KR101708752B1 - 광합성 세포막 소낭을 이용한 아데노신 삼인산 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(인산)의 지속적 생산 방법 - Google Patents

광합성 세포막 소낭을 이용한 아데노신 삼인산 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(인산)의 지속적 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광합성 세균 세포막으로부터 분리된 소낭을 함유하는 광합성 명반응 산물 생산용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 광합성 명반응 산물의 생산 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 광합성 세균의 세포막으로부터 소낭을 분리하는 단계를 포함하는 광합성 명반응 단위체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물을 이용하면 빛 조사 조건하에서 광합성 세균 세포막 소낭을 이용하여 지속적으로 광합성 명반응 산물을 제공할 수 있으며, 다른 파장의 빛을 흡수하는 다른 기원의 소낭을 조합하여 광합성 명반응 단위체를 구성할 경우 상기 광합성 명반응 산물의 생산량을 극대화할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 광합성 명반응 산물의 생산 방법은 물 이외에는 추가적인 전자공여체가 필요하지 않으므로 ATP 또는 NAD(P)H의 경제적인 생산이 가능하다. 본 발명의 방법에 의해 지속적으로 생산되는 ATP 및 NAD(P)H는 다양한 생화학 반응을 매개하는 능력을 가지므로 유용 물질을 생산하는 다양한 공정에 적용될 수 있다.

Description

광합성 세포막 소낭을 이용한 아데노신 삼인산 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(인산)의 지속적 생산 방법{A method for continuous production of ATP and NAD(P)H by photosynthetic membrane vesicle}
본 발명은 광합성 세균 세포막으로부터 분리된 소낭을 함유하는 광합성 명반응 산물 생산용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 광합성 명반응 산물의 지속적 생산 방법에 관한 것이다.
현대 산업의 구조는 화학공업의 원료 물질과 에너지원의 대부분을 화석 연료에 의존할 수밖에 없다. 화석연료의 양은 한정되어 있으며, 이러한 화석 연료의 이용은 경제적 문제와 함께 다양한 환경문제를 발생시키고 있다. 이와 같은 상황에서 화석연료를 대체할 수 있는 신재생 에너지에 관한 연구가 계속되고 있으며, 태양빛을 이용하는 에너지 생산기술은 인류가 의존해야 할 궁극적인 에너지 기술 중 하나에 해당한다. 빛에너지 이용기술은 빛에너지를 화학에너지 또는 전기에너지로 변환시키는 기술로서 다양한 방법에 의해 가능할 수 있으나, 그 중에서도 생체에서 일어나는 광합성(photosynthesis)은 35억년의 진화과정을 거치면서 현재와 같은 빛에너지 이용 기능을 보유하게 되었다.
광합성은 식물에서 뿐만 아니라 조류(algae) 및 다양한 미생물에 의해 수행된다. 이러한 광합성은 전자공여체의 종류에 따라 크게 산소발생 광합성 및 비산소발생 광합성으로 구분된다. 산소발생 광합성은 식물과 조류 그리고 남세균 (Cyanobacteria) 등에서 일어나는데, 전자공여체가 물(H2O)로서 산소를 발생하는 것을 그 특징으로 한다. 이러한 산소발생 광합성은 식물 내의 세포 소기관인 엽록체(chloroplast) 또는 조류 및 미생물에 존재하는 특이적인 세포막 구조인 틸라코이드 세포막(thylakoid membrane)에서 일어난다. 빛에너지는 전자를 흥분시켜 일련의 전자 흐름을 유도하게 되며, 이러한 전자의 흐름 과정에서 양성자를 이동시켜 막 내외에서의 양성자 농도 구배를 야기한다. 결과적으로 양성자의 농도 구배는 아데노신 삼인산 합성효소(ATP synthase)의 작용을 통해 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)의 합성으로 이어진다. 또한 이러한 전자의 흐름은 페레독신(ferredoxin)으로 전달되고 최종적으로 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADP+)을 환원시켜 환원된 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH)을 생성시킨다. 이 때 생성된 NADPH는 피리딘 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소(pyridine nucleotide transhydrogenase, Pnt)의 작용에 의해 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH)로도 전환될 수 있다.
비산소발생 광합성은 자색비유황세균(purple non-sulfur bacteria), 자색유황세균(purple sulfur bacteria), 녹색비유황세균(green non-sulfur bacteria), 녹색유황세균(green sulfur bacteria) 및 헬리오박테리아(Heliobacteria) 등에서 수행되는 것으로 알려져 있으며, 식물 및 조류에서 일어나는 산소발생 광합성과는 달리 그 과정 중에 산소를 발생시키지 않는 것을 그 특징으로 한다. 특히 자색비유황세균에서는 이러한 광합성 기전이 세포막의 내부 방향으로 만입되는 만입 세포막(intracytoplasmic membrane)에서 일어난다. 이들 균주의 만입 세포막에 존재하는 광반응 중심체(reaction center)에서는 빛에너지에 의한 광화학 반응이 유도되어 순환식 전자 전달(cyclic electron transfer)을 유도하게 되며, 이 과정에서 발생하는 양성자의 농도 구배를 그 동력으로 아데노신 삼인산 합성효소가 작용하여 아데노신 이인산(adenosine diphosphate, ADP) 및 무기인산으로부터 ATP를 합성하게 된다. 반면 만입 세포막에 존재하는 복합체 I(complex I)에 의해 양성자가 막의 반대 방향으로 이동하는 역전자 전달(reverse electron flow)이 일어나면 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD+)를 환원시켜 환원된 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH)을 생성시키게 된다. 이후 전자를 잃은 퀴논(quinone)은 역시 만입 세포막에 존재하는 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase, complex Ⅱ)의 작용에 의해 숙신산이 푸마르산(fumarate)으로 전환되는 과정에서 전자를 다시 얻게 된다. 이러한 기전으로 생성된 NADH는 산소발생 광합성에서와 마찬가지로 피리딘 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소의 작용에 의해 NADPH로 전환될 수 있다.
ATP 및 NAD(P)H는 생체 내에서 다양한 생화학적 반응을 매개하는 효소들의 조효소(cofactor)로서 작용한다. 따라서 생체는 ATP 및 NAD(P)H의 지속적인 합성을 필요로 하는데, 다양한 대사 물질이 갖는 에너지를 소모하여 이러한 조효소를 생산하는 효소 반응들이 알려져 있다. 해당과정(glycolysis)과 구연산 회로(citric acid cycle 또는 TCA cycle)가 그 대표적인 예로서 포도당(glucose)을 분해하는 과정에서 관련 효소들의 작용으로 ATP 및 NADH를 생성시킬 수 있다. 아울러, 생체 외에서의 생화학 반응들을 위해 ATP 및 NAD(P)H를 합성할 수 있는 방법이 알려져 있다. ATP의 합성을 위한 구성으로서 크레아틴 인산(creatine phosphate) 및 크레아틴 포스포키나아제(creatine phosphokinase)의 용법이 알려져 있는데, 크레아틴 포스포키나아제는 크레아틴 인산의 인산기를 아데노신 이인산에 전달하여 ATP를 합성하는 반응을 매개한다. 즉, 이 효소는 크레아틴 인산을 소모하여 ADP로부터 ATP를 합성할 수 있다. 또한 포도당-6-인산 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase)는 포도당-6-인산을 소모하며 동시에 NADP+를 환원시켜 NADPH의 생성 반응을 매개할 수 있다. 그러나 이들 반응을 실제로 유용물질 생산을 위한 생체 외 효소 반응에 적용할 경우, 그 반응 과정에서 크레아틴 인산 또는 포도당-6-인산을 계속 소모하게 되므로 비용이 크게 증가하여 그 현실성이 낮다는 문제점이 있다.
대한민국출원특허 제10-2011-7017135호에서 제시된 발명은 ATP를 재생하는 목적의 분리된 조성물이 틸라코이드 막을 포함할 수 있음을 제안하고 있다. 그러나 틸라코이드 막이 ATP를 생산하는 광인산화(photophosphorylation) 반응을 수행하기 위해서는 필수적으로 양성자의 농도 구배가 형성되어야 하는데 막 내외가 공간적으로 분리된 구조인 소낭(vesicle) 형태의 막이 아니라 평면 구조의 막 자체로는 이러한 목적을 달성할 수 없다. 실제로도 상기 출원에서는 틸라코이드 막을 이용하여 ATP를 생성하는 결과를 제시하지 못하고 있다. 또한 상기 특허에서는 틸라코이드 막을 이용하여 NAD(P)H를 생산하기 위한 방법을 제시하지 않는다.
또한 대한민국출원특허 제10-2008-0021127호에서 제시된 발명은 분리된 틸라코이드 세포막을 그 유효 성분으로 이용한다는 점에서는 본 발명과 유사하지만, 틸라코이드 세포막에 존재하는 췌장의 지질분해효소(lipase)에 대한 억제 성분을 이용하여 인체에 포만감을 주어 비만을 제어하는데 사용하는 용법을 제시하는 것을 그 주된 구성으로 한다는 점에서 본원과 그 내용이 상이하다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 남세균 또는 자색비유황세균과 같은 광합성 세균을 이용하여 ATP 및 NAD(P)H와 같은 광합성 명반응 산물을 지속적으로 생산할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 상기 세균의 세포막에 존재하는 소낭만을 분리하여 광합성 명반응 수행 기구를 구성할 경우 물 이외의 추가적인 전자 공여체 또는 추가적인 기질 없이 지속적으로 광합성 명반응 산물을 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 광합성 세균 세포막으로부터 분리된 소낭을 함유하는 광합성 명반응 산물 생산용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 광합성 명반응 산물 생산용 조성물을 포함하는 광합성 명반응 단위체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 광합성 세균의 세포막으로부터 소낭을 분리하는 단계를 포함하는 광합성 명반응 단위체의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 광합성 세균의 세포막으로부터 분리된 소낭에 빛을 조사하는 단계를 포함하는 광합성 명반응 산물의 생산 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 광합성 세균 세포막으로부터 분리된 소낭(vesicle)을 함유하는 광합성 명반응 산물 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 광합성 세균의 세포막으로부터 분리된 소낭에 빛을 조사하는 단계를 포함하는 광합성 명반응 산물의 생산 방법을 제공한다.
본 발명자들은 남세균 또는 자색비유황세균과 같은 광합성 세균을 이용하여 ATP 및 NAD(P)H와 같은 광합성 명반응 산물을 지속적으로 생산할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 상기 세균의 세포막에 존재하는 소낭만을 분리하여 광합성 명반응 수행 기구를 구성할 경우 물 이외의 추가적인 전자 공여체 또는 추가적인 기질 없이 지속적으로 광합성 명반응 산물을 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 사용된 용어 "광합성 세균(photosynthetic bacteria)"은 빛에너지를 이용하여 광합성을 수행할 수 있는 세균을 의미하며, 전자공여체의 종류에 따라 크게 산소발생 광합성 세균 및 비산소발생 광합성 세균으로 구분할 수 있다.
산소발생 광합성은 전자공여체가 물(H2O)로서 산소를 발생하는 것을 그 특징으로 하며, 대표적으로는 남세균(Cyanobacteria)이 상기 산소발생 광합성 세균에 해당한다. 남세균은 상기 광합성을 수행하는 특이적인 세포막 구조인 틸라코이드 세포막(thylakoid membrane, TM)을 갖고 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "틸라코이드 세포막의 소낭(vesicle)"은 상기 틸라코이드 세포막에 포함된 것으로, 두 종류의 광계(photosystem)와 전자전달 기능을 갖는 다수의 단백질들이 포함된 세포막 단위체를 말한다. 상기 틸라코이드 세포막의 소낭은 일반 세포막 소낭과는 달리 빛에너지를 이용하여 ATP 및 NADPH를 생산하는 능력을 갖는다.
본 발명에서 상기 틸라코이드 세포막의 소낭을 수득할 수 있는 남세균은 제한되지 않으며, 예를 들어, Synechocystis sp., Synechococcus sp., Nostoc sp., Anabaena sp., Gloeobacter sp., Cyanobacterium sp., Candidatus sp., Camptylonema sp., Camptylonemopsis sp., Coleodesmium sp., Fortiea sp., Godleya sp., Hassallia sp., Microchaete sp., Petalonema sp., Rexia sp., Spirirestis sp., Tolypothrix sp., Anabaenopsis sp., Aphanizomenon sp., Aulosira sp., Cronbergia sp., Cuspidothrix sp., Cyanospira sp., Cylindrospermopsis sp., Cylindrospermum sp., Desmonostoc sp., Dolichospermum sp., Hydrocoryne sp., Mojavia sp., Nodularia sp., Raphidiopsis sp., Richelia sp., Sphaerospermopsis sp., Trichormus sp., Wollea sp., Calothrix sp., Dichothrix sp., Gloeotrichia sp., Rivularia sp., Brasilonema sp., Chakia sp., Scytonema sp., Scytonematopsis sp., Umezakia sp., Nostocales sp., Acaryochloris sp., Aphanocapsa sp., Aphanothece sp., Chamaesiphon sp., Chlorogloea sp., Chondrocystis sp., Chroococcus sp., Chroogloeocystis sp., Coelosphaerium sp., Crocosphaera sp., Cyanobium sp., Cyanocystis sp., Cyanodictyon sp., Cyanosarcina sp., Cyanothece sp., Dactylococcopsis sp., Geminocystis sp., Gloeocalita sp., Gloeocapsa sp., Gloeocapsopsis sp., Gloeothece sp., Johannesbaptistia sp., Limnococcus sp., Merismopedia sp., Microcystis sp., Pannus sp., Radiocystis sp., Rhabdoderma sp., Rubidibacter sp., Snowella sp., Sphaerocavum sp., Thermosynechococcus sp., Woronichinia sp., Aerosakkonema sp., Annamia sp., Arthronema sp., Arthrospira sp., Blennothrix sp., Coleofasciculus sp., Crinalium sp., Desertifilum sp., Geitlerinema sp., Haloleptolyngbya sp., Halomicronema sp., Halospirulina sp., Hormoscilla sp., Hydrocoleum sp., Jaaginema sp., Katagnymene sp., Komvophoron sp., Leptolyngbya sp., Limnoraphis sp., Limnothrix sp., Lyngbya sp., Microcoleus sp., Moorea sp., Nodosilinea sp., Oculatella sp., Oscillatoria sp., Phormidesmis sp., Phormidium sp., Planktolyngbya sp., Planktothricoides sp., Planktothrix sp., Plectolyngbya sp., Plectonema sp., Pseudanabaena sp., Pseudophormidium sp., Pseudoscillatoria sp., Pseudoscytonema sp., Romeria sp., Roseofilum sp., Schizothrix sp., Spirulina sp., Starria sp., Symploca sp., Symplocastrum sp., Tapinothrix sp., Trichocoleus sp., Trichodesmium sp., Tychonema sp., Wilmottia sp., Chroococcidiopsis sp., Dermocarpa sp., Dermocarpella sp., Hyella sp., Myxosarcina sp., Pleurocapsa sp., Solentia sp., Stanieria sp., Xenococcus sp., Prochloron sp., Prochlorococcus sp., Prochlorothrix sp., Capsosira sp., Chlorogloeopsis sp., Fischerella sp., Hapalosiphon sp., Iphinoe sp., Loriellopsis sp., Mastigocladopsis sp., Mastigocladus sp., Mastigocoleus sp., Nostochopsis sp., Stigonema sp., Symphyonema sp., Symphyonemopsis sp. 및 Westiellopsis sp. 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 남세균으로부터 상기 틸라코이드 세포막 소낭을 수득할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 틸라코이드 세포막 소낭을 수득할 수 있는 남세균은 시네코시스티스 속(Synechocystis sp.), 시네코코쿠스 속(Synechococcus sp.), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아나베나 속(Anabaena sp.), 글로이오박터 속(Gloeobacter sp.) 및 시아노박테리움 속(Cyanobacterium sp.)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 남세균인 것이다.
비산소발생 광합성은 광합성 과정 중에 산소를 발생시키지 않는 것을 그 특징으로 하며, 대표적으로는 자색비유황세균(purple non-sulfur bacteria), 자색유황세균(purple sulfur bacteria), 녹색비유황세균(green non-sulfur bacteria), 녹색유황세균(green sulfur bacteria) 및 헬리오박테리아(Heliobacteria) 등에서 상기 비산소발생 광합성이 수행된다. 특히 자색비유황세균에서는 이러한 광합성 기전이 세포막의 내부 방향으로 만입되는 만입 세포막(intracytoplasmic membrane, ICM)에서 일어난다.
본 발명에서 사용된 용어 "만입 세포막의 소낭"은 상기 만입 세포막에 포함된 것으로, 광반응 중심체와 광 흡수체(light harvesting complex) 그리고 전자전달 기능을 갖는 다수의 단백질들이 포함된 세포막 단위체를 말한다. 상기 만입 세포막의 소낭은 일반 세포막 소낭과는 달리 빛에너지를 이용하여 ATP 및 NADH를 생산하는 능력을 갖는다.
본 발명에서 상기 만입 세포막의 소낭을 수득할 수 있는 자색비유황세균은 제한되지 않으며, 예를 들어, Rhodobacter sp., Rhodospirillum sp., Rhodopseudomonas sp., Roseobacter sp., Bradyrhizobium sp., Rubrivivax sp., Rhodobaca sp., Rhodovulum sp., Rhodoblastus sp., Rhodochloris sp., Rhodomicrobium sp., Rhodobium sp., Rhodoplanes sp., Rhodocista sp., Phaeospirillum sp., Rhodopila sp., Rhodospira sp., Rhodovibrio sp., Rhodothallasium sp., Roseospira sp., Roseospillum sp., Rhodocyclus sp., Rhodoferax sp., Roseovarius sp., Azospirillum sp., Caenispirillum sp., Dechlorospirillum sp., Inquilinus sp., Magnetospirillum sp., Nisaea sp., Skermanella sp., Thalassobaculum sp., Thalassospira sp. 및 Tistrella sp. 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 자색비유황세균으로부터 상기 만입 세포막 소낭을 수득할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 만입 세포막 소낭을 수득할 수 있는 자색비유황세균은 로도박터 속(Rhodobacter sp.), 로도스피릴룸 속(Rhodospirillum sp.), 로도수도모나스 속(Rhodopseudomonas sp.), 로지오박터 속(Roseobacter sp.), 브래디리조비움 속(Bradyrhizobium sp.) 및 루비리박스 속(Rubrivivax sp.)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 자색비유황세균인 것이다.
상기 로도박터 속 자색비유황세균에는 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides)를 비롯하여 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 아피그멘툼(Rhodobacter apigmentum), 로도박터 애스투아리(Rhodobacter aestuarii), 로도박터 블라스티쿠스(Rhodobacter blasticus), 로도박터 챵렌시스(Rhodobacter changlensis), 로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans), 로도박터 오바투스(Rhodobacter ovatus), 로도박터 글루코니쿰(Rhodobacter gluconicum), 로도박터 조리(Rhodobacter johrii), 로도박터 리토랄리스(Rhodobacter litoralis), 로도박터 마리스(Rhodobacter maris), 로도박터 메갈로필루스(Rhodobacter megalophilus), 로도박터 비나이쿠마리(Rhodobacter vinaykumarii), 로도박터 비리디스(Rhodobacter viridis), 로도박터 마실리엔시스(Rhodobacter massiliensis), 로도박터 데니트리피칸스(Rhodobacter denitrificans), 로도박터 벨드캄피(Rhodobacter veldkampii) 등이 있다.
상기 로도스피릴룸 속 자색비유황세균에는 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum)을 비롯하여 로도스피릴룸 센테눔(Rhodospirillum centenum), 로도스피릴룸 인디엔시스(Rhodospirillum indiensis), 로도스피릴룸 오리재(Rhodospirillum oryzae), 로도스피릴룸 포토메트리쿰(Rhodospirillum photometricum), 로도스피릴룸 몰리쉬아눔(Rhodospirillum molischianum), 로도스피릴룸 술푸렉시겐스(Rhodospirillum sulfurexigens) 등이 있다.
상기 로도수도모나스 속 자색비유황세균에는 로도수도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)를 비롯하여 로도수도모나스 아시도필리아(Rhodopseudomonas acidopilia), 로도수도모나스 분케르디(Rhodopseudomonas boonkerdii), 로도수도모나스 패칼리스(Rhodopseudomonas faecalis), 로도수도모나스 하우디에(Rhodopseudomonas harwoodiae), 로도수도모나스 줄리아리첸(Rhodopseudomonas julialichen), 로도수도모나스 오리재(Rhodopseudomonas oryzae), 로도수도모나스 판곤젠시스(Rhodopseudomonas pangongensis), 로도수도모나스 펜토쎄나텍시젠(Rhodopseudomonas pentothenatexigens), 로도수도모나스 레노바켄시스(Rhodopseudomonas rhenobacensis), 로도수도모나스 쎄르모톨레란스(Rhodopseudomonas thermotolerans) 등이 있다.
상기 로지오박터 속 자색비유황세균에는 로지오박터 디나이트리피칸스 (Roseobacter denitrificans)를 비롯하여 로지오박터 리토랄리스(Roseobacter litoralis), 로지오박터 프리오니티스(Roseobacter prionitis) 등이 있다.
또한, 상기 브래디리조비움 자색비유황세균에는 브래디리조비움 속(Bradyrhizobium sp.) 등이 있으며, 상기 루비리박스 속 자색비유황세균에는 루비리박스 젤라티노수스(Rubrivivax gelatinosus) 등이 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "광합성 명반응 산물"은 상기 광합성 세균이 빛에너지를 화학에너지로 전환하는 명반응(light reaction)을 수행한 결과 생산된 산물을 의미하며, 상기 산물은 아데노신 삼인산(ATP), 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH) 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 명반응 산물을 포함한다.
본 발명은 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 수득하고, 상기 분리된 광합성 특이적 세포막 소낭을 이용한 명반응을 균체 외부에서 이루어지도록 하여, 다양한 생화학 반응을 진행할 수 있는 ATP 및 NAD(P)H와 같은 광합성 명반응 산물을 생산하는 에너지 생산 단위체(energy generation unit)로서 상기 광합성 세균과 별도로 분리된 광합성 명반응 수행 단위체를 구성하고자 고안된 것이다.
본 발명에서 광합성이 일어나는 조건이란, 광합성 세균의 명반응을 유도하기 위한 조건으로 적절한 빛(파장과 광도), 온도, 공기 조성을 필요로 하며, 당업자라면 광합성 세균의 구체적 종류에 따라 최적의 조건을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 남세균의 광합성은 약 20 내지 37℃, 혐기 또는 호기 조건, 약 5-500 micro Einstein/m2·s(μmole photons/m2·s)의 광도 그리고 바람직하게는 400-700 nm 파장의 빛이 주어지는 조건에서 수행될 수 있다. 이러한 파장 영역을 충족시키기 위해 형광등과 LED 등을 광원으로 사용할 수 있다. 한 실시 예에서는 남세균의 광합성이 50 micro Einstein/m2·s의 백색광(형광등), 호기, 30℃조건에서 수행된다. 또한 자색 비유황 세균의 광합성은 약 20 내지 37℃, 혐기 또는 미세호기, 약 3-300 Watts/m2의 광도 그리고 바람직하게는 350-1000 nm 파장의 빛이 주어지는 조건에서 수행될 수 있다. 여기서 미세호기 조건이란 산소의 분압이 5% 이내의 농도인 조건으로 정의할 수 있다. 이러한 파장 영역을 충족시키기 위해 백열등과 할로겐등(hallogen lamp) 등을 광원으로 사용할 수 있다. 다른 한 실시 예에서는 자색 비유황 세균의 광합성이 15 Watts/m2의 광, 혐기, 30℃조건에서 수행된다.
남세균의 명반응 기구를 포함하는 틸라코이드 세포막 소낭은 빛에너지를 이용하여 전자를 전달하는 과정에서 막 내외에서의 양성자 농도 구배를 만들고, 이러한 농도 구배에 의한 운동에너지를 동력으로 하여 아데노신 삼인산 합성효소의 작용을 통해 ADP 및 무기인산을 ATP로 전환시키는 능력을 갖는다. 또한 자색 비유황 세균의 광반응 중심체에서는 빛에너지에 의한 광화학 반응이 유도되어 순환식 전자 전달을 유도하게 되며, 역시 이 과정에서 발생하는 양성자의 농도 구배를 그 동력으로 하여 아데노신 삼인산 합성효소가 ATP를 합성하게 된다. 도 1은 분리된 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭에 의한 ATP의 합성 효율을 측정한 결과를 나타낸다. 두 종류의 세포막 소낭에서 모두 빛이 주어지지 않은 암조건에서는 ATP의 합성 속도가 빛이 제공되는 광조건에 비해 그 수준이 낮게 나타났으며, 이러한 결과를 바탕으로 빛이 주어졌을 때 생성되는 ATP의 대부분은 광합성 명반응의 산물인 것으로 판단할 수 있다.
본원에서는 ATP를 명반응을 통해 생산하기 위한 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭의 최적 농도를 확인하였다. 이를 위해 틸라코이드 세포막 소낭의 정량은 클로로필 a (chlorophyll a, Chl a)의 농도를 기준으로 하였으며, 만입 세포막 소낭의 정량은 박테리오클로로필 a (bacteriochlorophyll a, Bchl a)의 농도를 기준으로 하였다.
상기 남세균의 틸라코이드 세포막으로부터 분리된 소낭 내 클로로필 a의 농도는 바람직하게는 1 ㎍ 클로로필 a/㎖ 내지 1 ㎎ 클로로필 a/㎖, 보다 바람직하게는 5 ㎍ 클로로필 a/㎖ 내지 200 ㎍ 클로로필 a/㎖인 것이다. 만약 클로로필 a의 농도가 상기 범위 미만일 경우 광합성이 충분하게 일어나지 못하므로 ATP 및 NAD(P)H의 생산에 있어 낮은 생산속도를 나타내는 문제점이 발생하며, 만약 클로로필 a의 농도가 상기 범위를 초과할 경우 빛의 투과성이 제한되어 ATP 및 NAD(P)H의 생산효율이 더 이상 증가하지 못하고 포화되는 결과로 이어질 수 있다.
또한, 상기 자색비유황세균의 만입 세포막으로부터 분리된 소낭 내 박테리오클로로필 a 의 농도는 바람직하게는 1 ㎍ 박테리오클로로필 a/㎖ 내지 1 ㎎ 박테리오클로로필 a/㎖, 보다 바람직하게는 5 ㎍ 박테리오클로로필 a/㎖ 내지 200 ㎍ 박테리오클로로필 a/㎖인 것이다. 만약 박테리오클로로필 a의 농도가 상기 범위 미만일 경우 광합성이 충분하게 일어나지 못하므로 ATP 및 NAD(P)H의 생산에 있어 낮은 생산속도를 나타내는 문제점이 발생하며, 만약 박테리오클로로필 a의 농도가 상기 범위를 초과할 경우 빛의 투과성이 제한되어 ATP 및 NAD(P)H의 생산효율이 더 이상 증가하지 못하고 포화되는 결과로 이어질 수 있다.
도 2는 상기 방법으로 결정된 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭의 첨가 농도에 따른 ATP의 합성 효율을 나타낸다. 그 결과 두 종류의 세포막 소낭에서 모두 그 첨가 농도의 증가에 따른 ATP의 합성 속도 증가가 관찰되었으며 세포막 소낭의 일정 농도 이상에서 ATP의 합성 속도가 포화되는 것으로 나타났다. 이는 광기구가 빛을 흡수하는 성질이 있어 고농도의 광합성 기구 존재 시 빛의 투과성이 낮아지므로, 적정 농도 이상의 광합성 세포막 소낭의 사용은 비효율적일 수 있음을 의미한다. 물론 빛을 제공하는 조건을 변화시켜 빛에너지를 보다 강하게 조사하면 광합성 세포막 소낭의 최적 사용범위 또한 증가할 것이므로, 당업자라면 연구개발의 목적에 따라 빛에너지를 제공하는 조건을 고려하여 광합성 세포막 소낭의 최적 농도를 결정하여 적용할 수 있을 것이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물은 남세균의 틸라코이드 세포막으로부터 분리된 소낭 및 자색비유황세균의 만입 세포막으로부터 분리된 소낭을 동시에 포함하는 것이다.
틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭은 흡수파장이 서로 달라 한 종류의 소낭이 흡수하지 않는 영역의 빛에너지를 다른 종류의 소낭이 흡수하므로, 두 종류의 광합성 세포막 소낭을 동시에 사용하여 명반응을 유도할 경우 한정된 공간에서 보다 높은 효율로 ATP를 합성할 수 있을 것이다. 도 3은 이러한 예상을 바탕으로 만입 세포막 소낭만을 사용하여 ATP를 생산하는 경우와 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 동시에 사용하여 ATP를 생산하는 경우의 ATP의 합성 효율을 측정한 결과를 나타낸다. 그 결과 두 종류의 광합성 세포막 소낭을 모두 첨가하여 시험한 경우에서 ATP의 합성 효율이 높게 나타났다. 이러한 결과는 두 종류의 광합성 세포막 소낭이 서로 다른 특정 파장의 빛만을 흡수하므로, 한 종류의 광합성 세포막 소낭을 고농도로 사용하기 보다는 두 종류의 광합성 세포막 소낭을 동시에 적용하면 보다 효율적인 ATP 합성이 일어날 수 있다는 사실을 의미한다.
따라서, 본 발명의 조성물이 남세균의 틸라코이드 세포막으로부터 분리된 소낭 및 자색비유황세균의 만입 세포막으로부터 분리된 소낭을 동시에 포함할 경우, 서로 다른 파장대의 빛, 예를 들어, 가시광선 파장대 및 적외선 파장대의 빛을 동시에 흡수하여 최고의 효율로 광합성 명반응 산물을 생산할 수 있다.
틸라코이드 세포막 소낭에서 광합성 과정 중 일어나는 전자의 흐름은 최종적으로 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADP+)을 환원시켜 환원된 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH)을 생성시킨다. 이 때 생성된 NADPH는 막단백질인 피리딘 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소의 작용에 의해 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH)로 전환될 수 있다. 분리된 틸라코이드 세포막 소낭이 빛이 주어지는 조건에서 ATP를 합성하는 활성과 함께 NADH 및 NADPH를 환원시키는 활성을 나타내는 지의 여부를 검증하기 위해 NADH 및 NADPH의 환원 효율을 측정하였다. NADPH의 합성 효율을 측정하기 위해서는 틸라코이드 세포막 소낭이 존재하는 반응 용액에 NADP+만을 첨가하였으나, NADH의 합성 효율을 측정하기 위해서는 틸라코이드 세포막 소낭이 존재하는 반응 용액에 NAD+ 및 NADP+를 모두 첨가하여 시험하였다. 도 4는 빛을 조사하면서 결정된 틸라코이드 세포막 소낭에 의한 NADH 및 NADPH의 합성 효율을 나타낸다. 그 결과 암조건에서의 NADH 및 NADPH의 합성 속도는 모두 광조건에 비해 현저하게 낮게 나타났으며, 이러한 결과로부터 생성된 NADH 및 NADPH의 대부분은 빛을 이용한 광합성 명반응의 산물이라는 사실을 알 수 있다. 도 4에서 NADPH의 생성 효율이 NADH에 비해 높게 나타나므로, 틸라코이드 세포막 소낭만으로 명반응 단위체를 구성할 경우 ATP 및 NADPH를 소모하는 생합성 반응을 유도하는데 가장 적절하게 적용될 수 있을 것이다. 물론 틸라코이드 세포막 소낭의 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소의 작용에 의해 NADH 또한 생성될 수 있으므로, 상기 효소의 활성을 높이는 다양한 추가적인 노력을 통해 NADH 생산 효율을 증진시키는 방법도 가능할 것이다.
만입 세포막에서는 틸라코이드 세포막과는 달리 광합성 과정에서 NADH를 주로 생산하는 것으로 알려져 있다. 그리고 이 때 생성된 NADH는 막단백질인 피리딘 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소의 작용에 의해 NADPH로 전환될 수 있다. 분리된 만입 세포막 소낭이 빛이 주어지는 조건에서 ATP를 합성하는 활성만을 갖는 것이 아니라 NADH 및 NADPH를 환원시키는 활성을 나타내는 지의 여부를 확인하기 위해 NADH 및 NADPH의 환원 효율을 시험하였다. NADH의 합성 효율을 측정하기 위해서는 숙신산과 NAD+만을 반응 용액에 첨가하였으나, NADPH의 합성 효율을 측정하기 위해서는 숙신산, NAD+ 및 NADP+를 모두 첨가하였다. 도 5는 만입 세포막 소낭에 의한 NADH 및 NADPH의 합성 효율을 측정한 결과를 나타낸다. 암조건에서의 NADH 및 NADPH의 합성 속도는 광조건에서의 결과에 비해 현저하게 낮게 나타났으며, 따라서 생성된 NADH 및 NADPH의 대부분은 빛을 이용한 광합성 명반응의 산물인 것을 알 수 있다. 만입 세포막 소낭에서는 예상과 같이 NADH의 생성 효율이 NADPH에 비해 상대적으로 높게 나타났으며, 따라서 만입 세포막 소낭만으로 명반응 단위체를 구성할 경우 ATP 및 NADH를 소모하는 생합성 반응을 유도하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
하지만, 만입 세포막 소낭이 NAD(P)H를 생성하는 과정에서 그 전자공여체로서 숙신산의 사용이 요구되므로, 외부 물질의 투입 없이 수용액상의 물로부터 전자를 얻어 지속적으로 NAD(P)H를 생산할 수 있는 틸라코이드 세포막 소낭의 능력과 대비된다. 따라서 ATP의 합성을 위해서는 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭 모두 큰 차이점 없이 사용될 수 있으나, NAD(P)H의 생산을 위해서는 틸라코이드 세포막 소낭을 적용하는 방법이 보다 효율적일 구성이 될 수 있다. 다만 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭은 흡수파장이 서로 달라 두 종류의 광합성 특이적 세포막 소낭을 동시에 사용하여 명반응을 유도하면 한정된 공간에서 보다 높은 효율을 나타낼 수 있으므로, 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 동시 구성하는 대신 반응액에 숙신산을 첨가하지 않을 경우, 틸라코이드 세포막 소낭은 ATP 및 NAD(P)H를 생산하게 되고 만입 세포막 소낭은 ATP만을 생성하게 될 것이다. 따라서 당업자라면 본원에서 제공하는 정보를 바탕으로 연구개발의 목적에 따라 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 각각 적용하여 구성하거나, 또는 상기 두 종류의 광합성 특이적 세포막 소낭을 동시에 첨가하는 구성이 가능할 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 광합성 명반응 산물 생산용 조성물을 포함하는 광합성 명반응 수행 단위체를 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "광합성 명반응 수행 단위체"는 상기 광합성 세균의 세포막으로부터 분리된 소낭, 바람직하게는 틸라코이드 세포막 소낭 및 만입 세포막 소낭으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 분리된 소낭을 함유하는 조성물을 포함하는 상기 광합성 세균과 별도로 광합성 명반응을 수행할 수 있는 기구 또는 장치의 하나의 구성 단위(unit)를 의미한다. 상기 단위체는 틸라코이드 세포막 소낭 1개 또는 만입 세포막 소낭 1개만을 포함하여 구성될 수 있으며, 상기 틸라코이드 세포막 소낭 및 만입 세포막 소낭의 조합으로 구성될 수도 있다. 또한 다양한 종류의 광합성 세균으로부터 분리된 여러가지 종류의 소낭이 모여 하나의 단위체를 구성할 수도 있다. 이러한 단위체들이 모일 경우 하나의 큰 집합체를 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 광합성 세균 세포막으로부터 분리된 소낭을 이용한 광합성 명반응 산물의 생산 방법에 관한 것이다:
a) 광합성 세균, 바람직하게는 남세균의 틸라코이드 세포막 및 자색비유황세균의 만입 세포막으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 세포막으로부터 소낭을 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 소낭을 포함하는 광합성 명반응 단위체를 구성하는 단계; 및
c) 상기 광합성 명반응 단위체에 빛을 조사하여 광합성 명반응 산물을 생산하는 단계.
상기 광합성 명반응 수행 단위체는 수득된 세포막 소낭을 단순하게 수용액 용액에 유리하여 제조할 수도 있으나, 이와 같은 방법은 일시적인 효과를 나타내는데 지나지 않을 수 있다. 상기와 같은 방법으로 진행 시 반응 용액 내에 해당 생산물이 축적될 수 있고 이를 회수하는 과정에서 명반응 단위체가 포함하는 소낭의 구조 및 기능이 손상될 수 있으므로 가장 바람직한 구성이 될 수 없다. 따라서 수득한 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 각각 또는 함께 구성하기 위해 그 공극 크기(pore size)가 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭에 비해 작은 투석막(dialysis membrane)이나 필터막(filter membrane) 등 다양한 종류와 형태의 막을 적용할 경우 상기 소낭보다 크기가 작은 광합성 명반응 산물이 상기 투석막이나 필터막 공극으로 투과하여, 소낭의 구조 및 기능의 손상없이 상기 광합성 명반응 산물을 수득할 수 있다. 상기 남세균의 틸라코이드 세포막으로부터 분리된 소낭 및 자색비유황세균의 만입 세포막으로부터 분리된 소낭은 직경이 바람직하게는 1 내지 500 ㎚, 보다 바람직하게는 10 내지 200 ㎚이므로 이보다 공극 크기가 작은 투석막이나 필터막 등이 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 기둥(column) 형태의 반응조를 구성할 경우 평면형태의 막을 적용할 수 있으며, 3차원적 반응조를 구성할 경우 역시 공간형태의 막을 적용할 수 있다. 또한 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 각각 또는 함께 구성하여 명반응 단위체를 제조하기 위해서는 플라스틱이나 비닐 등의 화학물질 경화과정과 더불어 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 그 내부에 고정하여 명반응 단위체를 제조하는 나노 단위의 격자구조를 이용한 구성이 가능할 수 있다. 아울러 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭의 표면에 존재하는 지질이나 막단백질 중 하나 이상과 결합이 가능한 물질을 반응조 구성 시 특정 부분의 표면에 부착시킴으로서 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 고정하여 명반응 단위체를 제조하는 구성이 가능할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 광합성 세균의 세포막으로부터 소낭을 분리하는 단계를 포함하는 광합성 명반응 단위체의 제조 방법을 제공한다.
상기 소낭의 분리 단계는 상기 광합성 세균을 파쇄하는 단계 및 상기 파쇄된 파쇄물로부터 소낭을 분리하는 단계를 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명에서 배양된 광합성 세균으로부터 틸라코이드 세포막 소낭과 만입세포막 소낭을 분리하기 위해 세포를 파쇄하는 방법에는 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 광합성 특이적 세포막의 손상을 최소화 하는 물리적인 방법을 사용하는 것이 좋다. 그 구체적인 방법으로는 유리 알갱이(glass bead)의 강한 혼합에 의한 파쇄법, 초음파를 이용한 파쇄법(sonication), 그리고 고압력 사출을 이용한 파쇄법(French Press 사용)이 바람직하다. 반면 SDS 등의 세제(detergent) 또는 클로로포름(chloroform) 등의 유기용매를 사용하여 세포를 파쇄하는 화학적인 방법은 세포막 구조 및 기능의 손상을 야기할 수 있으므로 바람직하지 못하다.
본 발명에서 광합성 세균을 파쇄한 이후 틸라코이드 세포막 소낭과 만입세포막 소낭을 분리하는 방법으로 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 서당 농도구배(sucrose density gradient)를 이용한 원심분리법(centrifugation)을 사용할 수 있으며, 이 방법은 광합성 특이적 세포막의 비중에 따른 분리를 유도한다. 또한 틸라코이드 세포막 소낭과 만입세포막 소낭은 1-500 nm 범위의 직경을 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 10-200 nm 범위의 직경을 가지므로, 이 범위보다 그 공극 크기(pore size)가 크거나 작은 다양한 종류와 형태의 막(membrane)을 사용하는 크기에 따른 분리법 또한 유용한 대안이 될 수 있다.
서당 농도구배를 이용한 원심분리법을 사용할 경우, 상기 서당 농도는 5 내지 50%, 틸라코이드 세포막 소낭의 경우 바람직하게는 10 내지 50%, 만입세포막 소낭의 경우 바람직하게는 5 내지 35%의 서당 농도구배하에서 원심분리를 수행한다. 상기 농도 범위 미만의 경우에서는 광합성 세포막 소낭의 비중보다 서당의 비중이 낮아 원심분리가 일어나지 않는 문제가 발생할 수 있으며, 상기 범위를 초과할 경우에는 그 비중이 너무 높아 역시 원심분리가 일어나지 않는 문제가 발생될 수 있다.
상기 서당 농도구배하에 원심분리는 50,000 내지 500,000 g의 힘으로 20분 내지 24 시간 수행하는 것이 좋으며, 틸라코이드 세포막 소낭의 경우 바람직하게는 100,000 내지 400,000 g의 힘으로 1 내지 20 시간, 만입세포막 소낭의 경우 바람직하게는 60,000 내지 200,000 g의 힘으로 30분 내지 10 시간 수행한다. 상기 범위 미만의 경우에서는 일반 세포막과 광합성 세포막 소낭이 모두 상층액의 상단에 존재하여 서로 분리되지 않는 문제가 발생할 수 있으며, 상기 범위를 초과할 경우에는 일반 세포막과 광합성 세포막 소낭이 모두 침전되어 서로 분리되지 않는 문제가 발생될 수 있다.
의약품, 건강보조 식품, 화장품 원료 등 고부가가치 생체유래 소재를 생체에서 분리하여 정제할 경우 그 비용이 매우 높은 경우가 많다. 따라서 이러한 유용물질들을 그 합성 효소 및 전구체를 사용하여 시험관 내에서 직접 제조하려는 공정 개발의 노력이 있어왔다. 그러나 다양한 효소 반응은 그 에너지원으로서 주로 ATP 또는 NAD(P)H를 요구하게 되나 화학적으로 합성하여 사용하는 경우는 물론, 기존에 알려진 효소를 이용하여 ADP 및 NAD(P)+로부터 ATP 및 NAD(P)H를 재생하는 경우에도 에너지 근원이 되는 기질을 계속 공급해야 하므로 이들 물질을 이용한 공정 개발에는 큰 비용이 요구된다는 문제점이 있었다. 본 발명이 제공하는 ATP 및 NAD(P)H 생산방법은 종래의 방법들과는 달리 빛 조사 조건하에서 광합성 세균 세포막 소낭을 이용하여 지속적으로 ATP 및 NAD(P)H를 제공할 수 있으며, 그 과정에서 물 이외에는 추가적인 전자공여체가 필요하지 않으므로 ATP 또는 NAD(P)H의 경제적인 생산이 가능하다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 광합성 세균 세포막으로부터 분리된 소낭을 함유하는 광합성 명반응 산물 생산용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 광합성 명반응 산물의 생산 방법을 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 광합성 세균의 세포막으로부터 소낭을 분리하는 단계를 포함하는 광합성 명반응 단위체의 제조 방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명에 따른 조성물을 이용하면 빛 조사 조건하에서 광합성 세균 세포막 소낭을 이용하여 지속적으로 광합성 명반응 산물을 제공할 수 있으며, 다른 파장의 빛을 흡수하는 다른 기원의 소낭을 조합하여 광합성 명반응 단위체를 구성할 경우 상기 광합성 명반응 산물의 생산량을 극대화할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 광합성 명반응 산물의 생산 방법은 물 이외에는 추가적인 전자공여체가 필요하지 않으므로 ATP 또는 NAD(P)H의 경제적인 생산이 가능하다.
도 1은 틸라코이드 세포막(TM) 소낭 또는 만입 세포막(ICM) 소낭을 이용하여 빛을 조사한 조건(light)과 빛을 조사하지 않은 조건(dark)에서 아데노신 삼인산(ATP)의 생성 정도를 시험한 결과를 나타낸다. 각 조건에서 ATP의 생산 속도는 nmole/min·mg protein의 값으로 나타내었다.
도 2는 틸라코이드 세포막(TM) 소낭 또는 만입 세포막(ICM) 소낭을 농도별로 사용하여 빛을 조사한 조건(light)과 그렇지 않은 조건(dark)에서 아데노신 삼인산(ATP)의 생산 속도를 시험한 결과를 나타낸다. 위의 도면은 틸라코이드 세포막 소낭에 의한 ATP의 생산 속도를, 아래의 도면은 만입 세포막 소낭에 의한 ATP의 생산 속도를 각각 나타낸다. 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭의 농도는 각각 클로로필 a(Chl a) 및 박테리오클로로필 a(Bchl a)의 농도를 기준으로 결정하였다. 각 농도 조건에서의 ATP의 생산 속도를 nmole/min으로 나타내었다.
도 3은 흡수파장이 서로 다른 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 동시에 사용하여 아데노신 삼인산(ATP)의 생산 효율을 증진시킨 결과를 나타낸다. 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭의 농도는 각각 클로로필 a(Chl a) 및 박테리오클로로필 a(Bchl a)의 농도를 기준으로 결정하였다. 틸라코이드 세포막(TM) 소낭을 사용하지 않거나 그 사용량을 40 ㎍ Chl a/㎖의 농도로 고정한 두 가지 조건에서 만입 세포막(ICM) 소낭을 농도별로 조합한 후 넓은 파장의 빛을 방출하는 백열등을 15 Watts/m2의 세기로 조사하면서 ATP의 생산 속도를 측정하여 그 값을 nmole/min으로 나타내었다.
도 4는 틸라코이드 세포막 소낭을 이용하여 빛을 조사한 조건(light)과 그렇지 않은 조건(dark)에서 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD+) 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADP+)을 환원시키는 효율을 측정한 결과를 나타낸다. NADH 및 NADPH의 생산 속도는 nmole/min·mg protein의 값으로 나타내었다.
도 5는 만입 세포막 소낭을 이용하여 빛을 조사한 조건(light)과 그렇지 않은 조건(dark)에서 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD+) 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADP+)을 환원시키는 효율을 측정한 결과를 나타낸다. NADH 및 NADPH의 생산 속도는 nmole/min·mg protein의 값으로 나타내었다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 남세균의 틸라코이드 세포막 소낭 분리
남세균의 명반응 기구를 포함하는 틸라코이드 세포막 소낭을 분리하기 위해 시네코시스티스(Synechocystis) sp. PCC 6803을 대상 균주로 사용하였다. 상기 균주의 성장을 위하여 그 조성이 일부 변형된 BG11 최소배지[18 mM 질산나트륨(NaNO3), 0.23 mM 인산일수소칼륨(K2HPO4), 0.30 mM 황산마그네슘(MgSO47H2O), 0.24 mM 염화칼슘(CaCl22H2O), 31 μM 구연산(citric acid), 23 μM 구연산철암모늄(ferric ammonium citrate), 0.19 mM 탄산나트륨(Na2CO3), 8.8 mM 티오황산나트륨(sodium thiosulfate), 46 μM 붕산(H3BO3), 14 μM 염화망간(MnCl2), 0.77 μM 황산아연(ZnSO47H2O), 1.6 μM 몰리브덴산나트륨(Na2MoO42H2O), 0.32 μM 황산동(CuSO45H2O), 0.17 μM 질산코발트(II)(Co(NO3)26H2O) (Cratz and Myers. 1955. Am. J. bot. 42: 282-287)]를 사용하였으며, 여기에 균주의 빠른 성장을 위해 필터로 멸균된 포도당(glucose)을 10 mM이 되도록 첨가하였다. 시네코시스티스 균주를 300 ml 용량의 플라스크에 50 ml의 BG11 최소배지를 넣어준 후 접종하여 100 rpm(resolution per minute)으로 진탕 배양하며 30℃의 호기성 조건에서 성장시켰으며, 이때의 광도는 약 50 micro Einstein/m2·s가 되도록 형광등의 백색광을 사용하였다. 균주의 600 nm에서의 흡광도가 약 1.0이 되었을 때, 1 liter 용량의 플라스크에 500 ml의 BG11 최소배지를 넣어준 후 균주를 다시 접종하여 상기 성장조건에서 균주의 600 nm에서의 흡광도가 약 2.0이 되도록 배양하였다.
남세균을 상기 광합성 조건에서 배양한 후 세포를 약 7,000 g의 힘으로 4℃에서 10분간 원심분리를 수행하여 수득하였으며, 수득된 균체는 1 mM의 EDTA를 함유하는 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 버퍼 약 10 ml을 이용하여 용해시켰고 얼음물에 넣어 유지하였다. 용해된 세포를 파쇄하기 위해 유리 알갱이(glass bead)를 사용하였는데, 유리 알갱이를 세포가 녹아있는 버퍼 용액에 가득 차도록 넣어준 후 2분간 5회(총 10분)동안 강하게 흔들어주어 세포를 파쇄하였다. 이후 파쇄되지 않은 세포, 큰 세포조각 및 유리 알갱이는 약 3,000 g의 힘으로 4℃에서 10분간 원심분리를 수행하여 제거하였다. 이 때 얻어진 상층액(supernatant)은 다양한 수용성 세포구성 물질 및 세포막(소낭 포함)을 포함하는데, 전체 세포막을 수득하기 위해 100,000 g의 힘으로 30분 동안 원심분리를 수행하였다. 이후 전체 세포막 중 틸라코이드 세포막 소낭을 순수 분리하기 위해 10-50%의 서당 농도구배(sucrose density gradient)하에서 130,000 g의 힘으로 15시간 동안 원심분리를 수행하였다. 이후 분리되어 나타난 여러 층 중에서 38-42%의 서당 농도에 해당하는 부분을 수득하였고, 이를 다시 187,000 g의 힘으로 45분 동안 원심분리 하여 농축하였다. 상기 원심분리 후 바닥으로 떨어진 세포막 소낭은 0.25 M의 서당을 함유하는 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 버퍼에 녹인 후 dextran T-500 및 PEG 3350을 사용하는 층 분리법(phase partitioning, Norling et al. 1998. FEBS Lett. 436: 189-192)을 수행하여, 하부로부터 5번째 및 6번째 층으로부터 남세균의 틸라코이드 세포막 소낭이 존재하여 녹색을 나타내는 부분을 수득하여 사용하였다.
실시예 2: 자색비유황세균의 만입 세포막 소낭 분리
자색비유황세균의 명반응 기구를 포함하는 만입 세포막 소낭을 분리하기 위해 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 2.4.1 (ATCC BAA-808, Cohen-Bazire et al. 1956. J. Cell. Comp. Physiol. 49: 25-68)을 대상 균주로 사용하였으며, 이 균주의 성장을 위하여 시스트롬 최소배지[20 mM 인산이수소칼륨(KH2PO4), 3.8 mM 황산암모늄((NH4)2SO4), 34 mM 숙신산(succinate), 0.59 mM L-글루탐산(L-glutamate), 0.30 mM L-아스파르트산(L-aspartate), 8.5 mM 염화나트륨, 1.05 mM 니트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid), 1.2 mM 염화마그네슘(MgCl26H2O), 0.23 mM 염화칼슘(CaCl27H2O), 25 μM 황산제일철(FeSO47H2O), 0.16 μM 몰리브덴산암모늄((NH4)6Mo7O244H2O), 4.7 μM EDTA, 38 μM 황산아연(ZnSO47H2O), 9.1 μM 황산망간(MnSO4H2O), 1.6 μM 황산동(CuSO45H2O), 0.85 μM 질산코발트(II)(Co(NO3)26H2O), 1.8 μM 붕산(H3BO3), 8.1 μM 니코틴산, 1.5 μM 티아민염산염, 41 nM 비오틴(biotin) (Sistrom. 1962. J. Gen. Microbiol. 28: 607-616)]를 사용하였다. 로도박터 스페로이데스 균주를 300 ml 용량의 플라스크에 30 ml의 시스트롬 최소배지를 넣어준 후 접종하여 250 rpm으로 진탕 배양하며 30℃의 호기성 조건에서 성장시켰다. 균주의 660 nm에서의 흡광도가 약 1.0이 되었을 때, 1 liter 용량의 투명 용기에 산소가 들어가지 않도록 시스트롬 최소배지를 가득 채우고 균주를 접종하여 15 Watts/m2 광도의 백열등 빛이 주어지는 혐기 조건에서 균주의 660 nm에서의 흡광도가 약 2.0이 되도록 배양하였다.
상기 광합성 조건에서 배양된 로도박터 스페로이데스 세포는 약 7,000 g의 힘으로 4℃에서 10분간 원심분리를 수행하여 수득하였으며, 수득된 균체는 1 mM의 EDTA를 함유하는 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 버퍼 약 10 ml을 이용하여 용해시켰고 얼음물에 넣어 유지하였다. 용해된 세포를 파쇄하기 위해 5분씩 4회(총 20분)동안 초음파를 이용한 세포파쇄법(sonication)을 수행하였다. 이후 파쇄되지 않은 세포 및 큰 세포조각은 약 10,000 g의 힘으로 4℃에서 30분간 원심분리를 수행하여 제거하였다. 이 때 얻어진 상층액은 다양한 수용성 세포구성 물질 및 세포막(소낭 포함)을 포함하는데, 만입 세포막을 순수 분리하기 위해 5-35%의 서당 농도구배하에서 96,000 g의 힘으로 4시간 동안 원심분리를 수행하였다. 이후 분리되어 나타난 여러 층 중에서 로도박터 스페로이데스의 광합성 기구가 함유된 만입 세포막 소낭이 존재하여 갈색을 나타내는 부분을 수득하여 사용하였다.
실시예 3: 상기 광합성 세포막 소낭을 이용한 아데노신 삼인산의 생성 확인
남세균의 명반응 기구를 포함하는 틸라코이드 세포막 소낭은 빛이 주어지는 조건에서 물로부터 나온 전자를 전달하는 과정에서 양성자를 이동시켜 막 내외에서의 양성자 농도 구배를 만들고, 이러한 농도 구배에 의한 운동에너지를 동력으로 하여 아데노신 삼인산 합성효소의 작용을 통해 ADP 및 무기인산을 ATP로 전환시킨다. 이와 유사하게 로도박터 스페로이데스의 광반응 중심체에서는 빛에너지에 의한 광화학 반응이 유도되어 순환식 전자 전달을 유도하게 되며, 이 과정에서 발생하는 양성자의 농도 구배를 그 동력으로 하여 아데노신 삼인산 합성효소가 작용하여 ATP를 합성하게 된다. 따라서 본 실시 예에서는 분리된 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭이 빛이 주어지는 조건에서 명반응을 수행하는 활성을 나타내는 지의 여부를 확인하기 위해 ATP의 합성 효율을 시험하였다. ATP의 생성 효율은 ATP를 선택적으로 검출할 수 있는 다양한 방법(주로 ATP를 소모하며 그 동력으로 투명한 기질을 전환시키는 효소 반응을 사용하여 특정 파장에 대한 흡광도 또는 형광을 갖는 최종생산물의 생성을 유도하고 이를 측정함으로 ATP를 정량하는 방법이 사용됨)에 의해 측정될 수 있으므로 당업자라면 연구개발의 목적에 따라 최적의 방법을 결정할 수 있을 것이나, 본 실시 예에서는 ATP를 정량적으로 측정하는 방법으로서 ATP 측정 kit(BioVision)을 사용하였다.
반응을 위해 50 mM 농도의 PBS 버퍼(phosphate buffered saline, pH 7.4)를 사용하였고, 기질로서는 ADP를 1mM의 농도가 되도록 첨가한 30℃ 조건에서 반응을 진행하였다. 사용한 틸라코이드 세포막 소낭과 만입세포막 소낭이 함유하는 단백질의 수준을 정량하여 그 단백질 농도를 결정하였으며, 여러 번의 ATP 생산속도 측정값은 두 종류의 세포막 소낭이 함유한 단백질의 농도 값으로 표준화 하였다. ATP의 합성 정도는 570 nm에서의 흡광도의 변화를 통해 측정하였으며, 알고 있는 다양한 농도의 ATP를 사용하여 동일한 실험을 진행하여 표준 곡선(standard curve)를 제작하였고, 측정된 흡광도 값을 ATP의 생성량으로 전환시킬 수 있었다. 이렇게 결정된 ATP의 생성량을 시간에 따른 값으로 나타내어 ATP의 생산 속도를 단위 단백질 및 분당 생성되는 ATP의 nmole 값으로 표현하였다. 도 1은 상기 방법으로 결정된 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭에 의한 ATP의 합성 효율을 나타낸다. 두 종류의 세포막 소낭 모두 빛이 주어지지 않은 암조건에서의 ATP의 합성 속도는 빛이 제공되는 광조건에 비해 현저하게 낮게 나타났으며, 이는 본 실시 예에서 생성된 ATP의 대부분은 빛을 이용한 광합성 명반응의 산물인 것으로 판단할 수 있다. 본 실시 예에서 틸라코이드 세포막 소낭의 ATP 합성 효율을 측정하기 위해서 50 micro Einstein/m2·s 광도의 형광등 빛을 사용하였으며, 만입 세포막 소낭의 ATP 합성 효율을 측정하기 위해서는 15 Watts/m2 광도의 백열등 빛을 사용하였다.
실시예 4: 상기 광합성 세포막 소낭의 농도에 따른 아데노신 삼인산 생성효율 시험
ATP를 명반응을 통해 생산하기 위한 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭의 최적 농도를 확인하고자 하였다. 이를 위해 분리된 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 다양한 농도로 첨가하여 준 후 실시 예 3에서와 같은 방법으로 ATP의 합성 속도를 측정하였다. 본 실시 예에서 틸라코이드 세포막 소낭의 정량은 클로로필 a (chlorophyll a)의 농도를 기준으로 하였으며, 만입 세포막 소낭의 정량은 박테리오클로로필 a (bacteriochlorophyll a)의 농도를 기준으로 하였다. 분리된 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭의 일부를 아세톤:메탄올(acetone:methanol, 7:2) 혼합 용매로 추출하면, 세포막 소낭으로부터 색소인 클로로필 a 또는 박테리오클로로필 a를 추출할 수 있다. 이 때 약 660 nm의 파장에서 측정되는 클로로필 a와 약 780 nm의 파장에서 측정되는 박테리오클로로필 a의 흡광도를 측정한 후, 이미 알고 있는 농도의 클로로필 a 또는 박테리오클로로필 a를 측정하여 제작한 표준 곡선에 대입함으로서 분리된 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭의 농도를 정량하였다.
도 2는 상기 방법으로 결정된 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭의 첨가 농도에 따른 ATP의 합성 효율을 나타낸다. 그 결과 두 종류의 세포막 소낭에서 모두 광조건에서 그 첨가 농도의 증가에 따른 ATP의 합성 속도 증가가 관찰하였으며, 암조건에서는 ATP의 합성 정도가 낮게 나타났다. 틸라코이드 세포막 소낭에서는 약 80 μg 클로로필 a/ml의 농도에서 ATP의 합성 속도가 포화되었으며, 만입 세포막 소낭의 경우에도 유사하게 약 100 μg 박테리오클로로필 a/ml의 농도에서 ATP의 합성 속도가 포화되는 것으로 나타났다. 이는 고농도의 광기구 존재 시 광기구가 빛을 흡수하여 빛의 투과성이 낮아지므로, 적정 농도 이상의 광합성 세포막 소낭의 사용은 비효율적일 수 있음을 의미한다. 물론 빛을 제공하는 조건을 변화시켜 빛에너지를 보다 강하게 조사하면 광합성 세포막 소낭 첨가의 최적 농도 범위 또한 커질 것이므로, 당업자라면 연구개발의 목적에 따라 빛에너지를 제공하는 조건을 고려하여 광합성 세포막 소낭의 사용 농도를 결정할 수 있을 것이다.
실시예 5: 흡수파장이 서로 다른 두 종류의 광합성 세포막 소낭을 이용한 아데노신 삼인산 생성효율 시험
틸라코이드 세포막 소낭은 660 nm의 파장 주변과 보다 짧은 단파장을 흡수하는 반면, 만입 세포막 소낭은 직접적으로는 800-900 nm 범위 파장의 빛에너지를 광합성에 이용한다. 따라서 이 두 종류의 광합성 세포막 소낭을 동시에 사용하여 명반응을 유도할 경우, 흡수파장이 서로 다른 부분의 빛에너지를 흡수하지 않아 서로의 광합성 효율에 영향을 미치지 않을 것이므로, 한정된 공간에서 보다 높은 효율로 ATP를 합성할 수 있을 것으로 예상되었다. 이를 확인하기 위해 분리된 틸라코이드 세포막 소낭의 농도를 고정한 상태에서 만입 세포막 소낭을 다양한 농도로 첨가하여 준 후 실시 예 3에서와 같은 방법으로 ATP의 합성 속도를 측정하였다. 두 종류의 광합성 세포막 소낭의 ATP 합성 효율을 동시에 측정하기 위해서 광원의 파장 범위가 보다 넓은 백열등 빛을 15 Watts/m2의 세기로 사용하였다. 도 3은 이러한 예상을 바탕으로 틸라코이드 세포막 소낭만을 사용하여 ATP를 생산하는 경우와 틸라코이드 세포막 소낭과 만입 세포막 소낭을 동시에 사용하여 ATP를 생산하는 경우의 ATP의 합성 효율을 측정한 결과를 나타낸다. 만입 세포막 소낭의 농도가 60-80 μg 박테리오클로로필 a/ml의 농도를 넘어서는 조건에서부터는 첨가된 광기구의 농도에 따라 ATP의 합성 속도가 더 이상 증가하지 않아 그 값이 포화되었으나, ATP의 합성 속도가 포화되지 않은 낮은 농도의 첨가 조건에서 뿐만 아니라 포화 조건의 농도에서 모두 두 종류의 광합성 세포막 소낭을 첨가하여 시험한 경우에서 ATP의 합성 효율이 보다 높게 나타났다. 이러한 결과는 두 종류의 광합성 세포막 소낭이 서로 다른 특정 파장의 빛만을 흡수하므로, 한 종류의 광합성 세포막 소낭을 고농도로 사용하여 ATP의 합성 속도가 포화되는 현상을 지양하고, 두 종류의 광합성 세포막 소낭을 동시에 적용하면 보다 효율적인 ATP 합성이 일어날 수 있다는 사실을 의미한다.
실시예 6: 틸라코이드 세포막 소낭을 이용한 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 (인산)의 환원 시험
틸라코이드 세포막 소낭에서 빛의 존재 시 일어나는 전자의 흐름은 페레독신으로 전달되고 최종적으로 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADP+)을 환원시켜 환원된 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH)을 생성시킨다. 이 때 생성된 NADPH는 세포막 소낭에 존재하는 것으로 추정되는 피리딘 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소의 작용에 의해 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH)로 전환될 수 있다. 이러한 환원된 NADH 및 NADPH는 생체 내의 다양한 생합성 반응에 필수적으로 요구되므로, ATP와 함께 광합성 명반응의 주요한 산물이 된다. 따라서 본 실시 예에서는 분리된 틸라코이드 세포막 소낭이 빛이 주어지는 조건에서 ATP를 합성하는 활성만을 갖는 것이 아니라 NADH 및 NADPH를 환원시키는 활성을 나타내는 지의 여부를 확인하기 위해 NADH 및 NADPH의 환원 효율을 시험하였다. NADH 및 NADPH의 환원 효율은 두 물질을 선택적으로 검출할 수 있는 다양한 방법(주로 NADH 및 NADPH를 산화시키며 그 동력으로 투명한 기질을 전환시키는 효소 반응을 사용하여 특정 파장에 대한 흡광도 또는 형광을 갖는 최종생산물의 생성을 유도하고 이를 측정함으로 NADH 및 NADPH를 정량하는 방법이 사용됨)에 의해 측정될 수 있으므로 당업자라면 연구개발의 목적에 따라 최적의 방법을 결정할 수 있을 것이나, 본 실시 예에서는 NADH 및 NADPH를 정량적으로 측정하는 방법으로서 NADH 측정 kit(BioVision) 및 NADPH 측정 kit(BioVision)을 각각 사용하였다. 두 종류의 kit은 각각 NADH 및 NADPH를 선택적으로 측정하는데 사용되었다.
반응을 위해 50 mM 농도의 PBS 버퍼(phosphate buffered saline, pH 7.4)를 사용하였고, 기질로서는 1mM NAD+ 및 1mM NADP+가 첨가된 용액을 사용하여 30℃ 조건에서 반응을 진행하였다. NADPH의 합성 효율을 측정하기 위해서는 NADP+만을 반응 용액에 첨가하였으나, NADH의 합성 효율을 측정하기 위해서는 NAD+ 및 NADP+를 모두 첨가하였다. 사용한 틸라코이드 세포막 소낭이 함유하는 단백질의 정량을 통해 그 단백질 농도를 결정하였으며, 여러 번의 측정값은 틸라코이드 세포막 소낭이 함유한 단백질의 농도 값으로 표준화 하였다. NADH 및 NADPH의 합성 정도는 450 nm에서의 흡광도의 변화를 통해 측정하였으며, 알고 있는 다양한 농도의 NADH 및 NADPH를 각각 사용하여 동일한 실험을 진행하여 표준 곡선을 제작하였고, 측정된 흡광도 값을 각각 NADH 및 NADPH의 생성량으로 전환시킬 수 있었다. 이렇게 결정된 NADH 및 NADPH의 생성량을 시간에 따른 값으로 나타내어 NADH 및 NADPH의 생산 속도를 분당 생성되는 NADH 및 NADPH의 nmole 값으로 표현하였다. 도 4는 50 micro Einstein/m2·s 광도의 형광등 빛을 조사하면서 상기 방법으로 결정된 틸라코이드 세포막 소낭에 의한 NADH 및 NADPH의 합성 효율을 나타낸다. 그 결과 빛이 주어지지 않은 암조건에서의 NADH 및 NADPH의 합성 속도는 빛이 제공되는 광조건에 비해 현저하게 낮게 나타났으며, 이는 본 실시 예에서 생성된 NADH 및 NADPH의 대부분은 빛을 이용한 광합성 명반응의 산물인 것으로 판단할 수 있다. 결과적으로 NADPH의 생성 효율이 NADH에 비해 상대적으로 높게 나타났으며, 따라서 틸라코이드 세포막 소낭을 사용하여 명반응 산물을 생성시키는 방법은 ATP 또는 NADPH를 소모하는 생합성 반응을 유도하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 다만 도 4의 결과에서 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소의 작용에 의해 상당한 수준의 NADH 또한 생성된다는 사실 또한 확인되었으므로, 틸라코이드 세포막 소낭에 존재하는 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소의 이러한 활성을 이용하여 NADH를 소모하는 생합성 반응을 유도하는 용법으로도 적용될 수 있을 것이다.
실시예 7: 만입 세포막 소낭을 이용한 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 (인산)의 환원 시험
만입 세포막 소낭에서 ATP의 생성을 위한 광인산화 과정과는 달리 역전자 전달이 일어나면 복합체 II인 숙신산 탈수소효소의 작용에 의해 숙신산이 푸마르산으로 전환되며 복합체 I에서 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD+)를 환원시켜 환원된 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH)을 생성시키게 된다. 이 때 생성된 NADH는 산소발생 광합성에서와 마찬가지로 피리딘 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소의 작용에 의해 NADPH로 전환될 수 있다. 따라서 본 실시 예에서는 분리된 만입 세포막 소낭이 빛이 주어지는 조건에서 ATP를 합성하는 활성만을 갖는 것이 아니라 NADH 및 NADPH를 환원시키는 활성을 나타내는 지의 여부를 확인하기 위해 NADH 및 NADPH의 환원 효율을 실시 예 6에서 제시한 방법에 따라 시험하였다.
반응을 위해 50 mM 농도의 PBS 버퍼(pH 7.4)를 사용하였고, 기질로서는 1 mM NAD+ 및 1 mM NADP+가 첨가된 용액을 사용하여 30℃ 조건에서 반응을 진행하였다. 여기에 실시 예 6에서와는 달리 전자 공여체로서 5 mM의 숙신산을 추가로 첨가시켰다. NADH의 합성 효율을 측정하기 위해서는 숙신산과 NAD+만을 반응 용액에 첨가하였으나, NADPH의 합성 효율을 측정하기 위해서는 숙신산, NAD+ 및 NADP+를 모두 첨가하였다. 사용한 만입 세포막 소낭이 함유하는 단백질의 정량을 통해 그 단백질 농도를 결정하였으며, 여러 번의 측정값은 만입 세포막 소낭이 함유한 단백질의 농도 값으로 표준화 하였다. 도 5는 15 Watts/m2 광도의 백열등 빛을 조사하면서 상기 방법으로 결정된 만입 세포막 소낭에 의한 NADH 및 NADPH의 합성 효율을 나타낸다. 그 결과 실시 예 6에서와 유사하게 빛이 주어지지 않은 암조건에서의 NADH 및 NADPH의 합성 속도는 빛이 제공되는 광조건에 비해 현저하게 낮게 나타났으며, 이를 근거로 본 실시 예에서 생성된 NADH 및 NADPH의 대부분은 빛을 이용한 광합성 명반응의 산물인 것을 알 수 있다. 반면 만입 세포막 소낭에서는 실시 예 6에서의 결과와 달리 NADH의 생성 효율이 NADPH에 비해 현저하게 높게 나타났으며, 따라서 만입 세포막을 사용하여 명반응 산물을 생성시키는 방법은 ATP 또는 NADH를 소모하는 생합성 반응을 유도하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다. 다만 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소의 작용에 의해 일부 NADPH 또한 생성된다는 사실 또한 확인되었으므로, 뉴클레오타이드 트랜스탈수소효소의 활성을 높이기 위한 다양한 추가적인 시도를 통해 NADPH 생산 효율을 증진시키는 방법도 가능할 것이다.
아울러 서로 다른 영역대의 파장을 갖는 빛에너지를 사용하는 틸라코이드 세포막 소낭 및 만입 세포막 소낭을 동시에 사용하여 NADH 및 NADPH의 합성 효율을 증진시키는 방법에 대해서는 구체적으로 예시하지 않았으나, 당업자라면 실시 예 5에서 예시한 틸라코이드 세포막 소낭 및 만입 세포막 소낭을 동시에 사용하여 ATP의 합성 효율을 증진시키는 방법을 참조하여 이를 쉽게 달성할 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (24)

  1. 광합성 세균 세포막으로부터 분리된 소낭(vesicle)을 함유하는 광합성 명반응 산물 생산용 조성물로서, 상기 광합성 세균 세포막은 자색비유황세균(purple non-sulfur bacteria)의 만입 세포막(intracytoplasmic membrane, ICM)인 것을 특징으로 하는 광합성 명반응 산물 생산용 조성물로,
    상기 광합성 명반응 산물은 아데노신 삼인산(ATP)을 포함하고, 그리고 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH) 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 명반응 산물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 광합성 명반응 산물 생산용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 자색비유황세균은 로도박터 속(Rhodobacter sp.), 로도스피릴룸 속(Rhodospirillum sp.), 로도수도모나스 속(Rhodopseudomonas sp.), 로지오박터 속(Roseobacter sp.), 브래디리조비움 속(Bradyrhizobium sp.) 및 루비리박스 속(Rubrivivax sp.)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 자색비유황세균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 남세균의 틸라코이드 세포막으로부터 분리된 소낭 및 자색비유황세균의 만입 세포막으로부터 분리된 소낭을 동시에 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 남세균의 틸라코이드 세포막으로부터 분리된 소낭 및 자색비유황세균의 만입 세포막으로부터 분리된 소낭은 서로 다른 파장대의 빛을 흡수하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 서로 다른 파장대의 빛은 가시광선 및 적외선인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 남세균의 틸라코이드 세포막으로부터 분리된 소낭 내 클로로필 a(chlorophyll a, Chl a)의 농도는 1 ㎍ 클로로필 a/㎖ 내지 1 ㎎ 클로로필 a/㎖인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 자색비유황세균의 만입 세포막으로부터 분리된 소낭 내 박테리오클로로필 a (bacteriochlorophyll a, Bchl a)의 농도는 1 ㎍ 박테리오클로로필 a/㎖ 내지 1 ㎎ 박테리오클로로필 a/㎖인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 소낭은 직경이 1 내지 500 ㎚인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항 또는 제 5 항의 광합성 명반응 산물 생산용 조성물을 포함하는 광합성 명반응 수행 단위체.
  12. 광합성 세균의 세포막으로부터 분리된 소낭(vesicle)에 빛을 조사하는 단계를 포함하는 광합성 명반응 산물의 생산 방법으로서, 상기 광합성 세균의 세포막은 자색비유황세균(purple non-sulfur bacteria)의 만입 세포막(intracytoplasmic membrane, ICM)인 것을 특징으로 하는 생산 방법으로,
    상기 광합성 명반응 산물은 아데노신 삼인산(ATP)을 포함하고, 그리고 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH) 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 명반응 산물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 광합성 세균의 세포막은 남세균(Cyanobacteria)의 틸라코이드 세포막(thylakoid membrane, TM) 및 자색비유황세균(purple non-sulfur bacteria)의 만입 세포막(intracytoplasmic membrane, ICM)인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  14. a) 자색비유황세균(purple non-sulfur bacteria)의 만입 세포막(intracytoplasmic membrane, ICM)으로부터 소낭을 분리하는 단계;
    b) 상기 분리된 소낭을 포함하는 광합성 명반응 수행 단위체를 제조하는 단계; 및
    c) 상기 광합성 명반응 수행 단위체에 빛을 조사하여 광합성 명반응 산물을 생산하는 단계;
    를 포함하는 광합성 세균 세포막으로부터 분리된 소낭(vesicle)을 이용한 광합성 명반응 산물의 생산 방법으로,
    상기 광합성 명반응 산물은 아데노신 삼인산(ATP)을 포함하고, 그리고 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH) 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 명반응 산물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
  15. 삭제
  16. 제 12 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH)는 추가적인 효소 처리 없이도 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH)으로 전환 가능한 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  17. 제 12 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH)은 추가적인 효소 처리 없이도 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH)로 전환 가능한 것을 특징으로 하는 생산 방법.
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