycol. (2002), 37: 217-226).
Volvocales 속의 다른 종과 같이 단세포 담수종 미세조류인 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)는 극한의 환경에서 시스트를 생성한다. 이러한 시스트는 많은 양의 아스타잔틴을 합성하고 축적한다. 그러나 화학적, 효소적, 물리적 충격에 강한 저항성을 지니기 때문에 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 세포벽은 아스타잔틴 추출 과정에 어려움을 준다. 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 시스트 세포벽은 가수분해가 불가능한(nonhydrolyzable) 고분자로 이루어져 있다. 이동성이 있는 flagellate 단계는 젤라틴성의 세포외기질을 가지고 있으나 이동성을 잃으며 세포외기질 내 primary cell wall이라는 새로운 층을 형성한다. trilaminar sheath는 primary cell wall 안에 형성되고 가장 안쪽에 있는 층은 비결정성의 secondary wall이다. 그리고 시스트는 발아(germination)를 거쳐 zoospore를 방출한다. 이 발아과정 중 모양이 바뀐다. 발아와 zooid 방출 중 헤마토코쿠스 플루비알리스의 시스트 세포벽의 요소의 특정한 거동은 녹조류에서는 특이한 것이다. Trilaminar sheath와 secondary wall은 단일 구조처럼 행동한다. 시스트 크기가 커지며 zooid 형성 동안 부서진다. 대조적으로 더 신축성이 있는 tertiary wall이 밖으로 뻗어나오고 발아 과정 내내 시스트 팽창이 같이 일어난다. zooid 방출 순간에 tertiary wall은 시스트의 훨씬 얇은 정단 조직에서만 파괴된다. 비록 secondary와 tertiary wall이 성숙한 시스트에서 비슷하게 나타난다 할지라도 시스트 형성 과정 중 이들 요소들의 배열은 다르다. 이것은 아마도 발아 과정 중 이러한 세포벽들의 거동을 설명해 줄 것이다. 방출된 zoospores는 잠깐 동안 아스타잔틴이 존재하므로 붉은색을 유지하나 이는 곧 분해된다(Damiani et al., Cell wall and germination in H. pluvialis, Phycologia (2006) Volume 45 (6) 616-623).Haematococcus pluvialis, a single-cell freshwater species microalga, like other species in Volvocales, produces systole in extreme environments. These systs synthesize and accumulate large amounts of astaxanthin. However, since jinigi highly resistant to chemical, enzymatic, and physical impact of the cell wall hematoxylin nose kusu flat ruby Alice (Haematococcus pluvialis) gives a difficulty to the astaxanthin extraction process. The syst cell walls of Haematococcus pluvialis are composed of nonhydrolyzable polymers. The migratory flagellate stage has a gelatinous extracellular matrix but loses mobility and forms a new layer called the primary cell wall in the extracellular matrix. The trilaminar sheath is formed in the primary cell wall and the innermost layer is the amorphous secondary wall. And the systole releases the zoospore through germination. The shape changes during the germination process. The specific behavior of the element of the syst cell wall of hematococzual pluvialis during germination and zooid release is unusual in green algae. Trilaminar sheath and secondary wall behave like a single structure. The size of the cyst increases and breaks during zooid formation. In contrast, a more elastic tertiary wall extends outward, and systole swells throughout the germination process. At the moment of zooid release, the tertiary wall is destroyed only in the much thinner root tissue of the sist. Although the secondary and tertiary walls are similar in mature sist, the arrangement of these elements during the systole formation is different. This will probably explain the behavior of these cell walls during the germination process. The released zoospores retain their red color because of the presence of astaxanthin for a short time, but they are degraded soon (Damiani et al., Cell wall and germination in H. pluvialis, Phycologia (2006) Volume 45 (6) 616-623).
세포 내 있는 아스타잔틴은 헤마토코쿠스 세포를 그대로 섭취하는 것보다 세포 밖으로 추출하여 섭취했을 때 생물학적 활성을 가진다. 그러므로, 생물학적 활성을 갖는 아스타잔틴 수득을 위해서는 헤마토코쿠스 세포의 세포벽을 파쇄하여 세포 내에 있는 아스타잔틴을 추출해야 한다. 이에 따라 시스트 세포로부터의 아스타잔틴 추출에 관한 다양한 연구가 이루어지고 있다(Sarada et al., An Efficient Method for Extraction of Astaxanthin from Green Alga Haematococcus pluvialis, J. Agric. Food Chem., 2006, 54, 7585-7588).Astaxanthin in the cells is biologically active when taken out of the cells and ingested, rather than ingesting the hematococz cells as it is. Therefore, in order to obtain astaxanthin having biological activity, the cell wall of hematococz cells must be disrupted to extract astaxanthin in the cells. Thus, various studies have been made on the extraction of astaxanthin from syst cells (Sarada et al., An Efficient Method for Extraction of Astaxanthin from Green Alga Haematococcus pluvialis, J. Agric. Food Chem., 2006, 54, 7585 -7588).
그 동안 용매 및 산 처리 추출, 효소 처리 후 용매 추출, DMSO, 그리고 세포 분해 공정을 이용한 여러 아스타잔틴 추출법이 보고된 바 있다. 추출 공정에서 처리시간, 온도, 산 농도는 추출율을 높이는 주요한 요인이다. 또한 UAE(ultrasound-assisted extraction), MAE(microwave-assisted extraction)와 같이 세포벽을 약화시키는 전처리를 가해 추출을 돕는 방법도 연구되고 있다. 그러나 이 모든 방법은 아스타잔틴이 손실될 뿐만 아니라 대규모 공정에 적용하기 어려운 점이 있다(Duankamol Ruen-ngam et al., Comparison of Extraction Methods for Recovery of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis, Separation Science and Technology, 46: 64-79, 2011).In the meantime, various methods of extracting astaxanthin using solvent extraction, acid extraction, enzyme extraction, DMSO, and cell lysis process have been reported. In the extraction process, treatment time, temperature, and acid concentration are the main factors that increase the extraction rate. In addition, methods of helping extraction by pretreatment such as ultrasound-assisted extraction (UAE) and microwave-assisted extraction (MAE) are also being studied. However, not all of these methods suffer from loss of astaxanthin as well as difficulties in application to large scale processes (Duankamol Ruen-ngam et al., Comparison of Extraction Methods for Recovery of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis, Separation Science and Technology, 46: 64 -79, 2011).
이에, 본 발명자들은 헤마토코쿠스 플루비알리스로(Haematococcus pluvialis)부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 성숙한 포자형태의 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)에 높은 광도와 질소원을 제공하여 발아를 유도하면 세포 내 C/N(탄소/질소)비가 낮아지고 세포벽이 약화되어 아스타잔틴 수득율이 높아진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Thus, the present inventors have hematoxylin nose kusu flat ruby Alice to (Haematococcus pluvialis) from astaxanthin example to develop a method for efficiently extracting the sought results, mature spore form of hematoxylin nose kusu flat ruby Alice (Haematococcus pluvialis) It was confirmed that inducing germination by providing a high luminous intensity and a nitrogen source lowers the intracellular C / N (carbon / nitrogen) ratio, weakens the cell wall, and increases the astaxanthin yield, thereby completing the present invention.
본 발명의 목적은 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 세포벽을 약화시켜 아스타잔틴 수득효율을 향상시키는 방법을 제공하는 데 있다.
An object of the present invention is to weaken the cell walls of hematoxylin nose kusu flat ruby Alice (Haematococcus pluvialis) to provide a process for improving astaxanthin yield efficiency.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 자가영양조건에서 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 배양하는 단계 (b) 아스타잔틴 생성을 유발한 다음, 성숙한 포자형태의 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 발아를 유도하는 단계 및 (c) 상기 발아가 유도된 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴을 수득하는 단계를 포함하는 자가영양조건에서 헤마토코쿠스 플루비아리스 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 세포발아 유도를 통한 아스타잔틴의 제조방법을 제공한다.
In order to achieve the above object, the present invention comprises (a) self-Mato RE in a nutrient conditions nose kusu flat ruby Alice causing the step (b) of astaxanthin produced culturing (Haematococcus pluvialis) and then, a mature spore form hematoxylin nose kusu flat ruby Alice in step and (c) self-nutritional condition, comprising said germination-induced hematoxylin nose kusu flat ruby Alice to give the astaxanthin from (Haematococcus pluvialis) to induce germination (Haematococcus pluvialis) hematoxylin nose kusu flu provides via-less hematoxylin nose kusu flat ruby Alice method for producing astaxanthin by the cells induction of germination (Haematococcus pluvialis).
본 발명에 따른 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis) 세포 발아를 통한 세포벽 약화를 위한 전처리 기술을 이용하면 적절한 광도와 C/N 비(탄소/질소 비) 조성을 통해 아스타잔틴 분해를 최소화할 수 있으며, 세포 구성 성분 내 단백질 함량을 최대화하여 세포 파쇄를 쉽게 할 수 있어 그 안에 존재하는 아스타잔틴을 높은 수율로 추출할 수 있다. 또한 이 기술은 배양 공정에 적용 가능하여 이후 추출 과정을 용이하게 한다는 장점이 있고, 비교적 그 적용 방법이 간단하여 배양 공정에 적용 가능하고 이후 추출 과정을 용이하게 한다는 장점이 있으며, 다른 전처리 방법과 달리 생물학적인 매커니즘을 이용하므로 에너지 소비가 적으며 친환경적이다.
Hematoxylin according to the invention co kusu flat ruby Alice (Haematococcus pluvialis) by using the pre-treatment techniques for cell wall weakened by the cells germinated minimizes astaxanthin decomposition with a composition appropriate light intensity and the C / N ratio (carbon / nitrogen ratio) And can maximize the protein content in the cell components to facilitate cell disruption, thereby allowing the astaxanthin present therein to be extracted with high yield. In addition, this technology has an advantage that it can be applied to a culturing process, facilitates the subsequent extraction process, has a relatively simple application method and can be applied to a culturing process, and has an advantage of facilitating the extraction process thereafter. It utilizes a biological mechanism and thus consumes less energy and is environmentally friendly.
도 1은 자가영양조건을 이용한 광 배양 공정을 이해하기 쉽게 나타낸 개략도이다.
도 2는 자가영양조건에서 약 2달 동안의 유발(아스타잔틴 합성) 기간을 거친 헤마토코쿠스 플루비알리스에 영양원인 NIES-C 배지를 공급하였을 때 세포 발아 중 형태 변화를 나타낸 광학 현미경 사진이다.
도 3은 자가영양조건에서 약 2달 동안의 유발(아스타잔틴 합성) 기간을 거친 헤마토코쿠스 플루비알리스에 각각 다른 광 조건(50μE/m2/s, 300μE/m2/s)에서 질소원을 농도별로 공급한 후 바이오매스와 아스타잔틴 농도 변화 추이를 나타낸 그래프이다.
도 4는 자가영양조건에서 약 2달 동안의 유발(아스타잔틴 합성) 기간을 거친 헤마토코쿠스 플루비알리스에 각각 다른 광 조건(50μE/m2/s, 300μE/m2/s)에서 농도 별로 질소원을 공급하여 발아기를 유도한 후 아스타잔틴 추출 효율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 농도 2.0mM의 질소원을 첨가한 조건에서 세포 내 성분 함량 변화를 나타낸 막대그래프이다. FIG. 1 is a schematic view showing an optical culture process using autotrophic conditions in an easily understood manner.
FIG. 2 is an optical microscope photograph showing morphological changes during cell germination when feeding NIES-C nutrient, nutritional cause, to Hematococcus pluvialis over a period of about 2 months (astaxanthin synthesis) under autotrophic conditions to be.
FIG. 3 is a graph showing the effect of different concentrations of hematocrit on platelet aggregation in different light conditions (50 μE / m 2 / s, 300 μE / m 2 / s) And the concentration of biomass and astaxanthin after the supply of nitrogen source at different concentrations.
Figure 4 is a graph showing the effect of different concentrations of hematocrit on platelet aggregation in different light conditions (50 μE / m 2 / s, 300 μE / m 2 / s) over a period of about two months (astaxanthin synthesis) And the extraction efficiency of astaxanthin after inducing germination by supplying nitrogen source to each concentration.
5 is a bar graph showing changes in intracellular component content under the condition of adding a nitrogen source at a concentration of 2.0 mM.
본 발명에서는 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴의 생산효율을 높이기 위하여 헤마토코수스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 세포벽을 약화시키는 방법을 제공하였다. In the present invention, hematoxylin nose kusu flat ruby Alice provided a method of order from (Haematococcus pluvialis) to increase the production efficiency of astaxanthin weaken the cell walls of hematoxylin nose Versus flat ruby Alice (Haematococcus pluvialis).
구체적으로, 본 발명자들은 자가 영양 조건에서 유도기를 거쳐 아스타잔틴을 함유한 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)에 일시적으로 질소원을 공급하여 세포내 C/N 비를 낮추고 세포 발아를 유도하여 배양 공정 중 세포 주기를 세포벽이 단단한 aplanospore에서 flagellate기로 접어들도록 하여 상대적으로 세포벽을 약화시켰으며, 이러한 조건에서 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터의 아스타잔틴 추출 효율이 향상된 것을 확인하였다. Specifically, the present inventors hypothesized that by feeding a source of nitrogen temporarily to Haematococcus pluvialis containing astaxanthin through autotrophic conditions under autotrophic conditions, the intracellular C / N ratio is lowered and cell germination is induced In the culture process, the cell cycle was folded into a flagellate group from a cell wall-hard aplanospore, and the cell wall was relatively weakened. In this condition, it was confirmed that the extraction efficiency of astaxanthin from Haematococcus pluvialis was improved .
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 자가영양조건에서 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 배양하는 단계 (b) 아스타잔틴 생성을 유발한 다음, 성숙한 포자형태의 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 발아를 유도하는 단계 및 (c) 상기 발아가 유도된 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴을 수득하는 단계를 포함하는 자가영양조건에서 헤마토코쿠스 플루비아리스 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 세포발아 유도를 통한 아스타잔틴의 제조방법에 관한 것이다. Therefore, the invention in one aspect, (a) self-nutritional condition in hematoxylin nose kusu flat ruby Alice (Haematococcus pluvialis) for causing the step (b) of astaxanthin produced culturing and then, a mature spore form of hematoxylin nose inducing germination kusu flat ruby Alice (Haematococcus pluvialis) and (c) H. self nutritional conditions comprising the step of said germination-induced hematoxylin nose kusu flat ruby Alice to give the astaxanthin from (Haematococcus pluvialis) Mato nose kusu flu via leased hematoxylin nose kusu flat ruby Alice relates to a process for the preparation of astaxanthin by the cells induction of germination (Haematococcus pluvialis).
본 발명에서는 세포 발아를 위한 광조건과 C/N 비(탄소/질소 비)의 최적화를 달성하기 위하여, 이산화탄소 고정 및 유용 물질 생산을 위해 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 자가영양조건에서 대량 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, in order to achieve optimization of light condition and C / N ratio (carbon / nitrogen ratio) for cell germination, Haematococcus pluvialis is cultured under autotrophic conditions Followed by mass culture.
본 발명에 있어서, 배양 조건은 회분배양(Batch-culture) 조건으로서, 반응기 내 별다른 유입과 유출 없이 연속적으로 이산화탄소만이 공급되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the culture condition is a batch culture condition and can be characterized in that only carbon dioxide is supplied continuously without any inflow and outflow in the reactor.
본 발명에서 생장기 단계의 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)는 NIES-C 배지에서 배양하며, 광조건은 50~70μE/m2/s인 것을 특징으로 할 수 있다.Hematoxylin nose kusu flat ruby Alice (Haematococcus pluvialis) of the anagen phase in the present invention is cultured in NIES-C medium, light condition may be characterized in that 50 ~ 70μE / m 2 / s .
본 발명에서 생장기가 끝난 헤마토쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)는 NIES-N 배지에서 배양하며 증식을 억제하고 200μE/m2/s ~ 500μE/m2/s 범위의 광조건으로 스트레스 환경을 제공하여 시스트 생성 및 아스타잔틴 생산을 유발하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 국한된 것은 아니다.Hematoxylin kusu flat ruby Alice (Haematococcus pluvialis) is growing season ended in the present invention are cultured in NIES-N medium and inhibit the proliferation and provide stress environment light conditions of 200μE / m 2 / s ~ 500μE /
바람직하게는 상기의 광조건이 300μE/m2/s 인 것을 특징으로 할 수 있다. Preferably, the above light condition is 300 mu E / m < 2 > / s.
본 발명에서 자가영양조건에서 성숙한 시스트에 200μE/m2/s ~ 500μE/m2/s 범위의 광조건을 제공하고 질소원을 첨가하여 세포내 C/N 비(탄소/질소 비)를 조절하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 국한된 것은 아니다. In the present invention, it is characteristic that in the self-nutritional condition, the light condition in the range of 200 μE / m 2 / s to 500 μE / m 2 / s is provided to the mature sist and the intracellular C / N ratio (carbon / nitrogen ratio) But it is not limited to this.
바람직하게는 상기의 광조건이 300μE/m2/s 인 것을 특징으로 할 수 있다. Preferably, the above light condition is 300 mu E / m < 2 > / s.
본 발명에서 헤마토쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis) 발아기에는 NIES-C 배지를 공급하고 200μE/m2/s ~ 500μE/m2/s 범위의 광조건을 제공하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, Haematococcus pluvialis (Haematococcus pluvialis) The germination may be characterized by supplying NIES-C media and providing light conditions ranging from 200 μE / m 2 / s to 500 μE / m 2 / s.
바람직하게는 상기의 광조건이 300μE/m2/s 인 것을 특징으로 할 수 있다. Preferably, the above light condition is 300 mu E / m < 2 > / s.
본 발명의 일실시예에서 300μE/m2/s 광조건 및 2.0mM KNO3일 때, 대조군의 C/N비가 2.3인 것과 비교하여 실험군은 1.3이었다.In one embodiment of the present invention, the experimental group was 1.3 compared to the control group with a C / N ratio of 2.3, at 300 μE / m 2 / s light condition and 2.0 mM KNO 3 .
결과적으로, 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)의 발아 과정 중 아스타잔틴 분해를 최소화하고 추출 효율을 최대화하기 위해 발아에 영향을 주는 두 요인인 광도와 C/N 비(탄소/질소 비) 조건을 고려하여 배양 공정 중 아스타잔틴 손실을 최소화할 수 있었다.
As a result, in order to minimize the decomposition of astaxanthin and to maximize the extraction efficiency during the germination process of Haematococcus pluvialis, the luminosity and C / N ratio (carbon / nitrogen ratio ), The loss of astaxanthin during the culture process was minimized.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments.
<실시예><Examples>
본 발명에 사용된 균주는 Haematococcus pluvialis NIES-144로서 National Institute for Environmental Studies, Tsukuba, Japan으로부터 구입되었다. 본 실험에 사용된 배지의 NIES-C와 NIES-N이며, 이들의 구성성분을 하기 [표1]에 나타내었다. 또한 자가영양조건에서 헤마토코쿠스 플루비알리스에 공급한 지역 난방공사 판교지사의 배가스 성분을 하기 [표 2]에 나타내었다. 또한 광 배양공정의 옥외 배양 조건은 아래에 나타내었다. The strain used in the present invention was purchased from National Institute for Environmental Studies, Tsukuba, Japan as Haematococcus pluvialis NIES-144. NIES-C and NIES-N of the medium used in this experiment, and their constituents are shown in Table 1 below. Table 2 shows the flue-gas composition of the Pangyo branch of District Heating Corporation supplied to Hematokokus Fluvialys under autotrophic conditions. The outdoor culture conditions of the light cultivation process are shown below.
- NIES-C 배지: autotrophic medium (자가영양배지, 목적: 생장)- NIES-C medium: autotrophic medium (objective: growth)
- NIES-N 배지: autotrophic medium (자가영양배지, 목적: 생육억제, 광유발, 아스타잔틴 생산)- NIES-N medium: autotrophic medium (purpose: growth inhibition, light induction, astaxanthin production)
- 가스 공급 : 한국 지역난방공사 판교 지사 배기가스 (LNG 연소 배가스)- Gas supply: Pangyo branch office of Korea District Heating Corporation exhaust gas (LNG combustion flue gas)
- 주입속도 : 0.1~0.2 L/min- Feed rate: 0.1 ~ 0.2 L / min
- 배양 온도 : 26±3 ℃- Culture temperature: 26 ± 3 ℃
℃ - 광주기 : (대략적으로) 16:8℃ - Light period: (approx.) 16: 8
- 반응기 종류 : 5L 부피의 기포탑(bubble column)을 이용하여 교반하는 관형(tubular)의 투명한 광 생물 반응기- Reactor type: Tubular transparent biocide reactor with stirring in a bubble column of 5L volume
- 생장 및 시스트 유도기 시 광조건 : 50~70 μE/m2/s (for vegetative growth); 300~500 μE/m2/s (for inductive growth)- Light and dry conditions for growth and seed induction: 50 ~ 70 μE / m 2 / s (for vegetative growth); 300 to 500 μE / m 2 / s (for inductive growth)
- 서로 다른 C/N 비 조성에 사용된 영양원 : 0.5mM KNO3, 1.0mM KNO3, 2.0mM KNO3, 대조군 (아무것도 첨가하지 않음)
- the nutrient source used for different C / N ratio composition: KNO 3 0.5mM, 1.0mM 3 KNO, KNO 3 2.0mM, control (no addition of nothing)
(per liter)
Na2EDTA 1 g
FeCl36H2O 0.196 g
MnCl24H2O 0.036 g
ZnSO47H2O 0.022 g
CoCl26H2O 4 ㎎
Na2MoO42H2O 2.5 ㎎PIV metal solution
(per liter)
Na 2 EDTA 1 g
FeCl 3 6H 2 O 0.196 g
MnCl 2 4H 2 O 0.036 g
ZnSO 4 7H 2 O 0.022 g
CoCl 2 6H 2 O 4 mg
Na 2 MoO 4 2H 2 O 2.5 mg
(per liter)
Na2EDTA 1 g
FeCl36H2O 0.196 g
MnCl24H2O 0.036 g
ZnSO47H2O 0.022 g
CoCl26H2O 4 ㎎
Na2MoO42H2O 2.5 ㎎PIV metal solution
(per liter)
Na 2 EDTA 1 g
FeCl 3 6H 2 O 0.196 g
MnCl 2 4H 2 O 0.036 g
ZnSO 4 7H 2 O 0.022 g
CoCl 2 6H 2 O 4 mg
Na 2 MoO 4 2H 2 O 2.5 mg
실시예 1. 헤마토코쿠스 플루비알리스의 성숙한 시스트 배양액의 C/N 비(탄소/질소 비) 변화 후 발아 과정의 관찰Example 1. Observation of germination process after changing the C / N ratio (carbon / nitrogen ratio) of mature sist culture medium of hematocookus pluvialis
C/N 비(탄소/질소 비)가 헤마토코쿠스 플루비알리스의 시스트 발아에 미치는 영향을 탐구하기 위하여, 먼저 헤마토코쿠스 플루비알리스를 생장 조건에서 배양하였다. 도 1A에서 배양 공정에 관해 대략적으로 나타내었다. 유기 탄소원이 결핍된 NIES-C 배지에서 낮은 광도의 빛(50 ~70μE/m2/s)과 오직 배가스 내 이산화탄소만을 유일 탄소원으로 생육하여 대수기에 이른 세포 배양액 (OD680 = ~0.6) 내 세포를 NIES-N 배지를 첨가하여 증식을 억제하고, 강한 빛(300μE/m2/s)에 노출하여 시스트 형성을 유도하였고 이후 약 2달 동안의 유도기를 거쳤다.In order to investigate the effect of C / N ratio (carbon / nitrogen ratio) on sist germination of hematococzus pluvialis, Hematococzus pluvialis was first cultured under growth conditions. The culture process is schematically shown in Fig. 1A. Low light intensity (50 ~ 70μE / m 2 / s) and with only the growth only of carbon dioxide in the exhaust gas as the only carbon source early in the cell culture medium to log phase (OD 680 = ~ 0.6) the cells in the NIES-C medium containing an organic carbon source is deficient Was added to NIES-N medium to inhibit proliferation and exposed to strong light (300 μE / m 2 / s) to induce syst formation, followed by induction for about 2 months.
유도기는 다음과 같이 진행하였다. 플라젤레이트 세포를 스트레스 상황에 1달 이상 노출하여 원형질체가 둥글게 변하고 크기가 커지고 운동성을 잃은 시스트를 형성하였다. 시스트가 성숙되면 vegetative wall(생장기 때의 세포벽)은 사라진다. 시스트의 직경은 22~76μm이다. 기존 연구에서 전자현미경으로 시스트 세포벽으로 관찰한 결과 외부의 primary wall, trilaminar sheath, secondary wall로 이루어져 있음을 밝혀냈다. 그리고 최근에 추가적인 tertiary wall이 관찰되었다. 4~6주 정도 된 시스트에서 2개의 층을 가진 섬유질성의 tertiary wall을 관찰할 수 있다. 시스트가 점차 성숙해지며 primary cell wall은 분해된다.The induction machine proceeded as follows. Plazelate cells were exposed to stress conditions for more than a month to form protoplasts rounded and larger in size and losing mobility. When the seeds mature, the vegetative wall disappears. The diameter of the sist is 22 to 76 μm. In previous studies, electron microscopic observation of the syst cell wall revealed that it consisted of external primary wall, trilaminar sheath, and secondary wall. Recently, an additional tertiary wall was observed. A fibrous tertiary wall with two layers can be observed in the sieves of 4-6 weeks. The syst gradually matures and the primary cell wall degrades.
도 2에 나타난 바와 같이, C/N 비(탄소/질소 비) 변화 후 세포 발아를 관찰할 수 있었다. 시스트 발아 과정은 다음과 같다. 먼저 유도기를 거친 헤마토코쿠스 플루비알리스에 생장기에 사용했던 NIES-C 배지를 영양원으로 공급하였다. 새로운 배지로 옮겨졌을 때 시스트는 발아하고 zoospore를 방출한다. 시스트 발아와 zoospore 방출 과정에서 세포벽은 다음과 같이 변화한다. trilaminar sheath가 파괴되는 반면에 신장성이 있는 tertiary wall이 인접한 secondary wall과 함께 이동하며 시스트의 크기 확장과 모형 변화에 관여한다. Zooid는 이 tertiary wall을 파괴하며 방출되며, 정단 조직에서 매우 얇아진다. 이 단계에서 zooid는 아스타잔틴 때문에 시스트와 마찬가지로 붉은 색으로 관찰되었다.
As shown in FIG. 2, cell germination could be observed after C / N ratio (carbon / nitrogen ratio) change. The syst germination process is as follows. First, NIES-C medium, which was used for growing plants, was supplied as a nutritional source to Hematococcus pluvialis through an induction machine. When transferred to a new medium, the seeds germinate and release the zoospore. In the process of syst germination and zoospore release, the cell wall changes as follows. While the trilaminar sheath is destroyed, the elongated tertiary wall moves with the adjacent secondary wall and is involved in the expansion of the systole and the change of the model. The zooid is released by destroying this tertiary wall, becoming very thin in the topology. At this stage, the zooid was observed in red like the syst because of the astaxanthin.
실시예 2. 자가영양조건에서 헤마토코쿠스 플루비알리스의 성숙한 시스트 발아가 바이오매스 및 아스타잔틴 농도 변화에 미치는 영향Example 2. Effect of mature syst germination of Hematococz E. fluvialis on the biomass and astaxanthin concentration changes under autotrophic conditions
C/N 비(탄소/질소 비) 변화가 발아에 주는 영향을 관찰하기 위하여 헤마토코쿠스 플루비알리스의 성숙한 시스트에 도 1B에서 나타난 바와 같이 각각 다른 농도의 질소원(0.5mM KNO3, 1.0mM KNO3, 2.0mM KNO3)을 공급해 발아를 유도하였고, 광도가 발아에 주는 영향을 관찰하기 위하여 세포 발아 동안 각각 높은 광 조건과 낮은 광 조건을 주었다. In order to observe the effect of C / N ratio (carbon / nitrogen ratio) change on germination, the mature sist of Hematococus pluvialis was treated with different concentrations of nitrogen source (0.5 mM KNO 3 , 1.0 mM KNO 3 , 2.0 mM KNO 3 ) to induce germination. In order to observe the effect of light intensity on germination, high light condition and low light condition were given during cell germination, respectively.
도 3A는 높은 광도에서의 바이오매스, 도 3B는 낮은 광도에서의 바이오매스, 도 3C는 높은 광도에서의 아스타잔틴 농도, 도 3D는 낮은 광도에서의 아스타잔틴 농도를 나타낸다. C/N 비(탄소/질소 비) 변화 후 헤마토코쿠스 플루비알리스는 바이오매스 생장 및 아스타잔틴 농도 감소를 보였다(도3). FIG. 3A shows biomass at high light intensity, FIG. 3B shows biomass at low light intensity, FIG. 3C shows astaxanthin concentration at high light intensity, and FIG. 3D shows astaxanthin concentration at low light intensity. After the C / N ratio (carbon / nitrogen ratio) change, Hematococz Plubialis showed biomass growth and a decrease in astaxanthin concentration (Fig. 3).
도 3A 및 3B에 나타난 바와 같이 초기 바이오매스는 2.0~2.3g/L인 반면 질소원 공급 후 바이오매스가 영양원 공급 10일 후 C/N 비에 따라 높은 광도에서는 최대 3.4g/L이고 낮은 광도에서는 최대 3.7g/L로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 3C와 3D에 나타난 바와 같이 초기 아스타잔틴 농도는 100~110mg/L인 반면 질소원 공급 후 아스타잔틴 농도는 영양원 공급 10일 후 높은 광도에서 C/N 비에 따라 최대 94mg/L, 최소 71 mg/L이었고, 낮은 광도에서 최대 70mg/L, 최소 46mg/L으로 나타났다.As shown in FIGS. 3A and 3B, the initial biomass is 2.0 to 2.3 g / L, whereas the biomass after the supply of nitrogen source is 3.4 g / L at high light intensity and the maximum And increased to 3.7 g / L. As shown in FIGS. 3C and 3D, the initial astaxanthin concentration was 100 to 110 mg / L, whereas the astaxanthin concentration after the nitrogen source was 94 mg / L at the highest C / N ratio 71 mg / L, and the maximum was 70 mg / L and 46 mg / L at low light intensity.
결과적으로 낮은 광도의 빛(3B)이 높은 광도의 빛(3A)보다 바이오매스 생장에 유리함을 알 수 있었다. 낮은 광도의 빛은 세포 생장기 조건의 광도 조건이다. 이는 강한 광 조건은 세포에서 일종의 스트레스로 작용하므로 이에 대응하기 위해 탄소 고정이 광 보호 물질인 아스타잔틴의 형태로 이루어지나, 낮은 광 조건은 탄소 고정이 바이오매스 증가로 이어질 것이라는 관점과 상응한다.As a result, it was found that the light 3B having a low light intensity is advantageous to the biomass growth than the light 3A having a high light intensity. Low light intensity is a luminous condition of cell growth conditions. This is because the strong light condition acts as a sort of stress in the cell. To cope with this, the carbon fixation takes the form of astatanthin, which is a light protection substance, but the low light condition corresponds to the view that carbon fixation will lead to an increase in biomass.
또한 낮은 광도는 높은 광도에 비해 더 많은 아스타잔틴 분해를 야기하였다. 이는 아스타잔틴의 광보호적 역할, 다시 말해 차광막으로서 그리고 직접적인 산화 손상에 대응하기 위해 또는, 방어 매커니즘의 부산물으로서 세포를 보호하기 위해 생성된다는 기존 연구 결과와 상응한다.
Also, low light intensity caused more astaxanthin degradation than high light intensity. This corresponds to the existing research results that astatanthin is produced in the photoprotective role, that is to say as shielding film and to protect the cells as a byproduct of the defensive mechanism, either to cope with direct oxidative damage.
실시예 3. 자가영양조건에서 헤마토코쿠스 플루비알리스의 성숙한 시스트 발아가 아스타잔틴 추출율 향상에 주는 영향Example 3: Effect of mature syst germination of Hematococz E. pluvialis under autotrophic conditions on enhancement of astaxanthin extractability
10일 동안의 시스트 발아 과정 동안 헤마토코쿠스 샘플을 채취하여 아스타잔틴 추출 실험을 진행하였다. 추출은 다음과 같이 진행하였다. 먼저 2ml microtube에 세포 배양액 1ml를 넣고 상등액을 버리고 세포 pellet만을 남긴다. 그 후 methanol 1ml을 넣고 glass bead를 첨가한다. 이후 호모게나이저(Qiagen사, Germany)를 이용하여 물리적 충격을 가해 bead-beating법으로 세포벽을 파쇄하여 세포 내 물질을 추출하였다. 그리고 HPLC(Shimazu 사, Japan)를 이용하여 아스타잔틴 농도를 분석하였다.During 10 days of syst germination, a sample of Hematococcus was sampled and tested for astaxanthin extraction. Extraction proceeded as follows. First, add 1 ml of cell culture to 2 ml microtube, discard supernatant and leave cell pellet. Then add 1 ml of methanol and add glass beads. Subsequently, the cells were disrupted by bead-beating method using physical homogenization using a homogenizer (Qiagen, Germany) to extract intracellular substances. The concentration of astaxanthin was analyzed using HPLC (Shimazu Co., Japan).
도 4A는 높은 광도 조건에서 아스타잔틴 추출 효율 변화를 나타낸 것이다. 발아 유도 후 1일~4일 동안 추출 효율이 증가하였으며, 특히 2.0mM의 KNO3 첨가 조건에서 추출 효율이 급격히 증가함을 알 수 있었다. 그 후 추출 효율은 거의 일정하게 유지되는 양상을 보였다. 아스타잔틴 추출 효율의 증가는 세포가 발아하면서 시스트가 커지며 zooid 형성동안 세포벽이 부서지는 것과 관련된다.Figure 4A shows the change in astaxanthin extraction efficiency at high light intensity conditions. Extraction efficiency increased during 1 ~ 4 days after induction of germination. Especially, extraction efficiency increased rapidly with 2.0mM KNO 3 addition. After that, the extraction efficiency remained almost constant. The increase in astaxanthin extraction efficiency is related to cell wall germination during zooid formation, as the cell germinates and the syst increases.
도 4B는 낮은 광도 조건에서 아스타잔틴 추출 효율 변화를 나타낸 것이다. 발아 유도 후 추출 효율은 계속적으로 증가하였으며, 대조군에서도 추출 효율이 약간 증가하는 하였다(10일 후 70%). 이와 같은 결과는 낮은 광도 조건은 세포 생장에 유리하므로 세포가 점차 시스트에서 플라젤레이트로 분화하면서 세포벽의 단단한 구조가 약화됨에 따른 것으로 보인다.4B shows the change in astaxanthin extraction efficiency at low light intensity conditions. After germination induction, the extraction efficiency was continuously increased and the extraction efficiency was slightly increased in the control group (70% after 10 days). These results suggest that the low light intensity condition is favorable for cell growth, which is due to the gradual weakening of the cell wall structure as the cells gradually differentiate into sphygotes.
아스타잔틴 추출 효율은 다음과 같이 계산하였다.The extraction efficiency of astaxanthin was calculated as follows.
[아스타잔틴 추출 효율(%) = 30분의 호모게나이저 처리 후 추출된 아스타잔틴 농도/ 총 아스타잔틴 농도 100]
[Efficiency of extraction of astaxanthin (%) = concentration of astaxanthin extracted after 30 minutes homogenizer treatment / total astaxanthin concentration 100)
실시예 4. 2.0mM KNOExample 4. 2.0 mM KNO 33 조건(낮은 C/N비)에서 헤마토코쿠스 플루비알리스의 세포 구성 성분의 함량비 The ratio of cellular components of Hematococz Plubialis in conditions (low C / N ratio)
도 5A, B는 아스타잔틴 추출 효율 및 수득률이 가장 우수했던 높은 광도에서 2.0mM KNO3 첨가 조건에서 세포 구성 성분인 단백질, 탄수화물, 지질 등의 함량을 백분율로 나타내었다. 대조군인 A와 비교해 보았을 때 실험군인 B에서 단백질 함량은 건중량 대비 17%에서 30%로 늘어났으며 이는 시스트가 발아하며 새로 세포 분열을 위해 위한 단백질 합성이 왕성하게 일어남에 따른 것으로 보인다. 세포 분열이 활발히 일어나고 단백질 함량이 높은 세포는 상대적으로 단단한 섬유질성의 탄수화물 중합체로 이루어진 시스트에 비해 물리적 충격에 약하므로 더 쉽게 아스타잔틴을 추출할 수 있었다. 높은 단백질 함량은 세포 발아가 왕성함을 의미하며, 단백질 성분이 높을수록 세포 파쇄에 적은 노력이 필요하나, 세포 발아가 일어나며 보호 물질인 아스타잔틴이 분해되고 세포 내 대사 산물이 새로운 세포 분열 쪽으로 사용되므로 적절한 중간 지점을 찾는 것이 중요할 것이다.FIGS. 5A and 5B show the content of protein, carbohydrate, and lipid as cellular components under the condition of 2.0 mM KNO 3 at a high light intensity, which was the best in extraction efficiency and yield of astaxanthin. Protein content in the experimental group B increased from 17% to 30% compared to the control group, A, which seems to be due to the vigorous synthesis of proteins for germination and new cell division. Cells with high cell density and high protein content were able to extract astaxanthin more easily because they were less susceptible to physical impact than those of relatively hard fibrous carbohydrate polymer. High protein content means that the cell germination is vigorous. The higher the protein content, the less effort is needed to break down the cells. However, the cell germination occurs and astatanthin, the protective substance, is degraded and the intracellular metabolites are used for new cell division So it will be important to find a suitable midpoint.
본 발명의 실시예에 의하면, 완전히 성숙한 시스트에 질소원을 첨가하여 C/N 비를 낮추면 광도에 따라 정도의 차이가 관찰되나 바이오매스가 증가하며 아스타잔틴 농도가 감소하였다. 낮은 광도에서 바이오매스 증가율이 더 우수하였으나, 아스타잔틴이 높은 광도에 비하여 더 많이 분해된다. 반면, 높은 광도에서는 바이오매스 증가율은 낮으나 아스타잔틴이 보존되는 효과가 있었다. 이는 아스타잔틴이 항산화물질로서 광 보호 효과가 있기 때문이라고 사료된다.
According to the embodiment of the present invention, when the nitrogen source is added to the fully mature cyst to lower the C / N ratio, a difference in the degree of light intensity is observed but the biomass is increased and the concentration of astaxanthin is decreased. The biomass growth rate was better at low light intensity, but the astaxanthin decomposes more than the high light intensity. On the other hand, at high light intensity, biomass growth rate was low but astaxanthin was preserved. This suggests that astaxanthin acts as an antioxidant for photoprotective effects.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
Claims (5)
(a) 자가영양조건에서 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 배양하는 단계;
(b) 아스타잔틴 생성을 유발한 다음, 성숙한 포자형태의 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)에 2.0mM의 KNO3를 질소원으로 첨가하여 세포내 C/N비를 1.3으로 낮추고, 200~500μE/m2/s 광조건에 노출하여 세포 내 단백질 함량을 증가시켜, 세포벽 파쇄를 통한 아스타잔틴 추출효율이 향상되도록 발아를 유도하는 단계; 및
(c) 상기 발아가 유도된 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 발아 유도 후 1~4일째 세포벽을 파쇄하여 아스타잔틴을 수득하는 단계.
A method for producing astaxanthin through induction of cell germination of Haematococcus pluvialis comprising the steps of:
(a) culturing Haematococcus pluvialis in an autotrophic condition;
(b) After inducing astaxanthin production, 2.0 mM KNO 3 was added to Haematococcus pluvialis in the form of mature spores to lower the intracellular C / N ratio to 1.3, and 200 To 500 μE / m 2 / s light to increase the protein content in the cell, thereby inducing germination so as to improve the extraction efficiency of astaxanthin through cell wall disruption; And
(c) disrupting the cell wall from germination-induced Haematococcus pluvialis for 1 to 4 days after germination induction to obtain astaxanthin.
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|---|---|
| KR (1) | KR101745589B1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190033297A (en) | 2017-09-21 | 2019-03-29 | 고려대학교 산학협력단 | A method for producing astaxanthin by removal of flagella in haematococcus species microalgae with pH shock |
| KR20190120876A (en) * | 2018-04-17 | 2019-10-25 | 고려대학교 산학협력단 | Method for Preparing Astaxanthin Comprising Biological Pretreatment and Chemical Extraction of Haematococcus pluvialis |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107326058B (en) * | 2017-08-21 | 2021-04-20 | 睿藻生物科技（苏州）有限公司 | Method for producing astaxanthin using haematococcus pluvialis |
| CN110343616B (en) * | 2019-01-25 | 2022-04-26 | 暨南大学 | Haematococcus pluvialis JNU35 with high astaxanthin yield as well as culture method and application thereof |
| KR102350706B1 (en) * | 2019-09-17 | 2022-01-14 | 한국지역난방공사 | Astaxanthin producing method using microalgae cultivation system |
| EP4116406A1 (en) * | 2021-07-07 | 2023-01-11 | Korea University Research and Business Foundation | Method for culturing haematococcus pluvialis containing large amount of astaxanthin |
| KR102674506B1 (en) * | 2022-04-26 | 2024-06-11 | 고려대학교 산학협력단 | Method for mass production of astaxanthin from microalgae using chitosan fibers cross-linked with polyethylenimine |
-
2015
- 2015-03-20 KR KR1020150039268A patent/KR101745589B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 61, pp. 545-551 (2003.01.14.)* |
| Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 74, pp. 987-994 (2007.01.11.) |
| Bioprocess Biosyst Eng., Vol. 36, pp. 729-736 (2013.01.30.)* |
| Trans. of the Korean Hydrogen and New Energy Society, Vol. 24, pp. 255-263 (2013.)* |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190033297A (en) | 2017-09-21 | 2019-03-29 | 고려대학교 산학협력단 | A method for producing astaxanthin by removal of flagella in haematococcus species microalgae with pH shock |
| KR20190120876A (en) * | 2018-04-17 | 2019-10-25 | 고려대학교 산학협력단 | Method for Preparing Astaxanthin Comprising Biological Pretreatment and Chemical Extraction of Haematococcus pluvialis |
| KR102078257B1 (en) * | 2018-04-17 | 2020-02-17 | 고려대학교 산학협력단 | Method for Preparing Astaxanthin Comprising Biological Pretreatment and Chemical Extraction of Haematococcus pluvialis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160112877A (en) | 2016-09-28 |
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