KR101719776B1 - A promoter for high-expression of gene involved in fatty acid metabolisms and its uses - Google Patents
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Abstract
본 발명의 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자특이적 발현을 유도하는 프로모터에 관한 것으로, 구체적으로 식물 내 지방산 생합성 유전자의 고발현을 유도하여, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체의 종자는 지방산 함량이 증대되므로 지방산 대사 조절에 관한 기초 연구 및 부가가치성이 높은 특정 지방산 함량을 높이는 실용화 연구에 유용하게 이용할 수 있다. The present invention relates to a promoter inducing plant seed-specific expression derived from rapeseed ( Brassica napus ) of the present invention. Specifically, it relates to a promoter inducing high expression of a fatty acid biosynthesis gene in a plant, and a seed of a plant transformed with the recombinant expression vector Can be usefully used in basic studies on the regulation of fatty acid metabolism and in practical studies to increase the content of certain fatty acids with high added value.
Description
본 발명은 유채(Brassica napus) 유래 지방산 대사 관여 유전자의 고발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to a promoter for inducing high expression of a fatty acid metabolism related gene derived from rape ( Brassica napus ) and use thereof.
식물 내에 포함되어 있는 유지는 탄소사슬 16개 또는 18개의 지방산을 주성분으로 하며 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레인산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 리놀렌산(linolenic acid)의 혼합물이다.The fat contained in the plant is composed mainly of 16 or 18 fatty acids and is composed of palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid and linolenic acid ).
이와 같은 식물 유지는 자연분해가 잘되고 생산성이 뛰어나며 윤활성이 뛰어난 장점을 가지고 있어 식용유, 바이오디젤, 윤활유, 세제류 등 이용범위가 넓고 부가가치성이 높은 원료로 이용되고 있다. These vegetable oils have good natural decomposition, excellent productivity and excellent lubricity, and are widely used as raw materials for edible oil, biodiesel, lubricant, detergent, etc. and have high added value.
이에, 본 발명자들은 식물 종자 내에서 지방산 대사 관여 유전자의 고발현을 유도하는 프로모터를 탐색하였으며, 유채(Brassica napus)로부터 BnPAT(Protein S-acyltransferase) 프로모터를 분리하였다. BnPAT 프로모터를 포함하는 형질전환 운반체로 형질전환된 식물체의 종자는 지방산 대사 관여 유전자가 고발현됨에 따라 지방산 함량이 증대되므로, 지방산 대사 조절에 관한 기초 연구 및 부가가치성이 높은 특정 지방산 함량을 높이는 실용화 연구를 수행하고자 할 때 BnPAT 프로모터가 매우 유용하게 사용될 것으로 기대한다.
Accordingly, the present inventors have searched for a promoter inducing high expression of a fatty acid metabolism involved gene in a plant seed, and a BnPAT (Protein S-acyltransferase) promoter was isolated from rapeseed ( Brassica napus ). The seeds of the transgenic plants transformed with the BnPAT promoter showed that the fatty acid content was increased due to the high expression of the fatty acid metabolism related gene, so that the basic research on the regulation of fatty acid metabolism and the practical application to increase the content of high specific fatty acid The BnPAT promoter is expected to be very useful.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자 내 지방산 함량 증대를 유도하는 프로모터를 제공하기 위한 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for producing rapeseed, which is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 The present invention provides a promoter inducing an increase in fatty acid content in plant seeds derived from napus .
본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector comprising the promoter and a base sequence encoding the target protein operably linked to the promoter.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a microorganism transformed with said recombinant expression vector.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물로 형질전환된 식물체를 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a plant transformed with said microorganism.
본 발명의 다른 목적은,Another object of the present invention is to provide
(1) 상기 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;(1) preparing the recombinant expression vector;
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및(2) transforming the vector into a plant using Agrobacterium; And
(3) 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.(3) selecting a transformant by spraying a herbicide. The present invention also provides a method for producing a transgenic plant.
본 발명의 또 다른 목적은, A further object of the present invention is to provide
(1) 상기 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;(1) obtaining T1 seeds from the transgenic plants;
(2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계를 포함하는 식물 종자 내 지방산 함량 증대 방법을 제공하기 위한 것이다.
(2) A method for increasing fatty acid content in plant seeds, comprising the step of selecting a line in which the content of fatty acid is increased in the T1 seed of step (1).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자 내 지방산 함량 증대를 유도하는 프로모터를 제공한다.The present invention relates to a rapeseed which is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 ( Brassica The present invention provides a promoter which induces an increase in fatty acid content in plant seeds derived from napus .
상기 프로모터는 유채(Brassica napus)에서 유래한 BnPAT(Protein S-acyltransferase) 프로모터이다.The promoter may be selected from rapeseed ( Brassica napus ). < RTI ID = 0.0 > BnPAT < / RTI > (Protein S-acyltransferase)
상기 프로모터는 지방산 생합성 유전자의 발현을 유도하는 것일 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.The promoter may be one which induces expression of a fatty acid biosynthetic gene, but is not limited thereto.
상기 지방산은 팔미트산(C16:0), 스테아릭산(C18:0)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.The fatty acid may be selected from the group consisting of palmitic acid (C16: 0) and stearic acid (C18: 0), but is not limited thereto.
프로모터는 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 본 발명의 프로모터는 유전자 발현을 조절하는TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등을 포함한다. 본 발명의 프로모터는 식물 종자에서만 특이적으로 발현을 유도하는 특징이 있으며, 그 발현은 상시적일 수 있고 성장 정도, 밤/낮, 온도, 계절 등의 환경에 따라 한시적일 수 있다.
The promoter is a gene site located upstream of the coding site, which generally includes a point at which transcription is initiated. The promoter of the present invention affects gene expression in response to external stimuli, such as a TATA box, a CAAT box site, An enhancer that promotes expression of almost all genes regardless of the site and position and orientation of the gene. The promoter of the present invention has a characteristic of specifically inducing expression only in plant seeds, and its expression may be normal and may be temporal depending on the growth degree, night / day, temperature, season, and the like.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.The present invention provides a recombinant expression vector comprising a promoter represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence encoding a target protein operably linked to the promoter.
상기 재조합 발현 벡터는 pCAMBIA3300-pBnPAT인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The recombinant expression vector is preferably pCAMBIA3300-pBnPAT, but is not limited thereto.
상기 발현 벡터는 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 발현 벡터는 발현 조절 서열 및 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있으며, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.The expression vector is a vector capable of expressing a target protein or a target RNA in a host cell, and includes a necessary regulatory element operatively linked to express the gene insert. Expression vectors include expression control sequences and signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion, and may be prepared variously according to the purpose. An expression control sequence is a DNA sequence that regulates the expression of a polynucleotide sequence operably linked to a particular host cell. Such regulatory sequences include promoters for conducting transcription, any operator sequences for regulating transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosome binding sites, and sequences controlling the termination of transcription and translation. In addition, the expression vector may comprise a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and may contain a replication origin if it is a replicable expression vector.
본 발명의 재조합 발현 벡터에는 당업계에 알려진 다양한 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있으며, 이 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 프로모터와 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결(operablylinked) 된다는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.The recombinant expression vector of the present invention may include a base sequence encoding various proteins known in the art, and the base sequence encoding the target protein is operably linked to the promoter. Operably linked, it is meant that one nucleic acid fragment is combined with another nucleic acid fragment so that its function or expression is affected by other nucleic acid fragments.
본 발명에 따른 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물 종자 특이적으로 발현시키고자 하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질 일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 식물체의 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의하여 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다. 목적 단백질은 항생제 저항성 단백질, 제초제 저항성 단백질, 바이러스 저항성 단백질, 해충 저항성 단백질, 대사 관련 단백질, 발광 단백질, GFP(green fluorescence 단백질), GUS(β-glucuronidase), GAL(β-galactosidase) 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.The target protein according to the present invention may be any target protein derived from the outside, that is, an exogenous protein or an endogenous protein and a reporter protein, which is intended to be expressed in plant seeds by the promoter of the present invention. The exogenous protein refers to a protein that is not naturally present in a specific tissue or cell of a plant, and the endogenous protein refers to a protein expressed by a gene naturally present in a specific tissue or cell. The reporter protein is a protein expressed by a reporter gene, and refers to a marker protein that indicates its activity in a cell by its presence. The target proteins include antibiotic resistance proteins, herbicide resistance proteins, virus resistance proteins, insect resistance proteins, metabolism related proteins, luminescent proteins, GFP (green fluorescence protein), GUS (β-glucuronidase), GAL But is not limited thereto.
본 발명에 따른 발현 벡터는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 상기 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터는 공지의 재조합 발현 벡터로 특히 형질전환 식물체의 제조에 이용될 수 있는 식물 형질전환용 재조합 발현 벡터일 수 있다. 그 예로는 대장균 유래 플라스미드, 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드, 효모 유래 플라스미드 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등일 수 있으나, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열 같은 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터는 CAMBIA(centerfor the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제 센터 및 대학 연구소에서 입수 가능하다.The expression vector according to the present invention can be prepared by inserting the promoter of the present invention using a conventional vector used for protein expression as a basic framework and inserting a nucleotide sequence encoding the target protein downstream of the promoter. The conventional vector used for protein expression may be a known recombinant expression vector, particularly a recombinant expression vector for plant transformation, which can be used for the production of transgenic plants. Examples thereof include a plasmid vector such as an E. coli-derived plasmid, a Bacillus subtilis-derived plasmid, a yeast-derived plasmid and a Ti plasmid, a cosmid vector, a bacteriophage vector and a viral vector and the like, but a common binary vector such as pCHF3, pPZP, pGA and pCAMBIA a binary vector or a cointegration vector may be used. There are many types of binary vectors widely used in plant transformation. Almost all binary vectors are available at international centers and university laboratories such as CAMBIA (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Australia) Available.
본 발명의 일실시예에서는 제초제 저항성 Bar 유전자가 포함되어 있는 pCAMBIA3300을 기본벡터로 이용하여 팔미트산 생합성에 관여하는 CvFatB1 유전자의 5‘-말단 앞에 BnPAT 프로모터를 융합함으로써 제조합 발현 벡터인 pCAMBIA3300-pBnPAT를 제조하였다(실시예 3 및 도 3).
In one embodiment of the present invention, pCAMBIA3300-pBnPAT, which is a combined expression vector, is prepared by fusing the BnPAT promoter in front of the 5'-end of the CvFatB1 gene involved in palmitic acid biosynthesis by using pCAMBIA3300 containing the herbicide resistance Bar gene as a basic vector (Example 3 and Fig. 3).
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.The present invention also provides a microorganism transformed with said recombinant expression vector.
상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로 코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 및 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogene)로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하며, 이로 한정되지 않는다.The microorganism is Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Streptomyces (Streptomyces), Pseudomonas (Pseudomonas), Proteus Mira Billy's (Proteus mirabilis), Staphylococcus (Staphylococcus), Agrobacterium Tome Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogenes , and the like, but are not limited thereto.
본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 염화칼슘 및 열 쇼크법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporaion), PEG-매게 융합법, 미세사출법, 미세주입법, 리포좀 매개법 및 진공침윤법 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.
The recombinant expression vector comprising the promoter of the present invention and the nucleotide sequence encoding the target protein operably linked to the promoter may be introduced into the host using methods known in the art. For example, there may be mentioned calcium chloride and heat shock method, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, electroporaion, PEG-agglutination, microinjection, A microinjection method, a liposome mediated method, and a vacuum infiltration method, but the present invention is not limited thereto.
본 발명은 상기 미생물로 형질전환된 식물체를 제공한다.The present invention provides a plant transformed with said microorganism.
상기 식물은 애기장대, 유채, 들깨, 콩, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 이로 한정되지 않는다.The plant is preferably selected from the group consisting of Arabidopsis, rapeseed, perilla, bean, cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, squash, onion and carrot Do not.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 식물체 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporaion), PEG-매게 융합법, 미세사출법, 미세주입법, 리포좀 매개법, 진공침윤법 및 화아침지법을 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않으나, 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)매개에 의한 방법을 사용할 수 있으며 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985; An et al., EMBOJ. 4:227-288, 1985).
The recombinant expression vector according to the present invention can be introduced into plants using methods known in the art. For example, Agrobacterium sp. Mediated method, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, electroporaion, PEG (Agrobacterium sp.) -Mediated method may be used, although it is not limited thereto. For example, it is possible to use a fusion method, a microinjection method, a microinjection method, a liposome mediated method, a vacuum infiltration method, And can use the methods exemplified in the literature (Horsch et al., Science 227: 1229-1231, 1985; An et al., EMBOJ 4: 227-288, 1985).
본 발명은The present invention
(1) 상기 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;(1) preparing the recombinant expression vector;
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및(2) transforming the vector into a plant using Agrobacterium; And
(3) 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
(3) selecting a transformant by spraying a herbicide. The present invention also provides a method for producing a transgenic plant.
아울러, 본 발명은In addition,
(1) 상기 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;(1) obtaining T1 seeds from the transgenic plants;
(2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계를 포함하는 식물 종자 내 지방산 함량 증대 방법을 제공한다.
(2) A method for increasing the fatty acid content in a plant seed, comprising the step of selecting a line in which the content of fatty acid is increased in the T1 seed of the step (1).
본 발명에 따른 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자특이 BnPAT(Protein S-acyltransferase) 프로모터는 일반적으로 널리 사용하고 있는 프로모터인 CaMV35S 프로모터와 유채에서 유래한 종자특이 발현 프로모터 3종(BnNapin, Bn12S, BnVPE)에 비하여 프로모터 발현 효율이 1.9~5.1배 가량 높은 것으로 나타났다(도 4). The plant seed-specific BnPAT (Protein S-acyltransferase) promoter derived from rapeseed ( Brassica napus ) according to the present invention can be produced by using the commonly used promoter CaMV35S promoter and 3 kinds of seed-specific expression promoters derived from rapeseed (BnNapin, Bn12S, BnVPE ), The expression efficiency of the promoter was 1.9 to 5.1 times higher (Fig. 4).
또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터의 애기장대 형질전환체의 T1종자에서 지방산 분석을 수행한 결과, 모든 계통에서 포화지방산인 팔미트산(C16:0) 함량이 음성대조구인 비형질전환체에 비해 3.9~5.8배 증가하였으며, 스테아릭산(C18:0) 함량은 음성대조구에 비해 약 2배 증가하였음을 확인하였다(표 1). As a result of fatty acid analysis of the T1 seed of the Arabidopsis thaliana transformant of the recombinant expression vector according to the present invention, the content of palmitic acid (C16: 0), which is a saturated fatty acid in all strains, (C18: 0) was about twice that of negative control (Table 1).
이와 같은 결과는 BnPAT 프로모터가 특히 지방산 생합성 유전자의 고발현 유도 및 식물 종자 내 포화지방산 함량 증대에 우수한 효과가 있음을 시사한다.These results suggest that the BnPAT promoter is particularly effective in inducing high expression of a fatty acid biosynthesis gene and increasing the content of saturated fatty acids in plant seeds.
포화지방산은 산업용 가공오일 (세제류, 엔진오일 등) 생산의 기본물질로서 산업적 이용범위가 넓어 산업현장에서의 수요가 높다. 또한 BnPAT 프로모터는 포화지방산뿐만 아니라 불포화지방산 함량 증대에도 기여할 것으로 예상되는 바, BnPAT 프로모터는 고부가성 지방산 작물 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 결과적으로 농가소득창출 및 품종로얄티로 인한 경제적 효과가 높을 것으로 보인다.
Saturated fatty acids are the basic materials for the production of industrial processing oils (detergents, engine oils, etc.) In addition, the BnPAT promoter is expected to contribute not only to saturated fatty acid but also to the content of unsaturated fatty acids. The BnPAT promoter can be very useful for the production of high-value fatty acid crops. As a result, It seems to be high.
본 발명의 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자특이적 발현을 유도하는 프로모터는 식물 내 지방산 생합성 유전자의 고발현을 유도하여, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체의 종자는 지방산 함량이 증대되므로 지방산 대사 조절에 관한 기초 연구 및 부가가치성이 높은 특정 지방산 함량을 높이는 실용화 연구에 유용하게 이용할 수 있다.
The promoter inducing plant seed-specific expression derived from rapeseed ( Brassica napus ) of the present invention induces high expression of the fatty acid biosynthesis gene in the plant, and the seed of the plant transformed with the recombinant expression vector containing the same promotes the increase of the fatty acid content Therefore, it can be usefully used in basic studies on the regulation of fatty acid metabolism and in practical studies for increasing the specific fatty acid content with high added value.
도 1은 유채(Brassica napus) 잎의 유전체 DNA로부터 BnPAT 프로모터를 분리하여 확인한 도이다.
도 2는 BnPAT 프로모터의 염기서열 및 시스작용요소(Cis-acting element)를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따라 제작한 식물 형질전환용 재조합 발현 벡터의 모식도이다.
도 4는 프로모터 종류별 팔미트산 함량을 나타낸 도이다.
도 5는 프로모터 종류별 지방산의 불포화도 및 포화도를 나타낸 도이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing a BnPAT promoter isolated from a genomic DNA of a leaf of Brassica napus .
Fig. 2 is a diagram showing a base sequence and a cis-acting element of the BnPAT promoter.
3 is a schematic diagram of a recombinant expression vector for plant transformation produced according to the present invention.
4 is a graph showing the content of palmitic acid according to the type of promoter.
5 is a graph showing the degree of unsaturation and degree of saturation of a fatty acid by promoter type.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
<< 실시예Example 1> 유채( 1> Rapeseed ( BrassicaBrassica napusnapus )로부터 유전자 분리)
본 발명자들은 유채(Brassica napus) 잎에서 유전체 DNA를 추출한 후 Genome Walker™ Universal Kit를 이용하여 4종(DraI, EcoRV, PvuⅡ, StuI)의 라이브러리를 제작하였다. 4종의 라이브러리에 대해 프라이머 Forward: 5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’(서열번호 2), Reverse:5’-AGGATGTTCCAGGAGGGTACAAGTCAA-3’(서열번호 3)를 사용하여 PCR 반응을 한 결과, 도 1과 같이 DraI 라이브러리와 PvuⅡ 라이브러리로부터 유전자 단편이 각각 증폭되었다. 증폭된 2종의 유전자 단편을 pGEM-T-easy 벡터로 옮겨 염기서열을 확인하였다.
The present inventors extracted genomic DNA from leaves of Brassica napus , A library of four species ( Dra I, EcoR V, Pvu II, and Stu I) was constructed using the Universal Kit. For the library four kinds of primers Forward: 5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3 ' ( SEQ ID NO: 2), Reverse: 5'-3-AGGATGTTCCAGGAGGGTACAAGTCAA' (SEQ ID NO: 3) The results of the PCR reaction, using, as shown in FIG. 1 Dra I < / RTI > library and Pvu II library, respectively. The amplified two gene fragments were transferred to pGEM-T-easy vector to confirm the base sequence.
<< 실시예Example 2> 유전자 단편의 염기서열 정보 분석 2> Analysis of nucleotide sequence information of gene fragments
증폭된 2종의 유전자 단편의 염기서열을 확인한 결과, DraI 라이브러리에서 유래한 유전자 단편으로부터 1200 bp에 해당하는 BnPAT(Protein S-acyltransferase) 프로모터의 염기서열 정보를 획득하였다(서열번호 1, 도 2). PlantCARE(Plant Cis acting regulatory element) 데이터베이스를 이용하여 염기서열 내에 6개의 시스작용요소(Cis-acting element)가 존재함을 알 수 있었고, 시스작용요소 중 종자특이 발현에 관여하는 Skn-1 모티브가 있는 것으로 보아 BnPAT 프로모터가 종자특이 발현 프로모터의 기능이 있음을 알 수 있었다.
The nucleotide sequences of the amplified two kinds of gene fragments were confirmed, and as a result, nucleotide sequence information of the BnPAT (Protein S-acyltransferase) promoter corresponding to 1200 bp was obtained from the gene fragment derived from the Dra I library (SEQ ID NO: 1, ). Using the Plant CARE (Plant Cis acting regulatory element) database, it was found that there are six cis-acting elements in the nucleotide sequence, and the Skn-1 motif involved in the seed-specific expression of the cis- As a result, it was found that the BnPAT promoter functions as a seed-specific expression promoter.
<< 실시예Example 3> 3> BnPATBnPAT (( ProteinProtein S- S- acyltransferaseacyltransferase ) 프로모터의 기능 검정) Functional Test of Promoter
<3-1> 식물 형질전환용 재조합 발현 벡터 제작<3-1> Production of Recombinant Expression Vector for Plant Transformation
BnPAT 프로모터의 기능을 검정하기 위하여, 식물 형질전환용 재조합 발현 벡터를 제작하였다(도 3). 형질전환체 선발을 위해 제초제 저항성 Bar 유전자가 포함되어 있는 pCAMBIA3300을 기본벡터로 이용하였으며 팔미트산 생합성에 관여하는 CvFatB1 유전자의 5‘-말단 앞에 BnPAT 프로모터를 융합하였다. To test the function of the BnPAT promoter, a recombinant expression vector for plant transformation was prepared (Fig. 3). For selection of transformants, pCAMBIA3300 containing a herbicide resistant Bar gene was used as a basic vector, and a BnPAT promoter was fused at the 5'-end of the CvFatB1 gene involved in palmitate biosynthesis.
또한, BnPAT 프로모터의 유전자 발현 효율을 양성대조구와 비교하기 위하여, 앞에서 기재한 바와 동일한 방식으로 일반적으로 널리 사용하고 있는 프로모터인 CaMV35S 프로모터와 유채에서 유래한 종자특이 발현 프로모터 3종(BnNapin, Bn12S, BnVPE)을 재조합 발현 벡터로 제작하였다.
In order to compare the gene expression efficiency of the BnPAT promoter with the positive control, the CaMV35S promoter, which is a widely used promoter in the same manner as described above, and three species-specific expression promoters derived from rapeseed (BnNapin, Bn12S, BnVPE ) Was constructed as a recombinant expression vector.
<3-2> 형질전환 식물체 제작<3-2> Production of Transgenic Plants
제작한 재조합 발현 벡터 5종을 각각 아그로박테리움 EHA105에 형질전환하고 식물에서의 프로모터 기능 검정을 위해 애기장대(Arabidopsis thaliana cv. Colombia)에 화아침지법(floral dipping)으로 형질전환하였다. 이후, 형질전환된 애기장대로부터 수득한 종자를 파종한 후 본엽 2매를 가진 유묘기에 0.3% 바스타 제초제를 살포하고 살아남은 개체를 포트에 이식하여 식물생장실(22℃, 16시간 광조건)에서 약 3개월간 재배한 후 종자를 수확하였다.
Five recombinant expression vectors were transformed into Agrobacterium EHA105 and Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana cv. Colombia) was transformed into floral dipping. Thereafter, the seed obtained from the transformed Arabidopsis seeds was sown, and then 0.3% Basta herbicide was sprayed on the stem with two main leaves. The surviving seed was transplanted into the pot, and the plant was grown in a plant growth chamber (22 캜, The seeds were harvested after 3 months of cultivation.
<3-3> 형질전환 식물체에서의 지방산 분석<3-3> Analysis of fatty acids in transgenic plants
BnPAT 프로모터가 형질전환된 애기장대 형질전환체 4개 계통(7번, 10번, 12번, 15번)을 획득하여 각 계통의 T1종자에서 지방산 분석을 수행하였다.Four strains of Arabidopsis transformants transformed with BnPAT promoter (No. 7, No. 10, No. 12 and No. 15) were obtained and fatty acid analysis was performed on T1 seeds of each strain.
그 결과, 모든 계통에서 포화지방산인 팔미트산(C16:0) 함량이 음성대조구인 비형질전환체에 비해 3.9~5.8배 증가하였으며, 스테아릭산(C18:0) 함량은 음성대조구에 비해 약 2배 증가하였음을 알 수 있었다(표 1, 단위: mol%). 특히, 7번 계통과 12번 계통은 포화지방산 함량이 54mol% 이상으로, 14mol%인 음성대조구에 비해 크게 증가하였음을 확인하였다. 포화지방산 함량이 증대된 2개 계통(7번, 12번)을 살펴보면 다른 계통에 비하여 불포화지방산인 올레인산(C18:1)과 아라키도닉산(C20:1)의 함량이 크게 감소하였고, 리놀레산(C18:2)와 리놀렌산(C18:3)의 함량 또한 감소하였음을 알 수 있었다. 즉, 이러한 결과를 통해 BnPAT 프로모터는 CvFatB1 유전자의 발현을 크게 증대시킴을 알 수 있었다.As a result, the content of saturated fatty acid palmitic acid (C16: 0) was 3.9 ~ 5.8 times higher than that of non - transfected negative control, and the content of stearic acid (C18: 0) (Table 1, unit: mol%). Especially, it was confirmed that saturated fatty acid content of the 7th line and 12th line was 54 mol% or more, which was significantly increased compared to the 14 mol% negative control. The content of oleic acid (C18: 1) and arachidonic acid (C20: 1), which are unsaturated fatty acids, was significantly decreased in the two systems (No. 7 and No. 12) : 2) and linolenic acid (C18: 3) contents were also decreased. That is, these results indicate that the BnPAT promoter significantly increases the expression of the CvFatB1 gene.
지방산Saturation
fatty acid
지방산Unsaturation
fatty acid
대조구voice
Control
<3-4> 지방산 생합성 유전자의 발현율 분석<3-4> Analysis of Expression Rate of Fatty Acid Biosynthetic Gene
BnPAT 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터와 실시예 3-1에서 제작한 CaMV35S, BnNapin, Bn12S 및 BnVPE 프로모터를 각각 포함하는 재조합 발현 벡터에 대하여, 지방산 생합성 유전자인 CvFatB1 유전자의 발현율을 분석하였다.The recombinant expression vector containing the BnPAT promoter and the recombinant expression vector containing the CaMV35S, BnNapin, Bn12S and BnVPE promoters prepared in Example 3-1 were analyzed for the expression rate of the CvFatB1 gene, a fatty acid biosynthesis gene.
그 결과, CvFatB1 유전자의 산물인 팔미트산의 함량은 BnPAT 프로모터 처리구에서 46mol%로 가장 높은 것으로 나타나, BnPAT 프로모터 발현 효율이 CaMV35S, BnNapin, Bn12S 및 BnVPE 프로모터에 비하여 1.9~5.1배 가량 높은 것을 확인하였다(도 4). As a result, the content of palmitic acid, the product of the CvFatB1 gene, was the highest at 46 mol% in the BnPAT promoter treated group, and the expression efficiency of the BnPAT promoter was 1.9 to 5.1 times higher than that of the CaMV35S, BnNapin, Bn12S and BnVPE promoters (Fig. 4).
또한, 형질전환 식물체의 종자 내에 분포하고 있는 지방산의 불포화도 및 포화도 함량을 조사한 결과, 음성대조구인 비형질전환체에 비해 BnPAT 프로모터 처리구에서 불포화도 및 포화도의 함량 비율이 가장 크게 변화하였음을 확인하였다(도 5). As a result of investigating the unsaturation degree and saturation content of fatty acids in seeds of transgenic plants, it was found that the content of unsaturation and degree of saturation was the largest in BnPAT promoter treated group compared with the non-transformant (Fig. 5).
이는 기존에 개발된 유채 유래 종자특이 발현 프로모터들보다 BnPAT 프로모터가 형질전환 식물체의 종자 내에서 CvFatB1 유전자의 발현율을 최대화하였음을 시사하였다.This suggests that BnPAT promoter maximizes the expression rate of CvFatB1 gene in seeds of transgenic plants than that of seed - specific expression promoters derived from rapeseed.
<110> Republic of Korea <120> A promoter for high-expression of gene involved in fatty acid metabolisms and its uses <130> P14R12D1319 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1200 <212> DNA <213> DNA sequence of BnPAT promoter and Cis-acting regulatory element <400> 1 acactcttta cggatattta tatgagacac aaagtcagtg ttttgaaaac ttaaacggac 60 cggccaatca aactgttgtg attgtgactc gttagataag ccaagtccta gtttaaaaac 120 tgattttgag gaaaaatggt aaaacaagct aaaactagtg accatattaa ctttaaaacc 180 cggttctaaa aagaacacat aattaatgta ttttaaattg ttattttttt tttgacaact 240 attaaaatta ttattttata gccaatattt gactatcatt atttaaatat ttttcgttta 300 ttttattttt gtaagaaatg aagtaaaaca atttcatttg acttttagtt gtaaaaataa 360 ataaatgtga tagtttgaat ggtcaatcag agcatttgtg tgtttatcag tttcaattct 420 tcacttgttt actgtatata tagtagattt atatttattg tttatttttc taattaatgg 480 aaaagaactt gtcatatgta gaactacact cttaaagttg agctaatgta aatatatgat 540 tatacatata tctaatttct gaaaaataga aaatttggtt taatcggtct agttacgccg 600 aatcaatatc cagtttggtt tttaaaacat tatctaaaac atagatacat atccgcatgg 660 ccacaaaaca aatgttttga gatgtttcgt aaccagattg cttagatctt caaaatccac 720 ttaccattaa accaccatgt ttttttgtga tgcaaagatc ctaatctagt attatatcaa 780 cttttaaaag aaaatatcag gaaatttatt gtaaatctta caaagtcgta aatattattg 840 gatttatagt aaacaattaa tatgaaatcc atgaatattt tctggaaaaa aaaaaatact 900 tgcatatttt atcgcataca tacaagtaca cacaaaacat acacgcatat taaaagaggc 960 tgcgagaaga tagcatagga ttaggataaa caaaaaaaaa gacgaagaag agagttaatg 1020 cgatcgcagg aagacatgag caatcgtcac cgtccatttt acaaagacac tcacttactt 1080 ggccgcaact cccaaccaca tcacgctctt tctattccct acttatattc ccatctcaaa 1140 aaacttcctg gagacaacaa aacattaaca caaacgcaaa tctcatctct cgcgtttact 1200 1200 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Primer_Forward <400> 2 actatagggc acgcgtggt 19 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Primer_Reverse <400> 3 aggatgttcc aggagggtac aagtcaa 27 <110> Republic of Korea <120> A promoter for high-expression of gene involved in fatty acid metabolisms and its uses <130> P14R12D1319 <160> 3 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1200 <212> DNA <213> DNA sequence of BnPAT promoter and Cis-acting regulatory element <400> 1 acactcttta cggatattta tatgagacac aaagtcagtg ttttgaaaac ttaaacggac 60 cggccaatca aactgttgtg attgtgactc gttagataag ccaagtccta gtttaaaaac 120 tgattttgag gaaaaatggt aaaacaagct aaaactagtg accatattaa ctttaaaacc 180 cggttctaaa aagaacacat aattaatgta ttttaaattg ttattttttt tttgacaact 240 attaaaatta ttattttata gccaatattt gactatcatt atttaaatat ttttcgttta 300 ttttattttt gtaagaaatg aagtaaaaca atttcatttg acttttagtt gtaaaaataa 360 ataaatgtga tagtttgaat ggtcaatcag agcatttgtg tgtttatcag tttcaattct 420 tcacttgttt actgtatata tagtagattt atatttattg tttatttttc taattaatgg 480 gt; tatacatata tctaatttct gaaaaataga aaatttggtt taatcggtct agttacgccg 600 aatcaatatc cagtttggtt tttaaaacat tatctaaaac atagatacat atccgcatgg 660 ccacaaaaca aatgttttga gatgtttcgt aaccagattg cttagatctt caaaatccac 720 ttaccattaa accaccatgt ttttttgtga tgcaaagatc ctaatctagt attatatcaa 780 cttttaaaag aaaatatcag gaaatttatt gtaaatctta caaagtcgta aatattattg 840 gatttatagt aaacaattaa tatgaaatcc atgaatattt tctggaaaaa aaaaaatact 900 tgcatatttt atcgcataca tacaagtaca cacaaaacat acacgcatat taaaagaggc 960 tgcgagaaga tagcatagga ttaggataaa caaaaaaaaa gacgaagaag agagttaatg 1020 cgatcgcagg aagacatgag caatcgtcac cgtccatttt acaaagacac tcacttactt 1080 ggccgcaact cccaaccaca tcacgctctt tctattccct acttatattc ccatctcaaa 1140 aaacttcctg gagacaacaa aacattaaca caaacgcaaa tctcatctct cgcgtttact 1200 1200 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Primer_Forward <400> 2 actatagggc acgcgtggt 19 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Primer_Reverse <400> 3 aggatgttcc aggagggtac aagtcaa 27
Claims (11)
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
(3) 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법.(1) preparing the recombinant expression vector of claim 4;
(2) transforming the vector into a plant using Agrobacterium; And
(3) selecting a transformant by spraying a herbicide.
(2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계를 포함하는 식물 종자 내 지방산 함량 증대 방법.(1) obtaining a T1 seed from the transgenic plant of claim 8;
(2) A method for increasing fatty acid content in plant seeds, comprising the step of selecting a line in which the content of fatty acid is increased in the T1 seed of step (1).
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