KR101727750B1 - Composition for diagnosing ischemia compriging sweet-taste receptor genes - Google Patents

Abstract

본 발명은 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 허혈질환 진단 마커로서의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 상기 유전자를 함유하는 허혈질환 진단용 조성물, 허혈질환 진단 방법 및 성상세포의 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 유전자의 상향조절된 발현을 억제하는 물질을 스크리닝하여 허혈질환의 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 허혈질환과 관련된 신규한 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 유전자 마커는 질병을 진단하는 정확도가 우수하여 조기에 허혈 질환을 진단하고 치료하는 용도로 유용하게 활용할 수 있다. The present invention relates to the use of at least one gene selected from T1R2, T1R3 and a-gusted ducine as an ischemic disease diagnostic marker. More specifically, the present invention relates to a composition for diagnosing ischemic diseases containing the gene, The present invention relates to a method for screening a therapeutic agent for an ischemic disease by screening a substance that inhibits up-regulated expression of T1R2, T1R3 and alpha-gust dulse gene of astrocytes. The novel T1R2, T1R3 and alpha-gust-duxin gene markers related to the ischemic diseases according to the present invention are excellent in the accuracy of diagnosing diseases and can be usefully used for early diagnosis and treatment of ischemic diseases.

Description

단맛 수용체 유전자를 함유하는 허혈질환 진단용 조성물{Composition for diagnosing ischemia compriging sweet-taste receptor genes}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for diagnosing ischemic diseases containing a sweet receptor gene,

본 발명은 단맛 수용체 T1R2, T1R3 및 이들과 관련된 α-거스트듀신 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 허혈질환 진단 마커로서의 용도에 관한 것으로, 상기 유전자들을 함유하는 허혈질환 진단용 조성물 및 허혈질환 진단 방법 등에 관한 것이다.
The present invention relates to the use of at least one gene selected from the sweet taste receptors T1R2, T1R3 and α-gust duducins associated therewith as diagnostic markers for ischemic diseases. The present invention relates to a composition for diagnosing ischemic diseases, will be.

최근, 바이오 마커(유전자 마커) 발굴 연구는 게놈 프로젝트의 완성과 함께 폭발적으로 진행되었다. 각종 암, 심혈관 및 노인성 질환 등에 결정적인 단서를 제공하는 많은 바이오 마커들이 발견되었다. 최근에는 신개념의 후생적 바이오 마커까지 발견되어 바이오 마커의 적용 범위가 넓어지고 있다.In recent years, biomarker (genetic marker) research has exploded with the completion of the genome project. Many biomarkers have been found that provide crucial clues to various cancers, cardiovascular and geriatric diseases. In recent years, a new concept of welfare biomarkers has been found and the scope of application of biomarkers is widening.

바이오(유전자) 마커란 질병과 관련된 유전자 내의 표지인자를 의미하는데, 이러한 표지인자의 유무를 통해 질병의 단서를 포착한다. 상기 바이오 마커를 이용하면 보다 간단한 방법으로 정확하게 질병을 진단 할 수 있어 많은 연구자들이 바이오 마커의 연구에 매진하고 있다. 본 발명과 관련이 있는 T1R2 및 T1R3는 미각 수용체 세포에서 특이적으로 발현되며 이량체성 단맛 수용체 복합체(T1R2/T1R3 이종이량체)를 형성하는 서브유닛으로, 상기 T1R2 및 T1R3으로 구성된 수용체 TAS1R에 의해 단맛의 검출이 매개되는 것으로 공지되어 있다. Bio (gene) markers refer to markers in genes related to disease, which capture clues of disease through the presence or absence of such markers. Using the above-mentioned biomarker, a disease can be accurately diagnosed by a simpler method, and many researchers are engaged in research on biomarkers. T1R2 and T1R3, which are associated with the present invention, are subunits that are specifically expressed in taste receptor cells and form a dimeric sweet receptor complex (T1R2 / T1R3 heterodimer), which is constituted by the receptor TAS1R composed of T1R2 and T1R3 Is known to be mediated.

상기 두 서브유닛은 모두 소위 "G-단백질에 커플링된 수용체" 또는 GPCR, 특히 C-등급 GPCR의 계열에 속한다. T1R2, T1R3는 글루코스 센서로 최근에 보고되고 있지만, 허혈 질환 관련성에 대해서는 지금까지 알려진 바가 없다.Both of these subunits belong to the so-called "G-protein coupled receptor" or a family of GPCRs, particularly C-class GPCRs. Although T1R2 and T1R3 have recently been reported as glucose sensors, the relevance of ischemic diseases has not been known until now.

특히, 허혈 질환 중 뇌 허혈과 깊은 관련이 있는 말초 신경의 당뇨병 관련 변화는 복잡하고 다양한 원인을 포함한다. 주요한 발병적 메카니즘은 저산소증이나 허혈에 의해 발병된 신경 섬유에서의 변화에 기원하는 신경속막 미소혈관의 구조적 및 기능적 손상이다. 이러한 뇌 허혈은 짧은 시간이라도 반신마비와 현기증 실명 언어장애 등을 수반하는 등 그 영향이 치명적이다.In particular, diabetes-related changes in peripheral nerves that are deeply related to cerebral ischemia among ischemic diseases involve complicated and diverse causes. The principal pathogenic mechanism is structural and functional damage of the nerve endocardial microvasculature originating from changes in nerve fibers caused by hypoxia or ischemia. Such brain ischemia is fatal even in a short period of time, accompanied by hemiparesis, dizziness, blindness, language impairment, and the like.

따라서 뇌 허혈 연구를 위한 실험은 그동안 여러 동물들을 이용하여 이루어져왔고, 이러한 모델들을 이용하여 허혈의 기전을 밝히기 위한 연구와 각 약제의 효과를 알기 위한 많은 연구들이 시행되어 왔으나, 아직도 여전히 뇌 허혈질환의 발병 확인, 치료 등에 어려움이 존재하고 있다. 특히, 허혈성 뇌 손상에는 다양한 병태 생리학적 기전이 관여하고 있어 허혈질환에 관련된 새로운 유전자들을 발굴하는 연구는 매우 중요한 의미가 있다.
Thus, studies on brain ischemia have been conducted using several animals, and many studies have been conducted to investigate the mechanism of ischemia and the effects of each drug using these models. However, There is a difficulty in confirming the onset and treating the disease. In particular, various pathophysiological mechanisms are involved in ischemic brain injury, so research to discover new genes involved in ischemic diseases is very important.

이에, 본 발명자들은 허혈성 해마에서 단맛 수용체 T1R2 및 T1R3와 맛-특이적인 G-단백질 α-거스트듀신의 상향조절이 반응성 성상세포에서 발견됨을 확인하고, 허혈질환과 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신 유전자의 발현 관련성 및 특이성을 검토함으로써 본 발명을 완성하였다.
Thus, the present inventors confirmed that up-regulation of taste-specific receptors T1R2 and T1R3 and taste-specific G-protein a-gust endosynthesis in ischemic hippocampus was found in reactive astrocytes and confirmed that ischemic diseases and T1R2, T1R3 or α- The present invention has been completed.

본 발명은 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신 유전자와 허혈질환발생과의 관련성을 기초로 허혈질환 진단 마커로서의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 목적은 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신 유전자를 함유하는 허혈 질환 진단용 조성물 및 이를 포함하는 허혈 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.The present invention relates to the use of a T1R2, T1R3, or a-gusted duodenal gene as an ischemic disease diagnostic marker based on the relationship between ischemic disease occurrence and an object of the present invention is to provide a method for diagnosing ischemic diseases comprising T1R2, T1R3, And a kit for diagnosing an ischemic disease comprising the same.

본 발명의 다른 목적은 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신 유전자의 발현수준을 측정함으로써 허혈질환 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for providing information for diagnosing ischemic diseases by measuring the expression levels of T1R2, T1R3 or alpha-gusted duodenal gene.

본 발명의 또 다른 목적은, T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신 유전자를 이용하여 허혈질환 치료용 물질의 스크리닝 방법 및 뇌의 글루코오스 항상성을 유지시키는 방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a method for screening a substance for treating ischemic diseases and a method for maintaining glucose homeostasis in the brain using T1R2, T1R3, or?

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 허혈 질환 진단용 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a composition for diagnosing ischemic diseases comprising at least one gene mRNA selected from T1R2, T1R3 and α-gust duducin or an agent for measuring the level of the mRNA.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 T1R2는 서열번호 1의 염기서열을 가지고, 상기 T1R3는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 상기 α-거스트듀신는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the T1R2 has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the T1R3 has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and the a-gustducin has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 .

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the agent for measuring the level of the gene mRNA may include a primer that specifically binds to at least one gene selected from T1R2, T1R3, and alpha-gusted duchy.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the agent for measuring the level of the protein may comprise an antibody that specifically binds to at least one protein selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted dyssyn.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준은 성상세포(astrocyte)에서의 수준을 측정하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the level of the at least one gene mRNA or protein thereof selected from T1R2, T1R3, and? -Structured duchy may be one that measures the level in astrocyte.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 허혈 질환은 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the ischemic disease is selected from the group consisting of wound healing, ischemic brain disease, ischemic heart disease, peripheral vascular disease, renal artery disease, gastrointestinal lesion, burn, skin graft, vascular graft, A disease, a uterine disease, a retinal angiogenic disease, a bone regeneration disease, a cartilage repair disease, and a smooth muscle cell disease.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 허혈 질환은 허혈성 뇌질환인 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the ischemic disease may be ischemic brain disease.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자는 T1R2 및 α-거스트듀신; T1R3 및 α-거스트듀신; 또는 T1R2, T1R3, α-거스트듀신의 조합으로 측정하는 것일 수 있다.In one embodiment of the invention, the gene is selected from the group consisting of T1R2 and alpha-gusted dysin; T1R3 and a-gusted duchy; Or by a combination of T1R2, T1R3, a-gust dewax.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 허혈질환 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing ischemic diseases comprising the composition according to the present invention.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit.

또한, 본 발명은, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 허혈질환 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.Further, the present invention provides a method for detecting a protein comprising the steps of: measuring at least one gene expression level selected from T1R2, T1R3 and a-gusted dysine from a biological sample separated from a patient or a level of a protein encoded by the gene; And comparing the expression level of the gene or the level of the protein encoded by the gene with the expression level or protein level of the corresponding gene of the normal control sample.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 것이고, 상기 단백질 수준은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the expression level of the gene is a measure of mRNA level of the gene, and the protein level can be measured using an antibody that specifically binds to the protein.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준은 성상세포(astrocyte)에서의 수준을 측정하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the level of the at least one gene mRNA or protein thereof selected from T1R2, T1R3, and? -Structured duchy may be one that measures the level in astrocyte.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자는 T1R2 및 α-거스트듀신; T1R3 및 α-거스트듀신; 또는 T1R2, T1R3, α-거스트듀신의 조합을 이용하여 측정하는 것일 수 있다.In one embodiment of the invention, the gene is selected from the group consisting of T1R2 and alpha-gusted dysin; T1R3 and a-gusted duchy; Or by using a combination of T1R2, T1R3, a-gust dewax.

또한, 본 발명은,Further, according to the present invention,

(a) 후보 물질의 존재 하에서, 성상세포에 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 발현시키는 단계; 및 (a) expressing in the presence of a candidate substance at least one gene selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted duchin in astrocytic cells; And

(b) 후보물질이 없이 성상세포에 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 발현시킨 경우에 비하여, 상기 유전자들의 발현이 억제되는 경우의 후보물질을 허혈질환 치료용 물질로 선택하는 단계를 포함하는, 허혈질환 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.(b) candidate substances in which the expression of the genes is suppressed, as compared with the case where at least one gene selected from T1R2, T1R3 and alpha-gust duducin is expressed in astrocytes without the candidate substance, is used as a substance for treating ischemic diseases A method for screening a substance for treating ischemic diseases.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자는 T1R2 및 α-거스트듀신; T1R3 및 α-거스트듀신; 또는 T1R2, T1R3, α-거스트듀신의 조합으로 발현시키는 것일 수 있다. In one embodiment of the invention, the gene is selected from the group consisting of T1R2 and alpha-gusted dysin; T1R3 and a-gusted duchy; Or a combination of T1R2, T1R3, alpha-gusted ducin.

나아가 본 발명은 성상세포에서 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자의 발현을 감소 또는 증가시킴으로써 뇌의 글루코오스 항상성을 유지시키는 방법을 제공한다.
Further, the present invention provides a method for maintaining glucose homeostasis in the brain by decreasing or increasing the expression of at least one gene selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted duchyme in astrocytes.

본 발명은 성상세포에서의 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 유전자의 상향조절을 확인함을 통해 허혈질환, 특히 뇌 허혈질환을 진단하는 조성물 및 방법을 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 성상세포의 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 유전자의 상향조절된 발현을 억제하는 물질을 스크리닝함으로써 허혈질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공할 수도 있다. 따라서 본 발명은 허혈질환과 관련한 신규한 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 유전자 마커에 따른 다양한 용도를 제공함으로써 허혈 질환의 진단, 치료 등의 연구에 유용하게 활용할 수 있다.
The present invention provides a composition and a method for diagnosing ischemic diseases, particularly cerebral ischemic diseases, by confirming upregulation of T1R2, T1R3 and a-gust duducin gene in astrocytes. In addition, the present invention may provide a method of screening a therapeutic agent for ischemic diseases by screening a substance that inhibits up-regulated expression of T1R2, T1R3 and alpha-gusted duodenal gene of astrocytes. Therefore, the present invention can be utilized for diagnosis, treatment, and the like of ischemic diseases by providing various uses according to novel T1R2, T1R3 and alpha-gust ducein gene markers related to ischemic diseases.

도 1은 허혈 후 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신의 면역블럿팅 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 면역블럿팅의 밀도 분석(Densitometric analysis) 결과 그래프이다.
도 3은 허혈 후 면역조직화학 염색법을 이용한, 해마에서의 T1R2 (A-F) 및 T1R3 (G-L)의 면역반응성 변화를 관찰한 공초점 현미경 사진이다.
도 4는 재관류 후 7일째, 해마의 CA1 영역에서의 T1R2, T1R3 면역반응성 세포의 표현형을 나타낸 사진이다.
도 5는 허혈 후 해마에서 α-거스트듀신 면역반응성 세포의 일시적 프로파일 및 표현형을 나타낸 사진이다. FIG. 1 is a photograph showing the results of immunofluorescence of T1R2, T1R3, and? -Gastedesin after ischemia.
Figure 2 is a graph of the results of a densitometric analysis of T1R2, T1R3 and a-gusted duodenal blotting.
FIG. 3 is a confocal microscopic photograph showing changes in immunoreactivity of T1R2 (AF) and T1R3 (GL) in hippocampus using immunohistochemistry after ischemia.
FIG. 4 is a photograph showing the phenotype of T1R2, T1R3 immunoreactive cells in CA1 region of hippocampus at 7 days after reperfusion.
FIG. 5 is a photograph showing the temporal profile and phenotype of? -Gastustine immunoreactive cells in the hippocampus after ischemia.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
The terms used in the present invention are defined as follows.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 허혈질환 발병 여부를 확인하는 것이다. 그 중에서도 특히 허혈성 뇌질환 발병 여부에 유용하다."Diagnosis" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to ascertain whether or not an ischemic disease has occurred. Especially, it is useful for the onset of ischemic brain disease.

"진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 허혈질환 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 허혈 질환을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 허혈질환 진단 마커는 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신으로, 성상세포에서 발현이 증가하는 유전자들이며, 바람직하게 상기 T1R2 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 T1R3는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 α-거스트듀신는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. "Diagnostic markers, diagnostic markers or diagnostic markers are substances that can diagnose ischemic disease cells differentiated from normal cells, and include polypeptides or nucleotides that show increased patterns in cells with ischemic diseases compared to normal cells An organic biomolecule such as lipid, glycolipid, glycoprotein, sugar (monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide, etc.), etc. For the purpose of the present invention, an ischemic disease diagnostic marker is T1R2, T1R3 or? - gustatory duodenum, wherein the T1R2 gene is composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and T1R3 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 And the α-gust residues may be composed of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.

"상향조절"이라는 표현은, 정상조직세포에 비하여, 활성화된 세포에서 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발 현량이 현저하게 증가된 것을 의미한다.The term "up-regulation" refers to the expression of a specific gene into mRNA or a marked increase in the amount of protein expressed by a gene transcription or gene translation in activated cells compared to normal tissue cells it means.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. "Subject" or "patient" means any single entity that requires treatment, including human, cow, dog, guinea pig, rabbit, chicken, In addition, any subject who participates in a clinical study test that does not show any disease clinical findings, or who participates in epidemiological studies or used as a control group is included.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다. "Tissue or cell sample" refers to a collection of similar cells obtained from a subject or tissue of a patient. The source of the tissue or cell sample may be a solid tissue from fresh, frozen and / or preserved organ or tissue sample or biopsy or aspirate; Blood or any blood components; It may be a cell at any point in the pregnancy or development of the subject. Tissue samples can also be primary or cultured cells or cell lines.

조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 하나의 일부 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 및 분자적 수준 모두에 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다."Intercept" of a tissue sample refers to a piece or piece of tissue sample, for example, a thin slice of tissue or cell that has been cut from a tissue sample. It will be appreciated that multiple sections of a tissue sample may be taken for analysis in accordance with the present invention if the present invention is understood to include methods in which the same section of tissue sample is analyzed both at the morphological and molecular levels, It is understood that it can do.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다."Nucleic acid" is meant to include any DNA or RNA, such as chromosomes, mitochondria, viruses and / or bacterial nucleic acids present in a tissue sample. Includes one or both strands of a double-stranded nucleic acid molecule and includes any fragment or portion of the intact nucleic acid molecule.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다."Gene" means any nucleic acid sequence or portion thereof that has a functional role at the time of protein coding or transcription, or in the control of other gene expression. The gene may consist of only a portion of the nucleic acid encoding or expressing any nucleic acid or protein that encodes the functional protein. The nucleic acid sequence may comprise an exon, an intron, an initiation or termination region, a promoter sequence, another regulatory sequence, or a gene abnormality within a particular sequence adjacent to the gene.

"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다."Primer" refers to an oligonucleotide sequence that hybridizes to a complementary RNA or DNA-targeted polynucleotide and serves as a starting point for the stepwise synthesis of a polynucleotide from a mononucleotide by the action of, for example, the nucleotidyltransferase that occurs in the polymerase chain reaction .

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다"Protein" also includes fragments, analogs, and derivatives of proteins that retain essentially the same biological activity or function as the reference protein

"항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날(단일클론) 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다."Antibody" is used in its broadest sense and specifically includes intact monoclonal (monoclonal) antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (e. G. Bispecific antibodies) formed from at least two intact antibodies, and And antibody fragments exhibiting the desired biological activity.

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.
"Label" or "label " means a compound or composition that facilitates the detection of a reagent, such as a reagent conjugated, conjugated, conjugated, or fused to a nucleic acid probe or antibody. The label may itself be detected (e. G., A radioactive isotope label or a fluorescent label), in the case of an enzyme label, to catalyze the chemical modification of the detectable substrate compound or composition.

본원에 설명되거나 참조된 기술 및 절차는 당업자에게 일반적으로 잘 이해되고, 통상적인 방법, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재된 바와 같은 널리 이용되는 분자 클로닝 방법을 사용하여 이용된다. 적절한 경우, 시판되는 키트 및 시약의 사용을 수반하는 과정은 달리 언급되지 않으면 제조사에 의해 규정된 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 일반적으로 수행된다.The techniques and procedures described or referenced herein are well understood and generally understood by those of ordinary skill in the art and can be performed by conventional methods, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). Where appropriate, the process involving the use of commercially available kits and reagents is generally performed according to protocols and / or parameters defined by the manufacturer, unless otherwise noted.

본 발명의 방법 및 분석을 설명하기 전에, 본 발명이 물론 변할 수 있는, 본원에서 설명되는 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구성체 및 시약으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다.
Before describing the methods and assays of the present invention, it should be understood that the present invention is not limited to the particular methods, protocols, cell lines, animal species or genus, constructs and reagents described herein, which may vary.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 뇌 허혈(cerebral ischemia)이 있는 경우 성상세포(astrocyte)에서 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신의 발현이 상향조절됨을 발견하였다. 즉, 허혈 질환과 단맛 수용체인 T1R2 및 T1R3, 맛-특이적인 G-protein α-거스트듀신 발현 변화의 관련성에 대해 최초로 규명하였다.The present inventors have found that expression of T1R2, T1R3 and a-gustducin in astrocytes is upregulated in the presence of cerebral ischemia. That is, the relationship between ischemic diseases and T1R2 and T1R3, taste-specific G-protein a-gust duducin expression changes, was first identified.

따라서 본 발명은 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 허혈질환 진단 마커로서의 용도에 관한 것으로, 상기 유전자의 성상세포에서의 상향발현 여부의 확인을 통해 허혈질환 발병 여부를 진단할 수 있다.
Therefore, the present invention relates to the use of at least one gene selected from among T1R2, T1R3 and alpha-gusted duces as an ischemic disease diagnostic marker, and it is possible to diagnose the onset of an ischemic disease by confirming whether the gene is up- can do.

본 발명에서 진단하고자 하는 질병은 허혈과 관련된 질병이다.The disease to be diagnosed in the present invention is a disease associated with ischemia.

"허혈(ischemia)"은 혈액을 공급하는 혈관의 수축, 폐색 또는 차단에 의해 야기되는, 신체 부위로 혈액의 부적절한 유입 또는 부족을 의미한다. 상기 허혈은 조직 저산소증을 야기한다. "저산소증"은 혈액 또는 조직에서 불충분한 산소 수준을 의미하는데, 예를 들면, 혈관 폐색에 의해 야기되는 혈액 공급의 부족의 결과일 수 있다. 이는 혈전, 임의의 외부 순환 물질에 의한 색전, 또는 동맥경화와 같은 혈관 질환에 의한 혈동맥 또는 정맥의 방해로 일어날 수 있는 것이다. "Ischemia" means an improper entry or lack of blood into the body part caused by contraction, occlusion or blockage of blood supply vessels. The ischemia causes tissue hypoxia. "Hypoxia" means an insufficient oxygen level in blood or tissue, for example, as a result of a lack of blood supply caused by vascular occlusion. This can happen with thrombosis, embolization by any external circulatory material, or obstruction of the arteries or veins due to vascular disease such as atherosclerosis.

상기 허혈성 질환은 산소에 대한 타겟 조직 요구량이 공급에 비하여 상대적으로 증가될 때 발생될 수 있다. 혈류의 감소는 갑작스럽게 시작되고 짧게 지속될 수 있거나 (급성 허혈증) 또는 느리게 개시되고 길게 지속되거나 또는 빈번하게 나타날 수 있다 (만성 허혈증). 급성 허혈증은 종종, 국소적이고, 비가역적 조직 괴사와 관련되고 (경색), 반면에 만성 허혈증은 통상적으로 일시적 저산소증 손상과 연관이 있다. The ischemic disease may occur when the target tissue requirement for oxygen is relatively increased relative to the supply. Reduced blood flow may begin abruptly, be short-lived (acute ischaemia), slow onset, long lasting or frequent (chronic ischemia). Acute ischemia is often associated with localized, irreversible tissue necrosis (infarction), while chronic ischemia is usually associated with transient hypoxic damage.

즉, 본 발명은 따라서 급성, 일시적 또는 만성이든지 간에, 임의의 허혈성 질환과 관련된 의학적 상처를 치료하는 것에 적용되는 방법에 관한 것이다. 허혈 질환은 저산소증 또는 허혈증, 감소된 조직 관혈류 또는 저혈류를 포함하는데, 급성 허혈성 사건은 수술, 장기 이식, 경색 (예, 뇌, 내장, 심근, 폐 등), 외상, 모욕 또는 상해 등과 관련된 것들을 포함할 수 있다. 허혈증과 연관된 만성적 사건들은 고혈압, 당뇨병,폐색성 동맥 질환, 만성 정맥 부전증, 레이노 병 (Raynaud's disease), 간경변, 선천성 심장 질환, 전신성 경화증 등을 포함할 수 있다. 허혈증과 연관된 다른 질병 또는 질환들은 상처 치유, 위내장 병변, 자가면역 질환 및 신경변성 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특수 조건의 예는, 상처 치유, 허혈성 발작, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관 질환, 신장 동맥 질환, 위내장 병변,화상, 피부 이식, 혈관 이식물, 장기 재생(예, 생체 외 및 생체 내), 골 회복 질환, 간질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 재생 질환, 및 평활근 세포 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.That is, the present invention relates to a method of treating medical wounds associated with any ischemic disease, whether acute, transient or chronic. Ischemic diseases include hypoxia or ischaemia, reduced tissue duct blood flow or hypotonia, acute ischemic events include those associated with surgery, organ transplantation, infarction (e.g., brain, visceral, myocardial, lung, etc.), trauma, insult or injury . Chronic events associated with ischemia may include hypertension, diabetes, occlusive arterial disease, chronic venous insufficiency, Raynaud's disease, cirrhosis, congenital heart disease, systemic sclerosis, and the like. Other diseases or disorders associated with ischemia include, but are not limited to, wound healing, stomach gland lesions, autoimmune diseases and neurodegenerative diseases. Examples of special conditions include, but are not limited to, wound healing, ischemic stroke, ischemic heart disease, peripheral vascular disease, renal artery disease, gastric intussusception, burn, skin graft, vascular graft, But are not limited to, restorative diseases, liver diseases, uterine diseases, retinal angiogenic diseases, bone regeneration diseases, cartilage regeneration diseases, and smooth muscle cell diseases.

특히, 본 발명은 허혈성 뇌질환(cerebral ischemia)에 유용한데, 허혈성 뇌질환은 저산소증이나 허혈에 의해 발병된 신경 섬유에서의 변화에 기원하는 신경속막 미소혈관의 구조적 및 기능적 손상에 따른 말초 신경의 당뇨병 관련 변화와 관련이 있다. 그리고, 상기 허혈성 뇌질환 진행을 회피하는데 글루코스의 엄격한 제어가 중요하다. 본 발명은 뇌에 있어서의 상기 글루코스의 항상성 유지와도 관련이 있다.
Particularly, the present invention is useful for cerebral ischemia, wherein ischemic brain disease is caused by structural and functional damage of nerve endothelial microvasculature originating from changes in nerve fibers caused by hypoxia or ischemia, Related changes. And, strict control of glucose is important for avoiding the ischemic brain disease progression. The present invention also relates to the homeostasis of the glucose in the brain.

진단마커Diagnostic marker 및 진단조성물 And diagnostic composition

본 발명은 일 관점에서 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중 선택되는 1종 이상의 허혈질환 진단마커로서의 용도에 관한 것이다.The present invention relates in one aspect to its use as one or more ischemic disease diagnostic markers selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted duce.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 허혈질환 진단 마커는, 허혈질환의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.The selection and application of significant diagnostic markers determines the reliability of diagnostic results. Significant diagnostic markers are those markers that are highly reliable with high validity and consistency in repeated measurements. The ischemic disease diagnostic marker of the present invention shows the same results in repeated experiments with genes whose expression always increases as a direct or indirect factor with the onset of ischemic diseases and the difference in expression level is very large when compared with the control group, Are highly reliable markers with little chance of falling. Therefore, the diagnosis result based on the result of measuring the expression level of the significant diagnostic marker of the present invention can be reasonably reliable.

본 발명의 상기 유전자들은 허혈 질환이 있는 환자의 성상세포에서 상향조절되어 발현되는 것을 특징으로 한다. 허혈성 해마내 반응성 성상세포에서의 단맛 신호 분자(T1R2, T1R3)의 유도는, 그들의 발현이 허혈손상으로 인해 변경된 세포외 수준에 반응하여 뉴런에 공급하는 에너지를 유지하기 위해 상향조절되는 것이다. 따라서, T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신의 성상세포에서의 상향조절 확인을 통해 허혈질환의 발병 여부를 확인할 수 있다.The genes of the present invention are characterized in that they are up-regulated in astrocytes of patients with ischemic diseases. Induction of the sweet signaling molecules (T1R2, T1R3) in the ischemic hippocampus reactive astrocytes is upregulated in order to maintain their energy in response to altered extracellular levels due to ischemic injury and to supply the neurons. Thus, up-regulation of T1R2, T1R3, and α-gust endocrine cells in astrocytes can confirm the onset of ischemic disease.

특히, 상기 마커들을 이용함에 있어서, T1R2 및 α-거스트듀신; T1R3 및 α-거스트듀신; 또는 T1R2, T1R3, α-거스트듀신의 조합으로 측정하는 것이 바람직하다. 결국, 본 발명은 허혈성 손상이 반응성 성상세포에서 G-protein(α-거스트듀신)-결합된 단맛 수용체(T1R2, T1R3)의 발현에 영향을 준다는 것을 의미하고 있기 때문이다.
In particular, using the markers, T1R2 and a-gust duchin; T1R3 and a-gusted duchy; Or a combination of T1R2, T1R3, and? -Gust dough. As a result, the present invention implies that ischemic injury affects the expression of G-protein (a-gusted ducine) -binding sweet receptor (T1R2, T1R3) in reactive astrocytes.

동일한 관점에서, 본 발명은 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 허혈 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.In the same viewpoint, the present invention relates to a composition for diagnosing ischemic diseases, comprising an agent for measuring the level of one or more gene mRNAs or a protein thereof selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted duchy.

생물학적 시료, 바람직하게는 성상세포 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.The level of gene expression in a biological sample, preferably an astrocyte, can be ascertained by determining the amount of mRNA or protein.

mRNA 발현수준 측정이란 허혈질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. In order to diagnose ischemic disease, the amount of mRNA is measured by confirming the presence or absence of mRNA and the expression level of the marker genes in a biological sample. RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA) Northern blotting, DNA chips, and the like, but are not limited thereto.

이에, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1이상의 유전자에 특이적인 프라이머 서열을 포함하는 허혈질환 진단 마커 조성물을 제공한다.Thus, in one specific embodiment of the present invention, there is provided an ischemic disease diagnostic marker composition comprising a primer sequence specific to at least one gene selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted duchy.

프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.Primer refers to a short nucleic acid sequence that can form a base pair with a complementary template with a short free 3-terminal hydroxyl group and function as a starting point for template strand copying.

프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수있다.Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures. The primer of the present invention is a sense and antisense nucleic acid having 7 to 50 nucleotide sequences for each marker gene-specific primer. Primers can incorporate additional features that do not alter the primer's basic properties that serve as a starting point for DNA synthesis.

본 발명의 프라이머는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소,형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.The primers of the present invention can be chemically synthesized using other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, "capping ", substitution of one or more natural nucleotides into homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers such as methylphosphonate, phosphotriester, (E.g., phosphoramidate, carbamate, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.). The nucleic acid can be in the form of one or more additional covalently linked residues such as a protein such as a nuclease, a toxin, an antibody, a signal peptide, a poly-L-lysine, an intercalator such as acridine, ), Chelating agents (e.g., metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.), and alkylating agents. The nucleic acid sequences of the present invention can also be modified using labels that can directly or indirectly provide a detectable signal. Examples of labels include radioactive isotopes, fluorescent molecules, biotin, and the like.

또한, 단백질 발현수준 측정이란 허혈질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 허혈질환 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 조직면역 염색법을 사용하였다.In order to diagnose ischemic disease, the protein expression level measurement is a process for confirming the presence and the degree of expression of a protein expressed from an ischemic disease marker gene in a biological sample. Preferably, the protein is specifically bound to a protein of the gene The amount of protein can be confirmed by using an antibody. Methods for this analysis include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket, But are not limited to, immunoelectrophoresis, immunohistochemistry, immunoprecipitation assays, complement fixation assays, fluorescence activated cell sorters (FACS), protein chips, and the like. . In one embodiment of the present invention, tissue immunostaining was used.

따라서 또 다른 양태로서, 본 발명은 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 허혈질환 진단 마커 조성물을 제공한다.Accordingly, in another aspect, the present invention provides an ischemic disease diagnostic marker composition comprising an antibody specific for one or more proteins selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted duchin.

항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.Antibody means a specific protein molecule directed against an antigenic site. For purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to a marker protein and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.

상기한 바와 같이 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.Since the marker protein has been identified as described above, the production of an antibody using the marker protein can be easily performed using techniques well known in the art.

다클론 항체는 상기한 허혈질환 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976)European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature,352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for obtaining serum containing antibodies by injection of the above-described ischemic disease marker protein antigen into an animal and blood sampling from the animal. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, small dogs, and the like. Monoclonal antibodies may be obtained from the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Jounal of Immunology 6: 511-519), or the phage antibody library (Clackson et al, Nature, 352: 624 Biol., 222: 58, 1-597, 1991) techniques. The antibody prepared by the above method can be separated and purified by gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.

샘플에서 특정 마커의 검출에 관련된 하기 프로토콜을 예시를 위해 제시한다. The following protocol relating to the detection of a specific marker in the sample is presented for illustrative purposes.

포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서 T1R2, T1R3, α-거스트듀신 단백질의 존재를 조사 또는 시험하는 프로토콜을 포함한다. Protocols to investigate or test for the presence of T1R2, T1R3, a-gusted dorsal proteins in mammalian tissue or cell samples.

본 발명의 일 실시예에서, 샘플에서 상기 단백질들의 발현은 면역블럿 분석, 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 사용하여 조사하였다. 조직 절편의 면역조직화학적 염색은 샘플에서 단백질의 존재를 평가 또는 검출하는 신뢰할 수 있는 방법으로 판명되었다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은 프로브에 대한 항체를 이용하고, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 가시화시킨다.In one embodiment of the invention, the expression of the proteins in the sample was investigated using immunoblot analysis, immunohistochemistry and staining protocols. Immunohistochemical staining of tissue sections has been shown to be a reliable method of assessing or detecting the presence of a protein in a sample. Immunohistochemistry ("IHC") techniques utilize antibodies to the probe and generally visualize cellular antigens in the system by chromogenic or fluorescent methods.

샘플 제조를 위해, 포유동물 (일반적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하여 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 과정에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. For sample preparation, tissues or cell samples from mammals (typically human patients) can be used. Samples may be obtained by a variety of procedures known in the art including, but not limited to surgical excision, aspiration, or biopsy. The tissue can be fresh or frozen.

조직 샘플은 통상적인 방법에 의해 고정 (즉 보존)될 수 있다. 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정액을 선택할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 또한 고정 시간이 조직 샘플의 크기 및 사용되는 고정액에 따라 결정됨을 이해할 것이다.The tissue sample can be fixed (i.e., preserved) by conventional methods. Those skilled in the art will appreciate that the fixative may be selected for purposes in which the sample is histologically stained or otherwise analyzed. Those skilled in the art will also appreciate that the fixation time is determined by the size of the tissue sample and the fixative used.

상기 방법은 추가로 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA 발현을 조사하는 프로토콜을 포함한다. 세포 내의 mRNA의 평가 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 상보성 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 분석 및 다양한 핵산 증폭 분석 (예를 들어 상보성 프라이머를 사용하는 RT-PCR 등)을 포함한다. 포유동물의 조직 또는 세포 샘플은 노던 블럿, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 사용하여 mRNA에 대해 편리하게 분석할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 분석, 정량적 PCR 분석은 당업계에 공지되어 있다. The method further comprises a protocol for examining mRNA expression in a tissue or cell sample. Methods for evaluating mRNA in cells are well known and include, for example, hybridization assays using complementary DNA probes and various nucleic acid amplification assays (such as RT-PCR using complementary primers, etc.). Mammalian tissue or cell samples can be conveniently analyzed for mRNA using Northern blot, dot blot or PCR analysis. For example, RT-PCR analysis, quantitative PCR analysis are known in the art.

생물학적 샘플에서 mRNA를 검출하는 방법은 적어도 하나의 프라이머를 사용한 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생성시키고, 상기 cDNA를 증폭시키기 위해 센스 및 안티센스 프라이머로서 폴리뉴클레오티드를 사용하여 상기 생성된 cDNA를 증폭시키고, 증폭된 cDNA의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 mRNA의 수준을 결정할 수 있도록 하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. A method for detecting mRNA in a biological sample comprises generating cDNA from a sample by reverse transcription using at least one primer and amplifying the resulting cDNA using a polynucleotide as a sense and antisense primer to amplify the cDNA, RTI ID = 0.0 > cDNA < / RTI > The method may also include one or more steps to enable the level of mRNA in the biological sample to be determined.

상기 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 사용하여, 시험 및 대조조직 샘플로부터의 시험 및 대조 mRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 생성시킨다. 이어서, 프로브는 고체 지지체 상에 고정된 핵산 어레이에 혼성화된다. 어레이는 어레이의 각각의 멤버의 서열 및 위치를 알 수 있도록 준비한다. 예를 들어, 특정 질병 상태에서 발현되는 능력을 갖는 유전자가 고체 지지체 상에 배열된다. 표지된 프로브와 특정 어레이 멤버의 혼성화는 프로브가 그로부터 유도되는 샘플이 유전자를 발현함을 나타낸다. 질병 조직의 차등 유전자 발현 분석은 유용한 정보를 제공할 수 있다. The method includes protocols for probing or detecting mRNA in a tissue or cell sample by microarray technology. Using nucleic acid microarrays, test and control mRNA samples from test and control tissue samples are reverse transcribed and labeled to generate cDNA probes. The probe is then hybridized to a nucleic acid array immobilized on a solid support. The array is ready to know the sequence and location of each member of the array. For example, genes with the ability to be expressed in a particular disease state are arranged on a solid support. Hybridization of a labeled probe and a particular array member indicates that the probe is expressing the gene from which the sample is derived. Differential gene expression analysis of diseased tissues can provide useful information.

상기와 같은 프로토콜에 의해 T1R2, T1R3, α-거스트듀신 발현을 측정하여 허혈질환의 진단이 가능하다. 앞서 언급한 바와 같이, 상기 유전자는 T1R2 및 α-거스트듀신; T1R3 및 α-거스트듀신; 또는 T1R2, T1R3, α-거스트듀신의 조합으로 측정하는 것이 바람직하다.
Diagnosis of ischemic diseases is possible by measuring T1R2, T1R3, α-gusted ducin expression by the above protocol. As mentioned earlier, the genes are T1R2 and alpha-gusted dysin; T1R3 and a-gusted duchy; Or a combination of T1R2, T1R3, and? -Gust dough.

진단키트Diagnostic Kit

유사한 관점에서 본 발명은 인간의 허혈질환 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 T1R2, T1R3, α-거스트듀신 중 1종 이상의 유전자의 발현을 분석하여 허혈질환의 유무를 판단하는데 쓰이는데, 이는 크게 두 가지 방법으로 실시할 수 있다: 유전적 분석(genetic analysis) 및 면역분석(immunoassay).In a similar aspect, the present invention relates to a kit for diagnosing human ischemic diseases. The kit is used to determine the presence or absence of ischemic diseases by analyzing the expression of at least one gene among T1R2, T1R3, alpha-gusted duodenum, which can be largely performed by two methods: genetic analysis and immunization Analysis (immunoassay).

이를 위해, 상기 키트는 T1R2, T1R3, α-거스트듀신 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 혹은 프로브; 또는 T1R2, T1R3, α-거스트듀신 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. To this end, the kit may comprise primers or probes specifically binding to T1R2, T1R3, alpha-gust toxin gene sequences; Or an antibody that specifically binds to T1R2, T1R3, a-gusted dsun protein.

즉, 본 발명의 인간 허혈질환 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 그리고, 본 발명의 인간 허혈질환 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. That is, when the kit for diagnosing human ischemic diseases of the present invention is applied to a PCR amplification process, the kit of the present invention may optionally include reagents necessary for PCR amplification, such as a buffer, a DNA polymerase (for example, Thermus aquaticus (Taq) Thermostable DNA polymerases obtained from Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis or Pyrococcus furiosus (Pfu)), DNA polymerase joins and dNTPs. And, when the kit for diagnosing human ischemic diseases of the present invention is applied to immunoassay, the kit of the present invention may optionally include a secondary antibody and a label substrate.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.The kit of the present invention may be made from a number of separate packaging or compartments containing the above reagent components.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 상기 허혈질환 진단용 조성물을 포함하는 허혈질환 진단 키트를 제공한다. In still another embodiment of the present invention, there is provided an ischemic disease diagnostic kit comprising the composition for diagnosing ischemic diseases according to the present invention.

바람직하게, 상기 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.Preferably, the diagnostic kit may further comprise one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.

구체적인 일 양태로서, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.In a specific embodiment, the diagnostic kit may be a diagnostic kit comprising essential elements necessary for performing a reverse transcription-polymerase reaction. The RT-PCR kit contains the respective primer pairs specific for the marker gene. The primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each marker gene, and has a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also contain a primer specific for the nucleic acid sequence of the control gene. Other reverse transcription polymerase reaction kits may be used in combination with test tubes or other appropriate containers, reaction buffers (varying in pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC DEPC-water, sterile water, and the like.

또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.In another embodiment, it may be a diagnostic kit, preferably comprising an essential element necessary for carrying out a DNA chip. The DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and reagents, preparations, enzymes, and the like for producing a fluorescent-labeled probe. The substrate may also comprise a cDNA or oligonucleotide corresponding to a control gene or fragment thereof.

또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
Also preferably, it may be a diagnostic kit characterized by comprising essential elements necessary for performing ELISA. ELISA kits contain antibodies specific for the marker protein. Antibodies are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies or recombinant antibodies with high specificity and affinity for each marker protein and little cross reactivity to other proteins. The ELISA kit may also include antibodies specific for the control protein. Other ELISA kits can be used to detect antibodies that can bind a reagent capable of detecting the bound antibody, such as a labeled secondary antibody, chromophores, an enzyme (e. G., Conjugated to an antibody) Other materials, and the like.

진단방법Diagnostic method

본 발명은 일 관점에서, 이러한 발견에 기초하여 T1R2, T1R3, α-거스트듀신의 발현수준을 측정하는 것을 포함하는 허혈질환 진단 방법 또는 허혈질환 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a method for diagnosing ischemic diseases or a method for providing information for diagnosing ischemic diseases, which comprises measuring the expression levels of T1R2, T1R3, a-gustducin based on such findings.

일 구체예로서, 상기 방법은,In one embodiment,

환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1이상 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 특히, 상기 유전자들의 성상세포(astrocyte)에서의 발현수준을 측정하는 것을 특징으로 한다. 기타 사항은 앞서 설명한 바와 같다.Measuring the level of expression of one or more genes selected from T1R2, T1R3, and alpha-gusted dyssin from the biological sample isolated from the patient or the level of the protein encoded by said gene; And comparing the expression level of the gene or the level of the protein encoded by the gene to the expression level or protein level of the corresponding gene of the normal control sample. In particular, the expression level of the genes in astrocyte is measured. Other details are as described above.

즉, 상기 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 유전자의 발현은 허혈 질환에 대한 지표임을 특징으로 한다. 다시 말해, 상기 허혈질환 진단방법은 허혈, 특히 뇌 허혈에 따른 성상세포에서의 특정 마커의 발현을 조사하는 것에 관한 것이고, 본 명세서에 개시된 방법은 허혈질환 환자 치료를 위해 적절하거나 효과적인 요법을 평가할 때 유용한 데이터 및 정보를 얻기 위한 편리하고, 효율적이며, 비용 효과적인 수단을 제공할 수 있을 것이다. That is, expression of the T1R2, T1R3, and a-gusted duodenal genes is an index for ischemic diseases. In other words, the method for diagnosing ischemic diseases relates to examining the expression of specific markers in astrocytes following ischemia, particularly brain ischemia, and the methods disclosed herein are useful for evaluating appropriate or effective therapies for the treatment of patients with ischemic diseases Efficient, and cost effective means for obtaining useful data and information.

예를 들어, 허혈로 진단된 환자에 대해 조직 또는 세포 샘플을 얻기 위해 생검을 수행할 수 있고, 치료제가, 예를 들어 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신의 활성과 관련되는 경우 치료제의 효과를 예측하기 위해 환자의 조직 또는 샘플을 각종 시험관 내 분석에 의해 조사할 수 있다.For example, a biopsy may be performed to obtain a tissue or cell sample for a patient diagnosed with ischemia, and the effect of the therapeutic agent may be predicted if the therapeutic agent is associated with, for example, T1R2, T1R3 or & The patient ' s tissues or samples may be examined by various in vitro assays.

구체적인 일 양태로서, 본 발명은 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 허혈질환 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA를 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 허혈질환 진단 방법을 제공한다.In a specific embodiment, the present invention provides a method for detecting an ischemic disease, comprising: measuring mRNA from a biological sample of a patient suspected of ischemic disease using a primer specific to one or more genes selected from T1R2, T1R3, and? And comparing the increase of the mRNA level with the mRNA level of a normal control sample.

생물학적 시료에서 mRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 mRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.The process of separating mRNA from a biological sample can be carried out using known processes, and the level of mRNA can be measured by various methods.

본 발명에서 용어 생물학적 시료란 허혈질환 발병에 의해 허혈질환 마커의 유전자 발현 수준이 차이나는 조직,세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.The term biological sample in the present invention includes, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine, etc. in which gene expression levels of ischemic disease markers are changed by the onset of ischemic diseases Do not.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.Methods for measuring mRNA levels include, but are not limited to, reverse transcriptase polymerase, competitive reverse transcriptase polymerase, real-time reverse transcriptase polymerase, RNase protection assay, northern blotting, and DNA chip.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 허혈질환 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 허혈질환 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 허혈질환 의심 환자의 실제 허혈질환 발병 여부를 진단할 수 있다.Through these detection methods, it is possible to compare the amount of mRNA expression in the normal control group and the amount of mRNA expression in the suspected ischemic disease patient, and to determine whether the expression level of mRNA is significantly increased in the ischemic disease marker gene, It is possible to diagnose the onset of ischemic disease.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 허혈질환 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.Measurement of mRNA expression level is preferably performed using a reverse transcriptase polymerase reaction method or a DNA chip using a primer specific to a gene used as an ischemic disease marker.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 허혈질환 진단마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 허혈질환 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.The above reverse transcriptase polymerase reaction is followed by electrophoresis to determine the band pattern and the thickness of the band, thereby confirming the expression level and mRNA expression level of a gene used as a marker for ischemic diseases. By comparing the mRNA expression level with the control group, Can be diagnosed easily.

한편, DNA 칩은 상기 허혈질환 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 허혈질환의 발병 여부를 판독할 수 있다.On the other hand, a DNA chip uses a DNA chip in which the nucleic acid corresponding to the ischemic disease marker gene or a fragment thereof is attached to a glass-like substrate at a high density. The DNA chip separates the mRNA from the sample, A cDNA probe can be prepared, hybridized to a DNA chip, and the occurrence of an ischemic disease can be read.

또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1개 이상의단백질에 특이적인 항체를 허혈질환 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 허혈질환 진단 방법을 제공한다.In yet another specific embodiment, the present invention provides a method of identifying an antibody specific to one or more proteins selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted dyssin, with a biological sample of a subject suspected of having ischemic disease to determine protein levels by antigen- And comparing the increase of the protein formation amount with the protein level of the normal control sample.

생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.The process of separating proteins from biological samples can be carried out using known processes and protein levels can be measured by various methods.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.Analysis methods for measuring protein levels include Western blotting, ELISA, radioimmunoassay, radial immunodiffusion, Oucheroton immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immuno staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, Protein chips, and the like.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 허혈질환 의심환자에서의 항원-항체복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 허혈질환 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 허혈질환 의심 환자의 실제 허혈질환 발병 여부를 진단할 수 있다.Through the above analysis methods, it is possible to compare the amount of the antigen-antibody complex formed in the normal control group with the amount of the antigen-antibody complex formed in the suspected ischemic disease patient, and the increase in the expression level of the protein from the ischemic disease marker gene , It is possible to diagnose the actual onset of ischemic disease in patients suspected of ischemic diseases.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 허혈질환 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.The term antigen-antibody complex in the present invention refers to a combination of an ischemic disease marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of the antigen-antibody complex formed can be quantitatively measured through the magnitude of a signal of a detection label .

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.Such detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, chromophores, ligands, emitters, microparticles, redox molecules, and radioisotopes, but are not necessarily limited thereto. When an enzyme is used as the detection label, available enzymes include? -Glucuronidase,? -D-glucosidase,? -D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholine Glucoamylase, terazo, glucose oxidase, hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokutase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphoenolpyruvate decar ≪ / RTI > beta-lactamase, and the like. The minerals include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, picoeriterine, picocyanin, allophycocyanin, o-phthaldehyde, fluororescamine and the like. Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.

발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물,바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ]2+,[RU(bpy) 3 ]2+, [MO(CN) 8 ]4-등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,125I,131I ,186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.Emitters include, but are not limited to, acridinium esters, luciferin, luciferase, and the like. Fine particles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like. Examples of the redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, viologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K4 W (CN) 8, [Os (bpy) [RU (bpy) 3] 2+, [MO (CN) 8] 4-, and the like. Radiation isotopes include, but are not limited to, 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, 상기 허혈질환 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 허혈질환 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 허혈질환이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도) 차이로 나타낼 수 있다.Determination of protein expression levels is preferably by Western blot using one or more antibodies to the ischemic disease marker. The whole protein is separated from the sample, and the protein is separated according to size by electrophoresis, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. The amount of the protein produced by the expression of the gene can be confirmed by confirming the amount of the produced antigen-antibody complex using the labeled antibody, thereby confirming whether or not the ischemic disease has occurred. This detection method is performed by examining the amount of marker gene expression in a control group and the expression level of a marker gene in a cell in which ischemic disease has occurred. The level of mRNA or protein may be expressed as the absolute (e.g., [mu] g / ml) or relative (e.g., the relative intensity of the signal) difference of the marker protein.

또한, 바람직하게는, 상기 허혈질환 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다.In addition, preferably, immunostaining is performed using one or more antibodies against the ischemic disease marker.

정상 대장 상피 조직 및 허혈질환으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 um 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.Normal colon epithelial tissues and suspected ischemic diseases are collected and fixed, and paraffin-embedded blocks are prepared by methods well known in the art. They are made into sections with a thickness of several um and attached to a glass slide, and then reacted with a selected one of the above antibodies by a known method. Thereafter, the unreacted antibody is washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels, and the labeling of the antibody is read on a microscope.

또한, 바람직하게는, 상기 허혈질환 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 허혈질환 발병 여부를 확인할 수 있다.
In addition, preferably, one or more antibodies against the ischemic disease markers are arranged at predetermined positions on the substrate, and protein chips are immobilized at a high density. A method of analyzing a sample using a protein chip is a method of separating a protein from a sample, hybridizing the separated protein with a protein chip to form an antigen-antibody complex, reading the protein, It is possible to confirm whether or not an ischemic disease has occurred.

스크리닝 방법Screening method

한편, 다른 관점에서 본 발명은 앞서 설명한 사실을 기반으로 하여, T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신의 발현을 억제시키는 허혈질환 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.On the other hand, the present invention, on the other hand, relates to a method for screening a substance for treating ischemic diseases which inhibits the expression of T1R2, T1R3 or? -Gestrous ducin on the basis of the facts described above.

상기 방법은 일 구체예로,The method comprises, in one embodiment,

(a) 후보 물질의 존재하에, 성상세포에 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 발현시키는 단계; 및 (b) 후보물질이 없이 성상세포에 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 발현시킨 경우에 비하여, 상기 유전자들의 발현이 억제되는 경우의 후보물질을 허혈질환 치료용 물질로 선택하는 단계를 포함할 수 있다.(a) expressing in the presence of a candidate substance at least one gene selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted dyssyn in astrocytic cells; And (b) a candidate substance in the case where the expression of the genes is inhibited, as compared with a case in which at least one gene selected from T1R2, T1R3, and? -Gastedesin is expressed in astrocytes without a candidate substance, As shown in FIG.

본 발명의 상기 방법에서는 먼저 후보물질의 존재하에 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신를 함유하는 세포를 배양한다. 이러한 세포로서는 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신 유전자를 발현하는 암세포 또는 NLK 유전자를 발현하도록 형질전환된 세포를 포함한다. In the method of the present invention, cells containing T1R2, T1R3 or a-gustducin are first cultured in the presence of the candidate substance. Such cells include cancer cells expressing T1R2, T1R3, or alpha-gusted ducin gene, or cells transformed to express NLK gene.

다음으로, 후보물질이 없이, T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신 유전자로 형질전환된 세포를 배양하여 상기 유전자를 발현시킨 경우와 비교하여, T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신의 발현이 억제되는 경우의 후보물질을 허혈질환 치료용 물질로 선택한다.Next, the expression of T1R2, T1R3, or a-gusted ducin is inhibited in comparison with the case of culturing cells transformed with T1R2, T1R3, or? The candidate substance is selected as a substance for treating ischemic diseases.

한편, 본 발명자는 허혈질환 조직에서 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신이 상향조절 발현됨에 있어서, 이들의 상향조절이 허혈성 해마에서 임의의 뉴런이 아닌, 반응성 성상세포에서 발견됨을 확인하였다. 또한, T1R2 및 T1R3의 발현 프로파일은 겹쳐지는(overlapping) 발현 패턴을 공유하고, 상기 a-거스트듀신의 증가된 발현 역시 상기 두 단맛 수용체들과 일치하는, 허혈성 해마에서의 시공간적 활성을 보여줌을 발견하였다. 즉, a-거스트듀신 역시 허혈성 해마에서 반응성 성상세포 중 특이적으로 일어났다. 이는 허혈성 손상이 반응성 성상세포에서 G-protein-결합된 단맛 수용체의 발현에 영향을 준다는 것을 의미하고, 이는 뇌 허혈에 의해 나타나는 반응성 성상세포의 단맛 시그날링 단백질 유도가 뇌에서의 글루코오스 항상성 유지에 관여함을 시사한다.On the other hand, the present inventors confirmed that upregulation of T1R2, T1R3 or a-gust dyschyne in ischemic disease tissues was found in reactive astrocytes, rather than in any neurons in the ischemic hippocampus. In addition, the expression profiles of T1R2 and T1R3 share an overlapping expression pattern, and it was found that increased expression of the a-gusted dysine also exhibits spatio-temporal activity in the ischemic hippocampus consistent with the two sweet taste receptors . That is, a-gust ducein also occurs specifically in reactive astrocytes in the ischemic hippocampus. This indicates that ischemic injury affects the expression of G-protein-coupled sweet receptor in reactive astrocytes, suggesting that the induction of the sweet signaling protein of reactive astrocytic cells induced by brain ischemia is involved in the maintenance of glucose homeostasis in the brain .

따라서 본 발명은 다른 관점에서, 성상세포에서 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자의 발현을 감소 또는 증가시킴으로써 뇌의 글루코오스 항상성을 유지시키는 방법에 관한 것이다. Thus, the present invention, in another aspect, relates to a method of maintaining glucose homeostasis in the brain by reducing or increasing the expression of one or more genes selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted duchin in astrocytes.

또한, 본 발명은 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신의 발현과 관련하는 유전자의 발현의 상향 조절 또는 하향 조절에 대한 유전적 접근까지 확장한다. 일반적으로, 유전자 사일런싱 예컨대 전사 전 또는 전사후 유전자 사일런싱을 유도하기 위해 유전적 수단을 사용하는 것이 보다 편리하다. 그러나, 발현을 상향 조절하는데 사용되는 일반적 기법은 유전자 복제수를 증가시키거나 또는 유전자 발현의 억제제를 길항시키는 것이다.
The present invention also extends to a genetic approach to the upregulation or downregulation of the expression of genes associated with the expression of T1R2, T1R3 or alpha-gusted ducin. Generally, it is more convenient to use genetic means to induce gene silencing, e.g., gene silencing before or after transcription. However, a common technique used to up-regulate expression is to increase the number of gene copies or to antagonize inhibitors of gene expression.

이처럼, 본 발명에서는 허혈, 특히 뇌허혈 환자에게서 T1R2, T1R3 또는 α-거스트듀신 유전자의 발현양이 증가한다는 것을 보여 주었고, 이러한 결과는 허혈질환 치료제를 개발 또는 스크리닝 하기 위한 표적유전자로서, 본 발명에 의해 특성이 규명된 상기 유전자를 이용할 수 있다.
As described above, the present invention shows that the expression level of T1R2, T1R3, or a-gust duducin gene is increased in ischemia, particularly in cerebral ischemic patients, and the result is a target gene for developing or screening an agent for treating ischemic diseases, The above-described gene whose characteristics have been identified can be used.

<< 실시예Example >>

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

<< 실시예Example 1> 1>

일시적인 temporary 전뇌Whole brain 허혈 유도 Ischemic induction

모든 실험적 동물 과정은 한국 카톨릭 대학의 가톨릭 윤리 위원회(Catholic Ethics Committee)로부터 승인을 받고(CUMC09U029), 미국 NIH(National Institutes of Health) 가이드 및 실험 동물 사용(NIH Publication No. 80-23, revised 1996)에 따랐다. 실험에는 성인 수컷 백서(Sprague Dawley rat)(250-300 g)를 이용하였다. Pulsinelli 및 Brierley 에 기재되어 있는 내경동맥 영역의 혈류를 차단시키는 4혈관 폐색 모델 4-VO(four-vessel occlusion) 및 재관류 방법을 이용하여(Pulsinelli WA, Brierley JB (1979) A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke 10:267 - 272), 일시적 전뇌 허혈을 유도하였다. 즉, 척추 동맥을 전기 응고기를 사용하여(electrocauterized) 혈관에서의 순환을 정지시켰다. 24시간 후, 총경동맥을 미니어처 동맥류 클립으로 10분 동안 폐색시켰다. 혈관 폐색 후 완전한 평편한 뇌파(flat electroencephalograms)를 보여주는 이들 동물들만을 허혈로 분류하여 실험에 사용하였다. 허혈 동안 및 허혈 후 가열램프로 체온을 37.5± 0.3℃로 유지시켰다. 척추 동맥을 전기 응고한 후 경동맥 주위를 잡아매되 폐색을 하지 않은 쥐를 대조군으로 사용하였다. 가짜(sham)-수술 또는 재관류 후 경련을 일으키거나 죽은 동물은 없었다. 재관류 후 1, 3, 7, 및 14일 동안 살려둔 후, 각각의 시점에서 3마리의 쥐를 면역블럿 분석에 사용하기 위해 희생시키고 7마리를 면역조직화학분석을 위해 희생시켰다. 수술한 동물은 상기 허혈/재관류 동물과 동일한 방법을 이용하여 처리하였다. 재관류에 따른 각 시점에 동물들을 16.9% 우레탄(10 ml/kg)으로 깊이 마취시키고, 0.1 M 인산 버퍼 중 (pH 7.4) 4% 파라포름알데히드를 함유하는 고정액으로 경심관류 고정(transcardial perfusion)에 의하거나 또는 참수(decapitation)에 의해서 죽였다. 그리고 액체 질소에서 빠른 냉동으로 해마를 절제하였다.
All experimental animal procedures are approved by the Catholic Ethics Committee of the Catholic University of Korea (CUMC09U029), the US National Institutes of Health (NIH) Guide and Laboratory Animals Use (NIH Publication No. 80-23, revised 1996) . Adult male Sprague Dawley rats (250-300 g) were used for the experiment. (Pulsinelli WA, Brierley JB (1979). A new model of bilateral hemispheric ischemia using 4-VO (four-vessel occlusion) and reperfusion method to block blood flow in the internal carotid artery region described in Pulsinelli and Brierley in the unanesthetized rat (Stroke 10: 267-272), induced transient total cerebral ischemia. That is, the vertebral artery was electrocauterized using an electric coagulator to stop circulation in the blood vessels. After 24 hours, the total carotid artery was occluded with a miniature aneurysm clip for 10 minutes. Only those animals showing flat electroencephalograms after vascular occlusion were classified as ischemia and used in the experiment. During ischemia and after ischemia, the body temperature was maintained at 37.5 ± 0.3 ° C with a heating lamp. After the vertebral artery was electrocoagulated, carotid artery grafts were used, and the mice without occlusion were used as controls. Sham - There was no spasm or dead animal after surgery or reperfusion. After resuscitation for 1, 3, 7, and 14 days after reperfusion, 3 rats at each time point were sacrificed for use in immunoblot analysis and 7 were sacrificed for immunohistochemical analysis. The operated animals were treated using the same method as the above ischemia / reperfusion animals. Animals were deeply anesthetized with 16.9% urea (10 ml / kg) at each time point following reperfusion and were anesthetized with a fixative containing 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) Or killed by decapitation. The hippocampus was resected by rapid freezing in liquid nitrogen.

<< 실시예Example 2> 2>

면역블럿Immune blot 분석( analysis( ImmunoblotImmunoblot analysis분석 ))

면역블럿 분석을 위하여, coronal slices (400 μm thick)를 McIlwain 조직 절편기(The Mickle Laboratory Engineering, Guildford, UK)로 중격 해마 수준에서 자르고, 유곽 유두를 절개하여 도려내었다. 대조군의 등쪽 해마와 재관류 후 3, 7, 14일되는 실험용 쥐, 맛 돌기를 포함하는 유곽 유두를 ice-cold RIPA buffer (50 mM Tris buffer, pH 8.0; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 0.5% deoxycholate; and 0.1% SDS)에서 균질화시켰다. 해마 조직 및 유곽 유두로부터 전체 단백질의 동일 양(80 μg)을 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인상에 블럿팅시켰다. T1R2 (Santa Cruz Biotechonolgy, Inc., Santa Cruz, CA, USA; dilution 1:100) 또는 T1R3 (Santa Cruz Biotechonolgy, Inc.; dilution 1:100)에 대한 염소 다클론 항체 또는 α-거스트듀신 (Santa Cruz Biotechonolgy, Inc.; dilution 1:200)에 대한 토끼 다클론 항체를 이용하여 블럿의 면역염색을 수행하였다. 향상된 화학발광 시스템 (ECL kit, Amersham, Arlington Heights, IL, USA)으로 면역반응성 밴드를 현상시켰다. Eagle Eye TMII Still Video System (Stratagene, La Jolla, CA, USA)을 이용하여 밀도분석(Densitometric analysis)을 수행하였다. 3마리 동물들을 각각의 시점에서 면역블럿팅에 사용하였고 각 샘플들을 트리플리케이트(triplicate)에 테스트하였다. 주변 밀도를 뺀 후에, 수술 쥐에 대한 실험군 쥐의 광학밀도 비율을 측정하였다. 통계학적 유의성을 Dunnetts t test에 따른 변량분석(ANOVA)에 의해 분석하였다; P < 0.05는 유의한 것으로 간주하였다.
For immunoblot analysis, coronal slices (400 μm thick) were cut at the septal hippocampus level with a McIlwain tissue explorer (The Mickle Laboratory Engineering, Guildford, UK), and the papillae were dissected out. The rats were placed in ice-cold RIPA buffer (50 mM Tris buffer, pH 8.0; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 0.5) in the control rat's dorsal hippocampus and 3, 7 and 14 days after reperfusion. % deoxycholate; and 0.1% SDS). The same amount (80 μg) of total protein from hippocampal tissues and marginal papillae was separated by 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and blotted onto nitrocellulose membranes. (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz Biotechnology, Inc., dilution 1: 100) or T1R3 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. dilution 1: 100) Biotechonolgy, Inc., dilution 1: 200) was performed using a rabbit polyclonal antibody. Immunoreactive bands were developed with an enhanced chemiluminescence system (ECL kit, Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Densitometric analysis was performed using an Eagle Eye TMII Still Video System (Stratagene, La Jolla, Calif., USA). Three animals were used for immunoblotting at each time point and each sample was tested in triplicate. After subtracting the peripheral density, the optical density ratio of the experimental mice to the surgical rats was measured. Statistical significance was analyzed by ANOVA with Dunnett's t test; P <0.05 was considered significant.

상기와 같은 분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, T1R2, T1R3 or α-거스트듀신 에 대한 특이적 항체로 실험한 면역블럿 분석은 유곽 유두에서의 분석과 일치하는, 95 kDa (T1R2), 93 kDa (T1R3) or 38 kDa (α-거스트듀신)의 단백질에 상응하는 면역반응성 종들을 각각 보여주었다.As shown in FIG. 1, immunoblot analysis of specific antibodies against T1R2, T1R3, or a-gusted dyssin showed 95 kDa (T1R2), 93 kDa (T1R3) or 38 kDa (α-gusted ducsin), respectively.

또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 일반적으로, 각 단백질의 발현 수준은 유사한 일시적 패턴을 보여주었다. 단맛 시그날링 단백질의 수준은 재관류 후 3일 째 증가하였고, 7일째 피크를 나타냈으며 그 후부터는 감소하였다. 그러나 향상된 발현 수준이 적어도 14일까지는 유지되었다.
In addition, as shown in Figure 2, in general, the expression levels of each protein showed a similar transient pattern. The levels of the sweet signaling protein increased at 3 days after reperfusion, peaked at 7 days, and decreased thereafter. However, improved expression levels were maintained for at least 14 days.

<< 실시예Example 3> 3>

단일, 이중, 삼중 표지 통한 면역조직화학 분석Immunohistochemical analysis through single, double, triple labeling

Coronal 동결 절편(25 μm thick)을 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 면역조직화학 분석을 위해 사용하였다. 10% 정상 당나귀 혈청으로 1시간동안 블러킹한 후, 상기 절편을 T1R2 (Santa Cruz Biotechonolgy, Inc.; dilution 1:100) 또는 α-거스트듀신 (Santa Cruz Biotechonolgy, Inc.; dilution 1:100)에 대한 토끼 다클론 항체, 또는 T1R3 (Santa Cruz Biotechonolgy, Inc.; dilution 1:100)에 대한 염소 다클론 항체로 밤새 4 ℃에서 배양하였다. 퍼옥시다아제-표지된 당나귀 항-염소. IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA; dilution 1:100) 또는 퍼옥시다아제-표지된 당나귀 항-토끼 IgG (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:100), 및 기질로서 0.01% H₂O₂ 와 함께0.05% 3,3´-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(diaminobenzidine tetrahydrochloride)를 이용하여 1차 항체 결합을 가시화하였다. 1차 항체가 생략된 절편들에서 또는 비-특이적 토끼 또는 염소 IgG에서 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 면역반응성의 특이성을 면역화학조직적 염색의 결핍에 의해 확인하였다. 2중 또는 3중-면역형광 조직화학분석을 위해, 절편들을 다음의 항체들과 함께 밤새도록 4℃에서 배양하였다; T1R2에 대한 토끼 다클론 항체, α-거스트듀신에 대한 토끼 다클론 항체, T1R3 에 대한 염소 다클론 항체, GFAP(glial fibrillary acidic protein; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA; dilution 1:500)에 대한 마우스 단클론 항체, OX-42 (Serotec, UK; dilution 1:100)에 대한 마우스 단클론 항체 및 NeuN(anti-neuronal nuclear antigen; Chemicon International Inc.; dilution 1:500)에 대한 마우스 단클론 항체. Coronal frozen sections (25 μm thick) were used for T1R2, T1R3 and α-gust-duxin immunohistochemistry. After blocking for 1 hour with 10% normal donkey serum, the sections were incubated with T1R2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.; dilution 1: 100) or α-gust duucine (Santa Cruz Biotechnology, Inc., dilution 1: Rabbit polyclonal antibody, or T1R3 (Santa Cruz Biotechnology, Inc .; dilution 1: 100) overnight at 4 ° C. Peroxidase - labeled donkey anti - chlorine. (Jackson ImmunoResearch; dilution 1: 100) with peroxidase-labeled donkey anti-rabbit IgG (0.01% H ₂ O ₂ as a substrate) and 0.05 Primary antibody binding was visualized using 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride. The specificity of T1R2, T1R3 and a-gust-du- tine immunoreactivity was confirmed by lack of immunochemical tissue staining in sections where primary antibodies were omitted or in non-specific rabbit or goat IgG. For double- or triple-immunohistochemistry, sections were incubated overnight at 4 ° C with the following antibodies; Rabbit polyclonal antibody against T1R2, rabbit polyclonal antibody against alpha-gust ducein, chlorcloc antibody against T1R3, glial fibrillary acidic protein (GFAP; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA; dilution 1: 500) Mouse monoclonal antibody against mouse monoclonal antibody to OX-42 (Serotec, UK; dilution 1: 100) and mouse monoclonal antibody against NeuN (anti-neuronal nuclear antigen; Chemicon International Inc. dilution 1: 500).

그 후 상기 절편들을, Cy3-접합된 당나귀 항-토끼 IgG (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:1,000), Cy3-접합된 당나귀 항-염소 IgG (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:1,000), FITC-접합된 당나귀 항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:50), FITC-접합된 당나귀 항-염소 IgG (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:50), FITC-접합된 항-토끼 항체 (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:50) 및 Cy5-접합된 항-마우스 항체 (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:500) 혼합물로 각각 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 대조군 절편들도 상기 기재한 대로 준비하였다. 10분 동안 DAPI(4′,6-diamidino-2′-phenyindole; Roche; dilution 1:1000)로 절편들을 배양함으로써 세포 핵의 대조염색(Counterstaining)을 실시하였다. 슬라이드를 공초점 현미경(LSM 510 Meta, Carl Zeiss Co., Ltd., Germany)으로 관찰하였다.
The sections were then incubated with Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch dilution 1: 1,000), Cy3-conjugated donkey anti-goat IgG (Jackson ImmunoResearch dilution 1: 1,000), FITC- (Jackson ImmunoResearch dilution 1:50), FITC-conjugated donkey anti-goat IgG (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:50), FITC-conjugated anti-rabbit antibody (Jackson ImmunoResearch dilution 1:50) Cy5-conjugated anti-mouse antibody (Jackson ImmunoResearch; dilution 1: 500) mixture for 2 hours at room temperature. Control sections were also prepared as described above. Counterstaining of cell nuclei was performed by incubating the sections with DAPI (4 ', 6-diamidino-2'-phenyindole;Roche; dilution 1: 1000) for 10 minutes. The slides were observed with a confocal microscope (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Co., Ltd., Germany).

<3-1> 허혈 후 <3-1> After ischemia T1R2T1R2 andand T1R3 의T1R3's 일시적 프로파일 및 표현형 분석 Temporal profile and phenotypic analysis

허혈 후 해마에서의 단맛 수용체 T1R2 and T1R3의 세포내 위치 및 영역적 분포를 알아보기 위하여 면역조직화학 분석을 실시하였다.
Immunohistochemical analysis was performed to determine the intracellular location and regional distribution of the sweet receptor T1R2 and T1R3 in the hippocampus after ischemia.

그 결과, T1R2 or T1R3에 특이적인 모든 면역반응성은 1차 항체가 생략되거나 비특이적 토끼 또는 염소 IgG로 대체하였을 때 보이지 않는 것으로 나타났으며, 수술한 쥐에서, immunoreactivity for T1R2의 면역반응성은 모든 시점에서 해마 중 과립세포 및 피라미드 세포층의 뉴런에서 볼 수 있었다(도 2의 A, C). 또한, 이는 뇌 피질 뉴런(cerebral cortical neurons) 및 시상하부 뉴런에서 명백히 나타났다.As a result, all immunoreactivity specific for T1R2 or T1R3 was not seen when the primary antibody was omitted or replaced by nonspecific rabbit or goat IgG. In the operated rats, immunoreactivity for T1R2 immunoreactivity was observed at all time points Were found in neurons in granule cells and pyramidal cell layers in the hippocampus (A, C in Fig. 2). It was also apparent in cerebral cortical neurons and hypothalamic neurons.

나아가, 재관류 후 1일이 시작되면서, T1R2 면역반응성이 증가하였고(데이터 도시않음) 3일 및 7일까지 CA1 및 CA3 영역 및 치상회 폐문 부위(dentate hilar region) 에서 우선적으로 증가하였다(도2 B). 이때, T1R2의 면역반응성이 대조군과 비교하여 CA1 영역의 방사층 및 지향층 중 소세포에서 현저하게 나타났다(도2의 C-E). 이들 면역반응성 세포들의 분포 패턴 및 형태는 그들이 아교세포일 수 있음을 보여주었다. 14일째, 표지되는 패턴에는 변화가 없었으나, 표지되는 세포는 강한 면역반응성과 함께 비후성 양태를 나타내었다(도2 F).Furthermore, as 1 day after reperfusion began, T1R2 immunoreactivity increased (data not shown) and increased preferentially in the CA1 and CA3 regions and the dentate hilar region until 3 and 7 days (Fig. 2B ). At this time, the immunoreactivity of T1R2 was remarkable in small-sized cells in the radiating layer and the orienting layer in the CA1 region as compared with the control group (C-E in FIG. 2). The distribution pattern and morphology of these immunoreactive cells showed that they could be glial cells. On day 14, there was no change in the labeled pattern, but the labeled cells exhibited a hypertrophic pattern with strong immunoreactivity (FIG. 2 F).

T1R3 면역반응성의 시공간적 분포 패턴도 T1R2의 경우와 거의 일치하였다. 대조군 동물의 해마에서, 기초가 되는 T1R3 면역반응성은 치아이랑에서뿐만 아니라 뉴런에서 주요하게 존재하였다(도2 G, I). Spatiotemporal distribution pattern of T1R3 immunoreactivity was almost same as that of T1R2. In the hippocampus of control animals, the underlying T1R3 immunoreactivity was predominantly present in neurons as well as in dentate gyrus (Fig. 2 G, I).

재관류 후 3일(도2 J) 및 7일(도2 H, K) 때, T1R3 면역반응성은 고유해마(hippocampus proper)의 방사층 및 치아이랑의 폐문 부위(hilar region)에서 현저히 나타났고, 이곳에서는 T1R3 면역반응성 세포가 아교세포인 것으로 보였다. 허혈 2주후, T1R3 면역반응성은 CA1 영역에 현저하게 위치하였고, 표지된 세포들은 비후성 외양을 나타냈다(Fig. 2L).
T1R3 immunoreactivity was prominent in the hilar region of the hippocampus proper and in the hilar region of the dentate gyrus at 3 days (Fig.2J) and 7 days (Fig.2H, K) after reperfusion, Showed that T1R3 immunoreactive cells were glial cells. After 2 weeks of ischemia, T1R3 immunoreactivity was significantly located in the CA1 region, and the labeled cells showed hypertrophic appearance (Fig. 2L).

또한, 허혈성 해마에서 단맛 수용체를 발현하는 세포 형태를 알아보기 위하여, GFAP, OX-42 및 NeuN를 포함하는 세포 타입-특이적 마커를 이용하여 2중 라벨링을 수행하였다.
In addition, in order to determine the cell type expressing the sweet taste receptor in the ischemic hippocampus, double labeling was performed using cell type-specific markers including GFAP, OX-42 and NeuN.

그 결과, 허혈 손상에 따른 CA1영역의 방사층에서 대부분의 T1R2 면역반응성 세포는 GFAP-면역반응성 성상세포였고(도3 A-C), OX-42-면역반응성 미세아교세포는 아니었다(도3 D-F).또한, 피라미드 세포층의 일부 T1R2 면역반응성세포는 NeuN 면역반응성(도3 G-I)을 보여주는 보존된 뉴런이었다. T1R3 및 이들 마커들의 이중 라벨링 면역형광은 T1R3 면역반응성이 미세아교세포가 아닌 반응성 성상세포(도3 J-L) 및 보존된 뉴런에 위치함을 보여주었다.As a result, most T1R2 immunoreactive cells in the radiating layer of the CA1 region due to ischemic injury were GFAP-immunoreactive astrocytes (FIG. 3 AC) and not OX-42-immunoreactive microglia (FIG. 3 DF). In addition, some T1R2 immunoreactive cells in the pyramidal cell layer were conserved neurons showing NeuN immunoreactivity (Fig. 3 GI). Double labeling immunofluorescence of T1R3 and these markers showed that T1R3 immunoreactivity is located in reactive astrocytes (Fig. 3 J-L) and conserved neurons rather than in microglia.

또한, T1R2, T1R3와 GFAP의 삼중표지는 허혈성 해마의 CA1영역에서 대부분 T1R2와 T1R3 이중표지된 세포들이 GFAP에 양성임을 보여주었다(도3 M-P).
In addition, the triple labeling of T1R2, T1R3 and GFAP showed that most of the T1R2 and T1R3 double labeled cells in the CA1 region of the ischemic hippocampus were positive for GFAP (Fig. 3 MP).

락테이트(젖산) 셔틀 모델에서 성상세포는 글루코스를, 뉴런 주변에서 에너지 소스로 사용될 수 있는 락테이트로 수송 및 대사작용을 한다. 뇌 허혈은 산소 및 글루코스 공급, 세포성 대사작용에 주요한 변화를 가져오는데, 허혈 조직에서 글루코스의 감소된 수준은 허혈 손상에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 저산소증에 대한 적응성 반응에서 성상세포는 해당효소 활성의 증가에 의해 무산소성 해당작용(anaerobic glycolysis)을 강화시켜 세포내 에너지를 유지하고, 정상 및 허혈 손상과 같은 병적조건에서 뇌 에너지 대사작용의 조절에 결정적인 역할을 한다. In the lactate (lactate) shuttle model, astrocytes transport glucose and metabolize lactate around the neuron, which can be used as an energy source. Brain ischemia leads to major changes in oxygen and glucose supply, cellular metabolism, and reduced levels of glucose in ischemic tissue are known to play an important role in ischemic injury. In the adaptive response to hypoxia, astrocytes increase intracellular energy by enhancing the anaerobic glycolysis by increasing the activity of the corresponding enzyme, and regulate brain energy metabolism in pathological conditions such as normal and ischemic injury It plays a decisive role.

따라서 상기와 같은 허혈성 해마내 반응성 성상세포에서의 단맛 신호 분자의 유도는, 그들의 발현이 허혈손상으로 인해 변경된 세포외 수준에 반응하여 뉴런에 공급하는 에너지를 유지하기 위해 상향조절 된다는 것을 시사한다.
Thus, the induction of sweet signaling molecules in such ischemic hippocampal responsive astrocytic cells suggests that their expression is upregulated in order to maintain the energy supplied to the neurons in response to altered extracellular levels due to ischemic injury.

<3-2> <3-2> 허혈 후 α-After ischemia, 거스트듀신Gusty Duchin 면역반응성 세포의 일시적 프로파일 및 표현형 분석 Temporal profile and phenotypic analysis of immunoreactive cells

상기 방법과 유사하게 α-거스트듀신의 면역반응성을 면역조직화학분석으로 알아보았다.
Similar to the above method, the immunoreactivity of alpha-gust endosyne was examined by immunohistochemistry.

그 결과, 수술한 경우 및 허혈성 해마에서 α-거스트듀신의 면역반응성이 관찰되었다. 수술한 동물에서, 면역반응성은 과립세포 및 피라미드세포층의 뉴런에 위치하였다(도4 A, C). 허혈 손상 후 3일(도4 D) 및 7일(도4 B, E)째, -거스트듀신 면역반응성이 무수한 아교양 세포(glia-like cells)에서 보여졌고, 특히 CA1영역 및 치상회 폐문 부위의 방사층 및 지향층에서 현저하였다. 재관류 후 14일째, α-거스트듀신의 표지된 패턴은 7일째의 경우와 비교하여 변화없이 유지되었다. 그러나, 표지된 세포들은 도4의 F에 나타난 바와 같이 더욱 높아진 비율로 비후성 외양을 나타냈다. As a result, immunoreactivity of [alpha] -gastedesin was observed in the operated case and the ischemic hippocampus. In the operated animals, immunoreactivity was located in neurons of granule cells and pyramidal cell layers (Fig. 4A, C). The gut duodenal immunoreactivity was found in innumerable glia-like cells on the 3rd day after the ischemic injury (Fig. 4D) and on the seventh day (Fig. 4B, E) Of the emission layer and the orientation layer. On the 14th day after reperfusion, the labeled pattern of α-gust Ducs was maintained unchanged compared to the case of 7 days. However, the labeled cells exhibited a hypertrophic appearance at a higher rate as shown in Fig. 4F.

α-거스트듀신-반응성 세포의 분포 패턴 및 형태는 그들이 아교세포일 수 있음을 시사한다. 이는, 허혈성 CA1 영역에서 α-거스트듀신-발현 세포들이 OX-42-면역반응성 미세아교세포(데이터 도시않음)가 아닌, 반응성 성상세포임을 보여주는(도4 G-I), α-거스트듀신 및 GFAP 또는 OX-42의 이중 표지에 의해 확인되었다.The distribution pattern and morphology of alpha-gust-duccin-reactive cells suggests that they may be glial cells. This shows that α-gusted ducin-expressing cells in the ischemic CA1 region are reactive astrocytes, not OX-42-immunoreactive microglia (data not shown) (Fig. 4 GI) -42. &Lt; / RTI &gt;

또한, 일부 면역반응성 세포들은 NeuN 반응성을 보여주는 보존된 뉴런이었다 (도4 J-L). 게다가, T1R3, α-거스트듀신 및 GFAP의 삼중 표지는 허혈성 해마의 CA1 영역에서의 대부분 T1R3 및 α-거스트듀신 이중 라벨 세포들이 GFAP에 양성임을 보여주었다 (도4 M-P).
In addition, some immunoreactive cells were conserved neurons showing NeuN reactivity (Figure 4 JL). In addition, the triple labeling of T1R3, alpha-gusted ducein and GFAP showed that most T1R3 and a-gusted duodenal double-labeled cells in the CA1 region of the ischemic hippocampus were positive for GFAP (Fig. 4 MP).

결론적으로, 본 발명은 일시적인 전뇌 허혈 쥐를 이용해 단맛 수용체 T1R2 및 T1R3가 반응성 성상세포에서 유의미하게 상향조절됨을 확인하였다. 이들이 관련된 맛-특이적 G-protein α-거스트듀신은 동일한 해마 영역 내의 반응성 성상세포에서 선택적으로 증가하였다
In conclusion, the present inventors confirmed that the sweet taste receptors T1R2 and T1R3 were significantly up-regulated in reactive astrocytes using transient whole brain ischemic mice. The taste-specific G-protein a-gustducin to which they are associated is selectively increased in reactive astrocytes within the same hippocampal region

이러한 결과는 허혈성 손상이 반응성 성상세포에서 G-protein-결합된 단맛 수용체의 발현에 영향을 준다는 것을 의미하고, 이는 뇌 허혈에 의해 나타나는 반응성 성상세포의 단맛 시그날링 단백질 유도가 뇌에서의 글루코오스 항상성 유지에 관여함을 시사한다.This result implies that ischemic injury affects the expression of G-protein-coupled sweet receptor in reactive astrocytes, suggesting that the induction of the sweet signaling protein of reactive astrocytes by brain ischemia results in glucose homeostasis .

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Composition for diagnosing ischemia compriging sweet-taste receptor genes <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3060 <212> DNA <213> TIR2 DNA sequence <400> 1 gggcatcgtc taaggctgtt acttggctgg catgggaccc caggcgagga cactccattt 60 gctgtttctc ctgctgcatg ctctgcctaa gccagtcatg ctggtaggga actccgactt 120 tcacctggct ggggactacc tcctgggtgg cctctttacc ctccatgcca acgtgaagag 180 cgtctctcac ctcagctacc tgcaggtgcc caagtgcaat gagtacaaca tgaaggtctt 240 gggctacaac ctcatgcagg ccatgcgatt cgccgtggag gaaatcaaca actgtagctc 300 tctgctgccc ggcgtgctgc tcggctacga gatggtggat gtctgctacc tctccaacaa 360 tatccagcct gggctctact tcctgtcaca gatagatgac ttcctgccca tcctcaaaga 420 ctacagccag tacaggcccc aagtggtggc cgtcattggc ccagacaact ctgagtccgc 480 catcaccgtg tccaacattc tctcctactt cctcgtgcca caggtcacat atagcgccat 540 caccgacaag ctgcgagaca agcggcgctt ccctgccatg ctgcgcactg tgcccagcgc 600 cacccaccac atcgaggcca tggtgcaact gatggttcac ttccagtgga 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tccagattgt gtgcgtcttc aagatggcca gacgcctgcc 2040 aagcgcctac ggtttctgga tgcgttacca cgggccctac gtctttgtgg ccttcatcac 2100 ggccgtcaag gtggccctgg tggcaggcaa catgctggcc accaccatca accccattgg 2160 ccggaccgac cccgatgacc ccaatatcat aatcctctcc tgccacccta actaccgcaa 2220 cgggctactc ttcaacacca gcatggactt gctgctgtcc gtgctgggtt tcagcttcgc 2280 gtacgtgggc aaggaactgc ccaccaacta caacgaagcc aagttcatca ccctcagcat 2340 gaccttctcc ttcacctcct ccatctccct ctgcacgttc atgtctgtcc acgatggcgt 2400 gctggtcacc atcatggatc tcctggtcac tgtgctcaac tttctggcca tcggcttggg 2460 gtactttggc cccaagtgtt acatgatcct tttctacccg gagcgcaaca cttcagctta 2520 tttcaatagc atgattcagg gctacacgat gaggaagagc tagtcccacc caccgcctca 2580 gcagcagagc ccccagccac gctcccggtg ttccttgttc ctcagcattc tttgcagtgt 2640 agctattttt tttacccaca tagctcttga aattacccat aatgcactcc cactgccccc 2700 tcctccaatc cccgaacccc gcccgagcgg ggggttcact ggctaggacc taccacccac 2760 ttatggaaga aaccaccaag gtgacctatg tggctccaag gatggcccac cactgccatc 2820 tggtggccat agagagcacc tgcggggctg tggcccatgc cttcctgctc atggctagtg 2880 tggctgtgag accaaccatg gtggctactg tgctctccag atgtctgtta atctgtgttt 2940 cattccggtt cctggggag acagactggg actcctgtgt tctaatggtc agatgagcat 3000 catgggtcct ccattgttgc ttatgaataa atttcccttg ggtgaaaaaa aaaaaaaaaa 3060                                                                         3060 <210> 2 <211> 2559 <212> DNA <213> TIR3 DNA sequence <400> 2 atgctgggcc ctgctgtcct gggcctcagc ctctgggctc tcctgcaccc tgggacgggg 60 gccccattgt gcctgtcaca gcaacttagg atgaaggggg actacgtgct gggggggctg 120 ttccccctgg gcgaggccga ggaggctggc ctccgcagcc ggacacggcc cagcagccct 180 gtgtgcacca ggttctcctc aaacggcctg ctctgggcac tggccatgaa aatggccgtg 240 gaggagatca acaacaagtc ggatctgctg cccgggctgc gcctgggcta cgacctcttt 300 gatacgtgct cggagcctgt ggtggccatg aagcccagcc tcatgttcct ggccaaggca 360 ggcagccgcg acatcgccgc ctactgcaac tacacgcagt accagccccg tgtgctggct 420 gtcatcgggc cccactcgtc agagctcgcc atggtcaccg gcaagttctt cagcttcttc 480 ctcatgcccc aggtcagcta cggtgctagc atggagctgc tgagcgcccg ggagaccttc 540 ccctccttct tccgcaccgt gcccagcgac cgtgtgcagc tgacggccgc cgcggagctg 600 ctgcaggagt tcggctggaa ctgggtggcc gccctgggca gcgacgacga gtacggccgg 660 cagggcctga gcatcttctc ggccctggcc gcggcacgcg gcatctgcat cgcgcacgag 720 ggcctggtgc cgctgccccg tgccgatgac tcgcggctgg ggaaggtgca ggacgtcctg 780 caccaggtga accagagcag cgtgcaggtg gtgctgctgt tcgcctccgt gcacgccgcc 840 cacgccctct tcaactacag catcagcagc aggctctcgc ccaaggtgtg ggtggccagc 900 gaggcctggc tgacctctga cctggtcatg gggctgcccg gcatggccca gatgggcacg 960 gtgcttggct tcctccagag gggtgcccag ctgcacgagt tcccccagta cgtgaagacg 1020 cacctggccc tggccaccga cccggccttc tgctctgccc tgggcgagag ggagcagggt 1080 ctggaggagg acgtggtggg ccagcgctgc ccgcagtgtg actgcatcac gctgcagaac 1140 gtgagcgcag ggctaaatca ccaccagacg ttctctgtct acgcagctgt gtatagcgtg 1200 gcccaggccc tgcacaacac tcttcagtgc aacgcctcag gctgccccgc gcaggacccc 1260 gtgaagccct ggcagctcct ggagaacatg tacaacctga ccttccacgt gggcgggctg 1320 ccgctgcggt tcgacagcag cggaaacgtg gacatggagt acgacctgaa gctgtgggtg 1380 tggcagggct cagtgcccag gctccacgac gtgggcaggt tcaacggcag cctcaggaca 1440 gagcgcctga agatccgctg gcacacgtct gacaaccaga agcccgtgtc ccggtgctcg 1500 cggcagtgcc aggagggcca ggtgcgccgg gtcaaggggt tccactcctg ctgctacgac 1560 tgtgtggact gcgaggcggg cagctaccgg caaaacccag acgacatcgc ctgcaccttt 1620 tgtggccagg atgagtggtc cccggagcga agcacacgct gcttccgccg caggtctcgg 1680 ttcctggcat ggggcgagcc ggctgtgctg ctgctgctcc tgctgctgag cctggcgctg 1740 ggccttgtgc tggctgcttt ggggctgttc gttcaccatc gggacagccc actggttcag 1800 gcctcggggg ggcccctggc ctgctttggc ctggtgtgcc tgggcctggt ctgcctcagc 1860 gtcctcctgt tccctggcca gcccagccct gcccgatgcc tggcccagca gcccttgtcc 1920 cacctcccgc tcacgggctg cctgagcaca ctcttcctgc aggcggccga gatcttcgtg 1980 ggtcagaac tgcctctgag ctgggcagac cggctgagtg gctgcctgcg ggggccctgg 2040 gcctggctgg tggtgctgct ggccatgctg gtggaggtcg cactgtgcac ctggtacctg 2100 gtggccttcc cgccggaggt ggtgacggac tggcacatgc tgcccacgga ggcgctggtg 2160 cactgccgca cacgctcctg ggtcagcttc ggcctagcgc acgccaccaa tgccacgctg 2220 gcctttctct gcttcctggg cactttcctg gtgcggagcc agccgggccg ctacaaccgt 2280 gcccgtggcc tcacctttgc catgctggcc tacttcatca cctgggtctc ctttgtgccc 2340 ctcctggcca atgtgcaggt ggtcctcagg cccgccgtgc agatgggcgc cctcctgctc 2400 tgtgtcctgg gcatcctggc tgccttccac ctgcccaggt gttacctgct catgcggcag 2460 ccagggctc acacccccga gttcttcctg ggagggggcc ctggggatgc ccaaggccag 2520 aatgacggga acacaggaaa tcaggggaaa catgagtga 2559 <210> 3 <211> 1174 <212> DNA <213> Galpa-gust <400> 3 gctgcctgtt gtagcgagca ccgctcatat gtcctatatc taaactacag ctgtgctccg 60 tgtttgaaaa gtttgagcaa atcaactgcc cagccactaa catcaaaaga tgggaagtgg 120 aattagttca gagagcaagg aatcagccag aaggtccaaa gaactggaga agaagcttca 180 ggaggatgct gagcgggatg caagaactgt gaagttactg ctactaggag caggtgaatc 240 tgggaaaagc actattgtta aacaaatgaa gatcatccat aagaatggtt acagcaaaca 300 agaatgcatg gagtttaaag cagtgattta cagtaacaca ttgcagtcca tcctagctat 360 tgtgaaagcc atggctacac tggggattga ttatgtcaat cctaggagcc gagaggacca 420 agaacaactt cactcaatgg caaatacact agaagatggt gatatgactc cacagctggc 480 tgaaatcatt aaacgactgt ggggggatcc aggaatccaa gcctgctttg aaagggcatc 540 tgaataccag ctcaatgact ctgcagctta ctaccttaat gacttagaca gactcacagc 600 ccctgggtac gtgccaaatg agcaagatgt tctacattcc cgggtgaaaa ccactggtat 660 cattgaaact caattctcct ttaaagactt gaacttcaga atgtttgatg taggtggcca 720 gagatcagag agaaaaaaat ggatccactg ctttgaagga gtcacctgca ttatattttg 780 cgcagcgcta agtgcctatg acatggtgct tgtagaagat gaggaggtga acagaatgca 840 tgaaagtctt cacctgttta acagcatatg taatcataag tacttcgcaa ccacctccat 900 tgttctgttt cttaacaaga aagatctctt ccaggagaaa gtggctaagg tgcacctcag 960 catttgcttt ccagaatata ctggaccaaa cacatttgaa gatgcaggga actacatcaa 1020 gaaccagttt ctagacctga acttaaaaaa agaagataag gaaatctatt ctcacatgac 1080 ctgtgctact gacacacaaa atgtcaaatt tgtgtttgat gcagtgacag atataataat 1140 aaaagagaac ctcaaagact gtgggctctt ctga 1174

Claims (16)

T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 허혈 질환 진단용 조성물.T1R2, T1R3, and? -Gusted ducein or an agent for measuring the level of the protein of the mRNA. 제1항에 있어서,
상기 T1R2는 서열번호 1의 염기서열을 가지고, 상기 T1R3는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 상기 α-거스트듀신는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 허혈 질환 진단용 조성물. The method according to claim 1,
Wherein T1R2 has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, T1R3 has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and the a-gust endine has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. 제1항에 있어서,
상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈 질환 진단용 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the agent for measuring the level of the gene mRNA comprises a primer that specifically binds to at least one gene selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted duchy. 제1항에 있어서,
상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈 질환 진단용 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the agent for measuring the level of the protein comprises an antibody that specifically binds to at least one protein selected from T1R2, T1R3, and alpha-gusted dyssyn. 제1항에 있어서,
상기 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준은 성상세포(astrocyte)에서의 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 허혈 질환 진단용 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the level of at least one gene mRNA or protein thereof selected from T1R2, T1R3 and alpha -gusted ducein is measured in an astrocyte. 제1항에 있어서,
상기 허혈 질환은 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈 질환 진단용 조성물.The method according to claim 1,
The ischemic diseases are not limited to wound healing, ischemic brain disease, ischemic heart disease, peripheral vascular disease, renal artery disease, gastrointestinal lesion, burn, skin graft, vascular graft, long term treatment, bone rescue disease, liver disease, uterine disease, , Bone regeneration disease, cartilage repair disease, and smooth muscle cell disease. 제6항에 있어서,
상기 허혈 질환은 허혈성 뇌질환인 것을 특징으로 하는 허혈 질환 진단용 조성물.The method according to claim 6,
Wherein the ischemic disease is ischemic brain disease. 제1항에 있어서,
상기 유전자는 T1R2 및 α-거스트듀신; T1R3 및 α-거스트듀신; 또는 T1R2, T1R3, α-거스트듀신의 조합으로 측정하는 것을 특징으로 하는 허혈 질환 진단용 조성물.The method according to claim 1,
These genes include T1R2 and alpha-gusted dysin; T1R3 and a-gusted duchy; Or a combination of T1R2, T1R3, and? -Gastedesin. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 허혈질환 진단용 키트.A kit for the diagnosis of ischemic diseases comprising the composition according to any one of claims 1 to 8. 제9항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 허혈질환 진단용 키트.10. The method of claim 9,
Wherein the kit is an RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 허혈질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.Measuring the level of one or more gene expression levels selected from T1R2, T1R3 and alpha-gusted duchin from the biological sample isolated from the patient or the level of the protein encoded by said gene; And
And comparing the expression level of the gene or the level of the protein encoded by the gene with the expression level or the protein level of the corresponding gene of the normal control sample. 제11항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 것이고, 상기 단백질 수준은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 허혈질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.12. The method of claim 11,
Wherein the expression level of the gene is measured by measuring an mRNA level of the gene and the protein level is measured using an antibody that specifically binds to the protein. 제11항에 있어서,
상기 T1R2, T1R3 및 α-거스트듀신 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준은 성상세포(astrocyte)에서의 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 허혈질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.12. The method of claim 11,
Wherein the level of at least one gene mRNA or protein thereof selected from T1R2, T1R3, and alpha-gusted duchin is measured in an astrocyte. 제11항에 있어서,
상기 유전자는 T1R2 및 α-거스트듀신; T1R3 및 α-거스트듀신; 또는 T1R2, T1R3, α-거스트듀신의 조합을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 허혈질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.

12. The method of claim 11,
These genes include T1R2 and alpha-gusted dysin; T1R3 and a-gusted duchy; Or a combination of T1R2, T1R3, and? -Gastedesin.

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