KR101734529B1

KR101734529B1 - Method of screening compound for treating sepsis and pharmaceutical composition for treating sepsis

Info

Publication number: KR101734529B1
Application number: KR1020150064278A
Authority: KR
Inventors: 서한극; 황정석
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2015-05-08
Filing date: 2015-05-08
Publication date: 2017-05-11
Also published as: KR20160131562A

Abstract

본 발명은 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용을 확인하는 단계를 포함하는 패혈증 치료제의 스크리닝 방법 및 SIRT1 단백질 또는 SIRT1 단백질의 활성화제를 포함하는 패혈증 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 패혈증 치료제의 스크리닝 방법은 패혈증 치료제의 선별을 효과적으로 수행할 수 있는 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있으며, 본 발명의 패혈증 치료용 약학 조성물은 효과적인 패혈증 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention provides a method for screening a therapeutic agent for sepsis comprising the step of confirming the physical interaction of a nuclear HMGB1 protein and a SIRT1 protein, and a pharmaceutical composition for treating sepsis comprising an activator of SIRT1 protein or SIRT1 protein.
The screening method of the therapeutic agent for sepsis of the present invention can be effectively used as a screening method capable of effectively screening a therapeutic agent for sepsis, and the pharmaceutical composition for treating sepsis of the present invention can be effectively used as a therapeutic agent for sepsis.

Description

패혈증 치료제의 스크리닝 방법 및 패혈증 치료용 약학 조성물{Method of screening compound for treating sepsis and pharmaceutical composition for treating sepsis}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a method for screening a therapeutic agent for sepsis and a pharmaceutical composition for treating sepsis,

본 발명은 패혈증 치료제의 스크리닝 방법 및 패혈증 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 핵내 단백질의 상호작용을 확인하는 단계를 포함하는 패혈증 치료제의 스크리닝 방법 및 패혈증 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.TECHNICAL FIELD The present invention relates to a screening method for treating sepsis and a pharmaceutical composition for treating sepsis, and more particularly, to a screening method for treating sepsis and a pharmaceutical composition for treating sepsis.

비-히스톤 크로마틴-관련 핵 단백질인 고-이동성 그룹 박스 1(High-mobility group box 1, HMGB1)은 대부분의 진핵 세포에 높게 발현되어 있는 진화적으로 보존된 단백질이다(Muller et al., 2004). 핵 내에서, HMGB1는 DNA를 구부리고 핵단백질 복합체의 조립을 촉진시키는 구성 단백질로 작용하며, 이에 의해 전사, 복제, 재조합, 수선, 및 게놈 안정성 유지를 포함한 다양한 핵 기능을 가능하게 한다(Ueda 및 Yoshida, 2010). 반면에, HMGB1는 무균성 염증 및 감염시에 세포외부 환경으로 방출된다(Andersson 및 Tracey, 2011). 대식세포(Wang et al., 1999; Gardella et al., 2002), 수지상세포(Dumitriu et al., 2005), 및 자연살해세포(Semino et al., 2005)를 포함하는 활성화된 면역능 세포는 리포폴리사카라이드(LPS) 및 다른 위험 신호를 포함한 병원체- 또는 손상-관련 분자적 패턴에 노출에 의해 활성화 후에는 HMGB1를 능동적으로 분비한다. HMGB1 길항제 및 중화성 항-HMGB1 항체는 패혈증, 관절염, 대장염, 및 허혈재관류(ischemia reperfusion)와 같은 염증 상태의 심각성을 현저히 감소시키므로, 질환 발병에 있어서 세포외부 HMGB1 신호의 중요성은 확립된 바 있다(Wang et al., 1999; Dave et al., 2009; Harris et al., 2012; Andrassy et al., 2008). 이러한 사실로써 활성화된 면역 세포로부터 HMGB1 방출 및 이러한 과정을 제어하는 조절적 신호전달 경로를 기전적으로 이해하는 것이 중요하다는 것을 알 수 있다.High-mobility group box 1 (HMGB1), a non-histone chromatin-related nuclear protein, is an evolutionarily conserved protein highly expressed in most eukaryotic cells (Muller et al., 2004 ). Within the nucleus, HMGB1 acts as a constitutive protein that bends DNA and facilitates the assembly of the nuclear protein complex, thereby enabling a variety of nuclear functions including transcription, replication, recombination, repair, and maintenance of genomic stability (Ueda and Yoshida , 2010). On the other hand, HMGB1 is released into the extracellular environment during aseptic inflammation and infection (Andersson and Tracey, 2011). Activated immune cells, including macrophages (Wang et al., 1999; Gardella et al., 2002), dendritic cells (Dumitriu et al., 2005), and natural killer cells (Semino et al., 2005) HMGB1 is active after activation by exposure to pathogenic- or damage-related molecular patterns including polysaccharide (LPS) and other danger signals. The importance of the extracellular HMGB1 signal in disease outbreaks has been established since HMGB1 antagonists and neutralizing anti-HMGB1 antibodies significantly reduce the severity of inflammatory conditions such as sepsis, arthritis, colitis, and ischemia reperfusion Wang et al., 1999; Dave et al., 2009; Harris et al., 2012; Andrassy et al., 2008). This fact suggests that it is important to understand HMGB1 release from activated immune cells and to master the regulatory signaling pathways that control this process.

대부분의 사이토카인 분비와는 달리, 일반적인 분비 신호 펩티드가 없는 HMGB1는 소포체- 및 골지-비의존적 비통상적 단백질 분비 경로를 거쳐 방출된다(Gardella et al., 2002; Lu et al., 2014). HMGB1는 2개의 비-전통적 핵 방출 신호를 가지므로, 핵으로부터 세포질로 계속적으로 왕복한다. 그러나, 그 평형은 비활동 세포에서 거의 완전히 단백질의 핵 축적으로 기울어 있다(Bonaldi et al., 2003). 대조적으로, 2개 핵 위치 서열(nuclear localization sequence, NLS) 내의 라이신 잔기의 2개 주요 클러스터의 과-아세틸화를 통하여 LPS 또는 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)와 같은 염증성 신호에 의한 단핵구의 활성화에 의해 HMGB1는 핵으로부터 세포질로 이동한다(Bonaldi et al., 2003). 이러한 아세틸화-관련 이동은 핵 엑스포틴(exportin)인 염색체 부위 유지 1(chromosome region maintenance 1, CRM1)에 의해 매개된다(Tang et al., 2007). TNF-α에 의한 세린 인산화는 대식세포에서의 HMGB1의 핵세포질성 이동에 있어서 또 다른 필수적인 단계이다(Youn 및 Shin, 2006). 이러한 발견은 HMGB1의 번역 후 수식이 HMGB1의 방출에 있어서 결정적임을 시사하지만, 이러한 특정 수식이 어떻게 HMGB1 방출을 제어하는지에 대하여는 불명확하다(Bonaldi et al., 2003; Youn 및 Shin, 2006). Unlike most cytokine secretions, HMGB1, which lacks the usual secretory signal peptide, is released via an endogenous and Golgi-independent, non-conventional protein secretion pathway (Gardella et al., 2002; Lu et al., 2014). Since HMGB1 has two non-conventional nuclear emission signals, it continually reciprocates from the nucleus to the cytoplasm. However, the equilibrium is almost completely skewed to the nuclear accumulation of proteins in inactive cells (Bonaldi et al., 2003). In contrast, over-acetylation of two major clusters of lysine residues within the nuclear localization sequence (NLS), such as LPS or tumor necrosis factor-alpha, TNF-alpha, HMGB1 is transferred from the nucleus to the cytoplasm by activation of monocytes by inflammatory signals (Bonaldi et al., 2003). This acetylation-related migration is mediated by chromosomal region maintenance 1 (CRM1), a nuclear exportin (Tang et al., 2007). Serine phosphorylation by TNF-α is another essential step in the nuclear cytoplasmic transport of HMGB1 in macrophages (Youn and Shin, 2006). This finding suggests that post-translational modification of HMGB1 is crucial for the release of HMGB1, but it is unclear as to how this particular formula controls HMGB1 release (Bonaldi et al., 2003; Youn and Shin, 2006).

효모 침묵 정보 조절자 2(yeast silent information regulator 2)의 포유류 상동기관인 SIRT1은, 히스톤 및 비-히스톤 기질에 광범위하게 작용하는 다수의 유전 프로그램을 통제하는 NAD+-의존적 III류 단백질 탈아세틸화제이다(Bordone 및 Guarente, 2005; Xie et al., 2013; Feige 및 Auwerx, 2008). SIRT1은 히스톤, 전사 인자, 및 공동-조절자의 탈아세틸화를 통한 복잡한 복합체 유전자 발현 프로그램을 조정함으로써, 미토콘드리아 생합성, 세포 노쇠, 에너지 대사, 스트레스 내성, 및 염증과 같은 다양한 대사성 및 병리생리학적 과정의 결정적인 조절자로 알려져 있다(Bordone 및 Guarente, 2005; Xie et al., 2013; Feige 및 Auwerx, 2008). 또한, SIRT1은 히스톤, 및 핵 인자 카파 B 및 활성화 단백질 1과 같은 결정적 전사 인자를 탈아세틸화시켜 다양한 염증-관련 유전자의 전사 수준의 억제를 가져옴으로써 염증 반응의 조절에 직접적으로 관여한다(Yeung et al., 2004; Zhang et al., 2010). 또한, SIRT1의 정도 및 기능에서의 감소는 만성적 염증 조건과 밀접하게 관련되어 있다(Rajendrasozhan et al., 2008). SIRT1 활성화제는 TNF-α, 단핵구 화학유인성 단백질 1, 및 인터루킨(IL)-8의 생성을 억제하여 세포성 염증 조절 및 염증 반응에서의 SIRT1의 중심 역할을 강조하는 반면, SIRT1의 넉아웃 또는 넉다운은 사이토카인 방출의 증가로 이어진다(Yang et al., 2007; Dong et al., 2014).SIRT1, a mammalian homologue of yeast silent information regulator 2, is a NAD + -dependent class III protein deacetylating agent that regulates a number of genetic programs that act extensively on histone and non-histone substrates (Bordone And Guarente, 2005; Xie et al., 2013; Feige and Auwerx, 2008). SIRT1 modulates complex complex gene expression programs through deacetylation of histones, transcription factors, and co-regulators, resulting in a variety of metabolic and pathophysiological processes such as mitochondrial biosynthesis, cell senescence, energy metabolism, stress tolerance, (Bordone and Guarente, 2005; Xie et al., 2013; Feige and Auwerx, 2008). In addition, SIRT1 is directly involved in the regulation of the inflammatory response by deacetylating a critical transcription factor such as histone, nuclear factor kappa B and activating protein 1, thereby inhibiting the transcription level of various inflammation-related genes (Yeung et & al., 2004; Zhang et al., 2010). In addition, a reduction in the degree and function of SIRT1 is closely related to chronic inflammatory conditions (Rajendrasozhan et al., 2008). SIRT1 activators inhibit the production of TNF-α, monocyte chemoattractant protein 1, and interleukin (IL) -8, and emphasize the central role of SIRT1 in cellular inflammation regulation and inflammatory responses, while knockout or knockdown Leads to an increase in cytokine release (Yang et al., 2007; Dong et al., 2014).

최근, SIRT1를 상향조절(upregulation)시키거나 활성화시키면, 시험관내 및 생체내에서 확인되지 않은 기전에 의해 LPS-프라임된(primed) 또는 식이제한-매개된 HMGB1 방출이 억제된다는 것이 밝혀졌다(Hwang et al., 2014; Rickenbacher et al., 2014).Recently, upregulation or activation of SIRTl has been shown to inhibit LPS-primed or dietary rest-mediated HMGB1 release by in vitro and in vivo unconfirmed mechanisms (Hwang et < RTI ID = 0.0 > al., 2014; Rickenbacher et al., 2014).

그러나, 현재까지 알려진 HMGB1 단백질 방출과 관련한 SIRT1의 상세한 작용 기전은 알려진 바 없으며, 보다 효과적으로 염증, 특히 패혈증을 치료하기 위하여 HMGB1 단백질의 위치 이동 기전을 이용한 패혈증 치료제의 스크리닝 방법이 요구된다.However, the detailed mechanism of action of SIRT1 in relation to HMGB1 protein release known so far is unknown, and a method for screening a therapeutic agent for sepsis using HMGB1 protein localization mechanism is required to more effectively treat inflammation, particularly sepsis.

대한민국 공개특허공보 제2013-0038832호Korean Patent Publication No. 2013-0038832 대한민국 공개특허공보 제2015-0031413호Korean Patent Laid-Open Publication No. 2015-0031413 대한민국 공개특허공보 제2015-0018809호Korean Patent Publication No. 2015-0018809 미국 특허 S 8,669,113호U.S. Patent No. 8,669,113

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본 발명자들은 HMGB1 단백질 방출과 관련한 SIRT1의 상세한 작용 기전에 대하여 연구하던 중, 세포에서 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질이 물리적 상호작용을 통하여 HMGB1 단백질의 세포내 이동 및 세포외부로의 방출을 조절한다는 것을 발견하였다.As a result of studying the detailed mechanism of action of SIRT1 related to HMGB1 protein release, the present inventors discovered that HMGB1 protein and SIRT1 protein in the nucleus regulate intracellular and extracellular release of HMGB1 protein through physical interaction Respectively.

따라서, 본 발명은 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용을 확인하는 단계를 포함하는 패혈증 치료제의 스크리닝 방법 및 SIRT1 단백질 또는 SIRT1 단백질의 활성화제를 포함하는 패혈증 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, the object of the present invention is to provide a method for screening for a therapeutic agent for sepsis comprising the step of confirming the physical interaction of the nuclear HMGB1 protein and the SIRT1 protein, and a pharmaceutical composition for treating sepsis comprising an activator of SIRT1 protein or SIRT1 protein do.

본 발명의 일 태양에 따라, 패혈증 치료제의 스크리닝 방법으로, (a) 세포를 배양하는 단계; (b) 단계(a)의 세포에 염증 자극 인자를 처리하는 단계; (c) 단계(b)의 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계; (d) 단계(c)의 세포에서 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용의 수준을 측정하는 단계; 및 (e) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용의 증가를 나타내는 시험 물질을 패혈증 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이 제공된다.According to one aspect of the present invention, there is provided a method of screening for a therapeutic agent for sepsis comprising the steps of: (a) culturing a cell; (b) treating the cells of step (a) with an inflammatory stimulating factor; (c) contacting the test substance to the cell of step (b); (d) measuring the level of physical interaction of the nuclear HMGB1 protein and the SIRT1 protein in the cells of step (c); And (e) screening a test substance exhibiting an increase in the physical interaction of the HMGB1 protein and the SIRT1 protein with a sepsis treatment agent as compared to a control not treated with the test substance.

일 구현예에서, 단계(b)의 상기 염증 자극 인자는 리포폴리사카라이드 또는 마우스 종양 괴사 인자-α일 수 있다.In one embodiment, the inflammatory stimulator of step (b) can be a lipopolysaccharide or mouse tumor necrosis factor-a.

일 구현예에서, 상기 단계(d)의 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용의 수준은 공동면역침강법에 의해 확인될 수 있다.In one embodiment, the level of physical interaction of the HMGB1 protein and the SIRT1 protein of step (d) can be ascertained by co-immunoprecipitation.

일 구현예에서, 단계(e)의 상기 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용의 증가는 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 동시 발현의 증가, 또는 SIRT1 단백질의 세포외부 방출의 감소일 수 있다.In one embodiment, the increase in the physical interaction of the HMGB1 protein and the SIRT1 protein of step (e) may be an increase in the co-expression of the nuclear HMGB1 protein and the SIRT1 protein, or a decrease in the extracellular release of the SIRT1 protein.

일 구현예에서, 단계(e)의 상기 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용의 증가는 HMGB1 단백질의 A 박스의 탈아세틸화, 바람직하게는 HMGB1 단백질의 N-말단 28, 29 및 30번 잔기의 탈아세틸화에 의한 것일 수 있다.In one embodiment, an increase in the physical interaction of the HMGB1 protein and the SIRT1 protein of step (e) is achieved by deacetylation of the A box of the HMGB1 protein, preferably of the N-terminal 28, 29 and 30 residues of the HMGB1 protein Or by deacetylation.

또한, 본 발명의 일 태양에 따라, SIRT1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 패혈증 치료용 약학 조성물이 제공된다.Further, according to one aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for treating sepsis, comprising a SIRT1 protein or a gene encoding the SIRT1 protein.

또한, 본 발명의 일 태양에 따라, SIRT1 단백질의 활성화제를 포함하는 패혈증 치료용 약학 조성물이 제공된다.In addition, according to one aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for treating sepsis comprising an activator of SIRT1 protein.

일 구현예에서, 상기 SIRT1 단백질의 활성화제는 레스베라트롤일 수 있다.In one embodiment, the activator of the SIRT1 protein may be resveratrol.

본 발명에 의해, 대식세포 및 내독소혈증 동물 모델에서 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질이 물리적 상호작용을 통하여 HMGB1 단백질의 세포내 이동 및 세포외부로의 방출이 조절된다는 것이 발견되었으며, SIRT1 단백질의 탈아세틸화에 의하여 HMGB1 단백질과의 물리적 상호작용 및 나아가 HMGB1 단백질의 세포외부 방출을 조절함으로써, 내독소혈증 동물 모델에서 현저히 증가된 생존율을 나타내는 것으로 밝혀졌다.According to the present invention, it has been found that intracellular migration and exocytosis of HMGB1 protein are regulated through physical interaction of nuclear HMGB1 protein and SIRT1 protein in animal models of macrophages and endotoxemia, and deacetylation of SIRT1 protein Lt; RTI ID = 0.0 > HMGB1 < / RTI > protein, and furthermore the extracellular release of HMGB1 protein, thereby significantly increasing survival in animal models of endotoxemia.

따라서, 본 발명의 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용을 확인하는 단계를 포함하는 패혈증 치료제의 스크리닝 방법 및 SIRT1 단백질 또는 SIRT1 단백질의 활성화제를 포함하는 패혈증 치료용 약학 조성물은 패혈증 치료제의 선별을 효과적으로 수행할 수 있는 스크리닝 방법 및 효과적인 패혈증 치료제로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 규명한 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 상호작용 기전에 의하여 염증성 반응의 원인에 대한 분자적 기전을 이해함으로써 신규 항-염증 약물의 개발에 기여할 것이다.Therefore, a method for screening a therapeutic agent for sepsis comprising the step of confirming the physical interaction between the intracorneal HMGB1 protein and the SIRT1 protein of the present invention, and a pharmaceutical composition for treating sepsis comprising an activator of SIRT1 protein or SIRT1 protein, A screening method that can be effectively performed, and an effective therapeutic agent for sepsis. In addition, understanding the molecular mechanism of the cause of the inflammatory reaction by the interaction mechanism between the HMGB1 protein and the SIRT1 protein identified in the present invention will contribute to the development of a new anti-inflammatory drug.

도 1은 HMGB1 및 SIRT1 간 직접적 상호작용을 나타내는 결과이다.
(A)는 HEK293T 세포를 표시된 플라스미드로 48시간 동안 공동-형질주입시킨 후, 전-세포 용해물을 제조하여 IgG 또는 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물 및 총 용해물(input)을 항-Flag, 항-Myc, 및 항-β-액틴 항체로 면역블럿 분석을 수행하여 HMGB1, SIRT1, 및 β-액틴을 각각 검출하였다. 전-세포 용해물의 2%를 input으로 사용하였다.
(B) HEK293T 세포를 Flag-태그된 HMGB1로 48시간 동안 형질주입시켜 전-세포 용해물을 글루타치온-세파로오즈 4B 비즈에 고정된 재조합 GST 또는 GST-SIRT1 융합 단백질과 함께 20시간 동안 배양시켰다. 비즈-결합된 단백질을 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다. GST 및 GST-융합된 단백질을 폰소 S(Ponceau S)로 염색하였다.
(C) HEK293T 세포에서 각 융합 단백질의 형광을 공초점 현미경으로 시각화하였다. HMGB1 및 SIRT1이 동일한 위치에 존재한다는 것은 병합 이미지(Merge)에서 노란색의 존재로써 알 수 있다(기준자는 10 μm임).
(D) Flag-태그된 HMGB1 구조체를 도식적으로 나타내었다.
(E) 및 (F) HEK293T 세포를 Myc-SIRT1 및, Flag-HMGB1-FL 또는 결실 돌연변이를 포함하는 플라스미드로 48시간 동안 공동-형질주입시켰다. 전-세포 용해물을 항-Flag 항체로 면역침강시켰다.
도 2는 HMGB1 및 SIRT1 간 직접적 상호작용을 나타내는 결과이다.
(A) HEK293T 세포를 Flag-HMGB1 및 Myc-SIRT1로 48시간 동안 공동-형질주입시킨 후, 전-세포 용해물을 제조하여 IgG 또는 항-Myc 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물 및 총 용해물(input)을 항-Flag, 항-Myc, 및 항-β-액틴 항체로 면역블럿 분석하여 각각 HMGB1, SIRT1, 및 β-액틴을 검출하였다. 전-세포 용해물의 2%를 input으로 사용하였다.
(B) 표시된 배양 조건(Protein induction by IPTG) 하에서 pGEX4T-1-SIRT1로 형질전환된 BL21 세포로부터 용해성 GST-융합 SIRT1의 상당량을 얻었다. 모든 박테리아 펠렛은 1% NP-40와 함께 초음파 처리로 용해시켜 원심분리하였다. 용해성 GST-융합 SIRT1를 포함하는 상청액 및 동일 부피의 8 M 우레아로 가용화한 펠렛을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시키고, 쿠마씨 블루(Coomassie blue)로 염색하였다.
(C) Flag-태그된 HMGB1 구조체를 도식적으로 나타내었다.
(D) HEK293T 세포를 Myc-SIRT1 및, Flag-HMGB1 FL 또는 결실 돌연변이를 포함하는 플라스미드로 48시간 동안 공동-형질주입시킨 후, 전-세포 용해물을 제조하여 항-Myc 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물 및 총 용해물(input)을 상기와 같은 방법으로 면역블럿 분석하였다.
(E) HEK293T 세포를 Flag-태그된 HMGB1 결실 돌연변이로 48시간 동안 형질주입시킨 후, 전-세포 용해물을 제조하여 글루타치온-세파로오즈 4B 비즈에 고정된 GST-SIRT1 융합 단백질 또는 재조합 GST와 20시간 동안 배양하였다. 비즈-결합된 단백질을 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다. GST 및 GST-융합된 단백질을 폰소 S로 염색하였다.
도 3은 LPS가 SIRT1로부터의 분리를 거쳐 HMGB1 방출을 촉진시킨 결과를 나타낸다.
(A), (B) 및 (C) Flag-HMGB1 및/또는 Myc-SIRT1로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 LPS(100 ng/ml), Poly(I:C)(50 μg/ml), IFN-γ(40 ng/ml), 또는 TNF-α(20 ng/ml)와 함께 3시간 동안 배양한 후, 전-세포 용해물을 항-Flag 항체((A) 및 (C)) 또는 항-Myc 항체(B)로 면역침강시키고, 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다.
(D) 및 (E) Flag-HMGB1를 발현하는 HEK293T 세포를 표시된 자극의 존재 또는 비존재 하에서 3시간 동안 배양하였다. 전-세포 용해물을 글루타치온-세파로오즈 4B 비즈에 고정된 재조합 GST 또는 GST-SIRT1 융합 단백질과 함께 20시간 동안 배양한 후, 풀 다운 또는 면역침강시켰다. GST 및 GST-융합된 단백질을 폰소 S로 염색하였다.
(F) Flag-HMGB1 및 Myc-SIRT1로 48시간 동안 공동-형질주입된 RAW 264.7 세포를 LPS(100 ng/ml)의 존재 또는 비존재 하에서 6시간 동안(상호작용을 위해) 또는 24시간 동안(HMGB1 방출을 위해) 배양하였다. 전-세포 용해물을 항-HMGB1 항체와 면역침강시켜 SIRT1과의 상호작용을 결정하였다. 방출된 HMGB1를 검출하기 위하여, 동일 부피의 후 배양액(medium)을 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다.
도 4는 단핵구 세포 계통에서의 HMGB1의 자극-유도 방출 및 아세틸화 수준을 나타낸다.
(A) Flag-HMGB1 및 Myc-SIRT1로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 LPS(100 ng/ml) 존재 또는 비존재 하에서 3시간 동안 배양한 후, 전-세포 용해물을 제조하여 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물 및 총 용해물(input)을 항-Flag, 항-Myc, 및 항-β-액틴 항체로 면역블럿 분석하여 HMGB1, SIRT1, 및 β-액틴을 각각 검출하였다. 전-세포 용해물의 2%를 input으로 사용하였다.
(B) 및 (C) 60 mm 배양 접시에 접종된 세포를 60%(confluency) 성장하도록 하고, 무혈청 배지에서 LPS(100 ng/ml), Poly(I:C)(50 μg/ml), IFN-γ(40 ng/ml), 또는 TNF-α(20 ng/ml)로 표시된 시간 동안(B) 또는 24시간 동안(C) 자극시켰다. 배양 배지로 방출된 HMGB1를 검출하기 위하여, 동일 부피의 후 배양액을 웨스턴 블럿 분석하였다. 폰소 S 염료를 대조군으로 사용하였다.
(D) 표시된 자극으로 6시간 동안 처리된 세포 군에서, 전-세포 용해물을 제조하여 항-HMGB1 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물을 항-아세틸-라이신 및 항-HMGB1 항체로 면역블럿 분석하여 아세틸화된 HMGB1 및 세포내 HMGB1을 각각 검출하였다.
(E) HEK293T 세포를 LPS(100 ng/ml)로 표시된 시간 동안 처리하였다. 전-세포 용해물을 제조하여 항-HMGB1 항체로 면역침강킨 후, 항-아세틸-라이신 및 항-HMGB1 항체로 면역블럿 분석을 수행하여 아세틸화된 HMGB1 및 세포내 HMGB1를 각각 검출하였다. 결과를 평균±표준편차로 나타내었다(n = 3, ^*p < 0.01 비처리 군과 비교시).
도 5는 HMGB1가 가역적으로 아세틸화되는 라이신 잔기를 포함한다는 결과를 나타낸다.
(A) HEK293T 세포를 HA-PCAF, Flag-HMGB1, 및/또는 Myc-SIRT1으로 48시간 동안 공동-형질주입시키고, 전-세포 용해물을 항-Flag 항체로 면역침강시켜 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다.
(B) RAW 264.7 세포를 LPS(100 ng/ml)로 6시간 동안(아세틸-HMGB1을 위해) 또는 24시간 동안(HMGB1 방출을 위해) 처리한 후, 전-세포 용해물을 항-HMGB1 항체로 면역침강키고 항-아세틸-라이신 항체로 탐침하였다. HMGB1의 방출은 후 배양액을 면역블럿함으로써 분석하였다.
(C) HMGB1 A-박스 구조체를 도식적으로 나타냈다.
(D) Myc-SIRT1 및 Flag-HMGB1-A 돌연변이체로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 LPS(100 ng/ml)로 3시간 동안 자극을 가한 후, 전-세포 용해물을 항-Flag 항체로 면역침강시켰다.
(E) 3개 돌연변이된 아세틸화 잔기(라이신 28, 29, 및 30)를 포함하는 마우스 HMGB1 단백질의 도식적 표시 및 이러한 잔기를 포함하는 마우스 및 다른 종의 HMGB1의 플랭킹(flanking) 영역의 배열을 도식적으로 나타냈다(보존된 라이신 잔기는 빨간색으로 표시함). (약자: H, 인간; M, 마우스; R, 래트; B, 소; S, 돼지; C, 개; O, 토끼; G, 닭; D, 제브라피시; X, 개구리).
(F) 및 (G) Myc-SIRT1, 및 Flag-HMGB1 또는 Flag-HMGB1 돌연변이체로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 LPS(100 ng/ml)로 3시간 동안 자극을 가한 후, 전-세포 용해물을 항-Flag 항체로 면역침강시켰다.
(H) Ad-HMGB1, Ad-HMGB1^K282930R 및/또는 Ad-SIRT1로 48시간 동안 감염된 RAW 264.7 세포를 LPS(100 ng/ml)로 6시간 동안(아세틸-HMGB1 및 단백질 상호작용을 위해) 또는 24시간 동안(HMGB1 방출을 위해) 처리한 후, 전-세포 용해물을 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. HMGB1 방출은 후 배양액을 면역블럿함으로써 분석하였다.
(I) Myc-SIRT1 및 Flag-HMGB1로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 LPS(100 ng/ml)로 3시간 동안 자극을 가한 후, 전-세포 용해물을 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물을 트립신으로 처리하여 액체 크로마토그래피-이중 질량 분광(LC-MS/MS) 분석을 수행하였다. ¹³MSSYAFFVQTCREEHK₍ _ac ₎K²⁹, ²⁹K_(ac)K_(ac)HPDASVNFSEFSK⁴³, 및 ³⁰K₍ _ac ₎HPDASVNFSEFSK⁴³의 단편화 스펙트럼이 각각 28, 29, 및 30 라이신 잔기에 아세틸화된 펩티드의 존재를 나타낸다. LC-MS/MS 분석을 위한 단백질 제조 과정을 도식적으로 나타내었다.
도 6은 SIRT1과의 상호작용의 원인이 되는 HMGB1의 도메인을 확인한 결과를 나타낸다.
(A) HEK293T 세포를 HA-PCAF 및 Flag-HMGB1으로 48시간 동안 공동-형질주입한 후, 전-세포 용해물을 제조하여 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물 및 총 용해물(input)을 항-Flag, 항-HA, 및 항-β-액틴 항체로 면역블럿 분석하여 HMGB1, PCAF, 및 β-액틴을 각각 검출하였다. 전-세포 용해물의 2%를 input으로 사용하였다.
(B) Myc-SIRT1 및 Flag-HMGB1 돌연변이체로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 TNF-α(20 ng/ml)의 존재 또는 비존재 하에서 3시간 동안 배양한 후, 전-세포 용해물을 제조하여 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물 및 총 용해물(input)을 항-Flag, 항-Myc, 및 항-β-액틴 항체로 면역블럿 분석하여 HMGB1, SIRT1, 및 β-액틴을 각각 검출하였다.
(C) 및 (D) Myc-SIRT1 및 야생형 또는 돌연변이체 Flag-HMGB1로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 TNF-α(20 ng/ml) 또는 LPS(100 ng/ml)의 존재 또는 비존재 하에서 3시간 동안 배양한 후, 전-세포 용해물을 제조하여 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 역침강물 및 총 용해물(input)을 상기와 동일한 방법으로 면역블럿 분석하였다.
(E) Hela 세포를 Ad-Flag-HMGB1, Ad-Flag-HMGB1^K282930R, 또는 Ad-Myc-SIRT1로 감염시켰다. 48시간 동안 배양한 후에, 세포를 용해시켜 전-세포 용해물의 일정량을 항-Flag 및 항-Myc 항체로 웨스턴 블럿 분석하여 Flag-HMGB1 및 Myc-SIRT1, 각각의 아데노바이러스-매개 발현을 검출하였다.
(F) Myc-SIRT1 및 Flag-HMGB1 또는 Flag-HMGB1^K282930R로 48시간 동안 공동-형질주입된 RAW 264.7 세포를 TNF-α(20 ng/ml) 또는 LPS(100 ng/ml)의 존재 또는 비존재 하에서 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 동일 부피의 후 배양액을 웨스턴 블럿 분석하여 배양 배지로 방출된 HMGB1을 검출하였다. 폰소 S 염료를 대조군으로 사용하였다.
(G) Myc-SIRT1 및 Flag-HMGB1으로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 TNF-α(20 ng/ml)와 함께 3시간 동안 배양한 후, 전-세포 용해물을 제조하여 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물을 트립신으로 처리하여 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. ²⁵EEHK₍ _ac ₎K_(ac)K₍ _ac ₎ ³⁰ 단편화 스펙트럼은 각각 28, 29, 및 30 라이신 잔기에 아세틸화된 펩티드의 존재를 나타낸다. LC-MS/MS 분석을 위한 단백질 제조 과정을 도식적으로 나타내었다.
(H) 및 (I) Myc-SIRT1 및 Flag-HMGB1로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 IFN-γ(40 ng/ml) 또는 Poly(I:C)(50 μg/ml)의 존재 또는 비존재 하에서 3시간 동안 배양한 후, 전-세포 용해물을 제조하여 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물을 트립신으로 처리하여 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 트립신-처리된 HMGB1으로부터의 펩티드의 단편화 스펙트럼에서, 라이신 잔기 28 또는 29는 제외된, 라이신 잔기 30의 아세틸화가 검출되었다.
도 7은 HMGB1이 CRM1과 가역적으로 상호작용한다는 결과를 나타낸다.
(A), (B), 및 (C) Flag-HMGB1, Flag-HMGB1^K282930R, Myc-SIRT1, 및/또는 HA-CRM1으로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 LPS(100 ng/ml) 또는 TNF-α(20 ng/ml)와 함께 6시간 동안 배양한 후, 전-세포 용해물을 항-Flag 항체로 면역침강시켜 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다.
(D) Myc-SIRT1, HA-CRM1, 및 Flag-HMGB1 또는 Flag-HMGB1^K282930R로 48시간 동안 공동-형질주입된 RAW 264.7 세포를 24시간 동안 LPS(100 ng/ml)로 자극을 가하였다. 동일 부피의 후 배양액을 웨스턴 블럿팅으로 분석하여 방출된 HMGB1을 검출하였다.
도 8은 HEK293T 및 RAW 264.7 세포에서의 HMGB1 및 CRM1의 상호작용의 결과를 나타낸다.
(A) 및 (B) Flag-HMGB1, Flag-HMGB1^K282930R, Myc-SIRT1, 및/또는 HA-CRM1으로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 TNF-α(20 ng/ml) 존재 또는 비존재 하에서 3시간 동안 배양한 후, 전-세포 용해물을 제조하여 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물 및 총 용해물(input) 항-Flag, 항-Myc, 항-HA, 및 항-β-액틴 항체로 면역블럿 분석하여 HMGB1, SIRT1, CRM1, 및 β-액틴을 각각 검출하였다. 전-세포 용해물의 2%를 input으로 사용하였다.
(C) Myc-SIRT1, HA-CRM1, 및 Flag-HMGB1 또는 Flag-HMGB1^K282930R로 48시간 동안 공동-형질주입된 RAW 264.7 세포를 TNF-α(20 ng/ml)와 함께 24시간 동안 배양하고, 동일 부피의 후 배양액을 웨스턴 블럿 분석하여 방출된 Flag-HMGB1을 검출하였다. 폰소 S 염료를 대조군으로 사용하였다.
도 9는 HMGB1의 LPS- 또는 TNF-α-유도 아세틸화가 핵으로부터 세포질로의 이동을 결정한다는 결과를 나타낸다.
(A) 및 (B) GFP-SIRT1 및 RFP-HMGB1, RFP-HMGB1^K282930R, 또는 RFP-HMGB1^K282930Q로 48시간 동안 공동-형질주입된 CHO 세포를 LPS(100 ng/ml) 또는 TNF-α(20 ng/ml)의 존재 또는 비존재 하에서 24시간 동안 배양한 후, 각 융합 단백질의 형광을 공초점 현미경으로 시각화하고(A), 정량하였다(B)(기준자는 30 μm). HMGB1 및 SIRT1이 동일한 위치에 존재한다는 것은 병합 이미지(Merge)에서 노란색의 존재로써 알 수 있다. 결과를 평균±표준편차로 나타내었다(n = 3, ^*p < 0.01 비처리된 야생형 HMGB1 군과 비교시).
도 10은 Poly(I:C) 또는 IFN-γ로 처리된 CHO 세포에서 HMGB1 및 SIRT1의 위치를 측정한 결과이다.
(A) 및 (B) GFP-SIRT1 및 RFP-HMGB1 또는 RFP-HMGB1^K282930R로 48시간 동안 공동-형질주입된 CHO 세포를 Poly(I:C)(50 μg/ml) 또는 IFN-γ(40 ng/ml)와 함께 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후에, 각 융합 단백질의 형광을 공초점 현미경으로 시각화하고(A), 정량하였다(B)(기준자는 30 μm). HMGB1 및 SIRT1이 동일한 위치에 존재한다는 것은 병합 이미지(Merge)에서 노란색의 존재로써 알 수 있다. 결과는 평균±표준편차로 나타내었다(n = 3, ^*p < 0.01 비처리 군과 비교시).
(C) 및 (D) Myc-SIRT1, 및 야생형 또는 돌연변이체 Flag-HMGB1로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 Poly(I:C)(50 μg/ml), IFN-γ(40 ng/ml), LPS(100 ng/ml), 또는 TNF-α(20 ng/ml)와 함께 24시간 동안 배양한 후, 전-세포 용해물을 제조하여 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물 및 총 용해물(input)을 항-Flag, 항-Myc, 및 항-β-액틴 항체로 면역블럿 분석하여 HMGB1, SIRT1, 및 β-액틴을 각각 검출하였다. 전-세포 용해물의 2%를 input으로 사용하였다.
도 11은 HMGB1의 이동 및 방출이 SIRT1에 의해 직접적으로 조절된다는 결과를 나타낸다.
(A) SIRT1^+/+ 또는 SIRT1^-/- MEF를 LPS(100 ng/ml)로 24시간 동안 처리한 후, 전-세포 용해물을 핵(N) 및 세포질(C) 분획으로 분획화하였다. HMGB1의 위치는 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다.
(B) 공 벡터 또는 Myc-SIRT1으로 48시간 동안 형질주입된 SIRT1^-/- MEF를 LPS(100 ng/ml)로 24시간 동안 자극을 가한 후, 전-세포 용해물을 분획화하였다. HMGB1 및 SIRT1의 위치는 웨스턴 블럿팅으로 검출하였다.
(C) Flag-HMGB1 및 Myc-SIRT1로 48시간 동안 공동-형질주입된 HEK293T 세포를 레스베라트롤(resveratrol, 10 μM) 또는 써티놀(sirtinol, 10 μM)로 1시간 동안 처리한 후, 3시간 동안 LPS(100 ng/ml)로 자극을 가하였다. 전-세포 용해물을 항-Flag 항체로 면역침강시켜 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다.
(D) Flag-HMGB1 및 Myc-SIRT1로 48시간 동안 공동-형질주입된 RAW 264.7 세포를 레스베라트롤(10 μM) 또는 써티놀(10 μM)로 1시간 동안 처리한 후, 6시간 동안 LPS(100 ng/ml)로 자극을 가하였다. 전-세포 용해물을 항-Flag 항체로 면역침강시켜 분석하였다. 방출된 HMGB1을 조사하기 위하여, 세포를 24시간 동안 배양한 후, 동일 부피의 후 배양액을 웨스턴 블럿 분석하였다.
(E) SIRT1-표적 또는 대조 siRNA로 형질주입된 RAW 264.7 세포를 6시간 동안 LPS(100 ng/ml)로 자극을 가하였다. 전-세포 용해물을 항-HMGB1 항체로 면역침강시켜 분석하였다. 방출된 HMGB1를 상기 기재한 방법으로 조사하였다.
도 12는 LPS 또는 TNF-α에 의해 자극받은 SIRT1^+/+ 및 SIRT1^-/- MEF에서의 HMGB1의 세포내 위치를 나타내는 결과이다.
(A) SIRT1^+/+ MEF 및 SIRT1^-/- MEF로부터 전-세포 용해물을 제조한 후, SIRT1의 발현을 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다.
(B) SIRT1^+/+ MEF을 표시된 농도의 LPS 또는 TNF-α로 24시간 동안 처리한 후, 전-세포 용해물을 핵(N) 및 세포질(C) 분획으로 분획화하였다. HMGB1의 위치는 항-HMGB1 항체로 웨스턴 블럿팅 분석하였다. 라민 B(Lamin B) 및 α-튜불린(α-tubulin)을 각각 핵 및 세포질 분획에 대한 대조군으로 사용하였다.
(C) SIRT1^+/+ 및 SIRT1^-/- MEF를 TNF-α(20 ng/ml)의 존재 또는 비존재 하에서 24시간 동안 처리한 후, 전-세포 용해물을 핵(N) 및 세포질(C) 분획으로 분획화하였다. HMGB1의 위치는 항-HMGB1 항체로 웨스턴 블럿팅 분석하였다.
(D) 공 벡터 또는 Myc-SIRT1로 48시간 동안 형질주입된 SIRT1^-/- MEF를 TNF-α(20 ng/ml)와 함께 24시간 동안 배양한 후, 전-세포 용해물을 핵(N) 및 세포질(C) 분획으로 분획화하였다. HMGB1 및 SIRT1의 위치는 표시된 특이적 항체로 웨스턴 블럿팅으로 검출하였다.
도 13은 SIRT1으로부터의 분리를 통한 HMGB1의 아세틸화-의존적 방출은 엔도톡신 독성과 관련이 있다는 결과를 나타낸다.
(A), (B), 및 (D) 꼬리 정맥을 통해 감염다중도 0.5 × 10¹⁰로 Ad-Myc-SIRT1, Ad-Flag-HMGB1, 및/또는 Ad-Flag-HMGB1^K282930R로 감염시킨 다음, LPS 또는 운반체(5 mg/kg, i.p.)를 3일 후에 주입시킨 BALB/c 마우스로부터 조직을 제조하였다. 전-조직 용해물을 면역침강법으로 분석하였다(A). 투여 후 13시간에 수집한 시료로부터 제조된 혈청을 이용하여 Flag-HMGB1(B) 및 사이토카인(D)의 전신순환 수준을 각각 웨스턴 블럿팅 또는 ELISA로 검출하였다. 결과를 평균±표준편차로 나타내었다(n = 3 또는 7).
(C) BALB/c 마우스(군 당 n = 10-11)를 꼬리 정맥을 통해 감염다중도 0.5 × 10¹⁰로 Ad-Myc-SIRT1, Ad-Flag-HMGB1, 및/또는 Ad-Flag-HMGB1^K282930R로 감염시킨 다음, 엔도톡신(LPS, 1 mg/kg, i.p.)을 3일 후에 주입하여 치사시켰다. 생존율을 2주 동안 매일 기록하였다(^*p < 0.01 Ad-lacZ-감염 군과 비교시; ^#p < 0.01 및 ^##p < 0.05 Ad-lacZ + LPS-처리 군과 비교시; ^†p < 0.01 및 ^††p < 0.05 Ad-Flag-HMGB1 + LPS-처리 군과 비교시; ^‡p < 0.01 Ad-Flag-HMGB1 + Ad-Myc-SIRT1 + LPS-처리 군과 비교시; ^∮p < 0.001 Ad-Flag-HMGB1 + Ad-Myc-SIRT1 + LPS-처리 군과 비교시; 및 ^∬p < 0.001 Ad-Flag-HMGB1^K282930R + LPS-처리 군과 비교시).
도 14는 내독소혈증(endotoxemia) 모델 마우스에서 아데노바이러스-매개된 Flag- 또는 Myc-태그 HMGB1 및 SIRT1의 발현 결과를 나타낸다.
(A) BALB/c 마우스에 꼬리 정맥을 통해 감염다중도 0.5 × 10¹⁰로 Ad-Flag-SIRT1, Ad-Myc-HMGB1, 및/또는 Ad-Flag-HMGB1^K282930R을 감염시킨 다음, LPS 또는 운반체(5 mg/kg, i.p.)를 3일 후에 16시간 동안 주입시킨 후, BALB/c 마우스로부터 조직을 제조하였다. 단백질 발현은 각 조직의 전 용해물을 이용하여 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다.
(B) BALB/c 마우스(군 당 n = 5-6)에 꼬리 정맥을 통해 감염다중도 0.5 × 10¹⁰로 Ad-lacZ 또는 Ad-Flag-HMGB1을 감염시킨 다음, 엔도톡신(i.p.)을 3일 후에 주입하여 치사시켰다. 생존율을 2주 동안 매일 기록하였다. Figure 1 shows the direct interaction between HMGB1 and SIRT1.
(A) co-transfected HEK293T cells with the indicated plasmids for 48 hours, and then pre-cell lysates were prepared and immunoprecipitated with IgG or anti-Flag antibodies. Immunoprecipitates and total lysates were subjected to immunoblot analysis with anti-Flag, anti-Myc, and anti-beta-actin antibodies to detect HMGB1, SIRT1, and beta -actin, respectively. 2% of pre-cell lysates were used as input.
(B) HEK293T cells were transfected with Flag-tagged HMGB1 for 48 hours, and the pre-cell lysates were incubated with recombinant GST or GST-SIRT1 fusion protein immobilized on glutathione-sepharose 4B beads for 20 hours. The bead-bound proteins were analyzed by Western blotting. GST and GST-fused proteins were stained with Ponceau S.
(C) The fluorescence of each fusion protein in HEK293T cells was visualized with a confocal microscope. The presence of HMGB1 and SIRT1 in the same position can be seen as the presence of yellow in the merged image (the reference is 10 μm).
(D) Flag-tagged HMGB1 structure is schematically shown.
(E) and (F) HEK293T cells were co-transfected with plasmids containing Myc-SIRT1 and Flag-HMGB1-FL or deletion mutants for 48 hours. The pre-cell lysates were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody.
Figure 2 shows the results of direct interaction between HMGB1 and SIRT1.
(A) HEK293T cells were co-transfected with Flag-HMGB1 and Myc-SIRT1 for 48 hours and then pre-cell lysates were prepared and immunoprecipitated with IgG or anti-Myc antibodies. Immune precipitates and total lysates were immunoblotted to anti-Flag, anti-Myc, and anti-beta-actin antibodies to detect HMGB1, SIRT1, and β-actin, respectively. 2% of pre-cell lysates were used as input.
A large amount of soluble GST-fusion SIRT1 was obtained from BL21 cells transformed with pGEX4T-1-SIRT1 under the indicated culture conditions (Protein induction by IPTG). All bacterial pellets were lysed by sonication with 1% NP-40 and centrifuged. The supernatant containing soluble GST-fusion SIRT1 and the same volume of 8 M urea solubilized pellet were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie blue.
(C) Flag-tagged HMGB1 structure is schematically shown.
(D) HEK293T cells were co-transfected with plasmids containing Myc-SIRT1 and Flag-HMGB1 FL or deletion mutants for 48 hours, and then pre-cell lysates were prepared and immunoprecipitated with anti-Myc antibodies. Immune precipitates and total lysates were immunoblot analyzed in the same manner as above.
(E) HEK293T cells were transfected with a Flag-tagged HMGB1 deletion mutant for 48 hours, and then a pre-cell lysate was prepared and transfected with GST-SIRT1 fusion protein or recombinant GST immobilized on glutathione-sepharose 4B beads and 20 Lt; / RTI > The bead-bound proteins were analyzed by Western blotting. GST and GST-fused proteins were stained with Fonso S.
Figure 3 shows the results of LPS promoting HMGB1 release via separation from SIRTl.
HEK293T cells co-transfected with Flag-HMGB1 and / or Myc-SIRT1 for 48 hours were treated with LPS (100 ng / ml), Poly (I: C) (50 μg / ml), IFN-y (40 ng / ml), or TNF-α (20 ng / ml) for 3 hours, ) Or anti-Myc antibody (B) and analyzed by Western blotting.
(D) and (E) HEK293T cells expressing Flag-HMGB1 were cultured for 3 hours in the presence or absence of the indicated stimulus. The pre-cell lysates were incubated with recombinant GST or GST-SIRT1 fusion protein immobilized on glutathione-sepharose 4B beads for 20 hours and then pulled down or immunoprecipitated. GST and GST-fused proteins were stained with Fonso S.
(F) RAW 264.7 cells co-transfected with Flag-HMGB1 and Myc-SIRT1 for 48 hours were incubated for 6 hours (for interaction) in the presence or absence of LPS (100 ng / ml) Gt; HMGB1 < / RTI > release). The pre-cell lysates were immunoprecipitated with anti-HMGB1 antibodies to determine their interaction with SIRT1. To detect the released HMGB1, the same volume of post-culture medium was analyzed by Western blotting.
Figure 4 shows the stimulation-induced release and acetylation levels of HMGB1 in the monocytic cell line.
(A) HEK293T cells co-transfected with Flag-HMGB1 and Myc-SIRT1 for 48 hours were cultured in the presence or absence of LPS (100 ng / ml) for 3 hours, and then pre- Immunoprecipitated with -Flag antibody. Immunoprecipitates and total lysates were immunoblot analyzed with anti-Flag, anti-Myc, and anti-beta-actin antibodies to detect HMGB1, SIRT1, and beta -actin, respectively. 2% of pre-cell lysates were used as input.
(100 μg / ml), Poly (I: C) (50 μg / ml), and LPS (100 μg / ml) in a serum-free medium were allowed to grow in confluency (B) or 24 hours (C) as indicated by IFN-y (40 ng / ml), or TNF-a (20 ng / ml). To detect HMGB1 released into the culture medium, the same volume of post-culture was Western blotted. Ponso S dye was used as a control.
In a group of cells treated for 6 hours with stimuli labeled (D), pre-cell lysates were prepared and immunoprecipitated with anti-HMGB1 antibody. The immunoprecipitates were immunoblot-analyzed with anti-acetyl-lysine and anti-HMGB1 antibody to detect acetylated HMGB1 and intracellular HMGB1, respectively.
(E) HEK293T cells were treated with LPS (100 ng / ml) for the indicated time. Pre-cell lysates were prepared, immunoprecipitated with anti-HMGB1 antibody, and subjected to immunoblot analysis with anti-acetyl-lysine and anti-HMGB1 antibody to detect acetylated HMGB1 and intracellular HMGB1, respectively. Results were expressed as mean ± standard deviation (n = 3, ^* p <0.01 compared to untreated group).
Figure 5 shows that HMGB1 contains lysine residues that are reversibly acetylated.
(A) HEK293T cells were co-transfected with HA-PCAF, Flag-HMGB1, and / or Myc-SIRT1 for 48 hours and the pre-cell lysates were immunoprecipitated with anti-FLAG antibodies and analyzed by Western blotting .
(B) RAW 264.7 cells were treated with LPS (100 ng / ml) for 6 hours (for acetyl-HMGB1) or for 24 hours (for HMGB1 release) and then pre-cell lysates were incubated with anti-HMGB1 antibody Immunoprecipitated and probed with anti-acetyl-lysine antibody. Release of HMGB1 was analyzed by immunoblotting the post-culture.
(C) The HMGB1 A-box structure is schematically depicted.
(D) HEK293T cells co-transfected with Myc-SIRT1 and Flag-HMGB1-A mutants for 48 hours were stimulated with LPS (100 ng / ml) for 3 hours and then the pre-cell lysate was incubated with anti- Immunoprecipitated with antibody.
(E) Schematic representation of mouse HMGB1 protein containing three mutated acetylated residues (lysine 28, 29, and 30) and the arrangement of the flanking region of HMGB1 of mouse and other species containing these residues (Conserved lysine residues are shown in red). (Abbreviation: H, human, M, mouse, R, rat, B, cow, S, pig, C, dog, O, rabbit G, chicken D, zebrafish X, frog).
HEK293T cells co-transfected with (F) and (G) Myc-SIRT1 and Flag-HMGB1 or Flag-HMGB1 mutants for 48 hours were stimulated with LPS (100 ng / ml) for 3 hours, Cell lysates were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody.
RAW 264.7 cells infected with Ad-HMGB1, Ad-HMGB1 ^K282930R and / or Ad-SIRT1 for 48 hours were ^incubated with LPS (100 ng / ml) for 6 hours (for acetyl-HMGB1 and protein interaction) After treatment (for HMGB1 release), the pre-cell lysates were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody. HMGB1 release was analyzed by immunoblotting the post-culture.
(I) HEK293T cells co-transfected with Myc-SIRT1 and Flag-HMGB1 for 48 hours were stimulated with LPS (100 ng / ml) for 3 hours, and then pre-cell lysates were immunized with anti-Flag antibody Lt; / RTI > Immunoprecipitates were treated with trypsin to perform liquid chromatography-double mass spectrometry (LC-MS / MS) analysis. The fragmentation spectra of ¹³ MSSYAFFVQTCREEHK ₍ _ac ₎ K ²⁹ , ²⁹ K _(ac) K _(ac) HPDASVNFSEFSK ⁴³ , and ³⁰ K ₍ _ac ₎ HPDASVNFSEFSK ⁴³ show the presence of acetylated peptides at 28, 29, and 30 lysine residues, respectively . The process of protein preparation for LC-MS / MS analysis is schematically shown.
Fig. 6 shows the result of confirming the domain of HMGB1 that causes interaction with SIRT1.
(A) HEK293T cells were co-transfected with HA-PCAF and Flag-HMGB1 for 48 hours and then pre-cell lysates were prepared and immunoprecipitated with anti-FLAG antibody. The immunoprecipitates and the total input were subjected to immunoblot analysis with anti-Flag, anti-HA, and anti-beta-actin antibodies to detect HMGB1, PCAF, and β-actin, respectively. 2% of pre-cell lysates were used as input.
(B) HEK293T cells co-transfected with Myc-SIRT1 and Flag-HMGB1 mutants for 48 hours were cultured for 3 hours in the presence or absence of TNF-α (20 ng / ml) And immunoprecipitated with anti-FLAG antibody. Immunoprecipitates and total lysates were immunoblot analyzed with anti-Flag, anti-Myc, and anti-beta-actin antibodies to detect HMGB1, SIRT1, and beta -actin, respectively.
HEK293T cells co-transfected with Myc-SIRT1 and wild-type or mutant Flag-HMGB1 for 48 hours were cultured in the presence or absence of TNF-α (20 ng / ml) or LPS (100 ng / ml) After incubation for 3 hours in the absence, pre-cell lysates were prepared and immunoprecipitated with anti-FLAG antibody. Reverse sediment and total solids were subjected to immunoblot analysis in the same manner as above.
(E) Hela cells were infected with Ad-Flag-HMGB1, Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R , or Ad-Myc-SIRT1. After incubation for 48 hours, the cells were lysed and a certain amount of pre-cell lysate was Western blot analyzed with anti-Flag and anti-Myc antibody to detect expression of each of adenovirus-mediated expression of Flag-HMGB1 and Myc-SIRT1 .
(F) RAW 264.7 cells co-transfected with Myc-SIRT1 and Flag-HMGB1 or Flag-HMGB1 ^K282930R for 48 hours were ^incubated with TNF-α (20 ng / ml) or LPS (100 ng / ml) For 24 hours in serum-free medium. Western blot analysis of the same volume of post-culture was performed to detect HMGB1 released into the culture medium. Ponso S dye was used as a control.
(G) HEK293T cells co-transfected with Myc-SIRT1 and Flag-HMGB1 for 48 hours were incubated with TNF-α (20 ng / ml) for 3 hours and then pre- Flag antibody. Immunoprecipitates were treated with trypsin to perform LC-MS / MS analysis. ^{The 25} EEHK ₍ _ac ₎ K _(ac) K ₍ _ac ₎ ³⁰ fragmentation spectrum shows the presence of acetylated peptides at 28, 29, and 30 lysine residues, respectively. The process of protein preparation for LC-MS / MS analysis is schematically shown.
HEK293T cells co-transfected with Myc-SIRT1 and Flag-HMGB1 for 48 hours were incubated with IFN-y (40 ng / ml) or Poly (I: C) (50 μg / ml) Or for 3 hours in the absence, and then pre-cell lysates were prepared and immunoprecipitated with anti-Flag antibody. Immunoprecipitates were treated with trypsin to perform LC-MS / MS analysis. In the fragmentation spectrum of the peptide from trypsin-treated HMGB1, acetylation of lysine residue 30, with the exception of lysine residue 28 or 29, was detected.
Figure 7 shows that HMGB1 reversibly interacts with CRM1.
HEK293T cells co-transfected with Flag-HMGB1, Flag-HMGB1 ^K282930R , Myc-SIRT1, and / or HA-CRM1 for 48 hours were treated with LPS (100 ng / ml) Or TNF-α (20 ng / ml) for 6 hours, and the pre-cell lysates were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody and analyzed by Western blotting.
(D) RAW 264.7 cells co-transfected with Myc-SIRT1, HA-CRM1, and Flag-HMGB1 or Flag-HMGB1 ^K282930R for 48 hours were stimulated with LPS (100 ng / ml) for 24 hours. The same volume of post-culture was analyzed by Western blotting to detect the released HMGB1.
Figure 8 shows the results of the interaction of HMGB1 and CRM1 in HEK293T and RAW 264.7 cells.
HEK293T cells co-transfected with Flag-HMGB1, Flag-HMGB1 ^K282930R , Myc-SIRT1, and / or HA-CRM1 for 48 hours in the presence or absence of TNF-α (20 ng / ml) For 3 hours, a pre-cell lysate was prepared and immunoprecipitated with anti-FLAG antibody. Immune precipitates and total lysates HMGB1, SIRT1, CRM1, and β-actin were detected by immunoblot analysis with anti-Flag, anti-Myc, anti-HA and anti-β-actin antibodies, respectively. 2% of pre-cell lysates were used as input.
(C) RAW 264.7 cells co-transfected with Myc-SIRT1, HA-CRM1, and Flag-HMGB1 or Flag-HMGB1 ^K282930R for 48 hours were cultured with TNF-α (20 ng / ml) The same volume of post-culture was Western blot analyzed to detect the released Flag-HMGB1. Ponso S dye was used as a control.
Figure 9 shows that LPS- or TNF- alpha -induced acetylation of HMGB1 determines the migration from the nucleus to the cytoplasm.
CHO cells co-transfected with GFP-SIRT1 and RFP-HMGB1, RFP-HMGB1 ^K282930R or RFP-HMGB1 ^K282930Q for 48 hours were ^incubated with LPS (100 ng / ml) or TNF- The fluorescence of each fusion protein was visualized (A) and quantitated by confocal microscopy (B) (baseline 30 μM) after incubation for 24 h in the presence or absence of the fusion protein (ng / ml). The presence of HMGB1 and SIRT1 in the same position can be seen as the presence of yellow in the merge image. Results were expressed as mean ± SD (n = 3, ^* p <0.01 compared to untreated wild-type HMGB1 group).
FIG. 10 shows the results of measurement of the positions of HMGB1 and SIRT1 in CHO cells treated with Poly (I: C) or IFN-y.
CHO cells co-transfected with either (A) and (B) GFP-SIRT1 and RFP-HMGB1 or RFP-HMGB1 ^K282930R for 48 hours were ^incubated with poly (I: C) (50 μg / ml) or IFN- / ml). After 24 hours of incubation, the fluorescence of each fusion protein was visualized (A) and quantitated (B) (30 μM standard) with a confocal microscope. The presence of HMGB1 and SIRT1 in the same position can be seen as the presence of yellow in the merge image. Results were expressed as mean ± SD (n = 3, ^* p <0.01 compared to untreated group).
HEK293T cells co-transfected with Myc-SIRT1 (C) and (D) Myc-SIRT1 and wild-type or mutant Flag-HMGB1 for 48 hours were cultured in Poly (I: C) (50 μg / ml), IFN- / ml), LPS (100 ng / ml), or TNF-α (20 ng / ml) for 24 hours, and then pre-cell lysates were prepared and immunoprecipitated with anti-Flag antibody. Immunoprecipitates and total lysates were immunoblot analyzed with anti-Flag, anti-Myc, and anti-beta-actin antibodies to detect HMGB1, SIRT1, and beta -actin, respectively. 2% of pre-cell lysates were used as input.
Figure 11 shows that the migration and release of HMGB1 is directly regulated by SIRT1.
(A) Pre-cell lysates were fractionated into nuclear (N) and cytoplasmic (C) fractions after treatment of SIRT1 ^{+ / +} or SIRT1 ^{- / -} MEF with LPS (100 ng / ml) for 24 hours. The location of HMGB1 was analyzed by Western blotting.
Cell lysates were fractionated after stimulation with LPS (100 ng / ml) for 24 hours with SIRT1 ^{- / -} MEF transfected with the (B) empty vector or Myc-SIRT1 for 48 hours. The positions of HMGB1 and SIRT1 were detected by Western blotting.
(C) HEK293T cells co-transfected with Flag-HMGB1 and Myc-SIRT1 for 48 hours were treated with resveratrol (10 μM) or sirtinol (10 μM) for 1 hour, followed by LPS (100 ng / ml). The pre-cell lysates were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody and analyzed by Western blotting.
(D) RAW 264.7 cells co-transfected with Flag-HMGB1 and Myc-SIRT1 for 48 hours were treated with resveratrol (10 μM) or thalonol (10 μM) for 1 hour, followed by LPS / ml). Total-cell lysates were analyzed by immunoprecipitation with anti-FLAG antibody. To examine the released HMGB1, cells were cultured for 24 hours, and then the same volume of post-culture was Western blotted.
(E) RAW 264.7 cells transfected with SIRT1-target or control siRNA were stimulated with LPS (100 ng / ml) for 6 hours. The pre-cell lysates were analyzed by immunoprecipitation with anti-HMGB1 antibody. The released HMGB1 was examined by the method described above.
FIG. 12 shows the intracellular location of HMGB1 in SIRT1 ^{+ / +} and SIRT1 ^{- / -} MEF stimulated by LPS or TNF-α.
(A) The expression of SIRT1 was analyzed by western blotting after preparation of pre - cell lysates from SIRT1 ^{+ / +} MEF and SIRT1 ^{- / -} MEF.
(B) Pre-cell lysates were fractionated into nuclear (N) and cytoplasmic (C) fractions after treatment of SIRT1 ^{+ / +} MEF with LPS or TNF-α at the indicated concentrations for 24 hours. The location of HMGB1 was analyzed by Western blotting with anti-HMGB1 antibody. Lamin B and α-tubulin were used as controls for the nuclear and cytoplasmic fractions, respectively.
(C) After treatment of SIRT1 ^{+ / +} and SIRT1 ^{- / -} MEF in the presence or absence of TNF-α (20 ng / ml) for 24 hours, ) &Lt; / RTI > The location of HMGB1 was analyzed by Western blotting with anti-HMGB1 antibody.
After incubation for 24 hours with TNF-α (20 ng / ml), SIRT1 ^{- / -} MEFs transfected with the (D) pore vector or Myc-SIRT1 for 48 hours were incubated with the pre- And the cytoplasmic (C) fraction. The positions of HMGB1 and SIRT1 were detected by Western blotting with the indicated specific antibodies.
Figure 13 shows that the acetylation-dependent release of HMGBl through isolation from SIRT1 is associated with endotoxin toxicity.
(A), (B), and (D) via the tail vein was infected with the multiplicity of 0.5 × ¹⁰ 10 infected with Ad-Myc-SIRT1, Ad- Flag-HMGB1, and / or Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R then Tissues were prepared from BALB / c mice injected after 3 days with LPS or vehicle (5 mg / kg, ip). Whole - tissue lysates were analyzed by immunoprecipitation (A). The systemic circulation levels of Flag-HMGB1 (B) and cytokine (D) were detected by Western blotting or ELISA using serum prepared from the samples collected at 13 hours after administration. Results were expressed as mean ± standard deviation (n = 3 or 7).
(C) Ad-Myc-SIRT1, Ad-Flag-HMGB1, and / or Ad-Flag-HMGB1 ^{K282930R at a} multiplicity of infection of 0.5 × 10 ¹⁰ via tail vein in BALB / c mice (LPS, 1 mg / kg, ip) was injected after 3 days and killed. The survival rate were recorded daily for 2 weeks ^(* p <0.01 Ad- lac Z- infected groups as compared ^{^{to; † p <;# p <}} 0.01 and ^{## p <0.05 Ad- lac Z +} LPS- when compared to the group treated 0.01 and ^{†† p <0.05 Ad-Flag-} HMGB1 + LPS- during treatment compared to the ^{group; ‡ p <0.01 Ad-Flag} -HMGB1 + Ad-Myc-SIRT1 + LPS- during treatment compared to the group; ^∮ p <0.001 Ad -Flag-HMGB1 + Ad-Myc-SIRT1 + LPS-treated group and ^∬ p <0.001 Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R + LPS-treated group).
Figure 14 shows the expression of adenovirus-mediated Flag- or Myc-tag HMGB1 and SIRT1 in endotoxemia model mice.
(A) BALB / c mice were infected with Ad-Flag-SIRT1, Ad-Myc-HMGB1, and / or Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R at a ^multiplicity of infection of 0.5 × 10 ¹⁰ via tail vein, 5 mg / kg, ip) was injected after 3 days for 16 hours, and tissues were prepared from BALB / c mice. Protein expression was analyzed by Western blotting using a total soluble fraction of each tissue.
(B) BALB / c mice (n = 5-6 per group) were infected with Ad lac Z or Ad-Flag-HMGB1 at a multiplicity of infection of 0.5 × 10 ¹⁰ through the tail vein, Day after injection. Survival rates were recorded daily for two weeks.

본 발명은 패혈증 치료제의 스크리닝 방법으로, (a) 세포를 배양하는 단계; (b) 단계(a)의 세포에 염증 자극 인자를 처리하는 단계; (c) 단계(b)의 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계; (d) 단계(c)의 세포에서 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용의 수준을 측정하는 단계; 및 (e) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용의 증가를 나타내는 시험 물질을 패혈증 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention relates to a screening method for a therapeutic agent for sepsis, comprising the steps of: (a) culturing a cell; (b) treating the cells of step (a) with an inflammatory stimulating factor; (c) contacting the test substance to the cell of step (b); (d) measuring the level of physical interaction of the nuclear HMGB1 protein and the SIRT1 protein in the cells of step (c); And (e) screening a test substance exhibiting an increase in the physical interaction of HMGB1 protein and SIRT1 protein with a sepsis treatment agent as compared to a control group not treated with said test substance.

단계(a)는 패혈증 치료제의 스크리닝 방법에 사용할 세포를 배양하는 단계이다. 상기 세포는 통상적으로 사용되는 시험관내 실험에 사용되는 세포주를 사용할 수 있다. 구체적으로, RAW 264.7, 햄스터 난소(Chinese hamster ovary), HL-60, U937, HEK293T 세포 또는 마우스 배아 섬유아세포를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하거나, 상업적으로 판매되는 세포주를 사용할 수도 있다.Step (a) is a step of culturing the cells to be used for the screening method of the therapeutic agent for sepsis. The cell may be a cell line used in a commonly used in vitro experiment. Specifically, RAW 264.7, Chinese hamster ovary, HL-60, U937, HEK293T cells or mouse embryonic fibroblasts can be used, but are not limited thereto. These cells can be used either from the Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea) or from commercially available cell lines.

단계(b)는 단계(a)에서 배양된 세포에 염증 자극 인자를 처리하는 단계이다.Step (b) is a step of treating the cells cultured in step (a) with an inflammatory stimulator.

일 구현예에서, 단계(b)의 상기 염증 자극 인자는 통상적으로 사용되는 염증 자극 인자를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 리포폴리사카라이드 또는 마우스 종양 괴사 인자-α일 수 있다. 단계(b)는 상기 염증 자극 인자를 단계(a)에서 배양된 세포와 함께 일정 시간, 예를 들어 3시간 내지 24시간 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.In one embodiment, the inflammatory stimulating factor of step (b) can be a commonly used inflammatory stimulating factor, for example, lipopolysaccharide or mouse tumor necrosis factor-a. Step (b) can be performed by culturing the inflammatory stimulating factor with the cells cultured in step (a) for a predetermined time, for example, 3 to 24 hours.

단계(c)는 패혈증 치료 효과가 있을 것으로 예상되는 시험 물질을 단계(b)의 염증 자극 인자를 처리한 세포에 접촉시키는 단계이다.Step (c) is a step of bringing the test substance expected to have a therapeutic effect on sepsis to the cell treated with the inflammatory stimulating factor of step (b).

단계(d)는 단계(c)의 세포에서 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용의 수준을 측정하는 단계이다. 단계(d)는 통상적으로 사용되는 단백질 상호작용 측정방법에 의하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 공동면역침강법에 의해 수행될 수 있다.Step (d) is the step of measuring the level of the physical interaction of the nuclear HMGB1 protein and the SIRT1 protein in the cells of step (c). Step (d) can be carried out by a commonly used method for measuring protein interaction, for example, by co-immunoprecipitation.

단계(e)는 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 물리적 상호작용의 증가를 나타내는 시험 물질을 패혈증 치료제로 선별하는 단계이다.Step (e) is a step of screening a test substance exhibiting an increase in physical interaction of HMGB1 protein and SIRT1 protein with a sepsis treatment agent as compared with a control group in which the test substance is not treated.

또한, 본 발명은 SIRT1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 패혈증 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of sepsis, which comprises a SIRT1 protein or a gene encoding the SIRT1 protein.

또한, 본 발명은 SIRT1 단백질의 활성화제를 포함하는 패혈증 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of sepsis comprising an activator of SIRT1 protein.

일 구현예에서, 상기 SIRT1 단백질의 활성화제는 레스베라트롤일 수 있다.
In one embodiment, the activator of the SIRT1 protein may be resveratrol.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예Example

<시험><Test>

1. 재료1. Materials

이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS, Escherichia coli 0111:B4), 폴리이노시닉-폴리시티딜릭 산(polyinosinic-polycytidylic acid), 폰소 S(Ponceau S), 레스베라트롤(resveratrol), 써티놀(sirtinol), 다클론성 토끼 항-β-액틴 항체, 및 단일클론성 마우스 항-Flag 항체는 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 재조합 인간 인터페론(interferon, IFN)-γ 및 마우스 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)는 R&D 시스템(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)으로부터 구입하였다. 단일클론성 토끼 항-Flag 및 항-혈구응집소(anti-hemagglutinin, HA) 항체는 셀 시그널링사(Cell Signaling, Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다. 아세틸-라이신 특이적 단일클론성 항체, α-튜불린, 및 라민 B, c-Myc 및 SIRT1 특이적 다클론성 항체, 및 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)-공유결합된 항-면역글로불린 G는 산타크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)로부터 구입하였다. 단일클론성 토끼 항-고-이동성 그룹 박스 1(HMGB1) 항체는 에피토믹스(Epitomics, Burlingame, CA, USA)로부터 구입하였다. 이외 시약은 최상급으로 사용하였다.
Isopropyl-1-thio-? -D-galactopyranoside (IPTG), lipopolysaccharide (LPS, Escherichia coli 0111: B4), poly Polyunosinic-polycytidylic acid, Ponceau S, resveratrol, sirtinol, polyclonal rabbit anti-beta-actin antibodies, and monoclonal mouse anti- Flag antibody was purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Mo., USA). Recombinant human interferon (IFN) -γ and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) were purchased from R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). Monoclonal rabbit anti-Flag and anti-hemagglutinin (HA) antibodies were purchased from Cell Signaling (Beverly, MA, USA). C-Myc and SIRTl specific polyclonal antibodies, and horseradish peroxidase-covalently conjugated anti-immunoglobulin G, are useful in the treatment of cancer, Were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Monoclonal rabbit anti-high-mobility group box 1 (HMGB1) antibodies were purchased from Epitomics (Burlingame, CA, USA). Other reagents were used at the highest level.

2. 세포 배양2. Cell culture

RAW 264.7, 햄스터 난소(Chinese hamster ovary), HL-60, U937, 및 HEK293T 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 구입하여, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는, 10% 열-비활성화 소 태아 혈청 보충된 배양 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM)에서 37 ℃, 95% 공기 및 5% CO₂ 대기 하에서 배양하였다. 야생형 또는 SIRT1-넉아웃 마우스로부터 유래된 마우스 배아 섬유아세포는 타인(Dr. Richard Allsopp, Burns School of Medicine, University of Hawaii, Honolulu, HI, USA)으로부터 제공받아 DMEM 배지에서 상기 기재한 방법으로 배양하였다.
RAW 264.7, Chinese hamster ovary, HL-60, U937, and HEK293T cells were purchased from Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea) and cultured in DMEM containing 10 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin % Heat-inactivated fetal bovine serum supplemented culture medium (Dulbecco ' s modified Eagle ' s medium, DMEM) at 37 占 폚 in 95% air and 5% CO ₂ atmosphere. Mouse embryonic fibroblasts derived from wild-type or SIRTl-knockout mice were cultured in the DMEM medium as described above, received from another person (Dr. Richard Allsopp, Burns School of Medicine, University of Hawaii, Honolulu, HI, USA) .

3. 소 간섭 3. Small interference RNARNA (( smallsmall interferinginterfering RNARNA , , siRNAsiRNA )에 의한 유전자 억제 )

세포를 형질주입 전 18-24시간에 60 mm 배양 접시에 접종하였다. siRNA 형질주입 시험은 수퍼펙트(SuperFect, Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 형질주입-레디 대조 siRNA 듀플렉스를 앰비온사(Ambion, Austin, TX, USA)로부터 구입하였고, 마우스 SIRT1 mRNA 서열의 뉴클레오티드(5’-TGA AGT GCC TCA GAT ATT A-3’ 및 5’-TAA TAT CTG AGG CAC TTC A-3’)에 대하여 설계된 SIRT1-표적화 siRNA는 바이오니아(Bioneer, Daejeon, Korea)에서 합성하였다. 6시간 동안 배양한 후, 세포에 신선한 세포 배양 배지를 첨가하고 추가로 38시간 배양한 다음, 표시된 시간 동안 각 시약으로 처리하였다. 유전자 억제 효과는 웨스턴 블럿 분석으로 평가하였다.
Cells were inoculated into a 60 mm culture dish 18-24 hours before transfection. siRNA transfection test was performed according to the manufacturer's instructions using SuperFect (Qiagen, Valencia, Calif., USA). (5'-TGA AGT GCC TCA GAT ATT A-3 'and 5'-TAA TAT CTG) were purchased from Ambion, Austin, TX, USA, SIRT1-targeted siRNA designed for AGG CAC TTC A-3 ') was synthesized in bioneer (Bioneer, Daejeon, Korea). After incubation for 6 hours, fresh cell culture medium was added to the cells and incubated for an additional 38 hours and then treated with each reagent for the indicated times. The gene suppression effect was evaluated by Western blot analysis.

4. 플라스미드 제작 및 형질주입4. Plasmid preparation and transfection

HMGB1, p300/CBP-관련 인자, 및 SIRT1 플라스미드는 선행문헌(Hwang et al., 2014)에 기재된 바에 따라 제작하였다. HMGB1의 결실 돌연변이는 pcDNA3.1-Flag-HMGB1 유래 단편을 PCR 증폭하여 제작하였다. 이러한 단편은 HindIII/EcoRV로 처리하여, 유사하게 처리된 에피토프-태그된 벡터 pcDNA3.1-Flag(Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 결찰시켜, pcDNA3.1-Flag-HMGB1-A&B(aa 1-185), pcDNA3.1-Flag-HMGB1-B&C(aa 89-215), pcDNA3.1-Flag-HMGB1-A(aa 1-88), pcDNA3.1-Flag-HMGB1-B(aa 89-185), pcDNA3.1-Flag-HMGB1-Δ¹¹A(aa 12-88), 및 pcDNA3.1-Flag-HMGB1-Δ³⁰A(aa 31-88)을 제작하였다. 위치-지향성 돌연변이체인 HMGB1, pcDNA3.1-Flag-HMGB1^K28R, pcDNA3.1-Flag-HMGB1^K29R, pcDNA3.1-Flag-HMGB1HMGB1^K28R, pcDNA3.1-Flag-HMGB1^K282930R, 및 pcDNA3.1-Flag-HMGB1^K282930Q는 키트(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) 및 pcDNA3.1-Flag-HMGB1 플라스미드를 이용하여 제작하였다. GST-융합된 단백질은, 전장 SIRT1 cDNA를 pGEX4T-1 벡터(GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)의 BamHI 및 SalI 위치에 클로닝하여 제작하였다. 위치 분석을 위하여, pEGFP-C1 및 pDsRed-Express-C1(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 GFP-SIRT1 및 RFP-HMGB1를 각각 제작하였다. HA-CRM1 플라스미드는 타인(Dr. Ralph Kehlenbach, Department of Biochemistry, Georg-August-University of Gottingen, Germany)으로부터 제공받았다. 모든 재조합 플라스미드는 서열분석으로 확인하였으며, 표시된 플라스미드로 48시간 동안 형질주입된 HEK293T 세포는 표시된 시간 동안 표시된 시약으로 자극을 가하였다.
HMGB1, p300 / CBP-related factors, and SIRT1 plasmids were prepared as described in the prior art (Hwang et al., 2014). The deletion mutation of HMGB1 was generated by PCR amplification of pcDNA3.1-Flag-HMGB1-derived fragment. This fragment was ligated to a similarly treated epitope-tagged vector pcDNA3.1-Flag (Stratagene, La Jolla, Calif., USA) by treatment with HindIII / Eco RV to generate pcDNA3.1-Flag-HMGB1-A & B (aa 1-88), pcDNA3.1-Flag-HMGB1-B (aa 89-215), pcDNA3.1-Flag-HMGB1-A to -185), pcDNA3.1-Flag-HMGB1 -Δ 11 a (aa 12-88), and ^{pcDNA3.1-Flag-HMGB1-Δ 30} a (aa 31-88) was produced. Flag-HMGB1 ^K28R , pcDNA3.1-Flag-HMGB1 ^K29R , pcDNA3.1-Flag-HMGB1HMGB1 ^K28R , pcDNA3.1-Flag-HMGB1 ^K282930R , and pcDNA3.1- ^Flag- HMGB1 ^K282930Q was ^constructed using a kit (QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) and a pcDNA3.1-Flag-HMGB1 plasmid. GST-fused proteins were prepared by cloning full-length SIRT1 cDNA into Bam HI and Sal I sites of pGEX4T-1 vector (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa., USA). For location analysis, GFP-SIRT1 and RFP-HMGB1 were prepared using pEGFP-C1 and pDsRed-Express-C1 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA). The HA-CRM1 plasmid was provided by a different person (Dr. Ralph Kehlenbach, Department of Biochemistry, Georg-August-University of Gottingen, Germany). All recombinant plasmids were identified by sequencing and HEK293T cells transfected with the indicated plasmids for 48 hours were stimulated with the indicated reagents for the indicated times.

5. 5. 웨스턴Western 블럿Blot 분석 analysis

모든 세포 및 조직은 냉 인산-완충 식염수(PBS)로 세척하였고, 용해액(PRO-PREP Protein Extraction Solution, iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)으로 용해시켰다. 세포 또는 조직 용해물의 일정량을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 수행하고 멤브레인(Hybond-P+ polyvinylidene difluoride membrane, GE Healthcare Life Sciences)으로 전이시켰다. 멤브레인을 4 ℃에서 0.1% 트윈-20 포함 트리스-완충 식염수(Tris-buffered saline, TBS)에서 제조된 5% 탈지 우유로 밤새 블록(block)하고, 1% BSA 및 0.05% 트윈-20 포함 TBS에서 제조된 표시된 특이적 항체로 4 ℃에서 밤새 탐침하였다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 페록시다제-결합된 2차 항체와 함께 배양시켰다. 0.1% BSA 및 0.1% 트윈-20 포함 TBS에서 세척한 후, 면역반응성 밴드를 웨스턴 블랏 검출 시스템(West-ZOL 및, iNtRON Biotechnology)을 이용하여 검출하였다.
All cells and tissues were washed with cold phosphate-buffered saline (PBS) and lysed in solution (PRO-PREP Protein Extraction Solution, iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea). A certain amount of cell or tissue lysate was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and transferred to a membrane (Hybond-P + polyvinylidene difluoride membrane, GE Healthcare Life Sciences). The membranes were blocked with 5% skim milk prepared in Tris-buffered saline (TBS) containing 0.1% Tween-20 at 4 ° C overnight and resuspended in TBS containing 1% BSA and 0.05% Tween-20 Lt; RTI ID = 0.0 > 4 C < / RTI > overnight. Membranes were incubated with peroxidase-conjugated secondary antibodies for 1 hour at room temperature. After washing in TBS containing 0.1% BSA and 0.1% Tween-20, the immunoreactive bands were detected using a Western blot detection system (West-ZOL and iNtRON Biotechnology).

6. 핵 및 6. Nuclear and 세포질성Cytoplasm 단백질의 분획 Fraction of protein

세포성 분획을 선행문헌(Kiemer et al., 2003)에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 즉, 세포를 PBS로 세척하고, 용해용 용액[10 mM HEPES(pH 7.9), 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 및 프로테아제 억제제]에 재현탁시켜 얼음에서 15분 동안 팽창(swell)시켰다. 계면활성제(Nonidet P-40, 0.1%, 최종 농도)를 첨가하고, 시료를 10초 동안 격렬히 혼합하였다. 12,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 상청액 및 세포질 분획을 얻었다. 얻어진 펠렛을 용해용 용액으로 2회 세척하고 용해액(PRO-PREP Protein Extraction Solution, iNtRON Biotechnology)에 재현탁시켰다. 얼음에서 30분 동안 배양한 후, 핵 단백질을 포함하는 상청액 분획을 4 ℃에서 15분 동안 12,000 rpm으로 원심분리하여 수집하였다. 단백질 농도는 브래드포드법(Bradford method)으로 측정하였다.
Cellular fractions were prepared according to the method described in the prior art (Kiemer et al., 2003). That is, the cells were washed with PBS and resuspended in lysis solution [10 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT and protease inhibitor] . Surfactant (Nonidet P-40, 0.1%, final concentration) was added and the sample mixed vigorously for 10 seconds. And centrifuged at 12,000 rpm for 30 seconds to obtain a supernatant and a cytoplasmic fraction. The resulting pellet was washed twice with the dissolution solution and resuspended in the dissolution solution (PRO-PREP Protein Extraction Solution, iNtRON Biotechnology). After incubation on ice for 30 minutes, supernatant fractions containing nuclear proteins were collected by centrifugation at 12,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. The protein concentration was measured by the Bradford method.

7. 형광 7. Fluorescence 공초점Confocal 레이져laser 현미경 측정 Microscope measurement

직경 35 mm의 커버글라스 바텀 디쉬에 1 × 10⁵ 세포 밀도로 도포된 세포에 진펙틴(Genefectin, Genetrone Biotech, Gwangmyeong, Korea)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 GFP-SIRT1 및 RFP-HMGB1, RFP-HMGB1^K282930R, 또는 RFP-HMGB1^K282930Q을 형질주입하였다. 형질주입 후에 48시간 동안 단백질 발현을 진행시켰고, 최종 24시간 동안 LPS 또는 TNF-α의 존재 또는 비존재 처리하여 배양하였다. 상기 처리 후, 커버글라스를 공초점 레이져 형광 현미경(Olympus FV-1000 confocal laser fluorescence microscope, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
(Gene- fectin Biotech, Gwangmyeong, Korea) was added to cells coated with 1 x 10 < ⁵ > cell density in a cover glass bottom dish having a diameter of 35 mm to prepare GFP-SIRT1 and RFP- HMGB1 ^K282930R , or RFP-HMGB1 ^K282930Q . Protein expression was allowed to proceed for 48 hours after transfection and cultured for the last 24 hours in the presence or absence of LPS or TNF- [alpha]. After the treatment, the cover glass was observed using a confocal laser fluorescence microscope (Olympus FV-1000 confocal laser fluorescence microscope, Olympus, Tokyo, Japan).

8. 8. GSTGST -융합된 단백질 및 - fusion proteins and GSTGST 풀-다운 분석의 박테리아성 발현 Bacterial expression of pool-down analysis

SIRT1 및 HMGB1 간의 직접적 결합은 선행기술(Davenport et al., 2014; Choi et al., 2006)에 기재된 바와 같이 박테리아에 의해 발현된 GST-융합된 단백질을 이용하여 평가하였다. 즉, pGEX4T-1 벡터에 클로닝된 인간 SIRT1을 BL21 감응(competent) 세포에 형질전환시켰다. 단일 클론을 50 μg/ml 암피실린 포함 LB 배지에서 배양하였다. GST 또는 GST-융합된 SIRT1의 발현은 18 ℃에서 18시간 동안 0.5 mM IPTG 존재하에서 약 OD₆₀₀ 0.6에서 유도하였다. 박테리아 펠렛을 용해용 완충액[30 mM Tris-Cl(pH 7.5), 0.1 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% NP-40, 및 프로테아제 억제제]에 재현탁시켜, 3회(회당 1분) 초음파 처리하고, 12,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. GST 및 GST-SIRT1 융합 단백질은 주로 용해성 분획에 존재하였다; 따라서, 상청액을 글루타치온-세파로오즈 4B 비즈(GE Healthcare Life Sciences)와 함께 4시간 동안 배양하여 GST 또는 GST-SIRT1을 고정시켰다. SIRT1 및 HMGB1 간 직접적 결합을 확인하기 위하여, 고정된 GST-융합된 단백질을 세포 용해물과 4 ℃에서 밤새 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 결합된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하여 표시된 항체로 면역블럿팅하여 검출하였다.
Direct binding between SIRT1 and HMGB1 was assessed using GST-fused proteins expressed by bacteria as described in the prior art (Davenport et al., 2014; Choi et al., 2006). That is, human SIRT1 cloned into pGEX4T-1 vector was transformed into BL21 competent cells. Single clones were cultured in LB medium containing 50 μg / ml ampicillin. Expression of GST or GST-fused SIRTl was induced at about OD ₆₀₀ 0.6 in the presence of 0.5 mM IPTG for 18 hours at 18 ° C. The bacterial pellet was resuspended in lysis buffer [30 mM Tris-Cl (pH 7.5), 0.1 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% NP-40 and protease inhibitor), sonicated three times , And centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes. GST and GST-SIRT1 fusion proteins were predominantly in soluble fractions; Therefore, the supernatant was incubated with glutathione-Sepharose 4B beads (GE Healthcare Life Sciences) for 4 hours to fix GST or GST-SIRT1. To confirm direct binding between SIRT1 and HMGB1, immobilized GST-fused proteins were incubated with cell lysates overnight at 4 ° C. After washing three times with PBS, the bound protein was separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the labeled antibody.

9. 9. HMGB1HMGB1 방출의 분석 Analysis of emissions

RAW 264.7 세포에 표시된 플라스미드를 형질주입하여 48시간 동안 배양하였다. 16시간 동안 무혈청 배지에서 배양한 후, 표시된 시간 동안 LPS 또는 TNF-α로 세포에 자극을 가하였다. 배양 배지로 방출된 HMGB1의 상대적 양을 결정하기 위하여, 동일 수의 RAW 264.7 세포를 포함하는 일정량의 후 배양 배지를 사용하였다. 동일 부피의 후 배양액을 80% 냉 아세톤으로 침전시키고 -20 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 4 ℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 단백질 펠렛을 침전시켰다. 80% 냉 아세톤으로 세척한 후, 얻어진 펠렛을 SDS-PAGE 시료 완충액에 재현탁시켜 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 동일한 로딩(loading)을 확인하기 위하여 폰소 S 염료를 사용하였다.
Plasmid expressed in RAW 264.7 cells was transfected and cultured for 48 hours. After incubation in serum-free medium for 16 hours, cells were stimulated with LPS or TNF-a for the indicated time. To determine the relative amount of HMGB1 released into the culture medium, an amount of post-culture medium containing the same number of RAW 264.7 cells was used. The same volume of post-culture was precipitated with 80% cold acetone and incubated at -20 ° C for 1 hour. Protein pellets were precipitated by centrifugation at 4 ° C at 13,000 rpm for 10 minutes. After washing with 80% cold acetone, the resulting pellet was resuspended in SDS-PAGE sample buffer and Western blot analysis was performed. Ponso S dye was used to confirm the same loading.

10. 바이러스성 벡터 구조체 및 재조합 바이러스10. Viral vector construct and recombinant virus

lacZ, Flag-HMGB1, Flag-HMGB1^K282930R, 및 Myc-SIRT1 발현을 위한 재조합 아데노바이러스성 벡터를 제작하였다. 모든 cDNA는 게이트웨이 시스템(Gateway system) 및 LR 클로나제 II(R Clonase II, Invitrogen)을 이용하여 pAd/CMV/V5-DEST 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 전이시켰다. 재조합 아데노바이러스성 벡터를 PacI로 계통화하고, 리포펙타민(Lipofectamine 2000, Invitrogen)을 이용하여293A 세포로 형질주입시켰다. 이 후, 293A 세포를 10% 소 태아 혈청 포함 DMEM 배지에서 1 내지 2주 동안 배양하였다. 대조군으로서, lacZ-포함 아데노바이러스를 생산하는 pAd/CMV/V5-GW/lacZ 벡터(Invitrogen)를 사용하였다.
lac Z, Flag-HMGB1, Flag-HMGB1 ^K282930R , and Myc-SIRT1 expression. All cDNAs were transferred to the pAd / CMV / V5-DEST vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) using the Gateway system and LR Clonase II (Invitrogen). Recombinant adenoviral vectors were spiked with Pac I and transfected with 293A cells using lipofectamine (Lipofectamine 2000, Invitrogen). Thereafter, 293A cells were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum for 1 to 2 weeks. As a control, pAd / CMV / V5-GW / lac Z vector (Invitrogen) was used to produce lac Z-containing adenovirus.

11. 단백질 정제 및 질량 분석11. Protein purification and mass spectrometry

HEK293T 세포를 pcDNA3.1-Flag-HMGB1 및 pcDNA3.1-Myc-SIRT1로 형질주입시켰다. 48시간 동안 배양한 후에, 형질주입된 HEK293T 세포를 LPS 또는 TNF-α로 3시간 동안 처리한 후 수확하여 아세틸화된 HMGB1를 정제하였다. 세포를 수집하여 용해액(PRO-PREP Protein Extraction Solution, iNtRON Biotechnology)으로 용해킨 후, 전-세포 용해물을 제조하여 및 단일클론성 항-Flag 항체(시그마-알드리치)로 면역침강시켰다. Flag 펩티드-용리 물질을 10% SDS-PAGE에 용해시켜 선행문헌(Nystrom et al., 2013; Entezari et al., 2014)에 기재된 방법에 따라 분석하였다. HMGB1의 비결합 티올 기를 4 ℃에서 10 mM 요오드아세트아미드(iodoacetamide)로 90분 동안 알킬화하였다. 디설피드(disulfide) 결합에서의 시스테인 잔기를 4 ℃에서 1시간 동안 30 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)로 환원시킨 후, 새롭게 노출된 티올 기를 90 mM N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide)로 4 ℃에서 10분 동안 알킬화하였다. 시료를 제조사의 지시에 따라 트립신 처리하고, 집팁 C18 피펫 팁(ZipTip C18 pipette tips, Merck Millipore, Billerica, MA, USA)을 이용하여 탈염하였다. HMGB1의 아세틸화된 라이신 잔기의 특성을 선행문헌(Antoine et al., 2012)에 기재된 방법에 따라 확인하였다.
HEK293T cells were transfected with pcDNA3.1-Flag-HMGB1 and pcDNA3.1-Myc-SIRT1. After culturing for 48 hours, transfected HEK293T cells were treated with LPS or TNF-a for 3 hours and harvested to purify acetylated HMGB1. Cells were harvested and dissolved in the lysis solution (PRO-PREP Protein Extraction Solution, iNtRON Biotechnology), and then pre-cell lysates were prepared and immunoprecipitated with monoclonal anti-Flag antibody (Sigma-Aldrich). Flag peptide-eluting material was dissolved in 10% SDS-PAGE and analyzed according to the method described in the prior art (Nystrom et al., 2013; Entezari et al., 2014). Unbound thiol groups of HMGB1 were alkylated at 4 占 폚 with 10 mM iodoacetamide for 90 minutes. The cysteine residue in the disulfide bond was reduced to 30 mM dithiothreitol at 4 ° C for 1 hour and the newly exposed thiol group was then reacted with 90 mM N-ethylmaleimide 0.0 > C < / RTI > for 10 minutes. Samples were trypsinized according to the manufacturer's instructions and desalted using ZipTip C18 pipette tips (Merck Millipore, Billerica, MA, USA). The properties of the acetylated lysine residues of HMGBl were confirmed by the method described in the prior art (Antoine et al., 2012).

12. 12. 내독소혈증의Endotoxemic 동물 모델 Animal model

선행문헌(Wang et al., 1999; Uolla et al., 2002)에 기재된 방법에 따라, BALB/c 마우스(수컷, 6-7주령, 20-25 g)에 박테리아성 엔도톡신(10 mg/kg, Escherichia coli LPS 0111:B4)을 복강내 주사하여 내독소혈증을 유도하였다. 즉, BALB/c 마우스는 코아텍(Koatech, 평택, 한국)에서 구입하여 무-병원체 환경에서 사육하였다. 12 시간 주간/야간 주기(6:00 광 시작)로 조절된 환경 조건 하에서 표준 살균 실험실 식이 및 식수를 사용하였다. 실험 주령에 해당하는 BALB/c 수컷 마우스에 Ad-lacZ, Ad-Flag-HMGB1, Ad-Flag-HMGB1^K282930R, 및/또는 Ad-Myc-SIRT1를 발현하는 정제 재조합 아데노바이러스 1 × 10¹⁰ 입자가 포함되어 있는 식염수(100 μl)를 정맥주사 하였다. 2일 후에, 마우스 하기 7개 군으로 임의 분배하였다: Ad-lacZ-감염 마우스에 운반체 주사, Ad-lacZ-감염 마우스에 LPS(1 mg/kg) 주사, Ad-Flag-HMGB1-감염 마우스에 LPS(1 mg/kg) 주사, Ad-Flag-HMGB1 및 Ad-Myc-SIRT1-감염 마우스에 LPS(1 mg/kg) 주사, Ad-Flag-HMGB1^K282930R-감염 마우스에 LPS(1 mg/kg) 주사, Ad-Flag-HMGB1^K282930R 및 Ad-Myc-SIRT1-감염 마우스에 LPS(1 mg/kg) 주사, 및 Ad-Myc-SIRT1-감염 마우스에 LPS(1 mg/kg) 주사. LPS 주사 후 2주 동안 사망률을 기록하여 추가적인 사망 발생 여부를 확인하였다.
Bacterial endotoxin (10 mg / kg body weight) was administered to BALB / c mice (male, 6-7 weeks old, 20-25 g) according to the method described in the previous article (Wang et al., 1999; Uolla et al. Escherichia coli LPS 0111: B4) was intraperitoneally injected to induce endotoxemia. In other words, BALB / c mice were purchased from Koatech (Pyeongtaek, Korea) and raised in a non-pathogenic environment. A standard sterilization laboratory diet and drinking water were used under controlled environmental conditions with a 12 hour day / night cycle (6:00 am start). 1 x 10 < 10 ^> particles of purified recombinant adenovirus expressing Ad- lac Z, Ad-Flag-HMGB1, Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R , and / or Ad-Myc-SIRT1 were ^injected into BALB / The saline solution (100 μl) was intravenously injected. Two days later, mice were to any distributed into seven groups: Ad- lac Z- carrier injection to mice infected, Ad- lac Z- LPS in mice infected (1 mg / kg) injection, Ad-infected mouse Flag-HMGB1- to LPS (1 mg / kg) injection, Ad-Flag-HMGB1 and Ad-Myc-SIRT1- LPS (1 mg / kg) injection in mice ^{infected, Ad-Flag-HMGB1 K282930R -} LPS (1 mg / kg in mice infected ) Injection, LPS (1 mg / kg) injection into Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R and Ad-Myc-SIRT1- infected mice, and Ad-Myc-SIRT1- infected mice with LPS (1 mg / kg). Mortality rates were recorded for two weeks after LPS injection to confirm the occurrence of additional deaths.

13. 혈청 사이토카인 분석 13. Serum cytokine analysis

식염수(100 μl) 중의 Ad-lacZ, Ad-Flag-HMGB1, Ad-Flag-HMGB1^K282930R, 및/또는 Ad-Myc-SIRT1를 발현하는 정제 재조합 아데노바이러스 1 × 10¹⁰ 입자를 16시간 동안 LPS 존재 또는 비존재 하에서 감염시킨 BALB/c 마우스로부터 얻은 순환혈 시료에 있는 HMGB1, TNF-α, 및 인터루킨(IL)-6의 혈청 농도를 분석하였다. 선행문헌(Hwang et al., 2012)에 기재된 방법에 따라, 혈액을 수집하여, 실온에서 2시간 동안 응고시킨 후, 4,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 혈청 중 순환 Flag-HMGB1를 웨스턴 블럿 분석으로 결정하였다. TNF-α 및 IL-6의 혈청 농도를 각각의 측정 키트(mouse TNF-α ELISA Ready-SET-Go! Kit, eBioscience, San Diego, CA, USA; 및 IL-6 ELISA Max Set Standard, BioLegend, San Diego, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
^1x10 < 10 ^> particles of purified recombinant adenovirus expressing Ad- lac Z, Ad-Flag-HMGB1, Ad- Flag-HMGB1 ^K282930R , and / or Ad- ^Myc- SIRT1 in saline (100 [ Serum concentrations of HMGB1, TNF-a, and interleukin (IL) -6 in circulating blood samples from BALB / c mice infected in the absence or presence of the virus were analyzed. Following the method described in the prior art (Hwang et al., 2012), blood was collected, allowed to solidify at room temperature for 2 hours, and then centrifuged at 4,000 rpm for 20 minutes. The circulating Flag-HMGB1 in the serum was determined by Western blot analysis. Serum concentrations of TNF-a and IL-6 were measured in each measurement kit (mouse TNF-alpha ELISA Ready-SET-Go! Kit, eBioscience, San Diego, Calif. Diego, CA, USA).

14. 공동-14. Co- 면역침강법Immune sedimentation 및 And 면역블럿Immune blot 분석 analysis

용해액(PRO-PREP Protein Extraction Solution, iNtRON Biotechnology)에 제조된 세포 또는 조직 용해물을 단백질 G 세파로오즈^TM 4 Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)로 전처리하였다. 전처리된 용해물을 4 ℃에서 밤새 적절한 IgG 또는 표시된 항체(1 μg)와 함께 배양한 후, 단백질 G 세파로오즈와 함께 4시간 동안 배양하였다. 인산-완충 식염수로 세척한 후에, 2× SDS 겔-로딩 완충액에서 끓임으로써 세파로오즈 비즈로부터 단백질을 추출하여 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 분리하였다. 면역침강물 및 총 용해물(input)을 표시된 항체로 면역블럿 분석하였다. West-ZOL Plus(iNtRON Biotechnology)를 이용하여 면역반응성 밴드를 검출하였다. 전-세포 용해물의 2%를 input으로 사용하였다..
Cells or tissue lysates prepared in the solution (PRO-PREP Protein Extraction Solution, iNtRON Biotechnology) were pretreated with protein G Sepharose ^™ Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK). The pretreated lysates were incubated overnight at 4 ° C with the appropriate IgG or labeled antibody (1 μg), followed by incubation with protein G sepharose for 4 hours. After washing with phosphate-buffered saline, proteins were extracted from the sepharose beads by boiling in 2x SDS gel-loading buffer and separated on a 10% SDS-polyacrylamide gel. Immunoprecipitates and total lysates were immunoblotted to the indicated antibodies. Immunoreactive bands were detected using West-ZOL Plus (iNtRON Biotechnology). 2% of pre-cell lysates were used as input.

15. 15. 엔도톡신Endotoxin 생존율 시험 Survival rate test

실험 주령에 해당하는 BALB/c 마우스(수컷, 6-7 주령, 20-25 g)에 Flag-HMGB1, Flag-HMGB1^K282930R, Myc-SIRT1, 또는 lacZ를 발현하는 정제 재조합 아데노바이러스 1 × 10¹⁰ 입자가 포함되어 있는 식염수(100 μl)를 정맥주사 하였다. 2일 후에, 마우스에 박테리아성 엔도톡신(1 mg/kg, Escherichia coli LPS 0111:B4)을 복강내 주사하여 내독소혈증을 유도하였다. LPS 주사 후 2주 동안 사망률을 기록하여 추가적인 사망 발생 여부를 확인하였다.
Weeks of age in experiment BALB / c mice (male, 6-7 weeks old, 20-25 g) for the purification of recombinant adenovirus expressing the HMGB1-Flag, Flag-HMGB1 ^K282930R, Myc-SIRT1, or lac Z 1 × ¹⁰ 10 The saline solution (100 μl) containing the particles was intravenously injected. Two days later, mice were treated with bacterial endotoxin (1 mg / kg, Escherichia coli LPS 0111: B4) was intraperitoneally injected to induce endotoxemia. Mortality rates were recorded for two weeks after LPS injection to confirm the occurrence of additional deaths.

16. 통계 분석16. Statistical Analysis

데이터를 평균±표준편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 일원분산분석(one-way ANOVA) 및 검정 방법(Tukey-Kramer test)을 이용하여 결정하였다. p < 0.05에 해당하는 값을 통계적으로 유의성있는 것으로 간주하였다.
Data are presented as mean ± standard deviation. Statistical significance was determined using one-way ANOVA and the Tukey-Kramer test. Values corresponding to p < 0.05 were considered statistically significant.

<결과><Result>

1. One. HMGB1HMGB1 는 The SIRT1SIRT1 과 물리적으로 상호작용한다Physically interact with

SIRT1이 HMGB1 방출의 음성 조절(negative regulation)에 결정적인 인자임은 선행문헌(Hwang et al., 2014)에 보고된 바 있다. 본 발명은 공동-면역침강법을 사용하여 HMGB1 및 SIRT1 간의 상호작용에 대한 상세 기전을 추가로 연구하였다. 에피토프-태그 단백질을 발현하는 HEK293T 세포의 용해물을 항-Flag 항체와 혼합하고, 항-Myc 항체와 면역블럿팅 수행하여 얻어진 면역 복합체를 분석하였다. 공동-형질주입된 세포의 용해물에 대하여 HMGB1를 면역침강시키면 SIRT1의 공동-침강이 발생했다(도 1(A) 참조). 또한, 면역침강에 항-Myc 항체를 사용하고 침강물의 면역블럿팅에 항-Flag 항체를 사용하여 상반적으로 수행하여도 이러한 상호작용이 동일하게 검출되었다(도 2(A) 참조). 대조 마우스 면역글로불린 G(IgG)는 어떠한 단백질도 침강시키지 않았다. HMGB1-포함하는 세포 용해물을 박테리아에 의해 생산된 GST-융합된 SIRT1 단백질과 함께 배양한 시험관내 단백질-결합 분석에서도 유사한 결과가 얻어졌다(도 1(B) 및 2(B) 참조). SIRT1 is a crucial factor in the negative regulation of HMGB1 release, as reported in the previous paper (Hwang et al., 2014). The present invention further explored the mechanism of the interaction between HMGB1 and SIRT1 using co-immunoprecipitation. The lysates of HEK293T cells expressing epitope-tagged proteins were mixed with an anti-Flag antibody, and the immune complexes were analyzed by immunoblotting with anti-Myc antibodies. Immunoprecipitation of HMGB1 against lysates of co-transfected cells resulted in co-precipitation of SIRT1 (see Figure 1 (A)). In addition, even when the anti-Myc antibody was used for immunoprecipitation and anti-Flag antibody was used for immunoblotting of the precipitate, these interactions were detected in the same manner (see Fig. 2 (A)). Control mouse immunoglobulin G (IgG) did not precipitate any protein. Similar results were obtained in an in vitro protein-binding assay in which an HMGB1-containing cell lysate was incubated with the GST-fused SIRT1 protein produced by the bacteria (see Figures 1 (B) and 2 (B)).

이러한 결과와 일치하여, 공초점 현미경으로 측정한 결과, 이소성으로 발현된 붉은색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP)-태그된 HMGB1 및 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)-태그된 SIRT1이 동일한 위치에, 주로 HEK293T 세포의 핵에 위치하는 것을 확인하였다(도 1(C) 참조).Consistent with these results, confocal microscopy showed that SIRT1 tagged as ectopic red fluorescent protein (RFP) -tagged HMGB1 and green fluorescent protein (GFP) -like (Fig. 1 (C)). As shown in Fig.

HMGB1과 SIRT1과의 상호작용의 원인이 되는 HMGB1의 부위를 확인하기 위하여, HMGB1 결실 돌연변이를 제작하였다(도 1(D) 및 2(C) 참조). 이러한 돌연변이체를 Myc-SIRT1와 함께 HEK293T 세포로 개별적으로 형질주입하고, 공동-면역침강법을 수행하여 이러한 돌연변이체가 SIRT1에 결합하는 능력을 평가하였다. 그 결과, HMGB1-B&C는 상호작용을 보이지 않은 반면, HMGB1-전장(FL) 및 HMGB1-A&B는 SIRT1과의 강한 상호작용을 나타내어, HMGB1의 N-말단 부위가 SIRT1과의 상호작용에 필수적임을 시사하였다(도 1(E) 참조). HMGB1 deletion mutants were prepared (see Figures 1 (D) and 2 (C)) to identify the sites of HMGB1 responsible for the interaction of HMGB1 and SIRT1. These mutants were individually transfected with Myc-SIRT1 into HEK293T cells and co-immunoprecipitation was performed to assess the ability of these mutants to bind to SIRT1. As a result, HMGB1-B & C showed no interaction while HMGB1-FL and HMGB1-A & B showed strong interaction with SIRT1 suggesting that the N-terminal region of HMGB1 is essential for interaction with SIRT1 (See Fig. 1 (E)).

HMGB1의 N-말단 부위의 어느 부분이 SIRT1과 상호작용하는지 분석하기 위하여, A-박스 또는 B-박스만을 포함하는 돌연변이체와의 면역침강을 수행하였다. 그 결과, HMGB1-B는 SIRT1과 상호작용하지 않은 반면에, HMGB1-A는 SIRT1과 강하게 상호작용하여, HMGB1의 A-박스가 SIRT1과의 상호작용을 매개한다는 것을 나타냈다(도 1(F) 및 2(D) 참조). HMGB1 결실 돌연변이를 포함하는 세포 용해물을, 박테리아에 의해 생산된 GST-융합된 SIRT1 단백질과 함께 배양한 GST pull-down 분석에서도 유사한 결과를 얻었다(도 2(E) 참조). 이러한 결과는 HMGB1 및 SIRT1가 서로 물리적 복합체룰 형성할 수 있다는 점을 보여주는 최초의 시도이다.
To analyze which part of the N-terminal part of HMGB1 interacts with SIRT1, immunoprecipitation with a mutant containing only A-box or B-box was performed. As a result, while HMGB1-B did not interact with SIRT1, HMGB1-A strongly interacted with SIRT1, indicating that A-box of HMGB1 mediated the interaction with SIRT1 (Fig. 1 (F) and 2 (D)). Similar results were obtained with GST pull-down assays in which cell lysates containing HMGB1 deletion mutants were incubated with GST-fused SIRT1 protein produced by bacteria (Fig. 2 (E)). These results are the first to show that HMGB1 and SIRT1 can form a physical complex with each other.

2. 2. LPSLPS 는 The HMGB1HMGB1 방출로 이어지는 Leading to release HMGB1HMGB1 및 And SIRT1SIRT1 의 분리를 촉진한다Promote the separation of

세포외부 환경으로 방출된 HMGB1은 다양한 병리학적 조건에서 염증전 사이토카인으로 기능한다(Harris et al., 2012). 따라서, 이러한 방출의 항상성 조절이 매우 중요할 것으로 보인다. 본 발명에서는 SIRT1가 HMGB1와의 직접적 상호작용을 통하여 이러한 맥락으로 기능하는지 조사하였다.HMGB1 released into the extracellular environment functions as a pre-inflammatory cytokine under a variety of pathological conditions (Harris et al., 2012). Therefore, it seems that the control of homeostasis of this release is very important. In the present invention, we examined whether SIRT1 functions in this context through direct interaction with HMGB1.

HMGB1 및 SIRT1을 이소성으로 발현하는 HEK293T 세포에서 항-Flag(도 3(A) 참조) 및 항-Myc(도 3(B) 참조) 항체에 의한 공동-면역침강법에 의해 HMGB1 및 SIRT1의 복합체는 LPS 존재시에 급격히 분리되는 것을 확인하였다. 항체 특이성을 평가하기 위한 또 다른 항-Flag 항체를 이용한 실험에서도 유사한 결과를 얻었다(도 4(A) 참조). Complexes of HMGB1 and SIRT1 by co-immunoprecipitation with anti-Flag (see Fig. 3A) and anti-Myc (see Fig. 3B) antibodies in HEK293T cells expressing HMGB1 and SIRT1 ectopically It was confirmed that they were abruptly separated in the presence of LPS. Similar results were obtained with another anti-Flag antibody for evaluating antibody specificity (see Fig. 4 (A)).

HL-60, U-937, 및 RAW 264.7를 포함한 단핵구 세포주에서 HMGB1 방출을 유발하는 자극 인자(도 4(B) 및 4(C) 참조) 중, 폴리이노시닉-폴리시티딜릭 산(Poly(I:C)) 및 인터페론(IFN)-γ는 HMGB1 및 SIRT1 복합체의 분리를 일으키지 않은 반면에, LPS 및 TNF-α는 상기 복합체를 분리시켰다(도 3(C) 참조). 박테리아에 의해 생산된 GST-융합된 SIRT1 단백질을 이용한 GST pull-down 분석에서도 유사한 결과를 얻었다(도 3(D) 및 3(E) 참조). Among the stimulating factors (see FIGS. 4 (B) and 4 (C)) that induce HMGB1 release in mononuclear cell lines including HL-60, U-937, and RAW 264.7, polyinosinic- I: C) and interferon (IFN) -y did not cause the separation of the HMGB1 and SIRT1 complexes, whereas LPS and TNF- alpha separated the complexes (see Fig. 3 (C)). Similar results were obtained with GST pull-down analysis using GST-fused SIRT1 protein produced by bacteria (see Figures 3 (D) and 3 (E)).

또한, HMGB1 및 SIRT1의 복합체는 비활동 조건 하에서 이러한 단백질의 이소성 발현 없이 RAW 264.7 세포에서 검출되었고, 이러한 복합체는 LPS의 존재 하에서 분리되어 HMGB1의 세포외부 환경으로의 방출로 이어졌다(도 3(F) 참조).
In addition, complexes of HMGB1 and SIRT1 were detected in RAW 264.7 cells without ectopic expression of these proteins under inactive conditions, and this complex was isolated in the presence of LPS leading to the release of HMGB1 into the extracellular environment (Fig. 3 (F) Reference).

3. 3. HMGB1HMGB1 는 The HMGB1HMGB1 의 방출에 중요한, 가역적으로 Which is important for the release of 아세틸화되는Acetylated 라이신 Lysine 잔기를The residue 포함한다 Include

아세틸화와 같은 번역 후 수식이 세포외부 환경으로의 HMGB1 방출에 매우 중요하므로(Bonaldi et al., 2003), 아세틸화가 HMGB1 및 SIRT1 간 복합체 형성에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 단핵구 세포에 HMGB1를 방출하도록 다양한 신호로 자극을 가하면, 면역침강물에서의 아세틸화된 HMGB1 수준이 상승하였다(도 4(D) 참조). Since post-translational modifications such as acetylation are crucial for HMGB1 release into the extracellular environment (Bonaldi et al., 2003), we have determined whether acetylation affects HMGB1 and SIRT1 complex formation. Stimulation with various signals to release HMGB1 into monocyte cells increased the level of acetylated HMGB1 in the immunoprecipitate (see FIG. 4 (D)).

이러한 HMGB1의 아세틸화가 SIRT1으로부터 분리와 관련있는지 평가하기 위하여, HMGB1를 아세틸화시키는 p300/CBP-관련 인자(p300/CBP-associated factor, PCAF)를 사용하였다(도 6(A) 참조). HA-태그된 PCAF를 HEK293T 세포에 이소성으로 발현시키면 HMGB1 및 SIRT1 간 회합이 현저히 감소하였고, 이는 HMGB1의 PCAF-매개 아세틸화가 SIRT1과의 상호작용을 저해한다는 것을 나타낸다(도 5(A) 참조). 이러한 SIRT1으로부터 HMGB1의 아세틸화-매개 분리는, LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 HMGB1의 증가된 방출로도 입증되었다(도 5(B) 참조). 이러한 결과로부터 HMGB1의 아세틸화가 SIRT1으로부터의 분리를 유발하고, 이에 의해 세포외부 환경으로 HMGB1의 방출을 촉진한다는 것을 알 수 있다. To evaluate whether this acetylation of HMGB1 is involved in the separation from SIRT1, the p300 / CBP-associated factor (PCAF), which acetylates HMGB1, was used (see Fig. 6 (A)). Expression of HA-tagged PCAF heterologously in HEK293T cells markedly reduced the association between HMGB1 and SIRT1, indicating that PCAF-mediated acetylation of HMGB1 inhibited the interaction with SIRT1 (see FIG. 5 (A)). This acetylation-mediated cleavage of HMGB1 from SIRT1 was also evidenced by increased release of HMGB1 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells (Fig. 5 (B)). From these results, it can be seen that acetylation of HMGB1 causes separation from SIRT1, thereby promoting the release of HMGB1 into the extracellular environment.

HMGB1의 A-박스는 SIRT1과의 상호작용에 필수적인 부위이므로, 이 부위에서 아세틸화가 발생하는 위치를 확인하기 위하여 HMGB1의 A-박스 결실 돌연변이를 제작하였다(도 5(C) 참조). 이러한 돌연변이체를 Myc-SIRT1와 함께 HEK293T 세포로 개별적으로 공동-형질주입시켰다. 그 결과, Δ³⁰A-박스는 SIRT1과의 상호작용을 나타내지 않은 반면에, A-박스 및 Δ¹¹A-박스는 SIRT1과 상호작용하고, 이러한 상호작용이 LPS에 의해 파괴되었다. 따라서, HMGB1의 N-말단 아미노산 12-30이 SIRT1과의 상호작용에 필수적임을 나타냈다(도 5(D) 참조). 세포를 TNF-α로 자극을 가한 경우에도 유사한 결과를 얻었다(도 6(B) 참조).Since the A-box of HMGB1 is an essential site for interaction with SIRT1, an A-box deletion mutation of HMGB1 was made to confirm the position of acetylation at this site (see Fig. 5 (C)). These mutants were co-transfected individually into HEK293T cells with Myc-SIRT1. As a result, Δ ³⁰ A-box did not show interaction with SIRT 1, while A-box and Δ ¹¹ A-box interacted with SIRT 1, and this interaction was destroyed by LPS. Thus, the N-terminal amino acid 12-30 of HMGB1 was shown to be essential for interaction with SIRT1 (see Fig. 5 (D)). Similar results were obtained when cells were stimulated with TNF-α (see FIG. 6 (B)).

HMGB1의 SIRT1와의 상호작용 및 SIRT1으로부터의 분리의 원인이 되는 결정적인 라이신 잔기(들)을 확인하기 위하여, HMGB1의 N-말단 12-30 잔기 내의 아미노산 서열을 분석하였다. 이 부분에, HMGB1는 28, 29, 및 30번 위치에 3개 라이신 잔기를 가지며, 이들은 다양한 종에서 진화적으로 잘 보존되어 있다(도 5(E) 참조). HMGB1 및 SIRT1 간의 상호작용에 있어서 상기 라이신 잔기의 중요성을 확인하기 위하여, HMGB1의 잔기 28, 29, 및 30의 아미노산을 치환하여(HMGB1^K282930R), 정상적으로 존재하는 라이신을 아르기닌으로 교체하였고, 이는 저-아세틸화 상태와 유사하다(Li et al., 2007). HEK293T 세포에 HMGB1^K282930R 돌연변이체를 Myc-SIRT1와 함께 공동-형질주입하면, 야생형 HMGB1를 사용할 때와는 반대로, HMGB1 및 SIRT1의 LPS- 또는 TNF-α-매개된 분리가 검출되지 않았다(도 5(F) 및 6(C) 참조). To identify the critical lysine residue (s) responsible for the interaction of HMGB1 with SIRT1 and the separation from SIRT1, the amino acid sequence within the N-terminal 12-30 residues of HMGB1 was analyzed. In this part, HMGB1 has three lysine residues at positions 28, 29, and 30, which are evolutionarily well conserved in various species (see FIG. 5 (E)). In order to confirm the significance of the lysine residues in the interaction between HMGB1 and SIRT1, the amino acids of residues 28, 29 and 30 of HMGB1 were replaced (HMGB1 ^K282930R ), replacing the normally present lysine with arginine, Similar to the acetylation state (Li et al., 2007). Co-transfection of HMGB1 ^K282930R mutants with Myc-SIRT1 into HEK293T cells did not detect LPS- or TNF-a-mediated cleavage of HMGB1 and SIRTl, as opposed to using wild-type HMGB1 (Figure 5 F) and 6 (C)).

상기 3개 라이신 잔기를 글루타메이트로 돌연변이시켜(HMGB1^K282930Q) 과-아세틸화 상태를 모방한 돌연변이체를 이용함으로써(Schwer et al., 2006), SIRT1으로부터의 HMGB1의 분리에서 아세틸화가 관련된다는 것을 추가로 입증하였다. 이러한 경우에, HMGB1 및 SIRT1 간 복합체 형성은 비활동 세포에서 야생형 HMGB1를 사용할 때와 비교하여 급격히 감소하였다(도 5(G) 참조). 그러나, 이러한 3개 라이신 잔기 중 어느 하나의 개별적 치환은 LPS 또는 TNF-α에 대한 HMGB1 및 SIRT1 의 분리에 영향을 미치지 않아서, 3개 잔기 모두의 아세틸화가 상기 분리에 필요하다는 것을 시사하였다(도 6(D) 참조). (Schwer et al., 2006), by mutating these three lysine residues to glutamate (HMGB1 ^K282930Q ) and -acetylation state (Schwer et al., 2006), further demonstrating that acetylation is involved in the separation of HMGB1 from SIRT1 . In this case, the complex formation between HMGB1 and SIRT1 was abruptly reduced as compared with the use of wild-type HMGB1 in inactive cells (see Fig. 5 (G)). However, the individual substitution of any of these three lysine residues did not affect the separation of HMGB1 and SIRTl for LPS or TNF- [alpha], suggesting that acetylation of all three residues is required for the separation (D)).

상기 결과로부터, HMGB1의 28, 29, 및 30 라이신 잔기가 HMGB1의 SIRT1과의 상호작용에 결정적이며, HMGB1의 라이신 잔기에서의 염증성 신호-매개 아세틸화가 HMGB1의 세포질로의 이동을 촉진시켜, 염증성 자극에 대하여 핵 단백질을 사이토카인으로 전환시킨다는 것을 알 수 있다. These results indicate that the 28, 29, and 30 lysine residues of HMGB1 are crucial for the interaction of HMGB1 with SIRT1 and that the inflammatory signal-mediated acetylation of HMGB1 at the lysine residues promotes the migration of HMGB1 into the cytoplasm, To convert the nuclear protein to a cytokine.

SIRT1이 HMGB1와 탈아세틸화 의존적 복합체를 형성하여 HMGB1의 방출을 간섭한다는 것을 평가하기 위하여, 야생형 단백질(Ad-Flag-HMGB1 및 Ad-Myc-SIRT1) 또는 HMGB1의 탈아세틸화 결실 돌연변이체(Ad-Flag-HMGB1^K282930R)를 발현하는 아데노바이러스를 제작하였다.(Ad-Flag-HMGB1 and Ad-Myc-SIRT1) or deacetylated deletion mutants of HMGB1 (Ad-Flag-HMGB1 and Ad-Myc-SIRT1), in order to evaluate that SIRT1 forms a deacetylation- dependent complex with HMGB1 and interferes with the release of HMGB1. Flag-HMGB1 ^K282930R ).

Ad-Myc-SIRT1, 및 Ad-Flag-HMGB1 또는 Ad-Flag-HMGB1^K282930R로 공동-감염된 RAW 264.7 세포에서 HMGB1의 및 SIRT1의 복합체가 검출되었지만, LPS-자극에 의한 분리는 Ad-Myc-SIRT1 및 Ad-Flag-HMGB1^K282930R 복합체에서 현저히 감소되었다. 이것은 HMGB1의 LPS-유도 아세틸화 및 방출 억제와 관련이 있다(도 5(H) 참조). 이러한 아데노바이러스로 감염시키면, 외인성 HMGB1 및 SIRT1 단백질의 수준은 LPS의 존재 및 비 존재시에 유사하였다(도 5(H) 및 6(E) 참조). HMGB1 방출의 탈아세틸화-매개 억제는 LPS 또는 TNF-α로 처리한 RAW 264.7 세포에서 확인하였다(도 6(F) 참조). 이러한 결과로부터, 비활동 세포에서 HMGB1 및 SIRT1가 복합체를 형성함으로써 HMGB1이 핵에 존재하는 것에 대한 평형을 유지하는 것으로 추정된다. ^Complexes of HMGB1 and SIRT1 were detected in RAW 264.7 cells co-infected with Ad-Myc-SIRT1 and Ad-Flag-HMGB1 or Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R , but LPS- ^Was significantly reduced in the Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R complex. This is associated with LPS-induced acetylation and release inhibition of HMGB1 (see FIG. 5 (H)). Upon infection with these adenoviruses, levels of exogenous HMGB1 and SIRT1 protein were similar in the presence and absence of LPS (see Figures 5 (H) and 6 (E)). Deacetylation-mediated inhibition of HMGB1 release was confirmed in RAW 264.7 cells treated with LPS or TNF-α (see FIG. 6 (F)). From these results, it is presumed that HMGB1 and SIRT1 form complexes in non-active cells to maintain equilibrium against the presence of HMGB1 in the nucleus.

LPS 자극은 HMGB1의 아세틸화를 신속히 유도하고, 이러한 아세틸화는 HMGB1의 핵 이동 및 세포질성 축적에 필수적이다(Bonaldi et al., 2003). 따라서, LPS 또는 TNF-α로 자극된 세포에서 이러한 3개 라이신 잔기가 아세틸화되는지 여부를 알아보았다. 액체 크로마토그래피-질량 분석에 의해 확인된 바와 같이(도 5(I) 및 6(G) 참조), 태그된 HMGB1 및 SIRT1로 형질주입된 HEK293T 세포에서, HMGB1의 28, 29, 및 30 라이신 잔기는 LPS 또는 TNF-α 자극에 의해 아세틸화되었다. 그러나, IFN-γ 또는 Poly(I:C)로 자극된 세포로부터 분리된 HMGB1에서는 3개 라이신 잔기가 모두 아세틸화된 것은 검출되지 않았다. IFN-γ 또는 Poly(I:C)로 자극된 세포에서 HMGB1의 라이신 잔기 30은 아세틸화되었지만, 이는 HMGB1의 및 SIRT1의 복합체의 분리를 자극하기에는 충분하지 않은 것으로 보였으며, 이로부터 3개 라이신 잔기 모두의 아세틸화가 SIRT1으로부터의 HMGB1의 분리 및 세포질로의 이동에 필수적임을 알 수 있다(도 6(H) 및 6(I) 참조).
LPS stimulation rapidly induces acetylation of HMGB1, and this acetylation is essential for nuclear migration and cellular accumulation of HMGB1 (Bonaldi et al., 2003). Thus, we examined whether these three lysine residues were acetylated in cells stimulated with LPS or TNF-α. In the HEK293T cells transfected with HMGB1 and SIRT1 tagged as identified by liquid chromatography-mass spectrometry (see Figures 5 (I) and 6 (G)), the 28, 29, and 30 lysine residues of HMGB1 LPS or TNF-a stimulation. However, in HMGB1 isolated from cells stimulated with IFN-y or Poly (I: C), it was not detected that all three lysine residues were acetylated. Lysine residue 30 of HMGB1 was acetylated in cells stimulated with IFN-y or Poly (I: C), but this did not appear to be sufficient to stimulate the separation of HMGB1 and SIRT1 complexes, from which three lysine residues All of the acetylation is indispensable for the isolation of HMGB1 from SIRT1 and its migration into the cytoplasm (see Figures 6 (H) and 6 (I)).

4. 4. CRM1CRM1 과의 상호작용을 통한 Through interaction with HMGB1HMGB1 의 핵 방출은 The nuclear release of SIRT1SIRT1 에 의해 음성적으로 조절된다Lt; RTI ID = 0.0 >

CRM1은 크로마틴 구조 유지 및 핵 단백질 방출에 필수적 매개체인, 진화적으로 보존된 단백질이다(Fukuda et al., 1997). CRM1이 HMGB1의 아세틸화-매개된 SIRT1으로부터의 분리에 따른 HMGB1의 방출과 관련있는지 알아보기 위하여, 공동-면역침강법으로 HMGB1 및 CRM1 간 상호작용을 조사하였다.CRM1 is an evolutionarily conserved protein (Fukuda et al., 1997), an essential mediator for chromatin structure retention and nuclear protein release. The interaction between HMGB1 and CRM1 was examined by co-immunoprecipitation to determine whether CRM1 is associated with release of HMGB1 following separation from acetylation-mediated SIRT1 of HMGB1.

LPS 또는 TNF-α의 자극에 대하여, 항-Flag 항체로 면역침강되는 CRM1의 양은 증가되었으며(도 7(A) 참조), 이로써 HMGB1과의 잠재적인 상호작용이 있음을 알 수 있다. 대조적으로, 공동-면역침강법으로 측정한 HMGB1 및 SIRT1 간의 상호작용은 LPS 또는 TNF-α 자극에 의하여 실질적으로 약화되어, HMGB1에 대한 친화성이 SIRT1으로부터 CRM1으로 기우는 것을 시사하였다(도 7(B) 및 8(A) 참조). With respect to the stimulation of LPS or TNF-a, the amount of CRM1 immunoprecipitated with anti-FLAG antibody was increased (see Fig. 7 (A)), indicating that there is a potential interaction with HMGB1. In contrast, the interaction between HMGB1 and SIRTl as measured by co-immunoprecipitation was substantially attenuated by LPS or TNF-a stimulation, suggesting that affinity for HMGB1 leaks from SIRTl to CRMl (Figure 7 B) and 8 (A)).

그러나, CRM1 및 HMGB1 간 상호작용은 HMGB1^K282930R로 형질주입된 HEK293T 세포에서 LPS 또는 TNF-α 자극에 대하여도 영향을 받지 않아서(도 7(C) 및 8(B) 참조), HMGB1의 SIRT1으로부터의 아세틸화-매개된 분리는 HMGB1과 CRM1의 상호작용에 중요함을 나타냈다. However, the interaction between CRM1 and HMGB1 was not affected by LPS or TNF-a stimulation in HEK293T cells transfected with HMGB1 ^K282930R (see Figures 7 (C) and 8 (B) The acetylation-mediated cleavage was important for the interaction of HMGB1 and CRM1.

다음으로, 이러한 아세틸화-매개된 HMGB1 및 CRM1의 상호작용이, 에피토프-태그된 단백질을 이소성으로 발현하는 RAW 264.7 세포에서, LPS 또는 TNF-α 자극에 따른 HMGB1의 세포외부 환경으로의 방출과 연결되는지 조사하였다. 야생형 HMGB1을 발현하는 세포에서 HMGB1의 세포외부 농도가 LPS 또는 TNF-α 자극에 대해 증가되고, CRM1으로 형질주입된 세포에서 더욱 증가되어, CRM1이 HMGB1의 셔틀링(shuttling)에 결정적임을 나타내었다. 그러나, 이러한 HMGB1의 방출 증가는 HMGB1^K282930R 발현 세포에서 거의 완전히 차단되고, CRM1으로 형질주입된 세포에서조차도 완전히 차단되어, HMGB1 및 SIRT1 간의 탈아세틸화-매개된 상호작용이 HMGB1 방출 조절에 중요하다는 것을 시사하였다(도 7(D) 및 8(C) 참조).
Next, the interaction of these acetylated-mediated HMGB1 and CRM1 is linked to the release of HMGB1 into the extracellular environment by LPS or TNF-a stimulation in RAW 264.7 cells expressing epitope-tagged proteins ectopically Respectively. In cells expressing wild-type HMGB1, the extracellular concentration of HMGB1 was increased for LPS or TNF-a stimulation and further increased in CRM1-transfected cells, indicating that CRM1 is crucial for shuttling of HMGB1. However, this increased release of HMGB1 is almost completely blocked in HMGB1 ^K282930R- expressing cells, and is completely blocked even in CRM1-transfected cells suggesting that deacetylation-mediated interaction between HMGB1 and SIRT1 is important for the regulation of HMGB1 release (See Figs. 7 (D) and 8 (C)).

5. 아세틸화가 5. Acetylation HMGB1HMGB1 의 세포질로의 이동에 결정적 요인이다Is a crucial factor for migration to the cytoplasm

HMGB1의 세포내 위치에 있어서의 28, 29, 및 30 라이신 잔기의 중요성을 결정하기 위하여, 야생형 HMGB1, HMGB1^K282930R, 및 SIRT1의 형광 융합 단백질을 이용하여 HMGB1 및 SIRT1의 세포내 위치를 공초점 형광 현미경으로 추가로 조사하였다. 햄스터 세포(Chinese hamster ovary cell, CHO cell)에서 야생형 RFP-HMGB1는 핵 부위에 존재하고, GFP-SIRT1와 함께 존재하였다. LPS 또는 TNF-α 자극을 주면, RFP-HMGB1 단백질 대부분이 핵 부분에 남아 있었지만, 다수의 신호가 확산 스테이닝 패턴으로 세포질에서 검출되었다. To determine the significance of the 28, 29, and 30 lysine residues in the intracellular location of HMGB1, the intracellular location of HMGB1 and SIRT1 was determined by confocal fluorescence microscopy using the fluorescent fusion proteins of wild-type HMGB1, HMGB1 ^K282930R , and SIRT1 . In wild-type hamster ovary cells (CHO cells), wild-type RFP-HMGB1 was present in the nucleus and was present with GFP-SIRT1. When LPS or TNF-a stimulation was given, most of the RFP-HMGB1 protein remained in the nucleus, but a large number of signals were detected in the cytoplasm in the diffuse staining pattern.

대조적으로, 이러한 LPS- 또는 TNF-α-유도에 의한 세포질 이동은 RFP-HMGB1^K282930R 발현 세포에서는 완전히 차단되었다(도 9(A) 및 9(B) 참조). 그러나, 이러한 차단은 Poly(I:C) 또는 IFN-γ로 자극된 세포에서는 관찰되지 않았다(도 10(A) 및 10(B) 참조). In contrast, this LPS- or TNF- [alpha] -induced cellular migration was completely blocked in RFP-HMGB1 ^K282930R expressing cells (see Figures 9 (A) and 9 (B)). However, this blockade was not observed in cells stimulated with Poly (I: C) or IFN-y (see Figures 10 (A) and 10 (B)).

이러한 결과와 일치하게, LPS 및 TNF-α는 SIRT1 및 HMGB1^K282930R 간이 아닌, SIRT1 및 HMGB1 간 복합체의 분리만을 자극한 반면, Poly(I:C) 및 IFN-γ은 SIRT1으로부터 HMGB1 및 HMGB1^K282930R 모두의 분리를 촉진시켰다(도 10(C) 및 10(D) 참조). 이러한 결과로부터, Poly(I:C) 및 IFN-γ는 LPS 및 TNF-α와 유사하게 HMGB1 방출을 자극하지만(도 4(B) 및 4(C) 참조), Poly(I:C)- 또는 IFN-γ-매개된 HMGB1의 SIRT1으로부터의 분리는 HMGB1의 28, 29, 및 30 라이신 잔기의 아세틸화(LPS 및 TNF-α에 의해 촉진됨)와는 독립적임을 알 수 있다.Consistent with this result, LPS and TNF-α are SIRT1 and HMGB1 ^K282930R the other hand a simple and not, stimulation only separation of SIRT1 and HMGB1 between complexes, Poly (I: C) from and IFN-γ are SIRT1 in all HMGB1 and HMGB1 ^K282930R (See Figs. 10 (C) and 10 (D)). These results indicate that Poly (I: C) and IFN-y stimulate HMGB1 release similar to LPS and TNF-α (see FIGS. 4 (B) and 4 Isolation of IFN-? -Mediated HMGB1 from SIRT1 is independent of acetylation (promoted by LPS and TNF-?) Of the 28, 29, and 30 lysine residues of HMGB1.

과-아세틸화는 HMGB1의 이동을 위한 결정적 신호이므로(Lu et al., 2014), 과-아세틸화 돌연변이를 갖는 융합 단백질(RFP-HMGB1^K282930Q)을 연구하였다. 자극 존재시의 야생형 HMGB1의 위치와 유사하게, RFP-HMGB1^K282930Q는 자극 비 존재시에도 세포질에 위치하였다(도 9(A) 및 9(B) 참조). 이러한 결과로부터, HMGB1^K282930Q는 SIRT1과의 상호작용 능력을 상실한 반면, 핵에 좀 더 위치하는 HMGB1^K282930R는 SIRT1과 상호작용할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 탈아세틸화는 HMGB1 및 SIRT1의 상호작용에 필수불가결한 것으로 여겨진다. 이는 HMGB1의 아세틸화와 같은 번역 후 수식이 HMGB1의 방출을 조절한다는 선행문헌(Bonaldi T, 2003)과 일치한다.
Since hyper-acetylation is a crucial signal for the movement of HMGB1 (Lu et al., 2014), fusion proteins with over-acetylation mutations (RFP-HMGB1 ^K282930Q ) were studied. Similar to the position of the wild-type HMGB1 in the presence of the stimulus, RFP-HMGB1 ^K282930Q was also located in the cytoplasm in the absence of stimulation (see FIGS. 9 (A) and 9 (B)). These results indicate that HMGB1 ^K282930Q lost its ability to interact with SIRT1 while HMGB1 ^K282930R, located more in the nucleus, could interact with SIRT1. Thus, deacetylation is considered to be indispensable for the interaction of HMGB1 and SIRT1. This is consistent with the prior art (Bonaldi T, 2003), in which post-translational modifications such as acetylation of HMGB1 regulate the release of HMGB1.

6. 6. HMGB1HMGB1 의 이동은 The movement of SIRT1SIRT1 에 의해 직접적으로 조절된다Lt; RTI ID = 0.0 >

유전적으로 SIRT1이 제거된 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)(SIRT1^-/- MEF)는 야생형 MEF(SIRT1^+/+ MEF)에 비하여 상당히 증가된 염증성 반응을 보인다(Bernier et al., 2011; Hwang et al., 2014). SIRT1은 SIRT1^-/- MEF에서 완전히 비발현됨을 확인하였다(도 12(A) 참조). SIRT1^+/+ MEF에서는 LPS 또는 TNF-α로 자극을 가하면, HMGB1의 핵으로부터 세포질로의 이동이 증가되었다. 반면, SIRT1^-/- MEF에서는 LPS 또는 TNF-α 자극 여부와 상관없이 HMGB1의 핵으로부터 세포질로의 이동이 관찰되었다(도 11(A), 12(B), 및 12(C) 참조). SIRT1 및 HMGB1 이동 간의 기전적 관련성을 알아보기 위하여, SIRT1^-/- MEF을 야생형 SIRT1-발현 벡터(Myc-SIRT1)로 형질주입시켰다. SIRT1의 이소성 발현은 SIRT1^-/- MEF에서 LPS 또는 TNF-α의 존재 하에서도 HMGB1의 이동을 억제하였다(도 11(B) 및 12(D) 참조).Mouse embryonic fibroblast (MEF) (SIRT1 ^{- / -} MEF) genetically deficient in SIRT1 exhibits a significantly increased inflammatory response compared to wild type MEF (SIRT1 ^{+ / +} MEF) (Bernier et al., 2011 ; Hwang et al., 2014). SIRT1 was completely non-expressed in SIRT1 ^{- / -} MEF (see Fig. 12 (A)). In SIRT1 ^{+ / +} MEF, when stimulated with LPS or TNF-α, migration of HMGB1 from the nucleus to the cytoplasm was increased. On the other hand, in SIRT1 ^{- / -} MEF, migration of HMGB1 from the nucleus to the cytoplasm was observed irrespective of LPS or TNF-α stimulation (see FIGS. 11 (A), 12 (B), and 12 (C)). SIRT1 and HMGB1 motifs were transfected with wild-type SIRT1 ^- expression vector (Myc-SIRT1). Ectopic expression of SIRT1 also inhibited the migration of HMGB1 in the presence of LPS or TNF-? In SIRT1 ^{- / -} MEF (see FIGS. 11 (B) and 12 (D)).

HMGB1 방출에서 SIRT1의 기능적 중요성을 추가로 밝혀내기 위하여, HMGB1 및 SIRT1 간의 상호작용에 미치는 SIRT1 탈아세틸화제 효능의 영향을 평가하였다. 레스베라트롤에 의한 SIRT1의 활성화는 HMGB1의 SIRT1으로부터의 LPS-유도된 분리를 거의 완전히 반전시켰다(도 11(C) 참조). 레스베라트롤 또는 SIRT1 억제제인 써티놀(Mai et al., 2005)에 의한 SIRT1 기능의 조절 또한, 에피토프-태그된 단백질을 발현하는 RAW 264.7 세포에서 HMGB1의 아세틸화 수준 및 HMGB1 방출과 관련이 있었다(도 11(D) 참조). 또한, siRNA-매개된 SIRT1 넉다운은 HMGB1 및 SIRT1 간의 상호작용을 감소시키고, 이에 의해 RAW 264.7 세포로부터 HMGB1의 방출을 증가시켜(도 11(E) 참조), SIRT1이 HMGB1 방출을 억제함으로써 항-염증성 기능을 가진다는 것을 시사하였다.
To further characterize the functional significance of SIRT1 in HMGB1 release, the effect of SIRT1 deacetylating agent on the interaction between HMGB1 and SIRT1 was assessed. Activation of SIRT1 by resveratrol almost completely reversed the LPS-induced separation of HMGB1 from SIRT1 (Figure 11 (C)). Regulation of SIRT1 function by resveratrol or SIRT1 inhibitor Thalinol (Mai et al., 2005) was also associated with HMGB1 acetylation levels and HMGB1 release in RAW 264.7 cells expressing epitope-tagged proteins (Figure 11 (D)). In addition, siRNA-mediated SIRT1 knockdown reduces the interaction between HMGB1 and SIRT1, thereby increasing the release of HMGB1 from RAW 264.7 cells (see Fig. 11 (E)), suggesting that SIRTl inhibits HMGB1 release, .

7. 7. HMGB1HMGB1 방출은 Release 내독소혈증Endotoxemia 모델 마우스에서 From a model mouse 아세틸화Acetylation 상태와 관련된다 It is related to the state

SIRT1은 아세틸화-의존적 방식으로 HMGB1과 직접적으로 상호작용함으로써 대식세포로부터 LPS- 또는 TNF-α-유도된 HMGB1 방출을 억제하였다. 따라서, 전신 염증의 표준 모델인 내독소혈증에서 순환 HMGB1 수준에 SIRT1가 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. SIRT1 inhibited LPS- or TNF- [alpha] -induced HMGB1 release from macrophages by directly interacting with HMGB1 in an acetylation-dependent manner. Therefore, we evaluated whether SIRT1 affects circulating HMGB1 levels in endotoxemia, a standard model of systemic inflammation.

Ad-Flag-HMGB1, Ad-Flag-HMGB1^K282930R, 및/또는 Ad-Myc-SIRT1를 꼬리 정맥을 통해 감염시킨 BALB/c 마우스를 LPS 처리하여 치사적 내독소혈증을 유발하였다. LPS 존재 또는 비 존재 하에서 아데노바이러스로 감염된 마우스에서, 심장, 신장, 간, 및 폐에서 Flag-HMGB1, Flag-HMGB1^K282930R, 및 Myc-SIRT1의 발현을 관찰하였다(도 14(A) 참조). 공동-면역침강된 조직 용해물에서 Flag-HMGB1 및 Myc-SIRT1의 복합체가 검출되었으며, 이는 LPS 처리에 의하여 현저히 감소되었다. 그러나, 이러한 공동-면역침강법의 LPS-유도된 억제는 Ad-Flag-HMGB1^K282930R 및 Ad-Myc-SIRT1로 감염된 마우스의 조직에서는 거의 완전히 상반되었다(도 13(A) 참조). 이러한 결과와 일치하여, 엔도톡신 처리 후에 Flag-HMGB1의 혈청 수준은 Ad-Flag-HMGB1^K282930R 및 Ad-Myc-SIRT1로 감염된 마우스에서는 상당히 감소된 반면에, Ad-Flag-HMGB1 및 Ad-Myc-SIRT1 로 감염된 마우스에서는 상당히 증가되었다(도 13(B) 참조). 이러한 결과는 SIRT1이 HMGB1과 복합체를 형성하여 HMGB1를 생체내 탈아세틸화하고, 이에 의해 HMGB1의 LPS-유도된 방출을 억제한다는 가설을 뒷받침한다.BALB / c mice infected through the tail vein with Ad-Flag-HMGB1, Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R , and / or Ad-Myc-SIRT1 were treated with LPS to induce fatal endotoxemia. Expression of Flag-HMGB1, Flag-HMGB1 ^K282930R , and Myc-SIRT1 was observed in heart, kidney, liver, and lung in mice infected with adenovirus in the presence or absence of LPS (see Fig. Complexes of Flag-HMGB1 and Myc-SIRT1 were detected in co-immunoprecipitated tissue lysates, which were significantly reduced by LPS treatment. However, the LPS-induced inhibition of this co-immunoprecipitation method is not consistent with Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R And Ad-Myc-SIRT1 (Fig. 13 (A)). Consistent with these results, serum levels of Flag-HMGB1 after endotoxin treatment were significantly reduced in mice infected with Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R and Ad-Myc-SIRT1, while Ad-Flag-HMGB1 and Ad-Myc-SIRT1 And significantly increased in infected mice (Fig. 13 (B)). These results support the hypothesis that SIRT1 complexes with HMGB1 to deacetylate HMGB1 in vivo, thereby inhibiting LPS-induced release of HMGB1.

LPS-유도된 내독소혈증과 관련하여, HMGB1가 병원성 염증 반응을 악화시킨다고 보고된 바 있다(Wang et al., 1999; El Mezayen et al., 2007). 따라서, HMGB1의 아세틸화 상태가 내독소혈증 모델 마우스의 치사율 및 생존율과 관련있는지 여부를 알아보았다. In association with LPS-induced endotoxemia, HMGB1 has been reported to exacerbate the pathogenic inflammatory response (Wang et al., 1999; El Mezayen et al., 2007). Therefore, we examined whether the acetylation status of HMGB1 is related to the mortality and survival rate of endotoxemia model mice.

마우스를 Ad-Flag-HMGB1로 감염시키면, 엔도톡신에 대한 감수성이 증가하였다(도 14(B) 참조). Ad-Flag-HMGB1^K282930R 단독 감염(생존율 15.3%)에 비하여, Ad-Flag-HMGB1^K282930R 및 Ad-Myc-SIRT1의 감염(생존율 85.7%)은 치사에 대하여 현저히 보호되는 경향을 나타냈으며, 내독소혈증에서의 생존율을 개선시켰다. 이러한 보호 효과는 Ad-Flag-HMGB1 및/또는 Ad-Myc-SIRT1로 감염된 마우스에서는 관찰되지 않았으며, 이는 HMGB1 및 SIRT1의 아세틸화-의존적 상호작용이 LPS-유도된 치사에서 결정적임을 나타낸다(도 13(C) 참조). LPS 주사 후 2주 동안 아데노바이러스-감염 동물의 후기 사망은 없었으며, 이는 HMGB1 방출에 대한 SIRT1-매개 억제 효과가 단순히 사망의 개시(onset)를 늦추는 것이 아니라 지속되는 보호 효과임을 나타낸다. When mice were infected with Ad-Flag-HMGB1, the susceptibility to endotoxin was increased (see Fig. 14 (B)). The infection (survival rate 85.7%) of Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R and Ad-Myc-SIRT1 tended to be significantly protected against lethal compared to Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R alone infection (survival rate 15.3%), The survival rate was improved. This protective effect was not observed in mice infected with Ad-Flag-HMGB1 and / or Ad-Myc-SIRT1, indicating that the acetylation-dependent interaction of HMGB1 and SIRT1 is critical in LPS-induced lethal (C)). There was no late death of the adenovirus-infected animal for 2 weeks after LPS injection, indicating that the SIRT1-mediated inhibitory effect on HMGB1 release is not merely a slowing onset of death but a sustained protective effect.

또한, 내독소혈증에 대한 병원성 반응에 참여할 것으로 예상되는 염증전 사이토카인의 혈청 수준을 조사하였다. Ad-Flag-HMGB1로 감염된 마우스에서 TNF-α 및 IL-6의 혈청 수준은 LPS 처리에 의하여 현저히 증가되었으며, 반면, 이러한 증가는 Ad-Myc-SIRT1의 존재 하에서 감소되었다(도 13(D) 참조). 또한, Ad-Flag-HMGB1^K282930R 및 Ad-Myc-SIRT1의 감염은 이러한 사이토카인의 LPS-유도된 분비를 거의 완전히 차단시켜, 대조군에서와 유사한 수준을 나타냈다. 이러한 결과는, HMGB1의 SIRT1-매개된 저-아세틸화가 내독소혈증에서 TNF-α 및 IL-6와 같은 염증전 사이토카인의 분비를 약화시켜, 이로써 무기력, 설사, 및 입모와 같은, 내독소혈증의 LPS-유도된 임상적 증상에 대한 보호 효과로 이어질 것임을 시사한다.
Serum levels of pre-inflammatory cytokines expected to participate in pathogenic responses to endotoxemia were also investigated. Serum levels of TNF-α and IL-6 in mice infected with Ad-Flag-HMGB1 were significantly increased by LPS treatment whereas this increase was reduced in the presence of Ad-Myc-SIRT1 (see FIG. 13 (D) ). In addition, infection of Ad-Flag-HMGB1 ^K282930R and Ad-Myc-SIRT1 almost completely blocked the LPS-induced secretion of these cytokines, showing similar levels to those in the control. These results indicate that SIRT1-mediated hypoacetylation of HMGB1 attenuates secretion of pre-inflammatory cytokines such as TNF-a and IL-6 in endotoxemia, thereby resulting in endotoxemia, such as insomnia, diarrhea, Lt; RTI ID = 0.0 > LPS-induced < / RTI > clinical symptoms.

<논의><Discussion>

핵 구성 단백질이며 사이토카인인 HMGB1은 이의 위치에 따라 특별한 기능을 나타낸다(Ueda 및 Yoshida, 2010; Wang et al., 1999; Dave et al., 2009; Harris et al., 2012; Andrassy et al., 2008). HMGB1의 핵 관련 기능과 함께 세포외부 관련 기능이 보고된 바 있으나, 이의 세포내 위치를 결정하는 조절 기전에 대하여는 거의 밝혀진 바가 없다. 최근 연구에서, 본 발명의 발명자들은 NAD+-의존적 탈아세틸화제 SIRT1이 후성적으로(epigenetically) 조절되는 항-염증성 유전자로서, 세포성 염증에서 HMGB1과 기능적으로 상호협력할 수 있음을 밝혔다(Hwang et al., 2014). HMGB1, a nucleus-forming protein and a cytokine, has a specific function depending on its location (Ueda and Yoshida, 2010; Wang et al., 1999; Dave et al., 2009; Harris et al., 2012; Andrassy et al. 2008). Although the extracellular function of HMGB1 has been reported in association with the nuclear function of HMGB1, there has been little research on the regulatory mechanism for determining its intracellular location. In a recent study, the inventors of the present invention have found that an NAD + -dependent deacetylating agent SIRTl is an epigenetically regulated anti-inflammatory gene that can functionally cooperate with HMGB1 in cellular inflammation (Hwang et al ., 2014).

본 발명에서는 HMGB1의 번역 후 수식이 HMGB1의 세포내 위치를 결정하는 과정에서 경유되는 중요한 기전 및 이러한 과정이 염증성 자극 하에서 HMGB1의 SIRT1과의 상호작용을 거쳐 발생한다는 것을 제시하였다. SIRT1은 HMGB1과 직접적으로 상호작용하고, 이러한 단백질-단백질 상호작용은 비활동 세포에서 선호된다. 그러나, 이러한 복합체는 염증성 신호에 대하여 아세틸화-의존적 방식으로 분리되고, 내독소성 쇼크 치사의 후기 매개체인 HMGB1의 방출로 이어진다(Wang et al., 1999). SIRT1 기능의 상실 또는 획득은 HMGB1의 아세틸화 수준이 세포성 염증 반응과 밀접하게 연관되어 있다는 것을 명확히 보여주었다(Bernier et al., 2011; Rabadi et al., 2014; Rickenbacher et al., 2014; Hwang et al., 2014). In the present invention, it has been suggested that the post-translational modification of HMGB1 mediates an important mechanism through which HMGB1 locates in the cell, and that this process occurs through interaction of HMGB1 with SIRT1 under inflammatory stimulation. SIRT1 directly interacts with HMGB1, and such protein-protein interactions are favored in inactive cells. However, these complexes are isolated in an acetylation-dependent manner on inflammatory signals and lead to the release of HMGB1, a late mediator of endotoxic shock dysfunction (Wang et al., 1999). The loss or acquisition of SIRT1 function has clearly shown that the level of acetylation of HMGB1 is closely related to the cellular inflammatory response (Bernier et al., 2011; Rabadi et al., 2014; Rickenbacher et al., 2014; Hwang et al., 2014).

이는 항-염증 반응에서 SIRT1 및 HMGB1 간의 상호작용의 역할을 보여주는 것으로서, 즉, SIRT1-매개된 탈아세틸화에 의해 HMGB1이 항-염증 반응에 조력하는 것을 불활성화시킨다. 이러한 측면에서, 마우스에서 HMGB1 및 SIRT1의 탈아세틸화-매개된 상호작용은 TNF-α 및 IL-6와 같은 사이토카인 및 HMGB1의 분비를 억제함으로써, LPS 처리에 의한 내독소혈증으로부터 충분히 보호할 수 있을 만큼 강력하였다.This demonstrates the role of the interaction between SIRT1 and HMGB1 in an anti-inflammatory response, i.e., SIRT1-mediated deacetylation inactivates HMGB1 in assisting the anti-inflammatory response. In this respect, the deacetylation-mediated interaction of HMGB1 and SIRT1 in mice is sufficient to protect against endotoxemia by LPS treatment by inhibiting the secretion of cytokines and HMGB1, such as TNF-a and IL-6 It was strong enough.

HMGB1의 28, 29, 및 30 라이신 잔기는 아세틸화-의존적 방식으로 SIRT1과의 상호작용을 매개하는 추정 부위의 일부로 확인되었다. HMGB1의 번역 후 수식은 양성적으로 또는 음성적으로 HMGB1의 세포내 위치를 조절하는 것으로 알려진 바 있다(Bonaldi et al., 2003; Evankovichi et al., 2010; Zhang et al., 2008). 이러한 선행 연구와 일치하게, 염증성 자극은, NLS 도메인을 포함하는 HMGB1의 N-말단 부위에서 28, 29, 및 30 라이신 잔기의 아세틸화를 유도하였다(Bonaldi et al., 2003). 이러한 자극-매개된 아세틸화가 HMGB1 및 SIRT1의 분리를 촉진시켜, HMGB1의 세포내 위치 변화로 이어졌다.The 28, 29, and 30 lysine residues of HMGB1 were identified as part of the putative site that mediates interaction with SIRT1 in an acetylation-dependent manner. The post-translational modification of HMGB1 has been shown to regulate the intracellular location of HMGB1 both positively and negatively (Bonaldi et al., 2003; Evangovichi et al., 2010; Zhang et al., 2008). Consistent with this previous study, inflammatory stimulation induced acetylation of 28, 29, and 30 lysine residues at the N-terminal region of HMGB1, including the NLS domain (Bonaldi et al., 2003). This stimulation-mediated acetylation promoted the separation of HMGB1 and SIRT1, leading to a change in the intracellular location of HMGB1.

HMGB1 위치에 대한 이러한 아세틸화의 효과는 SIRT1의 탈아세틸화제 기능과 관련있으며, SIRT1는 HMGB1과 상호작용하여 HMGB1을 탈아세틸화시킴으로써 HMGB1의 방출을 막는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 상기 위치의 아세틸화가 HMGB1의 결합 도메인에서의 입체구조 변화(conformational change)를 유도하고, 따라서, HMGB1의 SIRT1과의 상호작용을 변화시키는 것으로 보인다. 과-아세틸화 돌연변이체인 HMGB1^K282930Q은 SIRT1과 현저히 감소된 상호작용을 나타냈으며, 반면, 저-아세틸화 돌연변이체인 HMGB1^K282930R은 염증성 자극의 존재 하에서도 야생형 HMGB1에 비하여 SIRT1과 증가된 상호작용을 나타냈다. 이러한 결과는, 염증- 및 세포성 스트레스-매개된 아세틸화가 HMGB1의 핵으로의 재유입을 막아 세포질에서의 HMGB1의 축적으로 이어진다는 선행 연구와 일치한다(Bonaldi et al., 2003; Evankovichi et al., 2010; Zhang et al., 2008). 유사하게, HMGB1의 JAK/STAT- 또는 인터페론 조절 인자 1-매개된 과-아세틸화가 HMGB1의 방출을 자극한다(Lu et al., 2014; Dhupar et al., 2011). 따라서, 아세틸화에 의한 HMGB1의 후성적 수식은 HMGB1의 위치를 결정하는 중요한 조절자로 알려졌다. 이와 같은 발견으로, SIRT1이 HMGB1를 저-아세틸화된 상태로 유지하여 HMGB1의 세포질 축적 및 세포외 방출을 억제하는데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 따라서, 염증성 세포가 HMGB1 방출을 조절하는 기전을 이해함으로써 SIRT1의 선택적 활성화 또는 발현에 의한 HMGB1-관련 염증을 약화시키는 치료법의 표적화를 가능하게 할 수 있다.The effect of this acetylation on the HMGB1 locus is related to the deacetylating function of SIRT1, and it can be seen that SIRT1 interacts with HMGB1 to deacetylate HMGB1 to prevent HMGB1 release. Thus, it appears that acetylation of this site induces a conformational change in the binding domain of HMGB1 and thus changes the interaction of HMGB1 with SIRT1. The ^{hyperacetylation} mutant HMGB1 ^{K282930Q exhibited a} significantly reduced interaction with SIRT1, whereas the ^{HMG1 K282930R, a hypoacetylated} mutant, showed increased interaction with SIRT1 in the presence of inflammatory stimuli compared to wild-type HMGB1. These results are consistent with previous studies that inflammation- and cellular stress-mediated acetylation resulted in the accumulation of HMGB1 in the cytoplasm by blocking re-entry of HMGB1 into the nucleus (Bonaldi et al., 2003; Evankovichi et al. , 2010; Zhang et al., 2008). Similarly, JAK / STAT- or interferon regulatory factor 1-mediated and -acetylation of HMGB1 stimulates the release of HMGB1 (Lu et al., 2014; Dhupar et al., 2011). Thus, the posterior modification of HMGB1 by acetylation is known to be an important regulator of HMGB1 location. This finding suggests that SIRT1 plays an important role in maintaining HMGB1 in a hypoacetylated state and inhibiting cellular accumulation and extracellular release of HMGB1. Thus, by understanding the mechanism by which inflammatory cells regulate HMGB1 release, it may be possible to target therapies that attenuate HMGB1-associated inflammation by selective activation or expression of SIRT1.

LPS, TNF-α, IFN-γ, 및 Poly(I:C) 와 같은 세포성 자극에 대한 반응으로 HMGB1가 세포외부 환경으로 방출되지만, 이러한 자극이 HMGB1 및 SIRT1 간의 상호작용에 동일하게 영향을 미치는 것은 아니다. 본 발명에서는 HMGB1의 28, 29, 및 30 라이신 잔기의 아세틸화가 염증성 신호로 자극된 세포로부터의 HMGB1의 능동적 방출을 조절하는 중요한 인자라는 것을 밝혔다. 또한, LPS 및 TNF-α는 HMGB1의 28, 29, 및 30 라이신 잔기의 아세틸화를 유도하였고, 반면, IFN-γ 및 Poly(I:C)는 라이신 잔기 30의 아세틸화만을 유도하였다. 이러한 HMGB1에서 아세틸화되는 잔기의 차이는 각 자극에 의하여 서로 다른 신호전달 연쇄반응이 유도되는 것에 기인하는 것으로 추정된다. 즉, IFN-γ는 JAK-STAT 신호전달 경로를 활성화시키는 반면에, LPS는 톨-유사 수용체 4-매개 경로(Toll-like receptor 4-mediated pathway)로 신호전달한다(Bonaldi et al., 2003; Rendon-Mitchell et al., 2003). 따라서, 아세틸화의 위치가 자극의 성질에 의존하여 HMGB1 및 SIRT1의 분리를 매개하는 신호전달 연쇄반응을 결정하고, HMGB1의 방출로 이어질 수 있는 것으로 추정된다.HMGB1 is released into the extracellular environment in response to cellular stimuli such as LPS, TNF-a, IFN-y and Poly (I: C), but this stimulation equally affects the interaction between HMGB1 and SIRT1 It is not. In the present invention, it has been shown that acetylation of the 28, 29, and 30 lysine residues of HMGB1 is an important factor in regulating the active release of HMGB1 from cells stimulated with inflammatory signals. In addition, LPS and TNF- [alpha] induced acetylation of the 28, 29, and 30 lysine residues of HMGB1, whereas IFN-y and Poly (I: C) induced only acetylation of lysine residue 30. The difference in residues acetylated in HMGB1 is presumed to be due to the induction of different signal transduction by each stimulus. In other words, IFN-γ activates the JAK-STAT signaling pathway, while LPS signals to the Toll-like receptor 4-mediated pathway (Bonaldi et al., 2003; Rendon-Mitchell et al., 2003). Therefore, it is presumed that the position of acetylation can determine the signal transduction pathway mediating the separation of HMGB1 and SIRT1 depending on the nature of the stimulus, leading to the release of HMGB1.

자극에 따라 HMGB1이 방출되는 과정에서, HMGB1이 대량으로 아세틸화되고, 핵 방출 수용체인 CRM1과의 회합을 통하여 세포질로 이동한다(Bonaldi et al., 2003; Gardella et al., 2002). HMGB1 및 CRM1 간 복합체 형성은 LPS- 또는 TNF-α-유도된 HMGB1의 방출을 수반한다(Tang et al., 2007; Hayakawa et al., 2010). 또한, CRM1 억제제인 렙토마이신 B는 HMGB1의 LPS-유도된 핵 방출을 현저히 차단한다(Bonaldi et al., 2003). 본 발명에서는 특정 위치의 아세틸화가 단백질-단백질 상호작용을 경유하여 상이한 자극에 대한 반응으로 HMGB1 방출을 조절한다는 것을 최초로 밝혔다. 이러한 신규한 발견은 HMGB1의 방출 조절뿐만 아니라 SIRT의 항-염증 효능의 원인이 되는 분자적 기전을 이해하기 위하여 중요하다.In the course of the release of HMGB1 according to the stimulus, HMGB1 is mass-acetylated and migrates to the cytoplasm through association with the nuclear export receptor CRM1 (Bonaldi et al., 2003; Gardella et al., 2002). Complex formation between HMGB1 and CRM1 involves the release of LPS- or TNF- [alpha] -induced HMGB1 (Tang et al., 2007; Hayakawa et al., 2010). In addition, the CRM1 inhibitor, leptomycin B, significantly blocks LPS-induced nuclear release of HMGB1 (Bonaldi et al., 2003). In the present invention, it was first shown that acetylation at a particular site regulates HMGB1 release in response to different stimuli via protein-protein interactions. This new discovery is important to understand the molecular mechanisms responsible for the release of HMGB1 as well as the anti-inflammatory effects of SIRT.

SIRT1 및 HMGB1의 아세틸화-의존적 상호작용이 패혈증의 병태생리에 관여할 수 있다는 점이 매우 중요하다. SIRT1에 약물학적 또는 유전적 조작을 가하면 아세틸화에 의해 매개되는 과정으로 LPS- 및 TNF-α-유도된 HMGB1 방출이 현저히 약화되었다. 저-아세틸화된 돌연변이체 HMGB1^K282930R의 이소성 발현은 순환 HMGB1의 수준에 있어서 LPS-유도된 증가를 억제하여, HMGB1 방출이 이러한 잔기의 아세틸화 상태에 의해 엄격히 조절됨을 나타내었다. 또한, HMGB1^K282930R의 발현은 마우스에서 엔도톡신-유도된 LPS의 치사를 감소시켰다. 이러한 효과는 내독소혈증 마우스 조직에서 TNF-α 및 IL-6와 같은 2차 사이토카인의 분비뿐만 아니라 HMGB1 및 SIRT1 간의 상호작용과 밀접하게 관련되어 있다. 이러한 결과는, HMGB1이 SIRT1의 신규 탈아세틸화의 표적이고, HMGB1의 방출 및 핵 이동이 SIRT1 탈아세틸화제 기능과 밀접하게 연결되어 있어, 염증 반응에서의 SIRT1의 결정적인 역할을 강조하는 선행 연구와 일치한다(Hwang et al., 2014; Rabadi et al., 2014; Xu et al., 2014; Rickenbacher et al., 2014). 따라서, HMGB1 방출을 선택적으로 억제하기 위하여, 선천적 면역 반응의 현저한 기능저하 없이 SIRT1를 표적화하는 것이 가능할 수도 있다. 약물학적 또는 유전적 조작에 의한 SIRT1 탈아세틸화제 기능의 조절은 염증성 자극에 대한 HMGB1의 아세틸화-의존적 방출을 변화시켰다. 본 발명과 일치하게, 레스베라트롤에 의한 SIRT1의 약물학적 활성화는 HMGB1 방출을 현저히 감소시키고 패혈증성 간 손상을 감소시켰다(Rabadi et al., 2014; Xu et al., 2014; Rickenbacher et al., 2014). 따라서, 염증-관련 질환에서 SIRT1의 표적화는 HMGB1의 세포외 수준을 감소시킴으로써 치료 효과를 도출해 낼 수 있다.It is very important that the acetylation-dependent interactions of SIRT1 and HMGB1 can be involved in the pathophysiology of sepsis. Pharmacological or genetic manipulation of SIRT1 significantly attenuated LPS- and TNF- [alpha] -induced HMGB1 release as a process mediated by acetylation. Ectopic expression of the low-acetylated mutant HMGB1 ^K282930R inhibited LPS-induced increase in circulating HMGB1 levels, indicating that HMGB1 release was tightly regulated by the acetylation status of these residues. In addition, the expression of HMGB1 ^K282930R reduced the mortality of endotoxin-induced LPS in mice. This effect is closely related to the secretion of secondary cytokines such as TNF-a and IL-6 as well as the interaction between HMGB1 and SIRT1 in endotoxemia mouse tissues. These results are consistent with previous studies in which HMGB1 is the target of new deacetylation of SIRT1 and HMGB1 release and nuclear migration are closely linked to SIRT1 deacetylating function, thus emphasizing the critical role of SIRT1 in inflammatory responses 2014; Rauckbach et al., 2014). In this study, we investigated the effects of aquaculture on the morphological changes of fishes. Thus, in order to selectively inhibit HMGB1 release, it may be possible to target SIRTl without significant deterioration of the innate immune response. Modulation of SIRT1 deacetylating function by pharmacological or genetic manipulation altered the acetylation-dependent release of HMGB1 to inflammatory stimuli. Consistent with the present invention, pharmacological activation of SIRT1 by resveratrol significantly reduced HMGB1 release and reduced septic liver damage (Rabadi et al., 2014; Xu et al., 2014; Rickenbacher et al., 2014) . Thus, targeting of SIRTl in an inflammation-related disorder may result in a therapeutic effect by reducing the extracellular level of HMGB1.

본 발명에서는, SIRT1이 탈아세틸화에 의해 매개되는 직접적 상호작용을 통하여 염증전 사이토카인 HMGB1의 방출을 조절할 수 있다는 것을 입증하였다. 결론적으로, SIRT1 및 HMGB1 간 물리적 상호작용은 엔도톡신 자극에 대한 둔화된 염증 반응과 관련있으며, 이는 내독소혈증 동물에서 생존율의 현저한 증가로 이어졌다.In the present invention, it has been demonstrated that SIRT1 can regulate the release of pre-inflammatory cytokine HMGB1 through direct interaction mediated by deacetylation. In conclusion, the physical interaction between SIRT1 and HMGB1 is associated with a slowed inflammatory response to endotoxin stimulation, leading to a significant increase in survival in endotoxemic animals.

Claims

패혈증 치료제의 스크리닝 방법으로,
(a) 세포를 배양하는 단계;
(b) 단계(a)의 세포에 염증 자극 인자를 처리하는 단계;
(c) 단계(b)의 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
(d) 단계(c)의 세포에서 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 복합체의 수준을 측정하는 단계; 및
(e) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 복합체의 증가를 나타내는 시험 물질을 패혈증 치료제로 선별하는 단계
를 포함하는 스크리닝 방법.As a screening method for treating sepsis,
(a) culturing the cells;
(b) treating the cells of step (a) with an inflammatory stimulating factor;
(c) contacting the test substance to the cell of step (b);
(d) measuring the level of the complex of the nuclear HMGB1 protein and the SIRT1 protein in the cells of step (c); And
(e) selecting a test substance exhibiting an increase in the complex of HMGB1 protein and SIRT1 protein as a sepsis treatment agent as compared with a control group in which the test substance is not treated
&Lt; / RTI >

제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 염증 자극 인자가 리포폴리사카라이드 또는 마우스 종양 괴사 인자-α인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.The screening method according to claim 1, wherein said inflammatory stimulating factor of step (b) is lipopolysaccharide or mouse tumor necrosis factor-a.

제1항에 있어서, 상기 단계(d)의 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 복합체의 수준이 공동면역침강법에 의해 확인되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.The screening method according to claim 1, wherein the level of the complex of the HMGB1 protein and the SIRT1 protein of step (d) is confirmed by a joint immunoprecipitation method.

제1항에 있어서, 단계(e)의 상기 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 복합체의 증가가 핵내 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 동시 발현의 증가를 특징으로 하는 스크리닝 방법.2. The screening method according to claim 1, wherein the increase in the complex of the HMGB1 protein and the SIRT1 protein of step (e) is characterized by an increase in co-expression of the HMGB1 protein and the SIRT1 protein in the nucleus.

제1항에 있어서, 단계(e)의 상기 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 복합체의 증가가 HMGB1 단백질의 A 박스의 탈아세틸화에 의한 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.2. The screening method according to claim 1, wherein an increase in the complex of said HMGB1 protein and SIRT1 protein of step (e) is by deacetylation of A box of HMGB1 protein.

제1항에 있어서, 단계(e)의 상기 HMGB1 단백질 및 SIRT1 단백질의 복합체의 증가가 HMGB1 단백질의 N-말단 28, 29 및 30번 잔기의 탈아세틸화에 의한 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.The screening method according to claim 1, wherein an increase in the complex of the HMGB1 protein and the SIRT1 protein of step (e) is by deacetylation of N-terminal 28, 29 and 30 residues of the HMGB1 protein.

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