KR101722529B1 - 세포사멸이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주 및 그 제조방법 - Google Patents

세포사멸이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포사멸이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, Bst-2(테드린, Tetherin) 유전자의 기능을 상실시켜 세포사멸에 관여하는 신호전달체계를 억제함으로써 바이러스 생산능을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하여 제조되는 바이러스 생산 변이 세포주를 사용하는 경우 바이러스 생산수율을 증가시킬 수 있어, 바이러스성 질병의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

세포사멸이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주 및 그 제조방법 {Virus Producing Cell Lines Having Increased Longevity and Method for Preparing the Same}
본 발명은 세포사멸이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, Bst-2(테드린, Tetherin) 유전자의 기능을 상실시켜 세포사멸에 관여하는 신호전달체계를 억제함으로써 바이러스 생산능을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
인플루엔자는 인플루엔자 바이러스 호흡기 감염으로 발생하는 급성 발열성 질환이다. 인플루엔자 바이러스는 구조단백질의 차이에 따라 A, B, C형으로 분류되며 각각에 따라 숙주, 역학과 임상양상에 다소 차이가 있다. 인플루엔자 바이러스는 직경 80~120nm 크기의 구형바이러스로 표면에 부착된 hemagglutinin(HA)와 neuraminidase(NA) 당단백질의 종류에 따라 아형(subtype)이 결정된다. 아형은 주로 A형 인플루엔자를 중심으로 구분하는데 현재 H1~H16까지 16가지의 HA와 N1~N9의 9가지 NA가 발견되어 단순 계산에 의하면 총 144종 (H1N1, H1N2...등 )의 아형이 A형 인플루엔자 내에 분포하게 된다(Treanor J.J. et al., In Principles and Practice of Infectious Diseases, 2060-85, 2005).
인플루엔자 백신에는 비활성화백신과 생백신이 있으며, 비활성화백신은 부화란(embryonated egg)에서 배양한 바이러스를 정제하여 포르마린 등으로 비활성화시켜서 만든다. 비활성화시킨 바이러스 전체를 사용하는 전바이러스백신(whole virus vaccine), 에테르 등으로 바이러스 외피(envelope)를 분쇄시킨 분할 백신(split vaccine), hemagglutinin과 neuraminidase 성분을 정제한 아단위 백신(subunit vaccine) 등이 있고, 생백신은 약독화 생백신(live attenuated influenza vaccine, LAIV)이 개발되어 사용되고있다. 전바이러스 백신은 소아에서 부작용을 유발하므로 현재 국내를 비롯하여 세계적으로 잘 사용되지 않으며, 일부 국가에서만 이용되는 실정이다. 반면, 분할백신이나 아단위백신과 같은 성분백신은 매우 안전하며 효과가 인정되어 가장 많이 사용되고 있다. 이외에 면역반응을 증강시키기 위하여 MF-59와 같은 면역 보강제가 포함된 백신이나 바이러스 유사 형태의 소포를 형성하는 virosome 백신 등이 개발되어 일부 국가에서 사용되고 있다(Bridges C.B. et. al., In Vaccines, 259-290, 2008; Belshe R.B. et. al., In Vaccines, 291-309, 2008).
지금까지 인플루엔자에 대한 백신 제조를 위한 바이러스의 생산은 유정란에 바이러스 종균을 접종하여 증식시키는 방법을 사용하였으나 이는 유정란의 공급 안정성, 알러지 유발 및 바이러스 전파등의 문제점으로 매우 효율이 떨어지는 방법이었다. 백신생산에 쓰이는 무균유정란(Specific pathogen free egg)을 얻기 위해선 외부와 철저히 격리된 무균시설에서 항생제와 백신을 투약하지 않은 상태로 닭을 키우고, 그 닭으로부터 유정란을 생산해야 한다. 이렇게 생산한 무균유정란을 부화장에서 약 10일간 부화시킨 후에 주사기 바늘 등을 이용하여 유정란 내의 배아(embryo) 혹은 요막액(allantoic fluid)에 바이러스를 접종한다. 접종 후 3일간 바이러스를 배양하고 난 후, 배양한 바이러스를 회수하여 분리정제 공정에 들어간다. 이런 과정을 통해 준비된 바이러스는 경우에 따라 불활화(inactivation) 과정을 거친 후에 효과적인 면역반응을 유도하기 위한 면역증강제(adjuvant), 안정제(stabilizer), 보존제(preservative) 등이 첨가되어 백신으로 만들어진다. 이렇게 만들어진 백신은 개별 바이얼 (vial)이나 주사기로 충진(filling)된 후에 검사를 거치고 포장되어 시장에 출시된다. 일본뇌염 바이러스의 경우엔 유정란 외에 젖먹이 쥐(suckling mice)의 뇌에 바이러스를 접종하여 배양하기도 한다.
이런 전통적인 백신 제조 방법은 생산설비를 확장하는 데에 어려움이 따른다. 예를 들어 유정란을 이용한 생산공정을 확장하기 위해선 원재료가 되는 유정란의 추가 공급이 필요하고 이를 위해선 무균시설의 양계장이 확충 되어야만 한다. 이들 시설에서 자란 닭은 면역학적으로 매우 약하기 때문에 일반 닭에 비해 양육하기가 어렵고 철저한 관리가 요구된다. 따라서 이런 시설을 계속 확장하기 위해선 공간적으로나 경제적으로 제한사항이 많다. 또한 조류독감(AI)이나 뉴캐슬병(ND)과 같은 조류 전염병이 창궐할 경우 안정적인 무균유정란 공급에 큰 차질이 생기게 된다.
이런 전통적인 문제점들을 극복하기 위해 오래 전부터 관심을 받아 온 분야가 바로 동물세포배양을 통한 백신의 제조이다. 무균상태에서 동물세포를 대량으로 배양한 후에 바이러스를 동물세포에 감염시켜 백신을 생산하거나 혹은 유전공학적인 방법을 이용해 병원체에서 항체생성을 유도하는 항원 만을 생산하는 방법 등이 여기에 속한다. 동물세포배양을 통한 백신 제조의 가장 큰 장점은 생산규모의 확장성에 있다. 백신생산의 원재료가 되는 동물세포는 배양 규모에 따라 원하는 만큼 확장이 가능하다.
그러나 이런 많은 장점이 있음에도 동물세포배양을 통한 백신생산이 쉽게 이뤄지기 어려운 것은 초기 투자 비용이 너무 크다는 것과 이를 원활하게 운용할 인적 인프라가 부족하다는 것, 그리고 유정란이나 동물을 이용했을 때보다 다소 낮은 단위부피당 수율 때문이다. 동물세포를 이용하여 백신을 생산할 때, 낮은 단위부피당 수율을 극복하기 위해 유전공학기법을 이용하여 우수한 숙주 동물세포주를 개발하려는 시도가 일부 있었지만(Jang J. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 85:1509-1520, 2010) 아직까지는 걸음마 수준에 불과하다. 따라서 바이러스 생산을 최적화 하기 위한 생산 세포주 탐색, 배양조건의 개선 및 감염조건의 개선 등이 필요하다.
현재 바이러스 백신의 생산을 위한 대표적인 세포주의 예로는, MDCK (Madin-Darby 개 신장에서 유래된 세포), CRUCELL (네델란드)에서 개발된 PerC6 (인간 아데노바이러스 종류 5의 E1 유전자에 삽입하여 유전적으로 변이된 인간 배아 망막세포에서 유래된 세포), VERO(일본, Chiba 내의 Chiba 대학에서 분리한 아프리카 녹색 원숭이 (Cercopithecus aethiops)의 신장 상피 세포에서 유래된 세포), BHK21 (아기 햄스터 신장 세포에서 불멸화시킨 세포)가 있다.
한편, 바이러스가 체내에 감염되면 감염세포에서 바이러스의 증식이 일어나고 증식된 바이러스 입자들은 다시 세포막을 통해 방출(budding out) 되고 주변의 다른 세포들을 재감염시킨다. 바이러스의 감염에 대응하는 생체의 방어 메카니즘의 일환으로 세포들은 세포막에 Bst-2라는 단백질을 발현하고 있다. 이 단백질은 N말단과 C말단 양쪽에 세포막과 결합하는 부위를 가지고 있어서 마치 세포막에 다리처럼 가운데가 들려진 형태로 발현되는데 C말단은 세포막 중 lipid raft 부위에 위치하고 N말단은 비lipid raft 부위에 존재한다. 바이러스가 세포 내부로부터 세포외부로 출아하기 위해 lipid raft 부위에서 빠져나갈 때 Bst-2 단백질은 비lipid raft 부위에 고정된 부위를 통해 바이러스 입자가 세포막을 뚫고 나가는 것을 억제한다. 포유동물 세포의 이러한 방어 기작에 대해 일부의 바이러스들은 이를 회피하기 위한 기작으로 Bst-2 단백질의 분해를 촉진하는 단백질을 생산하여 숙주세포의 억제 기능을 우회하기도 한다. 이런 점은 역설적으로 Bst-2 유전자의 기능이 바이러스의 생산 억제에 강력하게 기여함을 보여주고 있다.
이에, 본 발명자들은 숙주세포의 바이러스 생산능을 증가시키는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, Bst-2 유전자의 기능을 상실시키는 경우, 세포사멸이 억제되어 바이러스 생산능이 증가된 변이 세포주를 제조할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 Bst-2를 발현하지 않는 바이러스 생산 세포주에 Bst-2 변이 유전자가 도입되어 있는 바이러스 생산능이 증가된 변이 세포주를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이러스 생산세포주에서 Bst-2 유전자를 돌연변이시키는 것을 특징으로 하는 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, Bst-2를 발현하지 않는 바이러스 생산 세포주에 Bst-2 유전자가 변이된 Bst-2 변이 유전자가 도입되어 있는 바이러스 생산능이 증가된 변이 세포주를 제공한다
본 발명에 따르면, Bst-2 단백질의 세포질부위 기능이 상실된 세포주는 야생형 세포주에 비해 생존률 및 바이러스 생산능이 우수하므로, 이를 바이러스 생산 세포주로 이용하는 경우 바이러스 생산수율을 증가시킬 수 있고, 바이러스성 질병의 예방 및 치료를 목적으로 하는 백신의 제조 및 연구에 사용할 수 있다.
도 1은 Bst-2가 결핍된 세포에서 세포 내 신호전달이 감소하는 것을 나타낸 그림이다(A: 농도별 LPS 처리에 따른 산화질소 생산 비교, B: LPS처리에 따른 NFĸB의 인산화 비교).
도 2는 바이러스 감염 후 Bst-2가 결핍된 세포에서 외형적으로 세포사멸(아폽토시스)의 양상이 감소한 것을 나타낸 사진이다(A: H1N1을 감염시킨 Vero 세포주, B: H3N2를 감염시킨 Vero 세포주).
도 3은 바이러스 감염 후 Bst-2가 결핍된 세포에서 세포사멸(아폽토시스)이 감소하는 현상을 아폽토시스의 지표물질인 Phosphatidylserine 염색을 통해 확인한 그림이다(A: H1N1을 감염시킨 Vero 세포주, B: H3N2를 감염시킨 Vero 세포주).
도 4는 Bst-2를 재도입 실험을 통하여 세포질부위(cytoplasmic domain)가 세포사멸에 관여하는 것을 증명한 것이다(A: Bst-2 재도입 후 FACS로 Bst-2 발현 확인, B: MHV68 virus 감염 후 세포사멸 비교).
본 발명에서는 바이러스 생산기간 및 생산능이 증가된 세포주를 제조하기 위해 Bst-2 유전자의 exon1 부위를 돌연변이 시켜 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주를 제조하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, VERO 세포주를 사용하여 Bst-2 유전자 exon1 부위의 염기를 1개 내지 12개 결실시킨 D-D8 및 G-D5세포주를 제조한 다음, H1N1 또는 H3N2 바이러스로 감염시키는 경우 돌연변이 세포주에서 세포사멸이 억제되는 것을 확인하였다.
본 발명은 일 관점에서, 바이러스 생산세포주에서 Bst-2 유전자를 돌연변이시키는 것을 특징으로 하는 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "세포사멸(apoptosis)"이란 세포가 능동적으로 생체에너지인 ATP를 적극적으로 소모하면서 죽음에 이르는 과정을 의미하며, 전형적인 세포사멸과정은 세포의 축소, DNA의 규칙적인 절단 그리고 세포막의 단편화에 의하여 진행된다. 비정상적인 세포분열, 방사선, 자외선, 세균 감염 또는 바이러스 감염 등의 원인으로 세포가 정상적인 기능을 유지하지 못하게 될 경우 세포사멸이 유도될 수 있다.
본 발명의 바이러스 생산세포주는 동물세포주인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 동물세포주는 인플루엔자 백신 개발에 사용되는 세포주를 종류에 상관없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 MDCK, VERO 및 생쥐 섬유아세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 “바이러스”란, 사람이나 동물에 질병을 유발할 수 있는 바이러스를 의미하며 바람직하게는 인플루엔자 바이러스를 의미하며 더욱 바람직하게는 P/H1N1, A/H1N1 및 A/H3N2로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.
상기 돌연변이는 Bst-2 유전자의 exon1 부위 일부를 삽입, 결실, 중복, 역위, 치환 또는 전좌 시키거나, exon1 전체를 제거 또는 gene silencing 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 Bst-2 유전자의 exon1 부위는 Bst-2 단백질의 세포질부위(cytoplasmic domain)를 암호화하고 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는, Bst가 결여된 생쥐 섬유아세포에 야생형 Bst-2 유전자를 도입하는 경우 야생형세포주와 유사한 세포사멸이 나타나지만, 세포질부위(cytoplasmic domain)를 제거한 Bst-2 유전자를 도입하는 경우 Bst-2 결여 세포주처럼 세포사멸이 억제되는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 다른 관점에서, Bst-2를 발현하지 않는 바이러스 생산 세포주에 Bst-2 유전자가 변이된 Bst-2 변이 유전자가 도입되어 있는 바이러스 생산능이 증가된 변이 세포주에 관한 것이다.
상기 Bst-2 변이 유전자는 야생형(Wild type) Bst-2 유전자의 exon1 부위 일부를 삽입, 결실, 중복, 역위, 치환 또는 전좌 시키거나, exon1 전체를 제거 또는 gene silencing 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 “생산능”이란, 생산 세포주의 생존기간 동안 세포내에서 증식된 바이러스가 배양액으로 방출되어 배양액의 바이러스 역가가 증가한 것을 의미한다.
본 발명에서 “해독틀 이동 돌연변이”란, 유전 암호는 유전자의 염기 3개를 하나의 틀로서 읽을 수 있는데, 염기가 1개, 2개 또는 3의 배수가 아닌 수로 결실 또는 삽입되어 유전암호를 읽을 수 있는 해독틀이 달라지는 돌연변이를 의미한다.
본 발명에서 사용된 MDCK(Madin-Darby, canine kideney) 세포주는 개의 신장에서 수립한 상피유사세포이며, vero 세포주는 원숭이 신장 내막에서 수립한 세포이다. 이 둘은 간염바이러스, 백시니아바이러스 및 독감바이러스 등에 감수성을 나타내므로 바이러스연구에 가장 흔하게 사용되는 세포주이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: Bst-2가 돌연변이된 VERO 세포주의 제조 및 돌연변이 확인
100Φ 배양접시에 University of Southern California, Chengyu Liang 실험실에서 분양받은 5 X 105 개의 야생형 vero 세포주를 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 5 μM β-mercaptoethanol, 10 ㎍/ml gentamicine, 50 U/ml penicillin, 50 ㎍/ml streptomycin 가 첨가된 DMEM complete (GIBCO, 미국) 배지에서 24시간 배양 후, Bst-2 유전자의 exon 1 부위와 결합 가능한 L1-DAW 및 R1-RR로 구성된 TALEN 벡터(ToolGen, 한국) 1쌍, 리포터 벡터(ToolGen, 한국) 1개 및 Turbofect reagent(Thermo, 미국)를 섞은 총 12㎍을 배양중인 세포에 넣고 48시간 동안 37℃ 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
상기 배양된 반응물을 FACS Aria(BD Bioscience, USA)를 이용하여 GFP와 RFP에 모두 양성인 세포를 선택적으로 고른 500개의 세포를 96-well에 분주하여 단일 클론세포를 수득하였다.
상기 수득된 단일 클론 세포의 돌연변이 여부를 확인하기 위하여, 단일 클론세포에 lysis 버퍼(50mM Tris-Cl, pH8.0, 50mM EDTA, 1% SDS, 10mM NaCl, 100㎍/ml proteinase K)(300㎕)를 추가하여 54℃에서 16시간 반응시켰다. 그리고 반응물에 페놀과 클로로폼이 1:1로 섞인 용액 300㎕을 추가하여 섞은 후 1700 x g 에서 10분간 원심분리하였다. 상층액 (300㎕)을 새 튜브에 옮겨 담고 100% 에탄올(600㎕)와 3M 아세트산나트륨 90㎕을 첨가한후 1700 x g 에서 10분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 70% 에탄올 1㎖을 넣어 1700 x g에서 2분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 바닥에 남아있는 genomic DNA를 3분간 말린 후 DW 50㎕에 다시 녹였다. 상기 추출한 Genomic DNA에 서열번호 1로 표시되는 dBst-2-F primer 및 서열번호 2로 표시되는 AGM-R primer를 이용하여 95℃ 5분, 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 10분의 조건으로 25사이클을 반복하여 중합효소 연쇄반응을 실시하였다.
상기 반응물을 10-3으로 희석하여 서열번호 2로 표시되는 AGM-R primer 및 서열번호 3으로 표시되는 AGM-F primer를 이용하여 95℃ 5분, 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 10분의 조건으로 25사이클을 반복하여 다시 한번 중합효소 연쇄반응을 실시하였다.
서열번호 1: 5‘-GGTCAGGATGGCTCCTATGC-3’
서열번호 2: 5‘-CTTCTCTGCATCCAGGGAAG-3'
서열번호 3: 5‘-GAGGGGGAGATCTGGATGG-3’
상기 반응물의 표적부위에 돌연변이를 확인하기 위하여 반응물을 95℃ 3분, 85℃에서 25℃까지 1초에 2℃씩 온도를 떨어뜨린 후 16℃에서 정지하는 조건으로 PCR을 이용하여 melting/annealing 반응을 시켰다. 그리고 수득된 반응물에 T7E1 효소(ToolGen, 한국)를 처리하여 37℃에서 15분간 반응 시킨 후 전기영동하여 반응물의 사이즈를 확인한 결과, exon 1 부위에 돌연변이가 일어났을 것으로 추정되는 세포주 2개는 정상적인 PCR 반응물 사이즈와 핵산내가수분해효소(endonuclase)에 의해 내부가 절단된 2개의 밴드가 추가로 생겨 돌연변이가 일어났음을 확인하였다. 이 후 Bst-2 돌연변이가 확인된 단일세포의 이름을 D-D8 및 G-D5라고 명명하였다.
실시예 2: Bst-2가 세포 내 신호전달에 미치는 효과
Bst-2 녹아웃 생쥐(이수엡지스, 한국)를 야생형 B6 생쥐(오리엔트바이오, 한국)와 교배하여 Bst-2 헤테로 생쥐를 제조하였다. 상기 Bst-2 헤테로 생쥐와 녹아웃 생쥐의 복강에서 대식세포를 얻어 96-well flat bottom plate에 1 x 106 개의 세포를 넣고 LPS (Lipopolysaccharide)를 0, 0.01, 0.1 그리고 1 ㎍/ml의 농도로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 배양액 속의 Nitrite의 농도는 Griess 기법을 이용하여 측정하였다. 그 결과 Bst-2 헤테로 생쥐에서 얻은 대식세포에 비해 Bst-2 녹아웃 생쥐에서 얻은 대식세포는 약 60%의 산화질소 생산 감소가 나타났다(도 1A).
Bst-2 헤테로 생쥐와 녹아웃 생쥐의 복강에서 대식세포를 얻어 6-well에 5 X 106 개를 접종하고 2시간을 기다려 세포를 배양접시에 부착시킨 후 LPS를 100 ng/㎖ 농도로 처리하였다. 30분, 90분 후에 세포의 단백질을 M-PER 버퍼(Pierce Biotechnology, USA)를 이용해 얻었다. 각 샘플마다 전체 단백질 30㎍을 SDS-PAGE 전기영동을 걸어 크기별로 분리하고 PVDF membrane에 단백질을 부착시켰다. 항 인산화-NFκB 항체(클론 93H1), 항 NFκB 항체(클론 C22B4), 항 IκBα(클론 L35A5) 항체는 Cell Signaling(Cell Signaling Technology, USA) 제품을 사용하였고, 2차 항체는 HRP가 붙어있는 항 토끼 IgG (고마바이오텍, 한국)를 사용하였다. 항체반응 후 ECL plus 또는 ELC fempto (Pierce Biotechnology, USA)사용하여 신호를 감광시킨 후 LAS 3000로 사진을 찍었다. 그 결과 전체 NF-κB 중 인산화된 NF-κB의 비율이 약 90% 감소하는 것을 확인하였다(도 1B). 따라서, Bst-2를 돌연변이시킬 경우 세포내의 세포-신호전달이 감소되는 것을 관찰하였다.
실시예 3: Bst-2가 결여된 세포주의 아폽토시스 지연
3-1. 바이러스를 감염시킨 세포주의 세포사멸(apoptosis) 관찰
야생형 (WT) Vero 세포주, Bst-2 헤테로 (D-D8) Vero 세포주, Bst-2 녹아웃 (G-D5) 세포주를 6-well에 각각 1 x 106 개씩 부착시키고, 20시간 후에 계절형 H1N1(도 2A) 또는 H3N2(도 2B) 인플루엔자를 각각 0.01 MOI로 감염시켰다.
감염 48시간 72시간 뒤 변형된 세포의 외형을 분석하였다. 그 결과 정상세포는 대부분이 바이러스 감염 후 제 1일차 혹은 2일차에서 사멸되었지만, Bst-2 결핍 세포들는 2일차에서도 상당수가 정상적인 세포형태를 유지하고 있었다. 즉, 야생형 세포들이 세포막이 일그러지는 아폽토시스 과정의 전형적인 외형을 보여주는 반면 Bst-2 녹아웃 세포주(G-D5)는 48시간 및 72시간에서 대부분의 세포에서 정상적인 세포외형을 유지하고 있었다(도 2). Bst-2 헤테로 세포주(D-D8)의 경우는 야생형과 녹아웃의 중간정도의 아폽토시스를 보였다.
3-2. 바이러스를 감염시킨 세포주의 Phosphatidylserine 발현 관찰
아폽토시스가 진행되면 세포내막에 존재하는 phosphatidylserine(PS)이 세포외막으로 이동하기 때문에 염색에 의한 검출이 가능하다. 따라서 아폽토시스의 정도를 비교하기 위하여 지표물질인 PS를 인식하는 annexin-V로 세포를 염색하였다.
야생형 (WT) Vero 세포주, Bst-2 헤테로 (D-D8) Vero 세포주, Bst-2 녹아웃 (G-D5) 세포주를 6-well에 각각 1 X 106 개씩 부착시키고, 20시간 후에 계절형 H1N1 또는 H3N2 인플루엔자를 각각 0.01 MOI로 감염시켰다. 감염 48시간 또는 72시간에 세포를 떼어내고, PBS를 넣어 1250rpm, 4분, 실온의 조건으로 원심분리하여 상층액을 제거했다. Annexin V-FITC (BD Biosciences, USA)와 Annexin V 부착 버퍼를 섞어 세포에 넣고 어두운 곳에서 15분간 두어 염색하였다.
그 결과 야생형 세포가 H1N1 바이러스 감염 후 72시간째에 PS를 세포표면에 강하게 발현하는 반면 녹아웃 세포주(G-D5)는 여전히 PS의 발현을 낮은 수준으로 유지하고 있었다(도 3A). Bst-2 헤테로 세포주(D-D8)은 야생형과 녹아웃 세포주의 중간정도로 PS를 발현하고 있었다.
한편, H3N2 바이러스 감염시에도 동일한 양상을 나타내는 것을 관찰하였다(도 3B). 즉, Bst-2 유전자의 발현 정도가 억제될수록 아폽토시스의 진행을 나타내는 Annexin V의 발현 또한 감소하는 것으로 나타났다.
3-3. Bst-2 재도입 세포주의 아폽토시스 증가
Bst-2가 결여된 생쥐 fibroblast 세포주 (B2K)를 생산하기 위하여 24주령의 Bst-2 녹아웃 생쥐(이수엡지스, 한국)의 허벅지에 MCA (3-methyl cholanthrene) 100㎍을 주사하였다. 약 4개월 후 허벅지에 생긴 암을 떼어낸 후 70% 에탄올에 헹궈 박테리아를 제거하고, 10% FBS와 RPMI 배지가 담긴 dish로 옮겨 수술용 가위로 잘게 잘랐다. 50㎖ conical tube에 digestion solution (500 Unit/㎖ collagenase IV, 150 Unti/㎖ DNase I) 13㎖과 암 조각들을 넣고 shaker에서 250 rpm 37℃에서 1시간 30분 동안 돌렸다. 10㎖ 피펫으로 3~5차례 피펫팅하여 조각들을 더 풀어준 후 새로운 50㎖ conical tube에 nylon mesh로 필터 하여 담았다. 1250 rpm 으로 5분간 원심분리하여 상층액은 제거한 후 펠렛은 새로운 배지로 풀어 nylon mesh에 필터하고 상기와 같은 조건으로 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 뒤 펠렛을 풀어 10cm dish당 2.4 X 107 cells를 접종하고 배양하여 녹아웃 암 세포주(B2K)로 유지하였다.
한편, 야생형 암세포주(MB19) 세포주를 생산하기 위하여 24주령의 B6 야생형 생쥐(오리엔트바이오, 한국)의 허벅지에 MCA (3-methyl cholanthrene) 100㎍을 주사하였다. 약 4개월 후 허벅지에 생긴 암을 떼어낸 후 70% 에탄올에 헹궈 박테리아를 제거하고, 10% FBS와 RPMI 배지가 담긴 dish로 옮겨 수술용 가위로 잘게 잘랐다. 50㎖ conical tube에 digestion solution (500 Unit/㎖ collagenase IV, 150 Unti/㎖ DNase I) 13㎖과 암 조각들을 넣고 shaker에서 250 rpm 37℃에서 1시간 30분 동안 돌렸다. 10㎖ 피펫으로 3~5차례 피펫팅하여 조각들을 더 풀어준 후 새로운 50㎖ conical tube에 nylon mesh로 필터 하여 담았다. 1250 rpm 으로 5분간 원심분리하여 상층액은 제거한 후 펠렛은 새로운 배지로 풀어 nylon mesh에 필터하고 상기와 같은 조건으로 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 뒤 펠렛을 풀어 10cm dish당 2.4 X 107 cells를 접종하고 배양하여 야생형 암 세포주(MB19)로 유지하였다.
Bst-2 녹아웃 암 세포주(B2K) 와 Bst-2 야생형 암 세포주 (MB19)의 MHC class (KbDb(R1.21.2)-APC, CD1d(1B1)-PE), LFA-1(207)-Cyc 그리고 Bst-2(e.Bio927)biotin + Streptavidin-PE를 형광 염색하여 발현 정도를 비교하였다. B2K 세포와 MB19 세포 1 x 106 개를 FACS buffer 50㎕에 풀고 2.4G2 항체 20 ㎍/ml을 넣어 얼음위에서 20분간 반응 시켜 세포 표면의 FcγReceptor를 blocking 하였다. Bst-2 biotin (1 ㎍/㎖)를 넣고 얼음 위에서 30분간 부착시킨 뒤 FACS buffer 500 ㎕를 넣고 1250rpm 4℃에서 4분간 원심분리하여 상층액을 제거하여 잔여 항체를 제거하였다. 그리고 나머지 항체들 KbDb-APC (0.1 ㎍/㎖), CD1d-PE (1.5 ㎍/㎖) 또는 LFA-1 (1 ㎍/㎖), Streptavidin-PE (0.5 ㎍/㎖)를 넣고 빛을 차단하여 얼음위에서 부착시켰다. 30분 후 잔여 항체 제거를 위해 FACS buffer 500 ㎕를 넣고 1250rpm 4℃에서 4분간 원심분리하였다. 분석은 FACS calibur(Becton Dickinson, Germany) 를 이용하였다. 그 결과, MB19이 정상적으로 Bst-2를 발현하는 반면 B2K 암세포주는 Bst-2를 발현하지 않는 것을 확인하고 실시예에 사용하였다.
확립된 B2K 세포(B2K empty)에 Bst-2 야생형 유전자(Flag WT: 서열번호 4), 세포질부위(cytoplasmic domain)가 제거된 유전자(Flag ΔCT: 서열번호 5) 또는 공 벡터를 각각의 실험군에 도입하였다.
서열번호 4:
ATGGCGCCCTCTTTCTATCACTATCTGCCCGTGCCCATGGATGAGATGGGGGGGAAGCAAGGATGGGGCAGCCACCGGCAGTGGCTGGGGTACCGCGGGAGAAAGATAGTGATAGACGGGAACGGGTACCTACTCTACCCCCCCTTCGTTCCTACCCCGTCGGTGGCCGTCACCGACCCC
서열번호 5:
ATGTACCGCGGGAGAAAGATAGTGATAGACGGGAACGGGTACCTACTCTACCCCCCCTTCGTTCCTACCCCGTCGGTGGCCGTCACCGACCCC
이 유전자들은 N-말단기에 Flag 단백질이 붙어있는 형태이고, 이들의 발현은 항 Bst-2 항체 (PDCA-1, eBio927: Ebioscience, 미국)을 통해 확인하였다(도 4A). FACS 분석 결과, B2K empty는 Bst-2가 억제되어 Bst-2 단백질이 발현하지 않아 Q2영역과 Q3영역에 도트(dot)이 나타나지 않았다. B2K empty에 Bst-2 야생형 유전자를 도입한 Flag WT의 경우 56%이상의 세포가 Q2 및 Q3 영역에 존재하였다.
B2K empty, B2K-Flag WT 그리고 B2K-Flag ΔCT 세포 2 x 106 개를 각각 6-well에 부착시키고 20시간 뒤 MHV-68 바이러스를 0.1 MOI로 감염시켰다. 1일(24시간) 또는 2일(48시간)후 세포 모양의 사진을 찍었다. 그 결과 도 4B와 같이 야생형 Bst-2 유전자를 재도입한 세포(B2K-Flag WT)에서는 빠른 속도로 아폽토시스가 유도되는 반면 신호전달에 관여할 것으로 판단되는 세포질 부위를 제거한 Bst-2 유전자를 도입한 세포(B2K-Flag ΔCT)에서는 여전히 아폽토시스가 지연되고 있음을 확인하였다.
즉, 상기의 Bst-2 재도입실험을 통하여 세포질부위가 바이러스 감염세포의 아폽토시스를 유발하는 신호전달에 중요한 역할을 하는 것을 최초로 증명하였다. 이러한 사실은 특정 바이러스에 국한되지 않고 감염세포의 생존기간을 연장함으로써 바이러스의 생산지속 및 생산증가 효과를 이끌어 낼 수 있음을 보여주고 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부한 청구항들과 그 것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Virus Producing Cell Lines Having Increased Longevity and Method for Preparing the Same <130> P13-B218 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dBst-2-F primer <400> 1 ggtcaggatg gctcctatgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-R primer <400> 2 cttctctgca tccagggaag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-F primer <400> 3 gagggggaga tctggatgg 19 <210> 4 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bst-2 Flag WT <400> 4 atggcgccct ctttctatca ctatctgccc gtgcccatgg atgagatggg ggggaagcaa 60 ggatggggca gccaccggca gtggctgggg taccgcggga gaaagatagt gatagacggg 120 aacgggtacc tactctaccc ccccttcgtt cctaccccgt cggtggccgt caccgacccc 180 180 <210> 5 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bst-2 Flag deltaCT <400> 5 atgtaccgcg ggagaaagat agtgatagac gggaacgggt acctactcta cccccccttc 60 gttcctaccc cgtcggtggc cgtcaccgac ccc 93

Claims (9)

  1. 바이러스 생산세포주에서 Bst-2 유전자를 돌연변이시키는 것을 특징으로 하는 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 생산세포주는 동물세포주인 것을 특징으로 하는 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 동물세포주는 MDCK, VERO 및 생쥐섬유아세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 Pandemic/H1N1, A/H1N1 및 A/H3N2로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 Bst-2 유전자의 exon1 부위 일부를 삽입, 결실, 중복, 역위, 치환 또는 전좌 시키거나, exon1 전체를 제거 또는 gene silencing 시키는 것을 특징으로 하는 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Bst-2 유전자의 exon1 부위는 Bst-2의 세포질부위(cytoplasmic domain)를 암호화하고 있는 것을 특징으로 하는 세포사멸(apoptosis)이 억제된 바이러스 생산 변이 세포주의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
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Retrovirology. 2012, vol. 9:10, pp. 1-12.*
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