KR101737313B1 - Genetic Marker for Detecting Infectious Myonecrosis Virus, and Method for Detecting Infectious Myonecrosis Virus Using the Same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 전염성 근괴사증 바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 전염성 근괴사증 바이러스(Infectious Myonecrosis Virus, IMNV)의 특정 핵산을 증폭시킨 다음, 증폭산물을 특이적으로 인식하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)을 혼성화시키고, 혼성화된 산물의 온도 조절을 통해 온도별 융해곡선을 얻고, 상기 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 전염성 근괴사증 바이러스를 검출하거나 새우의 상기 바이러스의 감염 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a genetic marker for detecting infectious mycorrhagic virus and a method for detecting a virus using the same. More particularly, the present invention relates to a method for amplifying a specific nucleic acid of an infectious myonecrosis virus (IMNV) (Peptide Nucleic Acid, PNA), and the temperature of the hybridized product is controlled to obtain a temperature-dependent melting curve. From the melting curve, the infectious mycotic virus is detected from the melting temperature, The present invention relates to a method for confirming whether or not the virus is infected with the virus.
새우류는 전 세계 수산물 교역 물량의 17%를 차지하며, 새우 생산량의 75%를 양식에 의존하고 있다 (FAO, 2009). 세계적으로 새우 양식 산업이 크게 성장하였음에도 불구하고, 질병 발생에 의한 손실 또한 계속적으로 증가하여 실제로 1994년부터 새우류의 바이러스성 질병에 의한 손실이 매년 30억 달러 ($US) 이상으로 집계되고 있다.Shrimps account for 17% of the world's marine trade and depend on farming for 75% of shrimp production (FAO, 2009). Despite the rapid growth of shrimp farming industry worldwide, the incidence of disease incidence has also increased steadily, and since 1994, the shrimp viral disease losses have been in excess of $ 3 billion annually.
전염성 근괴사증 (IMN)은 가장 최근에 새로이 발생한 질병으로서 2002년 브라질 남동부의 흰다리 새우 양식장에서 처음 발생하여 2004년 브라질의 다른 지역으로 확산되었고 2006년 브라질로부터 수입한 새우 종묘를 양식한 인도네시아 자바섬에서 발병하여 이후 태국, 중국 등 동남아시아 전역으로 전파되었으며 특히 흰다리새우에 가장 큰 위협으로 인식되고 있다. Infectious mycoses (IMN) is the most recent new disease that first occurred in P. vannamei shrimp farms in southeastern Brazil in 2002 and spread to other parts of Brazil in 2004, and in 2006, And has spread to all of Southeast Asia including Thailand and China. Especially, it is recognized as the biggest threat to P. vannamei.
전염성 근괴사증 (IMN)은 국내 미발생 전염병으로서 제2종 수산생물전염병으로 지정되어 방역조치가 필요적인 법정전염병으로 분류되고 있었으나, 최근 국내에서도 흰다리새우 종묘장에서도 검출된 사례가 있어서 국내유입 및 확산 차단을 위해 중점적으로 모니터링이 필요한 실정이다.Infectious myonecrosis (IMN) has been classified as a non - pandemic infectious disease in Korea and designated as a
전염성 근괴사증을 유발하는 바이러스는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)로 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)는 토티바이러스의 일종이고, 토티바이러스 과 계열에 속하는 람블편모충 바이러스(Giardia lablia virus; GLV)와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 게놈은 7560 bp의 단일, 이중 나선 RNA 분자로 구성되어 있으며, 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)에 감염되면 대규모 질병이 발생하고 양식 개체 수 내 폐사율이 높아지는 것으로 알려지고 있으며, 주된 숙주 종은 페네우스 바나메이(Penaeus vannamei)로 알려져 있다. The virus that causes infectious myofacial infection is the infectious myopathic virus (IMNV), the infectious myenteric virus (IMNV) is a type of torticoll virus and is closely related to the Giardia lablia virus (GLV) . The genome of the infectious mycoses virus (IMNV) is composed of 7560 bp single- and double-stranded RNA molecules. It is known that infection with infectious myonecrosis virus (IMNV) causes large-scale disease and increases mortality in aquaculture population , The main host species being known as Penaeus vannamei.
전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 급성 감염 단계에 들어선 새우는 줄무늬근(골격근) 부분에 집중적으로, 또는 광범위하게 하얗게 괴저된 부분이 나타나며 특히 배마디와 꼬리 지느러미 부근이 괴사되어 빨갛게 변하는 새우도 일부 있을 수 있는데, 질병의 영향을 심하게 받은 새우는 빈사 상태가 되며, "스트레스"를 유발하는 일이 생긴 직후에는 폐사율이 급격히 높아져 이후 며칠간 지속될 수 있다.Shrimp entering the stage of acute infection of the infectious myonecrosis virus (IMNV) have intensely or wholly irregular parts in the striatum (skeletal muscle) part, and some shrimp that are reddish due to necrosis near the paralysis and caudal fin However, shrimp, which are severely affected by disease, are in a state of dying, and immediately after the occurrence of "stress", the mortality rate increases rapidly and can continue for a few days.
현재 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)를 진단하기 위한 방법 중 분자진단을 사용한 진단 방법 및 키트 등이 개발되어 있으며 일반적인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)법을 수행한 다음, 상기 반응의 증폭산물을 전기영동법으로 확인하거나, 형광 프로브 또는 SYBR Green을 이용하여 Real-time PCR법 등으로 확인하는 방법이 주로 사용되고 있다.Diagnostic methods and kits using molecular diagnostics have been developed as methods for diagnosing infectious myonecrosis virus (IMNV), and a general polymerase chain reaction (PCR) method is performed. Is confirmed by electrophoresis or by real-time PCR using a fluorescent probe or SYBR Green.
특히, 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)를 진단하기 위해서는 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE) 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code)의 기준에 따른 일반적인 종래 PCR(conventional PCR)법을 수행하여 PCR 증폭산물을 전기영동으로 확인한 다음, 증폭산물을 클로닝하고 다시 정제된 플라스미드 DNA의 염기서열을 Sanger sequencing 등의 방법을 통하여 확인하는 작업을 거치고 있어, 절차가 복잡하고 질병진단을 위한 분석에 많은 시간이 소모되는 단점이 있다. In particular, the World Organization for Animal Health (OIE), in order to diagnose the infectious mycoses virus (IMNV) The PCR amplification product was confirmed by electrophoresis using conventional conventional PCR according to the criteria of the Aquatic Animal Health Code. Then, the amplified product was cloned and the base sequence of the purified plasmid DNA was amplified by Sanger sequencing, and so on. Thus, the procedure is complicated and the analysis for diagnosing diseases is time consuming.
또한, OIE 기준에 따라서 PCR 증폭산물의 전기영동 확인 시 객관적인 분석이 불가능하거나(gray zone), 희미한 PCR 증폭산물을 클로닝 벡터를 이용하여 클로닝한 후 시퀀싱을 통하여 상기 증폭산물의 염기서열을 재확인하는 등의 검증 단계를 거친다. 이러한 검증 단계는 비특이적 산물(non-specific PCR band)의 서열을 확인하여 검증하는 방식으로 분석 절차가 많고 많은 시간을 소모하는 등의 문제점을 가지고 있다. 특히, 종래 PCR법에 의해 증폭산물이 양성으로 확인되면(시퀀싱 판정 이전), 수산생물전염병의 감염이 우려되는 경우에 해당되어 방역조치를 취하게 됨에 따라, 이후 시퀀싱에 따라 위양성으로 판정되는 경우 검사기관의 신뢰성 하락 및 어업인의 피해 발생 사례도 있으므로, 신속, 정확하게 법정 전염병을 진단하는 방법의 개선이 절실하다. In addition, it is impossible to perform objective analysis in confirming the electrophoresis of the PCR amplification product according to the OIE standard (gray zone) or to clone the faint PCR amplification product using the cloning vector, and then to confirm the nucleotide sequence of the amplification product through sequencing . This verification step is a method of verifying and verifying the sequence of a non-specific PCR band, which has many analysis procedures and consumes a lot of time. Particularly, when the amplification product is confirmed to be positive by the conventional PCR method (before the determination of sequencing), the infection is considered to be a case of infection of aquatic life communicable disease, There are cases in which the reliability of the institution is lowered and the damage caused by the fishermen is damaged. Therefore, it is urgent to improve the method of diagnosing the infectious disease of the court quickly and accurately.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 판별 및/또는 검출용 유전자 마커를 발굴하고, 상기 유전자 마커에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머를 이용하여 증폭 및 융해곡선을 나타내게 함으로써 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)를 간단·신속·정확하게 판별할 수 있는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Under these technical backgrounds, the present inventors have discovered a gene marker for discrimination and / or detection of infectious myonecrosis virus (IMNV), and showed an amplification and melting curve using a peptide nucleic acid and a primer specific to the gene marker, The present invention has been accomplished by confirming that there is an effect that a necrotizing virus (IMNV) can be discriminated easily, quickly, and accurately.
본 발명의 목적은 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 검출용 유전자 마커, 및 PNA 프로브를 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a genetic marker for the detection of infectious mycoses virus (IMNV), and a PNA probe.
본 발명의 다른 목적은 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 검출용 프라이머 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a primer for detecting infectious myonecrosis virus (IMNV) and a kit for detecting infectious myopathic virus (IMNV) comprising the PNA probe.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시킨 다음, 생성된 유전자 마커 서열단편에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키고, 상기 PNA 프로브의 혼성화에 따른 Tm값을 얻어 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 감염 여부를 확인하는 방법을 제공하는 데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a method for producing a PNA probe, which comprises preparing a single-stranded gene marker sequence fragment using the primer, hybridizing the PNA probe to the generated gene marker sequence fragment, obtaining a Tm value according to hybridization of the PNA probe, And to provide a method for identifying an infection of the myofacial virus (IMNV).
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 검출용 유전자 마커를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a genetic marker for detecting infectious mycoses virus (IMNV) represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명은 또한, 상기 유전자 마커에 상보적으로 결합하는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 검출용 PNA 프로브를 제공한다.The present invention also provides a PNA probe for detecting infectious mycoses virus (IMNV), which is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, which is complementarily bound to the gene marker.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.The present invention also provides a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a composition and a kit for detecting infectious mycoses virus (IMNV) comprising the PNA probe.
본 발명은 또한, The present invention also relates to
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; (a) extracting a target nucleic acid from a specimen sample;
(b) 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 염기서열을 주형(template)으로 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 단계;(b) generating a single-stranded genetic marker sequence fragment using a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ. ID. NO. 2 as a template as the nucleotide sequence of the infectious mycoses virus (IMNV);
(c) 상기 단일가닥으로 생성된 유전자 마커 서열단편에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;(c) hybridizing a PNA probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 to the single-stranded gene marker sequence fragment;
(d) 상기 (c) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및 (d) obtaining a temperature-dependent melting curve while increasing the temperature of the product hybridized with the PNA probe in the step (c); And
(e) 상기 (d) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)를 검출하는 단계(e) detecting infectious mycoses virus (IMNV) from the fusion temperature through analysis of the melting curve obtained in step (d)
를 포함하는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 검출 방법을 제공한다.
(IMNV) detection method comprising the steps < RTI ID = 0.0 > of: < / RTI >
본 발명은 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 검출용 유전자 마커를 선정하고, 상기 유전자 마커에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머를 이용하여 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)를 간단·신속·정확하게 검출함으로써, 새우 양식에 가장 큰 위협으로 인식되고 있는 상기 바이러스의 감염 및 확산을 조기에 차단할 수 있는 효과가 있다.
The present invention is based on the finding that a gene marker for detection of infectious myonecrosis virus (IMNV) is selected and the infectious myonecrosis virus (IMNV) is easily, quickly, and accurately detected using a peptide nucleic acid and a primer specific to the genetic marker, The infection and spread of the virus, which is recognized as the biggest threat, can be prevented early.
도 1은 종래 사용되던 MeltingArray 방법과 본원발명에 따른 MeltingArray 방법의 각 단계별 기술적 특징을 나타내는 개념도이다.
도 2는 종래 사용되던 MeltingArray 방법에 비해 본원발명에 따른 MeltingArray 방법에 의해 발휘되는 효과를 비교한 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 유전자 마커, 프라이머 및 펩티드핵산을 포함하고 있는 공통서열(Consensus Sequence)을 나타낸 것이다.
도 4는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 OIE 기준에 따른 검출용 PCR법으로 도출된 증폭산물의 전기영동 결과이다.
도 5는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 프라이머 및 펩티드핵산을 이용한 바이러스 검출 방법에 따른 증폭곡선과 융해곡선 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 OIE 기준에 따른 검출용 PCR법에 따른 바이러스 검출 결과와 본 발명의 프라이머 및 펩티드핵산을 이용한 바이러스 검출 결과의 민감도를 비교한 결과이다. FIG. 1 is a conceptual diagram showing technical features of each step of a conventional MeltingArray method and a MeltingArray method according to the present invention.
FIG. 2 is a schematic diagram comparing an effect exerted by the MeltingArray method according to the present invention compared to a MeltingArray method used in the past.
FIG. 3 shows a consensus sequence including genetic markers, primers and peptide nucleic acids of infectious mycoses virus (IMNV) according to the present invention.
FIG. 4 shows the electrophoresis results of the amplification product derived from the detection PCR method according to the OIE standard of the infectious mycoses virus (IMNV).
FIG. 5 shows an amplification curve and a melting curve graph according to a virus detection method using primer and peptide nucleic acid of infectious mycoses virus (IMNV).
FIG. 6 shows the result of comparing the virus detection result obtained by the PCR for detection according to the OIE standard of the infectious mycoses virus (IMNV) with the sensitivity of the virus detection result using the primer and the peptide nucleic acid of the present invention.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.
본 발명자들은 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE)의 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code) 기준에 따른 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 특정 유전자 마커에 대한 PCR 산물의 특이/비특이적 증폭여부를 시퀀싱 단계 없이 또는 시퀀싱 단계 전에 검출하고, 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 새우)를 검출하는 방법을 개발하고자 하였다. 그 결과, 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 특이적 염기서열을 가지는 마커 및 상기 마커에 대응되는 바이러스 검출용 프라이머 및 펩티드핵산 프로브(peptide nucleic acid probe, PNA probe)를 이용하여 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)를 간단·신속·정확하게 검출할 수 있게 되었다.
The present inventors have carried out specific / nonspecific amplification of PCR products to specific gene markers of infectious mycoses virus (IMNV) according to the World Organization for Animal Health (OIE) Aquatic Animal Health Code standard And to develop a method for detecting the infected individual (for example, shrimp) without the sequencing step or before the sequencing step. As a result, a marker having an infectious myonecrosis virus (IMNV) -specific nucleotide sequence and a marker nucleic acid probe (PNA probe) Can be detected simply, quickly, and accurately.
더욱 상세하게 설명하면, (1) 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)를 검출할 수 있는전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 특이적인 검출용 PNA 프로브(서열번호 3) 및 프라이머(서열번호 2)를 포함하는 올리고머 혼합물(oligomer mixture); 및 (2) 상기 프라이머를 이용하여 생성된 PCR 증폭산물을 주형으로 단일가닥 DNA를 생성하고 상기 단일가닥에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키기 위한 SSG 버퍼(single strand generation buffer);를 포함하는 조성물 또는 키트(MeltingArray 포함)를 이용하여 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)을 검출할 수 있었다.
More specifically, (1) oligonucleotides comprising a PNA probe (SEQ ID NO: 3) and a primer (SEQ ID NO: 2) specific for infectious mycoses virus (IMNV) capable of detecting infectious mycoses virus (IMNV) An oligomer mixture; And (2) a SSG buffer (single strand generation buffer) for producing a single strand DNA from the PCR amplification product generated using the primer as a template and hybridizing the single strand with the PNA probe MeltingArray) was used to detect infectious mycoses virus (IMNV).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 검출용 유전자 마커에 관한 것이다.Accordingly, the present invention relates, in one aspect, to a genetic marker for the detection of infectious mycoses virus (IMNV) represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 검출용 프라이머에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a primer for detection of infectious mycoses virus (IMNV) represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a PNA probe for detecting infectious mycoses virus (IMNV) represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
본 발명에서 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.In the present invention, the PNA probe may be combined with a quencher fluorescent material capable of quenching reporter and reporter fluorescence at both ends thereof. The reporter may be selected from the group consisting of 6-carboxyfluorescein, Texas red, HEX (2 ', 4', 5 ', 7', - tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 and Cy5 And the quencher may be one or more selected from the group consisting of TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, and Dabcyl, but is not limited thereto. Preferably, the quencher is Dabcyl (FAM-labeled) can be used.
펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)이란 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로, 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었으며, 자연계에서는 발견되지 않아 화학적인 방법으로 인공 합성될 수 있다. Peptide nucleic acid (PNA) is a pseudo-DNA in which a nucleic acid base is linked by a peptide bond rather than a phosphate bond. It was first synthesized by Nielsen et al. In 1991 and can be artificially synthesized by a chemical method .
PNA는 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는 장점이 있다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. PNA is a gene recognition material such as LNA (locked nucleic acid) or MNA (Mopholino nucleic acid), and its basic structure is composed of polyamide. PNA has an excellent affinity and selectivity, and is highly resistant to nucleic acid degrading enzymes and thus is not degraded into existing restriction enzymes. In addition, it has the advantage of being easy to store and not to be easily decomposed because of high thermal / chemical property and stability.
PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다PNAs form double strands through hybridization reactions with natural nucleic acids of complementary base sequences. When the length is the same, the PNA / DNA double strand is more stable than the DNA / DNA double strand, and the PNA / RNA double strand is more stable than the DNA / RNA double strand. In addition, PNA is more resistant to double stranding due to single base mismatch, and therefore has the ability to detect single nucleotide polymorphism (SNP) better than natural nucleic acid
또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection)할 수 있게 된다.In addition, the PNA-DNA binding power is superior to the DNA-DNA binding force, resulting in a nucleotide miss match of about 10 to 15 ° C. Using this difference in binding force, it is possible to detect SNP (Single-nucleotide polymorphism) and nucleotide change of In / Del.
본 발명에 따른 PNA 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 바이러스 종류에 따른 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP))이 포함되도록 12~18mer 길이로 제작할 수 있다. 이 때, PNA 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 PNA 프로브를 디자인할 수도 있고, 같은 길이의 PNA 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, PNA 프로브는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 염기변이 또는 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High Resolution Melt) 방법에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어서 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도 변화 또는 보정을 필요로 하고, 이 때문에 2개 이상의 염기변이 또는 SNP가 나타날 경우에는 분석이 어려웠지만, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 PNA 프로브의 서열과 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 간편하게 분석이 가능하다.Although the length of the PNA nucleotide sequence according to the present invention is not particularly limited, the length of the PNA nucleotide sequence according to the present invention may be 12 to 18 mers in length so as to include a specific nucleotide sequence (for example, a base mutation or single nucleotide polymorphism (SNP) have. At this time, it is possible to design the PNA probe to have the desired Tm value by adjusting the length of the PNA probe, or to adjust the Tm value by changing the base sequence of the PNA probe of the same length. In addition, since PNA probes have higher binding strength than DNA and have a higher basic Tm value, they can be designed to have a shorter length than DNA, so that neighboring base mutations or SNPs can be detected. According to the existing HRM (High Resolution Melt) method, the difference in Tm value is very low at about 0.5 ° C, requiring additional analysis program or fine temperature change or correction. Therefore, when two or more base mutations or SNPs appear, analysis However, the PNA probe according to the present invention is not affected by the sequence and the SNP of the PNA probe, and thus can be easily analyzed.
본 발명에서와 같이, PNA 프로브가 13개의 염기서열을 포함하는 경우에는, 가운데 염기서열 중 하나 이상의 위치에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, PNA 프로브는 염기서열의 가운데 부분에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 포함하여 구조적인 변형을 가질 수 있고, 이를 통해 완전한 혼성화를 이루는 표적 핵산(perfect match)과의 융해온도(Tm) 차이를 더욱 크게 할 수 있다.
As in the present invention, when the PNA probe comprises 13 base sequences, it is preferable that the base sequence has a sequence corresponding to a base mutation or SNP site of the virus at one or more positions in the middle base sequence. In addition, the PNA probe may have a structural modification including a base mutation of the virus or a sequence corresponding to the SNP site in the middle of the base sequence, and thereby the fusion temperature with a perfect match (hybridization) Tm) can be further increased.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 프라이머, 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to compositions and kits for the detection of infectious myopathic virus (IMNV) comprising the primers and the PNA probes.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.The kit of the present invention may optionally comprise reagents necessary for carrying out a target nucleic acid amplification reaction (e. G., PCR reaction) such as a buffer, a DNA polymerase joiner and deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Alternatively, the kit of the present invention may also include various polynucleotide molecules, reverse transcriptase, various buffers and reagents, and antibodies that inhibit DNA polymerase activity. In addition, the kit may be readily determined by those skilled in the art having the teachings of the present disclosure to determine the optimal amount of reagent used in a particular reaction. Typically, the equipment of the present invention may be fabricated as a separate package or compartment comprising the aforementioned components.
상기 키트를 이용하면, PNA 프로브에 의한 용해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 검출이 가능하다.
Using the above kit, it is possible to effectively detect a single base mutation of a target nucleic acid and a mutation due to a deletion or insertion of a base through analysis of a dissolution curve by a PNA probe, thereby detecting an infectious mycoses virus (IMNV) Do.
본 발명자들은 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)에 대하여 OIE 기준에 따른 검출용 PCR 산물에 상응하는 유전자 염기서열을 비교 분석하여, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 검출용 프라이머를 이용하여 합성된 단일가닥의 PCR 증폭산물에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시켜 얻은 융해곡선으로부터 융해온도(Tm)를 확인하여 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 검출하고 상기 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있었다.The present inventors comparatively analyzed the gene base sequence corresponding to the PCR product for detection according to the OIE standard for the infectious mycoses virus (IMNV) and found that a single strand synthesized using a primer for detection represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: (Tm) from the melting curve obtained by hybridizing a PNA probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 to the PCR amplification product of the present invention to detect the infectious mycoses virus (IMNV) and confirm the infection of the virus.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, Thus, the present invention, in another aspect,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; (a) extracting a target nucleic acid from a specimen sample;
(b) 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 유전자 염기서열을 주형(template)으로 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 단계;(b) generating a single-stranded genetic marker sequence fragment using a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 as a template, using the gene sequence of the infectious mycoses virus (IMNV) as a template;
(c) 상기 단일가닥으로 생성된 유전자 마커 서열단편에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;(c) hybridizing a PNA probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 to the single-stranded gene marker sequence fragment;
(d) 상기 (c) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및 (d) obtaining a temperature-dependent melting curve while raising the temperature of the product hybridized with the PNA probe in the step (c); And
(e) 상기 (d) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)를 검출하는 단계;를 포함하는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 검출 방법에 관한 것이다.
and (e) detecting infectious mycoses virus (IMNV) from the melting temperature through analysis of the melting curve obtained in step (d).
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 단일가닥의 유전자 마커 서열단편은 단일가닥 형성용 버퍼(single strand generation buffer, SSG buffer)를 추가로 첨가하여 생성시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the single-stranded gene marker sequence fragment may be generated by further adding a single strand generation buffer (SSG buffer) in the step (b).
본 발명에 있어서, 상기 단일가닥 형성용 버퍼는 DNA 중합효소, dNTPs(deoxynucleotides) 및 안정제(Stabilizer)를 함유할 수 있고, 여기서, DNA 중합효소는 Taq 중합효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the buffer for single strand formation may contain a DNA polymerase, dNTPs (deoxynucleotides) and a stabilizer, wherein the DNA polymerase may be Taq polymerase, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서는 종래 프라이머 쌍을 이용하여 상기 유전자 마커 염기서열을 증폭하고, TaqMan 프로브를 추가로 포함시켜 증폭곡선을 얻을 수 있다.In the step (b) of the present invention, the amplification curve can be obtained by amplifying the gene marker sequence using a conventional primer pair and further including a TaqMan probe.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행할 수 있다.
In the present invention, the amplification can be performed by a real-time polymerase chain reaction (PCR) method.
본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 새우 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, a "specimen sample" includes various specimens, and preferably a biosample is analyzed using the method of the present invention. More preferably, the sample may be a sample mixed with the virus species described in the present invention or a sample of an individual infected with the virus (e.g., shrimp, etc.), and may be a plant, an animal, a human, a fungus, a bacterium, Samples can be analyzed. When analyzing a sample of mammalian or human origin, the sample may be from a particular tissue or organ. Representative examples of tissues include binding, skin, muscle or nervous tissue. Representative examples of organs include, but are not limited to, eyes, brain, lung, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, small intestine, testes, Line and inner blood vessels. The biological sample to be analyzed includes any cells, tissues, fluids from the biological source, or any other medium that can be well analyzed by the present invention, including human, animal, human or animal Lt; RTI ID = 0.0 > a < / RTI > In addition, the biological sample to be analyzed includes a body fluid sample, which may be a blood sample, serum, plasma, lymph, milk, urine, feces, eye milk, saliva, semen, brain extract And tonsil tissue extracts.
본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(염기변이 또는 SNP 포함)을 의미하며, 생리·생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다. The term "target nucleic acid", "synthetic DNA" or "synthetic oligos" of the present invention refers to a nucleic acid sequence (including a base mutation or a SNP) to be detected, and includes a nucleotide sequence encoding a protein having a physiological / biochemical function, Specific region of the nucleic acid sequence of the target gene, and is annealed or hybridized with the primer or probe under hybridization, annealing or amplification conditions.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다."Hybridization" of the present invention means that complementary single-stranded nucleic acids form a double-stranded nucleic acid. Hybridization can occur either in perfect match between two nucleic acid strands, or even in the presence of some mismatching bases. The degree of complementarity required for hybridization can vary depending on the hybridization conditions, and can be controlled, in particular, by temperature.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the melting curve analysis may be performed by the FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis) method.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(염기변이 또는 SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.The PNA probe comprising the reporter and the quencher of the present invention hybridizes with the target nucleic acid and generates a fluorescence signal. As the temperature rises, the fluorescence signal is rapidly extinguished with the target nucleic acid at the optimal melting temperature of the probe, (Base mutation or SNP) of the target nucleic acid can be detected through analysis of the high-resolution fusion curve obtained from the fluorescence signal according to the fluorescence signal. The PNA probe exhibits a predicted melting temperature (Tm) value in the case of a perfect match with the target nucleic acid sequence, but incompletely hybridizes with the target nucleic acid in which the base mutation is present, (Tm) value.
본 발명의 '염기변이'는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다. The 'base mutation' of the present invention is characterized by a mutation in the base sequence of the target nucleic acid, which includes not only single nucleotide polymorphism (SNP) but also mutation of base, substitution, deletion or insertion , The PNA probe of the present invention can be analyzed by melting curve analysis that the SNP of the target nucleic acid or the base of the target nucleic acid has been substituted, deleted or inserted so that the mutation occurs.
본 발명의 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.The PNA probe of the present invention can bind a quencher fluorescent material capable of quenching reporter and reporter fluorescence at both ends. The reporter may be selected from the group consisting of 6-carboxyfluorescein, Texas red, HEX (2 ', 4', 5 ', 7', - tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 and Cy5 And the quencher may be one or more selected from the group consisting of TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, and Dabcyl, but is not limited thereto. Preferably, the quencher is Dabcyl (FAM-labeled) can be used.
PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe)가 있다.The Tm value changes depending on the nucleotide of the DNA complementary to the nucleotide of the PNA probe, and it is easy to develop an application using the same. PNA probes are analyzed using a hybridization method different from the hydrolysis method of TaqMan probes. Molecular beacon probes, scorpion probes, .
PNA 프로브를 이용한 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 SNP) 분석을 위해서는 우선 특정 염기서열을 인식하는 염기(들)가 포함된 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트(종래 프라이머 쌍: OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따름) 및 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 유전자 마커 염기서열을 주형(template)으로 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 프라이머만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.In order to analyze a specific base sequence (for example, base mutation or SNP) using a PNA probe, a probe containing a base (s) recognizing a specific base sequence and a forward / reverse primer set for PCR (a conventional primer Pair: according to the criteria of the Office of International Epizootics (OIE)) and a primer that generates a single-stranded genetic marker sequence fragment from a template of a genomic marker sequence amplified by the primer set Do. The PCR can be performed using conventional methods. After the PCR is completed, a melting process is required. The intensity of fluorescence is measured every 0.5 ° C to obtain a Tm value. Particularly, general real-time PCR (real-time PCR) apparatuses are widely used and advantageous in that they do not require additional program purchase such as HRM (High Resolution Melting) or detailed temperature change.
본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상(표적)의 특정 염기서열(염기변이 또는 SNP 포함)에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다. The fusion curve analysis of the present invention is a method of analyzing the melting temperature of a double-stranded nucleic acid formed from DNA or RNA as a target nucleic acid and a probe. Such a method is called a fusion curve analysis because it is performed, for example, by Tm analysis or analysis of the melting curve of the double chain. Hybrid (double-stranded DNA) of the target single-stranded DNA of the detection sample and the probe is formed using a probe complementary to a specific base sequence (including base mutation or SNP) of the detection target (target). Subsequently, the hybrid formed body is subjected to a heat treatment, and dissociation (melting) of the hybrid due to temperature rise is detected by fluctuation of signals such as absorbance. Then, the Tm value is determined based on the detection result to determine the presence or absence of the specific base sequence. The Tm value is higher as the homology of the hybrid construct is higher, and lower as the homology is lower. For this reason, a Tm value (evaluation reference value) is previously obtained for a hybrid formed product of a specific base sequence to be detected and a probe complementary thereto, and the Tm value (measured value) between the target single- If the measured value is equal to the evaluation reference value, it can be determined that a specific base sequence exists in the match, that is, the target DNA. If the measured value is lower than the evaluation reference value, mismatch, that is, It can be judged that it does not.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.The fluorescence melting curve analysis of the present invention is a method of analyzing a melting curve using a fluorescent substance, and more specifically, a melting curve can be analyzed using a probe containing a fluorescent substance. The fluorescent material may be a reporter and a quencher, and may be an intercalating fluorescent material.
본 발명의 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열(염기변이, SNP 포함)의 유무로 바이러스 유형의 검출 및/또는 판별이 가능하다.
The real-time polymerase chain reaction (PCR) method of the present invention allows a fluorescent substance to be interchelated in a double strand DNA chain in a PCR process, amplifies the PCR product, By analyzing the pattern of the melting curve, especially the temperature (Tm) at which the DNA is melted (denatured), the specific nucleotide sequence (including base mutations, SNPs) The virus type can be detected and / or discriminated.
도 1은 종래 사용되던 MeltingArray 방법과 본원발명에 따른 MeltingArray 방법의 각 단계별 기술적 특징을 나타내는 개념도이고, 도 2는 종래 사용되던 MeltingArray 방법에 비해 본원발명에 따른 MeltingArray 방법에 의해 발휘되는 효과를 비교한 모식도이다. 상기 도에서 나타낸 바와 같이, PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호를 발생시킬 수 있으며, 온도가 높아짐에 따라 프로브의 적정 융해온도(Tm)에서 표적 핵산으로부터 빠르게 융해되어 형광신호를 소광시킨다. 본 발명은 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석(fluorescence melting curve analysis; FMCA)을 통하여, 표적 핵산의 존재 유무 및 염기차이 유무를 검출할 수 있는 것이다. 본 발명에 따른 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이며, 표적 핵산이 존재하지 않을 경우 융해온도 (Tm) 값을 보이지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
FIG. 1 is a conceptual diagram showing technical features of each step of a conventional MeltingArray method and a MeltingArray method according to the present invention. FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a comparison of effects exhibited by the MeltingArray method according to the present invention, to be. As shown in the figure, the PNA probe hybridizes with the target nucleic acid and can generate a fluorescence signal. As the temperature increases, the PNA probe is rapidly fused from the target nucleic acid at the optimal melting temperature (Tm) of the probe to extinguish the fluorescence signal. The present invention can detect presence or absence of a target nucleic acid and presence or absence of a base difference through a high-resolution fluorescence melting curve analysis (FMCA) obtained from the fluorescence signal according to the temperature change. The PNA probe according to the present invention exhibits a predicted melting temperature (Tm) value in the case of perfect match with the target nucleic acid sequence, but incompletely hybridizes with the target nucleic acid in which the base mutation is present, (Tm) value when the target nucleic acid is not present, and no melting temperature (Tm) value when the target nucleic acid is not present.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
실시예Example
1: One:
전염성 Infectious
근괴사증Myopathy
바이러스( virus(
IMNVIMNV
) 검출용 유전자 ) Detection gene
마커Marker
, 및 상기 바이러스에 특이적인 , And a virus-specific
프라이머primer
및 PNA And PNA
프로브Probe
제작 making
전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 특이적 유전자 마커를 도출하기 위하여 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 하기 표 1과 같은 11종의 바이러스 염기서열을 분석하였고, 분석결과를 바탕으로 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 특이적 유전자 마커를 포함하는 공통서열(Consensus Sequence)를 확보하고자 하였다. 이 때, 공통서열에 사용된 IUB code Name을 하기 표 2에 정리하였다.
To derive IMNV-specific gene markers, 11 kinds of virus bases as shown in Table 1 listed in the nucleotide database (DB) of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Sequence analysis was performed and the consensus sequence including the specific gene marker of infectious myonecrosis virus (IMNV) was secured based on the analysis results. At this time, the IUB code names used in the common sequence are summarized in Table 2 below.
전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 공통서열(Consensus Sequence) 분석 결과, 5'-TGGACGACTGCTG-3'(서열번호 1)로 표시되는 염기서열을 확보하고, 상기 염기서열을 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 검출용 유전자 마커로 선정하였다.As a result of the consensus sequence analysis of the infectious mycoses virus (IMNV), the nucleotide sequence shown by 5'-TGGACGACTGCTG-3 '(SEQ ID NO: 1) was obtained and the nucleotide sequence was detected by infection with mycobacterial virus (IMNV) Were selected.
또한, 상기 유전자 마커의 단일가닥 DNA 생성용 프라이머로 서열번호 2로 표시되는 프라이머 및 상기 유전자 마커의 혼성화용 프로브로 서열번호 3으로 표시되는 PNA 프로브를 제작하였다.In addition, a PNA probe represented by SEQ ID NO: 3 was prepared using the primer shown in SEQ ID NO: 2 as a primer for single-strand DNA synthesis of the gene marker and the probe for hybridization of the gene marker.
도 3는 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 염기서열 일부와 이로부터 도출된 유전자 마커, 프라이머, PNA 프로브를 포함하는 염기서열도이고 PNA 프로브가 혼성화되는 유전자 마커 부위는 특히 파란색으로 표시하였다.
FIG. 3 is a nucleotide sequence diagram including a part of a nucleotide sequence of infectious mycoses virus (IMNV) and a gene marker, a primer and a PNA probe derived therefrom, and a gene marker site where a PNA probe is hybridized is shown in blue in particular.
상기 표 3에 나타난 바와 같은 염기서열과 리포터 및 소광자로 PNA 프로브를 제작하였다. PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법으로 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다. 표적 핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다.
PNA probes were prepared with the nucleotide sequences shown in Table 3, the reporter and the quencher. PNA probes were synthesized by HPLC purification method from Panagene (Korea) and the purity of all synthesized probes was confirmed by mass spectrometry. The unnecessary secondary structure of the probe was avoided for more effective binding with the target nucleic acid.
실시예Example 2: 전염성 2: Infectious 근괴사증Myopathy 바이러스( virus( IMNVIMNV ) 검출용 ) For detection MeltingArrayMeltingArray 키트의Of kit 최적화 optimization
실시예 1에서 제작된 PNA 프로브 및 프라이머를 이용하여, 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 핵산 샘플에 대하여 증폭곡선 및 용해곡선을 도출하였고, 이를 분석하여 PCR 산물의 검증을 수행함으로써 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV) 검출을 최적화하고자 하였다. 이때, OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따른 바이러스 검출용 프라이머 세트(종래 프라이머 쌍, 표 4)를 이용하였다.
Using the PNA probes and primers prepared in Example 1, amplification curves and dissolution curves were obtained for the samples of infectious myonecrosis virus (IMNV) nucleic acid, and analyzed by PCR to confirm that the infectious mycoses virus (IMNV ) Detection. At this time, a virus detection primer set (conventional primer pair, Table 4) according to the Office of International Epizootics (OIE) standard was used.
MeltingArray 반응은 CFX96 Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, PCR 산물을 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 SSG 버퍼(single strand generation buffer) 및 프로브의 결합하는 가닥의 상보적인 방향인 단일 프라이머를 이용하였다. 상기 SSG 버퍼의 조성은 2X의 사용 농도로 nTaq-HOT(0.2 unit/㎕), nTaq-HOT buffer(4mM MgCl2 함유), dNTP 혼합물(A, T, G, C 각각 0.4mM) 및 안정제(Stabilizer)를 포함한다. The MeltingArray reaction was performed using a CFX96 Real-Time system (BIO-RAD, USA) and the PCR products were mixed with a single strand generation buffer (SSG buffer) to generate a single-stranded target nucleic acid, Direction was used. The composition of the SSG buffer was composed of nTaq-HOT (0.2 unit / μl), nTaq-HOT buffer (containing 4 mM MgCl 2 ), dNTP mixture (0.4 mM each of A, T, G and C) and a stabilizer ).
MeltingArray 반응을 위한 반응물의 조성은 표 5에 나타내었다. MeltingArray 키트의 master mix을 만든 후 상기 PCR 산물을 1~3㎕ 첨가하여 분석을 수행하였다.
The composition of the reactants for the MeltingArray reaction is shown in Table 5. After making a master mix of the MeltingArray kit, 1 ~ 3 ㎕ of the PCR product was added and analyzed.
표 6은 반응물의 혼성화 반응 조건을 나타낸 것으로, PCR 산물로부터 단일가닥 DNA을 형성하는 단계, 변성 단계, 및 PNA 프로브를 혼성화하고, 상기 혼성화된 산물의 온도를 높이는 과정을 나타낸 것이다.
Table 6 shows the hybridization reaction conditions of the reactants, showing the steps of forming single strand DNA from the PCR product, denaturing step, and hybridizing the PNA probe and raising the temperature of the hybridized product.
(Single Strand Generation)Single strand formation
(Single Strand Generation)
15-20 cycle
15-20 cycles
(Probe binding)Probe coupling
(Probe binding)
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석으로 63~69 ℃의 Tm값에서 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)를 검출할 수 있음을 확인하였다.
As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the infectious myonecrosis virus (IMNV) can be detected at a Tm value of 63 to 69 ° C by a melting curve analysis using a PNA probe.
실시예Example
3: 전염성 3: Infectious
근괴사증Myopathy
바이러스( virus(
IMNVIMNV
) 검출용 ) For detection
MeltingArrayMeltingArray
키트의Of kit
민감도 확인 Sensitivity check
OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따른 바이러스 검출용 프라이머 세트를 이용한 PCR 산물을 각각 1, 0.5, 025. 0.125㎕씩 2% 아가로오스 겔에 로딩하여 전기영동하고, 이를 MeltingArray 키트로 분석하였다.PCR products using a virus detection primer set according to OIE (Office of International Epizootics) were loaded on 2% agarose gel by 1, 0.5, and 0,25 μl, respectively, and electrophoresed, Lt; / RTI >
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 아가로스 겔에 전기영동 했을 때 band 확인이 가능한 0.25㎕ 까지 PNA 프로브를 이용한 융해곡선으로 명확한 융해피크를 나타내어 본원발명에 따른 MeltingArray 키트의 민감도를 확인할 수 있었고, 아가로오스 겔에 band를 확인할 수 있을 정도의 PCR 산물 농도이면 본원 발명에 따른 MeltngArray 키트로 검출 할 수 있음을 확인하였다.
As a result, as shown in FIG. 6, the MeltingArray kit according to the present invention was able to confirm the sensitivity of the MeltingArray kit according to the present invention by showing a clear melting peak with a melting curve using a PNA probe up to 0.25 쨉 l which can be confirmed when the gel was electrophoresed on the agarose gel, It was confirmed that the PCR product concentration was such that the band could be confirmed on the agarose gel, using the MeltngArray kit according to the present invention.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
<110> Republic of Korea(National Fisheries Research and Development Institute) <120> Genetic Marker for Detecting Infectious Myonecrosis Virus, and Method for Detecting Infectious Myonecrosis Virus Using the Same <130> P16-B233 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genetic Marker for IMNV <400> 1 tggacgactg ctg 13 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 agcgctgagt ccagtcttg 19 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 3 cagcagtcgt cca 13 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional Primer(Forward) <400> 4 ggcacatgct cagagaca 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional Primer(Reverse) <400> 5 agcgctgagt ccagtcttg 19 <110> Republic of Korea (National Fisheries Research and Development Institute) <120> Genetic Marker for Detecting Infectious Myonecrosis Virus, and Method for Detecting Infectious Myonecrosis Virus Using the Same ≪ 130 > P16-B233 <160> 5 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genetic Marker for IMNV <400> 1 tggacgactg ctg 13 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 agcgctgagt ccagtcttg 19 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 3 cagcagtcgt cca 13 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional Primer (Forward) <400> 4 ggcacatgct cagagaca 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional Primer (Reverse) <400> 5 agcgctgagt ccagtcttg 19
Claims (8)
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)의 유전자 염기서열을 주형(template)으로 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 단계;
(c) 상기 단일가닥으로 생성된 유전자 마커 서열단편에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 전염성 근괴사증 바이러스(IMNV)를 검출하는 단계.Method for detecting infectious mycoses virus (IMNV) comprising the steps of:
(a) extracting a target nucleic acid from a specimen sample;
(b) generating a single-stranded genetic marker sequence fragment using a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 as a template, using the gene sequence of the infectious mycoses virus (IMNV) as a template;
(c) hybridizing a PNA probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 to the single-stranded gene marker sequence fragment;
(d) obtaining a temperature-dependent melting curve while increasing the temperature of the product hybridized with the PNA probe in the step (c); And
(e) detecting infectious mycoses virus (IMNV) from the melting temperature through analysis of the melting curve obtained in step (d).
8. The method of claim 7, wherein the buffer for single strand formation comprises DNA polymerase, dNTPs (deoxynucleotides) and a stabilizer.
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