KR101741977B1

KR101741977B1 - 경구 투여용 유전자 전달을 위한 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR101741977B1
Application number: KR1020160050955A
Authority: KR
Inventors: 이용규; 이동윤; 강성훈; 레부리 비슈누; 현은주
Original assignee: 한국교통대학교산학협력단
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2017-05-31
Also published as: WO2017188731A1; JP2019514902A; EP3449944A4; US11266747B2; CN109069656A; CN109069656B; US20190111156A1; EP3449944A1

Abstract

본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 섭취된 식사를 감지하고 생물학적 시스템 내 혈당 수치와 인슐린 분비를 조절할 수 있는 새로운 경구 유전자 전달 시스템으로 경구 투여용 유전자 전달을 위한 나노입자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 유전자를 포함하는 유전자 전달용 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

경구 투여용 유전자 전달을 위한 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물{Nanoparticles for oral gene delivery system and pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient}

본 발명은 경구 투여용 유전자 전달을 위한 나노입자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 유전자를 포함하는 유전자 전달용 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 유전자 치료(gene therapy)는 질병의 증상을 치료하는 것이 아니고 질병의 원인을 제거하여 치료하는 방식이다. 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해 우수한 선택적 치료효과를 가지고, 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다.

유전자 치료는 다양한 질병 치료를 위하여 기재되고 있는 차세대 치료 기술이나, 거대분자인 DNA, RNA 등을 수용액 상태로 세포내로 전달하는 경우 생체 내 특정효소에 의해 급속하게 분해되고 세포전달률이 낮아, 유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현 효율을 얻을 수 있도록 하는 유전자 전달체(gene carrier)를 개발하는 것이 필수적이다.

유전자 전달체는 독성이 낮거나 없어야 하며, 유전자를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다.

바이러스성 벡터(viral vector)는 레트로 바이러스(RV; Retro Virus), 아데노 바이러스(AV; Adeno Virus), 아데노 부속 바이러스 (AAV; Adeno Associated Virus) 등을 유전자 전달체로 이용한 것으로서, 비바이러스성 벡터(non-viral vector)에 비하여 유전자 전달 효율이 높은 반면, 체내 적용 시 벡터 자체가 유발하는 면역반응이나 암 유발 등이 문제가 되며, 벡터에 삽입할 수 있는 유전자의 크기에도 제한이 있다.

고분자나 나노입자 등의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 의한 생물학적 위험성이 낮고, 비면역원성이며, 변형 및 대량생산이 가능하고, 전달할 수 있는 유전자의 크기에도 비교적 제한이 없다는 장점 때문에 최근 많은 연구가 이루어지고 있다. 특히, 양이온성 고분자 등의 비 바이러스성 벡터를 이용하는 방법이 제조방법의 간편성이나 상대적으로 낮은 위험성 때문에 많이 연구되고 있다. 구체적인 메커니즘은 음전하를 띄고 있는 유전자와 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성하여 유전자를 안정화시키고, 복합체 표면의 양전하와 세포 표면의 음전하가 전기적 상호작용에 의하여 복합체가 세포 표면에 결합한 후 엔도좀(endosome)으로부터 세포질로 유전자가 방출되는 과정을 거친다.

이러한 양이온성 고분자의 구체적인 예로는, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아미도아민(polyamidoamine), 폴리-L-라이신(PLL), 폴리아미노에스테르, 폴리프로필렌이민과 같은 양 이온성 단일중합체 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-블록-폴리L-리신 및 PEG-PEI와 같이 양 이온성 블록 공중합체 등을 들 수 있으며, 이들은 DNA 등의 유전자를 압축하여 나노 입자를 형성함으로써 효소 분해로부터 유전자를 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와준다.

대부분의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 사용상의 간편함 등의 장점을 가지나, 바이러스성 벡터에 비해 상대적으로 낮은 형질도입 효율, 제한적인 입자 크기 등의 문제점을 가지고 있다.

현재 비바이러스성 벡터로서 가장 광범위하게 연구되고 있는 폴리에틸렌이민(PEI) 역시 생체 내 형질도입 효율이 현저히 떨어지며, 높은 세포독성 및 낮은 혈액 적합성으로 인한 유전자의 낮은 발현 효과 등의 문제점이 있다.

한편, 한국 공개특허 제10-2010-0122405호는 친수성 고분자와 소수성 고분자가 결합된 복합체인 양친성 고분자 나노 입자에 siRNA를 결합시킨 siRNA 전달체로, 친수성 고분자로 키토산과 폴리에틸렌이미드 각각을 담즙산인 5-β-콜란산(5-β-cholanic acid)과 결합시켜 복합체를 생성한 후 각각의 복합체를 혼합하여 제조된 나노입자 형태의 양친성 고분자 나노입자를 개시하고 있다. 특히 상기 문헌은 담즙산의 소수성기와 키토산, 폴리에틸렌이민(PEI)의 친수성기에 의한 양친성으로 인하여 수계에서 구형의 자기집합체를 형성하며, 이로 인해 키토산-담즙산/폴리에틸렌이민(PEI)-담즙산 복합체 나노 입자는 표면에는 강한 양친성을 띄는 폴리에틸렌이민과 키토산이, 내부(core)에는 소수성인 담즙산이 위치하고 있음을 개시하고 있다.

따라서, 안전하고 효율적인 유전자 전달을 위해 기존의 비바이러스성 벡터의 장점은 그대로 유지하면서 형질도입(transfection) 효율을 증강시킨 유전자 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 당뇨병(diabetes mellitus)은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않아 혈중 포도당의 농도가 높아지는 대사질환으로, 인슐린이 제대로 분비되지 않거나 분비된 인슐린이 체내에서 제대로 작용하지 못하여 체내의 혈당이 조절되지 못하고 상승하는 경우를 제 2형 당뇨병이라고 하며, 췌장에서 인슐린을 분비하지 못하여 혈당이 상승하는 경우를 제 1형 당뇨병이라고 한다. 제1형 당뇨병의 경우에는 반드시 인슐린 투여 치료가 필요하다. 제2형 당뇨병의 경우에는 생활 습관 교정을 기본으로 하며 추가로 경구용 혈당 강하제의 투여가 필요할 수 있다. 먹는 약의 경우 하루 1~3회 복용하며 약의 작용 시간에 따라 먹는 시간이라든지 부작용 등이 조금씩 다르다.

현재 당뇨병의 치료법으로는 식사요법, 운동요법, 설폰요소제, 비구아니드(biguanide)계 약물, α-글루코시다아제 억제제, 인슐린 등이 이용되고 있으며 새로운 약물의 개발에 대한 많은 연구를 통해 다양한 인슐린 등이 개발되어 임상에 적용되고 있다.

한편 인슐린 분비 펩타이드의 일종인 글루카곤 유사 펩타이드-1 (Glucagon like peptide 1, GLP-1)은 회장과 대장의 L-세포에서 분비되는 인크레틴 (incretin) 호르몬이다. 글루카곤 유사 펩타이드-1의 주요한 작용은 인슐린 분비를 증가시키며, 포도당의 농도에 따른 인슐린 분비 (Glucose dependent secretion)가 이루어져 저혈당이 발생하지 않는다. 이런 특징으로 제 2형 당뇨병의 치료방법으로 적용되나, 혈중 반감기가 2분 내외로 매우 짧기 때문에 약제로 개발하는데 큰 제약을 갖고 있다. 이에 따라 개발되어 시판되는 글루카곤 유사 펩타이드-1(Glucagon like peptide-1) 작용제 (아고니스트)로서는 글리아 몬스터 도마뱀 (glia monster)의 침샘으로부터 정제된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체인 엑센딘(Exendin)-4가 있다. 이는 DPP-IV (Dipeptidyl peptidase-4)에 대한 저항성과 함께 글루카곤 유사 펩타이드-1 보다 높은 생리 활성을 가지며, 따라서 체내 반감기가 2-4시간으로 글루카곤 유사 펩타이드-1에 비해 길어진 체내 반감기를 가진다 (US 5,424,286). 그러나 DPP-IV의 저항성을 증가시키는 방법만으로는 충분한 생리활성의 지속기간을 기대할 수 없는데, 예를 들어 현재 시판되고있는 엑센딘-4 (엑세나티드, exenatide)의 경우 환자에게 하루 2회 주사를 통해 투여되어야 하며, 투여에 따른 구토유발 및 메스꺼움 현상이 환자에게 큰 부담으로 작용되는 단점이 여전히 남아있다.

그러나 이들 치료제들은 약효가 낮거나 간 기능 장애, 저혈당, 유산혈증 등과 같은 많은 부작용을 일으키는 문제점이 있다. 따라서, 기존 당뇨병 치료제의 부작용을 줄이고 대사이상 증세 등을 개선시켜 주며 장기복용 시에도 안전성이 우수한 당뇨병 치료제에 대한 요구가 있다.

암의 치료법으로는 수술, 방사선, 화학, 면역 요법 및 유전자 치료법 등 다양한 치료법이 연구되고 있는데, 유전자 치료법중 작은간섭 RNA(small interfering RNA, 이하 siRNA)를 이용한 유전자 치료법은 siRNA가 메신저 RNA(messenger RNA, 이하 mRNA)와 결합하여 RNA 유도 침묵 복합체 (RNA induced silencing complex, RISC)가 결합된 mRNA를 분해시킴으로써 특정 단백질의 발현을 저해 하는 것을 이용한 치료법이다. 특히 siRNA를 이용한 치료법은 적은 양으로도 서열이 동일한 mRNA의 발현을 효과적으로 억제하는 성질을 가지고 있어 유전자 관련 질병 치료에 다양한 가능성을 가지고 있다. 그러나 siRNA는 그 안정성이 매우 낮아서 생체 내에서 단시간에 분해되는 성질을 가지고 있고 음이온성을 가지고 있어서 음전하성의 세포막을 투과하기가 어려워 결과적으로 세포내로의 전달성이 떨어지게 된다는 문제점이 있다.

그리고 이러한 문제를 해결하기 위해 바이러스 전달체를 이용한 기술이 대두 되었는데, 이 기술은 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며, 생산 공정이 복잡하여 상용화에 많은 문제점이 있다. 따라서 최근의 연구 방향은 비바이러스성 전달체, 즉 양이온성 지질이나 고분자를 이용한 전달체를 이용하는 방향으로 진행되고 있다. 이러한 비바이러스성 전달체의 효율은 바이러스성 전달체에 미치지 못하지만 생체 내 안정성과 생산 공정이 쉽고 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다. 그러나 고분자와 siRNA을 이용하여 혼합물을 만들고자 할 때에 siRNA 특유의 단단한 성질과 약음이온성으로 혼합물의 형성에 큰 어려움을 겪는다.

한국공개특허 제10-2010-0122405호 미국등록특허 5,424,286

이에, 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 담즙산이 표면 수식된 이온성 고분자 및 유전자를 포함하되, 유전자 전달용 나노입자의 코어에 이온성 고분자와 유전자의 이온 복합체를 포함하고, 나노입자의 표면에 친수성의 이온성기를 가지는 담즙산이 위치함으로써, 체내에서의 안정성을 향상시킬 수 있으며, 생체 내에서의 독성을 최소화하여 상기한 부작용을 감소시킬 수 있고, 경구 투여와 관련된 장애를 극복할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포 내에서 목적하는 위치에 치료 유전자를 효과적으로 전달할 수 있는 유전자 전달용 나노입자로, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자; 및 유전자를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 간암 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자 및 유전자를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이온성 고분자는 양이온성 고분자일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이온성 고분자는 음이온성 고분자일 수 있으며, 이 경우 양이온성 고분자를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 음이온성 고분자는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate)에서 선택될 수 있고, 상기 양이온성 고분자는 키토산, 글리코키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine), 폴리에틸렌이민 (PEI: polyethyleneimine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 디옥시콜린산 (deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA(deoxyribonucleic acid), 단일가닥 또는 이중가닥 RNA(ribonucleic acid), 플라스미드 형태 DNA, 단일가닥 또는 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 리보자임, 촉매적 RNA 및 뉴클레오타이드 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자는 플라스미드 형태 DNA, 단일가닥 또는 이중가닥 siRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 더욱 바람직하게는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1, Glucagon like peptide-1) 또는 siRNA일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 이온성 고분자의 작용기 수에 따라 공유결합되는 정도가 달라질 수 있으나, 바람직하게 상기 담즙산 또는 이의 유도체와 이온성 고분자는 1 : 1 내지 1 : 300의 몰비로 공유결합될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달용 나노입자는 입자 크기에 관계없이 흡수가 가능하나, 바람직하게는 500 nm 이하의 입자 크기를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 이온성 고분자 및 유전자는 1 : 1 내지 1 : 200의 몰비로 결합될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달용 나노입자의 N/P 비(양이온성 고분자의 질소 원자 개수/유전자의 인산염 원자 개수)는 1 내지 200 일 수 있다.

또한, 본 발명은 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자 및 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1, Glucagon like peptide-1)를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여용일 수 있다.

또한, 본 발명은 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자 및 siRNA를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 섭취된 식사를 감지하고 생물학적 시스템 내 혈당 수치와 인슐린 분비를 조절할 수 있는 새로운 경구 유전자 전달 시스템으로, 담즙산이 공유결합된 이온성 고분자 및 유전자를 포함한다. 상기 유전자 전달용 나노입자는 상기 이온성 고분자와 유전자의 이온복합체가 나노입자의 코어에 존재하며, 친수성의 이온성기를 가지는 담즙산이 나노입자의 표면에 위치하는, 담즙산이 표면 수식된 형태의 나노입자이다.

치료 유전자를 표적 세포로 전달하기 위하여 본 발명의 담즙산이 표면 수식된 나노입자를 사용하는 경우 장 점막을 통해 유전자를 잘 전달함과 동시에 나노입자의 코어에 존재하는 이온복합체로 인하여 위장관에서 매우 안정하였다. 이로부터 본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 경구 투여용으로 매우 적합함을 알 수 있다.

본 발명에 따른 나노입자의 표면에 수식된 담즙산으로 인하여 나노입자의 GI 분해를 억제하고 작은 창자의 회장 부분에서 장 세포 막의 담즙산 수용체인 ASBT(apical sodium bile acid transporter) 수용체를 흡수하여 세포 내로 치료 유전자를 전달할 수 있어 향상된 유전자 발현을 나타낼 수 있다.

특히, 치료유전자로 GLP-1을 사용한 경우 장세포내의 효소와 pH에 의해 본 발명에 따른 나노입자의 표면에 수식된 담즙산이 분리되어 portal vein으로 들어가며, 이온성 고분자 운반체와 치료유전자는 장세포의 핵으로 전달되어 많은 양의 GLP-1이 발현되어 당뇨병 치료 효능을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자는 당뇨병 마우스 모델에 경구 투여시 성공적인 GLP-1 유전자를 발현시킴과 동시에 인슐린을 분비시켜 혈당 강하 효과를 나타내 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

한편, 표적지향 음이온성 고분자를 이용하여 siRNA의 간암세포로의 전달효율을 높이고자 하였다. siRNA와 음이온성 고분자와의 복합체를 형성하기 위하여 양이온성 단백질인 프로타민을 이용하여 유전자의 봉입률을 극대화하였다. 대표적인 음이온성 고분자로서, 히알루론산은 암세포 표면에 과발현된 CD44 수용체를 통해 높은 흡수율을 보였다. 따라서, 치료유전자로 siRNA를 포함하는 본 발명에 따른 유전자 전달용 나노입자의 경우 담즙산과 이온성고분자와의 결합체는 서로 분리되지 않고 간암세포에 도달하므로, 효율적으로 간암을 치료할 수 있다.

도 1 - 회장 부분에서 ASBT를 통한 본 발명의 유전자 전달용 나노입자의 흡수과정을 나타낸 모식도
도 2 - 실시예 1에서 제조된 Prot-TCA의 1H NMR
도 3 - 실시예 2에서 제조된 CS-TCA의 1H NMR
도 4 - 실시예 3의 Prot-TCA/GLP-1 gene complex의 제조과정을 나타낸 반응식
도 5 - 실시예 5의 Hep-S-S-NH2의 제조과정을 나타낸 반응식
도 6 - 실시예 5의 TCA-NPC의 제조과정을 나타낸 반응식
도 7 - 실시예 5의 Hep-S-S-TCA의 제조과정을 나타낸 반응식
도 8 - 실시예 5에서 제조된 Hep-S-S-NH2 및 Hep-S-S-TCA의 1H NMR
도 9 - 실시예 6의 bPEI/GLP-1/Hep-S-S-TCA의 제조과정을 나타낸 반응식도 10 - 실시예 7에서 제조된 TCA-NPC 및 TCA-NH2의 1H NMR
도 11 - 실시예 7에서 제조된 HA -TCA의 1H NMR
도 12 - 실시예 9의 prot/GLP-1/HA-TCA의 제조과정을 나타낸 반응식
도 13 - 실시예 11의 Prot/siRNA/HA-TCA의 제조과정을 나타낸 반응식
도 14 내지 도 17 - 실험예 11의 결과

이하, 본 발명에 대하여 보다 구체적으로 설명한다. 이 때 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 섭취된 식사를 감지하고 생물학적 시스템 내 혈당 수치와 인슐린 분비를 조절할 수 있는 새로운 경구 유전자 전달 시스템으로, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 고분자; 및 유전자;를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 유전자 전달용 나노입자를 제공한다.

유전자는 음이온으로 대전된 거대한 고분자 사슬 형태로, 유전자 단독으로 존재하는 경우 비교적 부피가 큰 랜덤코일의 형태를 띠고 있어 유전자를 세포 내로 전달하기 어렵기 때문에 이러한 유전자와의 정전기적 상호작용을 통해 나노 크기의 이온복합체를 형성할 수 있는 양이온성 고분자를 사용한다.

본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 유전자와 이온성 고분자의 이온복합체를 포함하며, 음이온성의 유전자와 이온복합체를 형성하는 이온성 고분자는 반드시 양이온성 고분자이며, 상기 양이온성 고분자는 담즙산과 공유결합된 형태일 수 있다.

본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 양이온성 고분자 및 유전자 간의 정전기적 상호작용으로 형성되거나, 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 음이온성 고분자, 양이온성 고분자 및 유전자 간의 정전기적 상호작용으로 형성된 것으로, 보다 안전하게 유전자의 세포 내재화를 유도할 수 있다.

즉, 본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 양이온성 고분자와 유전자의 이온복합체가 나노입자의 코어에 존재하며, 친수성의 이온성기를 가지는 담즙산이 나노입자의 표면에 위치하는, 담즙산이 표면 수식된 형태의 나노입자이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이온성 고분자는 양이온성 고분자일 수 있다. 상기 이온성 고분자가 양이온성 고분자인 경우 음전하의 유전자는 양이온성 고분자와 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 고분자 내부에 봉입된 이온복합체를 형성하고, 형성된 이온복합체는 나노입자의 코어 부분에 위치하며, 양이온성 고분자에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 이온성기를 가진 형태로 나노입자의 표면에 위치하게 된다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 중량평균분자량 100 내지 100,000인 고분자로, 예를 들면 키토산(chitosan), 글리코키토산, 프로타민(protamine), 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 키토산, 글리코키토산 또는 프로타민일 수 있다.

키토산(chitosan)은 (1->4) 2-amino-2-deoxy-β-D-glucan의 구조를 가지는 천연에 존재하는 매우 안전한 양이온성 다당류이다. 키토산은 천연의 갑각류 등으로부터 얻어지는 키틴(chitin)을 N-탈아세틸화하여 제조되는 염기성 다당류로서, 생분해성, 생체적합성 및 낮은 세포독성을 나타낸다고 알려져 있다. 본 발명에서는 바람직하게 생분해서 생체적합성이 우수한 천연 고분자인 수용성 키토산 또는 글리콜기가 도입되어 수용성이 더욱 증대된 글리콜 키토산을 사용할 수 있다.

프로타민(protamine)은 아르기닌이 풍부한 천연의 양이온성 단백질로서, 동물의 정소 중에서 특히 연어를 포함한 어류의 정자핵에 많이 존재하며, 히스톤과 같이 DNA와 회합 또는 해리를 통하여 유전정보 발현에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 통상, 어류의 정자핵으로부터 추출되는 프로타민의 분자량은 약 4,000 내지 10,000이며, 구성 아미노산의 70% 이상이 아르기닌으로 존재하나 본 발명이 여기에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 프로타민은 프로타민 자체 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 모두 포함한다. 구체적으로 본 발명의 프로타민의 염은 염산염 또는 황산염을 포함한 산성물질에 의한 염 형태를 포괄한다. 프로타민은 염 형성 없이도 물에 용해가 가능하며 염 형태 또한 물에 용해가 가능하므로 어떤 형태로든 사용 가능하다.

폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine)은 생분해설인 펩타이드 결합으로 연결되어 있어 유전자와 이온복합체를 형성해서 세포 내로 전달될 수 있으나, 다소 독성을 나타내므로 단독으로 높은 전달 효율을 나타내는데에는 한계가 있어 엔도좀 파괴 물질이나 엔도좀 융합펩타이드 등을 부착시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이온성 고분자는 음이온성 고분자일 수 있으며, 이 경우 유전자와의 이온복합체를 형성하기 위하여 반드시 양이온성 고분자를 더 포함한다. 즉 음전하의 유전자는 양이온성 고분자와 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 고분자 내부에 봉입된 이온복합체를 형성하고, 형성된 이온복합체는 나노입자의 코어 부분에 위치한다. 상기 음이온성 고분자는 이온복합체의 양이온성 고분자와 정전기적 상호작용으로 결합되어 있으며, 상기 음이온성 고분자에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 이온성기를 가진 형태로 나노입자의 표면에 위치하게 된다.

헤파린은 히드록시기, 카복실기 및 아미노기를 포함하는 구조로, 비분획 헤파린, 고분자량 헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파린 단편, 재조합 헤파린, 헤파린 유사체, 헤파란 설페이트, 헤파린 활성을 갖는 설폰화된 다당류 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 상기 이온성 고분자와 공유결합될 수 있는 작용기 이외에 친수성의 이온성기를 가지고 있는 것으로, 디옥시콜린산 (DCA: deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 담즙산은 소장의 회장 부분을 통해 95%이상의 높은 효율로 흡수가 되어 간으로 흡수되는데 이를 '장간순환(enterohepatic circulation)'이라 하며, 이러한 장간순환으로 지질 이동에 중요한 역할을 하는 생물학적 계면활성제로, 말단 장 부분에 존재하는 ASBT (apical sodium-dependent bile acid transporter)에 의해 특이적으로 인식되므로, 경구 전달에 있어서 표적 리간드로 작용할 수 있다.

즉, 회장 부분을 통해 흡수가 이루어지는 답즙산은 상기 유전자 전달용 나노입자의 표면에 위치함으로써 ASBT를 통하여 기존의 경구 투여 방식의 가장 큰 문제점인 장 내벽을 통한 상기 유전자 전달용 나노입자의 타겟 세포 내 흡수를 증대시키는 역할을 한다[도 1]. 이로 인하여 본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 담즙산을 흡수하는 회장 부분을 통해 흡수가 용이하므로 경구용으로 사용될 수 있으며, 이로인하여 약물의 생체내 이용률을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 유전자 전달용 나노입자에 결합될 수 있는 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 어떠한 유전자도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 유전자로는 질병과 관련된 치료 유전자의 정상 유전자, 표적 단백질의 발현 억제 유전자, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 크고 작은 폴리뉴클레오티드, 라이보자임이나 siRNA를 포함하는 임의의 RNA 형태의 유전자가 포함될 수 있다. 구체적으로, 단일가닥 또는 이중가닥 DNA(deoxyribonucleic acid), 단일가닥 또는 이중가닥 RNA(ribonucleic acid), 플라스미드 형태 DNA, 단일가닥 또는 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 리보자임, 촉매적 RNA 및 뉴클레오타이드 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자는 플라스미드 형태 DNA, 단일가닥 또는 이중가닥 siRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 유전자는 유전자 약물일 수 있으며, 여기서 유전자 약물은 하나 이상의 질병 치료 또는 예방을 약효로 나타내는 유전자를 의미한다.

상기 유전자는 인슐린 분비성 펩타이드로, 바람직하게는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1, Glucagon like peptide-1)일 수 있다. 상기 GLP-1을 이용하여 유전자 전달용 나노입자로 복합화하여 생체 내 투여시 우수한 혈당 저하 효과를 얻을 수 있으며, 이로 인해 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.

상기 유전자는 siRNA일 수 있으며, 상기 siRNA을 이용하여 유전자 전달용 나노입자로 복합화하여 생체 내 투여시 간암을 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 이온성 고분자의 작용기 수에 따라 공유결합되는 정도가 달라질 수 있다. 바람직하게 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 이온성 고분자는 1 : 1 내지 1 : 300의 몰비로 공유결합될 수 있다.

바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 키토산의 경우 1 : 1 내지 1 : 100의 몰비로 공유결합될 수 있다.

바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 헤파린의 경우 1 : 1 내지 1 : 30의 몰비로 공유결합될 수 있다.

바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 히알루론산의 경우에는 1 : 1 내지 1 : 200의 몰비로 공유결합될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달용 나노입자는 입자 크기에 관계없이 흡수가 가능하나, 바람직하게는 500 nm 이하일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 100 내지 300 nm이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달용 나노입자의 제타 전위는 나노입자의 표면에 사용된 이온성 고분자의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로, 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 양이온성 고분자 및 유전자 간의 정전기적 상호작용으로 형성된 유전자 전달용 나노입자는 10 내지 30 mV 범위의 제타 전위를 나타낼 수 있다. 또한, 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 음이온성 고분자, 양이온성 고분자 및 유전자 간의 정전기적 상호작용으로 형성된 유전자 전달용 나노입자는 -10 내지 -30 mV 범위의 제타 전위를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 이온성 고분자 및 유전자는 1 : 1 내지 1 : 200의 몰비, 바람직하게는 1 : 1 내지 1 : 100의 몰비로 결합될 수 있다. 상기의 결합 비율은 유전자의 발현율 및 세포 내 전달되는 유전자 전달용 나노입자로 인한 세포 독성에 따른 세포성장에 대한 부작용이 없는 범위이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 양온성 고분자 및 유전자는 1 : 1 내지 1 : 200 의 중량비/몰비, 바람직하게는 1 :3 내지 1 : 30 의 중량비/몰비로 혼합될 수 있다. 양이온성고분자가 결합할 수 있는 한계가 있고 최적의 강한 결합능력을 가질 수 있는 범위에서만 전달이 가능하기 때문에 상기 범위 내에서 양이온성 고분자와 유전자의 정전기적 상호작용에 따른 이온복합체의 형성이 잘 이루어진다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 음이온성 고분자, 양이온성 고분자 및 유전자는 3 : 1 : 1 내지 10 : 1: 200 의 중량비/몰비, 바람직하게는 3 : 1 : 1 내지 10 : 1: 30 의 중량비/몰비로 혼합될 수 있다. 상기 범위는 전하 대 전하(charge to charge)를 이용해서 결합력을 유지할 수 있는 최적의 범위로, 그 범위를 벗어나면 제형이 만들어지 않고 안정성을 잃어버린다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 전달용 나노입자의 N/P 비(양온성 고분자의 질소 원자 개수/유전자의 인산염 원자 개수)는 1 내지 200이다. 상기 N/P 비가 상기 범위 내로 포함되면 양이온성 고분자에 의한 유전자 안정화가 잘 이루어져 세포 흡수율이 높아지고 안정적인 유전자 전달용 나노입자를 형성할 수 있다.

상기 유전자 전달용 나노입자는 인슐린 분비 펩타이드의 일종인 글루카곤 유사 펩타이드-1 (Glucagon like peptide 1, GLP-1)를 치료 유전자로 포함하고 있어 타겟 세포에 흡수되어 인슐린 분비를 증가시키며, 혈중 포도당의 농도에 따른 인슐린 분비 (Glucose dependent secretion)를 일으켜 저혈당이 발생하지 않도록 한다. 따라서, 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 유전자 전달용 나노입자는 siRNA를 치료 유전자로 포함하고 있어 간암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "유효성분"이란 상기 조성물이 개체에 투여되는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 당뇨병의 예방 또는 치료하는 활성을 갖는 것을 포함한다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 마우스, 햄스터, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 용어 "예방"이란, 상기 조성물이 투여되지 않은 것에 비하여 혈중 포도당의 농도가 높아지는 것을 방지하는 것을 포함한다. 용어 "치료"란 상기 조성물이 투여되지 않은 것에 비하여, 혈중 포도당의 농도를 낮추는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유전자 전달용 나노입자를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 보강제 또는 부형제 등을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 환제, 경연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭서제(elixirs) 등의 경구투여용 제제 또는 정맥내, 피하, 설하, 근육내 투여용 멸균성 수성 또는 오일상 용제의 비경구투여용 제제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및/또는 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 부형제로는 감미제, 결합제, 용해제, 용해보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡착제, 붕해제, 산화방지제, 방부제, 활탁제, 충진제, 방향제 등이 있으며, 이러한 부형제의 비율 및 성질은 선택된 정제의 용해도 및 화학적 특성, 선택된 투여경로 및 표준 약제 실무에 의해 결정될 수 있다. 부형제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스, 글라이신, 실리카, 탈크, 스테아린산, 스테린, 마그네슘 스테아린산염, 마그네슘 알루미늄 규산염, 녹말, 젤라틴, 트라가칸트 고무, 알지닌산, 소디움 알진산염, 메틸셀룰로오스, 소디움 카르복실메틸셀룰로오스, 아가, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 엣센스, 딸기 엣센스, 바닐라 향 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여 형태로 제형화될 수도 있는데, 이러한 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 때, 상기 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 상기 약학 조성물은 유효 성분, 즉, 상기 유전자 전달용 나노입자가 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 보다 바람직하게는 경구 투여 제형일 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 멸균되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고, 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며, 혼합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물에서 유효성분인 상기 유전자 전달용 나노입자는 사람을 포함하는 포유류에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병정도에 따라 달라질 수 있고, 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분할되어 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

물질:

저-분자량의 헤파린 (Hep, average MW 5000 Da)은 메디플렉스(Mediplex Co., Ltd, 한국)로부터 구입하였고, 히알루론산 나트륨 (MW: 83 kDa)는 바이오랜드(Bioland Co., Ltd., 한국)로부터 구입하였고, TCA (PluronicTaurocholic acid sodium salt), DMF (dimethyl formamide), 프로타민(Prot), 아세톤, 4-NPC (4-methyl morpholin, 4-nitrophenyl chloroformate), TEA (trimethylamine), NHS (N-hydroxysuccinimide), EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride), EDA (ethylene diamine) 및 시스타민 이염산염은 sigma chemical.co (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. CaCo2 세포, MDCK-ASBT 및 MDCK 세포주는 한국세포주은행으로부터 구입하였다.

담즙산이 공유결합된 양이온성 고분자의 제조

실시예 1 : 타우로콜린산이 공유결합된 프로타민(Protamine-Taurocholic acid conjugate, 이하 'Prot-TCA'라 함)의 제조

투명한 용액이 될 때까지 0℃에서 TCA(taurocholic acid) (1 mmol)을 DMSO(dimethyl sulfoxide) (5 mL)에 용해시켰다. 그 후 TEA(triethylamine) (3 mmol) 및 4-NPC(4-nitrophenyl chloroformate) (2.5 mmol)을 차례로 가하고, 0℃에서 30분, 상온에서 30분간 반응시켰다. Prot(Protamine) (0.1 mmol)을 2차 증류수(double distilled water) (10 mL)에 용해시킨 후 상기 반응용액에 가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 반응액을 투석막 (MWCO: 1000Da)을 이용하여 매 6시간마다 매질을 바꾸면서 3일동안 2차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 Prot-TCA을 수득하였다(수득율 78±2%).

1H NMR 및 TNBSA 분석을 통해 프로타민에 타우로콜린산이 공유결합되었음을 확인하였다(도 2).

실시예 2 : 타우로콜린산이 공유결합된 키토산(Chitosan-Taurocholic acid conjugate, 이하 'CS-TCA'라 함)의 제조

투명한 용액이 될 때까지 0℃에서 TCA (1 mmol)을 DMSO (5 mL)에 용해시켰다. 그 후 TEA (3 mmol) 및 4-NPC (2.5 mmol)을 차례로 가하고, 0℃에서 30분, 상온에서 30분간 반응시켰다. CS(Chitosan) (0.01 mmol)을 2차 증류수 (20 mL)에 용해시킨 후 상기 반응용액에 가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 반응액을 투석막 (MWCO: 1000Da)을 이용하여 매 6시간마다 매질을 바꾸면서 3일동안 2차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 CS-TCA을 수득하였다(수득율 92±2%).

1H NMR 및 TNBSA 분석을 통해 키토산에 타우로콜린산이 공유결합되었음을 확인하였다(도 3).

(구조 확인)

상기 Prot-TCA 및 CS-TCA은 각각 Prot 및 CS의 아민 기가 TCA의 하이드록실 기에 공유결합되어 제조되었다. 이를 확인하기 위하여 D2O에 Prot-TCA 및 CS-TCA를 각각 10mg/mL로 용해시킨 후 1H NMR 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 도시하였으며, 이로부터 TCA와 Prot 사이의 아미드 결합 컨쥬게이션 및 TCA와 CS 사이의 아미드 결합 컨쥬게이션에 대한 피크가 δ 8 ppm에서 검출되었다.

또한, 상기 Prot-TCA 및 CS-TCA의 아민기 함량을 알아보기 위하여 TNBSA (trinitro benzene sulphonate) 분석을 통해 Prot과 CS 각각에 TCA가 공유결합된 후 아미노화 정도를 정량화하였다. 그 결과 Prot-TCA는 Prot로의 TCA 공유결합 전에 비해 53%로, TCA의 공유결합 이후 아민기 함량이 감소되었음을 확인하였다.

담즙산이 공유결합된 양이온성 고분자 및 유전자를 포함하는 나노입자의 제조

실시예 3 : 타우로콜린산이 공유결합된 프로타민 및 유전자 GLP-1를 포함하는 나노입자(이하 'Prot-TCA/GLP-1'이라 함)의 제조

10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)에 용해된 Prot-TCA (1mg/mL)를 스톡 용액(stock solution)으로 사용하였다. GLP-1(Glucagon like peptide-1) 유전자 (7.780 mg)를 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) (1.922 mL)에 용해시켜 GLP-1 유전자 용액을 제조하였다. gentle vortex 하에서 GLP-1 유전자 용액 (10 mL)을 스톡 Prot-TCA 용액 (10 mL)에 드랍와이즈 첨가하였다. 그런 다음, 반응물을 상온에서 1시간동안 방치하고 2일동안 동결건조하여 Prot-TCA/GLP-1을 수득하였다[도 4].

실시예 4 : 타우로콜린산이 공유결합된 키토산 및 유전자 GLP-1를 포함하는 나노입자 (이하, 'CS-TCA/GLP-1'이라 함)의 제조

상기 실시예 3의 Prot-TCA 대신에 CS-TCA를 사용한 것으로 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 CS-TCA/GLP-1을 수득하였다.

입자 크기 및 제타 전위를 분석하기 위하여 D2O에 Prot-TCA/GLP-1 (실시예 3) 및 CS-TCA/GLP-1 (실시예 4)을 각각 1mg/mL로 용해시켰다.

(나노입자의 형태학적 분석)

TEM(Transmission electron microscopy) 및 광산란 입자 분석기(Dynamic Light scattering particle size analyzer)를 이용하여 Prot-TCA/GLP-1 (실시예 3)의 형태 및 입자 크기 분포를 관찰하였다.

상기 나노입자의 크기는 평균 150 nm 정도이고, 상대적으로 균일한 크기의 분포를 나타내었다.

(나노입자의 표면 전하)

제타전위 분석기(Zeta analyzer)를 이용하여 상기 실시예 3에서 제조된 나노입자의 제타전위를 측정한 결과, 양성의 제타 전위를 나타내었다. 이처럼 표면 전하가 양전하를 띤다는 것은 음전하를 띠는 GLP-1 유전자가 유전자 전달 복합체 내부에 완전히 둘러싸여 있음을 의미하고, 양성의 표면 전하는 유전자 전달 나노입자의 세포 내로의 유입을 용이하게 한다. 또한, 입자들 사이에 정전기적 반발력을 일으켜 입자들끼리의 응집 현상을 감소시킨다.

(나노입자의 안정성)

상기 실시예 3 및 4에서 제조된 나노입자의 안정성을 확인하기 위하여 겔 리타데이션(Gel retardation) 분석을 실시하였다.

겔 리타데이션 실험은 1% agaros 겔과 1x TBE buffer 용액을 사용하여 수행되었다. 본 발명의 나노입자에 봉입된 유전자 GLP-1은 0.5 ㎍/mL EtBr (ethidium bromide)로 염색되어져 겔 상에 나타났다. 상기 실험은 100V에서 30분동안 진행되었다.

그 결과, Prot-TCA에 GLP-1의 복합화 및 CS-TCA에 대한 GLP-1의 복합화는 1 : 10 이상의 몰비에서 이루어짐을 확인하였다. 특히, 실시예 3의 Prot-TCA와 GLP-1의 복합화가 1 : 150의 몰비, 실시예 4의 CS-TCA와 GLP-1의 복합화가 1 : 10의 몰비에서 이루어진 경우 GLP-1 응축으로 인한 지연 현상이 야기되어 GLP-1의 이동성이 완전히 지연되었다. 이로부터 상기 Prot-TCA 및 CS-TCA 각각은 GLP-1을 효과적으로 응축시켜 유전자 전달 복합체 Prot-TCA/GLP-1 및 CS-TCA/GLP-1가 형성되었음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 나노입자는 유전자와 복합체를 형성함으로써 유전자를 전달하는 유전자 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

(혈청 내 안정성)

상기 실시예 3 및 4에서 제조된 나노입자의 혈청 내 안정성을 확인하기 위하여 아래와 같이 실험을 실시하였다.

Prot-TCA/GLP-1(실시예 3) 및 CS-TCA/GLP-1(실시예 4)를 각각 20% 혈청 하에 37℃조건에서 48시간동안 보관한 뒤, 0.5M 의 EDTA를 처리하였다. 그런 다음, Prot-TCA/GLP-1(실시예 3) 및 CS-TCA/GLP-1(실시예 4) 각각으로부터 유전자GLP-1를 분리하기 위해 1% SDS를 첨가하였다.

그 결과, free 유전자 GLP-1과 비교하여 Prot-TCA/GLP-1(실시예 3) 및 CS-TCA/GLP-1(실시예 4) 각각에 봉입된 유전자 GLP-1는 48시간 동안 혈청으로부터 분해되지 않았으며, 혈청 내에서 매우 안정함을 확인하였다.

(pH 조건에 대한 입자 안정성)

다양한 pH 조건에서 본 발명의 나노입자의 안정성을 확인하였다.

즉, 위장관(GI tract)의 위, 십이지장 및 회장(ileum) 단편에서의 pH 조건과 유사한 pH 3, pH5 및 pH 7.4의 세 가지 pH 용액에 Prot-TCA/GLP-1(실시예 3) 및 CS-TCA/GLP-1(실시예 4) 각각을 넣고, 입자 크기를 관찰하였다. 그 결과, Prot-TCA/GLP-1 (실시예 3)및 CS-TCA/GLP-1 (실시예 4) 모두 pH 3에서 24시간까지 안정함을 확인하였다.

실험예 1 : 시험관 내(in vitro) 유전자 발현 및 트랜스웰(transwell) 연구

ASBT(Apical Sodium-dependent Bile Salt Transporter)-과발현 MDCK 세포 및 Caco-2 세포주를 사용하여 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)의 발현을 관찰하였다.

실시예 3 및 4의 유전자 전달용 나노입자에 eGFP 유전자 4 μg 을 각각 로딩한 후, 상기 세포주들로부터 성공적인 발현 및 녹색 형광을 관찰하였다.

그 다음, 이중층 세포배양 기술에서 유전자 복합체의 전달을 연구하기 위하여, 트랜스웰 플레이트의 정단 부위에서 Caco-2 단층을 배양하고, 기저 부위에서 MDCK-ASBT 세포주를 배양하였다. 그 결과 상기 나노입자들의 성공적인 전달이 관찰되었으며, 이로부터 TCA 분자는 이들 유전자 복합체의 흡수와 전달을 도와주는 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

배지에서 당 수치에 반응하여 시험관 내 GLP-1 발현을 수치화하는 GLP-1 ELISA 키트를 사용하였으며, 그 결과, GLP-1 유전자의 향상된 발현이 나타났다.

실험예 2 : 복합체의 생체 내(in vivo) 생체 분포(bio distribution)

eGFP 로딩된 실시예 3 및 4의 유전자 전달용 나노입자의 생체 내 생체 분포를 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

Balb/c 마우스를 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 치료 유전자 복합체의 경구 투여 전 12시간동안 상기 동물들을 금식시켰다. 금식 12시간 후 eGFP 유전자 100 μg을 함유하는 실시예 3 및 4의 유전자 전달용 나노입자 각각을 경구 위관영양법(oral gavage)으로 투여하였다. 투여 24시간 후 동물들을 희생시키고 공초점 현미경(confocal microscope)으로 생체 내 유전자 발현 및 시료의 생체 내 분포를 정량화하였다.

그 결과, 본 발명의 유전자 전달 나노입자로 인하여 회장과 간 단편에서의 향상된 eGFP 유전자 발현을 확인하였다. 또한, 프로타민과 키토산 각각에 공유결합된 TCA는 GI(gastrointestinal) 분해를 방지하고 eGFP의 흡수와 발현을 도와줌을 알 수 있었다.

실험예 3 : 생체 내(in vivo) GLP-1 유전자의 발현 및 혈당 수치의 조절

5주령의 ZDFR(Zucker diabetic fatty rats)을 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 실시예 3 및 4의 유전자 전달용 나노입자의 경구 투여 전 12시간동안 상기 동물들을 금식시켰다. 금식 12시간 후 실시예 3 및 4의 유전자 전달용 나노입자 100 μg을 각각 경구 투여시켰다. 투여 24시간 후 소정의 시간 간격으로 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈당 수치를 측정하였다. 놀랍게도 혈당 수치가 정상 혈당 수치로 조절되었음을 확인하였다. 5일 후, 실험동물들을 희생시키고 ELISA 키트로 회장과 간 단편에서의 GLP-1 및 인슐린의 발현을 분석하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 본 발명의 유전자 전달용 나노입자의 경구 투여 후 GLP-1 펩타이드와 인슐린 단백질의 향상된 발현이 나타났다.

실험예 4 : GLP-1 유전자 전달용 복합체의 생체 내(in vivo) 독성

4주령의 SD쥐(Sprague Dowley rats)를 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 실시예 3 및 4의 유전자 전달용 나노입자 100 μg를 각각 경구 및 정맥 투여하였다. 소정의 시간 간격으로 24시간 동안 실험동물의 혈액을 채취하여 일반 혈액 내용물(complete blood content)을 분석하고 간 및 신장의 활성을 결정하는 생물학적 마커의 발현을 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 유전자 전달 복합체를 매우 높은 농도로 투여하였을 지라도 독성이 거의 나타나지 않았다.

투여 7일 후 동물들을 희생시키고, 회장과 간 단편의 면역 조직 검사를 실시하였다. 그 결과, 조직 내 어떠한 염증도 관찰되지 않았으며, 독성 역시 거의 나타나지 않았다.

따라서, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 안전하고, 무독성이며, 당뇨병 치료에 사용가능함을 알 수 있었다.

실시예 5 : TCA가 이황화 결합으로 공유결합된 헤파린(이하, 'Hep-S-S-TCA'라 함)의 제조

Hep-S-S-TCA의 합성은 헤파린과 시스타민의 컨쥬게이트로 시작되었다. 즉, 헤파린의 카복실기는 EDC(1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)/NHS(N-bromosuccinimide) chemistry를 통해 시스타민의 아민기와 공유결합되었다.

Hep-S-S-NH2의 제조

헤파린 (100 mg)을 10 mL의 MES 버퍼 (50mmol, pH 6)에 용해시키고, 용액이 투명해질 때까지 냉욕에서 교반시켰다. 과량의 EDC (헤파린에 대해 2.4 당량)를 가하고 10분간 교반시킨 다음, 상온에서 과량의 NHS (EDC에 대해 2.5배 당량)을 가하고 10분간 교반시켰다. EDC와 NHS에 의한 카복실기 활성 후 시스타민 (100μg)을 가하고 pH 7에서 24시간동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 2차 증류수로 24시간동안 투석하고 동결건조하여 Hep-S-S-NH2를 수득하였다(도 5).

TCA -NPC의 제조

활성화된 헤파린에 TCA를 컨쥬게이션시키기 위하여, TCA (50 mmol)을 DMSO (10 mL)에 용해시킨 후 4-NPC(200mg) 및 TEA(100μg)를 가하고 상온에서 1시간동안 반응시켜 TCA-NPC를 제조하였다(도 6).

Hep-S-S- TCA의 제조

그 후 DMSO (10 mL)에 용해된 활성화된 헤파린(100μg)을 가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 반응액을 투석막(MWCO: 1000 Da)을 이용하여 매 3시간마다 매질을 바꾸면서 48시간동안 2차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 Hep-S-S-TCA을 수득하였다(수득율 80±5%, 도 7, 도 8).

실시예 6 : TCA가 이황화(Disulfide) 결합으로 공유결합된 헤파린, 유전자 GLP-1 및 프로타민을 포함하는 나노입자 (이하, 'bPEI/GLP-1/Hep-S-S-TCA'라 함)의 제조

10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)에 용해된 가지화 폴리에틸렌이민(1mg/mL)을 스톡 용액으로 사용하였다. GLP-1 유전자 (7.780 mg)를 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) (1.922 mL)에 용해시켜 GLP-1 유전자 용액을 제조하였다. gentle vortex 하에서 GLP-1 유전자 용액을 스톡 bPEI 용액에 드랍와이즈 첨가하여 bPEI/GLP-1 이온복합체 용액을 제조하였다. bPEI/GLP-1 유전자 복합체의 bPEI: GLP-1 이 1 : 20의 몰비인 경우 양성의 제타 전위 및 강한 상호작용이 나타났다.

gentle vortex 하에서 상기 bPEI/GLP-1 이온복합체 용액을 Hep-S-S-TCA 수용액에 1 : 1 (v/v)로 가하고 상온에서 30분간 배양시킨 다음, 동결건조하여 bPEI/GLP-1/Hep-S-S-TCA를 수득하였다(도 9).

Hep-S-S-TCA는 세포 내 글루타티온(glutathione) 농도에 반응하여 치료 유전자를 국부적으로 방출하도록 합성되었으며, 도 5 내지 도 7에 Hep-S-S-TCA을 제조하기 위한 반응식을 예시하였다.

헤파린에 시스타민의 컨쥬게이션은 1H NMR 및 TNBS 분석에 따라 각각 정성적 및 정량적으로 결정되었으며[도 8], 이로부터, 각각의 헤파린 분자는 5개의 이황화 결합으로 결합된 TCA 분자가 부착되어 있음을 알 수 있었다.

상기 bPEI/GLP-1 이온복합체는 겔 리타데이션 실험을 통해 bPEI에 대해 GLP-1 유전자가 1 : 20의 몰 비율로 복합화되어 있음이 확인되었다.

bPEI/GLP-1 이온복합체는 혈청 내에서 안정하였으며, Hep-S-S-TCA로 bPEI/GLP-1 이온복합체를 코팅하더라도 bPEI/GLP-1 이온복합체의 구조적 완전성을 잃지 않으면서 여전히 혈청 내 안정함을 확인하였다. 또한, TEM 분석을 통해 Hep-S-S-TCA로 bPEI/GLP-1 이온복합체를 코팅하는 경우 185 nm에서 235 nm으로 입자 크기가 증가됨을 확인하였고, 또한, Hep-S-S-TCA로 bPEI/GLP-1 이온복합체를 코팅한 후 TEM 현미경 사진에서 투명한 코팅 쉘이 관찰되었다.

다양한 pH 조건에서 bPEI/GLP-1/Hep-S-S-TCA의 안정성을 확인하였다. 즉, 위장관(GI tract)의 위, 십이지장 및 회장(ileum) 단편에서의 pH 조건과 유사한 pH 3, pH5 및 pH 7.4의 세 가지 pH 용액에 넣고, 입자 크기를 관찰하였다. 그 결과, bPEI/GLP-1 이온복합체는 pH 3에서 불안정하였지만, Hep-S-S-TCA 고분자로 코팅된 bPEI/GLP-1, 즉 bPEI/GLP-1/Hep-S-S-TCA는 Hep-S-S-TCA 고분자의 코팅으로 인해 입자 안정성이 개선되었으며, pH 3에서 24시간까지 안정함을 확인하였다. 따라서, 다당류-TCA 고분자로 코팅된 후 입자는 안정함을 확인하였다.

실험예 5 : 시험관 내(in vitro) 유전자 발현 및 트랜스웰(transwell) 연구

실시예 6의 bPEI/GLP-1/Hep-S-S-TCA에 eGFP 유전자 4 μg 을 로딩한 후, 상기 세포주들로부터 성공적인 발현 및 녹색 형광을 관찰하였다.

그 다음, 이중층 세포배양 기술에서 유전자 복합체의 전달을 연구하기 위하여, 트랜스웰 플레이트의 정단 부위에서 Caco-2 단층을 배양하고, 기저 부위에서 MDCK-ASBT 세포주를 배양하였다. 형광 분자, 로다민을 고분자 백본에 컨쥬게이트시키고 전달 및 흡수 연구를 정량화하였다.

그 결과, bPEI/eGFP 이온복합체가 Hep-S-S-TCA 로 코팅되는 경우 Caco-2 단층에서 강화된 eGFP 유전자 발현이 관찰되었으며, 이는 caco-2 세포 내 글루타티온에 의한 Hep-S-S-TCA 쉘의 깨짐때문이다. 반면, 로다민이 컨쥬게이트된 TCA는 Caco-2 단층을 통과하였다. 이로부터 쉘은 표적 유전자의 방출에 있어 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있었다.

배지에서 당 수치에 반응하여 시험관 내 GLP-1 발현을 수치화하는 GLP-1 ELISA 키트를 사용한 결과, GLP-1 유전자의 향상된 발현이 나타났다.

실험예 6 : bPEI/GLP-1/Hep-S-S-TCA의 생체 내(in vivo) 생체 분포(bio distribution)

eGFP 로딩된 실시예 6의 bPEI/GLP-1/Hep-S-S-TCA의 생체 내 생체 분포를 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

Balb/c 마우스를 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 치료 유전자 복합체의 경구 투여 전 12시간동안 상기 동물들을 금식시켰다. 금식 12시간 후 eGFP 유전자 100 μg을 함유하는 시료를 경구 위관영양법(oral gavage)으로 투여하였다. 투여 24시간 후 동물들을 희생시키고 공초점 현미경(confocal microscope)으로 생체 내 유전자 발현 및 시료의 생체 내 분포를 정량화하였다.

그 결과, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 Hep-S-S-TCA로 인하여 회장 단편에서의 향상된 eGFP 유전자 발현을 확인하였다. 이는 회장 단편에서 쉘의 방출때문이다.

실시예 7 : TCA가 공유결합된 히알루론산(HA -TCA)의 제조

TCA는 HA와 컨쥬게이션을 유도하기 위하여 초기 아미노화되었다. 아미노화된 TCA의 합성은 다음과 같다.

TCA -NH2의 제조

0℃에서 TCA (1 mmol)을 DMF(dimethylformamide) (5 mL)에 용해시키고 용액이 투명해질 때까지 교반하였다. TEA (6 mmol) 및 4-NPC (5 mmol)를 차례로 가하고 0℃에서 1시간동안 반응시킨 후 상온에서 6시간 더 교반하였다. 그런 다음 5000 rpm으로 원심분리한 뒤, 펠렛을 에틸아세테이트 (20 mL)에 분산시키고 분별깔대기로 옮기고 동량의 2차 증류수를 가하여 추출하였다. 수층을 모아 회전증발기로 남아있는 유기 용매를 제거한 뒤, 48시간동안 동결건조시켜 TCA-NPC를 수득하였다.

형성된 TCA-NPC (1mmol)를 DMF (5mL)에 용해시킨 후 4-MMP(4-mercapto-4-methylpentan-2-one) (2 mmol)을 가하고 50℃에서 60분간 교반시켰다. 그런 다음, 에틸렌 디아민 (100mmol)을 드랍와이즈 첨가하고 상온에서 16시간동안 반응시켰다. 과량의 아세톤을 가하여 생성된 침전물을 여과한 후 48시간동안 동결건조시켜 TCA-NH2를 수득하였다(도 10).

HA- TCA의 제조

TCA와 HA(hyaluronic acid)의 컨쥬게이션은 EDC/NHS chemistry를 통해 수행되었다. HA의 카복실기는 초기 pH 4, 4℃에서 EDC(200mg)로 15분간 처리되었다. 그 후 NHS(100μg)를 가하고 10분간 교반하였다. TCA-NH2(100μg)를 가하고 pH 7, 상온에서 7시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 2차 증류수로 24시간동안 투석막(MWCO: 1000 Da)을 이용하여 투석한 뒤 48시간동안 동결건조하여 HA-TCA를 수득하였다[수득율 10%, 도 11].

실시예 8 : TCA가 공유결합된 헤파린(Hep-TCA)의 제조

HA 대신 Hep를 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 Hep-TCA 를 수득하였다.

TCA의 아미노화는 TCA와 HA 또는 Hep 사이의 안정한 아미드 결합을 형성하는데 도움을 주었다. 도 11에 도시된 1H NMR 분석 결과, δ 8 ppm에서 TCA와 HA 사이의 아미드 결합 컨쥬게이션 피크가 검출되었다.

TNBS 분석을 통해 TCA의 성공적인 아미노화를 확인하였다. 이러한 결과로부터 각각의 TCA 분자는 그의 백본 내 하나의 아민 기를 가짐을 알 수 있었다. TCA로 Hep 또는 HA의 컨쥬게이션은 1H NMR 분석에 의해 확인되었다[도 11]. 1.0 내지 1.5 ppm 근처 피크들로부터 TCA 모이어티의 존재 및 3.5 내지 3.9 ppm 근처 피크들로부터 HA 모이어티의 존재가 확인되었으며, 8 ppm의 새로운 피크로부터 TCA와 HA 사이의 안정한 아미드 결합이 형성되었음이 확인되었다.

Hep 또는 HA 에 결합된 TCA 분자의 수를 정량화하기 위하여 황산 분석을 실시하였다. 이후 실험은 Hep 또는 HA와 TCA가 1 : 5의 컨쥬게이션 비율을 갖는 HA-TCA 또는 Hep-TCA으로 수행하였다. 게다가 이들의 제타 전위는 음 전하를 나타냈다.

실시예 9 : Prot/GLP-1/HA-TCA 의 제조

10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)에 용해된 Prot (1mg/mL)을 스톡 용액으로 사용하였다. GLP-1 유전자 (7.780 mg)를 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) (1.922 mL)에 용해시켜 GLP-1 유전자 용액을 제조하였다. gentle vortex 하에서 GLP-1 유전자 용액을 스톡 Prot 용액에 드랍와이즈 첨가하여 Prot/GLP-1 이온복합체 용액을 제조하였다. Prot/GLP-1 이온복합체의 Prot : GLP-1 이 1 : 20의 몰비인 경우 양성의 제타 전위 및 강한 상호작용이 나타났다.

gentle vortex 하에서 상기 Prot/GLP-1 이온복합체를 HA-TCA 수용액에 1 : 1 (v/v)로 가하고 상온에서 30분간 배양시킨 다음, 동결건조하여 prot/GLP-1/HA-TCA를 수득하였다(수득율 20%, 도 12).

실시예 10 : prot/GLP-1/Hep-TCA 의 제조

HA 대신에 Hep를 사용한 것을 제외하고는 실시예 9와 동일한 방법으로 prot/GLP-1/Hep-TCA를 수득하였다.

GLP-1 및 Prot 사이의 상이한 몰 비율을 갖는 Prot/GLP-1 이온복합체를 제조하였으며, 겔 리타데이션 실험을 통해 Prot에 대해 GLP-1 유전자가 1 : 20의 몰 비율로 복합화되어 있음이 확인되었다.

prot/GLP-1 이온복합체는 혈청 내에서 안정하였으며, Hep-TCA 또는 HA-TCA로 Prot/GLP-1 이온복합체를 코팅하더라도 Prot/GLP-1 이온복합체의 구조적 완전성을 잃지 않으면서 여전히 혈청 내 안정함을 확인하였다. 또한, TEM 분석을 통해 Hep-TCA 또는 HA-TCA로 Prot/GLP-1 이온복합체를 코팅하는 경우 185 nm에서 235 nm으로 입자 크기가 증가됨을 확인하였고, 또한, Hep-TCA 또는 HA-TCA로 Prot/GLP-1 유전자 복합체를 코팅한 후 TEM 현미경 사진에서 투명한 코팅 쉘이 관찰되었다.

다양한 pH 조건에서 입자의 안정성을 확인하였다. 즉, 위장관(GI tract)의 위, 십이지장 및 회장(ileum) 단편에서의 pH 조건과 유사한 pH 3, pH5 및 pH 7.4의 세 가지 pH 용액에 넣고, 입자 크기를 관찰하였다. 그 결과, prot/GLP-1 이온복합체는 pH 3에서 불안정하였지만, Hep-TCA 또는 HA-TCA와 같은 다당류-TCA 고분자로 코팅된 prot/GLP-1 유전자 복합체는 Hep-TCA 또는 HA-TCA와 같은 다당류-TCA 고분자의 코팅으로 인해 입자 안정성이 개선되었으며, pH 3에서 24시간까지 안정함을 확인하였다. 따라서, 다당류-TCA 고분자로 코팅된 후 입자는 안정함을 확인하였다.

실험예 7 : 시험관 내(in vitro) 유전자 발현 및 트랜스웰(transwell) 연구

실시예 9 및 10의 유전자 전달용 나노입자에 eGFP 유전자 4 μg 을 로딩한 후, 상기 세포주들로부터 성공적인 발현 및 녹색 형광을 관찰하였다.

그 다음, 이중층 세포배양 기술에서 유전자 복합체의 전달을 연구하기 위하여, 트랜스웰 플레이트의 정단 부위에서 Caco-2 단층을 배양하고, 기저 부위에서 MDCK-ASBT 세포주를 배양하였다. Hep-TCA 및 HA-TCA 각각이 코팅된 Prot/GLP-1/HA-TCA(실시예 9) 및 Prot/GLP-1/Hep-TCA(실시예 10)의 전달을 분석하였다. Caco-2 단층에서 Prot/GLP-1/HA-TCA(실시예 9) 및 Prot/GLP-1/Hep-TCA(실시예 10)로부터 eGFP의 최소한의 발현이 관찰되었다. 이로부터 쉘은 표적 유전자의 방출에 있어 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있었다.

실험예 8 : Prot/eGFP/다당류-TCA 유전자 복합체의 생체 내(in vivo) 생체 분포(bio distribution)

eGFP 로딩된 Prot/GLP-1/HA-TCA(실시예 9) 및 Prot/GLP-1/Hep-TCA(실시예 10)의 생체 내 생체 분포를 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 HA-TCA 또는 Hep-TCA로 인하여 회장 및 간 단편에서의 향상된 eGFP 유전자 발현을 확인하였다.

실험예 9 : 생체 내(in vivo) GLP-1 유전자의 발현 및 혈당 수치의 조절

5주령의 ZDFR(Zucker diabetic fatty rats)을 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 치료 유전자 복합체의 경구 투여 전 12시간동안 상기 동물들을 금식시켰다. 금식 12시간 후 Prot/GLP-1/HA-TCA(실시예 9) 및 Prot/GLP-1/Hep-TCA(실시예 10) 100 μg을 각각 경구 투여시켰다. 투여 24시간 후 소정의 시간 간격으로 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈당 수치를 측정하였다. 놀랍게도 혈당 수치가 정상 혈당 수치로 조절되었음을 확인하였다. 5일 후, 실험동물들을 희생시키고 ELISA 키트로 상이한 조직에서의 GLP-1 및 인슐린의 발현을 분석하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 GLP-1 loaded polysaccharide-TCA gene complexes 의 경구 투여 후 GLP-1 펩타이드와 인슐린 단백질의 향상된 발현이 나타났다.

실험예 10 : bile acid mediated non-viral vectors 의 생체 내(in vivo) 독성

4주령의 SD쥐(Sprague Dowley rats)를 나무로된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. 본 발명의 유전자 전달용 나노입자, 즉 prot/GLP-1/HA-TCA(실시예 9), prot/GLP-1/Hep-TCA(실시예 10) 및 bPEI/GLP-1/Hep-S-S-TCA(실시예 6)를 각각 상이한 농도로 경구 및 정맥 투여하였다. 소정의 시간 간격으로 실험동물의 혈액을 채취하여 일반 혈액 내용물(complete blood content)을 분석하고 간 및 신장의 활성을 결정하는 생물학적 마커의 발현을 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 유전자 전달용 나노입자를 매우 높은 농도로 투여하였을 지라도 독성이 거의 나타나지 않았다.

투여 7일 후 동물들을 희생시키고, 다른 장기의 면역 조직 검사를 실시하였다. 그 결과, 조직 내 어떠한 염증도 관찰되지 않았으며, 독성 역시 거의 나타나지 않았다.

따라서, 본 발명의 유전자 전달용 나노입자는 안전하고, 무독성이며, 당뇨병 치료에 사용가능함을 알 수 있었다.

실시예 11 : TCA가 아미드결합으로 공유결합된 히알루론산 및 유전자 siRNA 및 프로타민을 포함하는 나노입자 (이하, 'Prot/siRNA/HA-TCA'라 함)의 제조

DEPC (diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수에 용해된 Protamine (1mg/mL)를 스톡 용액(stock solution)으로 사용하였다. siRNA 유전자 (0.1nmoL)를 DEPC (diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수에 용해시켜 siRNA 유전자 용액을 제조하였다.

siRNA 유전자 용액을 Protamine 용액에 부드럽게 섞어주어 Protamine/siRNA 복합체를 제조하였다. 상기 Prota/siRNA 유전자 복합체를 Hep-TCA 및 HA-TCA 용액 (DEPC (diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수)에 천천히 가하면서 부드럽게 섞어주었다. 그런 다음, 상온에서 30분간 방치시킨 다음 동결건조하여 Prot/siRNA/HA-TCA를 83±5%를 수득하였다(도 13).

실험예 11 : 생체 내(in vivo) siRNA의 간암세포 크기 관찰

실험방법: 6-7주령의 Balb/c mice를 이용하여 1 x 10⁵ cells/mouse로 0.1 mL의 DMEM에 분산을 시킨 후 mouse의 신장에 주사를 한다. 10분 후, mouse를 마취시켜 신장을 제거하는 수술을 시행한 후 IVIS 이미지를 이용하여 생체내의 종양의 성장을 확인한다.

분석방법 :

간암을 발생시킨 쥐에 약물을 경구투여 주사한 후 총 16일간 IVIS 이미지 시스템을 이용 하여 종양의 크기를 분석한다. 또한 동시에 쥐의 생존율을 측정한다. (생존율 = 생존 수 / 투여 군 마리 수)

16일간의 치료가 끝난 후 쥐를 해부하여 간을 채취 후 사진을 찍고 간에 발생된 종양의 Nodule의 크기에 따라 그 수를 확인하여 기록한다. 그 결과를 도 14 내지 도 17에 도시하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 실시예에 대해 상세히 기술되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야에 있어서 통상의 지식을 가진 사람이라면, 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명을 여러 가지로 변형하여 실시할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 앞으로의 실시예들의 변경은 본 발명의 기술을 벗어날 수 없을 것이다.

Claims

담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자; 및
유전자;
를 포함하되,
상기 담즙산 또는 이의 유도체는 디옥시콜린산 (deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 이온성 고분자는 양이온성 고분자 또는 음이온성 고분자로,
상기 양이온성 고분자는 키토산, 글리코키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 음이온성 고분자는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate)에서 선택되고;
상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 친수성의 이온성 기를 가지고 있으며, 나노입자의 표면에 위치하는 유전자 전달용 나노입자.
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제 1항에 있어서,
상기 이온성 고분자가 음이온성 고분자인 경우 키토산, 글리코키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine), 폴리에틸렌이민 (PEI: polyethyleneimine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 고분자를 더 포함하는 것, 유전자 전달용 나노입자.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
상기 유전자는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA(deoxyribonucleic acid), 단일가닥 또는 이중가닥 RNA(ribonucleic acid), 플라스미드 형태 DNA, 단일가닥 또는 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 리보자임, 촉매적 RNA 및 뉴클레오타이드 중에서 선택된 하나 이상인, 유전자 전달용 나노입자.
제 1항에 있어서,
상기 담즙산 또는 이의 유도체와 이온성 고분자는 1 : 1 내지 1 : 300의 몰비로 공유결합되는 것인, 유전자 전달용 나노입자.
제 1항에 있어서,
상기 나노입자의 크기는 100 내지 300 nm인, 유전자 전달용 나노입자.
제 1항에 있어서,
상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 이온성 고분자 및 유전자는 1 : 1 내지 1 : 200의 몰비로 결합되는 것, 유전자 전달용 나노입자.
제 1항에 있어서,
상기 나노입자의 N/P 비(담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 이온성 고분자의 질소 원자 개수/유전자의 인산염 원자 개수)는 1 내지 200인, 유전자 전달용 나노입자.
담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1, Glucagon like peptide-1)를 포함하되,
상기 담즙산 또는 이의 유도체는 디옥시콜린산 (deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 이온성 고분자는 양이온성 고분자 또는 음이온성 고분자로, 상기 양이온성 고분자는 키토산, 글리코키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 음이온성 고분자는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate)에서 선택되고;
상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 친수성의 이온성 기를 가지고 있으며, 나노입자의 표면에 위치하는 글루카곤 유사 펩타이드-1 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 이온성 고분자 및 siRNA를 포함하되,
상기 담즙산 또는 이의 유도체는 디옥시콜린산 (deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 이온성 고분자는 양이온성 고분자 또는 음이온성 고분자로, 상기 양이온성 고분자는 키토산, 글리코키토산, 프로타민, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 음이온성 고분자는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate)에서 선택되고;
상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 친수성의 이온성 기를 가지고 있으며, 나노입자의 표면에 위치하는 siRNA 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학 조성물.
제 14항 또는 제 15항에 있어서,
상기 약학 조성물은 경구 투여용인 약학 조성물.