KR101702499B1 - Composition of formulated diets comprising novel lactic acid bacteria, fungus and bacterium - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자연계에서 새로이 분리동정된 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135), 진균인 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4) 및 세균인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)를 포함하는 사료첨가용 조성물, 상기 조성물에 포함될 수 있는 신규한 미생물, 상기 조성물을 포함하는 발효사료, 상기 발효사료를 이용한 가축의 사육방법 및 상기 발효사료의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 이용하면 가축사료에 대한 유해균의 오염을 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 발효사료의 부패를 방지하여 저장성을 향상시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 가축사육에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a method for producing Lactobacillus plantarum J-135 , a fungus such as Saccharomyces cerevisiae DAE-4, and a bacterium Bacillus amylase, which are newly isolated and identified in the natural world, The present invention relates to a composition for feeding a feed comprising Bacillus amyloliquefaciens PBS-17, a novel microorganism which can be contained in the composition, a fermented feed containing the composition, a method of raising livestock using the fermented feed, And a method for producing the fermented feed. Use of the feed composition or the probiotics of the present invention can prevent contamination of harmful bacteria with respect to livestock feeds, prevent spoilage of fermented feeds and improve storability, and thus can be widely used for more effective livestock breeding There will be.
Description
본 발명은 신규한 유산균, 진균 및 세균 및 이를 포함하는 사료첨가용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 자연계에서 새로이 분리동정된 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135), 진균인 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4) 및 세균인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)를 포함하는 사료첨가용 조성물, 상기 조성물에 포함될 수 있는 신규한 미생물, 상기 조성물을 포함하는 발효사료, 상기 발효사료를 이용한 가축의 사육방법 및 상기 발효사료의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention is a thing, the present invention more specifically relates to novel lactic acid bacteria, fungi and bacteria, and compositions comprising the same for feed addition are identified newly separated from the natural lactic acid bacteria Lactobacillus plan tareom J-135 (Lactobacillus plantarum J-135 ), fungus Saccharomyces cerevisiae DAE-4 ( Saccharomyces cerevisiae DAE-4) and a bacterium, Bacillus amyloliquefaciens PBS-17, a novel microorganism that can be included in the composition, a fermented feed comprising the composition, A method of raising livestock using the fermented feed, and a method of producing the fermented feed.
가축 및 이들의 산물은 인류가 생존하기 위해 필요한 단백질의 중요한 공급원이기 때문에, 가축의 사육효율을 향상시키기 위한 노력이 지속적으로 수행되어 왔다. 이같은 가축의 사육효율을 향상시키기 위하여 가장 많은 연구가 진행된 부분은 사료이다. 전통적인 가축의 사육방법인 방목시에는 주로 초지에서 생산되는 풀을 사료로서 사용하였다. 그러나, 농업의 생산성이 증가함에 따라, 농가에서 생산되는 농작물 또는 그의 부산물을 사료로서 사용하게 되었는데, 주로 대두박, 참깨, 맥류, 볏짚, 옥수수, 땅콩, 완두콩, 사탕무, 펄프 등을 사용하였다. 또한, 농작물로부터 공급이 어려운 단백질 및 지방성분을 보충하기 위하여, 동물 내장 가루, 어분 가루 등의 동물유래 성분을 추가로 공급하고 있다. 최근에는, 종래의 사료성분에 아미노산, 무기염료, 비타민, 항생물질, 효소 등을 부가적으로 포함하는 배합사료가 일반적으로 사용되고 있다.
Since livestock and their products are an important source of proteins that humans need to survive, efforts have been made to improve the efficiency of raising livestock. In order to improve the efficiency of breeding of these livestock, the most studied part is feed. When grazing, which is a traditional breeding method of livestock, grasses produced mainly in grassland were used as feed. However, as the productivity of agriculture increased, the crops produced by the farmers or their by-products were used as feeds, mainly using soybean meal, sesame seeds, pulses, rice straw, corn, peanuts, peas, sugar beets and pulp. In addition, animal-derived components such as animal powder, fish meal powder and the like are additionally supplied to supplement protein and fat components that are difficult to supply from crops. In recent years, compound feeds that additionally contain amino acids, inorganic dyes, vitamins, antibiotics, enzymes, and the like to conventional feed components are generally used.
한편, 최근에는 청정하고 위생적인 축산물에 대한 소비자의 인식이 높아지고, 가축의 사육과정에서 사용되고 있는 항생제에 대한 부정적인 시각이 대두되면서, 항생제 사용의 대안으로 유용 미생물(생균제)을 이용한 발효사료 제조기술이 주목받고 있다. 그러나, 이같은 발효사료의 경우, 가축에 유익한 미생물 뿐만 아니라 해로운 미생물도 활발히 증식할 수 있어, 부패 및 변질이 쉬운 약점이 있다. 예를 들어, 곰팡이독소 중에서 발효사료에 영향을 크게 미치는 것에는 데옥시니발레놀(Deoxynivalenol), 제랄레논(Zearalenon), 아플라톡신 B1(Aflatoxin B1)이 있다. 데옥시니발레놀은 푸사리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) 균주가 생성하는 곰팡이 독소로 작물의 양적, 질적 저하와 가축의 생육저하 또는 개체수의 감소뿐만 아니라 급/만성 질병유발을 일으키지만 국제암연구소에서 발암가능성은 없는 물질로 분류했다. 푸사리움 그래미니아룸 균주는 곡물사료 제조시 생육하여 데옥시니발레놀을 생성하며, 데옥시니발레놀을 섭취하면 사료효율 감소와 발굽 이상, 유방염 등에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다(Smith, T. K. et. al., Journal of animal science (1997) 75(8), 2184-2191, Keese, C. et. al., Molecular nutrition & food research (2008) 52(12), 1514-1529). 푸사리움 그래미니아룸이 생성하는 다른 독소인 제랄레논(Zearalenon)은 난소낭종, 태아 사산, 비규칙적 고열, 낮은 임신율에 영향을 준다고 보고되었다. 이런 제랄레논은 5~20℃의 저온, 저산소 환경인 온대 및 한 대지역에서 생산된 농산물에서 흔히 발생하므로 온대지역에 포함되는 우리나라는 아플라톡신보다는 푸사리움(Fusarium) 독소에 오염될 가능성이 높다. 그리고 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus)가 생성하는 아플라톡신 B1은 인간 및 동물에서 노출될 경우 면역기능이 억제됨으로써 감염에 대한 저항성이 낮아지는 것으로 나타났고, 성장장해와 폐사, 사료 효율 감소, 질병별 감염율 증가를 야기하는 것으로 알려져 있다(Nam, K, H., Korean Journal of Poultry Science (1994) 21(2), 113-117 ). 동물은 종에 따라 독성에 대한 감수성이 달라지며, 같은 종 안에서도 연령, 성별, 몸무게, 식이, 감염 물질에의 노출, 기타 곰팡이독소 또는 약물 등의 존재에 따라 상당한 차이가 있다(식품의약품안전청 유해물질총서). 특히, 곰팡이독소는 가축을 키우는 농가에 심각한 피해를 주는 요인이 되고 있다.
On the other hand, recently, consumer's awareness of clean and hygienic livestock products has increased, and negative view of antibiotics used in the breeding process of livestock has been raised. As an alternative to the use of antibiotics, a fermented feed manufacturing technology using useful microorganisms It is attracting attention. However, in the case of such a fermented feed, not only microorganisms beneficial to livestock but also harmful microorganisms can actively grow, and there is a weak point that corruption and deterioration are easy. For example, Deoxynivalenol, Zearalenon, and Aflatoxin B1 are among the major mycotoxins that affect fermented feeds. Deoxy you can play Ballet Fusarium Grammy California Room (Fusarium graminearum ) is a fungal toxin that is classified as a substance that does not cause carcinogenicity in the International Cancer Research Institute, although it causes quantitative and qualitative degradation of crops, loss of livestock growth or decrease of population as well as acute / chronic disease induction. It has been found that the Fusarium germinia room strain grows in the production of grain feed to produce deoxynil valenol, and that ingestion of deoxynil valenol reduces feed efficiency and affects hoof abnormalities and mastitis (Smith, TK et < RTI ID = 0.0 > (1997) 75 (8), 2184-2191, Keese, C. et al., Molecular nutrition & food research (2008) 52 (12), 1514-1529). Zearalenon, another toxin produced by the Fusarium germinia room, has been reported to affect ovarian cysts, stillbirths, irregular high fever, and low pregnancy rates. These gellulenones are often present in agricultural products produced in temperate and one area, which are low temperature and hypoxic environments of 5 ~ 20 ℃. Therefore, Korea, which is included in the temperate zone, is more likely to be contaminated with Fusarium toxin than aflatoxin. It has been shown that aflatoxin B1 produced by Aspergillus flavus is less resistant to infection due to the suppression of immune function when exposed to humans and animals, (Nam, K, H., Korean Journal of Poultry Science (1994) 21 (2), 113-117). Animals are susceptible to toxicity by species, and there are significant differences in the same species depending on their age, sex, weight, diet, exposure to infectious agents, and the presence of other fungal toxins or drugs (Korea Food & Drug Administration) edition). In particular, mycotoxins are a serious source of damage to farms that raise livestock.
한편, 살모넬라 속(Salmonella sp .) 균주는 인체와 가축질병의 주된 원인체로 약 2,000여 종이 밝혀져 있고, 인간에게는 세균성 식중독, 가축에게는 주요 질병을 발병시키는 것으로 알려져 있다. 살모넬라 균주는 어린 가축에게 설사증상을 동반하여 높은 폐사율과 성장저해를 일으키고 다른 질병의 혼합감염에 의한 심한 병증을 유발한다. 살모넬라 균주에 대한 감염을 치료하기위해 항생제를 사용하는데, 이런 항생제는 투입된 후로 2∼3달이 지나야 소화 배출된다. 이러한 항생제를 지속적으로 투입하거나 휴약기간 전에 식용될 경우는 잔류 항생제로 인하여 면역력 저하와 항생제내성균주의 등장 위험성을 갖고 있다.
On the other hand, in Salmonella (Salmonella sp . ) Strain is a major cause of human and livestock diseases and about 2,000 species are known to cause bacterial food poisoning in humans and major diseases in livestock. Salmonella strains are associated with diarrhea symptoms in young livestock, resulting in high mortality and growth inhibition and severe disease caused by mixed infections of other diseases. Antibiotics are used to treat infections of Salmonella strains. These antibiotics extinguish after 2-3 months. If these antibiotics are used continuously or if they are edible before the period of abstinence, there is a danger that the immunity will decrease and antibiotic resistant bacteria may appear due to residual antibiotics.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 곰팡이 오염 및 잡균의 증식을 억제하여 보존성 및 안정성이 높은 발효사료를 제조하고자 예의 연구노력한 결과, 내산성 및 내담즙성을 지니며, 잡균의 생육 억제와 살모넬라 균에 대한 사멸능을 가지고 올 수 있는, 신규한 젖산균 락토바실러스 플란타룸 균주; 내산성 및 내담즙성을 지니고 장 내에서 증체량과 사료 섭취량을 증가시킬 수 있는, 신규한 효모균 및 곰팡이 생육 억제 효과 및 효소 활성을 나타내는 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주를 분리 동정하였고, 상기 3종의 균주를 생균제로 사용하여 발효 사료를 제조한 결과, 제조된 발효 사료의 보존성 및 안정성이 우수하여 상기 3종의 균주를 생균제 및 사료 첨가제로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have intensively studied to produce a fermented feedstock having high preservability and stability by inhibiting fungal contamination and growth of germs. As a result, they have acid resistance and biliary properties, and inhibit the growth of germs and kill the Salmonella A novel lactic acid bacterium Lactobacillus plantarum strain capable of bringing about its ability; A novel yeast and a novel Bacillus amyloliquefaciens strain exhibiting an enzyme activity and an inhibitory effect on fungal growth and having acid resistance and biliary properties and capable of increasing the amount of body weight and feed intake in the intestines were isolated and identified. Was used as a probiotic agent to produce a fermented feed. As a result, it was confirmed that the above-mentioned three strains can be effectively used as a probiotic and a feed additive, and the present invention was completed .
본 발명의 하나의 목적은 신규한 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135), 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4) 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)를 포함하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide novel Lactobacillus plantarum J-135 , Saccharomyces cerevisiae DAE-4 and Bacillus amyloliquefaciens PBS- 17 < / RTI > ( Bacillus amyloliquefaciens PBS-17).
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물에 포함될 수 있는 신규한 미생물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a novel microorganism which can be contained in the composition.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 3종의 균주를 포함하는 발효사료를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a fermented feed comprising the above three strains.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발효사료를 급이시키는 단계를 포함하는, 가축의 사육방법을 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a method for raising livestock, comprising feeding the fermented feed.
본 발명의 또 다른 목적은 원료사료에 상기 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 발효사료의 제조방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a method for producing a fermented feed comprising the step of fermenting the feed to which the feed composition or the probiotics are added.
본 발명자들은 유해균의 오염으로 인한 폐해를 방지할 수 있는 미생물 제제의 조건으로서, 유해균을 사멸시키거나 또는 유해균의 증식을 억제하는 기본적인 효과 외에도 가축의 체내에 섭식된 경우에도 미생물이 생존하여 본래의 기능을 발휘할 수 있어야 할 것으로 가정하였다. 또한, 이러한 조건을 모두 갖춘 단일 미생물을 사용하기 보다는, 각각의 효과를 부분적으로 나타낼 수 있는 미생물의 복합제제를 사용하는 것이 새로운 유해균에 대한 우수한 방어효과를 나타낼 수 있을 것으로 가정하였다.The present inventors have found that, in addition to the basic effect of killing harmful bacteria or inhibiting the growth of harmful microorganisms, microorganisms survive even when fed into the body of livestock, And to be able to demonstrate that. It was also assumed that the use of a combined preparation of microorganisms, which can partially exhibit the respective effects, would provide a superior defense effect against the new harmful bacteria, rather than using a single microorganism having all of these conditions.
이에, 유해균을 사멸시키거나 또는 유해균의 증식을 억제하는 능력이 우수한 균주와 가축의 체내에 섭식된 경우에도 미생물이 생존하여 본래의 기능을 발휘할 수 있는 균주를 규명하고자 예의 노력한 결과, 내산성과 내담즙성이 우수하고, 살모넬라 균에 대하여 사멸능을 지니는 신규한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135)(KCTC 12508BP), 내산성 및 내담즙성을 지니며 장내에서 증체량과 사료섭취량 증가를 가져올 수 있는 신규한 효모균인 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4)(KCTC 12510BP) 및 곰팡이 생육 억제 효과가 우수한 신규한 세균인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)(KCTC 12509BP)를 각각 발굴하고, 이들의 혼합제제가 사료에 미치는 효과를 규명하였다. 그 결과, 상기 혼합제제를 배합사료에 첨가하고 이를 발효시켜서 수득한 발효사료는 종래의 미생물 제제에 의해 제조된 발효사료와는 달리, 발효시간이 경과하여도 사료내 미생물 균체수의 비율이 일정하게 유지되고, pH가 감소하며, 발효후에도 부패되지 않음을 확인하였다.Therefore, in order to identify the strains which can survive the microorganisms and exert their original functions even when they are eaten in the body of a livestock and a livestock which are capable of killing harmful bacteria or inhibiting the proliferation of harmful bacteria, Lactobacillus plantarum J-135 (KCTC 12508BP), which is a novel lactic acid bacterium having an excellent killing power against Salmonella, has acid resistance and biliary properties, and has a gut weight and feed intake ( Saccharomyces < / RTI >< RTI ID = 0.0 > cerevisiae DAE-4) (KCTC 12510BP ) and mold growth inhibiting effect is excellent novel bacterium Bacillus amyl Lowry kwipe sieon's PBS-17 (Bacillus amyloliquefaciens PBS- 17) (KCTC 12509BP) for each excavation, and their mixtures I Feed . As a result, unlike the fermented feed prepared by the conventional microorganism preparation, the fermented feed obtained by adding the mixed preparation to the compounded feed and fermenting the mixed feed had a constant ratio of the number of microorganism cells in the feed even after the fermentation time Maintained, the pH was reduced, and it was not corroded after fermentation.
따라서, 본 발명의 미생물을 포함하는 혼합제제는 사료첨가용 조성물 또는 생균제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
Therefore, it can be seen that the mixed preparation containing the microorganism of the present invention can be usefully used as a feed additive composition or a probiotic agent.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135)(KCTC 12508BP), 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4)(KCTC 12510BP) 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)(KCTC 12509BP)를 포함하는 사료첨가용 조성물, 생균제 및 상기 사료첨가용 조성물에 포함될 수 있는 신규한 미생물을 제공한다.
In one embodiment for achieving the above object, the present invention is Lactobacillus plan tareom J-135 (Lactobacillus plantarum J-135) (KCTC 12508BP), Saccharomyces cerevisiae DAE-4 ( Saccharomyces cerevisiae DAE-4) (KCTC 12510BP ) and Bacillus amyl kwipe sieon Lowry's PBS-17 (Bacillus amyloliquefaciens PBS-17) (KCTC 12509BP), a probiotic microorganism, and a novel microorganism which can be contained in the feed composition.
본 발명의 용어 "락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135)"란, 16s rRNA를 코딩하는 유전자의 염기서열이 표준균주인 락토바실러스 플랜타럼의 것과 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주로서, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12508BP를 부여받은 균주를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주는 우수한 내산성과 내담즙성을 나타내며, 살모넬라 속 균주에 대하여 사멸능을 나타내어, 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제의 유효성분으로 사용될 수 있다.Terms of the present invention, "Lactobacillus plan tareom J-135 (Lactobacillus plantarum J-135) "refers to a strain that has high homology with the base sequence of 16s rRNA encoding gene of Lactobacillus plantarum, which is not the same as the standard strain, and has been approved by the International Federation under the Budapest Treaty on October 25, In the present invention, the Lactobacillus plantarum J-135 strain has excellent acid resistance and high acid resistance. The strain Lactobacillus plantarum J-135 is a strain having a deposit number KCTC 12508BP deposited with the depository institution of the Korean Collection for Type Culture. And shows an ability to kill bacteria of Salmonella genus, and can be used as an active ingredient of the composition for feed addition or the probiotic agent provided in the present invention.
본 발명의 용어 "사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4)"란, 16s rRNA를 코딩하는 유전자의 염기서열이 표준균주인 사카로마이세스 세레비지애의 것과 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주로서, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12510BP를 부여받은 균주를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주는 우수한 내산성과 내담즙성을 나타내어, 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제의 유효성분으로 사용될 수 있다.The term " Saccharomyces cerevisiae DAE-4 "of the present invention refers to a gene encoding Saccharomyces cerevisiae DAE-4, which has a high homology with that of Saccharomyces cerevisiae , the nucleotide sequence of 16s rRNA- But not identical, means a strain which has been deposited with the BRC under the Budapest Treaty on October 25, 2013 and granted accession number KCTC 12510BP. In the present invention, the Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain exhibits excellent acid resistance and bile resistance, and can be used as an active ingredient of the feed composition or the probiotic agent provided in the present invention.
본 발명의 용어 "바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)"란, 16s rRNA를 코딩하는 유전자의 염기서열이 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴페시언스의 것과 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주로서, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12509BP를 부여받은 균주를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주는 푸사리움 솔라니, 푸사리움 sp., 아스퍼질러스 플라부스 및 페니실리움 sp. 균주에 대하여 우수한 항균활성을 나타내며, 프로테아제, 셀룰라아제, α-아밀라제, 피타아제(phytase) 및 자일라나제와 같은 효소활성을 나타낸다. 따라서, 상기 균주는 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
Represent the term "Bacillus amyl Lowry kwipe sieon's PBS-17 (Bacillus amyloliquefaciens PBS- 17)" Bacillus amyl Lowry kwipe high homology to that of sieon's is, base sequence of the gene coding for the 16s rRNA the type strain of the present invention Means a strain which has been deposited with the BRC under the Budapest Treaty on October 25, 2013 and has been granted accession number KCTC 12509BP. In the present invention, the Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strain is selected from the group consisting of Fusarium solani, Fusarium sp., Aspergillus flavus, and Penicillium sp. Exhibits excellent antibacterial activity against a strain and exhibits an enzyme activity such as protease, cellulase,? -Amylase, phytase and xylanase. Therefore, the strain may be used as an active ingredient of the feed additive composition provided in the present invention.
본 발명의 용어 "유해균"이란, 가축 또는 가축의 부산물에 오염되어, 상기 가축에게 부정적인 효과를 유발시키거나, 상기 가축의 품질을 저해시키거나, 또는 가축의 부산물을 섭식한 사람에게 부정적인 효과를 유발시킬 수 있는 미생물을 의미한다.The term "harmful bacteria" of the present invention means that the product is contaminated with livestock or by-products of livestock, causing a negative effect on the livestock, impairing the quality of the livestock, Microorganisms that can be produced.
본 발명에 있어서, 상기 유해균은 가축에게 부정적인 효과를 유발시키거나, 또는 상기 가축의 품질을 저해시킬 수 있으면서도, 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제에 의하여 사멸하거나 또는 증식이 억제될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 가축용 배합사료에 오염되어 상기 배합사료를 변질시킬 수 있는 진균류 및 인간 및 가축에게 질병을 유발할 수 있는 살모넬라 속 미생물이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 푸사리움 속(Fusarium sp.) 균주, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주, 페니실리움 속(Penicillium sp.) 균주, 살모넬라 속(Salmonella sp .) 균주 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 균주, 푸사리움 속 균주, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주, 페니실리움 속 균주, 살모넬라 엔테리카 서브스페시스 엔테리카 균주(Salmonella enterica subsp . enterica), 살모넬라 티피무리엄 균주(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 균주(Salmonella enteritidis) 등의 단독 균주 또는 이들이 조합된 복합균주가 될 수 있다.
In the present invention, the harmful bacteria may cause a negative effect on the livestock, or may hinder the quality of the livestock. In addition, the harmful bacteria may be killed or proliferated by the feed additive composition or the probiotics provided in the present invention The fungus may be fungi capable of degrading the compounded feed and contaminated with the compound feed for livestock, and microorganisms of the genus Salmonella that can cause disease to humans and livestock, and more preferably, Fusarium sp.) strain, Aspergillus genus (Aspergillus sp .) strain, the genus Penicillium sp.) strain, Salmonella genus (Salmonella sp . ) And the like can be strain, most preferably from Fusarium solani (Fusarium solani) strain, Fusarium spp, Aspergillus Plastic booth (Aspergillus flavus strain, a strain of the genus Penicillium, a strain of Salmonella enterica subsp. enterica subsp . enterica ), Salmonella typhimurium strain ( Salmonella typhimurium ), Salmonella enteritidis strain ( Salmonella enteritidis ), or a combination thereof.
본 발명의 용어 "사료첨가용 조성물"이란, 가축의 생산성 향상이나 건강을 증진시키기 위해서 사료에 첨가되는 물질을 의미한다. The term " feed additive composition "of the present invention means a substance added to a feed to improve productivity and health of livestock.
본 발명의 용어 "생균제"란, 프로바이오틱스(probiotics)라고도 하고, 숙주동물의 장내 미생물 균총의 개선으로 숙주동물에 유익한 작용을 하는 살아있는 미생물을 포함하는 제제를 의미한다. 대체로, 상기 생균제는 그 자체로 비병원성일 뿐만 아니라 병원성 물질을 생산하지도 않으며, in vitro 증식이 용이하고, 생체 내에서 빠른 성장율을 나타내며, 내산성 및 내담즙성을 가지고, 실온에서도 그의 효과를 유지하는 등의 다양한 특징을 나타낸다. The term " probiotics " of the present invention means probiotics, and refers to preparations containing living microorganisms that are beneficial to the host animal by ameliorating intestinal microflora of the host animal. Generally, the probiotics themselves are not only non-pathogenic but also do not produce pathogenic substances, and in exhibits various characteristics such as easy in vitro propagation, exhibits rapid growth rate in vivo, has acid resistance and biliary cholesterol, and maintains its effect even at room temperature.
본 발명에 있어서, 상기 생균제는 본 발명에서 최초로 규명한 상기 3종의 균주를 포함하는 생균제로 해석될 수 있는데, 상기 생균제는 동물용 사료첨가제, 사일리지용 생균제, 발효사료용 생균제를 포함하는 다양한 제품의 첨가물로서 사용될 수 있고, 상기 제품에 첨가되기 위하여, 액상 생균제, 생균분말 등의 형태로 사용될 수 있다. In the present invention, the probiotic agent can be interpreted as a probiotic agent containing the three strains identified for the first time in the present invention. The probiotic agent can be used in various products including feed additives for animals, probiotics for silage, and probiotics for fermented diets And may be used in the form of liquid probiotics, live bacteria powder, etc. in order to be added to the product.
본 발명의 젖산균 락토바실러스 플라타넘 J-135, 효모 사카로마이세스 세레비제 DAE-4, 세균 바실러스 아밀로리퀴페시언스 Pbs-17의 혼합균주를 포함하는 생균제 및 생균분말은 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다.The probiotic agent and the live bacterial powder containing the lactic acid bacteria Lactobacillus lactanum platanum J-135, yeast saccharomyces cerevisiae DAE-4 and the bacterial strain Bacillus amyloliquefaciens Pbs-17 of the present invention may be further added with excipients and diluents .
또한, 젖산균 락토바실러스 플라타넘 J-135, 효모 사카로마이세스 세레비제 DAE-4, 세균 바실러스 아밀로리퀴페시언스 Pbs-17 균주는 단독으로 또는 다른 추출물, 부산물과 함께 사용될 수 있다.In addition, lactic acid bacteria Lactobacillus platanum J-135, yeast saccharomyces cerevisiae DAE-4 and bacterial Bacillus amyloliquefaciens Pbs-17 strains can be used alone or in combination with other extracts and by-products.
본 발명에 따른 젖산균 락토바실러스 플라타넘 J-135, 효모 사카로마이세스 세레비제 DAE-4, 세균 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주는, 각각 통상의 방법에 따라 배양액, 분말의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 젖산균 락토바실러스 플라타넘 J-135, 효모 사카로마이세스 세레비제 DAE-4, 세균 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 스테비아 추출물 및 천연소재 추출물을 들 수 있다. The lactic acid bacteria Lactobacillus platanum J-135, yeast saccharomyces cerevisiae DAE-4, and the bacterium Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strain according to the present invention are each prepared in the form of a culture solution or powder according to a conventional method Can be used. In the present invention, as excipients and diluents that can be contained in lactic acid bacteria Lactobacillus platanum J-135, yeast saccharomyces cerevisiae DAE-4, bacterial Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strains, lactose, dextrose , Sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzo Tartrate, magnesium stearate, mineral oil, stevia extract, and natural material extracts.
아울러, 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제는 발효사료, 발효조사료, 사일리지 등의 가축용, 가금용, 어류양식용 발효사료의 제조에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 곡물발효시에도 사용될 수 있다.
In addition, the feed composition or the probiotics provided in the present invention can be used not only for the preparation of fermented feed for fermented feed, fermentation forage, silage, etc., for livestock, poultry and fish cultivation, but also for fermentation of cereals .
본 발명에 있어서, 상기 사료첨가용 조성물 또는 생균제는 상기 유해균이 사료에 오염되는 것을 방지하기 위한 목적으로 사용될 수 있는데, 상술한 3종의 신규 미생물을 포함하는 상기 조성물 또는 생균제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 3종의 균주를 1:1:1(w/w/w)로 포함하는 조성물 또는 생균제가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 1 x 109CFU/㎖로 배양된 3종의 각 균주를 1:1:1(w/w/w)로 포함하는 조성물 또는 생균제가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 x 109CFU/㎖로 배양된 3종의 각 균주를 1:1:1(w/w/w)로 혼합한 혼합균주를 액상중량 기준으로 1%(w/w)가 되도록 포함하는 조성물 또는 생균제가 될 수 있다.
In the present invention, the feed composition or the probiotics may be used for the purpose of preventing the harmful microorganisms from being contaminated with the feed. The composition or the probiotics containing the three new microorganisms described above are not particularly limited, , Preferably a composition comprising the above three strains in a ratio of 1: 1: 1 (w / w / w) or a probiotic agent, more preferably three kinds of cultivars of 1 x 10 9 CFU / Each strain may be a composition or probiotic containing 1: 1: 1 (w / w / w) of each strain, and most preferably 3 strains of each strain cultured at 1 x 10 9 CFU / And 1% (w / w) of a mixed strain obtained by mixing 1% (w / w / w)
아울러, 본 발명의 사료첨가용 조성물 또는 상기 생균제는 상술한 3종의 신규 미생물 뿐만 아니라, 가축의 생산성 또는 건강 증진에 필요한 필수 영양소를 완전공급하는 데 필요한 뉴클레오티드류, 효소류, 미량성분 뿐만 아니라 가축의 생육을 보조하는 다른 미생물을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드류로는 5'-아데닐산, 크산틴산, 리보핵산, 디옥시리보핵산 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 효소류로는 상기 3종의 미생물로부터 제공되지 않는 아라비나제(arabinase), 아라비노퓨라노시타제(arabinofuranosidase), 갈락타나제(galactanase), 펙티나제(pectinase), 말타제(maltase), 인버타제(invertase), 리파제(lipase) 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 미량성분으로는 아미노산, 칼슘, 인산, 유기산 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 미생물로는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 균주, 웨이셀라 속(Weisella sp.) 균주, 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.) 균주, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주, 노카르디아 속(Nocardia sp.) 균주 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
In addition, the feed additive composition or the probiotics according to the present invention can be used not only for the above three kinds of new microorganisms but also for the nucleotides, enzymes and trace components necessary for the complete supply of essential nutrients necessary for productivity or health promotion of livestock, Lt; RTI ID = 0.0 > microorganisms. ≪ / RTI > For example, as nucleotides, 5'-adenylic acid, xanthic acid, ribonucleic acid, and deoxyribonucleic acid can be used alone or in combination; Examples of the enzymes include arabinase, arabinofuranosidase, galactanase, pectinase, maltase, and maltase which are not provided from the above three microorganisms. Invertase, lipase, and the like can be used alone or in combination; As trace constituents, amino acid, calcium, phosphoric acid, organic acid, etc. may be used alone or in combination; The microorganisms include Leuconostoc genus sp .) strain, Weisella sp.) strain, Enterococcus genus (Enterococcus sp.) strain, the genus Streptomyces (Streptomyces sp .) strain, Nocardia sp .) may be used alone or in combination.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 가축용 발효사료에 적합한 미생물 제제를 개발하기 위하여, 자연계에서 채취된 시료로부터 유산균, 진균 및 세균을 분리하고, 이 중에서 내산성, 내담즙성, 항균활성, 효소활성 등의 특징이 우수한 각 1종의 유산균, 효모균 및 세균을 선발하였다. 상기 선발된 균주의 16S rRNA를 코딩하는 유전자의 서열을 결정하고, 이를 종래의 균주의 것과 비교하여 동정한 결과, 상기 선발된 각 균주는 종래의 균주와 구별되는 새로운 균주임을 확인하였다. 이에, 상기 유산균은 "락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12508BP를 부여받았으며; 상기 효모균은 "사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12510BP를 부여받았으며; 상기 세균은 "바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12509BP를 부여받았다.
According to one embodiment of the present invention, in order to develop a microorganism preparation suitable for a fermented feed for livestock, lactic acid bacteria, fungi and bacteria are separated from a sample collected from the natural environment, and acid resistance, biliary properties, Were selected for each of the lactic acid bacteria, yeast, and bacteria. The sequence of the gene encoding 16S rRNA of the selected strain was determined and compared with that of a conventional strain. As a result, it was confirmed that each of the selected strains was a new strain that was distinguished from a conventional strain. Therefore, the lactic acid bacteria "Lactobacillus plan tareom J-135 (Lactobacillus plantarum J-135) "and deposited with the International Agency for Research on Biotechnology under the Budapest Treaty on October 25, 2013, and received the accession number KCTC 12508BP; the yeast was named" Saccharomyces Saccharomyces DAE-4 ( Saccharomyces cerevisiae DAE-4) ", deposited on October 25, 2013 under the Budapest Treaty with the International Agency for Research on Biotechnology, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, under the accession number KCTC 12510BP; the bacterium is "Bacillus amyloliquefuge Cis-PBS-17 ( Bacillus amyloliquefaciens PBS-17) "and deposited on October 25, 2013 under the Budapest Treaty with the Korea Biotechnology Research Institute, the international depository institution, and received the accession number KCTC 12509BP.
또한, 상기 동정된 각 균주의 내산성, 내담즙성, 효소활성 및 항균활성을 평가한 결과, 상기 유산균은 내산성(표 1)과 내담즙성(표 2)을 나타내고, 살모넬라 속 세균에 대한 항균활성을 나타내고(도 1 및 표 4), 상기 효모균은 내산성(표 1)과 내담즙성(표 2)을 나타내며, 상기 세균은 피타제, 프로테아제, 자일라나제, α-아밀라제 및 셀룰라제의 활성(표 3)을 나타낼 뿐만 아니라, 진균류에 대한 항균활성(도 2 및 표 4)을 나타냄을 확인하였다.
As a result of evaluating the acidity, biliary properties, enzymatic activity and antibacterial activity of each of the identified strains, the lactic acid bacteria showed acid resistance (Table 1) and biliary bile resistance (Table 2), and antimicrobial activity against bacterium Salmonella (Fig. 1 and Table 4). The yeast showed acid resistance (Table 1) and biliary bite (Table 2), and the bacterium exhibited activity of phytase, protease, xylanase,? -Amylase and cellulase Table 3), as well as antimicrobial activity against fungi (Fig. 2 and Table 4).
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 원료사료에 가하고, 이를 발효시켜서 제조된 발효사료를 제공한다.
As another embodiment for accomplishing the above object, the present invention provides a fermented feed prepared by adding the composition to a raw material feed and fermenting the same.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제는 사료에 오염될 수 있는 유해균의 증식을 억제할 수 있으므로, 이를 원료사료에 가하여 발효사료를 제조할 경우, 안전성 및 보존성을 향상시킬 수 있다.As described above, since the composition for feed addition or the probiotics provided in the present invention can inhibit the growth of harmful bacteria that may be contaminated with feed, when fermented feed is prepared by adding the feed to the feed, safety and preservability are improved .
본 발명의 용어 "원료사료"란, 상기 사료첨가용 조성물 또는 생균제가 첨가되는, 사료를 의미한다. 이러한 원료사료로는 단일사료, 배합사료 등이 될 수 있다.The term "raw material feed" of the present invention means a feed to which the composition for adding a feed or the probucifier is added. Such raw feeds may be single feeds, compound feeds, and the like.
본 발명의 용어 "배합사료"란, 가축의 사육목적에 맞는 영양소를 고르게 공급할 수 있도록 배합하여 만든 사료를 의미하며, 상기 배합사료는 가축이 필요로 하는 에너지, 단백질, 지질, 비타민, 광물질 등 영양소를 포함한다. 배합사료를 만들 때는, 영양적인 면에서 볼 때, 가축의 식욕을 증진시키고 소화기관의 정상적인 작용을 촉진시키기 위하여 적정량의 고형물(固型物)이 반드시 필요하며, 가축의 생산활동을 충분히 발휘시키기 위해 적당한 양의 단백질을 넣어 주어야 하며, 가축의 체온유지와 생산활동을 정상적으로 유지하기 위한 열량이 들어가야 하며, 기타 칼슘 또는 인과 같은 무기물과 비타민도 충분히 함유되어야 한다.
The term "compounded feed " of the present invention refers to a feed made by mixing together nutrients suitable for the purpose of raising livestock. The compounded feed includes nutrients such as energy, protein, lipid, . When making compounded feeds, nutritionally, it is necessary to have a proper amount of solid matter (solid matter) to promote the appetite of livestock and promote the normal action of digestive organs, An adequate amount of protein should be added, the amount of calories needed to keep the livestock body temperature and production normal, and other minerals and vitamins such as calcium or phosphorus.
본 발명의 용어 "발효사료"란, 상기 원료 사료에 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 가하여 발효시켜서 제조된 발효사료를 의미한다.The term "fermented feed " of the present invention means a fermented feed produced by adding the feed composition or the probiotics provided in the present invention to the raw feed, and fermenting the fermented feed.
본 발명에 있어서, 상기 발효사료는 가축의 사료에 대한 상기 유해균의 오염을 방지하는 효과를 나타낼 수 있는데, 당업계에 공지되거나 시판되는 임의의 가축용 배합사료에 상기 사료첨가용 조성물을 추가함으로써 구성될 수 있으며, 상기 사료첨가용 조성물이 추가되기만 한다면 배합사료의 조성은 당업자에 의해 적절하게 조절될 수 있다. In the present invention, the fermented feed can exhibit an effect of preventing the contamination of the harmful bacteria with respect to the feed of livestock. The composition can be prepared by adding the composition for feed addition to any animal feed compound known in the art or commercially available And the composition of the compounded feed can be appropriately adjusted by a person skilled in the art as long as the feed additive composition is added.
예를 들어, 본 발명의 유해균 오염 방지용 발효사료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 가축용 배합사료에 통상적으로 사용되는 쌀, 발효대두분, 대두, 이탈리안그라스, 수단그라스, 호밀, 볏짚, 옥수수, 소맥피, 쌀겨, 당맥피 등을 단독으로 또는 조합하여 주성분으로 포함할 수 있고, 이들 주성분은 가축용 배합사료에 일반적으로 사용되는 적절한 범위로 포함될 수 있다.
For example, the fermented feedstuff for preventing harmful bacteria of the present invention is not particularly limited. Preferably, the fermented feedstuff for preventing noxious bacteria from contamination is selected from the group consisting of rice, fermented soybean meal, soybean, Italian grass, Sudan grass, rye, rice straw, , Wheat bran, rice bran, sugar beet, and the like may be included as a main component, alone or in combination. These main ingredients may be included in an appropriate range generally used for livestock compound feeds.
한편, 상기 발효사료에 포함되는 유해균 오염 방지용 조성물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 발효사료의 최종 중량을 기준으로 0.01 내지 10%(w/w)가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.1 내지 5%(w/w)가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1%(w/w)가 될 수 있다.
On the other hand, the content of the composition for preventing harmful bacteria from contamination in the fermented feed is not particularly limited, but may be 0.01 to 10% (w / w) based on the final weight of the fermented feed, May be 0.1 to 5% (w / w), and most preferably 1% (w / w).
또한, 상기 발효사료는 상술한 주성분 이외에 통상적인 가축용 배합사료에 포함될 수 있는 혈장 단백질, 어분, 유장, 복합유제품, 대두유, 아미노산 프리믹스, 산미제 프리믹스, 홍삼박, 소금, 비타민-미네랄 혼합물 등을 단독으로 또는 혼합하여 추가로 포함할 수 있다.
The fermented feed may contain plasma proteins, fish meal, whey, complex dairy products, soybean oil, amino acid premix, acidic premix, red ginseng, salt, vitamin-mineral mixture and the like, which may be contained in conventional compounding feeds for livestock Alone or in combination.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 3종의 신규한 균주를 배합사료에 가하고 발효시켜서 발효사료를 제조한 다음, 상기 발효사료의 특성을 종래의 미생물 제제를 사용하여 제조된 발효사료와 비교한 결과, 본 발명의 발효사료는 유산균이 상대적으로 다량으로 증식하는 경향을 나타내었으나, 종래의 발효사료에 비하여는 과도하게 증식하지 않았고(도 3), pH는 발효시간의 경과에 따라 감소하였으며(도 4), 발효 후에도 부패하지 않음을 확인하였다(도 5).
According to one embodiment of the present invention, the three new strains provided in the present invention are added to a compounded feed and fermented to prepare a fermented feed, and then the characteristics of the fermented feed are compared with those of a fermented product prepared using a conventional microorganism As a result of comparison with the feed, the fermented feed of the present invention tended to proliferate a relatively large amount of lactic acid bacteria, but did not over-proliferate as compared with the conventional fermented feed (Fig. 3) (Fig. 4), and it was confirmed that it did not decay after fermentation (Fig. 5).
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 발효사료를 가축에 급이시키는 단계를 포함하는, 가축의 사육방법을 제공한다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a method of raising livestock, comprising feeding the fermented feed to the livestock.
본 발명의 발효사료를 급이시킬 수 있는 가축은 특별히 이에 제한되지 않으나, 한우, 육우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 개, 고양이, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위 등이 될 수 있다.
The livestock that can feed the fermented feed of the present invention are not particularly limited, but may be selected from the group consisting of cattle, cattle, cows, calves, pigs, pigs, dogs, cats, chicks, chickens, domestic chickens, roosters, .
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 원료사료에 본 발명의 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 발효사료의 제조방법을 제공한다.As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a method for producing a fermented feed comprising adding the feed composition or the probiotics of the present invention to the raw feed for fermentation.
상기 발효사료의 제조시 사용되는 원료사료는 본 발명에서 제공하는 발효사료의 제조에 사용될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 통상적으로 사용되는 쌀, 발효대두분, 대두, 이탈리안그라스, 수단그라스, 호밀, 볏짚, 옥수수, 소맥피, 쌀겨, 당맥피 등을 단독으로 또는 조합하여 주성분으로 포함하는 배합사료를 사용할 수 있고, 이들 주성분은 가축용 원료사료에 일반적으로 사용되는 적절한 범위로 포함될 수 있다.The raw material feed used in the production of the fermented feed is not particularly limited as long as it can be used in the production of the fermented feed provided in the present invention. Preferably, however, the conventionally used rice, fermented soybean meal, soybean, A mixed feed containing as a main component can be used alone or in combination as a main ingredient, and these main ingredients can be included in an appropriate range generally used for raw feed for livestock, such as grass, rye, rice straw, corn, wheat bran, rice bran, have.
또한, 상기 원료사료에 첨가되는 사료첨가용 조성물 또는 생균제는 본 발명에서 제공하는 락토바실러스 플라타넘J-135 균주, 사카로마이세스 세레비제 DAE-4 균주 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 Pbs-17 균주를 각각 개별적으로 포함할 수도 있고, 이들의 혼합균주를 포함할 수 있는데, 이들 개별균주 또는 혼합균주를 포함하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제의 원료사료에 대한 첨가량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 발효사료의 재료 및 무게, 곰팡이와 부패세균의 생육정도에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는데, 바람직하게는 락토바실러스 플라타넘 J-135, 사카로마이세스 세레비제 DAE-4 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 Pbs-17의 액상 혼합균주를 1회 사용시 10 내지 100 mg/kg으로, 분말 혼합균주는 1 내지 10 mg/kg으로 첨가할 수 있다. The feed composition or the probiotics to be added to the raw material feed may be selected from the group consisting of Lactobacillus platanum J-135 strain, Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain and Bacillus amyloliquefaciens strain Pbs-17 The amount of the feed composition or the probiotics added to the feed for the feed comprising these individual strains or mixed strains is not particularly limited, but the amount of the fermented feed And may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the material and weight, the degree of growth of the fungus and the decaying bacteria, preferably Lactobacillus platanum J-135, Saccharomyces cerevisiae DAE-4 and Bacillus amyloliquefaciens The liquid mixed strains of Pbs-17 may be added at a dose of 10 to 100 mg / kg once, and the powdery mixed strains may be added at 1 to 10 mg / kg.
이때, 원료사료에 대한 상기 사료첨가용 조성물 또는 생균제의 첨가방법은 다양한 경로를 통하여 수행될 수 있다.
At this time, the method of adding the feed composition or the probiotics to the raw feed can be carried out through various routes.
본 발명의 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 이용하면 가축사료에 대한 유해균의 오염을 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 발효사료의 부패를 방지하여 저장성을 향상시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 가축사육에 널리 활용될 수 있을 것이다.
Use of the feed composition or the probiotics of the present invention can prevent contamination of harmful bacteria with respect to livestock feeds, prevent spoilage of fermented feeds and improve storability, and thus can be widely used for more effective livestock breeding There will be.
도 1은 3종의 살모넬라 속 세균(살모넬라 sp.1(Salmonella enterica subsp . enterica), 살모넬라 sp.2(Salmonella typhimurium) 및 살모넬라 sp.3(Salmonella enteritidis))에 대한 본 발명에서 제공하는 유산균의 항균활성을 나타내는 사진으로서, A는 살모넬라 sp.1에 대한 항균활성을 나타내고, B는 살모넬라 sp.2에 대한 항균활성을 나타내며, C는 살모넬라 sp.3(Salmonella enteritidis)에 대한 항균활성을 나타낸다.
도 2는 4종의 진균류(푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 페니실리움 sp.(Penicillium sp.) 및 푸사리움 sp.(Fusarium sp.))에 대한 본 발명에서 제공하는 세균의 항균활성을 나타내는 사진으로서, A는 푸사리움 솔라니에 대한 항균활성을 나타내고, B는 아스퍼질러스 플라부스에 대한 항균활성을 나타내며, C는 페니실리움 sp.에 대한 항균활성을 나타내고, D는 푸사리움 sp.에 대한 항균활성을 나타낸다.
도 3은 발효시간의 경과에 따라 발효사료에 포함된 유산균, 진균 및 세균의 균체수의 변화를 나타내는 그래프로서, A는 대조군 1의 발효사료(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, B는 대조군 2의 발효사료(타사의 혼합생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, C는 실험군 1의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 0.5%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, D는 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, (●)는 유산균을 나타내고, (×)는 진균을 나타내며, (▲)는 세균을 나타낸다.
도 4는 발효시간의 경과에 따라 발효사료의 pH 변화를 나타내는 그래프로서, (●)는 대조군 1의 발효사료(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, (▲)는 대조군 2의 발효사료(타사의 혼합생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, (■)는 실험군 1의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 0.5%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, (×)는 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타낸다.
도 5는 대조군 1(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)과 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)의 부패여부를 나타내는 사진이다.1 is a bacterium belonging to the genus Salmonella, of the three (sp.1 Salmonella (Salmonella enterica subsp . enterica ), Salmonella sp. 2 ( Salmonella typhimurium ) and Salmonella enteritidis ), wherein A represents an antimicrobial activity against Salmonella sp. 1, B represents an antimicrobial activity against Salmonella sp. Activity, C is Salmonella sp. 3 ( Salmonella enteritidis . < / RTI >
Fig. 2 is a graph showing the results for four fungi ( Fusarium solani , Aspergillus flavus , Penicillium sp. And Fusarium sp. ) As a photograph showing the antibacterial activity of the bacterium provided in the present invention, A shows antibacterial activity against Fusarium solani, B shows antibacterial activity against Aspergillus flavus, C shows antibacterial activity against Penicillium sp. And D shows antimicrobial activity against Fusarium sp.
FIG. 3 is a graph showing changes in the number of bacteria of the lactic acid bacteria, fungi and bacteria contained in the fermented feed according to the elapse of the fermentation time, wherein A is a fermented feed of the control 1 (1% (w / w) B represents a fermented feed of the control group 2 (a fermented feed fermented by adding 1% (w / w) of a mixed probiotic of other companies), C represents a fermented feed of Experimental group 1 (Fermented feed fermented by adding 1.0% (w / w) of the mixed culture medium of the present invention), D represents a fermented feed of the experimental group 2 (fermented feed fermented by adding 1.0% (w / w) (*) Represents lactic acid bacteria, (x) represents fungi, and (▲) represents bacteria.
4 is a graph showing changes in the pH of the fermented feed according to the elapse of the fermentation time, wherein (●) represents a fermented feed of the control group 1 (fermented feed fermented by adding 1% (w / w) of a lactic acid bacterium of other company) , () Represents the fermentation feed of the control group 2 (fermented feed obtained by adding 1% (w / w) of a mixed probiotic of other company), (1) represents the fermented feed of the experimental group 1 (Fermented feed fermented by adding 0.5% (w / w) of fermented feed), and (x) represents fermented feed of experimental group 2 (fermented feed fermented by adding 1.0% (w / w) .
FIG. 5 shows the results of the fermentation of the fermented feed of the control group 1 (fermented feed fermented by adding 1% (w / w) of a third-party lactobacillus) Fermented feed) is corroded.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
1: 유산균, 효모균 및 세균의 선발 1: Selection of lactic acid bacteria, yeast bacteria and bacteria
가축용 발효사료에 적합한 미생물 제제를 개발하기 위하여, 내산성, 내담즙성, 항균활성 및 효소활성이 우수한 유산균, 효모균 및 세균을 자연계로부터 분리동정하고자 하였다.
In order to develop a microorganism preparation suitable for fermented feed for livestock, we tried to isolate lactic acid bacteria, yeast bacteria and bacteria which are excellent in acid resistance, bile resistance, antimicrobial activity and enzyme activity from the natural world.
먼저, 자연계로부터 내산성, 내담즙성, 항균활성 및 효소활성이 우수한 균주를 분리하기 위해 항생제를 먹이지 않은 닭 내장과, 대전 근교에서 채취한 포도, 정읍시 내장산 토양 등의 시료를 채취하였다. First, in order to isolate strains with excellent acid resistance, biliary properties, antimicrobial activity, and enzyme activity from the natural world, samples of chicken intestine without antibiotics, grapes collected from Daejeon,
다음으로, 채취된 시료에 멸균수를 가하고, 30 ℃에서 30분간 진탕시킨 다음, 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액을 10,000배 부피로 희석하여 희석액을 수득하고, 상기 희석액 0.1㎖를 유산균을 선별하기 위한 MRS-Agar 배지(10.0g/ℓ Proteose Peptone, 10.0g/ℓ Beef Extract, 5.0g/ℓ 효모추출물, 20.0g/ℓ Glucose, 1.0g/ℓ Polysorbate 80, 2.0g/ℓ Ammonium Citrate, 5.0g/ℓ Sodium Acetate, 0.1g/ℓ Magnesium Sulfate, 0.05g/ℓ Manganese Sulfate, 2.0g/ℓ Dipotassium Phosphate 및 15.0g/ℓ 한천), 효모균을 선별하기 위한 YM-Agar 배지(3.0g/ℓ 효모추출물, 3.0g/ℓ Malt Extract, 5.0g/ℓ Peptone, 10.0g/ℓ Dextrose 및 15.0g/ℓ 한천) 또는 세균을 선별하기 위한 LB-Agar 배지(5.0g/ℓ 효모추출물, 10.0g/ℓ Tryptone, 10.0g/ℓ NaCl 및 15.0g/ℓ 한천)에 각각 접종하고, 30 ℃ 항온기에서 1 내지 3일동안 배양한 후, 상기 각 배지에서 생성된 단일 콜로니(single colony)를 형태학적으로 분석하여, 유산균, 효모균 및 세균을 각각 1차 선발하였다. Next, sterilized water was added to the collected sample, shaken at 30 DEG C for 30 minutes, and centrifuged to obtain a supernatant. The obtained supernatant was diluted 10,000 times by volume to obtain a dilution. 0.1 ml of the diluted solution was added to MRS-Agar medium (10.0 g / l Proteose Peptone, 10.0 g / l Beef Extract, 5.0 g / l Yeast extract, 20.0g / l Glucose, 1.0g / l Polysorbate 80, 2.0g / l Ammonium Citrate, 5.0g / l Sodium Acetate, 0.1g / l Magnesium Sulfate, 0.05g / l Manganese Sulfate, 2.0g / l Dipotassium Phosphate And 10.0 g / L Dextrose and 15.0 g / L agar) to select yeast strains, YM-Agar medium (3.0 g / L yeast extract, 3.0 g / L Malt Extract, 5.0 g / L Peptone, Or yeast extract, 10.0 g / L Tryptone, 10.0 g / L NaCl and 15.0 g / L agar) for the selection of bacteria, respectively, and incubated for 1 to 3 days at 30 ° C. in a thermostat After culturing, a single colony produced in each medium was morphologically analyzed to firstly select lactic acid bacteria, yeast bacteria and bacteria.
상기 1차 선발된 균주 중에서, 유산균, 효모균 및 세균을 각각 최종 선발하였다. 구체적으로, 유산균은 살모넬라 sp. 균주에 대한 항균활성, 0.1N-HCl로 pH를 조절한 조건에서의 내산성 및 인공 담즙에 대한 내담즙성을 나타내는 균주를 최종 선발하였고; 효모균은 0.1N-HCl로 pH를 조절한 조건에서의 내산성 및 인공 담즙에 대한 내담즙성을 나타내는 균주를 최종 선발하였으며; 세균은 각종 효소(protease, cellulase, α-amylase, xylanase 및 phytase)의 활성을 나타내고, 다양한 균주(푸사리움 sp., 아스퍼질러스 플라부스, 페니실리움 sp., 곰팡이)에 대한 항균활성을 나타내는 균주를 최종 선발하였다.
Of the strains selected first, lactic acid bacteria, yeast bacteria and bacteria were finally selected. Specifically, lactic acid bacteria are Salmonella sp. The antimicrobial activity against the strain, the acid resistance at the pH controlled by 0.1N-HCl and the biliary endurance against artificial bile were finally selected; Yeast strains were selected for acid tolerance under 0.1N-HCl pH control and endothelial resistance against artificial bile; Bacteria exhibit activity of various enzymes (protease, cellulase, α-amylase, xylanase and phytase) and exhibit antimicrobial activity against various strains (Fusarium sp., Aspergillus flavus, Penicillium sp., Fungi) The strain was finally selected.
실시예Example
2: 선발된 유산균, 효모균 및 세균의 동정 2: Identification of selected lactic acid bacteria, yeast bacteria and bacteria
상기 실시예 1에서 최종 선발된 유산균, 효모균 및 세균의 계통분류학적으로 동정하기 위하여, 상기 각 균주로부터 16S ribosomal RNA(rRNA)의 유전자인 16S rDNA를 증폭시킨 후, 증폭된 산물을 정제하여 자동염기서열 분석 장치(Applied Biosystems model 373A automatic sequencer)와 염기서열 분석키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Perkin-Elmer Applied Biosystems)에 적용하여, 상기 16S rDNA의 염기서열을 결정하였다. 16S rDNA, which is a gene of 16S ribosomal RNA (rRNA), was amplified from each of the above strains in order to identify strains of lactic acid bacteria, yeast and bacteria selected finally in Example 1. The amplified products were purified, The base sequence of the 16S rDNA was determined by applying it to a sequencing apparatus (Applied Biosystems model 373A automatic sequencer) and a BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems).
상기 결정된 16S rDNA의 염기서열을 유전자은행의 블라스트 프로그램에 적용하여, 상기 16S rDNA에 포함된 internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene 그리고 internal transcribed spacer 2를 포함하는 571bp의 염기서열을 분석하였고, 그 결과는 다음과 같았다:
The nucleotide sequence of the determined 16S rDNA was applied to a blast program of a gene bank to analyze a nucleotide sequence of 571 bp including internal transcribed
먼저, 유산균은 표준균주인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)과 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주임을 확인하여, 상기 유산균을 "락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에서 수탁번호 KCTC 12508BP를 부여받았다.First, the lactic acid bacteria strains of Lactobacillus plan tareom (Lactobacillus plantarum) and to confirm that strains that are not identical but show a high homology, the said lactic acid bacteria "Lactobacillus plan tareom J-135 (Lactobacillus plantarum J-135) "and received the accession number KCTC 12508BP from the Korean Collection for Type Culture at the Korea Biotechnology Center on October 25, 2013.
다음으로, 효모균은 표준균주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주임을 확인하여, 상기 효모균을 "사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12510BP를 부여받았다.Next, it was confirmed that yeast was highly homologous but not identical with Saccharomyces cerevisiae , a standard strain, and the yeast was designated as " Saccharomyces cerevisiae DAE-4 ( Saccharomyces cerevisiae cerevisiae DAE-4) ", deposited on Oct. 25, 2013 with the Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology Center, and granted accession number KCTC 12510BP.
끝으로, 세균은 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)와 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주임을 확인하여, 상기 세균을 "바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고 수탁번호 KCTC 12509BP를 부여받았다.
Finally, it was confirmed that the bacterium was highly homologous but not identical to the standard strain Bacillus amyloliquefaciens , and the bacterium was named " Bacillus amyloliquefaciens PBS ( Bacillus amyloliquefaciens PBS -17). "On October 25, 2013, it was deposited with the Biological Resource Center of the Korea Research Institute of Bioscience and received the accession number KCTC 12509BP.
실시예Example
3: 3:
동정된Identified
유산균, 효모균 및 세균의 활성평가 Activity evaluation of lactic acid bacteria, yeast and bacteria
상기 실시예 2에서 동정된 각 유산균, 효모균 및 세균의 내산성, 내담즙성, 효소활성 및 항균활성을 평가하였다.
The acidity, biliary properties, enzymatic activity and antibacterial activity of each of the lactic acid bacteria, yeast bacteria and bacteria identified in Example 2 were evaluated.
실시예Example
3-1: 3-1:
내산성Acid resistance
평가 evaluation
상기 실시예 2에서 동정된 각 유산균 및 효모균의 내산성을 평가하였다(표 1).The acid resistance of each of the lactic acid bacteria and yeast bacteria identified in Example 2 was evaluated (Table 1).
먼저, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 9,000 rpm으로 25분동안 원심분리 하여 균주를 수득하였다. 또한, 상기 MRS 액체배지에 HCl을 첨가하여 pH 2.0 내지 5.0으로 조정된 각 배지를 수득하고, 상기 수득한 각 배지에 상기 수득한 균주를 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 접종하였으며, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 종료된 후, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 배양희석액을 수득하고, 상기 배양희석액을 MRS-Agar 배지에 접종한 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 배양이 종료된 후, 생성된 집락의 수를 측정하고, pH 변화에 따른 집락수의 변화를 분석함으로서, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주의 내산성을 평가하였다. 이때, 대조군으로는 pH를 조정하지 않은 MRS 액체배지에서 배양된 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 사용하였다.First, Lactobacillus plantarum J-135 strain was inoculated into the MRS liquid medium, cultured at 37 DEG C for 24 hours, and then centrifuged at 9,000 rpm for 25 minutes to obtain a strain. Further, HCl was added to the MRS liquid medium to obtain each medium adjusted to pH 2.0 to 5.0, and the obtained strain was inoculated at a concentration of 1.9 x 10 9 CFU / ml to each of the obtained media. ≪ / RTI > for 24 hours. After the cultivation was completed, sterilized physiological saline was added to the culture to obtain a culture dilution. The culture dilution was inoculated on MRS-Agar medium and then cultured at 37 ° C for 24 hours. After completion of the culture, The number of colonies formed was measured and the change in the number of colonies according to the change in pH was analyzed to evaluate the acid resistance of Lactobacillus plantarum J-135 strain. At this time, as a control group, Lactobacillus plantarum J-135 strain cultured in an MRS liquid medium without pH adjustment was used.
한편, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주와 YM 배지를 사용하고, 30℃에서 배양하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주의 내산성을 평가하였다.
On the other hand, Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain was obtained by performing the same method as described above, except that Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain and YM medium were used and cultured at 30 캜 Was evaluated.
상기 표 1에서 보듯이, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(유산균) 및 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(효모균)는 pH 5.0 이하의 조건에서도 생육할 수 있음을 확인하였다.As shown in Table 1, it was confirmed that Lactobacillus plantarum strain J-135 (lactic acid bacteria) and Saccharomyces cerevisiae strain DAE-4 (yeast bacteria) can be grown under pH 5.0 or lower.
따라서, 상기 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주 및 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주는 내산성을 나타내어 소장 및 대장에서 생육하면서 활성을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
Thus, the Lactobacillus plantarum strain J-135 and the Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain exhibited acid resistance and were able to exhibit activity while growing in the small intestine and the large intestine.
실시예Example
3-2: 3-2:
내담즙성My bile
평가 evaluation
담즙산에 대한 내성(내담즙성)은 위에서의 산성조건에 대한 저항성과 더블어 프로바이오틱스 미생물이 갖추어야 할 기본적인 특성 중 하나이다. 담즙은 소장의 상부에서 분비되어 섭취된 지질식품의 소화, 흡수를 촉진하고, 미생물에 대해 세제와 유사한 작용을 함으로써 지방과 지방산으로 구성되어있는 미생물의 세포막에 영향을 주어 미생물 살균작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이에, 상기 실시예 2에서 동정된 각 유산균 및 효모균의 내담즙성을 평가하였다(표 2).
Tolerance to bile acids (bile tolerance) is one of the basic characteristics that probiotic microorganisms must possess in combination with resistance to acidic conditions above. The bile is secreted from the upper part of the small intestine and promotes the digestion and absorption of the ingested lipid food. It acts similar to the detergent against the microorganism, thereby affecting the cell membrane of the microorganism composed of fat and fatty acid, have. Thus, the bile bastability of each of the lactic acid bacteria and yeast bacteria identified in Example 2 was evaluated (Table 2).
먼저, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 9,000 rpm으로 25분동안 원심분리 하여 균주를 수득하였다. 또한, 0.5 내지 2%(v/v)의 인공담즙(돼지담즙, Sigma)을 포함하는 각각의 MRS 액체배지를 제작하고, 상기 제작된 인공담즙을 포함하는 각각의 MRS 액체배지에 상기 수득한 균주를 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 접종하였으며, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 종료된 후, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 배양희석액을 수득하고, 상기 배양희석액을 MRS-Agar 배지에 접종한 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 생성된 집락의 수를 측정하고, 인공담즙의 농도 변화에 따른 집락수의 변화를 분석함으로서, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주의 내담즙성을 평가하였다. 이때, 대조군으로는 인공담즙을 포함하지 않은 MRS 액체배지에서 배양된 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 사용하였다.First, Lactobacillus plantarum J-135 strain was inoculated into the MRS liquid medium, cultured at 37 DEG C for 24 hours, and then centrifuged at 9,000 rpm for 25 minutes to obtain a strain. Each of the MRS broth containing 0.5 to 2% (v / v) artificial bile (pig bile, Sigma) was prepared, and each of the MRS broth containing the prepared artificial bile was added with the obtained strain Was inoculated at a concentration of 1.9 × 10 9 CFU / ml and cultured at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the incubation, sterilized physiological saline was added to the culture to obtain a culture dilution. The culture dilution was inoculated into MRS-Agar medium and cultured at 37 ° C for 24 hours. After the culture was completed, the number of colonies produced was measured, and the change in the number of colonies according to the concentration of artificial bile was analyzed to evaluate the bile resistance of Lactobacillus plantarum J-135 strain. As a control, Lactobacillus plantarum J-135 strain cultured in an MRS liquid medium containing no artificial bile was used.
한편, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주와 YM 배지를 사용하고, 30℃에서 배양하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주의 내담즙성을 평가하였다.
On the other hand, Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain was obtained by performing the same method as described above, except that Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain and YM medium were used and cultured at 30 캜 Were evaluated for their biliary properties.
상기 표 2에서 보듯이, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(유산균) 및 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(효모균)는 인공담즙의 농도가 증가할 수록 균주의 생존율이 감소되었으나, 최대함량의 인공담즙을 포함하는 배지에서도 일정 수준의 균주가 유지됨을 확인하였다.As shown in Table 2, the survival rate of the strain was decreased as the concentration of artificial bile was increased in the Lactobacillus plantarum J-135 strain (lactic acid bacteria) and Saccharomyces cerevisiae strain DAE-4 (yeast strain) And a certain level of strain was maintained in the culture medium containing the artificial bile.
따라서, 상기 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주 및 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주는 내담즙성을 나타내어 소장 및 대장에서 생육하면서 활성을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
Therefore, the Lactobacillus plantarum strain J-135 and the Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain exhibited biliary-biliary properties and were able to exhibit activity while growing in the small intestine and the large intestine.
실시예Example
3-3: 효소활성 평가 3-3: Evaluation of enzyme activity
상기 실시예 2에서 동정된 각 유산균, 효모균 및 세균에서 생산되는 다양한 효소(lipase, phytase, protease, Xylanase, α-amylase 및 cellulase)의 활성을 평가하였다(표 3).
The activities of various enzymes (lipase, phytase, protease, Xylanase, α-amylase and cellulase) produced in each lactic acid bacteria, yeast and bacteria identified in Example 2 were evaluated (Table 3).
먼저, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 희석된 배양희석액을 수득하고, 상기 배양희석액을 효소활성 평가용 기질이 포함된 MRS-Agar 배지에 접종한 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 배양된 배지에서 형성되는 투명환 또는 노란색환의 크기를 측정함으로써, 다양한 효소의 활성을 평가하였다. 이때, 리파제(lipase) 활성은 1%(w/v) 트리카프릴린(tricaprylin)이 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양후 형성되는 투명환의 크기를 측정하여 평가하고; 피타제(phytase) 활성은 0.1%(w/v) 소듐피테이트(sodium phytate)가 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양후 형성되는 투명환의 크기를 측정하여 평가하였으며; 프로테아제(protease) 활성은 1%(w/v) 탈지분유(skim milk)가 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양후 형성되는 투명환의 크기를 측정하여 평가하고; 자일라나제(xylanase) 활성은 0.5%(w/v) 바이르키우드 자일란(birchwood xylan)이 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양한 다음, 콜로니 주변에 0.5% Congo-red로 15분간 염색하여 생성되는 투명환의 크기를 측정하여 평가하였으며; α-아밀라제(α-amylase) 활성은 1%(w/v) 가용성 전분이 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양한 다음, 콜로니 주변에 Rugol's 용액을 적가하여 생성되는 노란색 환의 크기를 측정하여 평가하고; 셀룰라제(cellulase) 활성은 0.5%(w/v) CMC(carboxymethyl cellulose)가 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양한 다음, 0.2% Congo-red로 15분간 염색하고, 1M NaCl로 탈염시킨 후에 잔류하는 노란색 환의 크기를 측정하여 평가하였다.First, the Lactobacillus plantarum J-135 strain was inoculated into the MRS liquid medium and cultured at 37 DEG C for 24 hours. Then, sterilized physiological saline was added to the culture and diluted to a concentration of 1.9 x 10 9 CFU / The culture diluted solution was inoculated on MRS-Agar medium containing the substrate for enzyme activity assay, followed by incubation at 37 ° C. for 24 hours, and the size of the transparent or yellow circle formed in the cultured medium was measured To evaluate the activity of various enzymes. At this time, lipase activity was measured by measuring the size of the transparent ring formed after culturing using MRS-Agar medium supplemented with 1% (w / v) tricaprylin; Phytase activity was measured by measuring the size of the transparent ring formed after culturing using MRS-Agar medium supplemented with 0.1% (w / v) sodium phytate; Protease activity was measured by measuring the size of the transparent ring formed after culturing using MRS-Agar medium supplemented with 1% (w / v) skim milk; The xylanase activity was measured by using MRS-Agar medium supplemented with 0.5% (w / v) birchwood xylan, and then stained with 0.5% Congo-red for 15 minutes around the colonies The size of the resulting transparent ring was measured and evaluated; The α-amylase activity was determined by measuring the size of the yellow circle formed by adding Rugol's solution to the colony by using MRS-Agar medium supplemented with 1% (w / v) soluble starch and; Cellulase activity was measured by using MRS agar medium supplemented with 0.5% (w / v) CMC (carboxymethyl cellulose), followed by staining with 0.2% Congo-red for 15 minutes and desalting with 1 M NaCl The size of the remaining yellow circle was measured and evaluated.
다음으로, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주와 YM 배지를 사용하고, 30℃에서 배양하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주의 효소활성을 평가하였다.Next, the same procedure as described above was carried out except that Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain and YM medium were used and cultivation was carried out at 30 DEG C to prepare Saccharomyces cerevisiae DAE-4 The enzyme activity of the strain was evaluated.
끝으로, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주와 LB 배지를 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주의 효소활성을 평가하였다.
Finally, the enzyme activity of the Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strain was evaluated by the same method as described above, except that Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strain and LB medium were used.
효모균
세균Lactobacillus
yeast fungus
Germ
-
--
-
-
-
10-
-
10
-
22-
-
22
-
18-
-
18
-
13-
-
13
-
18-
-
18
상기 표 3에서 보듯이, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(유산균) 및 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(효모균)는 효소활성을 전혀 나타내지 않았으나, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주(세균)는 리파제를 제외한 피타제, 프로테아제, 자일라나제, α-아밀라제 및 셀룰라제의 활성을 나타냄을 확인하였다.As shown in Table 3, Lactobacillus plantarum J-135 strain (lactic acid bacteria) and Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain (yeast strain) did not show any enzyme activity, but Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 The strain (bacterium) showed activity of phytase, protease, xylanase,? -Amylase and cellulase except lipase.
따라서, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주는 다양한 효소활성을 나타냄을 알 수 있었다.
Thus, it was found that the Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strain exhibited various enzyme activities.
실시예Example
3-4: 항균활성 평가 3-4: Evaluation of antimicrobial activity
상기 실시예 2에서 동정된 각 유산균, 효모균 및 세균의 항균활성은 3종의 살모넬라 속 세균(살모넬라 sp.1(Salmonella enterica subsp . enterica), 살모넬라 sp.2(Salmonella typhimurium) 및 살모넬라 sp.3(Salmonella enteritidis))과 4종의 진균류(푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 페니실리움 sp.(Penicillium sp .) 및 푸사리움 sp.(Fusarium sp .))를 대상으로 측정하였다(도 1, 2 및 표 4).
Example 2 Each of lactic acid bacteria, the antimicrobial activity of the yeast and bacteria identified in Salmonella are bacteria belonging to the genus of the three (sp.1 Salmonella (Salmonella enterica subsp . enterica), Salmonella sp.2 (Salmonella typhimurium) sp.3 and Salmonella (Salmonella enteritidis)) and four species of fungi (Fusarium solani (Fusarium solani , Aspergillus flavus , Penicillium sp. sp . ) And Fusarium sp. (Fusarium sp . )) Were measured (Figs. 1 and 2 and Table 4).
먼저, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하여, 배양물을 수득하였다. 상기 배양물 100㎖를 여과지에 흡수시킨 디스크를 수득하고, 이를 3종의 살모넬라 속 세균이 배양된 각 NB 배지의 상단에 위치시킨 후, 37℃에서 24시간 배양하였으며, 배양후 NB 배지에서 생성되는 투명환의 크기를 측정하였다(도 1). 또한, 상기 4종의 진균류가 배양된 PDA 배지의 가장자리에 상기 수득한 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주의 배양물을 접종하고, 25℃에서 배양하여 곰팡이의 생육을 저해하는 환의 크기를 측정함으로써, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주의 항균활성을 평가하였다.First, the Lactobacillus plantarum J-135 strain was inoculated into the MRS liquid medium to a concentration of 1.9 x 10 9 CFU / ml and cultured at 37 ° C for 24 hours to obtain a culture. A disk in which 100 ml of the culture was absorbed into the filter paper was obtained and placed on top of each NB medium in which the three species of Salmonella bacteria were cultured and then cultured at 37 ° C for 24 hours. The size of the transparent ring was measured (Fig. 1). In addition, a culture of the obtained Lactobacillus plantarum J-135 strain was inoculated at the edge of the PDA medium in which the four fungi were cultured, and the size of the ring inhibiting the growth of the fungus was measured by culturing at 25 DEG C, The antibacterial activity of Lactobacillus plantarum J-135 strain was evaluated.
다음으로, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주와 YM 액체배지를 사용하고, 30℃에서 배양하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주의 항균활성을 평가하였다.Next, the same method as described above was carried out except that Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain and YM liquid medium were used and cultivation was carried out at 30 ° C to prepare Saccharomyces cerevisiae DAE- 4 were evaluated for antimicrobial activity.
끝으로, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주와 LB 배지를 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주의 항균활성을 평가하였다.
Finally, the antibacterial activity of the Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strain was evaluated by the same method as described above, except that the Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strain and LB medium were used.
도 1은 3종의 살모넬라 속 세균(살모넬라 sp.1(Salmonella enterica subsp . enterica), 살모넬라 sp.2(Salmonella typhimurium) 및 살모넬라 sp.3(Salmonella enteritidis))에 대한 본 발명에서 제공하는 유산균의 항균활성을 나타내는 사진으로서, A는 살모넬라 sp.1에 대한 항균활성을 나타내고, B는 살모넬라 sp.2에 대한 항균활성을 나타내며, C는 살모넬라 sp.3에 대한 항균활성을 나타낸다. 또한, 상기 A 내지 C에 표시된 Lp는 본 발명에서 제공하는 유산균을 처리한 실험군을 나타내고, C는 공지된 항생제(tetracycline)를 처리한 대조군을 나타낸다.
1 is a bacterium belonging to the genus Salmonella, of the three (sp.1 Salmonella (Salmonella enterica subsp . enterica ), Salmonella sp. 2 ( Salmonella typhimurium ) and Salmonella enteritidis ), wherein A represents an antimicrobial activity against Salmonella sp. 1, B represents an antimicrobial activity against Salmonella sp. And C shows an antibacterial activity against Salmonella sp. 3. Lp shown in the above A to C represents an experimental group treated with the lactic acid bacteria provided in the present invention, and C represents a control group treated with known antibiotic (tetracycline).
도 2는 4종의 진균류(푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 페니실리움 sp.(Penicillium sp .) 및 푸사리움 sp.(Fusarium sp .))에 대한 본 발명에서 제공하는 세균의 항균활성을 나타내는 사진으로서, A는 푸사리움 솔라니에 대한 항균활성을 나타내고, B는 아스퍼질러스 플라부스에 대한 항균활성을 나타내며, C는 페니실리움 sp.에 대한 항균활성을 나타내고, D는 푸사리움 sp.에 대한 항균활성을 나타낸다.
Figure 2 is a four species of fungi (Fusarium solani (Fusarium solani , Aspergillus flavus , Penicillium sp. sp . ) And Fusarium sp. (Fusarium sp . ), Wherein A represents an antimicrobial activity against fusarium solanii, B represents an antimicrobial activity against Aspergillus flavus, C represents penicillium sp., and D shows an antimicrobial activity against Fusarium sp.
아울러, 상기 도 1 및 2에서 측정된 생육을 저해하는 환의 직경을 하기 표 4에 나타내었다.
In addition, the diameters of the rings inhibiting growth as measured in FIGS. 1 and 2 are shown in Table 4 below.
sp. 1Salmonella
sp. One
sp. 2Salmonella
sp. 2
sp. 3Salmonella
sp. 3
솔라니Fusarium
Solanie
sp.Fusarium
sp.
효모균
세균Lactobacillus
yeast fungus
Germ
-
-12
-
-
-
-14
-
-
-
-10
-
-
-
10-
-
10
-
15-
-
15
-
9-
-
9
-
12-
-
12
도 1, 2 및 표 4에서 보듯이, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(유산균)는 살모넬라 속 세균에 대하여는 항균활성을 나타내었으나, 진균에 대하여는 항균활성을 나타내지 않고, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(효모균)는 세균 및 진균에 대하여 항균활성을 전혀 나타내지 않았으며, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주(세균)는 세균에 대하여는 항균활성을 나타내지 않았으나, 진균에 대하여는 항균활성을 나타냄을 확인하였다.As shown in Figs. 1 and 2 and Table 4, the Lactobacillus plantarum J-135 strain (lactic acid bacterium) showed antibacterial activity against bacteria belonging to Salmonella but did not exhibit antibacterial activity against fungi, and Saccharomyces cerevisiae The DAE-4 strain (yeast strain) showed no antimicrobial activity against bacteria and fungi, while the Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strain (bacterium) did not exhibit antimicrobial activity against bacteria, but the antimicrobial activity against fungi Respectively.
따라서, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주와 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주의 혼합제제는 세균과 진균에 대한 항균활성을 동시에 나타냄을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that the mixed preparation of Lactobacillus plantarum J-135 strain and Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strain exhibited antibacterial activity against bacteria and fungi at the same time.
실시예Example
4: 발효사료의 제조 및 특성분석 4: Preparation and characterization of fermented feed
실시예Example
4-1: 발효사료의 제조 4-1: Preparation of fermented feed
먼저, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 희석된 배양희석액을 수득하였다.First, the Lactobacillus plantarum J-135 strain was inoculated into the MRS liquid medium and cultured at 37 DEG C for 24 hours. Then, sterilized physiological saline was added to the culture and diluted to a concentration of 1.9 x 10 9 CFU / A culture dilution was obtained.
다음으로, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주를 YM 액체배지에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 희석된 배양희석액을 수득하였다.Next, the Saccharomyces cerevisiae strain DAE-4 was inoculated into a YM liquid medium and cultured at 30 ° C. for 24 hours. Then, sterilized physiological saline was added to the culture to obtain a concentration of 1.9 × 10 9 CFU / ml ≪ / RTI > was obtained.
그 다음으로, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주를 LB 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 희석된 배양희석액을 수득하였다.Subsequently, a strain of Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 was inoculated into the LB liquid medium and cultured at 37 DEG C for 24 hours. Then, sterilized physiological saline was added to the culture to obtain a concentration of 1.9 x 10 9 CFU / ≪ / RTI > was obtained.
끝으로, 상기 수득한 3종의 배양희석액을 동일부피로 혼합하여 혼합균주 배양액을 수득하였다.
Finally, the three culture dilutions thus obtained were mixed in the same volume to obtain a mixed culture medium.
상기 수득한 혼합균주 배양액을 배합사료(178kg/t 이탈리안그라스 사일리지, 178kg/t 수단그라스 사일리지, 133kg/t 호밀 사일리지, 222kg/t 볏짚 사일리지, 111kg/t 옥수수 사일리지, 33kg/t 소맥피, 45kg/t 쌀겨, 33kg/t 당맥피, 62kg/t 홍삼박, 3kg/t 소금 및 2kg/t 비타민-미네랄 혼합물)에 각각 0.5(실험군 1) 또는 1%(w/w)(실험군 2)로 첨가하고, 상기 배양액이 첨가된 배합사료를 대형자루에 500kg씩 담은 후 밀봉하고 3주 동안 발효시켜서, 각각의 발효사료를 제조하였다.
The obtained mixed culture broth was added to a mixed feed (178 kg / t Italian Grass silage, 178 kg / t Sudan grass silage, 133 kg / t rye silage, 222 kg / t rice straw silage, 111 kg / t corn silage, 33 kg / (experimental group 1) or 1% (w / w) (experimental group 2) were added to each of tungsten, tungsten, 33 kg / t of mackerel, 62 kg / t red ginseng, 3 kg / t salt and 2 kg / t vitamin- , 500 kg of the mixed feed containing the above culture solution was placed in a large bag, sealed, and fermented for 3 weeks to prepare each fermented feed.
한편, 대조군의 발효사료로는 타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료(대조군 1)와, 타사의 혼합생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료(대조군 2)를 사용하였다.
Meanwhile, as a fermented feed of the control group, a fermented feed (control 1) fermented by adding 1% (w / w) of a lactic acid bacterium of a third party and a fermented feed fermented by adding 1% (w / (Control group 2) were used.
실시예Example
4-2: 발효시간의 경과에 따른 4-2: As the fermentation time elapses
균체수의Number of cells
변화 change
상기 실시예 4-1에서 제조된 대조군과 실험군의 각 발효사료에 포함된 유산균, 진균 및 세균의 균체수의 변화를 발효시간의 변화에 따라 측정하였다. 대략적으로, 발효후 1, 3, 5, 7, 14 및 21일이 경과된 시점에서 시료를 채취하고, 채취된 각 시료 1g에 멸균된 생리식염수를 가하여 107 배 희석된 희석액을 수득한 다음, 상기 희석액 100㎕를 LB-Agar 배지, MRS-Agar배지 또는 PDA 배지에 접종하였으며, 25℃(PDA 배지) 또는 37℃(LB 고체배지, MRS 고체배지)에서 배양하여, 각각 세균, 유산균 및 진균을 선별배양하고, 배양이 종료된 후 생성된 집락을 계수하였으며, 이를 비교하였다(도 3). The changes in the number of cells of the lactic acid bacteria, fungi and bacteria contained in the fermented feeds of the control group and the experimental group prepared in Example 4-1 were measured according to changes in fermentation time. Approximately, samples were taken at 1, 3, 5, 7, 14 and 21 days after fermentation, and sterilized physiological saline was added to 1 g of each sample to obtain a 10 7 -fold diluted solution, 100 μl of the diluted solution was inoculated into LB-Agar medium, MRS-Agar medium or PDA medium and cultured at 25 ° C. (PDA medium) or 37 ° C. (LB solid medium, MRS solid medium) to obtain bacteria, lactic acid bacteria and fungi The cultures were sorted, and colonies formed after the culture was terminated were counted and compared (FIG. 3).
도 3은 발효시간의 경과에 따라 발효사료에 포함된 유산균, 진균 및 세균의 균체수의 변화를 나타내는 그래프로서, A는 대조군 1의 발효사료(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, B는 대조군 2의 발효사료(타사의 혼합생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, C는 실험군 1의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 0.5%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, D는 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, (●)는 유산균을 나타내고, (×)는 진균을 나타내며, (▲)는 세균을 나타낸다.FIG. 3 is a graph showing changes in the number of bacteria of the lactic acid bacteria, fungi and bacteria contained in the fermented feed according to the elapse of the fermentation time, wherein A is a fermented feed of the control 1 (1% (w / w) B represents a fermented feed of the control group 2 (a fermented feed fermented by adding 1% (w / w) of a mixed probiotic of other companies), C represents a fermented feed of Experimental group 1 (Fermented feed fermented by adding 1.0% (w / w) of the mixed culture medium of the present invention), D represents a fermented feed of the experimental group 2 (fermented feed fermented by adding 1.0% (w / w) (*) Represents lactic acid bacteria, (x) represents fungi, and (▲) represents bacteria.
도 3에서 보듯이, 대조군의 경우에는 발효시간이 경과함에 따라, 특정 미생물이 과도하게 증식되었으나, 본 발명의 혼합균주 배양액이 첨가된 발효사료는 유산균이 상대적으로 다량으로 증식하는 경향을 나타내었으나, 대조군에 비하여 과도하게 증식하지는 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 3, in the case of the control group, specific microorganisms were excessively proliferated as the fermentation time elapsed. However, the fermented feed to which the mixed culture medium of the present invention was added showed a tendency to multiply relatively large amounts of lactic acid bacteria, And did not over-proliferate compared with the control group.
상기 증식된 유산균은 기타 부패균 및 곰팡이의 생육을 억제할 수 있으므로, 발효사료의 부패 및 병원성 곰팡이로 인한 위험성을 방지하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
The above-mentioned lactic acid bacterium can inhibit the growth of other spoilage bacteria and fungi, thereby preventing the risk of corruption and pathogenic fungi of the fermented feed.
실시예Example
4-3: 발효시간의 경과에 따른 4-3: As the fermentation time elapses
pHpH
의 변화Change of
상기 실시예 4-1에서 제조된 대조군과 실험군의 각 발효사료의 pH 변화를 발효시간의 변화에 따라 측정하고, 비교하였다. 대략적으로, 발효후 1, 3, 5, 7, 14 및 21일이 경과된 시점에서 시료를 채취하고, 채취된 각 시료 1g에 멸균된 증류수 9㎖을 가하여 30분 동안 교반하였으며, 상기 교반액의 pH를 측정하고, 이를 비교하였다(도 4). The pH change of each fermented feed prepared in Example 4-1 was measured and compared according to the fermentation time. Approximately, samples were taken at 1, 3, 5, 7, 14 and 21 days after fermentation, and 1 g of each sample was added with 9 ml of sterilized distilled water, and the mixture was stirred for 30 minutes. The pH was measured and compared (Figure 4).
도 4는 발효시간의 경과에 따라 발효사료의 pH 변화를 나타내는 그래프로서, (●)는 대조군 1의 발효사료(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, (▲)는 대조군 2의 발효사료(타사의 혼합생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, (■)는 실험군 1의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 0.5%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, (×)는 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타낸다.4 is a graph showing changes in the pH of the fermented feed according to the elapse of the fermentation time, wherein (●) represents a fermented feed of the control group 1 (fermented feed fermented by adding 1% (w / w) of a lactic acid bacterium of other company) , () Represents the fermentation feed of the control group 2 (fermented feed obtained by adding 1% (w / w) of a mixed probiotic of other company), (1) represents the fermented feed of the experimental group 1 (Fermented feed fermented by adding 0.5% (w / w) of fermented feed), and (x) represents fermented feed of experimental group 2 (fermented feed fermented by adding 1.0% (w / w) .
도 4에서 보듯이, 대조군 1의 발효사료는 발효시간이 경과하여도 중성 pH를 유지하는 반면, 대조군 2, 실험군 1 및 실험군 2의 발효사료는 발효시간이 경과함에 따라, pH가 저하됨을 확인하였다.As shown in FIG. 4, the fermented feed of the
따라서, 본 발명의 발효사료는 낮은 수준의 pH를 유지하여 잡균과 부패균주의 생육을 억제할 수 있으므로, 저장성이 향상됨을 다시 한번 확인할 수 있었다.
Therefore, the fermented feed according to the present invention can maintain a low level of pH and inhibit the growth of germs and spoilage bacteria, so that the storage stability can be confirmed once again.
실시예Example
4-4: 발효시간의 경과에 따른 4-4: Time course of fermentation time
부패여부Whether corruption
상기 대조군 1의 발효사료와 실험군 2의 발효사료를 21일 동안 발효시킨 후에 부패여부를 확인하였다(도 5). 도 5는 대조군 1(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)과 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)의 부패여부를 나타내는 사진이다.The fermented feed of the
도 5에서 보듯이, 유산균 생균제를 첨가하여 발효시킨 발효사료(대조군 1)는 발효후에 부패된 반면, 본 발명의 혼합균주 배양액을 첨가하여 발효시킨 발효사료(실험군 2)는 발효후에도 부패하지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 5, the fermented feed (control group 1) fermented with the addition of the lactic acid bacteriostatic agent was decayed after fermentation, whereas the fermented feed (experimental group 2) fermented with the mixed culture of the present invention did not decay after fermentation Respectively.
따라서, 본 발명의 발효사료는 우수한 보존성을 나타냄을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that the fermented feed of the present invention exhibits excellent preservability.
Claims (11)
Lactobacillus plantarum J-135 strain of accession number KCTC 12508BP, Lactobacillus plantarum J-135 strain, which does not have antimicrobial activity against Fusarium spp., Saka of accession number KCTC 12510BP, which has no enzyme activity of amylase and cellulase romayi process three Levy jiae DAE-4 strains (Saccharomyces cerevisiae DAE-4) and having no anti-bacterial activity against bacteria belonging to the genus Salmonella, Bacillus amyl the accession number of KCTC 12509BP kwipe sieon Lowry's PBS-17 strain (Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 ). ≪ / RTI >
상기 조성물에 포함된 상기 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주의 함량비는 1:1:1(w/w/w)인 것인 조성물.
The method according to claim 1,
The content ratio of the Lactobacillus plantarum J-135 strain, Saccharomyces cerevisiae DAE-4 strain and Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 strain contained in the composition was 1: 1: 1 (w / w) / w). < / RTI >
상기 사료첨가용 조성물은 살모넬라 속(Salmonella sp .) 균주, 푸사리움 속(Fusarium sp.) 균주, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주, 페니실리움 속(penicillium sp.) 균주 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 균주에 대하여 항균활성을 나타내는 것인 조성물.
The method according to claim 1,
The feed additive composition for genus is Salmonella (Salmonella sp . ) Strain, the genus Fusarium sp.) strain, Aspergillus genus (Aspergillus sp .) strain, a penicillium sp .), and a combination thereof.
Lactobacillus plantarum J-135 strain of accession number KCTC 12508BP, Lactobacillus plantarum J-135 strain, which does not have antimicrobial activity against Fusarium spp., Saka of accession number KCTC 12510BP, which has no enzyme activity of amylase and cellulase romayi process three Levy jiae DAE-4 strains (Saccharomyces cerevisiae DAE-4) and having no anti-bacterial activity against bacteria belonging to the genus Salmonella, Bacillus amyl the accession number of KCTC 12509BP kwipe sieon Lowry's PBS-17 strain (Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 ≪ / RTI >
Lactobacillus plantarum J-135 strain of accession number KCTC 12508BP, Lactobacillus plantarum J-135 strain, which does not have antimicrobial activity against Fusarium spp., Saka of accession number KCTC 12510BP, which has no enzyme activity of amylase and cellulase romayi process three Levy jiae DAE-4 strains (Saccharomyces cerevisiae DAE-4) and having no anti-bacterial activity against bacteria belonging to the genus Salmonella, Bacillus amyl the accession number of KCTC 12509BP kwipe sieon Lowry's PBS-17 strain (Bacillus amyloliquefaciens PBS-17 ). ≪ / RTI >
상기 발효사료는 살모넬라 속(Salmonella sp .) 균주, 푸사리움 속(Fusarium sp.) 균주, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주, 페니실리움 속(penicillium sp.) 균주 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 균주에 대하여 항균활성을 나타내는 것인 발효사료.
6. The method of claim 5,
The fermentation feed in Salmonella (Salmonella sp . ) Strain, Fusarium genus (Fusarium sp.) Strain, Aspergillus genus (Aspergillus sp .) strain, a penicillium sp .), and combinations thereof. The fermented feed has an antibacterial activity against a strain selected from the group consisting of:
A method of breeding livestock comprising feeding the fermented feed of claim 5 to the livestock.
A method for producing a fermented feed comprising the step of fermenting a raw material feed by adding the feed additive composition according to any one of claims 1 to 3 or the probiotics according to claim 4.
Lactobacillus plantarum J-135 of Accession No. KCTC 12508BP, which has no antimicrobial activity against Fusarium spp.
Saccharomyces cerevisiae DAE-4 with accession number KCTC 12510BP, which has no enzymatic activity of amylase and cellulase.
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