KR101703132B1 - 이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 및 이를 이용한 약물 반응 예측 방법 - Google Patents

이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 및 이를 이용한 약물 반응 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 및 이를 이용한 약물 반응 예측 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 기술하고 있는 12종의 뇨 대사체는 이매티닙의 투여 전에 개체(피검체)의 약물 반응 예측에 필요한 정보를 제공함으로서, 개체에 최적의 치료법을 제공할 수 있게 하여 시간 및 비용 등 다양한 방면에서 효율적인 치료 환경을 제공하는 효과가 탁월하다.

Description

이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 및 이를 이용한 약물 반응 예측 방법{Markers for predicting pharmacodynamic response to imatinib and predicting method using thereof}
본 발명은 이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 및 이를 이용한 약물 반응 예측 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 타이라민, 오로티딘, L-히스티딘, 16β-하이드록시에스트라디올, 티아민, 3-인돌아세틱 에시드, 베타-시토스테롤, 에피네프린, 스핑고신, 7-디하이드로콜레스테롤, 베타인 및 아데닌으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뇨 대사체를 포함하는 이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 조성물 및 이를 이용하여 이매티닙에 대한 약물 반응 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
개인에 따라서 약물의 치료효과가 다르다는 것은 너무나 잘 알려져 있는 사실이다. 이러한 약물반응의 개인 차이를 유발하는 요인으로는, 환자의 연령, 체중, 성별, 체질 등과 같은 생물학적 요인이나, 흡연, 음주, 식습관, 병용약물 등과 같은 개별적 환경요인, 또는 환자 체내에서 일어나는 약물의 약동학적 특성이나 약력학적 특성에 영향을 주는 유전적 요인 등 매우 다양하다. 이와 같이 매우 다양한 약물반응의 개인차를 고려하여, 개인 환자별로 최적의 치료법을 선택하는 것이 맞춤의학의 핵심 주제이다. 즉, 종래에는 "고혈압에는 이 약"이라는 식으로, 질환의 종류나 정도에 따라 일률적으로 치료법을 적용해왔으나, 의학기술이 발달하여 한 가지 질환에 대하여 여러 가지 치료법을 적용할 수 있게 됨에 따라, 환자의 성별, 나이, 체질, 직업, 지역적 환경 등에 따라, 상기 환자에게 적합한 치료법을 선택할 수 있는 맞춤의학의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 예를 들어, 특정 질환이 발병된 환자가 병원에 방문하면, 의사와 상담 후 증상을 참조하여 의사가 약을 처방하거나 또는 적절한 치료법을 제시하게 된다. 이처럼 의사가 환자에게 약을 처방할 때에는, 진단결과에 근거한 의사의 주관적 판단에 의하여 적절한 의약품을 처방하는데, 경우에 따라서는 처방된 의약품이 적절한 치료효과를 나타내지 못할 수도 있고, 이러한 경우에는 다른 의약품을 처방하는 시행착오를 겪을 수도 있기 때문에, 이러한 불필요한 시행착오를 최소화하기 위한 맞춤의학의 개발이 요구되고 있다.
맞춤의학(Personalized Medicine)이라는 용어는 비교적 최근인 1998년 처음 언급 되었으며, 1999년 이후에야 Medline에 처음 소개 되는 등 그 역사가 매우 짧음에도 불구하고 현대 의학의 가장 중요한 핵심 키워드로서 회자 되고 있는 용어이다. 현재‘맞춤의학’이란 용어는 워낙에 광범위한 내용 및 의미를 내포하고 있어 이와 동일, 혹은 유사한 용어의 의미로지칭 되는 많은 용어들이 오늘날 사용 되고 있으며, 근거중심의학 (Evidence Based Medicine), 유전체 기반 의학, 맞춤 의학, 오믹스 기반 의학, 중개 의학, 시스템 의학 등이 이와 연관된 용어들로 언급 되고 있다. 이의 정의는 명확하게 확립 되어 있지 않지만, 정의를 한다면‘개인의 유전적, 환경적, 생물학적 특성에 기반하여 최대의 치료효과와 최소의 약물유해반응이 예상되는 가장 적절한 치료법을 선정하는 의학’정도로 소개 할 수 있을 것 이다.
이러한 맞춤의학은 궁극적으로는 모든 질환에 적용할 수 있으나, 특히 장기간의 투병기간이 소요되는 질환의 치료에 있어서 시간 및 비용 부담을 줄이기 위하여, 환자의 약물에 대한 반응을 예측하고 가장 효과적인 약물 처방에 중요한 역할을 한다.
한편, 최근 “-omics”종류의 하나인 metabolomics(대사체학)는 유전자나 단백질의 변화유무를 연구하는 genomics(유전체학)나 proteomics(단백질체학)를 포함하여 특정한 생물학적 변화 과정들을 통하여 생성된 저분자 대사체의 프로파일들을 체계적이며 종합적으로 연구하는 학문이다. 구체적으로 대사체학이란 세포 또는 조직 내의 대사체의 거동, 변화 등을 체계적으로 확인·정량하고, 그 결과로부터 대사체군을 다양한 생리·병리적 상태와 연관지어 대사체 네트워크를 다시 해석하는 총체적 연구를 말한다. 대사체학은 유전자 표현형과 단백질체의 분석만으로 해석할 수 없는 세포내 변화 등의 상관관계를 대사 네트워크 전체를 통해 고찰하고, 얻어진 결과를 통하여 최종생성물의 변화량에 대한 원인을 해석하는 유일한 연구분야이다. 유전체학, 전사체학 및 단백질체학과 더불어 대사 프로파일링을 통하여 얻은 세포 기능에 대한정보들을 종합하여 복잡한 생명체의 구조를 규명하려는 연구들이 시도되고 있다.
대사체학 연구를 위해서는 대사체의 변화를 네트워크 모델로 이해하고, metabolome의 변화를 검출·확인하기 위한 초정밀분석기술과 그 결과를 다시 생체의 생리적 상태와 연관지어 해석하기 위한 통계분석이 기초가 된다. 이러한 대사체 연구 중 대사체 프로파일링 연구는 세포 또는 조직 내의 대사체의 거동, 변화 등을 체계적으로 확인하고 정량함으로써 대사체군을 생리 상태와 연관 지어 대사체 네트워크를 이해하고 다시 해석하고 대사체 변화를 네트워크 모델로 이해하는 새로운 패러다임이다. 초정밀분석기술인 프로파일링 연구는 크게 대사체를 총체적으로 분석하는 global(non-targeted) profiling과 lipid, hormone등과 같은 특정 대사체를 분석하는 targeted profiling으로 나눌 수 있다.
생체에는 여러가지 대사경로(metabolic pathway)와 관련하여 다양한 대사체(또는 대사산물)들이 존재하지만, 질병 또는 약물의 반응 예측에 있어서 이들이 모두 유의미한 정보를 주는 것은 아니며 또한 여러 가지 대사체들이 유기적으로 연결되어 종합적인 정보를 제공하므로 대사체들 사이에 특정 관계를 도출하여 유의미한 정보를 알아내는 데에는 어려움이 있다.
이에 본 발명자들은 대사체학에 기반하여 개인 맞춤약물 처방의 실현방법을 연구하던 중, 뇨(urine) 속에 포함된 특정 12개 대사체의 프로파일 분석을 통하여 이매티닙(imatinib) 투여 전에 환자의 약물 반응이 예측 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 타이라민(tyramine), 오로티딘(orotidine), L-히스티딘(L-histidine), 16β-하이드록시에스트라디올(16β-hydroxyestradiol), 티아민(thiamine), 3-인돌아세틱 에시드(3-indoleacetic acid), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 에피네프린(epinephrine), 스핑고신(sphingosine), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol), 베타인(betaine) 및 아데닌(adenine) 으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뇨 대사체를 포함하는, 이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이매티닙의 투여 전에 개체의 뇨 시료로부터 타이라민(tyramine), 오로티딘(orotidine), L-히스티딘(L-histidine), 16β-하이드록시에스트라디올(16β-hydroxyestradiol), 티아민(thiamine), 3-인돌아세틱 에시드(3-indoleacetic acid), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 에피네프린(epinephrine), 스핑고신(sphingosine), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol), 베타인(betaine) 및 아데닌(adenine) 으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 대사체 프로파일을 분석하는 단계를 포함하는, 이매티닙에 대한 약물 반응 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 타이라민(tyramine), 오로티딘(orotidine), L-히스티딘(L-histidine), 16β-하이드록시에스트라디올(16β-hydroxyestradiol), 티아민(thiamine), 3-인돌아세틱 에시드(3-indoleacetic acid), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 에피네프린(epinephrine), 스핑고신(sphingosine), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol), 베타인(betaine) 및 아데닌(adenine) 으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뇨 대사체를 포함하는, 이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본원 발명은 이매티닙의 투여 전에 개체의 뇨 시료로부터 타이라민(tyramine), 오로티딘(orotidine), L-히스티딘(L-histidine), 16β-하이드록시에스트라디올(16β-hydroxyestradiol), 티아민(thiamine), 3-인돌아세틱 에시드(3-indoleacetic acid), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 에피네프린(epinephrine), 스핑고신(sphingosine), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol), 베타인(betaine) 및 아데닌(adenine) 으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 대사체 프로파일을 분석하는 단계를 포함하는, 이매티닙에 대한 약물 반응 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자는 뇨 대사체 중 타이라민(tyramine), 오로티딘(orotidine), L-히스티딘(L-histidine), 16β-하이드록시에스트라디올(16β-hydroxyestradiol), 티아민(thiamine), 3-인돌아세틱 에시드(3-indoleacetic acid), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 에피네프린(epinephrine), 스핑고신(sphingosine), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol), 베타인(betaine), 아데닌(adenine)의 뇨 대사체가 개체의 이매티닙에 대한 약물 반응을 예측하는 마커로 사용될 수 있다는 신규한 용도를 규명하였으며, 이는 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다. 이는 본 발명의 실시예에 잘 나타나 있다.
따라서 본 발명은 타이라민(tyramine), 오로티딘(orotidine), L-히스티딘(L-histidine), 16β-하이드록시에스트라디올(16β-hydroxyestradiol), 티아민(thiamine), 3-인돌아세틱 에시드(3-indoleacetic acid), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 에피네프린(epinephrine), 스핑고신(sphingosine), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol), 베타인(betaine) 및 아데닌(adenine)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뇨 대사체를 포함하는, 이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "마커"는 일반적으로 분석 대상 시료(sample)로부터 차별적으로 검출가능하고, 질환 상태를 포함하여 세포 또는 개체의 특정 상태를 표시하는 분석물질을 지칭한다. 분석물질은 세포 또는 개체에서 정량적으로 또는 정성적으로 구분될 수 있다면 차별적으로 검출가능하다.
본 발명의 용어 "이매티닙(imatinib)"이란, 화학적으로 4-(4-메틸피페라진-1-일메틸)-N-[4-메틸-3-((4-피리딘-3-일)피리미딘-2-일-아미노)페닐]-벤즈아미드(4-(4-methylpiperazin-1-ylmethyl)-N-[4-methyl-3-((4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl-amino)phenyl]-benzamide)라고 표시되는 화합물을 의미한다. 상기 이매티닙은 Bcr-Abl 유전자에 의하여 발현이 유도되는 타이로신키나제의 ATP 결합부위에 결합하여 타이로신키나제의 활성을 특이적으로 억제함으로써 만성골수성백혈병을 치료하는 치료제로서 알려져 있고, 이의 약학적으로 허용되는 염의 일종인 이매티닙 메실레이트는 글리벡(GleevecTM, Novartis Pharmaceuticals, U.S.A.)이라는 상품명으로 판매되고 있다. 뿐만 아니라, 혈소판 유래 성장인자 수용체 베타(PDGF-베타), Akt(단백질 카이나제 B), 세포외 조절성 카이나제 1 및 2(ERK 1 및 ERK2), c-kit 등과 같은 다른 종류의 타이로신키나제에 대하여도 억제효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 상기 이매티닙(글리벡)의 효능 효과와 관련하여 식품의약품안전처 승인 질환(적응증)으로는, 전술한 만성골수성백혈병, 위장관 기질종양(Gastrointestinal stromal tumors; GIST), 및 이매티닙에 감수성이 있는 티로신인산화효소(tyrosine kinase)와 관련된 다음의 질환으로 기존 치료제 또는 치료요법에 실패하거나 명확한 이점이 있는 임상적 치료방법이 없는 다음의 질환을 포함한다; 성인환자에서 혈소판유도 성장인자수용체(PDGFR) 유전자 재배열이 확인된 골수이형성증후군/골수증식질환, 성인환자에서 FIP1L1-PDGFRα 재배열이 확인된 과호산구성증후군/만성호산구성백혈병, 성인환자에서 절제 불가능한 재발성 또는 전이성 융기성 피부섬유육종.
상기 용어‘약물 반응(성)’이란 특정 질환을 앓고 있는 개체에서 약물에 의해 환부의 증상이 개선되는 상태 변화를 의미한다. 구체적으로 본 발명에서 상기 약물은 이매티닙(imatinib)이고, 상기 특정 질환이란 이매티닙이 치료효능을 가지는 것으로 공지된 질환이라면 특별힌 제한되지 않으나, 예를 들어 만성골수성 백혈병, 위장관 기질종양(GIST), 및 이매티닙에 감수성이 있는 티로신인산화효소(tyrosine kinase)와 관련된 다음의 질환으로 기존 치료제 또는 치료요법에 실패하거나 명확한 이점이 있는 임상적 치료방법이 없는 다음의 질환을 포함한다; 성인환자에서 혈소판유도 성장인자수용체(PDGFR) 유전자 재배열이 확인된 골수이형성증후군 및 골수증식질환, 성인환자에서 FIP1L1-PDGFRα 재배열이 확인된 과호산구성증후군 및 만성호산구성백혈병, 성인환자에서 절제 불가능한 재발성 또는 전이성 융기성 피부섬유육종.
따라서 본 발명의 상기 약물 반응은 구체적으로, 만성골수성백혈병, 위장관 기질종양(GIST), 특정 유전자 재배열이 확인된 골수이형성증후군 및 골수증식질환, 특정 유전자 재배열이 확인된 과호산구성증후군 및 만성호산구성백혈병, 일부 융기성 피부섬유육종으로 이루어진 군에서 선택된 질환을 앓고 있는 개체에서 이매티닙에 의해 상기 질환의 증상이 개선되는 상태 변화를 의미한다.
상기‘반응(성)’은 감수성 또는 민감성 등으로 이해될 수 있으며, 상기 용어 들은 본 명세서에서 호환성 있게 사용된다. 따라서 개체가 특정 약물(이매티닙)에 대하여 약물 반응(또는 감수성)이 있다는 것은 약물 반응(감수성)이 없는 것으로 결정된 개체에 비하여 상기 약물에 대한 치료적 효능이 나타날 가능성이 보다 높음을 의미한다.
또한 본 발명은, 이매티닙의 투여 전에 개체의 뇨 시료로부터 타이라민(tyramine), 오로티딘(orotidine), L-히스티딘(L-histidine), 16β-하이드록시에스트라디올(16β-hydroxyestradiol), 티아민(thiamine), 3-인돌아세틱 에시드(3-indoleacetic acid), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 에피네프린(epinephrine), 스핑고신(sphingosine), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol), 베타인(betaine) 및 아데닌(adenine) 으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 대사체 프로파일을 분석하는 단계를 포함하는, 이매티닙에 대한 약물 반응 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 '개체(subject)'는‘피검체’또는 ‘대상자’와 호환성 있게 사용되며, 본 명세서에서 이매티닙의 투여를 필요로 할 가능성이 있는 인간(Homo sapiens)을 의미하는 것으로, 바람직하게 동양인일 수 있고, 가장 바람직하게 한국인, 특히 한국인 남성 일 수 있다.
상기 '뇨(urine)'는 혈액 속의 노폐물과 수분이 신장에서 걸러져서 방광 속에 괴어 있다가 요도를 통하여 몸 밖으로 배출되는 액체를 의미한다. 본 발명에서 상기 뇨 시료 수집 전(前) 및 수집 중에 개체(대상자)는 식이 및 생활습관조절이 필요할 수 있으며, 예를 들어 뇨 시료 수집 전 및 수집 중에 카페인 성분이 함유된 음식의 제한(금지), 고-지방 식이 제한, 고-염분 식이 제한, 의약품의 섭취 제한, 금연(禁煙), 금주, 금식 또는 단식 등을 포함하여 한 가지 이상의 제한요건을 둔 상태로 조절될 수 있다. 상기 식이 및 생활조건의 조절은 뇨 시료 수집 시점을 기준으로 10시간 내지 168시간 전부터 수행되는 것 일 수 있으며, 당업자라면 각 제한요건에 따라 적정한 시간을 결정할 수 있을 것이다.
상기 뇨 시료는 개체로부터 처음 수집할 때의 상태 그대로 분석에 사용될 수 있으며, 분석, 처리, 보관 등의 용이함을 위하여 여과, 농축, 정제, 제단백 등 임의의 전처리 과정이 추가적으로 수행되어 제조되는 것 일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 뇨 시료는 최초 수집한 뇨에 제단백(deproteinization) 처리를 가한 것 일 수 있다. 상기 제단백 처리는 공지의 단백제거 방법에 의한 것일 수 있으며, 예를 들어 아세토니트릴 처리, 가열법(자비법, Boiling Method), 염석(Salting-Out), 삼염화초산(trichloroacetic acid)법, 피크린산(picric acid)법, 과염소산(perchloric acid)법, 폴린-우(Folin-Wu)법, 소모기(Somogyi)법, 메타인산염(Metaphosphate)법, 콜로디온(collodion)막 또는 셀로판 아세틸셀룰로오스(cellophane acetyl cellulose)막 등을 사용하는 투석 장치에 의한 단백제거 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직하게 본 발명의 제단백 처리는 아세토니트릴 첨가에 의한 단백질 침전 방법에 의한 것일 수 있다.
상기‘대사체(metabolite)’는 생체 내의 물질변화의 결과로서 생성되는 물질의 총칭으로, 대사체는 저분자로서 대사 과정의 중간체 또는 최종산물이다. 일반적으로 대사체는 생체의 표현형(phenotype)을 가장 잘 나타내는 정량할 수 있는 소분자로서, 본 발명에서는 타이라민, 오로티딘, L-히스티딘, 16β-하이드록시에스트라디올, 티아민, 3-인돌아세틱 에시드, 베타-시토스테롤, 에피네프린, 스핑고신, 7-디하이드로콜레스테롤, 베타인 및 아데닌의 12개 대사체를 하나 또는 두 개 이상 복합적으로 분석하는 것이 특징이다.
본 발명에서 용어 "프로파일"은 마커에 관한 임의의 정보를 광범위하게 지칭할 수 있다. 상기 정보는 정성적 (예를 들어, 존재 또는 부재) 또는 정량적 (예를 들어, 수준(level), 상대수준(relative level), 신호 강도(signal intensity) 또는 양)일 수 있다.
마찬가지로 본 발명에서 용어‘대사체 프로파일(metabolite profile)’은 전술한 12개의 대사체에 대하여 이의 정성적 또는 정량적 정보를 포함하는 의미이다. 이때 상기 대사체 프로파일은 각각의 대사체가 별개로 유의미한 정보를 나타낼 수 있고, 또한 2종 이상의 대사체간 상호 관계(ex, 별개의 데이터로는 유의미하지 않아보이나 이들 사이에 수치상 관계식 도출 등)에 의하여 유의미한 정보를 나타낼 수 있다. 상기 대사체 프로파일은 당업계에 공지된 대사체 프로파일링(metabolite profiling) 기법을 통하여 수득된 데이터로서 이해될 수 있으며, 상기 데이터는 측정 또는 분석기기에 따라 대상 물질의 고유값을 나타낼 수 있다.
상기 용어‘대사체 프로파일링(metabolite profiling)’이란 목적하는 대사체와 관련하여 특성 정보(또는 자료)를 수집 및 가공하는 행위를 의미하는 것으로, 본 발명의 일부 실시양태에서, 대사체 프로파일링은 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 기체 크로마토그래피, 질량 분광측정법, 병렬식 질량 분광측정법, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분광측정법, 전기분무 이온화 (ESI) 질량 분광 측정법, 표면-증강 레이저 탈착/이온화-비행 시간 (SELDI-TOF) 질량 분광측정법, 4중극자-비행 시간 (Q-TOF) 질량 분광측정법, 대기압 광이온화 질량 분광측정법 (APPI-MS), 푸리에 변환 질량 분광측정법 (FTMS), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-푸리에 변환-이온 사이클로트론 공명 (MALDI-FT-ICR) 질량 분광측정법, 2차 이온 질량 분광측정법(SIMS), 방사선면역검정, 미세유체 칩-기재 검정, 형광의 검출, 화학발광의 검출 또는 이것들의 조합을 통해 수행되는 것일 수 있다.
대사체학 연구를 위해서는 대사체의 변화를 네트워크 모델로 이해하고, 대사체(metabolome)의 변화를 검출·확인하기 위한 초정밀분석기술과 그 결과를 다시 생체의 생리적 상태와 연관지어 해석하기 위한 통계분석이 기초가 된다. 이러한 대사체 연구 중 대사체 프로파일링 연구는 세포 또는 조직 내의 대사체의 거동, 변화 등을 체계적으로 확인하고 정량함으로써 대사체군을 생리 상태와 연관 지어 대사체 네트워크를 이해하고 다시 해석하고 대사체 변화를 네트워크 모델로 이해하는 새로운 패러다임이다. 초정밀분석기술인 프로파일링 연구는 크게 대사체를 총체적으로 분석하는 비표적화 프로파일링(global(non-targeted) profiling)과 lipid, hormone등과 같은 특정 대사체를 분석하는 targeted profiling으로 나눌 수 있다.
본 발명에서 상기 대사체 프로파일은, 상기 12개의 대사체 물질에 대하여 표적화 프로파일링(targeted profiling)이 이루어지는 것을 그 특징으로 한다. 상기 표적화 프로파일링은 세포나 생체 내 전체 대사산물 중에서 목적하는 특정 대사산물의 종류 및 정량적 변화에 대한 분석을 하는 것으로, 본 발명에서는 상기 12개의 대사체의 검출 및 정량적 변화에 대한 분석을 수행하는 것이 그 특징이다. 본 발명에서 수행되는 대사체 프로파일링은 당업계에 알려진 표적화 프로파일링(targeted profiling)방법에 의하는 것이라면 그방법이 특별히 제한되지 않는다.
바람직하게 본 발명에서 상기 12개 대사체 프로파일은 대사체에 대한 질량스펙트럼에 의해 결정되는 것일 수 있다. 따라서 본 발명은 개체(피검체)의 뇨시료로부터 상기 대사체들을 분리 수득(채취)한 다음 그 대사체들을 질량분석기로 분석하여 얻은 분광학적 피크로부터 얻게 되는 각 대사체 프로파일 정보를 사용하여 이매티닙 투여 전에 개체의 약물 반응을 예측한다. 예를들어 LC-MS 등의 질량분석기법을 이용한 뇨대사체 프로파일링은 종합적이고 특이적인 대사체 표현형을 제공할 수 있다. 즉, 본 발명의 상기 대사체 프로파일은 이매티닙 투여 전에 개체의 뇨 시료를 상기 대사체에 관한 질량분석기법으로 분석하여 수득하는 것 일 수 있다. 따라서 본 발명에서 상기 12개 대사체에 대한 프로파일링은, 구체적으로 질량분석법에 의해 도출된 각 대사체별 피크 강도(peak intensity) 데이터를 이용하는 일련의 정보처리과정일 수 있다.
상기 질량분석법(질량 분광측정법)은 당해 기술 분야에서 공지이다 (Burlingame 등. Anal. Chem. 70: 647R-716R (1998); Kinter 및 Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience, New York (2000)참고). 질량분석법과 연관된 기본적 프로세스는 샘플로부터 유래된 가스상 이온의 생성 및 그들의 질량의 측정이다.
가스-상 이온의 이동은 질량분석기 내에 생성된 전자기장을 사용하여 정확하게 조절될 수 있다. 이러한 전자기장에서의 이온의 이동은 이온의 m/z에 비례하며, m/z는 샘플의 질량을 측정하는 기초를 형성한다. 이러한 전자기장에서의 이온의 이동은 이온이 함유되고 포커스되는 것을 가능하게하고, 이는 질량분석법의 고감도로서 설명된다. m/z 측정의 과정 동안, 이온은 고 효율성으로 입자 검출기로 전달되고, 상기 검출기는 이러한 이온의 도달을 기록한다. 각 m/z에서 이온의 양은 그래프 상의 피크에 의하여 나타나며, 이때, x 축은 m/z이고, y 축은 상대적 존재비이다. 질량 분석기에따라 다른 수준의 해상도(분해능) 즉, 질량에 있어서 밀접하게 연관된 이온 사이의 피크를 분리하는 능력을 가진다. 해상도(분해능)는 R=m/델타 m( R = m / Δm)으로서 정의되고, 이때, m은 이온 질량이고 델타 m은 질량 스펙트럼의 두 피크 사이의 질량의 차이이다. 예를 들어, 해상도 1000을 가진 질량분석기는 100.1의 m/z를 가진 이온으로부터 100.0의 m/z를 가진 이온을 분리할 수 있다.
일반적으로 질량 분석계(또는 질량분석기, mass spectrometer)는 다음의 주된 구성요소를 가진다; 샘플 주입구, 이온 소스(source, 이온원), 질량 분석기(mass analyzer), 검출기, 진공 시스템, 장비-조절 시스템, 및 데이터 시스템. 상기 샘플 주입기, 이온 소스, 및 질량 분석기에서의 차이는 일반적으로 장비의 형태 및 그것의 성능을 정의한다. 예를 들어, 주입구는 모세관-컬럼 액체 크로마토그래피 소스일 수 있거나 또는 매트릭스-보조된 레이저 이탈에서 사용되는 것과 같은 직접적인 프로브 또는 스테이지 (stage)일 수 있다. 예를 들어, 일반적인 이온 소스는 나노스프레이 및 마이크로스프레이 또는 매트릭스-보조된 레이저 이탈을 포함하는 전자스프레이(electrospray)이다. 예시적인 질량 분석기는 사중극자 질량 여과기 (quadrupole mass filter), 이온 트랩 질량 분석기 및 비행시간 (time-of-flight) 질량 분석기를 포함한다. 상기 이온 소스 및 질량분석기(mass analyzer)는 다양한 조합으로 이용할 수 있으며, 이는 사용자 편의에 맞는 검출 프로토콜의 설계에 있어서의 유연성을 가능하게 한다. 게다가, 질량 분석 장치는 이온원으로부터의 모든 이온을 질량 분석 장치에 연속적으로 또는 동시에 보내도록 프로그램될 수 있다. 또한 질량 분석 장치는 다른 이온을 차단하면서, 질량 분석 장치에 보낼 특정 질량의 이온을 선택하도록 프로그램될 수 있다. 질량 분석 장치에 있어서 이온의 움직임을 정확히 제어하는 능력은 검출 프로토콜에 있어서 보다 많은 선택지(greater option)를 허용한다. 즉, 상기와 같이 질량 범위를 선택하는 능력은 분석에 있어서 백그라운드 노이즈를 감소시킬 수 있으며, 신호 대 노이즈 비를 증가시킨다.
구체적으로, 이온 형성 프로세스는 질량 스펙트럼 분석을 위한 개시점이다. 몇 가지 이온화 방법이 이용가능하고 이온화 방법의 선택은 분석되는 샘플에 의존한다. 예를 들어 전자스프레이 이온화(ESI)와 같은 비교적 온화한 이온화 과정이 바람직할 수 있다. ESI 방법에서는, 샘플을 함유한 용액이 높은 포텐셜에서 정밀한 바늘을 통하여 통과되고, 이것은 질량 분석기 내로 향하는 높게 하전된 드롭플렛의 정밀한 스프레이로 인하여 강력한 전기장을 생성한다. ESI가 용액으로부터 직접적으로 하전된 분자를 생산할 수 있기 때문에, 액체 크로마토그래피 시스템으로부터 샘플이 공존할 수 있다. 예를 들어, 질량분석기는 HPLC와 같은 액체 크로마토그래피(LC)에 대한 주입구를 가지며, 분획은 크로마토그래피로부터 질량분석기로 흐른다. 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기의 이러한 인-라인 (in-line) 배열은 때때로 LC-MS로서 언급된다.
다른 이온화 과정은 예를 들어, 고-에너지 빔의 중성 원자가 고체 샘플에 충돌하여 이탈 및 이온화를 야기하는 고속-원자 충돌 (fast-atom bombardment) (FAB)을 포함한다. 매트릭스-보조된 레이저 이탈 이온화 (Matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)는 레이저 펄스가 샘플과 충돌하여 UV-흡수 화합물 매트릭스에서 결정화되는 방법이다. 당해 기술 분야에서 공지된 다른 이온화 과정은 예를 들어, 플라스마 및 글로우 방전, 플라스마 이탈 이온화, 공명 이온화, 및 이차 이온화를 포함한다.
또한 몇 가지 형태의 질량 분석법 및 질량 분석기가 하기와 같이 설명되나, 본 발명에 적용될 수 있는 질량분석법 및 질량분석기기로서 그 종류가 하기에 제한되지 않는다; 사중극자 질량 분석법은 사중극자 질량 필터 또는 분석기를 사용한다. 이러한 형태의 질량 분석기는 2개의 전기적으로 연결된 로드(rod)의 2 세트로서 배열된 4 로드로 구성된다. rf 및 dc 전압의 조합은 그들이 질량 필터의 시작에서 끝으로 움직일 때 이온의 진동하는 운동의 원인이 되는 장을 형성하는 각 쌍의 로드에 적용된다. 이러한 장의 결과는 한 쌍의 로드 내의 고-통과 (high-pass) 및 다른 쌍의 로드 내의 저-통과 필터의 생성이다. 고-통과 및 저-통과 필터 사이의 중첩은 양 필터를 통과 및 사중극자의 길이를 가로지를 수 있는 한정된 m/z를 남긴다. 이 m/z는 모든 다른 m/z가 불안정한 궤도를 가지고, 질량 필터 내에 남아 있지 않을 동안 사중극자 질량 필터 내에서 선택되고 안정하게 남아있다. 질량 스펙트럼은 적용된 장을 램핑 (ramping)함에의하여 결과되며, 증가하는 m/z는 질량 필터를 통과하기 위하여 선택되고 검출기에 도달한다. 추가적으로, 사중극자는 또한 rf-단일 장을 적용함에 의하여 모든 m/z의 이온을 함유 및 전달하기 위하여 준비될 수 있다. 이것은 사중극자가 질량분석기의 영역에서 렌즈 또는 포커싱 시스템으로서 작용하는 것을 가능하게 하며, 이때, 이온 전달은 질량 필터 없이 요구된다.
이온 트랩 질량 분석법은 이온 트랩 질량 분석기를 사용한다. 이러한 질량 분석기에 있어서, 장이 적용되고, 모든 m/z의 이온은 초기에 트랩되고 질량 분석기에서 진동한다. 이온은 옥타폴 (octapole) 렌즈 시스템과 같은 포커싱 장비를 통하여 이온 소스로부터 이온 트랩으로 들어온다. 이온 트랩은 전극을 통한 검출기로 흥분 및 배출 전에 트래핑 지역에서 발생한다. 질량 분석은 트랩의 밖으로 또는 검출기 내로 증가하는 m/z의 이온을 배출하는 방법으로 진동의 증폭을 증가시키는 전압을 순차적으로 적용함으로서 달성된다. 사중극자 질량 분석법과는 반대로, 선택된 m/z를 가진 것을 제외한 모든 이온은 질량 분석기의 장에 보유된다. 이온 트랩에 대한 하나의 이점은 한 시간에 트랩되는 이온의 수를 제한하는데 주의를 주는 한 그들은 매우 높은 민감성을 가진다는 점이다. 이온의 수의 조절은 이온이 트랩 내로 주입되는 시간 이상으로 다양하게 함으로서 달성된다. 이온 트랩의 질량 해상도는 이온 트랩이 낮은 m/z 제한을 가지더라도 사중극자 질량 필터의 그것과 유사하다.
비행 시간 질량 분석법은 비행 시간 질량 분석기를 사용한다. m/z 분석의 이러한 방법을 위하여, 이온은 먼저 전기장 (높은 전압에 의하여 생성) 내의 가속에 의하여 고정된 양의 역학적 에너지가 주어진다. 가속 후에, 이온은 장-없는 또는 "표류 (drift)" 지역으로 들어오며, 이때, 그것은 그것의 m/z에 반비례의 속도로 이동한다. 그러므로, 낮은m/z를 가진 이온은 높은 m/z를 가진 이온 보다 더 빠르게 이동한다. 장-없는 지역의 길이를 이동하기 위하여 이온에 요구되는 시간이 측정되고 이온의 m/z를 계산하기 위하여 사용된다. 이러한 형태의 질량 분석에서의 한가지 고려할 점은 동일한 시간에 분석기 내로 도입되어 연구되는 한 세트의 이온이다. 예를 들어, 이러한 형태의 질량 분석은 짧은 잘-한정된 펄스 내에서 이온을 생성하는 MALDI같은 이온화 기술에 아주 적합하다. 다른 고려할 점은 그들의 역학적 에너지에 있어서 다양성을 가지는 이온에 의하여 생성된 속도 확산을 조절하는 것이다. 더 긴 비행 관, 이온 반사기, 또는 더 높은 가속 전압의 사용은 속도 확산의 효과를 최소화하는데 도움을 줄 수 있다. 비행 시간 질량 분석기는 높은 수준의 민감성 및 사중극자 또는 이온 트랩 질량 분석기보다 넓은 m/z범위를 가진다. 또한 질량 분석기의 스캐닝을 요구하지 않기 때문에 이러한 형태의 질량분석기로 빠른 데이터를 얻을 수 있다.
또 한가지 예로서 상기 질량분석기들은 한 질량분석기에 다른 질량분석기가 연결된 형태로 제공될 수 있으며, 이를 직렬 질량분석법(tandem mass spectrometry, MS/MS)이라 칭한다.
상기 질량분석기의 사용 전에 뇨 시료로부터 대사체 물질을 분리하기 위한 크로마토그래피(chromatography) 단계가 선행될 수 있다. 복잡한 혼합물(complex mixture) 중에 함유된 목적 대사체들을 분리하기 위하여 크로마토그래피에 근거한 질량분석기법이 이용가능하다. 상기 크로마토그래피 과정은 본 발명의 목적 대사체 이외의 염, 효소, 또는 다른 완충용액 성분을 제거하기 위하여 추가적으로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 인-라인 또는 오프-라인 (off-line)으로 역상 HPLC 컬럼을 사용한 샘플의 탈염은 이온화 프로세스의 효율성을 증가시키고 따라서 질량 분석법에 의한 검출의 감도를 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 이동상과 고정상에 대한 혼합성분 각각의 인력차이를 이용하는 것으로 이에 제한되지 않으나, 이동상의 종류에 따라 기체 크로마토그래피(Gas Chromatography, GC), 액체 크로마토그래피(Liquid Chromatography(LC) 또는 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)로 칭함), 초임계 크로마토그래피(Supercritical Fluid Chromatography) 등이 있다. 분리 원리에 따라서도 좀 더 세분화된 크로마토그래피 방법이 당업계에 알려져있으며, 당업자라면 본 명세서에서 예시한 크로마토그래피 종류에만 한정하지 않고 필요에따라 선택적으로 응용가능함이 자명하다.
본 발명에서 질량분석은 상기와 같이 당업계에 공지된 여러가지 질량분석방법을 통상의 기술자가 적절히 선택하여 수행할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 크로마토그래피에 근거하는 방법으로서‘크로마토그래피-질량분석기법’을 이용하는 것일 수 있다. 예를들어 액체 크로마토그래피-질량분석기(LC-MS) 또는 기체 크로마토그래피-질량분석기(GC-MS)등을 사용하는 것 일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 질량분석은 LC-MS(또는 HPLC-MS) 또는 LC-MS/MS를 사용하는 것 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 MS가 전자분무 이온화(Electrospray ionization)의 이온원(ion source) 및 이온 트랩 질량분석 방식을 취하는 LC-ESI-MS(Electrospray ionization-ion trap mass spectrometry) 또는 LC-ESI-MS/MS(liquid chromatography-electrospray ionization-ion trap tandem mass spectrometry)를 사용하는 것 일 수 있다. 본 발명의 질량분석기에 관하여 상용제품으로는, 예를들어 Finnigan™ LXQ™ 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 질량분석기기를 이용한 본 발명의 대사체 프로파일링 및 이의 정보처리과정은 다음과 같이 예시될 수 있다; 예를 들어 환자의 뇨 시료로부터 상기 12개의 뇨 대사체중 일 부 또는 전체에 대하여 LC-MS 분석을 이용하여 피크 강도(peak intensity, 피크의 값은 해당 분자의 양(abundance) 또는 비율일 수 있다)를 측정하고, 상기 피크 강도를 분위수 정규화(quantile normalization) 알고리즘을 이용하여 log2 정규화를 시행하여 정규화된 대사체 강도(normalized metabolite intensity)를 구한 후, 상기 정규화된 대사체 강도를 특정 계산식에 대입하여 나온 값을 이용하는 방법 등이 사용될 수 있다. 이때 상기 특정 계산식에 대입하여 나온 값에 대하여 어떠한 기준값에 의거하여 기준값보다 값이 크거나 적을 때 이매티닙에 대한 약물 반응이 있거나 없을 것으로 판정할 수 있다.
본 발명에서 기술하고 있는 12종의 뇨 대사체는 이매티닙의 투여 전에 개체(피검체)의 약물 반응 예측에 필요한 정보를 제공함으로서, 개체에 최적의 치료법을 제공할 수 있게 하여 시간 및 비용 등 다양한 방면에서 효율적인 치료 환경을 제공하는 효과가 탁월하다.
도 1은 대상자로부터 수득한 뇨 샘플의 전처리 과정을 나타낸다.
도 2는 뇨 샘플로부터 분석된 여러가지 대사체들의 크로마토그램 (chromatogram)을 나타내는 것으로, 이때 본 발명의 12개 대사체 마커들은 붉은 색으로 표시하였다.
도 3은 대상자의 뇨와 품질관리(QC) 샘플들에서 얻은 주성분분석(principle component analysis, PCA) 스캐터 플롯을 나타낸다. 초록색 점(●)은 이매티닙 투약 전 샘플을, 파란색 점(◆)은 이매티닙 투약 후 샘플, 빨간점(■)은 QC 샘플들을 나타낸다. 잘 뭉쳐져 있는 QC 샘플은 분석이 유효하고 LC/MS 분석 시 주요 기기편향이 없음을 의미한다.
도 4는 이매티닙의 약물반응과 높은 상관관계를 갖는 대사체들의 선별을 위한 뇨 LC/MS 대사체 데이터의 PLS-DA 모델링을 나타낸다. 여기서 각 점은 수집된 대상자의 뇨 샘플을 나타내고, 검정색 점(■)은 이매티닙 투약 전 샘플을 나타내고 빨간색 점(◆)은 이매티닙 투약 후 샘플을 나타내며 투약 전과 투약 후가 명확하게 분리되고 있다.
도 5는 본 발명의 PLS-DA 모델의 내부 유효성 검증을 위하여 R2 (적합도)와 Q2 (모델의 예측가능성) 값을 나타내며, 우연적 상관관계와 데이터 오버핏(data over-fitting)을 체크하기 위함이다. R2 값은 0.746으로 비교적 높은 적합도를 나타냈으며 Y축에서 절편은 -0.0625로 유효함을 확인하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실험방법 >
1) 연구방법과 대상자의 자격
전향적 탐색 연구를 수행하였고 연구 전 동의서를 받은 20명의 건강한 남성 자원자들을 대상으로 하였다. 만 20세 미만이거나 심혈관계, 간, 신장, 혈액종양, 호흡기계, 내분비계, 중추신경계, 정신질환, 근골격계에 해당하는 임상적으로 유의한 질환이 있거나 과거력이 있었던 사람은 배제하였다. 모든 대상자들은 연구기간 동안 이매티닙 400 mg을 1일 1회 경구 복용하였다.
2) LC/MS기반 무작위 대사체 프로파일링
무작위의 대사체 프로파일을 분석하기 위해, LC/MS 분석은 하기의 과정에 따라 수행되었다: 뇨 샘플 준비, LC/MS 분석, 피크 검출과 정렬(peak detection and alignment), 피크 강도 정규화(peak intensity normalization), 및 다변량 통계 분석. 선형 이온-트랩 질량분석기 Finnigan™ LXQ™ (Thermo Electron, Waltham, MA)에 연결된 Alliance HPLC (Waters Corporation, Milford, MA)로 구성된 LC/MS 분석 시스템을 사용하였다. 상기 Finnigan™ LXQ™은 이온트랩 질량분석기로서 syringe pump, divert/inject valve, Electrospray ionization (ESI) source, MS detector 및 Xcalibur data system을 포함하여 이루어진다.
3) 뇨 샘플 준비
대사체 분석을 위하여, 이매티닙 투여 시점을 기준으로(0h), 이매티닙 투여 전 12시간, 이매티닙 투여 후 12시간 동안 소변 시료를 수집하였다. 뇨 샘플 전처리 과정으로는, 내부표준물질(internal standard, IS)로 엘페닐알라닌-d5(L-Phenyl-d5-alanine), 메칠프레드니솔론(methylprednisolone) 및 프로게스테론-d9(progesterone-2,2,4,6,6,17α,21,21,21-d9)을 포함하는 아세토니트릴(acetonitrile, AN) 200㎕에 각 소변 샘플 100㎕을 혼합(vortex, 2min)한 후, -20℃에서 30분동안 처리하는 과정을 포함하여 제단백법으로 전처리하였다. 전처리 샘플은 4℃, 13200 rpm에서 10분간 원심분리하고, 그 상층액 5㎕를 LC/MS 분석에 사용하였다 (도 1).
4) LC/MS 분석
준비된 샘플의 5㎕을 LC/MS 시스템에 주입하였다. 뇨 대사체들의 분리는 40℃에서 Phenomenex Kinetex C18 (150 X 2.1 mm i.d., 2.6 μm particle size) 칼럼을 사용하였다. 0.1% 포름산(formic acid)이 함유된 증류수(Distilled Water, DW)(이동상 A) 및 0.1% 포름산이 함유된 아세토니트릴(이동상 B)을 이동상(mobile phase)으로 이용하여 분석하였다. 상기 이동상 A 및 이동상 B의 gradient는 0-3분까지 이동상 A 90%, 12min까지 이동상 A 20%, 29분까지 이동상 A 10%, 35분까지 이동상 A 90%로 혼합하여 사용하였으며 유속은 0.2 mL/min, 주입량은 5μL, 분석시간은 35분으로 하여 상기 전처리 된 샘플 시료를 분석하였다.
질량분석기는 5 kV의 전자분무 이온화 전압(electro-spray ionization voltage)으로 150-2000 m/z이며, 모세관 온도(capillary temperature) 280℃, 시스 가스(sheath gas flow) 12 유닛, 튜브 렌즈(tube lens) 120 V, 모세관 전압(capillary voltage) 38 V로 풀-스캔 양성-이온 모드(full-scan positive-ion mode)로 사용하였다. 체계적 변이(systematic variation)를 피하기 위해, 모든 샘플들은 LC/MS 분석 전에 무작위로 사용하였고 품질관리(QC) 샘플은 모든 샘플들에서 내부표준물질과 함께 사용하였다.
5) 피크검출과 정렬
대사체들의 크로마토그램 정보를 다변형 통계분석에 적합한 데이터셋(dataset)으로 전환하기 위해, 데이터 전처리는 XCMS 소프트웨어 버전 1.16.1을 사용하여 배경분리(background subtractions), 피크 필터링과 검출(peak filtering and detection), 및 피크 정렬(peak alignment)을 포함하여 수행되었다. 이 프로그램은 3차원 LC/MS 데이터(m/z, retention time (T), ion intensity)를 쉽게 처리할 수 있는 2차원 데이터 매트릭스(a pair of m/z and T)로 전환한다. 이러한 처리 스텝은 default XCMS parameter들을 사용하여 다음과 같이 이루어진다 (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html): 0.1 m/z for peak picking, peak-width at half-maximum of 30 s, and peak group bandwidth of 10; the signal-to-noise ratio threshold was set to 10. 피크 검출과 XCMS에 의한 de-convolution 후에 각 검출된 대사체 피크는 그것의 m/z와 T에 따라 동정되었다. 블랭크 크로마토그램은 Xcalibur software utility (Thermo Electron, 2.0.SR2)를 사용하여 샘플 크로마토그램에서 background subtraction로 사용되었다. 파일들은 이후 Xcalibur file-converting utility(version 2.0)를 사용하여 NetCDF 포맷으로 전환하였다.
6) 데이터 정규화
측정된 피크 강도들은 R 언어(R language; version 2.9.0)를 갖는 preprocessCore package (Bolstad B. M. et al., Bioinformatics 2002;19(2):185-193)의 분위수 정규화(quantile normalization) 알고리즘을 이용하여 log2 강도로 정규화함으로써 체계적 변이를 제거하였다. 이후 정규화된 피크 강도는 CSV 파일로 전환하여 독특한 피크 식별자(unique peak identifiers)에 따라 주석달린 피크 데이터(annotated peak data) 표를 만들었고 m/z와 T를 갖는 정규화된 피크 강도를 통계적 분석에 사용하였다. 전체 T와 피크 영역 변이(변동계수, CV)는 20%가 넘지 않게 하였다. QC 샘플(CV > 20%)에서 허용불가한 변이를 갖는 피크들과, 약제 또는 약물대사체들의 m/z에 대응하는 피크들은 전환된 피크 데이타에서 배제하였다.
7) 다변량 데이터 분석
이매티닙의 약물반응 예측과 관련되는 주요한 대사체(metabolite)를 찾기 위하여, SIMCA P+ software(version 11; Umetrics, Uppsala, Sweden)를 사용하여 PCA (Principal component analysis, 주성분분석) 와 PLS-DA (partial least squares discriminant analysis)의 다변량 분석(multivariate analysis)을 시행하였다. PLS-DA 모델(Burnham AJ, et al., Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 1999;48:167-180)은 20 랜덤 치환 시험(20 random permutation tests)을 적용하여 내부 검증(internal validation)되었고, 적합도 (R2) 및 예측 능력(Q2)의 비교에 의해 예측에 대한 능력을 증명하기 위해 실증하였다.
6) PCA 및 PLS-DA 모델
PCA 및 PLS-DA 모델링을 수행하여 이매티닙 투약 전과 투약 후 차이를 보이는 주요한 피크들을 찾는다. 그리고 주요한 피크들을 대사체의 표준 물질(standard compound)와 비교하여 주요 대사체들을 확인하였다. 또한 투사에 대한 변수 영향(variable influence on projection, VIP)을 필수적으로 시험하여 이매티닙의 투약전과 투약 후, 약물반응에 가장 기여하는 특이 대사체들 또는 그 데이터에서 관찰되는 패턴을 측정하고 분석하였다. 본 발명자들은 VIP 값을 사용하여 PLS-DA 모델에서 이매티닙의 약물반응 예측과 가장 관련되는(VIP ≥ 1.0) 대사체 프로파일들을 선별하였다.
7) 대사체 동정
주요한 대사체들(VIP ≥ 1.0)을 선별하기 위해, LC/MS/MS를 기본으로 하는 방법(tandem mass spectrometry)을 적용하여 각각의 m/z와 T에 대한 MS/MS 스펙트럼을 구하였다. 그 후, Hmp[http:. //www.hmpdacc-resources, Otr / CRi-bin / hmp cataloR / main CRi] 와 Metlin[Metabolite and Tandem MS Database(http://metlin.scripps.edu/index.php); Smith CAM et al., Ther Drug Monit 2005;27(6):747-751)과 같은 대사체 데이터베이스 및 관련 문헌에 대사체 이온의 MS/MS 스펙트럼을 매칭시킴으로써 후보 대사체들을 동정하였다. MS 기법이 가지고 있는 일부 한계와 대사체학 자원의 제한된 이용가능성으로 인해, 선별된 모든 대사체들을 명명할 수는 없었다.
실시예 1. 대상자의 특성 및 연구방법
심혈관계, 간, 신장, 혈액종양, 호흡기계, 내분비계, 중추신경계, 정신질환, 근골격계 등에 해당하는 임상적으로 유의한 질환이 있거나 과거력이 없는 건강한 성인 남성 20명이 서면 동의서를 작성하고 연구에 참여하였다. 대상자의 평균 연령(세)은 24.1± 1.7 이며 신장(cm)은 175.6± 4.8, 체중(kg)은 71.9± 8.3 이었다. 대사체에 중요한 영향을 미칠 수 있는 식이, 활동 등을 엄격하게 관리하기 위하여 모든 대상자들은 이매티닙 투약 전날 밤에 지정된 병실에 입원하였고, 입원기간 동안에는 임상시험센터에서 제공되는 식사와 식수 이외 어떠한 음식물의 섭취도 허용하지 않았다. 특히 입원기간 동안 카페인 음료의 섭취를 금하였고 입원일 하루 전 부터 퇴원할 때까지 음주, 흡연을 제한하였다. 또한 이매티닙 투여 전 10시간 이상 금식하도록 조치하였다. 투약 전 오후 8시부터 다음 날 투약 전 오전 8시까지 12시간 동안 축뇨를 수행하였다(pre-dose). 모든 대상자들은 투약 당일 오전 8시경 이매티닙 400mg을 1일 1회 경구 복용하였다. 투약 후 오전 8시부터 오후 8시까지 12시간 동안 축뇨하였다(post-dose).
실시예 2. 이매티닙 투여 전후 뇨 대사체 프로파일링
20명의 건강한 대상자에서 이매티닙 투여 전후에 수집한 뇨 샘플을 이용하여 무작위 대사체 프로파일을 확보하였다. 약물과 약물 대사체들에 대응하는 피크를 제외한 후, 각각의 강도(피크 영역)를 갖는 내인성(endogenous) 대사체들로부터 대사체 데이터셋으로서 862개 공통 대사체 이온들을 얻었다. 주성분분석(PCA) 플롯(plot)에서 품질관리 값이 한 곳에 잘 모여있음을 관찰할 수 있었고 이를 통해 분석한 모든 시료의 높은 재현성과 안정성을 확인하였다(도 3 참조). PCA 분석을 수행하여 이매티닙 투약 전과 투약 후 시료가 그룹별로 잘 분류되는지 확인하고 PLS-DA 모델링으로 다시 분류하였다.
실시예 3. 이매티닙의 치료반응과 높은 상관관계를 갖는 대사체 선별
PCA와 PLS-DA 모델을 이용하여 이매티닙 투약 전과 투약 후로 분리시켜 본 결과, 명확하게 분리가 잘 되었다. PLS-DA 스코어는 대상자 샘플 간에 이매티닙 투여 전과 투여 후, 두 개의 그룹을 보여주고 있다(도 4 참조). 이는 이매티닙 투약으로 인하여 대사체 형성에 영향을 미쳤으며, 투약 전과 투약 후 대사체가 뚜렷하게 차이가 있음을 의미한다. PLS-DA 모델을 사용하여 이매티닙의 치료반응과 가장 높은 상관관계를 갖는 후보 대사체들을 선별하였다. PLS-DA 모델은 높은 예측가능성(high predictability)(Q2=0.974)을 나타내었다. 가장 유의한 대사체들을 분석하기 위해, 이매티닙의 치료반응을 예측하는데 각 대사체의 상대적 중요성을 반영하는 VIP 값을 사용하였다.
랜덤 치환 시험(20 random permutation test)(Fredrik Lindgren BH, et al., Journal of Chemometrics 1998;10(5-6):521-532)으로 내부 검증에 의한 PLS-DA 모델을 확인하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 치환된 모델(permuted model, 좌측 끝)의 적합도(R2)와 예측가능성(Q2)은 원래 모델(original model, 우측 끝) 보다 훨씬 작다. 또한 Q2 회귀분석선의 음의 절편(negative intercept; -0.0625)은 이 모델에서 데이터의 오버핏(over-fitting)이 없음을 나타낸다. 이러한 결과는 PLS-DA 모델의 유효성과 이매티닙의 치료반응을 예측하기 위하여 선택된 대사체 마커들의 유효성을 검증한 결과라고 할 수 있다.
실시예 4. 이매티닙의 치료반응과 관련된 주요 대사체의 동정
선별된 354개의 대사체 중 VIP(variable importance plot) 값이 1.0 이상인 대사체들을 동정하기 위해, 대사체 데이터베이스 및 관련 문헌에 대사체 이온의 MS/MS 스펙트럼을 매칭하여 30개의 대사체를 확인 하였다. 이를 LC/MS/MS 기반 방법을 적용하여 최종 12개의 대사체들의 MS/MS 데이터와 retention time 데이터(도 2 참조)를 확인하였다. 동정된 12개 주요 대사체들과 관련된 기능이 VIP의 내림차순으로 하기 표 1에 요약되어 있다.
Metabolite Retention time (min) VIP Pathway/Function
7-dehydrocholesterol 16.75 1.8 Steroid Biosynthesis
Thiamine 2.48 1.5 Thiamine metabolism
Tyramine 2.67 1.3 Tyrosine metabolism
Betaine 2.63 1.3 Betaine metabolism
Adenine 2.55 1.3 Purine metabolism
3-indoleacetic acid 14.37 1.2 Tryptophan metabolism
Epinephrine 2.9 1.2 Catecholamine biosynthesis
Sphingosine 16.12 1.2 Sphingolipid metabolism
Orotidine 17.6 1.1 Pyrimidine metabolism
L-histidine 2.35 1 Histidine metabolism
16β-hydroxyestradiol 19.57 1 Glycerolipid metabolism
Beta-Sitosterol 19.83 1 Steroid biosynthesis
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 및 이를 이용한 약물 반응 예측 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 기술하고 있는 12종의 뇨 대사체는 이매티닙의 투여 전에 개체(피검체)의 약물 반응 예측에 필요한 정보를 제공함으로서, 개체에 최적의 치료법을 제공할 수 있게 하여 시간 및 비용 등 다양한 방면에서 효율적인 치료 환경을 제공하는 효과가 탁월하여 산업상 이용 가능성이 높다.

Claims (4)

  1. 타이라민(tyramine), 오로티딘(orotidine), L-히스티딘(L-histidine), 16β-하이드록시에스트라디올(16β-hydroxyestradiol), 티아민(thiamine), 3-인돌아세틱 에시드(3-indoleacetic acid), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 에피네프린(epinephrine), 스핑고신(sphingosine), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol), 베타인(betaine) 및 아데닌(adenine) 으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뇨 대사체를 포함하는, 이매티닙에 대한 약물 반응 예측용 마커 조성물.
  2. 이매티닙의 투여 전에 개체의 뇨 시료로부터 타이라민(tyramine), 오로티딘(orotidine), L-히스티딘(L-histidine), 16β-하이드록시에스트라디올(16β-hydroxyestradiol), 티아민(thiamine), 3-인돌아세틱 에시드(3-indoleacetic acid), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 에피네프린(epinephrine), 스핑고신(sphingosine), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol), 베타인(betaine) 및 아데닌(adenine) 으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 대사체 프로파일을 분석하는 단계를 포함하는, 이매티닙에 대한 약물 반응 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 대사체 프로파일은 대사체에 대한 질량스펙트럼에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 대사체 프로파일은 이매티닙 투여 전에 개체의 뇨 시료를 크로마토그래피-질량분석기법으로 분석하여 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
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