KR101689787B1 - 입자 조성물 및 이를 가진 의약 조성물 - Google Patents

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Abstract

소수성 폴리머 사슬 세그먼트를 내측으로 향하게 하는 동시에, 친수성 폴리머 사슬 세그먼트를 외측으로 향하게 한 상태로 방사상으로 배치된 블록 코폴리머 유닛과, 내포시킬 약물의 전하와는 반대의 전하를 띤 하전 지질을 함유하고, 이 하전 지질이 소수성 폴리머 사슬 세그먼트측에 끌어당겨진 상태로 배치된 입자 조성물로 한다. 이 입자 조성물에서는 하전 지질과의 정전 결합에 의하여 약물이 입자 내에 유지되는 한편, 하전 지질과는 반대의 전하를 띤 대전성 물질을 유인할 수 있는 전하를 입자 외주면이 띠는 것이 방지된다.

Description

입자 조성물 및 이를 가진 의약 조성물{PARTICLE COMPOSITION AND MEDICINAL COMPOSITION COMPRISING SAME}
본 발명은 약물 운반 시스템 (DDS)의 담체로서 적용할 수 있는 입자 조성물 (예를 들면, 고분자 미셀)과, 이 입자 조성물 및 이것에 약물이 내포된 의약 조성물 (예를 들면, 고분자 미셀 제제)에 관한 것이다.
단백질이나 핵산과 같은 생체 고분자를 이용하는 바이오 의약품은 저분자 화합물을 이용하는 종래형의 의약품에 비하여, 효소로 분해되거나 면역계에 의하여 배제되거나 하기 쉽다. 특허 문헌 1 내지 4는 생체 내에 있어서의 바이오 의약품의 안정성을 높이는 관점에서, 지질 이중막으로 이루어지는 리포솜에 생체 고분자를 내포시킨 DDS를 개시한다.
특허 문헌 1: 국제 공개 제2001/034115호　팜플렛 특허 문헌 2: 국제 공개 제1998/58630호　팜플렛 특허 문헌 3: 국제 공개 제2005/092389호　팜플렛 특허 문헌 4: 특표2001-504093
특허 문헌 1 내지 3에 기재된 종래형의 DDS에서는 약물로서의 생체 고분자를 지질 이중막으로 보호함으로써, 생체 내에 있어서의 약물의 안정성을 향상시킬 수 있지만, 약물이 담체로부터 방출되기 어려워진다. 또한, 이러한 종래형의 DDS는 그 입자 지름의 크기나 지질 이중막을 구성하는 지질이 가진 전하에 기인하여, 폐, 간장 및 비장과 같은 세망 (細網) 내피계에 포착되기 쉽기 때문에, 투약 대상물에 도달하기 이전에 혈중으로부터 제거되어 버리는 경우가 있다. 특허 문헌 4에 기재된 DDS에서는 리포솜을 스텔스화함으로써, 이러한 세망 내피계에 포착되는 것을 방지하려 하고 있으나, 역시 약물이 담체로부터 방출되기 어려운 경향이 있다.
소수성 폴리머 사슬 세그먼트와 친수성 폴리머 사슬 세그먼트에 의한 블록 코폴리머 유닛에 의하여 구성된 고분자 미셀을 담체로 하는 DDS는 리포솜을 사용한 종래형의 DDS에 비하여 DDS 입자를 대폭 소형화 (예를 들면, 평균 입자 지름 100 nm 이하)할 수 있다. 그러나, 이와 같은 고분자 미셀을 담체로 하는 DDS는, 후술하는 비교예에 나타내는 바와 같이, 생체 고분자를 DDS 입자 내에 유지하는 작용이 너무 약하기 때문에, 역시 투약 대상물에 약물을 적절히 수송하기 어려워지는 경우가 있다. 또한, 이러한 DDS에서는 제조 후의 저장 기간 중에 담체로부터 약물이 박리되어 버리는 경우도 있다.
본 발명은 소수성 폴리머 사슬 세그먼트와 친수성 폴리머 사슬 세그먼트를 가진 블록 코폴리머 유닛을 함유하고, 복수의 상기 블록 코폴리머 유닛이 상기 소수성 폴리머 사슬 세그먼트를 내측으로 향하게 하는 동시에, 상기 친수성 폴리머 사슬 세그먼트를 외측으로 향하게 한 상태로 방사상으로 배치된 입자 조성물로서, 내포시킬 약물의 전하와는 반대의 전하를 띤 하전 지질을 추가적으로 가지고, 이 하전 지질과의 정전 결합에 의하여 상기 약물을 입자 내에 유지하는 한편, 이 하전 지질이 상기 소수성 폴리머 사슬 세그먼트측에 끌어당겨진 상태로 배치됨으로써, 상기 하전 지질과는 반대의 전하를 띤 대전성 물질을 유인할 수 있는 전하를 입자 외주면이 띠는 것이 방지된 입자 조성물을 제공한다.
본 발명은 다른 측면에서, 상기 입자 조성물과, 이 입자 조성물에 내포된 하전 지질과는 반대의 전하를 띤 약물을 가진 의약 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 약물의 유지성이 우수함과 동시에, 투약 대상물에의 약물 운반의 방해로 귀결될 수 있는 담체 표면에의 생체 분자의 부착이 방지된, DDS에 매우 적합한 약물 담체 및 이 약물 담체를 사용한 의약품을 제공할 수 있다. 이들 약물 담체 및 의약품은 종래형의 DDS에 비하여 투약 대상물에 의하여 확실히 약물을 수송할 수 있다.
도 1(a) 내지 (c)는 본 발명의 입자 조성물 및 의약 조성물의 구조의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 2는 시험예 1b에서 측정한 입자 조성물의 제타 전위의 절대 값과 시험예 1c에서 측정한 입자 조성물의 혈중 응집도와의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 3은 시험예 2b에 있어서의 알부민-FITC의 형광 강도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 시험예 5a에 있어서의 전기 영동의 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 시험예 5c에서 조사한 입자 조성물의 항암 활성을 설명하기 위한 그래프이다.
도 6은 시험예 5d에서 조사한 입자 조성물의 혈청 중에서의 응집성을 설명하기 위한 그래프이다.
도 7은 시험예 5b에서 측정한 입자 조성물의 제타 전위의 절대 값과, 시험예 5d에서 측정한 입자 조성물의 혈중 응집도와의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 8은 시험예 5f에서 조사한 약물의 장기 이행성을 설명하기 위한 그래프이다.
도 1(a)는 본 발명의 입자 조성물 (이하, 단지 「입자 조성물」이라 하는 경우가 있다)의 구조의 일례를 나타내는 모식도이고, 도 1(b)는 그 부분 확대도이다. 입자 조성물 (1)은 블록 코폴리머 유닛 (2)과 하전 지질 (3)을 함유한다. 블록 코폴리머 유닛 (2)은 친수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2a)와 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)를 가지고, 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)를 내측으로 향하게 하는 동시에, 친수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2a)를 외측으로 향하게 한 상태로, 입자 조성물 (1) 내에 방사상으로 배치된다. 또한, 하전 지질 (3)은 내포시켜야 할 약물의 전하와는 반대의 전하를 띠고, 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)측에 끌어당겨진 상태로 배치된다. 도 1(c)은 본 발명의 입자상 의약 조성물 (이하, 단자 「의약 조성물」이라 하는 경우가 있다)의 구조의 일례를 나타내는 모식도이다. 의약 조성물 (1')는 입자 조성물 (1)과 하전 지질 (3)과는 반대의 전하를 띤 약물 (4)를 가지고, 약물 (4)는 하전 지질 (3)과 정전 결합함으로써, 입자 조성물 (1) 내에 유지된다.
본 명세서에 있어서「하전 지질」이란, 생리적 pH (예를 들면, pH7.4)의 수성 매체 중에 있어서 정전하보다 부전하가 많은 음이온성 지질 및 해당 수성 매체 중에 있어서 부전하보다 정전하가 많은 양이온성 지질을 의미한다. 이 때문에, 본 명세서에서는 양이온성기 및 음이온성기를 가진 이른바 양성 하전 지질에 대하여도, 상기 기준에 기초하여 취급하기로 한다.
하전 지질 (3)은 내포시킬 약물 (4)를 정전 결합에 의하여 입자 조성물 (1) 내에 유지한다. 하전 지질 (3)은 적어도 입자 조성물 (1)로부터 형성되는 의약 조성물 (1')의 저장(stock) 환경하에 있어서, 내포되는 약물 (4)의 전하와는 반대의 전하를 띠고 있으면 좋다. 이에 의하여, 제조 후의 저장 기간 중에 약물 (4)를 더 확실하게 입자 조성물 (1) 내에 유지할 수 있다. 하전 지질 (3) 및 약물 (4)는 혈중에 대표되는 생리 환경하 (예를 들면, pH 7.4)에 있어서도 반대의 전하를 띠고 있는 것이 좋다. 이것에 의하여, 투약 대상물에 수송하는 도중에 약물 (4)가 입자 조성물 (1)로부터 박리되는 것을 더 확실하게 방지할 수 있다.
하전 지질 (3)은 다음의 메커니즘에 의하여, 소수성 폴리머 사슬 세그먼트측 (2b)에 끌어당겨진 상태로 배치된다. 입자 조성물 (1)은 블록 코폴리머 유닛 (2)과 하전 지질 (3)을 수용액 중에서 현탁하는 공정을 포함하여 형성한다. 블록 코폴리머 유닛 (2)의 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)는 소수성이기 때문에, 수용액 중에서는 확산하지 않고 응집하여 존재한다. 친수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2a)는 수용액 중에서 확산하여 자유롭게 운동할 수 있다. 이 때문에, 블록 코폴리머 유닛 (2)은 수용액 중에서, 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)를 내측으로, 친수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2a)를 외측으로 향한 방사상으로 배치된다. 또한, 하전 지질 (3)은 소수성이 강하고, 물이나 친수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2a)에 비하여 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)와의 친화성이 높기 때문에, 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)측으로 끌어당겨진 입자 조성물 (1)의 외주면으로부터 떨어져서 배치된다. 이에 의하여, 하전 지질 (3)과는 반대의 전하를 띤 대전성 물질 (예를 들면, 혈중의 단백질)을 유인할 수 있는 전하를, 입자 조성물 (1) 및 의약 조성물 (1')의 외주면이 띠는 것이 방지된다.
또한, 이렇게 하여 수용액 중에서 현탁하면, 하전 지질 (3)과 블록 코폴리머 유닛 (2)이 섞인 상태로 입자화하기 때문에, 하전 지질 (3)은 도 1(b)에 나타내는 바와 같이, 입자 조성물 (1)의 둘레 방향에 있어서 연속하는 상태로 배치되는 것이 아니라, 입자 조성물 (1)의 둘레 방향에 있어서 인접하는 블록 코폴리머 유닛 (2) 사이에 개재하도록 배치된다. 이로써 입자 조성물 (1)에서는 입자 조성물 (1)의 둘레 방향에 있어서 인접하는 하전 지질 (3)간의 접촉이 블록 코폴리머 유닛 (2)에 의하여 분단된다. 이 때문에, 입자 조성물 (1)에서는 입자 조성물 (1)의 둘레 방향에 있어서, 인접하는 하전 지질 (3) 사이에 블록 코폴리머 유닛 (2)을 수용할 수 있는 정도의 틈 (G)이 형성된 상태에 있는, 바꾸어 말하면, 인접하는 하전 지질 (3) 사이에 틈 (G)이 형성되어, 이 틈 (G)에 블록 코폴리머 유닛 (2)이 배치된 상태로 되어 있다. 하전 지질 (3)과 블록 코폴리머 유닛 (2)과의 사이의 결합력은 하전 지질 (3)끼리의 결합력에 비하면 작다. 이 때문에, 입자 조성물 (1)에서는 지질이 둘레 방향으로 연속하여 배치된 상태로 되어 있는 종래형의 DDS (리포솜)에 비하면, 하전 지질 (3)의 탈락에 기인한 입자 형상의 붕괴가 일어나기 쉬운 결과, 입자 (담체) 내에 있어서의 내포시켜야 할 약물 (4)의 과잉 유지가 방지된다. 특허 문헌 4에 기재된 DDS로 대표되는 스텔스 리포솜은 지질 이중 막으로 이루어지는 리포솜 본체를 형성한 후에, 이 본체의 표면에 디블록 코폴리머를 부착하는 것에 의하여 형성되기 때문에, 둘레 방향에 있어서 인접하는 지질간의 접촉은 블록 코폴리머 등에 의하여 분단되지 않고, 어디까지나 지질이 둘레 방향으로 연속하여 배치된 상태로 되어 있다.
대전성 물질을 유인할 수 있는 전하를 입자 조성물 (1) 및 의약 조성물 (1')의 외주면이 띠는 것이 방지된 상태라 함은, 예를 들면, 입자 조성물 (1) 및 의약 조성물 (1')로부터 측정되는 제타 전위의 절대 값이 소정 값 이하의 범위에 있는 것에 의하여 특정할 수 있다. 더 구체적으로는 의약 조성물 (1')에 대하여는 제타 전위의 절대 값이 10 mV 이하인 것이 좋고, 예를 들면 5 mV 이하, 또 예를 들면 3 mV 이하, 좋기로는 2 mV 이하, 더 좋기로는 1 mV 이하이다. 의약 조성물 (1')의 제타 전위의 절대 값은 입자 조성물 (1)에 약물 (4)을 함유시킴으로써, 이 입자 조성물 (1)에 고유의 제타 전위의 절대 값보다 낮아지는 경향이 있다. 이 때문에, 입자 조성물 (1)에 대하여는 제타 전위의 절대 값이 15 mV 이하인 것이 좋고, 예를 들면 12 mV 이하, 또 예를 들면 6 mV 이하, 또 예를 들면 3 mV 이하이고, 좋기로는 2 mV 이하, 더 좋기로는 1 mV 이하이다. 제타 전위는 pH가 7.4인 10 mM의 HEPES 버퍼 용액에, 입자 조성물 (1) 또는 의약 조성물 (1')에 함유되는 하전 지질 (3)의 총량이 이 버퍼 용액 1 mL 당 0.1 ㎎가 되도록 첨가하여 측정하도록 한다.
본 명세서에 있어서, 제타 전위의 절대 값은 소수점 이하를 사사오입하여 얻어지는 수치로서 취급하도록 한다. 예를 들면, 제타 전위의 절대 값이 「2 mV 이하」인 상태는 2.5 mV 미만인 상태를 포함한다.
또한, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 입자 조성물 (1) 또는 의약 조성물 (1')의 제타 전위의 절대 값이 낮아지도록 제어함으로써, 입자 조성물 (1) 또는 의약 조성물 (1')의 혈중에 있어서의 응집을 방지할 수 있다. 더 구체적으로는, 입자 조성물 (1)의 제타 전위의 절대 값을 소정 범위 이하로 제어함으로써, 입자 조성물 (1)의 혈중 응집도가, 예를 들면 0.2 이하, 또 예를 들면 0.18 이하, 또 예를 들면 0.15 이하, 나아가 0.1 이하, 경우에 따라서는 0.05 이하가 될 정도로까지, 혈중에 있어서의 응집을 방지할 수 있다. 또한, 의약 조성물 (1')의 제타 전위의 절대 값을 소정 범위 이하로 제어함으로써, 의약 조성물 (1')의 혈중 응집도가 예를 들면 0.2 이하, 또한 예를 들면 0.16 이하, 또한 0.1 이하, 경우에 따라서는 0.05 이하가 될 정도까지 혈중에 있어서의 응집을 방지할 수 있다.
혈중 응집도는 다음과 같이 하여 산출한다.
i) pH가 7.4인 10 mM의 HEPES 버퍼 용액에 하전 지질 (3)의 총량이 해당 버퍼 용액 1 mL당 2.2 ㎎이 되도록 측정 대상의 조성물 (입자 조성물 (1) 또는 의약 조성물 (1'))을 첨가하고, 또한 FBS (소 혈청)를 해당 버퍼 용액 1 mL당 9 mL가 되도록 첨가하여 측정 샘플 A를 조제한다.
ii) FBS (소 혈청)을 대신하여 pH가 7.4인 10 mM의 HEPES 버퍼 용액을 사용하는 것 이외에는, 상기 i)와 동일하게 하여 측정 샘플 B를 조제한다.
iii) 측정 샘플 A 및 B를 37℃에서 24시간 정치한 후, 파장 700 nm의 광선에 대한 흡광도를 각각으로부터 측정한다.
iv) 「측정 샘플 A로부터 얻은 흡광도」로부터 「측정 샘플 B로부터 얻은 흡광도」를 감산하여 얻은 값을 혈중 응집도로 한다. 또한, 해당 값이 작을수록 혈중에 있어서 측정 대상 조성물이 응집하기 어렵다.
하전 지질 (3)에 대한 블록 코폴리머 유닛 (2)의 비율은 질량비로 표시하여 1.0 이상인 것이 좋고, 좋기로는 1.5 이상, 더 좋기로는 2.0 이상, 또한, 50 이하인 것이 좋고, 좋기로는 20 이하, 더 좋기로는 10 이하이다. 이 비율을 높일수록 입자 조성물 (1) 및 의약 조성물 (1')의 제타 전위의 절대 값을 낮출 수 있다. 한편, 하전 지질 (3)의 비율이 높아질수록, 약물 (4)을 더 적극적으로 입자 내에 넣을 수 있기 때문에, 상기한 바와 같이 이 비율은 50 이하로 제한하는 것이 좋다.
하전 지질 (3)은 단순 지질, 복합 지질 및 유도 지질의 어느 것이어도 좋고, 인지질, 글리세로 당지질, 스핀고 당지질, 스핀고이드류 및 스테롤류를 예시할 수 있다. 더 구체적으로는, 양이온성 지질로서 예를 들면, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모니오프로판 (DOTAP), N-(2,3-디올레일옥시프로판-1-일)-N,N,N-트리메틸염화암모늄 (DOTMA), 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카르복시아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세트산 (DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸브롬화암모늄 (DMRIE), 1,2-디올레오일옥시프로필-3-디에틸히드록시에틸브롬화암모늄 (DORIE), 3β-[N-(N'N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol)을 들 수 있다. 음이온성 지질로서는, 예를 들면 카르디올리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티딘산, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민(N-숙시닐 PE), 포스파티딘산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에틸렌글리콜, 콜레스테롤 호박산을 들 수 있다.
친수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2a)는 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리옥시에틸렌으로 이루어지는 수용성 폴리머 유래의 세그먼트인 것이 좋다. 친수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2a)의 분자량은 2,500 Da 이상인 것이 좋고, 좋기로는 5,000 Da 이상, 더 좋기로는 8,000 Da 이상이며, 또한, 200,000 Da 이하인 것이 좋고, 좋기로는 20,000 Da 이하, 더 좋기로는 15,000 Da 이하이다. 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)는 폴리아미노산 사슬 유래의 세그먼트인 것이 좋다. 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)의 반복 단위 수는 10개 이상인 것이 좋고, 좋기로는 20개 이상이며, 또한, 200개 이하인 것이 좋고, 좋기로는 100개 이하, 더 좋기로는 60개 이하이다. 입자 조성물 (1)의 제타 전위의 절대 값을 낮게 하는, 바꾸어 말하면 입자 조성물 (1)의 표면 전하를 작게 하는 (중성에 가까워지는) 관점에서는 블록 코폴리머 유닛 (2)에 있어서, 친수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2a)의 사이즈 (분자량)를 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)의 사이즈 (반복 단위 수)에 비하여 크게 하는 것이 좋다.
친수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2a) 및 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)는 대전성 물질을 유인할 수 있는 전하를 입자 조성물 (1) 및 의약 조성물 (1')의 입자 외주면이 띠는 것이 방지되는 한, 아미노기 및 카르복실기로 대표되는 하전성의 치환기를 함유하고 있어도 좋다.
친수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2a)와 소수성 폴리머 사슬 세그먼트 (2b)는 주 사슬의 말단끼리를 공유 결합을 통하여 결합시킨 것을 사용할 수 있다. 더 구체적으로는 블록 코폴리머 유닛 (2)으로서 다음의 일반식 (I) 및 일반식 (II)로 표시되는 화합물을 예시할 수 있다. 입자 조성물 (1)은 2 종류 이상의 블록 코폴리머 유닛 (2)에 의하여 형성되어 있어도 좋다.
[화학식 1]
Figure 112012010388669-pct00001
[화학식 2]
Figure 112012010388669-pct00002
일반식 (I) 및 일반식 (II)에 있어서, R1 및 R3은 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 R8(R9)CH(CH2)q-로 나타내는 기를 나타내고 [다만, R8 및 R9는, i) 각각 독립적으로, 수소 원자, C1 - 6알콕시기, 아릴옥시기, 아릴C1 - 3옥시기, 시아노기, 카르복실기, 아미노기, C1 - 6알콕시카르보닐기, C2 - 7아실아미드기, 트리-C1 -6알킬실록시기, 실록시기, 시릴아미노기이고, ii) 함께 C1 - 3알킬기로 치환되어 있는 또는 미치환의 에틸렌디옥시기 또는 프로필렌디옥시기를 형성하거나, 또는 iii) 이들이 결합되어 있는 CH기와 함께 포르밀기를 형성한다], q는 O 내지 10의 정수이고, R2는 수소 원자, 포화 또는 불포화의 C1 내지 C29 지방족 카르보닐기 또는 아릴카르보닐기이며, R4는 수산기, 포화 또는 불포화의 C1 내지 C30 지방족 옥시기 또는 아릴-저급 알킬옥시기이고, R5는 ―O- 또는 ―NH-이고, R6는 수소 원자, 페닐기, 벤질기, -(CH2)4-페닐기, 미치환의 또는 아미노기 또는 카르보닐기로 치환된 C4 내지 C16 알킬기, 또는 스테롤 유도체의 잔기이며, R7은 메틸렌기이고, n은 55 내지 4,600의 범위에 있는 정수이며, x는 10 내지 200의 범위에 있는 정수이고, m은 0 내지 200의 범위에 있는 정수이며 [다만, m이 1 이상인 경우, (COCHNH)의 유닛과 (COR7CHNH)의 유닛은 랜덤하게 존재하고, m이 2 이상인 경우, R6은 1개의 블록 코폴리머 내의 각 아미노산 유닛에 있어서, 각각 독립적으로 선택되어 랜덤하게 존재하지만, R6이 수소 원자인 경우에는, R6 전체의 75% 이하이다.), y는 1 또는 2이고, L1은 -NH-, -O-, -O-Z-NH-, -CO-, -CH2-, 및―O-Z-S-Z-NH- (이 때, Z는 독립적으로 C1 내지 C6 알킬렌기이다.)로부터 선택되는 연결기이며, L2는 -OCO-Z-CO-, 및―NHCO-Z-CO- (다만, Z는 C1 내지 C6알킬렌기이다)로부터 선택되는 연결기이다.
일반식 (I) 및 일반식 (II)에 있어서, n은 좋기로는 110 이상, 더 좋기로는 180 이상, 또한, 좋기로는 460 이하, 더 좋기로는 340 이하의 정수이고, x는 좋기로는 20 이상, 또한, 좋기로는 100 이하, 더 좋기로는 60 이하의 정수이며, m은 좋기로는 100 이하, 더 좋기로는 60 이하의 정수이다.
블록 코폴리머 유닛 (2)는 음이온성의 폴리머인 것이 좋다. 블록 코폴리머 유닛 (2)으로서 음이온성의 폴리머를 사용함으로써, 하전 지질 (3)로서 양이온성 지질을 사용한 경우에 있어서, 입자 조성물 (1)이나 의약 조성물 (1')의 제타 전위의 절대 값을 3 mV 이하, 또한 2 mV 이하, 그리고 1 mV 이하로 제어하기 쉬워진다. 또한, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 블록 코폴리머 유닛 (2)로서 음이온성의 폴리머를 사용함으로써, 중성의 폴리머를 사용하였을 경우와 비교하여, 제타 전위의 절대 값이 동일한 정도이더라도, 혈중에 있어서의 응집을 더 현저하게 방지할 수 있다. 또한, 본 명세서에서는 생리적 pH (예를 들면 pH 7.4)의 수성 매체 중에 있어서, 정전하보다 부전하가 많은 폴리머를 음이온성, 부전하보다 정전하가 많은 폴리머를 양이온성, 정전하와 부전하와의 비율이 동일한 정도인 폴리머를 중성으로서 취급하기로 한다.
바람직한 음이온성의 블록 코폴리머 유닛 (2)로서는, 일반식 (I) 및 (11)에 있어서, R5가 ―O-이고, R6가 벤질기, -(CH2)4-페닐기, 또는 미치환의 또는 아미노기 또는 카르보닐기로 치환된 C4 내지 C16 알킬기인 것을 들 수 있다.
블록 코폴리머 유닛 (2)는 예를 들면 친수성 폴리머 사슬을 가진 폴리머 및 폴리아미노산 사슬을 가진 폴리머를 그대로, 또는 필요에 따라 분자량 분포를 좁게 하도록 정제한 후, 공지의 방법에 의하여 커플링함으로써 형성할 수 있다. 일반식 (I)의 블록 코폴리머 유닛 (2)에 대하여는, 예를 들면, R1을 부여할 수 있는 개시제를 사용하여 음이온 리빙 중합을 실시함으로써 폴리에틸렌글리콜 사슬을 형성한 후에, 성장 말단측에 아미노기를 도입하고, 그 아미노 말단으로부터 β-벤질-L-아스파르테이트, γ-벤질-L-글루타메이트, Nε-Z-L-리신과 같은 보호된 아미노산의 N-카르본산 무수물 (NCA)을 중합하여도 형성할 수 있다.
입자 조성물 (1)은 예를 들면, 다음과 같이 하여 형성할 수 있다. 먼저, 블록 코폴리머 유닛 (2)과 하전 지질 (3) 및 필요하면 중성의 지질을 유기 용매를 함유하는 형성 용액에 용해 또는 분산시키고, 충분히 용해 또는 분산시킨 후에 이 유기 용매를 증산 제거한다. 유기 용매로서는, 아세톤, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 메탄올을 예시할 수 있다. 형성 용액은 2종 이상의 유기 용매를 함유할 수 있고, 소량의 물을 더 함유하여도 좋다. 얻은 고형물 또는 페이스트에, 물 또는 적당한 염 또는 안정화제 등의 첨가물을 함유하는 수용액을 가하고, 교반함으로써 블록 코폴리머 유닛과 지질을 현탁시킨다. 이것을 초음파 조사, 고압 유화기 또는 엑스톨더 등의 수단을 사용하여 분산·미소화함으로써 입자 조성물 (1)을 형성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 입자 조성물 (1)과 이 입자 조성물 (1)에 내포된 하전 지질 (3)과는 반대의 전하를 띤 약물 (4)를 가진 의약 조성물 (1')을 제공할 수도 있다. 약물 (4)는 하전 지질 (3)과의 정전 결합에 의하여 입자 조성물 (1) 내에 유지된다. 이와 같이, 하전 지질 (3)과 약물 (4)의 결합 상태는 가역적이고, 화학적 구조 변화를 수반하지 않는다. 약물 (4)는 입자 조성물 (1)의 형성 과정에 있어서 형성 용액 중에 첨가하여도, 약물 (4)의 용액에 입자 조성물 (1)을 첨가하여도, 입자 조성물에 내포시킬 수 있다.
약물 (4)로서는, 생리적 pH (예를 들면, pH 7.4)의 수성 매체 중에 있어서 정전하보다 부전하가 많은 음이온성 화합물 및 이 수성 매체 중에 있어서 부전하보다 정전하가 많은 양이온성 화합물을 들 수 있다. 화합물은 고분자 화합물이 좋다.
약물 (4)에 적용할 수 있는 고분자 화합물로서는, 펩티드, 단백질, 당사슬, 핵산 등을 들 수 있다.
약물 (4)가 혈중 등에 있어서 입자 조성물 (1)로부터 조기에 이탈하는 것을 억제하는 동시에, 약물 (4)가 입자 조성물 (1) 내에 과잉의 기간동안 계속 유지되는 것을 방지하는 관점에서는 의약 조성물 (1')에 있어서의 하전 지질 (3)과 약물 (4)와의 전하비를 소정 범위로 제어하는 것이 좋다. 이 전하비는, 예를 들면 약물 (4)로서 핵산을 사용하는 경우, [입자 조성물에 함유되는 하전 지질 (3) 중의 양이온성기의 몰 농도]/[핵산 중의 인산기의 몰 농도]에 의하여 규정되고, 또한 예를 들면, 단백질로 대표되는 양성의 하전성기를 가진 약물을 사용하는 경우, [입자 조성물에 함유되는 하전 지질 중의 하전성기의 몰 농도]/([하전 지질의 전하와 반대의 전하를 가진 약물 중의 하전성기의 몰 농도]-[하전 지질의 전하와 동일한 전하를 가진 약물 중의 하전성기의 몰 농도])에 의하여 규정된다. 이 전하비는, 좋기로는 0.5 이상, 더 좋기로는 1 이상, 더 좋기로는 2 이상, 또한, 좋기로는 50 이하, 더 좋기로는 20 이하, 더 좋기로는 10 이하이다.
입자 조성물 (1) 및 의약 조성물 (1')의 평균 입자 지름은 좋기로는 10 nm 이상, 더 좋기로는 30 nm 이상, 또한, 좋기로는 300 nm 이하, 더 좋기로는 200 nm 이하이다.
실시예
이하, 실시예에 의하여, 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 또한, 이후의 설명에 있어서의 동적 광산란법 (DLS)에 따른 입자 조성물의 평균 입자 지름의 측정에는 광산란 입자 지름 측정 장치 제타사이저 나노 ZS(Zetasizer Nano ZS, Malvern lnstruments)를 사용하였다.
〔실시예·시험례군 1: 입자 조성물〕
[실시예 1-1]
질량 평균 분자량 (Mw) 10000의 α-메톡시-ω-아미노-폴리에틸렌글리콜 (이하, 「PEG」라고 표시하는 경우가 있다) (니치유가부시키가이샤) 5 g을 디메틸술폭시드 50 mL에 용해하고, γ-벤질-L-글루타메이트 (이하, 「PBLG」라고 표시하는 경우가 있다)의 N-카르본산 무수물 (NCA) 5.5 g (폴리에틸렌글리콜에 대하여 42 등량)을 가하고 40℃에서 24 시간 반응을 실시하였다. 이 반응 용액을 헥산 및 아세트산에틸의 혼합 용매 (체적비 1:1) 1 L 중에 적하함으로써, 폴리머를 석출한다. 감압 여과에 의하여 폴리머를 회수하고, 다시 건조시킴으로써, 8.6 g의 고형물을 얻었다. 이것을 DMF 86mL에 용해하고, 무수 아세트산 432 μL를 가하여 40℃에서 24 시간 반응을 실시하였다. 반응 용액을 헥산 및 아세트산에틸의 혼합 용매 (체적비 1:1) 1 L 중에 적하함으로써 폴리머를 석출시켰다. 폴리머는 감압 여과에 의하여 회수하고, 다시 건조시킴으로써 8.1 g의 폴리에틸렌글리콜-폴리(γ-벤질-L-글루타메이트)-Ac 블록 코폴리머 (이하,「PEG-PBLG」라고 표시하는 경우가 있다)를 얻었다. PEG-PBLG의 구조식을 아래에 나타낸다. 1H-NMR에 의한 해석으로부터, PBLG 블록의 중합도는 40이었다.
[화학식 3]
Figure 112012010388669-pct00003
PEG-PBLG의 클로로포름 용액 (50 ㎎/mL) 4 mL와, 양이온성의 하전 지질인 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모니오프로판 (이하,「DOTAP」라고 부른다) (Avanti Polar Lipid)의 클로로포름 용액 (40 ㎎/mL) 0.5 mL를 혼합한 후, 로타리 에바포레이터로 용매를 유거하고, 다시 하룻밤 감압 건조하였다. 얻은 고형물에 20 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4) 10 mL를 가하고 3 시간 실온에서 교반하여 현탁시켰다. 이 현탁액을 초음파 처리 (130 W, 1초 펄스, 20분간) 함으로써, 입자화를 실시하였다. 이 용액을 0.2 ㎛의 필터 (마이렉스 GP, 미리포아)로 여과하여, 입자 조성물 (1)을 얻었다. 입자 조성물 (1)은 친수성 폴리머 사슬 세그먼트가 바깥쪽을 향한 상태로 방사상으로 배치되고, 하전 지질이 소수성 폴리머 사슬 세그먼트측에 끌어당겨져서 배치된 상태에 있다. 후술하는 입자 조성물 2 내지 6도 이와 같은 상태에 있다.
[실시예 1-2]
DOTAP를 대신하여 음이온성의 하전 지질인 포스파티딘산 (이하,「PA」라고 표시하는 경우가 있다)을 사용한 것 이외에는 실시예 1-1과 동일하게 하여 입자 조성물 2를 얻었다.
[실시예 1-3]
실시예 1-1에서 얻은 PEG-PBLG의 클로로포름 용액 (50 ㎎/mL) 4 mL와, 양이온성의 하전 지질인 DOTAP (Avanti Polar Lipid)의 클로로포름 용액 (40 ㎎/mL) 0.5 mL 및 중성의 지질인 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (이하,「DOPE」라고 표시하는 경우가 있다) (Avanti Polar Lipid)의 클로로포름 용액 (40 ㎎/mL) 0.5 mL를 혼합한 후, 로타리 에바포레이터로 용매를 유거하고, 또한 하룻밤 감압 건조하였다. 얻은 고형물에 20 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4) 5 mL를 가하고 3 시간 실온에서 교반하여 현탁하였다. 이 현탁액을 초음파 처리 (130 W, 1초 펄스, 20 분간) 함으로써 입자화를 실시하였다. 이 용액을 0.2 ㎛의 필터 (마이렉스 GP, 미리포아)로 여과하여, 입자 조성물 (3)을 얻었다.
[실시예 1-4]
PEG-PBLG의 클로로포름 용액의 양을 2 mL로 변경한 것 이외에는 실시예 1-3과 동일하게 하여 입자 조성물 4를 얻었다.
[실시예 1-5]
PEG-PBLG의 클로로포름 용액의 양을 1.33 mL로 변경한 것 이외에는 실시예 1-3과 동일하게 하여 입자 조성물 5를 얻었다.
[실시예 1-6]
PEG-PBLG의 클로로포름 용액의 양을 1 mL로 변경한 것 이외에는 실시예 1-3와 동일하게 하여 입자 조성물 (6)을 얻었다.
[실시예 1-7]
실시예 1-1에서 얻은 PEG-PBLG를 알칼리 처리함으로써, 글루타민산 측쇄의 벤질기를 탈보호하고, 폴리에틸렌글리콜-폴리 (L-글루타민산) 블록 코폴리머 (PEG-pGlu)를 얻었다. 이 PEG-pGlu의 글루타민산 측쇄에 대하여, 옥틸알코올을 사용한 축합 반응에 의하여 부분적으로 옥틸기 (C8H17)를 도입함으로써, 음이온성 폴리머인 PEG-pGlu (C8) 폴리머를 얻었다. 1 H-NMR에 의한 해석에서 옥틸기의 도입 수는 폴리머당 33개이었다. PEG-pGlu (C8)의 구조식을 아래에 나타낸다.
[화학식 4]
Figure 112012010388669-pct00004
PEG-pGlu (C8)의 메탄올 용액 (50 ㎎/mL) 1 mL로 양이온성의 하전 지질인 DOTAP (Avanti Polar Lipid)의 메탄올 용액 (40 ㎎/mL) 0.5 mL 및 중성의 지질인 디올레오일포스파티딜에탄올아민(이하,「DOPE」라고 표시하는 경우가 있다) (Avanti Polar Lipid)의 메탄올 용액 (40 ㎎/mL) 0.5 mL를 혼합한 후, 로타리 에바포레이터로 용매를 유거하고, 다시 하룻밤 감압 건조하였다. 얻은 고형물에 100 mM의 인산나트륨 버퍼 (pH 7.4) 2.5 mL를 가하고, 3 시간 실온에서 교반하여 현탁하였다. 이 현탁액을 초음파 처리 (130 W, 1초 펄스, 10분간) 함으로써 입자화를 실시하였다. 이 용액을 0.2 ㎛의 필터 (마이렉스 GP, 미리포아) 로 여과하여, 입자 조성물 (7)을 얻었다.
[실시예 1-8]
PEG-pG1u (C8)의 메탄올 용액 (50 ㎎/mL)의 양을 0.5 mL로 변경한 것 이외에는 실시예 1-7과 동일하게 하여 입자 조성물 (8)을 얻었다.
[실시예 1-9]
실시예 1-1에서 얻은 PEG-PBLG를 알칼리 처리함으로써, 글루타민산 측쇄의 벤질기를 탈보호하고, 폴리에틸렌글리콜-폴리 (L-글루타민산) 블록 코폴리머 (PEG-pGlu)를 얻었다. 이 PEG-pGlu의 글루타민산 측쇄에 대하여, 벤질 알코올을 사용한 축합 반응에 의하여 부분적으로 벤질기(PhCH2)를 도입함으로써, 음이온성 폴리머인 PEG-pGlu(Bn) 폴리머를 얻었다. 1H-NMR에 의한 해석으로부터, 벤질기의 도입 수는 폴리머당 34개이었다. PEG-pGlu (Bn)의 구조식을 아래에 나타낸다.
[화학식 5]
Figure 112012010388669-pct00005
PEG-pGlu (Bn)의 아세톤 용액 (50 ㎎/mL) 1 mL와, 양이온성의 하전 지질인 DOTAP (Avanti Polar Lipid)의 메탄올 용액 (40 ㎎/mL) 0.5 mL 및 중성의 지질인 디올레오일포스파티딜에탄올아민(이하,「DOPE」라고 표시하는 경우가 있다) (Avanti Polar Lipid)의 메탄올 용액 (40 ㎎/mL) 0.5 mL를 혼합한 후, 로타리 에바포레이터로 용매를 유거하고, 다시 하룻밤 감압 건조하였다. 얻은 고형물인 100 mM의 인산나트륨 버퍼 (pH 7.4) 2.5 mL를 가하고 3 시간 실온에서 교반하여 현탁시켰다. 이 현탁액을 초음파 처리 (130 W, 1초 펄스, 10분간) 함으로써, 입자화를 실시하였다. 이 용액을 0.2 ㎛의 필터 (마이렉스 GP, 미리포아)로 여과하여, 입자 조성물 (9)를 얻었다.
[실시예 1-10]
PEG-pGlu (C8)의 메탄올 용액 (50 ㎎/mL)의 양을 0.5 mL로 변경한 것 이외에는 실시예 1-7과 동일하게 하여 입자 조성물 (10)을 얻었다.
[비교예 1-1]
DOTAP를 첨가하지 않는 것 이외에는 실시예 1-1과 동일하게 하여 비교용 입자 조성물 C1를 얻었다.
[비교예 1-2]
DOTAP를 첨가하지 않는 것 이외에는 실시예 1-3과 동일하게 하여 비교용 입자 조성물 C2를 얻었다.
[비교예 1-3]
PEG-PBLG를 첨가하지 않는 것 이외에는 실시예 1-3과 동일하게 하여 비교용 입자 조성물 C3를 얻었다. 이 조성물 C3는 블록 코폴리머를 함유하지 않고, 하전 지질인 DOTAP와 중성 지질인 DOPE만을 함유한다.
[시험예 1a]
동적 광산란법에 의하여 입자 조성물 1 내지 10 및 비교용 입자 조성물 C1 내지 C3의 평균 입자 지름을 측정하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure 112012010388669-pct00006
[시험예 1b]
입자 조성물 3 내지 10 및 비교용 입자 조성물 C3에 10 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4)를 가하고, 하전 지질의 농도가 0.1 ㎎/mL가 되도록 샘플을 조제하였다. 광산란 입자 지름 측정 장치 제타사이저 ZS (Zetasizer Nano ZS, Malvern lnstruments)를 이용하여 각 샘플 (800 μL)에 대하여 제타 전위를 측정하였다. 측정에는 디스포서블 캐필러리 셀 (DTS106O, Malvern lnstruments)을 사용하고, 측정시의 온도는 25℃로 설정하였다.
표 2에 나타내는 바와 같이, 블록 코폴리머 유닛을 함유하지 않은 비교용 입자 조성물 C3에 비하여, 입자 조성물 3 내지 10에서는 제타 전위의 절대 값이 작았다. 그리고, 입자 조성물 3 내지 10에 있어서, 하전 지질에 대한 블록 코폴리머 유닛의 질량비가 높아질수록, 제타 전위의 절대 값이 작았다. 이 결과는 입자 조성물 3 내지 10의 입자 외주면이 하전 지질에 기인하는 전하를 띠는 것이 방지된 상태에 있는 것을 의미한다. 또한, 입자 조성물에 있어서의 하전 지질의 함유량이 일정하다고 하였을 경우, 친수성 폴리머 사슬 세그먼트에 의하여 구성되는 영역의 밀도가 높아질수록, 하전 지질에 기인하는 전하를 입자 외주면이 띠기 어려워지는 것도 의미한다.
[시험예 1c: 혈청 중에서의 응집성 평가]
입자 조성물로서 입자 조성물 3 내지 10 및 비교용 입자 조성물 C3를 사용하여 전술한 바와 같이 하여 조제한 측정 샘플 A 및 B로부터, 파장 700 nm의 광선에 대한 흡광도를 플레이트 리더 (POWERSCAN HT, 다이닛폰세이야쿠)에 의하여 측정하고, 혈중 응집도를 산출하였다. 또한, 얻은 값이 O 이하일 경우, 혈중 응집도는 O으로 하였다. 이 결과 및 시험예 1b에서 측정한 제타 전위의 절대 값을 표 3에 나타내는 동시에, 도 2에 제타 전위의 절대 값과 혈중 응집도와의 관계를 나타낸다.
Figure 112012010388669-pct00008
도 2 및 표 3에 나타내는 바와 같이, 입자 조성물은 제타 전위의 절대 값이 10 mV 이하, 또한 6 mV 이하, 특히 3 mV 이하의 범위에 있는 경우, 혈중 응집도가 낮았다.
〔실시예·시험예군 2: 알부민 (pH 7.4) 내포 입자 조성물〕
[실시예 2]
소 유래 알부민이 FITC (플루오레세인5-이소티오시아네이트) 표지된 알부민-FITC (Sigma Aldrich)를 20 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4)에 용해하고, 10 ㎎/mL의 용액을 형성하였다. 이 알부민 용액 0.2 mL와, 입자 조성물 (1) (40 ㎎/mL의 PEG-PBLG와 4 ㎎/mL의 DOTAP를 함유한다) 0.5 mL와, 20 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4) 0.5 mL를 혼합하여, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써, 알부민 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법으로 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 98.7 nm이었다. 또한, 알부민은 등전점 (PI)이 약 4.8이고, pH 7.4에서는 음이온성을 나타내는 생체 고분자이다.
[비교예 2-1]
입자 조성물 (1)을 대신하여 입자 조성물 2 (40 ㎎/mL의 PEG-PBLG와 4 ㎎/mL의 PA를 함유한다)를 사용한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여 알부민 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법으로 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 91.6 nm이었다.
[비교예 2-2]
입자 조성물 (1)을 대신하여 비교용 입자 조성물 C1(40 ㎎/mL의 PEG-PBLG를 함유한다)를 사용한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여 알부민 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법으로 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 118 nm 이었다.
[비교예 2-3]
입자 조성물 (1)을 대신하여 비교용 입자 조성물 C2 (40 ㎎/mL의 PEG-PBLG와 2 ㎎/mL의 DOPE를 함유한다)를 사용한 것 이외에는 실시예 2와 동일하게 하여 알부민 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법으로 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 119 nm 이었다.
[시험예 2a: 초원심에 의한 알부민의 유지성의 평가]
실시예 2, 비교예 2-1 내지 비교예 2-3에서 얻은 알부민 내포 입자 조성물의 용액 각 40 μL를, 10 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4) 36O μL와 혼합한 상태로, 초원심기 (Optima MAX Ultracentrifuge, Beckman Coulter)에 의하여 100000×g, 4℃에서 1 시간 초원심 처리하였다. 상징액에 있어서의 알부민-FITC의 형광 강도를, 플레이트 리더 (POWERSCAN HT, 다이닛폰세이야쿠)에 의하여 측정 (여기 파장 485 nm, 형광 파장 528 nm) 하고, 아래 식 (1)에 기초하여 입자 조성물에 있어서의 알부민의 유지율을 산출하였다.
(유지율) = (A-B)×100/A 식 (1)
A: 입자 조성물에 첨가한 알부민-FITC의 형광 강도
B: 상징액에 있어서의 알부민-FITC의 형광 강도
Figure 112012010388669-pct00009
표 4에 나타내는 바와 같이, 실시예 2에서는 원심 처리 후에도 94%의 알부민이 입자 내에 유지되어 있었지만, 비교예 2-1 내지 비교예 2-3에서는 원심 처리 후에 입자 내에 알부민이 잔존하지 않았다.
[시험예 2b: 겔 여과 크로마토그래피에 의한 알부민의 유지성 평가]
실시예 2 및 비교예 2-1에서 얻은 알부민 내포 입자 조성물의 용액 각 1 mL를, Sepharose CL-4B를 사용한 겔 여과 크로마토그래피에 의하여 분석하였다. 용출액을 프랙션으로 나누어 회수하고, 각 프랙션에 함유되는 알부민-FITC의 형광 강도를 플레이트 리더 (POWERSCAN HT, 다이닛폰세이야쿠)에 의하여 측정하였다 (여기 파장 485 nm, 형광 파장 528nm). 또한, 용리액으로서는, 10 mM의 HEPES 버퍼에 150 mM의 염화나트륨을 첨가한 용액 (pH 7.4)를 사용하였다.
도 3은 이 측정 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에 나타내는 바와 같이, 알부민 단체 및 비교예 2-1에서는 프랙션 20 부근에 있어서 용출 피크가 확인된 것에 대하여, 실시예 2에서는 프랙션 10 부근에서 용출 피크가 확인되었다. 이것은 비교예 2-1에 비하여 실시예 2는 알부민의 입자 내에서의 유지성이 우수하다는 것을 의미한다.
〔실시예·시험례군 3: 덱스트란 내포 입자 조성물〕
[실시예 3]
평균 분자량 20000의 덱스트란을 FITC로 표지한 덱스트란-FITC (Sigma Aldrich)를 20 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4)에 용해하고, 10 ㎎/mL의 용액을 형성하였다. 이 덱스트란 용액 O.2mL와 입자 조성물 (1) (40 ㎎/mL의 PEG-PBLG와 4 ㎎/mL의 DOTAP를 함유한다) 0.5 mL와, 20 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4) 0.5 mL를 혼합하고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써, 덱스트란 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법에 의하여 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 77.6 nm이었다. 또한, 덱스트란은 pH 7.4에 있어서 음이온성을 나타내는 생체 고분자이다.
[비교예 3-1]
입자 조성물 (1)을 대신하여 입자 조성물 2 (40 ㎎/mL의 PEG-PBLG와 4 ㎎/mL의 PA를 함유한다)를 이용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 덱스트란 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법에 의하여 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 95.4 nm이었다.
[비교예 3-2]
입자 조성물 (1)을 대신하여 비교용 입자 조성물 C1(40 ㎎/mL의 PEG-PBLG를 함유한다)을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 덱스트란 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법에 의하여 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 119 nm 이었다.
[비교예 3-3]
입자 조성물 (1)을 대신하여 비교용 입자 조성물 C2 (40 ㎎/mL의 PEG-PBLG와 4 ㎎/mL의 DOPE를 함유한다)를 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 덱스트란 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법에 의하여 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 119 nm이었다.
[시험예 3: 초원심에 의한 덱스트란의 유지성의 평가]
실시예 3, 비교예 3-1 내지 비교예 3-3에서 얻은 덱스트란 내포 입자 조성물의 용액 각 40 μL에 대하여, 시험예 2a와 동일하게 하여 상징액에 있어서의 덱스트란-FITC의 형광 강도를 측정하고, 아래 식 (2)에 기초하여 입자 조성물에 있어서의 알부민의 유지율을 산출하였다.
(유지율) = (A'-B') x100/A' 식 (2)
A': 입자 조성물에 첨가한 덱스트란-FITC의 형광 강도
B': 상징액에 있어서는 덱스트란-FITC의 형광 강도
Figure 112012010388669-pct00010
표 5에 나타내는 바와 같이, 실시예 3에서는 원심 처리 후에도 40% 가까운 덱스트란이 입자 내에 유지되어 있었지만, 비교예 3-1 내지 비교예 3-3에서는 원심 처리 후에 입자 내에 알부민이 거의 잔존하지 않았다.
〔실시예·시험예군 4: 알부민 (pH 3.3) 내포 입자 조성물〕
[실시예 4]
알부민 (소 유래, Sigma Aldrich)을 50 mM의 글리신 버퍼 (pH3)에 용해하고, 1 ㎎/mL의 용액을 형성하였다. 이 알부민 용액 2 mL와, 입자 조성물 2 (40 ㎎/mL의 PEG-PBLG와 4 ㎎/mL의 PA를 함유한다) 0.5 mL와, 20 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4) 0.5 mL를 혼합하고, pH 3.3, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써, 알부민 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법에 의하여 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 78.8 nm이었다. 또한, 알부민은 pH 3.3에서는 양이온성을 나타낸다.
[비교예 4-1]
입자 조성물 2를 대신하여 입자 조성물 (1) (40 ㎎/mL의 PEG-PBLG와 4 ㎎/mL의 DOTAP를 함유한다)을 사용한 것 이외에는, 실시예 4와 같이 하여 알부민 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법에 의하여 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 95.1 nm이었다.
[비교예 4-2]
입자 조성물 2을 대신하여 비교용 입자 조성물 C1(40 ㎎/mL의 PEG-PBLG를 함유한다)을 사용한 것 이외에는, 실시예 4와 동일하게 하여 알부민 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법에 의하여 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 115 nm 이었다.
[비교예 4-3]
입자 조성물 2을 대신하여 비교용 입자 조성물 C2 (40 ㎎/mL의 PEG-PBLG와 1 ㎎/mL의 DOPE를 함유한다)를 사용한 것 이외에는 실시예 4와 동일하게 하여 알부민 내포 입자 조성물을 형성하였다. 동적 광산란법에 의하여 구한 이 입자 조성물의 평균 입자 지름은 120 nm 이었다.
[시험예 4: 초원심에 의한 알부민의 유지성의 평가]
실시예 4, 비교예 4-1 내지 비교예 4-3에서 얻은 알부민 내포 입자 조성물의 용액 각 400 μL를, 초원심기 (Optima MAX Ultracentrifuge, Beckman Coulter)에 의하여 100000×g, 4℃에서 1시간 초원심 처리하였다. 상징액에 있어서의 알부민의 농도를, 단백질 정량 키트 BCA Protein Assay (Pierce)에 의하여 정량하고, 아래 식 (3)에 기초하여 입자 조성물에 있어서의 알부민의 유지율을 산출하였다.
(유지율) = (A"-B")×100/A" 식 (3)
A": 입자 조성물에 첨가한 알부민의 농도
B": 상징액에 있어서의 알부민 농도
Figure 112012010388669-pct00011
표 6에 나타내는 바와 같이, 실시예 4에서는 원심 처리 후에도 94%를 초과하는 알부민이 입자 내에 유지되어 있었지만, 비교예 4-1 내지 비교예 4-3에서는 원심 처리 후의 알부민의 유지율은 실시예 4에 필적할 정도로 높지는 않았다.
〔실험예·시험례군 5: siRNA 내포 입자 조성물〕
[실험예 5]
다음에 기재하는 순서에 따라서 각 입자 조성물에의 siRNA의 내포 처리를 실시하였다.
입자 조성물 3 내지 6 및 비교용 입자 조성물 C3에 대하여, 다음과 같이 하여 내포 처리를 실시하였다. siRNA를 10 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4)에 용해시키고, 20 μM의 siRNA 용액을 조제하였다. 이 siRNA 용액 250 μL에, 목적으로 하는 전하비 (+/-)를 만족하도록 농도를 조정한 입자 조성물 250 μL를 첨가하고, 혼합한 후에 4℃에서 2 시간 정치함으로써, 입자 조성물에의 siRNA의 내포 처리를 실시하였다. 또한, 「전하비 (+/-)」란, [입자 조성물에 함유되는 양이온성 지질의 양이온성기의 농도]/[핵산 중의 인산기 농도]이다. 입자 조성물 7 내지 10에 대하여는 100 μM의 siRNA 수용액 100 μL에, 입자 조성물을 279 μL 첨가하고, 혼합한 후에 4℃에서 2시간 정치함으로써, 입자 조성물에서의 siRNA의 내포 처리를 실시하였다. 이렇게 하여 얻은 siRNA 내포 입자 조성물의 전하비 (+/-)는 8이다. 또한, 입자 조성물 7 내지 10으로부터 얻은 siRNA 내포 입자 조성물은 통상적인 방법에 따라서 동결 건조 처리를 한 스톡을 작성하고, 물에 재용해시킴으로써, 후술하는 각종 시험에 사용하였다.
이하의 시험예에서 사용하는 siRNA에 대하여, 아래에서 설명한다. 이들 siRNA는 가부시키가이샤닛폰이지티를 통해서 입수할 수 있다.
·siRNA (Luc): 바다반딧불 루시페라제 유전자를 표적으로 하여 설계되고, 센스 사슬로서 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3' (서열 번호 1), 안티센스 사슬로서 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3' (서열 번호 2)를 이용하고, 통상적인 방법에 의하여 이중 사슬을 형성시킨 siRNA이다.
·siRNA (Plkl): 사람 Plkl (Polo-like kinase 1) 유전자를 표적으로 하여 설계되고, 센스 사슬로서 5'-CCAUUAACGAGCUGCUUAAdTdT-3' (서열 번호 3), 안티센스 사슬로서 5'-UUAAGCAGCUCGUUAAUGGdTdT-3' (서열 번호 4)를 사용하여 통상적인 방법에 의하여 이중 사슬을 형성시킨 siRNA이다. Plk1 유전자는 세포 분열의 M기에 있어서 중요한 키나제이다. siRNA (Plk1)는 세포 내에 도입되었을 경우에, 아포토시스를 유도한다.
· F-siRNA (Luc): siRNA (Luc)에 있어서, 서열 번호 2의 안티센스 사슬의 5' 말단에 Cy3 표지를 붙인 안티센스 사슬 (5'-Cy3-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3')을 사용하여 형성한 siRNA이다.
[시험예 5a]
시험예 5a에서는 입자 조성물로서 입자 조성물 4 및 입자 조성물 6을, 그리고 siRNA로서 siRNA (Luc)를 사용하고, 전하비가 0.5, 1, 2, 4 및 8이 되도록, 실험예 5에 나타낸 방법으로 siRNA의 내포 처리를 실시하였다. 내포 처리 후의 각 입자 조성물에 있어서의 siRNA의 내포율을, 다음과 같이 하여 전기 영동법에 의하여 분석하였다. 폴리아크릴 아미도겔 (Novex 20% TBE Gel, Invitrogen)에, 100 ng의 siRNA를 함유하는 각 입자 조성물을 로드하고, TBE 용액을 영동 버퍼로서 사용하여 인가 전압 100 V, 영동 시간 1 시간의 조건으로 영동을 실시하였다. 또한, 대조로서 100 ng의 siRNA를 동시에 영동하였다. 종료 후, 발색용 시약 SYBR (등록 상표) GreenⅡ (Invitrogen)에 의하여 염색을 실시하고, 화상 분석용 이미징 장치 Molecular Imager FX (Bio-Rad)에 의하여 화상화하였다.
도 4는 시험예 5a에 있어서의 전기 영동의 결과를 나타내는 도면이다. 도 중, 전하비 0이란 대조를 의미한다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 전하비가 2 이상인 경우, 프리의 siRNA 유래의 밴드가 확인되지 않았다. 이것은 입자 조성물 4 및 입자 조성물 6을 사용하였을 경우, 전하비가 2 이상일 때, 거의 모든 siRNA를 입자 조성물에 내포시킨 것을 의미한다. siRNA를 내포한 입자 조성물은 siRNA에 비하여 전기 영동에서의 영동도가 작아지기 때문에, siRNA가 적절히 내포되면, 대응하는 영동 레인에 있어서 프리의 siRNA에 유래하는 밴드가 검출되지 않게 된다.
[시험예 5b]
시험예 5b에서는 입자 조성물로서 입자 조성물 3 내지 10 및 비교용 입자 조성물 C3를, 그리고 siRNA로서 siRNA (Luc)를 사용하여, 전하비가 8이 되도록, 실험예 5에 나타내는 방법으로 siRNA의 내포 처리를 실시하였다. 내포 처리 후의 입자 조성물에 10 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4)를 가하고 하전 지질의 농도를 0.1 ㎎/mL로 조정하였다. 이 샘플 (800 μL)에 대하여, 광산란 입자 지름 측정 장치 Zetasizer Nano ZS (Malvern lnstruments)를 사용하여 제타 전위를 측정하였다. 측정에는 디스포서블 캐필러리 셀 (DTS1060, Malvern lnstruments)을 사용하고, 측정시의 온도는 25℃로 설정하였다.
Figure 112012010388669-pct00012
표 7에 나타내는 바와 같이, 입자 조성물 3 내지 10을 사용하여 얻은 내포 처리 입자 조성물은 제타 전위의 절대 값이 현저하게 저하되어 있고, 많은 siRNA가 내포되었다고 생각된다. 또한, 표 7에 나타내는 바와 같이 1개, 블록 코폴리머 유닛에 대한 하전 지질의 첨가 비율이 증가할수록, siRNA 내포 처리 후의 제타 전위의 저감폭이 컸다. 이는 하전 지질의 첨가 비율이 클수록, 더 많은 siRNA를 내포할 수 있다는 것을 의미한다.
[시험예 5c: MDA-MB-231 세포에 대한 활성 평가]
시험예 5c에서는 입자 조성물로서 입자 조성물 3 내지 6을 사용하고, siRNA로서 siRNA (Plk1)를 사용하여, 전하비가 8이 되도록, 실험예 5에 나타낸 방법으로 siRNA의 내포 처리를 실시하였다. 또한, siRNA 내포 입자 조성물을 사용하여, MDA-MB-231 세포에 대한 다음과 같은 활성 평가를 실시하였다. 또한, 불활성인 제어(control) 서열로서 siRNA (Luc)를 사용하여 동일한 실험을 실시하였다.
〔활성 평가〕
siRNA 내포 입자 조성물에 10 mM의 HEPES 버퍼 (pH 7.4)를 가하고 siRNA 농도를 3μM/mL로 조정하였다. 사람 유방암 유래의 MDA-MB-231 세포를, 1 웰당 세포 2000개의 비율로 96 웰의 디쉬에 두고, 24 시간 후에 각 siRNA 내포 입자 조성물을 배지에 첨가하였다. siRNA의 배지 중에서의 최종 농도는 300 nM, 100 nM, 33 nM 및 11 nM이 되도록 조정하였다. 96 시간 더 배양한 후, 세포의 생존률을 세포 수 측정 키트 Cell Counting Kit-8 (도진도사 제품)를 사용하여 평가하였다.
도 5는 이 활성 평가의 결과를 설명하기 위한 그래프이다. 도 5에 나타내는 바와 같이, siRNA (Plk1)를 내포하는 입자 조성물은 siRNA (Luc)를 내포하는 입자 조성물에 비하여 세포수의 감소가 현저하였다. 이것은 siRNA 내포 입자 조성물이 정상으로 기능한 것을 의미한다.
[시험예 5d: 혈청 중에서의 응집성 평가]
시험예 5d에서는 입자 조성물로서 입자 조성물 3 내지 10 및 비교용 입자 조성물 C3를, 그리고 siRNA로서 siRNA (Luc)를 사용하고, 전하비가 8이 되도록, 실험예 5에 나타낸 방법으로 siRNA의 내포 처리를 실시하였다. 전술한 바와 같이 하여 조제한 측정 샘플 A 및 B로부터, 파장 700 nm의 광선에 대한 흡광도를 플레이트 리더 (POWERSCAN HT, 다이닛폰세이야쿠)에 의하여 측정하고, 혈중 응집도를 산출하였다. 또한, 얻은 값이 0 이하인 경우, 혈중 응집도는 O으로 하였다.
도 6은 입자 조성물 4를 사용한 내포 처리 입자 조성물과, 비교용 입자 조성물 C3를 사용한 내포 처리 입자 조성물에 있어서의, 측정 샘플 A (FBS 있음) 및 측정 샘플 B (FBS 없음)로부터 얻은 흡광도를 나타내는 그래프이다.
도 6에 나타내는 바와 같이, 비교용 입자 조성물 C3를 사용한 내포 처리 입자 조성물에서는 FBS 처리에 의하여 흡광도가 크게 증가하였다. 이것은 혈청 성분과의 상호 작용에 의한 응집이 발생한 것을 의미한다. 입자 조성물 4를 사용한 내포 처리 입자 조성물 (siRNA 내포 입자 조성물)에서는 FBS 처리에 의한 흡광도의 증가가 거의 없었다.
도 7 및 아래의 표 8은 시험예 5b에서 측정한 내포 처리 입자 조성물의 제타 전위의 절대 값과 시험예 5d에서 측정한 내포 처리 입자 조성물의 혈중 응집도의 관계를 나타내는 그래프 및 표이다.
Figure 112012010388669-pct00013
도 7 및 표 8에 나타내는 바와 같이, 내포 처리 입자 조성물은 제타 전위의 절대 값이 5 mV 이하, 3 mV 이하, 나아가 2 mV 이하, 특히 1 mV 이하의 범위에 있는 경우, 혈중 응집도가 현저하게 낮았다.
[시험예 5e: 혈중 체류성의 평가]
시험예 5e에서는 입자 조성물로서 입자 조성물 3 내지 10을, 그리고 siRNA로서 F-siRNA (Luc)를 사용하고, 전하비가 8이 되도록, 실험예 5에 나타낸 방법으로 siRNA의 내포 처리를 실시하였다. 또한, 입자 조성물 4에 대하여는 전하비가 1, 2 및 4가 되는 siRNA의 내포 처리도 실시하였다. 얻은 siRNA 내포 입자 조성물에 대하여, 3 M의 염화나트륨 수용액을 체적비 1/20로 첨가하고, 150 mM의 염화나트륨을 함유하는 등장액 (siRNA 내포 입자 조성물 샘플)을 조제하였다. 대조로서 F-siRNA (Luc)를 pH 7.4의 10 mM의 HEPES 버퍼에 용해하여 얻은 10μM의 siRNA 용액에, 3 M의 염화나트륨 수용액을 체적비 1/20로 첨가하고, 150 mM의 염화나트륨을 함유하는 등장액 (siRNA 단체 샘플)을 조제하였다. Balb/c 마우스 (닛폰찰즈리버)의 꼬리 정맥에 siRNA 내포 입자 조성물 샘플 및 siRNA 단체 샘플을 투여하고, 그 1 시간 후에 하대 정맥으로부터 혈액 200 μL를 채취하였다. 각 샘플의 투여량은 마우스 체중에 대한 F-siRNA의 비율이 1 ㎎/㎏가 되도록 조정하였다.
입자 조성물 3 내지 6 유래의 샘플을 투여한 개체로부터 채취한 혈액에 대하여, 4℃, 2000×g으로 10 분 원심하고, 상징액으로부터 80 μL의 혈장을 얻었다. 이 혈장의 형광 강도를, 플레이트 리더 (POWERSCAN HT, 다이닛폰세이야쿠)에 의하여 측정 (여기 파장 485 nm, 형광 파장 528nm) 함으로써, 혈중에 잔존하는 F-siRNA를 정량하였다. 입자 조성물 7 내지 10 유래의 샘플을 투여한 개체로부터 채취한 혈액에 대하여, 4℃, 2000×g로 10 분 원심하고, 상청 (上淸)으로부터 100 μL의 혈장을 얻었다. 이 혈장에 세파졸 RNA I (나카라이테스크)를 1 mL 가하고 볼텍스에 의하여 교반하여, 5 분간 정치하였다. 이것에 클로로포름 200 μL를 가하고 전도 혼화한 후, 3 분 정치하였다. 이 용액을 5200×g, 4℃에서 10분 원심하여, 얻은 상청 3OO μL의 형광 강도를 플레이트 리더 (POWERSCAN HT, 다이닛폰세이야쿠)에 의하여 측정 (여기 파장 485 nm, 형광 파장 528nm) 함으로써, 혈중에 잔존하는 F-siRNA를 정량하였다.
Figure 112012010388669-pct00014
Figure 112012010388669-pct00015
표 9에 나타내는 바와 같이, 입자 조성물 3 내지 10을 사용하여 조제한 siRNA 내포 입자 조성물에서는 0.9% 이상의 F-siRNA의 혈중의 잔존이 인정되었다. 또한, siRNA 내포 입자 조성물에 있어서, 하전 지질에 대한 블록 코폴리머 유닛의 질량비가 높아질수록 F-siRNA의 잔존율이 높았다. 이것은 입자 조성물에 있어서의 하전 지질의 함유량이 일정하다고 하였을 경우, 친수성 폴리머 사슬 세그먼트에 의하여 구성되는 영역의 밀도가 증가할수록, 혈중에 있어서 약제를 입자 내에 유지할 수 있는 기간이 길어지는 것을 의미한다. 또한, 제타 전위의 절대 값이 낮은 샘플일수록 F-siRNA의 잔존량은 높고, 제타 전위의 절대 값이 0.37 mV인 입자 조성물 (7)을 사용한 샘플에서의 F-siRNA 잔존량은 37.9%이고, 제타 전위의 절대 값이 0.57 mV인 입자 조성물 (9)을 사용한 샘플에서의 F-siRNA 잔존량은 15.5%이었다. 또한, 표 10에 나타내는 바와 같이, siRNA 내포 입자 조성물에 있어서 전하비가 높아질수록, F-siRNA의 잔존율이 높았다. 이것은 하전 지질의 첨가 비율이 클수록, 혈중에 있어서 약제를 입자 내에 유지할 수 있는 기간이 길어지는 것을 의미한다.
입자 조성물로서 입자 조성물 (6)을, siRNA로서 siRNA (Luc)를 사용하여, 전하비가 1.5가 되도록 실험예 5에 나타내는 방법으로 siRNA의 내포 처리를 실시한 샘플에 대하여, 시험예 5b에 기재한 방법으로 제타 전위를 측정하였더니, 그 절대 값은 0.36 mV으로 입자 조성물 (7)을 사용한 샘플과 거의 동등하였다. 그런데, 입자 조성물 (6)에 대하여, 시험예 5e에 나타낸 방법으로, siRNA로서 F-siRNA (Luc)를 사용하여 내포 처리를 실시한 샘플 (제타 전위: 0.36 mV)에 대하여, 혈중 체류성 평가를 실시한 바, F-siRNA의 잔존량은 0.91%이었다. 즉, 입자 조성물 (7)을 사용한 샘플은 입자 조성물 (6)을 사용한 샘플에 비하여, 제타 전위의 절대 값은 동일한 정도이면서도, 내포 약물의 혈중 체류성이 현저하게 우수하였다. 이와 같이, 입자 조성물을 음이온성 폴리머로 구성함으로써, 중성 폴리머에 의하여 입자 조성물을 구성한 경우에 비하여, 내포 약물의 혈중 체류성을 큰 폭으로 향상시킬 수 있다.
[시험예 5f: 장기 이행성의 평가]
시험예 5f에서는 입자 조성물로서 입자 조성물 3 및 비교용 입자 조성물 C3을, 그리고 siRNA로서 F-siRNA (Luc)를 사용하고, 전하비가 8이 되도록, 실험예 5에 나타낸 방법으로 siRNA의 내포 처리를 실시하였다. 내포 처리 후의 입자 조성물에 대하여, 3M의 염화나트륨 수용액을 체적비 1/20로 첨가하고, 150 mM의 염화나트륨을 함유하는 등장액 (내포 처리 입자 조성물 샘플)을 조제하였다. Balb/c 누드 마우스 (암컷, 5주령, 닛폰찰즈리버)에 사람 유방암 유래의 MDA-MB-231 세포를 이식하였다. 4주 후에 종양 사이즈가 200 ㎣ 이상이 된 마우스에 대하여, 내포 처리 입자 조성물 샘플을 투여하였다. 투여한 F-siRNA의 양은 마우스의 체중에 대하여 1 ㎎/㎏가 되도록 하였다. 투여로부터 10분 후, 60분 후 및 180 분 후에 각 장기 50 내지 100 ㎍를 채취하고, 각각 RNA 추출 시약 세파졸 RNAI (나카라이테스크) 1 mL를 가하고 호모디나이즈하였다. 각 호모디네이트 500 μL에 대하여 클로로포름 100 μL를 가하고 4℃, 5200 G에서 10 분 원심한 후, 상징액 200 μL의 형광 강도를, 플레이트 리더 (POWERSCAN HT, 다이닛폰세이야쿠)에 의하여 측정 (여기 파장 485 nm, 형광 파장 528nm) 하고, 각 장기 중에서 이행한 F-siRNA를 정량하였다.
Figure 112015064896564-pct00028
도 8은 시험예 5f로 조사한 약물의 장기 이행성을 설명하기 위한 그래프이다.
도 7 및 표 11에 나타내는 바와 같이, 비교용 입자 조성물 C3를 사용하여 얻은 내포 처리 입자 조성물의 경우에는, 신속하게 혈중으로부터 소실되어, 폐로의 현저한 집적이 인정되었다. 한편, 입자 조성물 (4)를 사용하여 얻은 siRNA 내포 입자 조성물의 경우에는 더 길게 혈중에 체류하는 동시에, 종양으로의 이행도 인정되었다.
산업상 이용 가능성
본 발명의 입자 조성물을 약물 담체로서 사용하고, 약물을 내포시켜 의약 조성물로 함으로써, 약물 (특히, 고분자 화합물)을 생체 내에서 더 유효하게 유지할 수 있고 분해나 배설로부터 보호할 수 있다. 또한, 활성을 유지한 채로 약물을 환부에 송달할 수 있다. 또한, 혈중 성분과의 상호 작용에 의한 약물 담체의 응집을 회피할 수 있다. 이에 의하여 약물의 유효 이용율이 한층 개선되고, 투여량이 대폭적인 저감에 의한 의료 경제상의 개선이나 효과적인 약리 작용의 발현이 기대된다. 투여량의 저감은 단백질이나 핵산 등에 대한 면역 응답의 야기나 혈액 응고계에 대한 영향 등의 부작용의 억제 등의 관점에서도 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> NanoCarrier Co., Ltd. <120> PARTICULE COMPOSITION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> Y660-PCT <150> JP2009-200681 <151> 2009-08-31 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> a sense strand of a double-strand siRNA designed to target Firefl y luciferase gene <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n stands for deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n stands for deoxythymidine <400> 1 cuuacgcuga guacuucgan n 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> an antisense strand of a double-strand siRNA designed to target f irefly luciferase gene <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n stands for deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n stands for deoxythymidine <400> 2 ucgaaguacu cagcguaagn n 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> a sense strand of a double-strand siRNA designed to target Human Polo-like kinase 1 gene <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n stands for deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n stands for deoxythymidine <400> 3 ccauuaacga gcugcuuaan n 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> an antisense strand of a double-strand siRNA designed to target H uman Polo-like kinase 1 gene <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n stands for deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n stands for deoxythymidine <400> 4 uuaagcagcu cguuaauggn n 21

Claims (12)

  1. 소수성 폴리머 사슬 세그먼트와 친수성 폴리머 사슬 세그먼트를 가진 블록 코폴리머 유닛을 함유하되, 복수의 상기 블록 코폴리머 유닛은 상기 소수성 폴리머 사슬 세그먼트를 내측으로 향하게 하는 동시에, 상기 친수성 폴리머 사슬 세그먼트는 외측으로 향하게 한 상태로 방사상으로 배치된 입자 조성물로서,
    내포시킬 약물의 전하와는 반대의 전하를 띤 복수의 하전 지질을 더 가지고, 이 하전 지질과의 정전 결합에 의하여 내포시킬 약물을 입자 내에 유지하는 한편, 이 하전 지질이 상기 소수성 폴리머 사슬 세그먼트측에 끌어당겨진 상태로 배치되는 것에 의하여, 상기 하전 지질과는 반대의 전하를 띤 대전성 물질을 유인할 수 있는 전하를 입자 외주면이 띠는 것이 방지되며,
    상기 입자 조성물은 내포시킬 약물로서, 단백질 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생체 고분자에 적용되고, 상기 친수성 폴리머 사슬 세그먼트는 폴리에틸렌글리콜 사슬이며, 상기 소수성 폴리머 사슬 세그먼트는 음이온성 폴리아미노산 폴리머 사슬 세그먼트이고,
    하전 지질에 대한 블록 코폴리머 유닛의 비율은 질량비로 표시하여 1.0 이상이며,
    pH가 7.4인 10 mM의 HEPES 버퍼 용액에, 상기 입자 조성물에 함유되는 상기 하전 지질의 총량이 1 mL인 해당 버퍼 용액당 0.1 ㎎이 되도록 첨가한 경우에 측정되는 제타 전위의 절대 값은 15 mV 이하의 범위로 제어되는 것인 입자 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하전 지질은 입자 조성물의 둘레 방향에 있어서 서로 연속하는 상태로 배치되어 있지 않고, 입자 조성물의 둘레 방향에 있어서 인접하는 상기 블록 코폴리머 유닛 사이에 개재하도록 배치되는 것에 의하여, 입자 조성물의 둘레 방향에 있어서 인접하는 하전 지질간의 접촉이 상기 블록 코폴리머 유닛에 의하여 분단된 상태에 있는 입자 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈중에 있어서의 응집이 방지된 것인 입자 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제타 전위의 절대 값이 3 mV 이하의 범위로 제어된 상태에 있는 것에 의하여, 혈중에 있어서의 응집이 더욱 방지된 입자 조성물.
  9. 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 입자 조성물 및 이 입자 조성물에 내포된 상기 하전 지질과는 반대의 전하를 띤 약물을 포함하는 의약 조성물로서, 상기 약물은 단백질 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생체 고분자를 포함하는 것인 의약 조성물.
  10. 제9항에 있어서, pH가 7.4인 10 mM의 HEPES 버퍼 용액에, 상기 입자 조성물에 함유되는 상기 하전 지질의 총량이 1 mL의 이 버퍼 용액당 0.1 ㎎이 되도록 첨가하였을 경우에 측정되는 제타 전위의 절대 값이 10 mV 이하의 범위로 제어된 상태에 있는 것에 의하여, 혈중에 있어서의 응집이 방지된 의약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제타 전위의 절대 값이 2 mV 이하의 범위로 제어된 상태에 있는 것에 의하여, 혈중에 있어서의 응집이 더욱 방지된 의약 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 소수성 폴리머 사슬 세그먼트가 음이온성 폴리머 사슬 세그먼트로 구성되어 있는 것에 의하여, 약물의 혈중 체류성이 향상된 상태에 있는 의약 조성물.
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