KR101698068B1 - PPAR-gamma acrivation or expression regulating composition comprising galectin-3 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 갈렉틴-3을 이용한 대사질환 치료에 관한 것으로, 보다 상세하게는 갈렉틴-3을 이용하여 과산화소체 증식체 활성화 수용체-감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)의 발현 및 활성을 조절하는 방법 및 이를 이용하여 대사성 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to the treatment of metabolic diseases using galectin-3, and more particularly, to the use of galectin-3 for the expression and activity of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) And a method for treating or preventing a metabolic disease using the same.
Description
본 발명은 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하는 과산화소체 증식체 활성화 수용체-감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ) 활성 또는 발현 조절용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for regulating the activity or expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) comprising galectin-3 as an active ingredient.
백색지방조직(white adipose tissue; WAT)의 주요 역할은 에너지 저장을 통한 항상성 에너지의 유지이다. 과도한 음식 에너지가 공급되는 경우, 남는 에너지는 백색지방조직에서 트리글리셀리드(triglycerides) 형태로 저장되며, 백색지방조직의 중량을 증가시킨다. 너무 많은 백색지방조직은 제2형 당뇨병, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증가 같은 대사성 질환의 원인이 된다.The main role of white adipose tissue (WAT) is the maintenance of homeostatic energy through energy storage. When excessive food energy is supplied, the remaining energy is stored in the form of triglycerides in white adipose tissue and increases the weight of white adipose tissue. Too much white fat tissue causes metabolic diseases such as
과산화소체 증식체 활성화 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor)는 과산화소체(peroxisome)의 수를 증가시킬 수 있는 화합물인 과산화소체 증식체를 리간드로 하는 핵내 수용체를 말하며, 리간드에 활성화되고, PPAR 반응요소(PPRE)에 결합하여 표적유전자의 발현을 증가시키는데, PPARα, PPARβ, PPARγ, PPARδ의 동형체가 알려져 있다[Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 431, 1996]. The peroxisome proliferator-activated receptor is a nuclear receptor that is a ligand of peroxisome proliferator, which is a compound capable of increasing the number of peroxisomes. It is activated in the ligand, and the PPAR response element PPRE) to increase the expression of the target gene, and the homozygous forms of PPAR [alpha], PPAR [beta], PPAR [gamma] and PPAR [delta] are known [Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 431, 1996].
PPAR은 주로 지방대사에 관여하는 유전자 또는 지방세포(asipocyte)의 분화에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는데, 이중 PPARγ는 지방세포, 면역세포, 부신, 비장 및 소장에서 주로 발현되며, 지방세포 분화의 주요 전사인자로 알려져 있다. 상기와 같이 PPAR이 지방대사에 중요한 역할을 하기 때문에 PPAR을 대상으로 하는 대사질환의 치료제를 개발하기 위한 많은 연구들이 진행되고 있다. 미국특허 제6,939,875호는 PPAR에 매개된 질병을 치료하는데 사용할 수 있는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물이 제2형 당뇨, 비만, 섭식장애, 대사증후군 등에 효과를 나타낸다고 기재되어 있으며, 미국특허 제6,967,212호에서는 PPAR 아고니스트로 작용하는 아졸산 유도체를 포함하는 조성물이 인슐린저항증, 비만, 고지혈증, 대사이상증후군 등에 효과를 나타낸다고 기재되어 있다. 그러나 상기와 같이 PPAR 리간드를 이용하는 방법은 간독성, 저혈당 증상을 비롯한 여러 가지 부작용을 동반하기 때문에 리간드를 사용하지 않고서도 PPARγ를 조절할 수 있는 새로운 방법이 요구되고 있다.PPARs mainly regulate the expression of genes involved in the differentiation of genes or fatty cells (asipocyte) involved in fat metabolism. PPARγ is mainly expressed in adipocytes, immune cells, adrenals, spleen, and small intestine. It is known as a major transcription factor. As described above, since PPAR plays an important role in lipid metabolism, many studies are being conducted to develop a therapeutic agent for metabolic diseases targeting PPAR. U.S. Patent No. 6,939,875 relates to a composition that can be used to treat a PPAR mediated disease wherein said composition is said to be effective in
갈렉틴(galectins)은 일반적으로 갈락토오스에 결합성을 갖는 티올 요구성 렉틴으로, 선충, 해면동물 포유류 등의 동물 조직에서 조직 특이적 발현 단백질로 발견되고 있다. 갈렉틴은 현재까지 9 종류가 밝혀져 있는데, 갈렉틴 -1, -3, -8은 생체 내의 여러 장기에 분포하고 있는 반면, 갈렉틴 -2, -4, -5, -7은 특정장기 또는 세포에 한정되어 있는 것으로 알려져 있다. Galectins are thiol-binding lectins that are generally galactose-binding, and have been found to be tissue-specific expression proteins in animal tissues such as nematodes and sponge mammals. Galectin-1, -3, and -8 are distributed in various organs in vivo, whereas Galectin-2, -4, -5, and -7 are specific organ or cell Are known to be limited.
갈렉틴-3에 대한 대부분의 연구들은 암 및 염증성 질환에 초점을 맞춰 연구되어 왔으며, 비만에서의 갈렉틴-3에 대한 역할을 제대로 연구된바 없다. Pang J 등은 갈렉틴-3이 넉아웃된 마우스에서 비만 전신염증 및 비정상적인 포도당 대사가 증가하였으며, 내장질량, 혈당 및 인슐린 수준을 증가시켰다고 보고한바 있다[PolS one, 2013; 8(2): e57915].
Most studies on galectin-3 have been focused on cancer and inflammatory diseases, and the role of galectin-3 in obesity has not been well studied. Pang J et al. Reported that obesity systemic inflammation and abnormal glucose metabolism were increased in galectin-3 knockout mice, and increased intestinal mass, blood glucose and insulin levels [PolS one, 2013; 8 (2): e57915].
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하는 과산화소체 증식체 활성화 수용체-감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)의 전사활성 또는 발현 조절용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, a problem to be solved by the present invention is to provide a composition for regulating transcription activity or expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) comprising galectin-3 as an active ingredient.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 갈렉틴-3을 제거 또는 발현을 억제함으로써 과산화소체 증식체 활성화 수용체-감마의 활성 또는 발현을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
Another object to be solved by the present invention is to provide a method for reducing the activity or expression of peroxisome proliferator activated receptor-gamma by inhibiting or eliminating galectin-3.
본 발명은 상기한 문제를 해결하기 위하여, 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하는 과산화소체 증식체 활성화 수용체 감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma; PPARγ)의 활성 또는 발현 조절용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for controlling the activity or expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) comprising galectin-3 as an active ingredient.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 갈렉틴-3은 과산화소체 증식체 활성화 수용체 감마에 작용하여 전사활성 또는 발현량을 증가시키는 것일 수 있으며, According to an embodiment of the present invention, the galectin-3 may act on the peroxidase proliferator-activated receptor gamma to increase transcription activity or expression level,
바람직하게는 상기 갈렉틴-3이 과산화소체 증식체 활성화 수용체 감마와 결합하여 과산화소체 증식체 활성화 수용체 감마의 활성 또는 발현을 증가시키는 것일 수 있다. Preferably, the galectin-3 binds to peroxidase proliferator-activated receptor gamma to increase the activity or expression of peroxisome proliferator activated receptor gamma.
또한, 본 발명은 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 조절용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for controlling adipocyte differentiation comprising galectin-3 as an active ingredient.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 갈렉틴-3은 지방세포 분화를 유도할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, galectin-3 may induce adipocyte differentiation.
또한, 본 발명은 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하는 중성지방 분해효소(adipose triglyceride lipase; ATGL) 발현 억제용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for inhibiting the expression of adipose triglyceride lipase (ATGL) comprising galectin-3 as an active ingredient.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 갈렉틴-3은 지방간 생성유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the galectin-3 may be one that increases the expression of a fatty liver producing gene.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 지방간 생성유전자는 과산화소체 증식체 활성화 수용체 감마(PPARγ), ccaat-enhancer-binding protein alpha(C/EBPα), fatty acid binding protein(FABP4) 및 fatty acid synthase(FAS) 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the fatty liver gene is selected from the group consisting of peroxidase proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), ccaat-enhancer-binding protein alpha (C / EBPα), fatty acid binding protein (FABP4) FAS). ≪ / RTI >
또한, 본 발명은 갈렉틴-3을 넉아웃(Knockout) 시킴으로써 갈렉틴-3을 제거 또는 발현을 억제하여 과산화소체 증식체 활성화 수용체 감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma; PPARγ)의 활성 또는 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for inhibiting the expression or elimination of galectin-3 by knocking galectin-3, thereby reducing the activity or expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) .
또한, 본 발명은 갈렉틴-3을 넉아웃(Knockout) 시킴으로써 지방간 생성 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for reducing the expression of a fatty liver producing gene by knocking galectin-3.
또한, 본 발명은 갈렉틴-3을 넉아웃(Knockout) 시킴으로써 중성지방 분해효소(adipose triglyceride lipase; ATGL)의 발현을 증가시키는 단계;를 포함하는 지방세포 크기 감소 방법을 제공한다.
Also, the present invention provides a method for reducing fat cell size comprising knocking galactin-3 to increase the expression of adipose triglyceride lipase (ATGL).
본 발명은 갈렉틴-3의 이용하여 지방세포 분화 지표로 알려진 전사 유전자인 과산화소체 증식체 활성화 수용체-감마 유전자의 활성 또는 발현을 조절함으로서, 과산화소체 증식체 활성화 수용체-감마의 부족 또는 과다 발현에 의해 유발되는 질병, 예를 들어 대사성 질병 등의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.
The present invention relates to a method of regulating the activity or expression of a peroxidase proliferating receptor-gamma gene, which is a transcriptional gene known as an adipocyte differentiation index, by using galectin-3, For example, metabolic diseases, and the like.
도 1은 고지방 식이를 섭취한 17개월령의 갈렉틴 넉아웃(lgals3-/-) 마우스 및 야생형(lgals3+/+) 마우스의 백색 지방조직 감소 효과를 측정한 결과로,
도 1a는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 몸 크기를 측정한 이미지 및 체중을 나타낸 그래프이다.
도 1b는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 부고환 백색 지방 조직(eWAT)의 크기를 비교한 이미지 및 무게를 나타낸 그래프이다.
도 1c는 각각 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 체중 당 부고환 백색 지방 조직(eWAT)의 중량, 갈색 지방 조직(BAT)의 중량 및 간(Liver) 중량을 비교한 그래프이다.
도 1d 는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 부고환 백색 지방 조직(eWAT)의 Galectin-3, peroxisome proliferator-activated receptor gamma(이하, 'PPARγ'라 한다), ccaat-enhancer-binding protein alpha(이하, 'C/EBPα'라 한다), fatty acid binding protein(이하, 'FABP4'라 한다) 및 fatty acid synthase(이하, 'FAS'라 한다)의 발현양을 실시간 RT-PCT로 분석한 결과이다.
도 1e는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 부고환 백색 지방 조직(eWAT)의 IL-10, INFγ 및 TNFα의 발현양을 실시간 RT-PCT로 분석한 결과이다.
도 1f는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 간에서 Galectin-3, PPARγ, C/EBPα, FABP4 및 FAS의 발현량을 실시간 RT-PCT로 분석한 결과이다.
도 1g는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 간에서 IL-10, INFγ 및 TNFα의 발현양을 실시간 RT-PCT로 분석한 결과이다.
mRNA의 발현은 β-actin으로 정규화하였고, 모든 데이터는 평균 ± s.e.로 표시하였다(독립표본 t 검정). 실험 개체수는 각각 5마리(n=5)를 이용하였다.
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 2는 고지방 식이를 섭취한 17개월령의 갈렉틴 넉아웃(lgals3-/-) 마우스 및 야생형(lgals3+/+) 마우스의 배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts; 이하, 'MEFs'라 한다)의 지방세포 분화 지연 경향을 측정한 결과로,
도 2a 및 2b는 각각 DMI 및 로시글리타존으로 처리한 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스 MEFs의 지방세포 분화를 나타낸 결과이다.
MEFs는 각각 DMI 및 로시글리타존으로 14일 동안 처리하였으며, 지방세포는 오일-레드-O로 염색하였다.
도 2c는 지질 축적량을 측정한 결과이다.
도 2d는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스 MEFs에서 지방생성 인자(Galectin-3, PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ 및 FABP4)의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 결과이다.
지방 생성인자의 단백질 발현은 β-actin으로 정규화하였고, 모든 데이터는 평균 ± s.e.로 표시하였다(독립표본 t 검정).
도 3은 갈렉틴-3이 결핍된 3T3-L1 세포의 지방 세포 분화 저해 특성을 확인한 결과이다.
도 3a는 지방세포 분화 중의 갈렉틴-3의 mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 3b는 지방세포 분화 중의 갈렉틴-3 단백질의 수준을 측정한 결과이다.
도 3c는 갈렉틴-3을 발현되지 않도록 갈렉틴-3 shRNA 렌티바이러스에 감염지키고 퓨로마이신으로 처리한 3T3-L1 세포의 결과이며, 도 3d는 이를 이용하여 지방세포를 분화시킨 결과이다. 세포는 분화 8일 후, DMI로 처리하고, 오일-레드-O로 염색하여 관찰하였다
도 3e는 지질 축정량을 측정한 결과이다.
도 3f는 지방생성 인자(Galectin-3, PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ 및 FABP4)의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 결과이다.
지방 생성인자의 단백질 발현은 β-actin으로 정규화하였고, 모든 데이터는 평균 ± s.e.로 표시하였다(독립표본 t 검정).
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 4는 갈렉틴-3과 PPARγ의 상호작용 및 전사활성 증가 효과를 확인한 결과로,
도 4a는 FLAG-표지된 갈렉틴과 HA-표지된 PPARγ을 이용하여 HEK293 세포를 형질전환한 결과로, 세포 용해물은 항-PLAG 비드를 사용하여 면역 침강시켰다.
도 4b는 갈렉틴-3과 PPARγ 사이의 내인적 상호작용을 확인한 결과이다.
도 4c는 HEK293 세포에서 PPRE 루시퍼라제 활성을 나타낸 결과이다. HEK293 세포는 sh-galectin-3, PPRE, 및 β-gal을 이용하여 형질전환 후, 20 μM 로시글리타존으로 처리하였다. 루시퍼라제 활성은 β-gal 활성으로 정규화하였다.
도 4d는 갈렉틴-3이 발현되지 않도록 처리한 3T3-L1 세포에서 갈렉틴-3 및 PPARγ의 면역세포화학 결과이다.
모든 데이터는 평균 ± s.e.로 표시하였다(독립표본 t 검정).
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 5는 고지방 식이에 대한 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 비만 저항을 나타낸 결과로,
도 5a는 12주간 60%의 지방이 함유된 고지방 식이를 공급받은 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5b는 하루에 섭취된 평균 식사량을 나타낸 그래프이다.
도 5c는 각각 고지방 식이를 섭취한 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 eWAT 무게, 체중당 eWAT의 중량, 갈색 지방 중량 및 간 중량을 나타낸 결과이다.
도 5d는 각각 고지방 식이를 섭취한 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 5시간 금식 후에 측정한 혈당량(Blood glucose level) 및 혈장 유리 지방산(plasma-free fatty acids) 농도를 나타낸 결과이다.
모든 데이터는 평균 ± s.e.로 표시하였다(독립표본 t 검정).
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 6은 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스의 eWAT를 통해 갈렉틴-3 넉 아웃 마우스의 비만 및 ATGL 발현 조절 효과를 측정한 결과로,
도 6a는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스 eWAT의 지방세포 크기를 비교한 이미지이다.
도 6b는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스 eWAT의 중성지방 함량을 측정한 결과이다.
도 6c는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스 eWAT의 갈렉틴-3 및 ATGL의 발현량을 실시간 RT-PCR로 측정한 결과이다.
도 6d는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스 간 조직의 PPARγ, C/EBPα, FABP4, FAS, Me1, Acaa, Acyl 및 Slc25a1에 대한 마이크로 어레이 분석 결과이다.
도 6e는 lgals3-/- 마우스 및 lgals3+/+ 마우스 간 조직의 갈렉틴-3, PPARγ, C/EBPα, FABP4 및 FAS의 유전자를 실시간 RT-PCR로 분석한 결과이다.
지방 생성인자의 단백질 발현은 β-actin으로 정규화하였고, 모든 데이터는 평균 ± s.e.로 표시하였다(독립표본 t 검정).
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.FIG. 1 shows the results of measuring the white adipose tissue reducing effect of galectin knockout (lgals3 - / - ) mice and wild type (lgals3 + / + ) mice at 17 months of age consuming high fat diets,
FIG. 1A is a graph showing an image and body weight of a body size of an Igal3 - / - mouse and an Igal3 + / + mouse.
FIG. 1B is a graph showing images and weights comparing sizes of epididymal white adipose tissue (eWAT) of Igal3 - / - mice and Igal3 + / + mice.
FIG. 1C is a graph comparing the weight of epididymal white adipose tissue (eWAT), the weight of brown adipose tissue (BAT), and the liver weight of each of lgals3 - / - and lgals3 + / + mice.
Figure 1d is lgals3 - / - mice and lgals3 + / + Galectin-3, in the epididymal white adipose tissue (eWAT) of mouse peroxisome proliferator-activated receptor gamma (hereinafter, 'PPARγ' referred to), ccaat-enhancer-binding protein alpha (Hereinafter referred to as 'C / EBP alpha'), fatty acid binding protein (hereinafter referred to as 'FABP4') and fatty acid synthase to be.
FIG. 1E shows the results of real-time RT-PCT analysis of expression amounts of IL-10, INFγ and TNFα in epididymal white adipose tissue (eWAT) of Igal3 - / - mice and Igal3 + / + mice.
FIG. 1F shows the results of real-time RT-PCT analysis of the expression levels of Galectin-3, PPARγ, C / EBPα, FABP4 and FAS in lgals3 - / - mice and lgals3 + / + mice.
FIG. 1g shows the results of real-time RT-PCT analysis of the expression levels of IL-10, INFγ and TNFα in the liver of lgals3 - / - and lgals3 + / + mice.
Expression of mRNA was normalized to β-actin and all data were expressed as mean ± SE (independent sample t-test). The number of experimental animals was 5 (n = 5).
* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
FIG. 2 is a graphical representation of the fat content of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) of galectin knockout mice (lgals3 - / - ) and wild type (lgals3 + / + ) mice at 17 months of age fed a high fat diet As a result of measuring the delayed cell differentiation,
Figures 2a and 2b show the adipocyte differentiation of lgals3 - / - and lgals3 + / + mouse MEFs treated with DMI and rosiglitazone, respectively.
MEFs were treated with DMI and rosiglitazone for 14 days, respectively, and fat cells were stained with oil-red-O.
FIG. 2C is a result of measurement of lipid accumulation amount.
FIG. 2d shows Western blot analysis of lipogenic factors (Galectin-3, PPARγ, C / EBPα, C / EBPβ and FABP4) in Igal3 - / - and Igal3 + / + mouse MEFs.
Protein expression of fat-producing factors was normalized to β-actin and all data were expressed as mean ± SE (independent sample t-test).
FIG. 3 shows the results of confirming the inhibition of adipocyte differentiation by galectin-3-deficient 3T3-L1 cells.
FIG. 3A shows the results of measuring the expression level of galectin-3 mRNA in adipocyte differentiation.
FIG. 3B shows the results of measuring the level of galectin-3 protein in adipocyte differentiation.
FIG. 3c shows the results of 3T3-L1 cells treated with puromycin and galectin-3 shRNA lentivirus so as not to express galectin-3, and FIG. 3d shows the result of differentiating adipocytes using the same. Cells were treated with
3E is a result of measurement of the amount of lipid axes.
Figure 3f shows results of western blot analysis of adipogenic factors (Galectin-3, PPARgamma, C / EBPa, C / EBP [beta] and FABP4).
Protein expression of fat-producing factors was normalized to β-actin and all data were expressed as mean ± SE (independent sample t-test).
* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
FIG. 4 shows the results of confirming the interaction between galectin-3 and PPAR gamma and the increase of transcriptional activity,
Figure 4A shows that cell lysates were immunoprecipitated using anti-PLAG beads as a result of transformation of HEK293 cells with FLAG-labeled galectin and HA-labeled PPARy.
FIG. 4B shows the result of confirming endogenous interactions between galectin-3 and PPARγ.
4C shows the results of PPRE luciferase activity in HEK293 cells. HEK293 cells were transformed with sh-galectin-3, PPRE, and β-gal and treated with 20 μM rosiglitazone. Luciferase activity was normalized to? -Gal activity.
FIG. 4d shows immunocytochemical results of galectin-3 and PPARγ in 3T3-L1 cells treated to inhibit galectin-3 expression.
All data were expressed as mean ± SE (independent sample t-test).
* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
FIG. 5 shows the results of obesity resistance of lgals3 - / - mice and lgals3 + / + mice on high fat diet,
FIG. 5A is a graph showing changes in body weight of lgals3 - / - mice and lgals3 + / + mice fed high fat diets containing 60% fat for 12 weeks.
5B is a graph showing an average food intake per day.
FIG. 5c shows eWAT weight, weight of eWAT, weight of brown fat, and liver weight of lgals3 - / - mice and lgals3 + / + mice consuming high fat diets, respectively.
FIG. 5d shows blood glucose levels and plasma-free fatty acids concentrations measured after fasting for 5 hours in Igal3 - / - mice and Igal3 + / + mice, respectively, which were fed a high fat diet.
All data were expressed as mean ± SE (independent sample t-test).
* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
FIG. 6 shows the effect of galectin-3 knockout mice on the regulation of obesity and ATGL expression through eWAT of lgals3 - / - and lgals3 + / + mice,
Figure 6a is an image comparing the fat cell size of Igal3 - / - mouse and Igal3 + / + mouse eWAT.
FIG. 6B shows the result of measuring the triglyceride content of IgAL3 - / - mouse and IgAL3 + / + mouse eWAT.
FIG. 6C shows the results of real-time RT-PCR measurement of expression levels of galectin-3 and ATGL in IgAL3 - / - mouse and IgAL3 + / + mouse eWAT.
FIG. 6d shows microarray analysis results for PPARγ, C / EBPα, FABP4, FAS, Me1, Acaa, Acyl and Slc25a1 of Igal3 - / - and Igal3 + / + mouse liver tissues.
FIG. 6E shows the results of real-time RT-PCR analysis of galectin-3, PPARγ, C / EBPα, FABP4 and FAS genes of Igal3 - / - mouse and Igal3 + / + mouse liver tissues.
Protein expression of fat-producing factors was normalized to β-actin and all data were expressed as mean ± SE (independent sample t-test).
* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
PPAR은 주로 지방대사에 관여하는 유전자 또는 지방세포(adipocyte)의 분화에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는데, 이중 PPARγ는 지방세포, 면역세포, 부신, 비장 및 소장에서 주로 발현되며, 지방세포 분화의 주요 전사인자로 알려져 있다. 본 발명이 발명자들은 생체분자인 갈렉틴-3이 PPARγ과 결합하여 PPARγ을 직접적으로 활성화시키고, 지방세포로의 분화를 리드하는 것을 밝혀냄으로써 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하여 PPARγ의 활성 또는 발현을 조절하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.PPARs mainly regulate the expression of genes involved in the differentiation of adipocytes or adipocytes involved in lipid metabolism. PPARγ is mainly expressed in adipocytes, immune cells, adrenals, spleen and small intestine, and adipocyte differentiation It is known as a major transcription factor. The inventors of the present invention found that galectin-3, which is a biomolecule, binds to PPARγ to directly activate PPARγ and leads to differentiation into adipocytes. Thus, the present inventors have found that galectin-3 is effective as an active ingredient, And the present invention has been completed.
구체적으로, 본 발명은 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하는 PPARγ 활성 또는 발현 조절용 조성물을 제공한다.Specifically, the present invention provides a composition for regulating PPARgamma activity or expression comprising Galectin-3 as an active ingredient.
본 발명에 의하면, 상기 갈렉틴-3은 PPARγ에 작용하여 PPARγ의 활성 또는 발현량을 증가시킬 수 있는데, According to the present invention, galectin-3 acts on PPARγ to increase the activity or expression level of PPARγ,
구체적으로 갈렉틴-3이 PPARγ와 내인적 및 외인적으로 직접적 상호작용 또는 결합하여 PPARγ의 활성 또는 발현량을 증가시킬 수 있다. Specifically, galectin-3 can directly or intrinsically and externally directly interact with or bind to PPARγ to increase the activity or expression level of PPARγ.
본 발명에 의하면, 갈렉틴-3이 제거된 환경에서는 PPARγ의 아고니스트인 로시글리타존의 존재 유무와 상관없이 PPARγ의 전사활성이 감소되었다. 이는 갈렉틴-3이 PPARγ에 직접적으로 결합하여 PPARγ를 활성 또는 발현시키는 것을 의미한다. 이러한 특징을 통해 본 발명의 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하는 PPARγ의 활성 또는 발현 조절용 조성물은 PPARγ의 발현에 의해 유발되는 대사성 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 이용될 수 있다. According to the present invention, the transcriptional activity of PPARγ was reduced in the absence of galectin-3 regardless of the presence or absence of rosiglitazone, an agonist of PPARγ. This means that galectin-3 binds directly to PPARy to activate or express PPARy. With these characteristics, the composition for controlling the activity or expression of PPARy comprising gallontin-3 as an active ingredient of the present invention can be effectively used for the treatment or prevention of metabolic diseases caused by the expression of PPARy.
상기 대사성 질환으로는 예를 들어, 비만, 당뇨, 고지혈증 및 비알콜성 지방간 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.The metabolic diseases may include, for example, at least one selected from obesity, diabetes, hyperlipidemia and non-alcoholic fatty liver.
또한, 본 발명에 의하면, 상기 갈렉틴-3은 염증반응에 관여하지 않는 것을 특징으로 한다. 다시 말해, 본 발명에 의하면 갈렉틴-3이 제거 또는 과다 발현된 환경과 염증반응은 서로 무관하며, 비만 등의 대사성 질환의 유발은 염증 반응 또는 고혈당증에 의한 것이 아닌, 갈렉틴-3과 결합하여 활성화된 PPARγ에 의한 지방세포분화에 의해 유발된 것일 수 있다. In addition, according to the present invention, galectin-3 is characterized in that it does not participate in an inflammatory reaction. In other words, according to the present invention, the galectin-3-deleted or overexpressed environment and the inflammatory reaction are independent of each other, and the induction of a metabolic disease such as obesity is not caused by an inflammatory reaction or hyperglycemia, And may be induced by adipocyte differentiation by activated PPARy.
본 발명에 의하면, 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하는 조성물은 지방세포 분화 조절에 이용될 수 있다. 구체적으로 갈렉틴-3은 지방세포 분화를 유도시킬 수 있다. 즉, 갈렉틴-3의 제거 또는 발현이 억제된 환경에서는 지방세포 분화를 억제 또는 지연시킬 수 있 수 있으므로, 이를 이용하여 지방세포 과다 분화에 의해 유발되는 질병, 예를들어 대사성 질환 등의 예방 또는 치료에 응용할 수 있다. According to the present invention, a composition comprising galectin-3 as an active ingredient can be used for controlling adipocyte differentiation. Specifically galectin-3 may induce adipocyte differentiation. In other words, it is possible to inhibit or delay adipocyte differentiation in an environment in which the removal or expression of galectin-3 is inhibited. Therefore, it is possible to prevent or delay diseases caused by adipocyte differentiation, for example, metabolic diseases or the like It can be applied to therapy.
또한, 본 발명에 의하면, 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하는 조성물은 중성지방 분해효소(adipose triglyceride lipase; ATGL) 발현을 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 중성지방 분해효소는 중성지방 가수분해 단계에서 중성지방의 가수분해 속도를 촉매하는 효소로서, ATGL이 없는 경우 여러 생체조직에서 중성지방과 백색지방조직이 증가될 수 있다. 본 발명에 의하면, 갈렉틴-3의 제거 또는 발현을 억제함으로써 ATGL를 증가시킬 수 있으며, ATGL는 중성지방을 가수분해할 수 있어, 이를 통해 체내 중성지방을 감소시킬 수 있다. In addition, according to the present invention, a composition comprising galectin-3 as an active ingredient can inhibit the expression of adipose triglyceride lipase (ATGL). Specifically, the triglycerolase catalyzes the hydrolysis rate of triglyceride in the step of hydrolyzing the triglyceride. In the absence of ATGL, the triglyceride and white adipose tissue may be increased in various tissues. According to the present invention, ATGL can be increased by suppressing the elimination or expression of galectin-3, and ATGL can hydrolyze the triglyceride, thereby reducing the triglyceride in the body.
또한, 본 발명에 의하면, 상기 중성지방 분해효소는 지방세포의 크기를 감소시킬 수 있으므로, 상기 갈렉틴-3을 제거 또는 발현을 억제함으로써 지방세포의 세포 크기가 커지는 것을 방지할 수 있다. In addition, according to the present invention, the triglycerolytic enzyme can reduce the size of adipocytes, thereby preventing the increase in the cell size of adipocytes by suppressing the elimination or expression of galectin-3.
본 발명에 의하면, 갈렉틴-3을 유효성분으로 포함하는 조성물은 지방간 생성 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 갈렉틴-3을 제거 또는 갈렉틴-3의 발현을 억제함으로써, 지방간을 유발시키는 유전자인 PPARγ, C/EBPα, FABP4 및 FAS의 유전자의 발현을 억제하여 지방간을 생성을 감소시킬 수 있다.
According to the present invention, a composition comprising galectin-3 as an active ingredient can control the expression of a fatty liver producing gene. 3 can be eliminated or expression of galectin-3 can be inhibited, thereby suppressing the expression of the genes of PPARγ, C / EBPα, FABP4 and FAS, which are genes that induce fatty liver, thereby reducing the production of fatty liver.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention as defined by the appended claims. It will be obvious to you.
실시예Example
마우스 및 식이 Mouse and Diet
갈렉틴-3 야생형 대립 유전자(homozygous +/+) 또는 갈렉틴-3 녹아웃 대립유전자(homozygous -/-)를 가지는 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스는 Dr. FT Liu(UC Davis)에 의해 제공받았다. 야생형 및 갈렉틴-3 결핍 마우스는 집 및 C57BL/6 유전적 백그라운드를 유지하여 분리사육하였다. 6주령의 야생형 수컷(lgals3+/+) 및 갈렉틴-3-결핍(lgals3-/-) 마우스는 같은 방에서 1일 12시간 암/12시간 음 조건을 유지하면서 12주 동안 60% 지방이 함유된 고지방 식이를 제공하였다. 상기 실험은 암컷 lgals3+/+ 및 lgals3-/- 마우스를 대상으로도 독립적으로 수행하였다. 연구는 한배 새끼가 아닌 동일 주령의 마우스를 사용하였다. 체중 및 음식물 섭취량은 일주일에 한 번씩 측정하였다. 실험에 사용된 마우스의 조직은 액체질소를 이용하여 동결시키고 - 80℃에 저장 보관한 뒤, 분석에 이용하였다.
Male and female C57BL / 6 mice with galectin-3 wild-type allele (homozygous + / +) or galectin-3 knockout allele (homozygous - / - FT Liu (UC Davis). Wild and galectin-3 deficient mice were housed and maintained in a C57BL / 6 genetic background. Six weeks old wild-type males (lgals3 + / + ) and galectin-3-deficient (lgals3 - / - ) mice received 60% fat for 12 weeks while maintaining 12 h / High-fat diet. The experiments were performed independently on female lgals3 + / + and lgals3 - / - mice. The same age group mice were used in the study. Body weight and food intake were measured once a week. The tissues of the mice used in the experiment were frozen using liquid nitrogen, stored at -80 ° C and used for analysis.
세포 배양 및 지방세포 분화 분석Cell culture and adipocyte differentiation analysis
HEK293 세포는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 구입하여 배양하였다. 이형접합체(lgals3+/-) 암컷 및 수컷 N6 마우스는 lgals3+/+ 및 gals3-/- 마우스를 생산하기 위하여 교차하였다. 3T3-L1 세포는 융합상태로 성장시키고, 분화는 10% FBS, 인슐린(5 g/ml), 이소부틸메틸잔탄(520 M) 및 dexamethasone(1 M) 이 함유된 고농도 포도당 DMEM을 이용하여 2일 후 유도하였다. 배지는 10% FBS 및 인슐린을 함유하는 고농도 포도당 DMEM로 2일마다 교체하였으며, 8일째까지 교체하였다. MEF 분화는 10% FBS, 인슐린(10 g/ml), 이소부틸메틸잔탄(520 M), dexamethasone(1 M) 및 로지글리타존(1 M)을 함유하는 고농도 포도당 DMEM을 이용하여 유도하였다. MEF 배지는 10% FBS, 인슐린(10 g/ml) 및 로지글리타존(1 M)을 함유하는 고농도 포도당 DMEM로 각 2일 마다 교체하였으며, 14일째까지 교체하였다. 지질 축적은 오일-레드-O 염색시약(O0625, Sigma-Aldrich)을 사용하여 검출하였다.
HEK293 cells were purchased from Korean Cell Line Bank (KCLB) and cultured. Heterozygous (lgals3 +/- ) female and male N6 mice crossed to produce lgals3 + / + and gals3 - / - mice. 3T3-L1 cells were grown in fusion state and differentiation was induced by high glucose DMEM containing 10% FBS, insulin (5 g / ml), isobutyl methyl xanthate (520 M) and dexamethasone Respectively. The medium was replaced every 2 days with high glucose DMEM containing 10% FBS and insulin, and replaced until
갈렉틴Galectin -3이 안정적으로 -3 is stable 넉다운된Knocked down 3 3 T3T3 -- L1L1 세포의 생성 Cell formation
Galectin-3 shRNA 렌티바이러스 운반체는 시그마-알드리치로 부터 구입하였으며, Galectin-3 shRNA 렌티바이러스는 Kim의 방법으로 제조하였다(J. Control Release 2011; 21(4) 594-603). 구체적으로, HEK293FT 세포를 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하는 렌티 바이러스 및 패키징 운반자를 이용하여 세포를 감염시켰다. 48 시간 후, 렌티바이어스를 포함하는 배지를 0.45-㎛ 실린지 필터를 이용하여 여과하였다. 렌티바이러스는 50% 융합 지방전구세포 3T3-L1에 형질도입하였다. 렌티바이러스에 감염된 3T3-L1 세포는 퓨로마이신(2 g/ml)에 의해 선택되었다.
Galectin-3 shRNA lentivirus carriers were purchased from Sigma-Aldrich and Galectin-3 shRNA lentiviruses were prepared by the method of Kim (J. Control Release 2011; 21 (4) 594-603). Specifically, HEK293FT cells were infected with lentivirus and packaging carriers using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 48 hours, the medium containing the lentivirus was filtered using a 0.45-μm syringe filter. Lentivirus was transfected into 50% confluent adipose precursor cells 3T3-L1. 3T3-L1 cells infected with lentivirus were selected by puromycin (2 g / ml).
웨스턴블롯Western blot 분석 analysis
균체 파쇄 추출은 RIPA 완충액(1% Triton X-100, 1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5 및 2 mM EDTA pH 8.0)과 프로테아제 억제제 칵테일(Genedepot)에 용해하였다. 용해물을 4 ℃에서 20분 동안 배양하고, 4 ℃에서 25분간 13,200 rpm으로 원심분리하였다. 상청액의 농도는 Quibit 2.0 fluorometer(Invitrogen)로 측정하였다. 단백질은 SDS PAGE 겔에 로딩한 후, PVDF 막(GE Healthcare)으로 옮겼다. 이어, 5% 탈지유로 블록킹하였다. 멤브레인은 4 ℃의 로타(rotor)에서 하룻밤 동안 1차 항체(Galectin-3, C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ, AFABP, HA (Santa Cruz), and Flag (Sigma-Aldrich))를 사용하여 배양하였다. 이어, 멤브레인을 PBTS로 세척한 뒤, HRP 접합된 2차 항체(Santa Cruz)로 배양하였다. 이어, 제조사의 지시에 따라 LAS-300(Fujifilm) 검출기를 이용하여 화상 검출하였다. 정규화 제어는 안티-β-액틴(Santa-Cruz)를 사용하였다.
Cell lysate extracts were dissolved in RIPA buffer (1% Triton X-100, 1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5 and 2 mM EDTA pH 8.0) and protease inhibitor cocktail (Genedepot) Respectively. The lysates were incubated at 4 ° C for 20 minutes and centrifuged at 13,200 rpm for 25 minutes at 4 ° C. The concentration of the supernatant was measured with a Quibit 2.0 fluorometer (Invitrogen). Proteins were loaded onto SDS PAGE gels and then transferred to PVDF membranes (GE Healthcare). Followed by blocking with 5% skim milk. Membranes were incubated overnight at 4 ° C on a rotator using primary antibodies (Galectin-3, C / EBPα, C / EBPβ, PPARγ, AFABP, HA (Santa Cruz), and Flag (Sigma-Aldrich) Respectively. Then, the membrane was washed with PBTS and then cultured with HRP-conjugated secondary antibody (Santa Cruz). Next, images were detected using a LAS-300 (Fujifilm) detector according to the manufacturer's instructions. Anti-beta-actin (Santa-Cruz) was used for the normalization control.
면역침강법Immune sedimentation
균체 파쇄 추출은 IP버퍼 및 프로테아제 억제제 칵테일(Genedepot)을 사용하여 수행하였다. 원심분리(4 ℃에서 25분간 13,200 rpm)한 후, 상측액의 단백질을 A/G 아가로스 비드(Santa Cruz)에 첨가하고, 로타에서 4 ℃에서 30분간 배양하였다. 원심분리 후, anti-Flag beads (Sigma-Aldrich), antigalectin-3, anti-PPAR 및 노말 lgG(음성대조군)을 각각 독립적으로 상층액에 첨가하고, 4 ℃의 로타에서 하룻밤동안 배양하였다. 면역 침강법은 IP 버버로 두번 세척한 뒤, 2X SDS 샘플 버버를 첨가하고, 95 ℃에서 5분간 끓였다. 원심분리(4 ℃에서 25분간 13,200 rpm)한 후, 상등액을 웨스턴 블롯 분석하였다.
Cell disruption extraction was performed using IP buffer and protease inhibitor cocktail (Genedepot). After centrifugation (13,200 rpm at 4 DEG C for 25 minutes), the protein in the supernatant was added to A / G agarose beads (Santa Cruz) and cultured in rotors at 4 DEG C for 30 minutes. After centrifugation, anti-Flag beads (Sigma-Aldrich), antigalectin-3, anti-PPAR and normal IgG (negative control) were separately added to the supernatant and cultured overnight at 4 ° C. Immunoprecipitation was performed twice with IP buffer, followed by addition of 2X SDS sample buffer and boiling at 95 ° C for 5 minutes. After centrifugation (13,200 rpm for 25 minutes at 4 DEG C), the supernatant was subjected to Western blot analysis.
루시페라제Luciferase 리포터 분석 Reporter Analysis
PPRE-TK-Luc, shgalectin-3 및 β-gal은 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용한 HEK293세포를 이용하여 형질감염시켰다. 48 시간 후 세포를 수확하였고, 루시퍼라제 활성은 루시페라제 에세이 분석 시스템(Promega)를 이용하여 측정하였다. 루시페라제 활성은 β-gal 효소 분석 시스템(Promega)을 사용하여 정규화하였다.
PPRE-TK-Luc, shgalectin-3 and? -Gal were transfected with HEK293 cells using lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 48 hours, the cells were harvested and the luciferase activity was measured using the luciferase assay system (Promega). Luciferase activity was normalized using a beta-gal enzyme assay system (Promega).
면역세포화학Immune cell chemistry
챔버 슬라이스의 세포는 4 ℃에서 30분간 4% 포름알데하이드를 이용하여 고정시킨 뒤 1X PBS 버퍼를 사용하여 세척하고, 10분 동안 0.5% Triton X-100을 사용하여 투과하였다. 세포는 4 ℃에서 1차 항체(galectin-3 및 PPARγ)와 함께 배양하였고, FITC 항마우스 및 cy5 항토끼 2차 항체(Invitrogen)와 DAPI 염색용액(Vector Laboratories)을 사용하여 배양하였다. 이미지는 공초점 현미경(LSM 700)으로 분석하였다.
The cells of the chamber slices were fixed with 4% formaldehyde for 30 minutes at 4 ° C, washed with 1X PBS buffer, and permeabilized with 0.5% Triton X-100 for 10 minutes. Cells were incubated with primary antibodies (galectin-3 and PPARγ) at 4 ° C and cultured with FITC anti-mouse and cy5 anti-rabbit secondary antibody (Invitrogen) and DAPI staining solution (Vector Laboratories). Images were analyzed by confocal microscopy (LSM 700).
RNARNA 분리 및 실시간 Detach and Real Time RTRT -- PCRPCR 분석 analysis
모든 조직 RNA는 RNA-분해 시약(5PRIME)를 사용하여 제조하였다. cDNA (1g)은 qPCR RT 마스터 믹스(TOYOBO)를 이용하여 RNA로부터 합성하였다. 다음의 프라이머를 사용하였다: Galectin-3-F 5'-cagtgctcctggaggctatc-3', R 5'-attgaagcgggggttaaagt-3'; PPARγ-F 5'-agggcgatcttgacaggaaa-3', R 5'-cgaaactggcacccttgaaa-3'; C/EBPα-F 5'-gtgactttgactacccggga-3', R 5'-ggggctcttgtttgatcacc-3'; FABP4-F 5'-catcagcgtaaatggggatt-3', R 5'-tcgactttccatcccacttc-3'; FAS-F 5'-tgggttctagccagcagagt-3', R 5'-accaccagagaccgttatgc-3'; ATGL-F 5'-caacgccactcacatctacg-3', R 5'-atgcagaggacccaggaa-3'; IL-10-F 5'-atcgatttctcccctgtgaa-3', R 5'-ttcggagagaggtacaaacga-3'; IFNγ-F 5'-gagccagattatctctttctacc-3', R 5'-gttgttgacctcaaacttgg-3'; TNFα-F 5'-cgtcagccgatttgctatct-3', R 5'-cggactccgcaaagtctaag-3'; and β-actin-F 5'-ggctgtattcccctccatcg-3', R 5'-ccagttggtaacaatgccatgt- 3'. All tissue RNA was prepared using RNA-degradation reagent (5PRIME). The cDNA (1 g) was synthesized from RNA using qPCR RT master mix (TOYOBO). The following primers were used: Galectin-3-F 5'-cagtgctcctggaggctatc-3 ', R 5'-attgaagcgggggttaaagt-3'; PPAR? -F 5'-agggcgatcttgacaggaaa-3 ', R 5'-cgaaactggcacccttgaaa-3'; C / EBP? -F 5'-gtgactttgactacccggga-3 ', R 5'-ggggctcttgtttgatcacc-3'; FABP4-F 5'-catcagcgtaaatggggatt-3 ', R 5'-tcgactttccatcccactTC-3'; FAS-F 5'-tgggttctagccagcagagt-3 ', R 5'accaccagagaccgttatgc-3'; ATGL-F 5'-caacgccactacacctctacg-3 ', R 5'-atgagaggacccaggaa-3'; IL-10-F 5'-atcgatttctcccctgtgaa-3 ', R 5'-ttcggagagaggtacaaacga-3'; IFN? -F 5'-gagccagattatctctctctacc-3 ', R 5'-gttgttgacctcaaacttgg-3'; TNF? -F 5'-CGTcagCCGATTGGTATCT-3 ', R 5'-CGGactCCGCAAAGTTTAAG-3'; and β-actin-F 5'-ggctgtattcccctccatcg-3 ', R 5'-ccagttggtaacaatgccatgt-3'.
실시간 RT-PCR 분석은 ABI instrument를 보유한 SYBR Green Master Mix(Toyobo)를 사용하여 수행하였다. 정규화 제어는 β-actin을 이용하였다. 결과는 야생형(lgals3+/+) 마우스에서의 평균식과 비교하여 나타내었다.
Real-time RT-PCR analysis was performed using SYBR Green Master Mix (Toyobo) with ABI instrument. Normalization control used β-actin. The results were compared with the mean expression in wild type (lgals3 + / +) mice.
마이크로 어레이 분석Microarray analysis
총 간 RNA는 RNA-분해 시약(5PRIME)을 사용하여 제조하였다. 유전자의 발현은 20 889 성적증명서를 가지는 고밀도의 올리고뉴클레오타이드 마이크로 어레이(HG-U133 플러스 2.0, 어피 메트릭스, 산타 클라라, CA, USA)를 사용하여 세포주에서 분석하였다. Affymetrix GeneChip 발현 분석 매뉴얼(Affymetrix)에 따라 대상 마크로어케이 제조 및 처리 절차를 수행하였다. 유전자 칩 분석은 Microarray Analysis Suite 5.0, Data Mining Tool 2.0 및 Microarray Database software(Santa Clara, CA, USA)와 Affymetrix GeneChip 매뉴얼을 이용하여 실시하였다.
Total RNA was prepared using RNA-degradation reagent (5PRIME). Expression of the genes was analyzed in cell lines using high density oligonucleotide microarrays (HG-U133 plus 2.0, Affymetrix, Santa Clara, Calif., USA) with 20 889 transcripts. The target macroscopic manufacturing and processing procedures were performed according to the Affymetrix GeneChip Expression Analysis Manual (Affymetrix). Gene chip analysis was performed using Microarray Analysis Suite 5.0, Data Mining Tool 2.0 and Microarray Database software (Santa Clara, Calif., USA) and Affymetrix GeneChip manual.
부고환 백색 지방조직(Epididymal white adipose tissue ( epididymalepididymal whitewhite adiposeadipose tissuetissue ; ; eWATeWAT )의 형태학 분석) Morphological analysis
부고환 백색 지방조직(이하, 'eWAT'이라 한다) 샘플은 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 파라핀에 내재화하였다. eWAT 파라핀 절편을 헤마토신 및 에오신으로 염색하였다. 이미지는 ImageJ software를 이용하여 분석하였다.
Samples of epididymal white adipose tissue (hereinafter "eWAT") were fixed in 4% paraformaldehyde and internalized in paraffin. eWAT paraffin sections were stained with hematocin and eosin. Images were analyzed using ImageJ software.
eWATeWAT 의 중성 지방 분석Neutral Fat Analysis
eWAT 샘플은 클로로포름/메탄올(2:1, v/v)에 균질화시켰다. 50 mM NaCl을 조직 용해물에 첨가한 뒤, 10분간 와류 시키고, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 다음으로 상등액 및 인터페이스를 유기층으로부터 완전히 제거하였다. Triton X-100/클로로포름(7.5:17.5, v/v)로 첨가하고, 유기용매를 완전히 증발 시켰다. TG 레벨은 TG 분석 시약(Thermo Scientific)을 사용하여 측정하였다.
eWAT samples were homogenized in chloroform / methanol (2: 1, v / v). 50 mM NaCl was added to the tissue lysate, vortexed for 10 minutes and centrifuged at 4 캜 for 10 minutes. The supernatant and interface were then completely removed from the organic layer. Triton X-100 / chloroform (7.5: 17.5, v / v) and the organic solvent was completely evaporated. TG levels were measured using a TG analysis reagent (Thermo Scientific).
통계 분석Statistical analysis
t-테스트를 이용하여 각군을 분석하여 비교하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism 5.01을 사용하여 수행하였다. P 값이 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 보았다.
Each group was analyzed using t-test and compared. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 5.01. P value <0.05 was considered statistically significant.
결과result
갈렉틴-3Galectin-3 넉아웃Knockout (( lgals3LGgS3 -/-- / - ) 마우스에서 흰색 지방조직 감소 확인) Reduction of white adipose tissue in mice
도 1에 나타낸 바와 같이, 17개월 된 수컷 lgals3-/- 마우스(n=5)는 야생형 (lgals3+/+) 마우스보다 크기가 작았다(도 1a). 이에, 상기 마우스들의 eWAT(백색 부고환 지방조직)를 분리하여 확인한 결과, eWAT 역시 lgals3-/- 마우스가 훨씬 작은 것을 확인할 수 있었다(도 1b). 또한, 체중 대비 eWAT의 비율을 확인한 결과 lgals3-/- 마우스의 비율이 훨씬 더 작았다. 그러나, 갈색지방조직 또는 간의 크기는 lgals3-/- 마우스와 lgals3+/+ 마우스 간에 유의적인 차이가 없었다(도 1c). As shown in Figure 1, the 17-month-old male lgals3 - / - mice (n = 5) were smaller than the wild type (lgals3 + / + ) mice (Fig. As a result, eWAT (white epididymal adipose tissue) of the mice was isolated and confirmed that ewAT was much smaller than that of lgals3 - / - mice (Fig. 1B). In addition, the proportion of lgals3 - / - mice was much smaller as a result of the ratio of eWAT to body weight. However, brown adipose tissue or liver size was not significantly different between lgals3 - / - and lgals3 + / + mice (Fig. 1c).
이에, 부고환 백색지방조직(eWAT) 및 간에서 지방 조직 또는 지방생성에 관련된 유전자의 발현을 측정한 결과, PPARγ와 FABP4의 mRNA 발현은 lgals3-/- 마우스의 eWAT에서 감소한 것을 확인하였다(도 1e). As a result, expression of genes related to epididymal white adipose tissue (eWAT) and adipose tissue or fat production in the liver was measured, and it was confirmed that mRNA expression of PPARγ and FABP4 was decreased in eWAT of lgals3 - / - mice (FIG. 1e) .
간의 크기에 차이가 있다 하더라도, lgals3-/- 마우스의 간에서 PPARγ와 FAS의 mRNA 발현 감소는 갈렉틴-3의 결핍이 eWAT와 간 모두에서 지방세포 및 지방 생성 유전자의 발현을 조절하는 것을 보여준다(도 1f). 한편, lgals3-/- 마우스의 eWAT와 간 모두에서 IL-10, IFNγ 및 TNFα의 발현수준은 변하지 않았는데, 이는 lgals3-/- 마우스에서 염증의 증가가 발생되지 않은 것을 시사한다(도 1e, g).
The decrease in mRNA expression of PPARγ and FAS in liver of lgals3 - / - mice shows that galectin-3 deficiency controls the expression of adipocyte and adipogenic genes in both eWAT and liver 1F). It suggests that the increase of inflammation are generated in mice (Fig. 1e, g) - On the other hand, lgals3 - / - in both the liver and eWAT of mouse IL-10, IFNγ, and the level of expression of TNFα is not changed, which lgals3 - / .
갈렉틴Galectin -3 -3 넉아웃Knockout (( lgals3LGgS3 -/-- / - ) 마우스의 ) Of the mouse 배아섬유세포(MEFs)에서In embryonic fibroblasts (MEFs) 지방 세포 분화의 저지 경향 확인 Identification of inhibition of adipocyte differentiation
lgals3-/- 마우스에서 지방세포 및 지방생성 유전자의 발현 감소가 관찰되었으므로, 상기와 같은 결과를 통해 갈렉틴-3이 지방생성에 중요한 역할을 할 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. 이에, lgals3+/+ 및 lgals3-/- 마우스의 배아섬유아세포(MEFs)를 DMI와 로시글리타존으로 처리하였으며, 지방세포 분화를 유도하였으며, 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다. 지방세포 분화의 강도는 지질비말(작은방울)의 오일-레드-O(ORO)로 염색하여 측정하였다. 14일간, lgals3-/- 마우스의 배아섬유아세포(MEFs)의 지방세포 분화는 대조군인 lgals3+/+ 마우스의 배아섬유아세포(MEFs)에 비해 부진하였다(도 2a, b). lgals3-/- 마우스의 배아섬유아세포(MEFs)의 지방세포 분화는 lgals3+/+ 마우스의 배아섬유아세포(MEFs)에 비하여 총 지질량도 적었다(도 2c). PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ 및 FABP4의 발현은 지방세포 분화 lgals3-/- 마우스의 배아섬유아세포(MEFs)에서 감소된 것을 확인하였다(도 2d).
It was hypothesized that galectin - 3 might play an important role in lipogenesis because of the decreased expression of adipocytes and fat - producing genes in lgals3 - / - mice. The embryonic fibroblasts (MEFs) of lgals3 + / + and lgals3 - / - mice were treated with DMI and rosiglitazone to induce adipocyte differentiation, and the results are shown in FIG. The intensity of adipocyte differentiation was measured by staining with oil-red-O (ORO) of lipid droplets (small droplets). Adipogenic differentiation of embryonic fibroblasts (MEFs) of lgals3 - / - mice for 14 days was poorer than embryonic fibroblasts (MEFs) of control group lgals3 + / + mice (Fig. 2a, b). Adipocyte differentiation of embryonic fibroblasts (MEFs) of lgals3 - / - mice was less than that of embryonic fibroblasts (MEFs) of lgals3 + / + mice (Fig. 2c). The expression of PPARγ, C / EBPα, C / EBPβ and FABP4 was found to be reduced in embryonic fibroblasts (MEFs) of adipocyte differentiated lgals3 - / - mice (FIG.
갈렉틴Galectin
-3-결핍 3-3
지방전구세포인 3T3-L1 세포의 분화에 대한 갈렉틴-3의 효과를 알아보았으며, 그 결과를 하기 도 3에 나타내었다. 갈렉틴-3 mRNA 및 단백질의 수준은 지방세포가 분화하는 동안 증가하였다(도 3a, b). 이에, 지방세포 분화에서 갈렉틴-3의 역할을 확인하기 위하여, 3T3-L1 세포에서 갈렉틴-3의 발현이 되지 않도록 하였다. 3T3-L1 세포를 galectin-3 shRNA 렌티바이러스로 감염시킨 뒤, shRNA 2 및 5에서 갈렉틴-3이 제거된 것을 확인하였다. 3T3-L1 세포는 DMI를 이용하여 유도하였으며, 8일간 분화시켰다. 그 결과, 대조군인 3T3-L1 세포에 비하여 갈렉틴-3-결핍 3T3-L1 세포는 지방세포 분화 및 지방 축적이 지연된 것을 볼 수 있었다(도 3d, e). 결과적으로, PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ 및 FABP4는 낮은 발현을 나타내었다(도 3f). 상기와 같은 결과들은 갈렉틴-3이 지방세포 분화를 조절할 수 있음을 시사한다.
The effect of galectin-3 on the differentiation of 3T3-L1 cells, a lipid precursor cell, was examined and the results are shown in FIG. The levels of galectin-3 mRNA and protein increased during adipocyte differentiation (Fig. 3a, b). In order to confirm the role of galectin-3 in adipocyte differentiation, galectin-3 was not expressed in 3T3-L1 cells. After 3T3-L1 cells were infected with galectin-3 shRNA lentivirus, galectin-3 was removed from shRNAs 2 and 5. 3T3-L1 cells were induced using DMI and differentiated for 8 days. As a result, galectin-3-deficient 3T3-L1 cells were observed to be differentiated from adipocyte differentiation and fat accumulation in comparison with 3T3-L1 cells of the control group (Fig. 3d, e). As a result, PPARγ, C / EBPα, C / EBPβ and FABP4 showed low expression (FIG. 3f). These results suggest that galectin-3 can regulate adipocyte differentiation.
갈렉틴Galectin -3과 -3 and PPARPPAR γ의 상호작용 및 전사활성 증가 특성 확인γ interaction and increase in transcriptional activity
갈렉틴-3과 PPARγ 사이의 상호작용에 관하여 확인하였으며, 이를 하기 도 4에 나타내었다. FLAG-표지된 갈렉틴-3과 HA-표지된 PPARγ를 이용하여 HEK293 세포를 형질전환 하였다. 48시간 후 세포를 수확하고, 세포용해물은 Anti FLAG 비드를 이용하여 면역침강하였다. 우리는 Anti-FLAG 및 Anti-HA 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 사용하여 HEK-293 세포의 HA-표지된 PPARγ과 FLAG-표지된 갈렉틴-3 사이의 외인적으로 나타난 상호작용을 확인하였다(도 4a). 또한, 갈렉틴-3과 PPARγ사이의 내인적 상호작용은 3T3-L1 세포에서 확인하였다(도 4b). PPARγ의 전사활성에 갈렉틴-3의 영향을 확인하기 위하여, PPARγ의 아고니스트인 로시글리타존의 존재 또는 부재 하에서 일시적으로 형질전환시킨 PPARγ 반응 요소(PPRE) 리셉터로 HKE293 세포에서 shRNA하여 갈렉틴-3을 녹다운 시켰다. 갈렉틴-3의 고갈은 shLacZ와 비교하여 로시글리타존의 존재와 상관없이 PPARγ 전사활성을 상당히 감소시켰다. 면역세포를 사용하여, 우리는 PPARγ의 발현과 핵지역화가 3T3-L1 세포에서 갈렉틴-3의 부재에 의해 감소된 것을 발견하였다(도 4d). 상기와 같은 결과는 갈렉틴-3이 직접적인 상호작용에 의해 PPARγ의 발현 및 전사활성을 조절하는 가능성이 있음을 시사하는 것이다.
The interaction between galectin-3 and PPARy was confirmed and is shown in FIG. HEK293 cells were transformed with FLAG-labeled galectin-3 and HA-labeled PPARy. After 48 hours, the cells were harvested and the cell lysates were immunoprecipitated using Anti FLAG beads. We have confirmed exogenously expressed interactions between HA-labeled PPARy and FLAG-labeled galectin-3 of HEK-293 cells using Western blot using anti-FLAG and anti-HA antibodies ). In addition, endogenous interactions between galectin-3 and PPARy were confirmed in 3T3-L1 cells (Fig. 4B). In order to confirm the effect of galectin-3 on the transcriptional activity of PPARγ, galectin-3 was transfected by shRNA in HKE293 cells with a PPARγ receptor element (PPRE) receptor transiently transformed in the presence or absence of rosiglitazone, an agonist of PPARγ Knocked down. Galactin-3 depletion significantly reduced PPARg transcriptional activity independent of the presence of rosiglitazone compared to shLacZ. Using immune cells, we found that expression of PPARy and nuclear localization were reduced by absence of galectin-3 in 3T3-L1 cells (Fig. 4d). These results suggest that galectin-3 may regulate the expression and transcriptional activity of PPARγ by direct interaction.
고지방 High fat 식이에On the diet 대한 About 갈렉틴Galectin -3 -3 넉아웃Knockout (( lgals3LGgS3 -/-- / - ) 마우스의 비만 저항 효과) Obesity resistance effect of mouse
고지방 식이에 대한 갈렉틴-3 넉아웃(lgals3-/-) 마우스의 비만 저항 효과를 알아보기 위하여, 60% 지방을 함유한 고지방 식이를 수컷 lgals3+/+ 마우스 및 lgals3-/- 마우스(각, n=5)에게 12주간 섭취시켰으며, 이의 특성 및 형질형을 관찰하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.Lectin -3 Knockout go on a high-fat diet (lgals3 - / -) to evaluate the effect of obesity resistant mice, male a high-fat diet containing 60% fat lgals3 + / + mice and lgals3 - / - mice (each, n = 5) for 12 weeks, and their characteristics and traits were observed, which is shown in FIG.
두 그룹이 섭취한 음식의 양은 크게 차이가 없었음에도 불구하고(도 5b), 수컷 lgals3-/- 마우스는 lgals3+/+ 마우스보다 훨씬 낮은 체중을 나타내었다(도 5a). 또한, lgals3-/- 마우스는 lgals3+/+ 마우스보다 더 적은 eWAT 크기 및 체중 대비 eWAT 무게를 나타낸 반면, 갈색 지방 조직과 간의 무게는 두 그룹 사이에 유의적 차이가 없었다(도 5c). Although there was no significant difference in the amount of food ingested by the two groups (Fig. 5b), male lgals3 - / - mice weighed much less than lgals3 + / + mice (Fig. 5a). In addition, lgals3 - / - mice showed less eWAT size and eWAT weight than lgals3 + / + mice, whereas brown fat tissue and liver weight did not show a significant difference between the two groups (Fig. 5c).
한편, 암컷 lgals3-/- 마우스는 lgals3+/+ 마우스에서도 고지방 식이에 의한 비만 저항효과를 확인하였는데, 암컷에서도 체중, eWAT 무게 및 체중당 eWAT 비율에 대해 유사한 결과를 얻었다. 한편, 두 그룹의 혈당, 혈장 유리 지방산(plasma free fatty acids; FFA)의 조절을 확인하였는데, 체중 증가 및 비만이 유도된 lgals3+/+ 마우스와 lgals3-/- 마우스 사이에 유의적 차이가 없는 것을 확인하였다(도 5d).
On the other hand, female lgals3 - / - mice also showed an obesity resistance effect on high fat diets in lgals3 + / + mice. Similar results were obtained in females with respect to body weight, eWAT weight and eWAT ratio per body weight. On the other hand, control of blood glucose and plasma free fatty acids (FFA) in the two groups was confirmed, but there was no significant difference between the weight gain and obesity-induced lgals3 + / + mice and lgals3 - / - mice (Fig. 5D).
갈렉틴Galectin -3 -3 넉아웃Knockout (( lgals3LGgS3 -/-- / - ) 마우스의 비만 및 ) Mouse obesity and ATGLATGL 발현 조절 효과 확인 Confirm expression control effect
고지방 식이를 공급받은 lgals3-/- 마우스의 eWAT 관찰을 통해 비만 감소가 지방세포의 수 감소와 관련 있는지 확인하였다. 그러나 도 6a에 나타낸 바와 같이, eWAT에서의 비만 감소는 지방세포 수의 감소와는 크게 관련이 없는 것을 확인하였다. 고지방 식이를 공급에 의해 유발된 중성지방(triglyceride; TG) 수치는 lgals3-/- 마우스의 eWAT에서 더 낮은 수치를 나타내었다(도 6b). EWAT observations of lgals3 - / - mice fed high fat diets showed that obesity reduction was associated with a decrease in the number of adipocytes. However, as shown in FIG. 6A, it was confirmed that the decrease in obesity in eWAT was not significantly related to the decrease in the number of adipocytes. The triglyceride (TG) levels induced by feeding high fat diets were lower in eWAT of lgals3 - / - mice (Fig. 6b).
한편 중성지방 분해효소(adipose triglyceride lipase; ATGL)는 중성지방 가수분해 단계에서 중성지방의 가수분해 속도를 촉매 하는 효소로서, 일반적으로 ATGL이 없는 경우, 마우스의 여러 조직에서 중성지방과 백색지방조직이 증가된다.Meanwhile, adipose triglyceride lipase (ATGL) is an enzyme that catalyzes the hydrolysis rate of triglyceride in the stage of triglyceride hydrolysis. Generally, in the absence of ATGL, neutral fat and white fat tissue .
그러나, 본 발명에 따른 고지방 식이를 공급한 lgals3-/- 마우스의 eWAT에서는 ATGL이 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 6c). 더불어, 고지방 식이를 공급한 lgals3-/- 마우스의 eWAT에서 감소된 지방세포의 크기가 증가된 ATGL의 수준과 유사한 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과는, 갈렉틴-3이 ATGL의 발현을 조절하는 효과가 있음을 시사하는 것이다.
However, it was confirmed that ATGL was significantly increased in the eWAT of lgals3 - / - mice fed with the high fat diet according to the present invention (Fig. 6C). In addition, we confirmed that the size of reduced fat cells in eWAT of lgals3 - / - mice fed high fat diets was similar to that of increased ATGL. The above results suggest that galectin-3 has an effect of regulating the expression of ATGL.
갈렉틴Galectin -3 -3 넉아웃Knockout (( lgals3LGgS3 -/-- / - ) 마우스의 지방간 생성 유전자 발현 조절 효과) Modulation effect of fatty liver gene expression in mouse
비만 질환에서 지방간은 종종 발견되는 질환이다. 그러나, 본 발명에서 살펴본 바로는, lgals3-/- 마우스 및 lgals3-/- 마우스 간의 조직학적 분석에서는 유의적 차이가 없었다. 이에 NDA 마이크로 어레이 분석을 이용하여 간 조직에서 지방생성 유전자의 발현을 측정하였다. In obesity, fatty liver is a disease that is often found. However, Pharaoh, lgals3 discussed herein - / - mice and lgals3 - / - mice between the histological analysis showed no significant difference. NDA microarray analysis was used to measure the expression of lipogenic genes in liver tissues.
PPARγ, C/EBPα, FABP4, FAS, Me1, Acaca, Acyl 및 Slc25a1에서의 mRNA 발현은 lgals3-/- 마우스의 간 조직에서 감소한 것을 확인하였다(도 6d). 또한, 실시간 RT-PCR 분석을 이용하여 실시한 lgals3-/- 마우스의 간 조직의 분석에서도 PPARγ, C/EBPα, FABP4 및 FAS의 mRNA 발현이 상대적으로 낮은 것을 확인하였다(도 6e). 상기와 같은 결과는 갈렉틴-3이 전신 비만을 자극하여 간에서 지방을 생성하는 유전자에 영향을 미칠 수 있음을 시사하는 것이다. MRNA expression in PPARγ, C / EBPα, FABP4, FAS, Me1, Acaca, Acyl and Slc25a1 was found to be decreased in liver tissues of lgals3 - / - mice (FIG. In addition, analysis of liver tissues of lgals3 - / - mice performed using real-time RT-PCR analysis revealed that mRNA expression of PPARγ, C / EBPα, FABP4 and FAS was relatively low (FIG. These results suggest that galectin-3 may affect the genes that produce fat in the liver by stimulating systemic obesity.
Claims (12)
상기 중성지방 분해효소는 지방세포의 크기를 감소시키는 것을 특징으로 하는 생물학적 조성물.6. The method of claim 5,
Wherein the triglycerolytic enzyme reduces the size of adipocytes.
상기 지방간 생성유전자는 과산화소체 증식체 활성화 수용체 감마(PPARγ), ccaat-enhancer-binding protein alpha(C/EBPα), fatty acid binding protein(FABP4) 및 fatty acid synthase(FAS) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생물학적 조성물.9. The method of claim 8,
The fat-growing gene is at least one selected from among peroxidase proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), ccaat-enhancer-binding protein alpha (C / EBPα), fatty acid binding protein (FABP4) and fatty acid synthase ≪ / RTI >
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