KR101707920B1 - Method for protecting livestock intestinal barrier using Bacillus subtilis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 유효성분으로 함유하는, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하기 위한 조성물 및 상기 조성물을 가축에게 경구 투여하여 데옥시니발레놀에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하는 방법에 관한 것으로, 돈육 농가의 경제적 손실을 예방할 수 있다.The present invention relates to a composition for protecting a livestock intestinal wall from intestinal wall damage caused by deoxynivalenol, which comprises heat-treated Bacillus subtilis as an active ingredient, and a composition for protecting the intestinal wall against deoxynivalenol, The present invention relates to a method for protecting a livestock intestinal wall from intestinal wall damage caused by nivalenol, thereby preventing the economic loss of pork farmers.
Description
본 발명은 바실러스 서브틸리스를 이용한 가축의 장관벽 보호 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 열 처리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 유효성분으로 함유하는, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하기 위한 조성물 및 상기 조성물을 가축에게 경구 투여하는 단계를 포함하는 데옥시니발레놀에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for protecting intestinal walls of a domestic animal using Bacillus subtilis, and more particularly, to a method for protecting intestinal walls of a domestic animal by using deoxynivalenol containing heat-treated Bacillus subtilis as an active ingredient To a method for protecting the livestock intestinal wall from intestinal wall damage by deoxynivalenol, comprising the step of administering the composition to the animal orally, and a composition for protecting the intestinal wall from intestinal wall injury.
장관 상피세포는 영양분 흡수를 위한 필터 작용뿐 아니라 장관에 들어온 병원균과 독소 같은 외래 항원에 대한 방어 작용도 수행한다. 상기 장관 상피세포로부터 독소 및 해로운 항원의 확산을 막기 위해 장관 상피세포의 정단부에는 흡착 단백질 복합체로 구성된 밀착연접(tight junction)이 형성되어 있다. 독소와 같은 외부자극에 의해서 장관 상피세포가 손상되어질 경우에 밀착연접의 변경으로 투과성(permeability)이 높아지고 장벽(barrier)의 결합이 떨어진다. 이에 독소 및 해로운 항원이 장관 상피세포로 확산되는 것은 밀착연접 형서을 개선하여 장관벽을 보호하는 방법 중의 하나로 여겨진다.The intestinal epithelial cells not only act as a filter to absorb nutrients, but also to protect against foreign antigens, such as pathogens and toxins in the intestinal tract. In order to prevent the diffusion of toxins and harmful antigens from the intestinal epithelial cells, a tight junction composed of an adsorption protein complex is formed at the tip of the intestinal epithelial cells. When intestinal epithelial cells are damaged by external stimuli such as toxins, the permeability is increased and the binding of the barrier is deteriorated due to the change of close contact. The diffusion of toxins and harmful antigens into the intestinal epithelial cells is considered to be one of the ways to protect the intestinal wall by improving the adhesion contact type.
붉은 곰팡이균은 벼, 보리, 밀 등에 병을 일으켜 작물의 수확 및 품질을 저하시키고, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol; DON) 같은 트라이코쎄신 (trichothecene) 독소를 생성하여 가축에 위해요소로 작용하여 문제가 되고 있다. 특히 돼지는 데옥시니발레놀에 민감하여 상기 독소에 오염된 사료를 섭취하였을 때 생장 및 면역성의 저하로 인한 양돈 농가의 경제적 손실을 야기시킨다. 기존의 연구(Diesing 등, 2011, PLoS One. 6:e17472)에서는 데옥시니발레놀이 위장관에 부착하여 빠르게 흡수되며 돼지의 상피세포 내 밀착연접 단백질 발현을 방해한다고 보고하였다. 이에 상기 독소로부터 돼지의 장관을 보호하려는 방법을 개발할 필요성이 제기되어진다. Red fungus causes diseases such as rice, barley and wheat to lower the yield and quality of crops and to produce trichothecene toxins such as deoxynivalenol (DON) It is becoming a problem. In particular, pigs are susceptible to deoxynil valenol, resulting in an economic loss of swine farming due to the loss of growth and immunity when the feed contaminated with the toxin is ingested. In a previous study (Diesing et al., 2011, PLoS One. 6: e17472), deoxynil valenol adheres to the gastrointestinal tract and is rapidly absorbed, interfering with the expression of closely related protein in the porcine epithelium. Thus, there is a need to develop a method for protecting the pigs from the toxins.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 그람양성 세균으로 토양과 수중 부생균으로 내생포자를 형성하는 특징을 가지는 생균제로 알려져 있다. 그러나 상기 세균이 가축 장관벽을 보호하는 기능을 하는지는 아직 확실히 알려진 바가 없다. Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ) is a gram-positive bacterium and is known to be a probiotic agent characterized by the formation of endosperm spores in soil and in water. However, it is still unclear whether these bacteria function to protect livestock gland walls.
한국공개특허 제2008-0073771호에는 '위장관 및 면역-관련 질환의 예방 및 치료를 위한 바실루스 PB6의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1046001호에는 '돼지유행성 설사 또는 돼지전염성 위장염에 대한 항체를 지닌 난황을 함유하는 자돈 사료용 첨가물 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 바실러스 서브틸리스를 이용한 진균감염으로부터 가축 장관벽을 보호하는 조성물 또는 방법에 대해서는 개시된 바가 없다.Korean Patent Publication No. 2008-0073771 discloses' Use of Bacillus PB6 for the Prevention and Treatment of Gastrointestinal and Immune-Related Diseases', Korean Patent No. 1046001 discloses' Antibody against Swine Epidemic Diarrhea or Swine Infectious Gastritis Discloses an egg yolk-containing food additive composition for pigs. However, the composition or the method for protecting the intestinal wall from fungal infections using Bacillus subtilis of the present invention has not been disclosed.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 돼지 장관의 상피세포에 처리함으로써, 바실러스 서브틸리스가 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)에 의한 장관벽 손상에 대한 보호 기능을 가진다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned needs, and it is an object of the present invention to provide a method for treating intestinal wall injuries caused by deoxynivalenol by treating Bacillus subtilis, The present invention has been completed.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 진균감염으로부터 가축 장관벽을 보호하기 위한 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a composition for protecting a meat wall of a livestock from fungal infections, which comprises heat-treated Bacillus subtilis as an active ingredient.
또한, 본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 유효성분으로 함유하는 조성물을 가축에게 경구 투여하는 단계를 포함하는 진균감염으로부터 가축 장관벽을 보호하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for protecting a livestock intestinal wall from a fungal infection comprising orally administering a composition containing heat-treated Bacillus subtilis as an active ingredient to a domestic animal.
본 발명의 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 진균감염으로부터 돼지 장관벽을 보호함으로써, 돼지 생장 저하를 막을 수 있으며 더 나아가, 돈육 농가의 경제적 손실을 예방할 수 있다. The composition comprising the heat-treated Bacillus subtilis as an active ingredient of the present invention can prevent the growth of pigs by protecting fungal intestinal walls from fungal infections and further prevent the economic loss of pork farms.
도 1은 바실러스 서브틸리스를 1 시간 처리한 돼지 장관 상피세포주인 IPEC-J2(intestinal porcine epithelial cells from jejunum) 내의 밀착연접 단백질들의 발현량을 웨스턴 블랏(A)과 면역세포화학법(B)으로 분석하여 나타낸 것이다[CON; 음성 대조구, LTA(lipoteichoic acid)-BS; 양성 대조구, BS(바실러스 서브틸리스); 실험구].
도 2는 바실러스 서브틸리스와 데옥시니발레놀을 처리한 돼지 장관 상피세포주인 IPEC-J2 내의 전기적 저항(transepithelial electrical resistance; TEER)을 시간별(0, 1, 24, 48시간) 측정하여 나타낸 것이다(DON; 데옥시니발레놀). TEER 수치는 평균±표준오차(n=3)로 표기하였다(*p<0.05, ***p<0.001).
도 3은 바실러스 서브틸리스와 데옥시니발레놀을 처리한 돼지 장관 상피세포주인 IPEC-J2 내의 밀착연접 단백질들의 발현량을 웨스턴 블랏(A-D)과 면역세포화학법(E)으로 분석하여 나타낸 것이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).FIG. 1 shows the expression levels of adhesion proteins in IPEC-J2 (porcine epithelial cells from jejunum) treated with Bacillus subtilis for 1 hour by Western blotting (A) and immunocytochemistry (B) Analysis [CON; Negative control, LTA (lipoteichoic acid) -BS; Positive control, BS (Bacillus subtilis); Experimental group].
Figure 2 shows the measurement of transepithelial electrical resistance (TEER) in time (0, 1, 24, 48 hours) in IPEC-J2, a porcine epithelial cell line treated with Bacillus subtilis and deoxynivalenol DON; deoxynil valenol). TEER values were expressed as mean ± standard error (n = 3) (* p <0.05, *** p <0.001).
FIG. 3 shows the expression levels of tightly linked proteins in IPEC-J2, a porcine epithelial cell line treated with Bacillus subtilis and deoxynivalenol, by Western blotting (AD) and immunocytochemistry (E) * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 유효성분으로 함유하는, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)에 의한 장관벽 손상으로부터 가축 장관벽을 보호하기 위한 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a method for protecting a livestock intestinal wall from intestinal wall damage caused by deoxynivalenol, which comprises heat-treated Bacillus subtilis as an active ingredient ≪ / RTI >
상기 진균은 데옥시니발레놀을 생성하는 붉은 곰팡이균으로, 일 예로 푸사리움 그래미네아룸(Fusarium graminearum) 또는 푸사리움 쿨모룸(F. culmorum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The fungus deoxy you a red fungus that produces a ballet play, one example of Fusarium yeah Mine arum (Fusarium graminearum ) or F. culmorum , but the present invention is not limited thereto.
상기 바실러스 서브틸리스는 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 HB3 (ATCC 55569)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The Bacillus subtilis may be, but is not limited to, Bacillus subtilis HB3 (ATCC 55569).
상기 열 처리된 바실러스 서브틸리스는The heat-treated Bacillus subtilis
(1) 바실러스 서브틸리스를 배지에 접종한 후 배양하는 단계; (1) inoculating and culturing the Bacillus subtilis in a medium;
(2) 상기 단계 (1)에서 배양된 바실러스 서브틸리스를 수득하는 단계; 및 (2) obtaining Bacillus subtilis cultured in the step (1); And
(3) 상기 단계 (2)에서 수득한 바실러스 서브틸리스를 열처리하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.(3) heat-treating the bacillus subtilis obtained in the step (2).
상기 단계 (1)에서 바실러스 서브틸리스는 공지의 배양 기술에 따라 적당한 온도에서 적당한 기간 동안 배양되며, 바람직하게는 20 내지 50℃에서 10시간 내지 4일간 배양하여 얻을 수 있다. In step (1), the Bacillus subtilis is cultured for a suitable period at an appropriate temperature according to a known culture technique, preferably at 20 to 50 DEG C for 10 hours to 4 days.
상기 단계 (2)에서 배양한 바실러스 서브틸시스는 공지의 수득 방법에 따라 수득하며, 바람직하게는 원심분리방법을 통해 상등액을 제거하고 펠렛을 회수하여 사용할 수 있다.The Bacillus subtilis sheath cultured in the step (2) is obtained according to a known method. Preferably, the supernatant is removed by centrifugation and the pellet is recovered.
상기 단계 (3)에서 열처리는 바실러스 서브틸리스의 안정성을 갖게 하고, 보존기간(shelf-life)를 연장시켜 저장 또는 수송에 유리하게 하기 위한 것이다. 상기 열처리 온도는 70 내지 140℃에서 증자(steaming), 고압증기멸균(autoclave), 건열처리(dry heat) 방법으로 수행될 수 있고, 100 내지 130℃에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 열처리는 온도에 따라 다르지만 15분 내지 90분 동안 수행되는 것이 바람직하다.In the step (3), the heat treatment is to stabilize Bacillus subtilis and prolong shelf-life so as to be advantageous for storage or transportation. The heat treatment may be performed at a temperature ranging from 70 to 140 DEG C by steaming, autoclaving, or dry heat, preferably at 100 to 130 < 0 > C. The heat treatment is preferably performed for 15 minutes to 90 minutes though it depends on the temperature.
본 발명에 따른 상기 바실러스 서브틸리스는 돼지 장관 상피세포의 투과성을 감소시킬 수 있다. The Bacillus subtilis according to the present invention can reduce the permeability of porcine gut epithelial cells.
본 발명에 따른 상기 바실러스 서브틸리스는 돼지 장관 상피세포에서 클라우딘(claudin), 오클루딘(occludin), 또는 ZO-1(zonula occludens-1)을 포함하는 밀착연접(tight junction) 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는 ZO-1의 발현을 증가시킬 수 있다.The Bacillus subtilis according to the present invention increases the expression of tight junction proteins including claudin, occludin, or ZO-1 (zonula occludens-1) in porcine gut epithelial cells . Lt; RTI ID = 0.0 > ZO-1. ≪ / RTI >
또한, 본 발명은 열 처리된 바실러스 서브틸리스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 가축에게 경구 투여하는 단계를 포함하는, 진균감염으로부터 가축 장관벽을 보호하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for protecting a livestock intestinal wall from a fungal infection, comprising orally administering a composition comprising heat-treated Bacillus subtilis as an active ingredient to a domestic animal.
본 발명에서, 상기 가축은 돼지, 소, 말, 닭, 개 등일 수 있으며, 바람직하게는 돼지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the livestock may be a pig, a cow, a horse, a chicken, a dog, and the like, preferably, but not limited to, a pig.
본 발명의 조성물을 제조하기 위하여, 상기 바실러스 서브틸리스는 경구 투여용 제제의 형태로 사용될 수 있다. 직접 제제화하거나 사료용 원료와 함께 제제화할 수 있다. In order to prepare the compositions of the present invention, the Bacillus subtilis may be used in the form of preparations for oral administration. It can be formulated directly or formulated with feedstuffs.
본 발명의 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있다. 상기 조성물은 돼지의 음용수 및 사료를 통해 투여할 수 있다. 바람직하게는 돼지의 사료를 통해 투여한다.
The composition of the present invention may be in the form of a dry or liquid formulation. The composition can be administered via drinking water and feed of pigs. Preferably, it is administered via a feed of pigs.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. 세포 배양 및 바실러스 서브틸리스, LTA-BS, 또는 데옥시니발레놀 시료 준비Example 1. Cell culture and sample preparation of Bacillus subtilis, LTA-BS, or deoxynil valenol
돼지 장관 상피세포주인 IPEC-J2(DSMZ, 독일)는 5% FBS, 1% ITS-X(insulin-transferrin-selenium-X), 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2가 포함된 37℃ 배양기에서 배양하였다. Pig secretary epithelium cell line, IPEC-J2 (DSMZ, Germany) 5% FBS, 1% ITS- X (insulin-transferrin-selenium-X), the 37 contain 5% CO 2 using a DMEM medium supplemented with antibiotics is added Lt; / RTI > incubator.
바실러스 서브틸리스 HB3 (ATCC 55569)는 37℃에서 12시간동안 TS 한천배지(trypticase soy agar; BD Biosciences, 미국)에서 배양하여 단일 콜로니를 접종한 후 TS 액체배지에서 37℃, 15시간동안 배양하였다. 배양된 세균은 4000 g 로 15분동안 원심분리한 후 PBS로 2번 세척하였다. 120℃에서 30분간 열처리한 후, 실험에 1X109 cfu/mL 농도로 사용하였다. 바실러스 서브틸리스가 가지는 구성요소인 LTA(lipoteichoic acid, Invivogen, 미국)-BS는 바실러스 서브틸리스의 양성 대조구로서, 10 ㎍/mL 농도로 세포에 동일 시간 사용하였다. 데옥시니발레놀(시그마, 미국)은 에탄올에 희석하여 2 ㎍/mL 농도로 실험에 사용하였다.
Bacillus subtilis HB3 (ATCC 55569) was cultured in a trypticase soy agar (BD Biosciences, USA) for 12 hours at 37 ° C, inoculated with a single colony, and cultured in TS liquid medium at 37 ° C for 15 hours . The cultured bacteria were centrifuged at 4000 g for 15 minutes and then washed twice with PBS. After heat treatment at 120 ° C for 30 minutes, the concentration was 1 × 10 9 cfu / mL. LTA (lipoteichoic acid, Invivogen, USA) - BS, a component of Bacillus subtilis, was used as a positive control for Bacillus subtilis at the concentration of 10 ㎍ / mL for the same time. Deoxynil valenol (Sigma, USA) was diluted in ethanol and used in experiments at a concentration of 2 μg / mL.
실시예Example 2. 2. 바실러스Bacillus 서브틸리스에Subtilis 의한 돼지 장관 상피세포 내 Of porcine intestinal epithelial cells ZOZO -1 및 -1 and 오클루딘Oak Runin 발현량의 증가 확인 Confirmation of increase in expression level
배양액(CON; 음성 대조구), 바실러스 서브틸리스(BS; 실험구) 또는 LTA(LTA-BS; 양성 대조구)로 각각 1시간동안 처리한 IPEC-J2 세포 내의 밀착연접 단백질 발현량을 비교분석하기 위하여 웨스턴 블랏(도 1A)으로 ZO-1, 오클루딘 및 클라우딘-3의 발현량을 측정하였다. 각기 처리를 완료한 세포는 하기와 같이 웨스턴 블랏을 수행하였다. 수확한 세포는 용해 완충액(20 mM 트리스-염산, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% 트립톤 X-100)으로 용해한 후 총 단백질량을 측정하여 동량의 단백질 추출물을 10% 트리스-글라이신 폴리아크릴아마이드젤에 로딩하여 전기영동 후 PVDF 막으로 옮겼다. 막은 5% 탈지분유가 포함된 TBS-T 용액으로 90분 동안 4℃에서 블로킹하였다. 5% 탈지분유가 포함된 TBS-T(20 mM 트리스-염산, 100 mM NaCl, 0.05% 트윈 20)에 1차 항체(토끼 항-클라우딘-3 항체, 항-오클루딘 항체, 항-ZO-1 항체 또는 마우스 항-β-액틴 항체)를 밤새 반응시키고 2차 항체를 1:10000으로 희석하여 첨가한 후 1시간 동안 반응시켰다. ECL 용액(Enhanced Chemiluminescent solution; GE Healthcare, 미국)을 첨가하였고, ChemiDoc XRS(Bio-rad, 미국)으로 분석하여 결과를 얻었다. 블로팅 강도는 MultiGauge 소프트웨어(후지필름, 일본)을 사용하여 정량화하였다. 도 1A에서 보이는 바와 같이 ZO-1 및 오클루딘은 대조구에 비해 상향조절되었다. To compare and analyze the amount of close-coupled protein expression in IPEC-J2 cells treated with culture medium (CON; negative control), Bacillus subtilis (BS) or LTA (LTA-BS; positive control) The amount of expression of ZO-1, occludin and claudin-3 was measured by Western blot (FIG. 1A). The treated cells were subjected to western blotting as follows. The harvested cells were lysed with lysis buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Tryptone X-100), and the total amount of protein was measured. The same amount of protein extract was dissolved in 10% Tris- Amide gel, electrophoresed, and then transferred to a PVDF membrane. The membrane was blocked with TBS-T solution containing 5% skim milk for 90 minutes at 4 ° C. (Rabbit anti-claudin-3 antibody, anti-aclodine antibody, anti-ZO-1 antibody) was added to TBS-T (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0.05% Tween 20) containing 5% Antibody or mouse anti- [beta] -actin antibody) was reacted overnight, and the secondary antibody was diluted to 1: 10000, followed by reaction for 1 hour. ECL solution (Enhanced Chemiluminescent solution; GE Healthcare, USA) was added and analyzed with ChemiDoc XRS (Bio-Rad, USA). Blotting strength was quantified using MultiGauge software (Fuji Film, Japan). As shown in FIG. 1A, ZO-1 and occludin were up-regulated compared to the control.
면역세포화학법(도 1B)으로 세포 내 밀착연접 단백질의 발현분포를 조사하였다. 배양액(CON; 음성 대조구), 바실러스 서브틸리스(BS; 실험구) 또는 LTA(LTA-BS; 양성 대조구)로 각각 처리한 IPEC-J2 세포를 PBS로 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드로 37℃에서 20분간 고정시켰고, 10% FBS가 들어있는 블로킹 완충액으로 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 1차 항체(토끼 항-오클루딘 항체, 항-ZO-1 항체)를 블로킹 완충액에 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 2차 항체 (염소 항-토끼 IgG-Alexa fluor 488; BD biosciences, 미국)를 첨가하여 반응시켰다. 핵을 염색하기 위해 DAPI를 사용하였다. 해당 단백질의 세포 내 분포는 공초점 레이저 스캔 현미경 LSM700(Carl Zeiss, 독일)으로 분석하였다. 공초점 현미경 관찰결과는 세포 내 ZO-1 및 오클루딘 발현이 증가함을 확인하였다(도 1B). 특히 바실러스 서브틸리스에 처리한 세포에서는 ZO-1이 세포의 바깥 경계선을 형성함을 관찰하였다.
The distribution of intracellular adhesion proteins was examined by immunocytochemistry (Fig. 1B). IPEC-J2 cells treated with culture medium (CON; negative control), Bacillus subtilis (BS), or LTA (LTA-BS; positive control) were washed with PBS and incubated with 4% paraformaldehyde 37 For 20 minutes, and reacted at 37 ° C for 1 hour with blocking buffer containing 10% FBS. Alexa fluor 488 (BD biosciences, USA) was added to the blocking buffer for 1 hour at room temperature, and then incubated with anti-ZO-1 antibody (anti-ZO- Was added and reacted. DAPI was used to stain nuclei. The intracellular distribution of the protein was analyzed by confocal laser scanning microscope LSM700 (Carl Zeiss, Germany). Confocal microscopy observations showed increased expression of intracellular ZO-1 and occludin (FIG. 1B). In particular, in cells treated with Bacillus subtilis, it was observed that ZO-1 formed the outer boundary of cells.
실시예 3. 바실러스 서브틸리스에 의한 돼지 장관 상피세포의 투과성 변화 확인Example 3 Confirmation of Transmission of Porcine Epithelial Cells by Bacillus subtilis
데옥시니발레놀이 세포생장율에 미치는 효과를 조사한 결과 48시간동안 2 ㎍/mL로 첨가하였을 경우 세포 손상을 유도할 뿐 죽음을 유도하지는 않음을 확인하였다. 바실러스 서브틸리스의 세포 내 투과성(permeability)에 미치는 효과를 알아보기 위해 전기적 저항성(TEER) 실험을 수행하였다. 상기 전기적 저항성(TEER) 실험은 상피 볼트옴 미터(epithelial voltohm meter; World precision instruments, 미국)를 사용하여 상피세포의 정단면과 기저면 사이의 통합성 변화를 조사하는 방법이다. 각 TEER 수치에서 배양액에서의 TEER 수치를 값을 빼서 정규화하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 아무 처리를 하지 않은 세포에 비해 바실러스 서브틸리스(BS)를 처리한 세포의 TEER 수치가 증가하였다. 또한 바실러스 서브틸리스는 데옥시니발레놀(DON)로 처리된 세포의 TEER 수치를 증가시켰으므로, 세포의 투과성을 감소시킴을 알 수 있었다.
The effect of deoxynil valerate on the cell growth rate was investigated. It was confirmed that when added at 2 ㎍ / mL for 48 hours, it induces cell damage but does not induce death. The electrical resistance (TEER) experiment was performed to investigate the effect on the intracellular permeability of Bacillus subtilis. The electrical resistance (TEER) test is a method of examining the change in integrity between the normal and basal surfaces of epithelial cells using an epithelial voltohm meter (World precision instruments, USA). The TEER value in the culture was normalized by subtracting the value from each TEER value. As shown in FIG. 2, the TEER value of cells treated with Bacillus subtilis (BS) was increased compared to that of the cells without any treatment. In addition, Bacillus subtilis increased TEER levels of deoxynil valenol (DON) -treated cells, thus reducing cell permeability.
실시예Example 4. 4. 바실러스Bacillus 서브틸리스를Subtilis 처리하여 By processing 데옥시니발레놀에Deoxynil valenol 의해 손상된 돼지 장관 상피세포 내 Inside porcine epithelial cells damaged by ZOZO -1 발현량의 증가 확인-1 Increased expression level
바실러스 서브틸리스에 1시간 전처리 후 데옥시니발레놀에 48시간 반응시킨 돼지 장관 상피세포의 세포 내 밀착연접 단백질인 ZO-1, 오클루딘 및 클라우딘-3의 발현을 조사하기 위하여 상기 실시예 2와 동일한 분석 방법을 수행하였다. 데옥시니발레놀 없이 바실러스 서브틸리스를 처리한 세포에서는 대조구와 달리 ZO-1(도 3A, B) 및 클라우딘-3(도 3A, D)이 증가하였고, 데옥시니발레놀 처리구 세포에서는 ZO-1 단백질이 증가하였다(도 3A, B). 특히 바실러스 서브틸리스 전처리시 ZO-1 단백질은 다른 단백질에 비해 현저히 증가량이 많았으며, 도 2E에서 보이는 TEER 수치가 높다는 점과 더불어 도 3에서는 밀착연접 단백질의 세포 바깥 경계선 형성을 보여주고 있다는 점이 ZO-1을 매개로 한 돼지 장관벽 보호기능을 제시하였다. 따라서 바실러스 서브틸리스가 데옥시니발레놀에 의한 장관벽 손상에 대한 보호 기능을 가짐을 확인하였다. In order to investigate the expression of ZO-1, ocurudin and claudin-3, intracellular close-coupled proteins of porcine intestinal epithelial cells, which had been pretreated with Bacillus subtilis for 1 hour and then reacted with deoxynivalenol for 48 hours, The same analytical method as that described above was performed. Unlike the control, cells treated with Bacillus subtilis without deoxynil valenol increased ZO-1 (Fig. 3A, B) and claudin-3 (Fig. 3A, D) -1 protein (Fig. 3A, B). In particular, ZO-1 protein was significantly increased in the pretreatment of Bacillus subtilis compared to other proteins, and the TEER value shown in FIG. 2E was high. In addition, in FIG. 3, ZO- -1 as a mediator. Thus, it has been confirmed that Bacillus subtilis has a protective function against intestinal wall damage caused by deoxynil valenol.
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