KR101706754B1 - 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물 및 이의 제조방법 - Google Patents
항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항원성이 저감되고 항산화활성이 우수한 당화 어류단백 분해물 및 이의 제조방법에 관한 것으로 내장이 제거된 어류 부산물 또는 어류 단백질을 단백질 분해효소로 가수분해하는 단계; 및 상기 가수분해된 가수분해물과 당류를 혼합하여 마이얄(Maillaird)반응 시키는 단계;를 포함함으로써, 우수한 항산화 활성 및 알러지 저감효과를 가질 수 있다.
Description
본 발명은 우수한 항산화 활성 및 알러지 저감효과를 갖는 어류단백 분해물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
우리나라의 어류중에서 넙치의 양식 산업은 해수어류 양식산업 전체 생산량의 절반을 차지하며 전 세계에서 가장 많은 생산량(연간 5만 톤, 약 5천억 원)을 차지하고 있는데 이는 세계 최고의 생산 기술을 갖추고 있기 때문이다.
최근 생물자원의 고갈에 대한 인식이 증가함과 동시에 환경공해로 여겨지던 식품가공부산물이 여러 분야에서 가치를 인정받고 있다.
우리나라에서 수산물의 총 공급량은 약 3,200만 톤(통계청 : 2012년)이며, 이 중 약 85%가 가공원료로써 이용되고 총량의 70%에 달하는 내장, 머리, 피부, 뼈, 및 잔육 등의 부산물은 사료로 이용되거나 폐기되어지는 실정이다. 이와 같이 해마다 많은 양의 수산가공 부산물들이 발생하고 있지만 이들을 효율적으로 이용하기 위한 연구가 미흡하여 유용자원의 낭비뿐만 아니라 환경오염을 초래하고 있다.
상기 어류 가공부산물을 활용하기 위한 노력으로 이들 단백질 자원을 효소 분해를 통한 생활성(bioactive) 단백질과 펩타이드(peptide)로 회수하려는 노력들이 기울여 지고 있다. 또한, 어류 가공부산물을 효소적 생물학적 기법으로 분해하는 것은 생산 공정의 안정성, 부산물의 감소, 기능성 물질의 선택적 획득, 인체 안전성 면에서 장점이 있는 것으로 알려있다.
또한, 상기 어류 가공부산물은 단백질과 펩타이드, 아미노산과 핵산 등을 포함한 각종 정미 성분을 많이 가지고 있어 식품 소재나 베이스로서 좋은 원료가 될 수 있음에도 불구하고 어류의 특유의 냄새와 맛 성분으로 인해 비료나 사료로만 국한적으로 이용되고 있어, 이 자원을 부가가치가 높은 소재로 전환 시킨다면 기업의 수익증대에 기여할 뿐 아니라 소재개발 기술력을 축적함과 동시에 국가 경쟁력 제고 및 환경 친화 공정으로 인정을 받게 될 것이다.
한편, 고압 처리 기술은 식품산업에서 주로 식품 중의 유해 미생물의 살균목적으로 사용된다. 그러나 최근 국내 및 일본을 중심으로 동식물 원료로부터 유용성분의 색상, 향미 및 영양성분 등을 유지하면서 수용화 및 추출증대 효과를 제공할 수 있는 비가열 기술로서의 장점이 부각되고 있다. 최근 상업적 규모의 고압 처리장치의 개발로 인하여 중소 식품소재 및 미용소재 제조업체를 중심으로 활용도가 점차적으로 증가하는 추세에 있다.
또한, 마이얄 반응(MR)은 비효소적 갈색화 반응으로 아미노산, 펩타이드, 단백질의 아미노기와 환원당의 카보닐기와의 축합에 의하여 시작되는 일련의 반응이다. 이 반응은 소위 MRPs라 불리는 다수의 반응 물질들을 생산하는데 이들이 저장 또는 가공식품의 품질과 기호도에 중요한 역할을 한다.
본 발명의 목적은 내장이 제거된 어류 부산물을 효소로 가수분해한 후 마이얄 반응으로 당화시킴으로써 우수한 항산화 활성 및 알러지 저감효과를 갖는 당화 어류단백 분해물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 당화 어류단백 분해물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법은 내장이 제거된 어류 부산물 또는 어류 단백질을 단백질 분해효소로 가수분해하는 단계; 및 상기 가수분해된 가수분해물과 당류를 혼합하여 마이얄(Maillaird) 반응시키는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 가수분해하는 단계 및 마이얄 반응시키는 단계 사이에 상기 가수분해물을 탈염시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 탈염시키는 단계 및 마이얄반응 시키는 단계 사이에 원하는 분자량을 갖도록 상기 탈염된 가수분해물을 획분하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단백질 분해효소는 프로타멕스(Protamex), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 알카라제(Alcalase), 키모트립신(α-chymotrypsin), 트립신(Trypsin) 및 파파인(Papain)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 어류 부산물 또는 어류 단백질과, 단백질 분해효소의 중량비는 40 내지 100 : 1일 수 있다.
상기 가수분해 시 온도는 40 내지 80 ℃, 가수분해 시 pH는 6.0 내지 7.5일 수 있다.
당류는 리보스, 자일로스 및 아라비로스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 5탄당 또는 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 프룩토오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 6탄당일 수 있다.
상기 가수분해물과 당류는 1 : 1 내지 5의 중량비로 혼합될 수 있다.
상기 마이얄 반응온도는 100 내지 150 ℃, 마이얄 반응압력은 0.2 내지 3 kg/㎠, 마이얄 반응 시 pH는 7 내지 9 및 마이얄 반응시간은 20 내지 60분일 수 있다.
상기 획분은 한외여과막을 이용할 수 있으며, 상기 획분된 가수분해물의 분자량은 5 KDa 이하일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 당화 어류단백 분해물은 가수분해된 어류단백 분해물을 마이얄(Maillaird)반응시킨 것 일 수 있다.
상기 당화 어류단백 분해물은 0.5 내지 20 mg/㎖의 농도로 사용될 수 있다.
상기 당화 어류단백 분해물의 가수분해도는 10 내지 13%, 갈변도는 550 내지 650, HMF(hydroxymethylfural) 함량은 30 내지 120 ugHMF/mg당화어류단백분해물, 및 분자량은 80 Da 내지 100 Da과 7 kDa 내지 47 kDa이 2 : 8의 중량비로 분포될 수 있다.
본 발명의 어류단백 분해물은 어류를 고압으로 가수분해한 후 마이얄 반응으로 당화시켜 제조함으로써 우수한 항산화 활성 및 알러지 저감효과를 갖는다.
또한, 버려지는 부산물을 모두 이용하며 화학 첨가물이 들어가지 않으므로 친환경적인 식품첨가물 소재이다.
도 1은 본 발명의 일 실시례에 따라 제조된 어류단백 분해물에 대한 분자량을 증기화광산란검출기가 장착된 고속액체크로마토그래피로 측정한 그래프이다.
본 발명은 우수한 항산화 활성 및 알러지 저감효과를 갖는 어류단백 분해물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 어류단백 분해물의 제조방법은 내장이 제거된 어류 부산물 또는 어류 단백질을 단백질 분해효소로 가수분해하는 단계; 및 상기 가수분해된 가수분해물과 당류를 혼합하여 마이얄(Maillaird)반응 시키는 단계;를 포함한다. 또한, 상기 가수분해하는 단계 및 마이얄 반응시키는 단계 사이에 순차적으로 상기 가수분해물을 탈염시키는 단계 및 상기 탈염된 가수분해물을 획분하는 단계를 더 포함할 수 있다.
먼저, 내장이 제거된 어류 부산물 또는 어류 단백질을 및 단백질 분해효소를 80 내지 300 MPa, 바람직하게는 100 내지 150 MPa의 압력; 40 내지 80 ℃, 바람직하게는 50 내지 60 ℃의 온도; 6.0 내지 7.5, 바람직하게는 6.0 내지 7.0의 pH;하에서 1 내지 6시간 동안 가수분해한다.
이때, 상기 어류 부산물(또는 어류 단백질)과 효소의 중량비는 40 내지 100 : 1, 바람직하게는 45 내지 60 : 1이다. 어류 부산물(또는 어류 단백질)과 효소의 중량비가 효소를 기준으로 상기 하한치 미만인 경우에는 하기 획분 시 원하는 분자량의 획분 수율이 현저히 낮아질 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 가수분해 효율이 떨어질 수 있다.
또한, 가수분해 시 압력이 상기 하한치 미만인 경우에는 가수분해 효율이 떨어질 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 하기 획분 시 원하는 분자량의 획분 수율이 현저히 낮아질 수 있다.
또한, 가수분해 시 온도가 상기 하한치 미만인 경우에는 가수분해 효율이 떨어질 뿐만 아니라 하기 획분 시 원하는 분자량의 획분 수율이 현저히 낮아질 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 하기 획분 시 원하는 분자량의 획분 수율이 현저히 낮아질 수 있다.
또한, 가수분해 시 pH는 완충액으로 조절하는데, pH가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 가수분해 효율이 떨어지고 하기 획분 시 원하는 분자량의 획분 수율이 현저히 낮아질 수 있다.
상기 가수분해 시 어류 부산물 및 효소, 압력, 온도, pH 및 시간 중에서 하나라도 상기 범위를 벗어나는 경우에는 가수분해 효율 및 하기 획분 시 원하는 분자량의 획분 수율이 현저히 낮아질 수 있다.
상기 어류로는 조단백 함량이 18 중량% 이상인 어류라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 가자미(넙치), 도다리 및 광어로 이루어진 군에서 선택된 1종을 들 수 있다.
또한, 상기 단백질 분해효소로는 프로타멕스(Protamex), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 알카라제(Alcalase), 키모트립신(α-chymotrypsin), 트립신(Trypsin) 및 파파인(Papain)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 프로타멕스, 플라보자임 또는 이들의 혼합효소, 더욱 바람직하게는 프로타멕스를 들 수 있다.
다음으로, 생체 유효성을 높이기 위하여 상기 가수분해된 가수분해물을 탈염시킨다.
상기 가수분해물을 탈염시키는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 전기 탈염기(electrodialyzer)를 이용하여 이온 교환막과 전기의 힘에 의한 강제적 투석법으로 탈염을 진행한다.
구체적으로, 상기 탈염법은 양이온 교환막과 음이온 교환막을 조합하여 상기 두 교환막 사이에 상기 가수분해물을 투입한 후 직류 전압을 인가하여 전기적으로 이온을 상기 가수분해물로부터 제거하는 방법이다.
다음으로, 생체이용성 및 이후의 마이얄(Maillaird)반응의 효율성을 향상시키기 위하여 상기 탈염된 가수분해물을 획분하여 원하는 분자량, 예컨대 5 KDa 이하, 바람직하게는 0.1 내지 3 KDa의 분자량을 갖는 가수분해물을 획분한다.
상기 획분된 가수분해물의 분자량이 5 KDa 초과인 경우에는 얻어지는 양(수율)이 낮으며 항산화 및 알러지 저감과 같은 생체이용성이 떨어지고 마이얄 반응이 원활하게 수행되지 못할 수 있다.
상기 가수분해물을 획분하는 공정은 한외여과막을 장착한 한외여과 시스템을 이용하여 분획한 후 농축하고 동결건조한 것이다.
다음으로, 상기 가수분해물(또는 획분된 가수분해물)과 당류를 혼합하여 마이얄 반응으로 당화시킨다.
상기 가수분해물과 당류를 1 : 1 내지 5의 중량비, 바람직하게는 1 : 2 내지 4의 중량비로 혼합하고 물을 첨가한 후 100 내지 150 ℃, 바람직하게는 110 내지 130 ℃ 하에서 0.2 내지 3 kg/㎠, 바람직하게는 0.6 내지 1.5 kg/㎠의 압력으로 20 내지 60분, 바람직하게는 30 내지 45분 동안 반응시켜 당화된 가수분해물, 예컨대 당화된 어류단백 분해물을 제조한다. 이때의 pH는 7 내지 9, 바람직하게는 8.2이다.
분획된 가수분해물과 당류의 중량비가 가수분해물을 기준으로 상기 하한치 미만인 경우에는 항산화능과 항알러지 효과가 낮으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 마이얄 반응 시 부반응이 다량 발생할 수 있다.
또한, 온도 및 압력이 상기 하한치 미만인 경우에는 항산화능과 항알러지 효과가 낮으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 독성물질이 생길 수 있다.
또한, pH가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 항산화능과 항알러지 효과가 발생하지 않을 수 있다.
상기 당류로는 5탄당 또는 6탄당을 들 수 있으며, 구체적으로 리보스, 자일로스 및 아라비로스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 5탄당; 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 프룩토오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 6탄당을 들 수 있으며, 바람직하게는 5탄당인 리보스이다. 상기 당류로 리보스를 사용하는 경우에는 6탄당의 당류를 사용하는 경우에 비하여 마이얄 반응이 잘 일어나고 갈변도 및 항산화능이 더 우수하다.
상기와 같은 방법으로 제조된 당화 어류단백 분해물은 0.5 내지 20 mg/㎖, 바람직하게는 1 내지 5 mg/㎖, 더욱 바람직하게는 1 mg/㎖의 농도로 사용한다.
당화 어류단백 분해물의 사용량이 상기 하한치 미만인 경우에는 기대하는 효과를 얻을 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 독성이 발생할 수 있다.
또한, 본 발명의 어류단백 분해물은 가수분해도가 10 내지 13%, 갈변도가 550 내지 650, HMF(hydroxymethylfural) 함량이 30 내지 120 ugHMF/mg당화어류단백분해물, 및 분자량이 80 Da 내지 100 Da과 7 kDa 내지 47 kDa이 2 : 8의 중량비로 분포될 수 있다(도 1). 상기 도 1의 당화 어류단백 분해물의 분자량은 증기화광산란검출기(evaporating light scattering detector)가 장착된 고속액체크로마토그래피(1200 series, Agilent, 미국)를 사용하여 젤여과크로마토그래피법으로 분석하였다. 분석조건은 시료 50 ul를 주입한 후 Agilent PL aquagel-OH 30 (8 um, 300 x 7.5 mm) 컬럼에 이동상인 0.02% sodium azide를 0.5 ml/min의 유속으로 용출하여 분자량별로 검출하였고, Easivial PEG/PEO(Agilent, 미국)을 표준물질로 비교분석하여 분자량 분포를 확인하였다.
또한, 본 발명의 어류단백 분해물은 히스타민 방출양(%)이 190 내지 300%, β-히소사미니다이즈 방출양(%)이 90 내지 130%, DPPH 라디칼 소거능(%)이 0.4 내지 1.2 mg/㎖, 및 FRAP(Ferric reducing ability of plasma) 활성이 2.00 내지 3.00 mM FeSO4 eq./mg extract이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1.
내장을 제거한 넙치를 습식 분쇄기로 분쇄한 넙치가루 100 중량부와 프로타멕스 2 중량부를 혼합한 후 100 MPa의 압력, 57 ℃의 온도 및 pH 6.8 하에서 6시간 동안 가수분해한 다음 이를 농축하고 동결건조하고 상기 동결건조된 가수분해물 100 중량부와 리보스 100 중량부를 혼합한 후 물을 첨가하고 121 ℃의 온도, 1.0 kg/㎠의 압력 및 pH 8.2하에서 38분 동안 마이얄 반응시켜 당화 어류단백 분해물을 제조하였다.
실시예 2.
내장을 제거한 넙치를 습식 분쇄기로 분쇄한 넙치가루 100 중량부와 프로타멕스 2 중량부를 혼합한 후 100 MPa의 압력, 57 ℃의 온도 및 pH 6.8 하에서 6시간 동안 가수분해한 다음 전기 탈염기(Micro-acilyzer S3, 창조테크노, 한국)를 이용하여 탈염된 가수분해물을 얻었다. 상기 탈염된 가수분해물을 한외여과막장치(QuixStandtm benchtop system, GE healthcare, 미국)를 이용하여 분획함으로써 3 KDa이하의 분자량을 갖는 분획된 가수분해물을 얻고 이를 농축하고 동결건조하였다. 상기 분획된 가수분해물 100 중량부와 리보스 100 중량부를 혼합한 후 물을 첨가하고 121 ℃의 온도, 1.0 kg/㎠의 압력 및 pH 8.2하에서 38분 동안 마이얄 반응시켜 당화 어류단백 분해물을 제조하였다.
실시예 3.
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 상기 분획된 가수분해물로 3.1 내지 5.0 KDa의 분자량을 갖는 분획된 가수분해물을 이용하여 당화 어류단백 분해물을 제조하였다.
실시예
4.
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 상기 리보스 대신 글루코스를 사용하여 당화 어류단백 분해물을 제조하였다.
실시예 5.
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 넙치가루 100 중량부에 대하여 프로타멕스 5 중량부를 사용하여 당화 어류단백 분해물을 제조하였다.
실시예 6.
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 분획된 가수분해물로 10 KDa 이상의 분자량을 갖는 분획된 가수분해물을 이용하여 당화 어류단백 분해물을 제조하였다.
실시예 7.
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 분획된 가수분해물 100 중량부에 대하여 리보스 1000 중량부를 사용하여 당화 어류단백 분해물을 제조하였다. 이때의 pH는 4.2에서 4.9이다.
실시예
8.
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 마이얄 반응시 온도를 80 ℃로 하여 당화 어류단백 분해물을 제조하였다.
실시예
9.
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 마이얄 반응시 압력을 6 kg/㎠으로 하여 당화 어류단백 분해물을 제조하였다.
비교예
1.
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, 마이얄 반응을 수행하지 않고 당화 어류단백 분해물을 제조하였다.
시험예
1.
알러젠
활성 측정
실시예 및 비교예의 알러젠 활성을 측정하기 위하여 히스타민(histamine)과 β-히소사미니다이즈(β-hexosaminidase) 방출 실험을 진행하였다. 상기 히스타민과 β-히소사미니다이즈는 알러지 반응이 진행됨에 따라 세포 외부로 분비되는 물질로 RBL-2H3 cell을 이용하여 측정하였다.
1-1. 히스타민 방출: 히스타민 방출을 측정하기 위하여 RBL-2H3을 96-well plate에 5X104 cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 배양하였다. 배지를 모두 제거한 후 PBS로 2번 세척하고 시료를 1 mg/mL의 농도로 방출 용액(116.9 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, 5.6 mM Glucose, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA)에 희석하여 세포주에 처리한 후, 2시간 동안 배양하였다. 세포 배양 상등액 100 uL를 취한 후, 0.5N NaOH와 2.5 mg/mL의 o-Phthalaldehyde를 2:1의 비율로 섞은 용액 60 uL를 넣어 37 ℃에서 30분간 반응시키고 3 N HCl을 10 uL 넣어 반응을 종결시켰다. 형광도는 excitation 355 nm/emission 460 nm에서 측정하였으며, 다음 [수학식 1]을 이용하여 히스타민의 방출 정도를 계산하였다.
1-2. β-히소사미니다이즈 방출: β-히소사미니다이즈 방출을 측정하기 위하여 RBL-2H3을 96-well plate에 5x104 cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 배양하였다. 배지를 모두 제거한 후 PBS로 2번 세척하였다. 시료를 1 mg/mL의 농도로 방출 용액(116.9 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, 5.6 mM Glucose, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA)에 희석하여 세포주에 처리한 후, 2시간 동안 배양하였다. 세포 배양 상등액 30 uL를 취하여 기질 용액(5 mM 4-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide in 0.05 M citrate buffer, pH 4.5) 70 uL와 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 배양 후 0.1 M sodium carbohydrate buffer(pH 10)를 100 uL 첨가하여 반응을 종결시키고 multiplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 후 다음 [수학식 2]를 이용하여 β-히소사미니다이즈 방출 정도를 계산하였다.
| 구분 | 히스타민 방출(%) | 히소사미니다이즈 방출(%) |
| 실시예 1 | 256.4 | 99.7 |
| 실시예 2 | 242.0 | 93.5 |
| 실시예 3 | 280.7 | 109.8 |
| 실시예 4 | 198.5 | 128.6 |
| 실시예 5 | 410.5 | 160.8 |
| 실시예 6 | 541.6 | 205.8 |
| 실시예 7 | 397.3 | 158.7 |
| 실시예 8 | 430.7 | 192.4 |
| 실시예 9 | 450.9 | 198.8 |
| 비교예 1 | 914.7 | 411.7 |
위 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 9에 따라 제조된 어류단백 분해물은 비교예 1에 비하여 히스타민 및 히소사미니다이즈의 방출량이 1.5 내지 3배 정도 낮은 것으로 확인되었다. 특히, 실시예 1 내지 4는 실시예 5 내지 9에 비해서도 히스타민 및 히소사미니다이즈의 방출량이 낮은 것으로 확인되었다.
상기 히스타민 및 히소사미니다이즈의 방출량이 높다는 것은 알러지 반응을 유발시킬 수 있다는 것이므로 실시예 1 내지 9는 비교예에 비하여 알러지 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.
시험예
2. 항산화 활성 측정
2-1. DPPH 라디칼 소거활성: 0.15 mM DPPH 용액(in 94.5 % ethanol) 45 uL에 EtOH 45 uL에 농도별로 증류수로 희석(1~5000배)한 각각의 GFPH 10 uL를 넣고 10초간 vortexing 한 후 암소에서 15분간 반응시킨 후에 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 다음 [수학식 3]에 대입하여 계산하였고 IC50값은 각 시료의 DPPH radical 소거율이 50 %일 때의 희석배수(DF)로 산출하여 각 시료의 소거활성을 비교하였다.
2-2. FRAP(Ferric reducing ability of plasma) 활성: 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) 및 20 mM FeCl36H2O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 37 ℃에서 10분 동안 가온한 후 FRAP 시약으로 사용하였다. 농도 5 mg/mL의 시료 10 uL를 FRAP 시약 90 uL와 혼합하여 37 ℃에서 5분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였으며 FeSO4·7H2O를 표준물질로 하여 얻은 표준 검량선으로부터 계산하여 mM FeSO4 eq./mg extract로 표시하였다.
| 구분 | DPPH 소거능(IC50, mg/) | FRAP(mM FeSO4 eq./mg extract) |
| 실시예 1 | 0.52 | 2.76 |
| 실시예 2 | 0.48 | 2.98 |
| 실시예 3 | 0.69 | 2.21 |
| 실시예 4 | 1.12 | 2.01 |
| 실시예 5 | 2.09 | 1.45 |
| 실시예 6 | 2.11 | 1.19 |
| 실시예 7 | 1.59 | 1.37 |
| 실시예 8 | 1.48 | 1.39 |
| 실시예 9 | 1.47 | 1.38 |
| 비교예 1 | 9.02 | 0.87 |
위 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 9에 따라 제조된 어류단백 분해물은 비교예 1에 비하여 DPPH 소거능 및 FRAP 활성이 우수한 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1 내지 4는 실시예 5 내지 9에 비해서도 DPPH 소거능 및 FRAP 활성이 우수한 것으로 확인되었다.
상기 DPPH 소거능 및 FRAP 활성이 우수하다는 것은 항산화 활성이 우수하다는 것이므로 실시예 1 내지 9는 비교예에 비하여 우수한 항산화 활성을 보이는 것으로 확인되었다.
시험예
3. 가수분해도, 갈변도 및
HMF
측정
3-1. 가수분해도: Standard로 Glycine(0.3125 mM~2.5 mM)을 사용하였으며, 100배 희석한 시료와 Standard를 96 well에 20 uL씩 분주한 뒤 Sodium bicarbonate buffer(pH 8.5) 50 uL를 각각 분주하고, 0.1 % TNBS를 50 uL 첨가하였다. 50 ℃의 Shaking Incubator에서 60분 동안 반응시킨 후, 10 % SDS를 넣어 단백질을 안정화 시키고 25 uL의 HCl로 반응을 종료시킨 후 Spectrometer(OD, 340 nm)에서 측정하여 아미노산 mM 값으로 변환하였다. 가수분해도는 넙치 부산물의 단백질 함량과 아미노산 분석을 통한 평균 분자량을 고려한 후 TNBS (Trinitrobenzenesulfonic Acid) assay를 이용하여 아미노산 mol 수를 분석하여 나타내었다.
3-2. 갈변도: 실시예 및 비교예의 제조된 당화 어류단백 분해물 용액을 흡광도로 측정할 수 있는 0.2 내지 0.8 범위 내에 들도록 증류수로 희석(1 내지 500배)하여 spectrophotometer(DU650 spectrophotometer, Beckman, USA)를 사용하여 갈색색소의 측정범위인 420 nm에서 흡광도를 측정하여 갈변도를 측정하였다.
3-3. HMF 함량: 실시예 및 비교예의 제조된 당화 어류단백 분해물의 당화 생성물(HMF)은 HPLC 분석 방법을 이용하여 측정하였다.
| 구분 | 가수분해도(%) | 갈변도 | HMF (ugHMF/mg당화어류단백분해물) |
| 실시예 1 | 11.6 | 589.67 | 97.5 |
| 실시예 2 | 11.7 | 612.73 | 110.1 |
| 실시예 3 | 11.6 | 534.41 | 78.4 |
| 실시예 4 | 10.3 | 522.84 | 67.5 |
| 실시예 5 | 9.0 | 384.51 | 8.4 |
| 실시예 6 | 11.5 | 399.72 | 26.4 |
| 실시예 7 | 11.4 | 259.46 | 10.2 |
| 실시예 8 | 11.3 | 402.46 | 13.8 |
| 실시예 9 | 11.5 | 399.75 | 19.5 |
| 비교예 1 | 11.4 | 112.10 | 0.1 |
위 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 9에 따라 제조된 당화 어류단백 분해물은 비교예 1에 비하여 가수분해도, 갈변도 및 HMF 함량 모두 우수한 것으로 확인되었다. 특히, 실시예 1 내지 4는 실시예 5 내지 9에 비해서도 가수분해도, 갈변도 및 HMF 함량이 우수한 것으로 확인되었다.
상기 실시예 1 내지 4는 HepG2 세포주, RBL-2H3 세포주, NRK-52E 세포주를 이용하여 세포 생존능을 측정한 결과, 세포독성은 나타나지 않았으며, 1 mg/㎖ 수준에서는 세포독성 보다는 세포 성장을 더욱 촉진시키는 것을 확인하였다.
Claims (22)
- 조단백 함량이 18% 이상인 어류의 내장이 제거된 어류 부산물 또는 어류 단백질과 단백질 분해효소를 40 내지 100 : 1의 중량비로 혼합하여 가수분해하는 단계;
상기 가수분해물을 탈염시키는 단계;
상기 탈염된 가수분해물을 분획하여 분자량이 0.1 내지 3 kDa인 분획된 가수분해물을 수득하는 단계; 및
상기 분획된 가수분해물과 당류를 1 : 1 내지 5의 중량비로 혼합하여 마이얄(Maillaird) 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법. - 삭제
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- 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 프로타멕스(Protamex), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 알카라제(Alcalase), 키모트립신(α-chymotrypsin), 트립신(Trypsin) 및 파파인(Papain)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 가수분해 시 온도는 40 내지 80 ℃인 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 가수분해 시 pH는 6.0 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 당류는 5탄당 또는 6탄당인 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 5탄당은 리보스, 자일로스 및 아라비로스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이며, 상기 6탄당은 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 프룩토오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 마이얄 반응온도는 100 내지 150 ℃인 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 마이얄 반응압력은 0.2 내지 3 kg/㎠인 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 마이얄 반응 시 pH는 7 내지 9인 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 마이얄 반응시간은 20 내지 60분인 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 분획은 한외여과막을 이용하는 것을 특징으로 하는 항원성이 저감되고 항산화 활성이 우수한 당화 어류단백 분해물의 제조방법.
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