KR101683463B1 - Microbubble-Liposome-Melanine nanoparticle complex and Contrast agent comprising the same - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로버블; 상기 마이크로버블과 공유결합된 리포좀; 상기 리포좀의 표면에 부착되고 상자성 금속이온이 결합된 멜라닌 나노입자; 및 상기 마이크로버블 또는 리포좀 표면에 부착된 타겟팅 리간드를 포함하는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체, 이를 포함하는 조영제 및 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체에 MR 조영제 및 종양 타겟팅 리간드(tumor targeting ligand)를 붙여서 특정 단백질이 발현된 종양에 선택적으로 복합체가 부착되고, 외부의 초음파 에너지에 의하여 선택적으로 암세포, 줄기세포 등 특정 세포내로 전달되는 원리를 이용하여 선택적인 MR 조영제의 역할을 한다. 또한, 본 발명에 사용된 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체의 내부에는 유전자 치료제나 항암제 등의 물질을 포함시킴으로써 MR 조영제의 효과와 동시에 치료제를 특정 단백질이 발현된 종양 세포에 선택적으로 전달하는 작용을 할 수 있다.The present invention relates to microbubbles; Liposomes covalently bonded to the microbubbles; Melanin nanoparticles attached to the surface of the liposome and bound to paramagnetic metal ions; And a targeting ligand attached to the surface of the microbubble or liposome, a contrast agent containing the same, and a pharmaceutical composition.
According to the present invention, an MR conjugate and a tumor targeting ligand are attached to a microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex to selectively attach a complex to a tumor expressing a specific protein, Cancer cells, stem cells, etc., which are transmitted to specific cells. In addition, the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex used in the present invention contains a substance such as a gene therapy agent or an anti-cancer agent to selectively deliver a therapeutic agent to a tumor cell expressing a specific protein at the same time as the effect of the MR contrast agent can do.

Description

마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체 및 이를 포함하는 조영제 {Microbubble-Liposome-Melanine nanoparticle complex and Contrast agent comprising the same}Microbubble-liposome-melanin nanoparticle complexes and contrast agents containing same (Microbubble-Liposome-Melanine nanoparticle complex and Contrast agent comprising the same)

본 발명은 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체에 관한 것으로, 구체적으로 마이크로버블; 상기 마이크로버블과 공유결합된 리포좀; 상기 리포좀의 표면에 부착되고 상자성 금속이온이 결합된 멜라닌 나노입자; 및 상기 마이크로버블 또는 리포좀 표면에 부착된 타겟팅 리간드를 포함하는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체, 이를 포함하는 조영제 및 약학 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to microbubble-liposome-melanin nanoparticle complexes, and more particularly to microbubble-liposome-melanin nanoparticle complexes. Liposomes covalently bonded to the microbubbles; Melanin nanoparticles attached to the surface of the liposome and bound to paramagnetic metal ions; And a targeting ligand attached to the surface of the microbubble or liposome, a contrast agent containing the same, and a pharmaceutical composition.

치료진단 물질(theranostic materials)의 주요 장점 중 하나는 다중 기능을 동시에 수행하는 그 능력이다. 단일 입자는 질병을 진단하고 영향 받은 세포를 이미징 및 타겟팅 하는 데에 사용될 수 있다 (X. Xie, et al. Adv . Drug Deliv . Rev. 2010, 62, 1064; H. L. Liu, et al. Theranostics 2014, 4, 432). 현재까지, 개발된 대부분의 유기, 무기 및 화합물 치료진단 제제들은 자기 나노입자, 양자점(quantum dots) 및 새로운 금속 기질들을 포함한다. 이러한 치료진단 제제들은 다양한 매력적인 특성들, 즉 연장된 순환시간(circulation time)으로 인한 증가된 생물학적 가용성, 증가된 투과성과 잔류 효과(enhanced permeability and retention (EPR) effect)로 인한 선택적 종양 축적 (H. Xiao, et al. J. Control Release 2014, 10, 173; G. Shi, et al. Adv . Healthc Mater. 2014, 3, 142), 및 현존하는 검출 양상들과의 이미징 호환성 (예컨대, 자기공명영상 또는 광학적 여기)을 나타내긴 하지만, 이들의 임상적인 해석은 어려운 일로 남아있다. 구성 물질들 (특히 무기 나노입자들)의 잠재적인 독성은 상당한 안전 문제와 독성학적 징후를 일으키는데, 이들 모두는 임상 적용에 앞서 조심스럽게 다루어질 필요가 있다 (A. Gojova, et al. Environ, Health Perspect. 2007, 115, 403; A. Sarkar, et al. J. Nanosci . Nanotechnol. 2014, 14, 730).One of the main advantages of theranostic materials is their ability to perform multiple functions simultaneously. Single particles can be used to diagnose disease and to imaging and targeting affected cells (X. Xie, et al. Adv . Drug Deliv . Rev. 2010, 62, 1064; HL Liu, et al. Theranostics 2014, 4, 432). To date, most of the organic, inorganic and compound therapeutic diagnostic agents developed include magnetic nanoparticles, quantum dots and new metal substrates. These therapeutic diagnostic agents have a variety of attractive properties: increased biological availability due to prolonged circulation time, selective tumor accumulation due to enhanced permeability and retention (EPR) effects (H. Xiao, et al., J. Control Release 2014, 10, 173; G. Shi, et al. Adv . Healthc Mater . 2014, 3, 142), and imaging compatibility with existing detection patterns (e.g., magnetic resonance imaging or optical excitation), their clinical interpretation remains challenging. The potential toxicity of constituent materials (especially inorganic nanoparticles) results in significant safety concerns and toxicological indications, all of which need to be handled carefully prior to clinical application (A. Gojova, et al., Environ, Health Perspect . 2007, 115, 403; A. Sarkar, et al. J. Nanosci . Nanotechnol . 2014, 14, 730).

마이크로버블(microbubbles, MBs) 및 리포좀(liposomes, Lipos)은 암 진단 및 치료를 위한 생체적합성 물질로 부상하고 있으며, 따라서 전통적인 치료진단 제제들에 대한 더 안전한 대안으로 제시되고 있다 (S. Capece, et al. Chem . Commun. 2013, 49, 5763; H. Cho, et al. Nanomedicine 2014, 10, 619). 복합체로서 MBs와 Lipos를 커플링함으로써, 이러한 개념의 물질은 세포들의 동시 초음파(US) 이미징 뿐만 아니라, 치료 물질의 매우 효율적인 타겟 전달을 달성하는 것으로 알려져 있다 (S. P. Wrenn, et al. Theranostics 2012, 2, 1140). 또한, 초상자성 무기물 산화철 나노입자들을 도입하는 경우, 그 집합체는 자기공명(MR) 및 US 이미징 모두에서 이중 조영을 제공하였다 (F. Yang, et al. Biomaterials 2009, 30, 23). 이러한 제형이 다중 모델 이미징을 가능하게 하지만, 무기입자들의 도입은 전통적인 치료진단 제제들과 마찬가지로, 그 생체적합성을 감소시키고 임상적 가능성 제한한다.Microbubbles (MBs) and liposomes (Lipos) are emerging as biocompatible materials for cancer diagnosis and treatment and are therefore presented as safer alternatives to traditional therapeutic diagnostic agents (S. Capece, et Chem . Commun ., 2013, 49, 5763, H. Cho, et al., Nanomedicine 2014, 10, 619). By coupling MBs and Lipos as a complex, this conceptual substance is known to achieve highly efficient target delivery of therapeutic agents as well as simultaneous ultrasound (US) imaging of cells (SP Wrenn, et al. Theranostics 2012, 2 , 1140). In addition, when introducing superparamagnetic iron oxide nanoparticles, the aggregate provided double contrast in both magnetic resonance (MR) and US imaging (F. Yang, et al. Biomaterials 2009, 30, 23). Although such formulations enable multi-model imaging, the introduction of inorganic particles, like traditional therapeutic diagnostic agents, reduces its biocompatibility and limits its clinical potential.

본 발명에서는, 이중(dual) US-MR 이미징 뿐만 아니라 강화된 유전자 전달을 가능하게 하는 MB, Lipo, 및 Fe^{3 +} 이온-킬레이팅된 멜라닌 나노입자(melanin nanoparticles, MNPs)를 포함하는, 완전히 생체 적합성이고 다중기능의 하이브리드 복합체를 제시한다. MNPs의 높은 Fe^{3 +} 로딩 용량(loading capacity)을 활용함에 따라, 그 결과로서 생기는 복합체는 생체적합성 케미컬(chemicals)에서만 MR 조영을 나타낸다 (K. Y. Ju, et al. Biomacromolecules 2013, 14, 3491). 또한 본 발명에서는 항체로 하이브리드 입자들을 기능화하여, 1) 종양세포에 대한 제제(agents)의 특이적 타겟팅, 및 2) 연결된 MNPs와 Lipo의 세포로의 US-자극된 전달을 확인하였다. 높은 음압(US flash)의 국부적인 적용 후, 본 발명자들은 MRI 시그널과 함께, 내재화된 MNP 및 Lipo 입자들의 치료 효과의 향상을 확인하였다.
In the present invention, it is possible to obtain a completely US-MR imaging, including MB, Lipo, and Fe ^{3 +} ion-chelated melanin nanoparticles (MNPs), which enable enhanced gene transfer as well as dual US- Hybrid, hybrid and multi-functional hybrid. As the advantage of the high Fe ^{3 +} loading capacity (loading capacity) of MNPs, complex occurs as a result shows a MR contrast only biocompatible chemicals (chemicals) (KY Ju, et al. Biomacromolecules 2013, 14, 3491). In the present invention, the hybrid particles are also functionalized with antibodies to 1) specific targeting of agents to tumor cells, and 2) US-stimulated delivery of the linked MNPs to Lipo cells. After local application of high sound pressure (US flash), the inventors have confirmed the enhancement of the therapeutic effect of the internalized MNP and Lipo particles, together with the MRI signal.

따라서 본 발명의 목적은, 향상된 MR 조영 효과와 함께, 형광 및 초음파(US) 영상 분석이 가능한, 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 제공하는데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide microbubble-liposome-melanin nanoparticle complexes capable of fluorescence and ultrasound (US) image analysis with improved MR imaging effect.

본 발명의 다른 목적은, 상기 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 포함하는 형광, 초음파 및 자기공명(MR)에 대한 다중 모드(multi-modal) 분석용 조영제를 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a multi-modal contrast agent for fluorescence, ultrasound, and magnetic resonance (MR) including the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체와, 치료 유전자 또는 약물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex and a therapeutic gene or drug as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은, 암세포 특이적이고 형광, 초음파 및 자기공명에 대한 다중 모드 이미징이 가능한 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체의 제조방법을 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a method for producing a microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex which is specific for cancer cells and capable of multimodal imaging for fluorescence, ultrasound and magnetic resonance.

본 발명의 또 다른 목적은, 현재까지 병리학적인 조직 검사에 의존하였던 조직이나 특정세포의 단백질의 발현을 영상학적으로 분석할 수 있는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체의 제조방법을 제공하는데 있다.
It is another object of the present invention to provide a method for preparing a microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex capable of imaging the expression of a tissue or a specific cell protein that has relied on pathological histology.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로버블; 상기 마이크로버블과 공유결합된 리포좀; 상기 리포좀의 표면에 부착되고 상자성 금속이온이 결합된 멜라닌 나노입자; 및 상기 마이크로버블 또는 리포좀 표면에 부착된 타겟팅 리간드를 포함하는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a microbubble; Liposomes covalently bonded to the microbubbles; Melanin nanoparticles attached to the surface of the liposome and bound to paramagnetic metal ions; And a microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex comprising a targeting ligand attached to the surface of the microbubble or liposome.

본 발명에서, 상기 복합체는 소수성인 마이크로버블과 친수성인 나노리포좀이 하이브리드 반응을 통해 결합되고, 상기 리포좀의 외부에 멜라닌 나노입자가 결합되어 있으며, 상기 복합체 외부에 항체 등의 타겟팅 분자(targeting molecules)가 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the complex comprises a hydrophobic microbubble and a hydrophilic nanoliposome bound to each other through a hybrid reaction, melanin nanoparticles bonded to the outside of the liposome, targeting molecules such as an antibody to the outside of the complex, Are combined with each other.

본 발명의 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자는 도 1에 나타낸 바와 같이 평균 직경 약 1.3 μm의 균일한 입자 크기를 갖는 구형의 소수성 마이크로버블 구조 외부에 약 200 nm 크기의 친수성 지질 구조체인 나노리포좀이 표면에 결합되어 있는 복합체에 상자성 금속이온이 도핑된(doped) 멜라닌 나노입자가 결합되어 있는 형태로서 약 1.7 μm의 크기의 입자이다. 상기 마이크로버블의 내부에는 SF₆, CO₂ 또는 CF₄ 등의 소수성의 기체가 내포되어 있다. As shown in FIG. 1, the microbubble-liposome-melanin nanoparticles of the present invention are nanoparticles of a hydrophilic lipid structure having a size of about 200 nm on the outside of a spherical hydrophobic microbubble structure having a uniform particle size of about 1.3 μm in average diameter It is a particle with a size of about 1.7 μm with a combination of doped melanin nanoparticles attached to the complex bound to the surface. The inside of the micro bubble contains a hydrophobic gas such as SF ₆ , CO ₂ or CF ₄ .

본 발명에서, 상기 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체는 본 명세서 또는 도면에서 ‘MB-Lipo-MNP(Fe)’ 또는 ‘ML-MNP(Fe)’ 이라는 용어로도 표현된다.
In the present invention, the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex is also expressed in the present specification or in the figures as "MB-Lipo-MNP (Fe)" or "ML-MNP (Fe)".

본 발명에 있어서, 상기 복합체는 바람직하게 평균 직경 1-2 μm의 균일한 크기를 나타낼 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 복합체 제조 시 리포좀의 사용 농도 및 여과 방법에 따라 100 nm 내지 10 μm로 입자크기를 조절할 수 있다. 또한, 이러한 입자크기는 현재 상용화 되어 있는 초음파 기기의 주파수에 맞춰 다양화시킬 수 있는데, 사용되는 초음파 기기의 주파수가 높아지면 복합체의 평균 직경은 작아질 수 있다.
In the present invention, the complex may preferably exhibit a uniform size of 1 to 2 μm in average diameter, but it is not limited thereto, and may be a particle size ranging from 100 nm to 10 μm according to the concentration and the filtration method of the liposome during the preparation of the complex Can be adjusted. These particle sizes can be varied according to the frequency of the currently commercialized ultrasonic devices. If the frequency of the ultrasonic devices used increases, the average diameter of the complexes can be reduced.

본 발명에 있어서, 상기 마이크로버블은 인지질 화합물과 콜레스테롤의 혼합물을 필름 형성 및 기계적 진동을 동반한 소수성 가스의 버블링에 의해 합성될 수 있다.In the present invention, the microbubbles may be synthesized by bubbling a mixture of a phospholipid compound and cholesterol with a hydrophobic gas accompanied by film formation and mechanical vibration.

본 발명의 구현예에 따르면, 상기 마이크로버블은 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물, 아민기를 갖는 화합물 및 다이설파이드기를 갖는 화합물을 이용하여 제조될 수 있으며, 이때 필름형성물질로는 DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), DDPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 등이; 인지질로는 콜레스테롤(cholesterol) 등이; 음전하 화합물로는 DCP (dicetyl phosphate), DEPA (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate), DLPA (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate), DMPA (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate) 또는 DOPA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate) 등이; 아민기를 갖는 화합물로는 DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE (1,2-dierucoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 등이; 그리고 다이설파이드기를 갖는 화합물로는 DSPE-PEG-SPDP {1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000]} 등이 사용될 수 있다.
According to embodiments of the present invention, the microbubbles may be prepared using film forming materials, phospholipids, negative charge compounds, compounds having amine groups, and compounds having disulfide groups, wherein the film forming materials include DPPC (1,2 -dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), DDPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC 2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1,2-dimyristoyl- , 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, or DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine); Phospholipids include cholesterol and the like; Examples of negative charge carriers include DCP (dicetyl phosphate), DEPA (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate), DLPA (1,2-dilauroyl- dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate or DOPA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate); Examples of the compound having an amine group include 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE), 1,2-dierucoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (DLPE) 3-phosphoethanolamine, DMPE (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) or DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine); And DSPE-PEG-SPDP {1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N- [PDP (polyethylene glycol) -2000]] may be used as the compound having a disulfide group.

본 발명에 있어서, 상기 리포좀은 인지질 화합물과 콜레스테롤의 혼합물을 필름 형성, 초음파 처리 및 압출을 통해 제조될 수 있다.In the present invention, the liposome may be prepared by film formation, ultrasonic treatment and extrusion of a mixture of a phospholipid compound and cholesterol.

본 발명의 구현예에 따르면, 상기 리포좀은 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물 및 아민기를 갖는 화합물을 이용하여 제조될 수 있으며, 이때 필름형성물질로는 DPPC (1,2-dipalmitory-snglycero-3-phosphatidylcholine), DDPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 등이; 인지질로는 콜레스테롤(cholesterol) 등이; 음전하 화합물로는 DCP (dicetyl phosphate), DEPA (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate), DLPA (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate), DMPA (1,2-dimyristoylsn-glycero-3-phosphate) 또는 DOPA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate) 등이; 그리고 아민기를 갖는 화합물로는 DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine) 또는 DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 등이 사용될 수 있다.
According to an embodiment of the present invention, the liposome may be prepared using a film-forming substance, a phospholipid, a negative charge compound and a compound having an amine group, wherein the film forming material is 1,2-dipalmitory-snglycero-3- phosphatidylcholine, DDPC, 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DEPC phosphocholine, 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC (1,2- dioleoyl- 3-phosphocholine or DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine); Phospholipids include cholesterol and the like; Examples of negative charge carriers include DCP (dicetyl phosphate), DEPA (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate), DLPA (1,2-dilauroyl- dimyristoylsn-glycero-3-phosphate or DOPA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate); Examples of compounds having an amine group include 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE), 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DLPE), 1,2- glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine) or DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine).

본 발명에 있어서, 상기 마이크로버블과 리포좀의 하이브리드는 pH, 반응온도 또는 반응시간 등의 조절을 통해 마이크로버블의 지질구조체 또는 나노리포좀의 지질구조체의 일부분을 변형하여 진탕반응시킴으로써 간단하게 공유결합을 유도하여 형성될 수 있다.
In the present invention, the hybrid of microbubbles and liposomes can be produced by modifying a lipid structure of a microbubble or a lipid structure of a nanoliposome by controlling pH, reaction temperature or reaction time, .

본 발명에 있어서, 상기 마이크로버블 또는 리포좀은 내부에 하나 이상의 형광물질을 포함할 수 있다. 상기 형광물질로는 임상 진단에 사용될 수 있는 소수성 또는 친수성 형광물질이라면 어느 것이든 사용할 수 있으며, 예를 들면 FITC, 텍사스 레드(Texas-red). RITC, Cy3, Cy5 또는 Cy7 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 형광물질들은 통상적인 방법에 따라 소수성을 갖는 형광물질인 경우 마이크로버블과, 친수성을 갖는 형광물질인 경우 나노리포좀과 30℃에서 교반 또는 초음파분산(sonication)시켜 담지시킬 수 있다.
In the present invention, the microbubble or liposome may contain at least one fluorescent substance therein. As the fluorescent material, any hydrophobic or hydrophilic fluorescent material that can be used for clinical diagnosis can be used. For example, FITC, Texas-red. RITC, Cy3, Cy5, or Cy7 may be used, but the present invention is not limited thereto. Such fluorescent materials can be supported by micro bubbles in the case of a fluorescent substance having hydrophobicity and nanoriposomes in the case of a fluorescent substance having hydrophilic property by stirring or ultrasonic dispersion (sonication) at 30 캜 according to a conventional method.

본 발명에 있어서, 상기 ‘멜라닌’은 식물, 동물, 원생생물 등 여러 생명체들의 다양한 부위에 존재하는 생물학적 고분자를 의미하며, 일반적으로 흑갈색의 유멜라닌(Eumelanin)과 황적색의 페오멜라닌(pheomelanin)으로 분류된다. 본 발명에서는 멜라닌 나노입자를 사용하는 것으로, 멜라닌 나노입자의 직경은 30 nm 내지 600 nm이며, 바람직하게는 30 nm 내지 200 nm 이다.In the present invention, the term 'melanin' refers to a biological polymer present in various parts of various living things such as plants, animals, protists, etc., and generally classified into eumelanin of dark brown color and pheomelanin of yellowish red color do. In the present invention, melanin nanoparticles are used, and the diameter of the melanin nanoparticles is 30 nm to 600 nm, preferably 30 nm to 200 nm.

본 발명에 있어서, 상기 멜라닌 나노입자(melanine nanoparticle, MNP)는 자연계에서 추출하거나, 또는 화학적으로 합성하여 제조할 수 있다. 자연계에서 추출하는 경우에는, 오징어 먹물로부터 원심분리하여 회수할 수 있다. 화학적으로 합성하는 경우에는, dopamine, DOPA 또는 cysteine의 멜라닌 전구체로부터 합성될 수 있다. In the present invention, the melanin nanoparticle (MNP) may be extracted from nature or chemically synthesized. In the case of extraction in a natural environment, it can be recovered by centrifugation from squid ink. When chemically synthesized, it can be synthesized from melamine precursors of dopamine, DOPA or cysteine.

하나의 예로서, 상기 멜라닌 나노입자는 멜라닌 전구체인 도파민의 자발적인 산화 및 중합반응으로부터 합성될 수 있다. 예들 들어,As an example, the melanin nanoparticles can be synthesized from the spontaneous oxidation and polymerization of dopamine, a melanin precursor. For example,

하기 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:Which can be prepared by a process comprising the following steps:

1) 도파민·H⁺X^-를 포함하는 용액에 염기를 첨가하여 중화반응하는 단계, 및 1) dopamine · H ⁺ X ^- the step of neutralization by adding a base to the solution containing, and

2) 상기 단계 1)의 용액의 도파민을 중합하는 단계,2) polymerizing dopamine in the solution of step 1)

여기서, 상기 도파민·H⁺X^-과 염기의 몰비는 1:0.1 내지 1:1이다.
Here, the molar ratio of the dopamine · H ⁺ X ^- to the base is 1: 0.1 to 1: 1.

상기 단계 1은 도파민·H⁺X^-를 염기와 반응시켜 중화시키는 단계로서, 상기 도파민·H⁺X^-과 염기의 몰비를 1:0.1 내지 1:1로 조절하면 멜라닌을 일정한 형상을 갖는 나노입자의 형태로 제조할 수 있다. 상기 단계 2는, 염기로 중화시킨 후 중합시켜 멜라닌 나노입자를 제조하는 단계이다.The step 1 is a dopamine · H ⁺ X ^- with a base and a step of reaction by neutralizing the dopamine · H ⁺ X ^- and the molar ratio of the base from 1: 0.1 to 1: Nano having Adjust to 1 constant melanin-like particle Can be prepared. Step 2 is a step of neutralizing with a base and then polymerizing to prepare melanin nanoparticles.

상기 X^-는 할라이드 이온, HSO₄ ^-, NO₃ ^-, H₂PO₄ ^- 및 CH₃COO^-로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 염기는 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 토금속 수산화물, 알칼리 금속의 탄산염, 알칼리 토금속의 탄산염, 알칼리 금속의 중탄산염, 알칼리 토금속의 중탄산염, 알칼리 금속의 아세트산염, 알칼리 금속의 인산염, 알칼리 금속 알콕사이드(탄소수 1 ~ 20), 암모니아, 암모니아수 및 아민으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The X ^- may be selected from the group consisting of halide ions, HSO ₄ ^- , NO ₃ ^- , H ₂ PO ₄ ^- and CH ₃ COO ^- . The base may be selected from the group consisting of alkaline metal hydroxides, alkaline earth metal hydroxides, carbonates of alkali metals, carbonates of alkaline earth metals, bicarbonates of alkali metals, bicarbonates of alkaline earth metals, acetates of alkali metals, phosphates of alkali metals, ~ 20), ammonia, ammonia water, and amines.

상기의 제조방법으로 제조된 멜라닌 나노입자의 경우, 자연계에서 추출한 멜라닌 나노입자와 비교하여, 입자의 형상이 보다 균일하고, 물에 보다 잘 분산되는 특징이 있다.
In the case of the melanin nanoparticles prepared by the above-described method, the shape of the particles is more uniform and more dispersed in water than the melanin nanoparticles extracted from nature.

본 발명에 있어서, 상기 상자성 금속이온은 핵자기 공명 영상을 나타내는 물질을 의미하는 것으로, 내부에 존재하고 있던 Unpaired Spin들이 평소 때는 열운동에 의한 불규칙적 스핀배열을 보이고 있다가 외부자기장이 걸리면 그 영향으로 인하여 일정방향으로 스핀정렬이 일어나게 되는 결과, 평소에는 자성을 띄지 않다가 외부자기장을 걸어 주었을 경우 자기장 방향으로 자화되는 특성을 가지는 물질을 의미한다. 이의 예로, 가돌리늄(Gd), 철(Fe), 망간(Mn), 니켈(Ni), 구리(Cu), 에르븀(Er), 유로퓸(Eu), 홀뮴(Ho) 및 크롬(Cr)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 금속의 이온을 사용할 수 있다.In the present invention, the paramagnetic metal ion refers to a material showing a nuclear magnetic resonance image. Unpaired spins existing in the inner part exhibit an irregular spin arrangement due to thermal motion in an ordinary state. However, when an external magnetic field is applied, As a result, spin alignment occurs in a certain direction, which means a material which is not magnetized normally but is magnetized in the magnetic field direction when an external magnetic field is applied. Examples thereof include a group consisting of gadolinium (Gd), iron (Fe), manganese (Mn), nickel (Ni), copper (Cu), erbium (Er), europium (Eu), holmium (Ho) May be used as the metal ion.

상기 상자성 금속이온은, 멜라닌 나노입자의 멜라닌과 배위결합할 수 있으며, 상기 상자성 금속이온을 멜라닌 나노 입자의 멜라닌에 배위시킬 경우, 종래 Gd계 조영제보다 T ₁ 감쇄효과가 보다 우세하여 T ₁ 강조 영상에서 우수한 핵자기 공명 영상 조영 효과를 발휘할 수 있다.The paramagnetic metal ions, can be combined melanin and coordination of melanin nanoparticles and, if to be coordinated to the paramagnetic metal ion to the melanin of the melanin nanoparticles, the conventional Gd-based contrast agent and more T ₁ The damping effect is more dominant T ₁ weighted images It is possible to exert an excellent nuclear magnetic resonance imaging effect.

상기 상자기성 금속이온은, 멜라닌 나노입자 중량 대비 1 내지 10 μg이 결합될 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 7 μg이 결합될 수 있다. 또한, 멜라닌 나노입자의 크기가 작을수록 멜라닌 나노입자 중량 대비 표면적이 넓어지므로, 상자성 금속이온의 결합량을 고려하여, 멜라닌 나노입자의 크기가 작은 것이 바람직하다.
The paramagnetic metal ion may be combined with 1 to 10 μg, preferably 2 to 7 μg, relative to the weight of the melanin nanoparticles. Also, since the smaller the size of the melanin nanoparticles, the larger the surface area relative to the weight of the melanin nanoparticles, the smaller the size of the melanin nanoparticles is, considering the binding amount of the paramagnetic metal ions.

본 발명에 있어서, 상기 타겟팅 리간드(targeting ligand)는 표적세포 표면의 분자(molecule), 리간드(ligand) 또는 수용체(receptor) 등의 표적물질을 선택적으로 인식(recognition)/결합(binding)할 수 있는 물질이라면 어느 것이든 사용가능하며, 예를 들어 표적세포의 표면에 존재하는 특정 수용체에 결합할 수 있는 항체, 호르몬, 약제 등의 분자를 들 수 있다. In the present invention, the targeting ligand can selectively recognize / bind a target substance such as a molecule, a ligand, or a receptor on the surface of a target cell Any substance can be used, for example, molecules such as antibodies, hormones, drugs, etc. that can bind to a specific receptor present on the surface of a target cell.

상기 타겟팅 리간드는 통상적인 반응을 통해 본 발명의 복합체 표면에 직접 또는 간접적으로 공유 또는 비공유 방식으로 결합되어 포함될 수 있으며, 예를 들어 이온결합, 정전기적 결합, 소수성 결합, 수소 결합, 공유결합, 친수성 결합 또는 반데르발스 결합을 통해 결합되어 포함될 수 있다. 또한, 상기 간접 결합의 경우 결합제 등의 중간 매개체(intervening agent)가 사용될 수 있는데, 이때 중간 매개체로는 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) 등을 사용할 수 있다.The targeting ligand may be incorporated into the complex surface of the present invention directly or indirectly through a common reaction in a covalent or noncovalent manner and may include, for example, an ionic bond, an electrostatic bond, a hydrophobic bond, a hydrogen bond, Or via a van der Waals bond. In addition, in the case of the indirect coupling, an intervening agent such as a binder may be used, wherein the intermediate mediator is sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane- 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate).

본 발명의 구현예에 따르면, 상기 타겟팅 리간드는 암세포 특이적인 항체일 수 있으며, 하나의 예로서 유방암 세포에서 발현되는 Her 수용체를 특이적으로 인식하는 항체를 본 발명의 ML-MNP(Fe) 입자에 부착시킴으로써 유방암 세포 특이적 타겟팅이 가능하게 된다.According to an embodiment of the present invention, the targeting ligand may be a cancer cell-specific antibody. As an example, an antibody specifically recognizing a Her receptor expressed in breast cancer cells may be administered to ML-MNP (Fe) particles of the present invention Thereby enabling specific targeting of breast cancer cells.

본 발명에 있어서, 상기 타겟팅 리간드는 마이크로버블 또는 리포좀의 표면에 부착되어 ML-MNP(Fe) 입자의 타겟팅을 용이하게 하는데, ML-MNP(Fe) 입자의 마이크로버블과 리포좀 표면에 각각 부착하여 타겟팅 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.In the present invention, the targeting ligand is attached to the surfaces of microbubbles or liposomes to facilitate the targeting of ML-MNP (Fe) particles. The targeting ligands are attached to microbubbles of ML-MNP (Fe) The efficiency can be further improved.

본 발명에서, 상기 복합체가 표면의 타겟팅 리간드에 의해 표적세포에 접근하면 외부 음파 자극을 통해 파괴시켜 복합체 구조 내부에 담지되어 있던 치료 유전자 및 약물 등의 치료제 및 형광물질을 동시에 표적 세포내로 전달시킬 수 있으며, 이때 음파 자극의 세기는 특별히 제한되는 것은 아니나 그 기계지수(mechanical index)가 0.01 내지 2.0인 것이 바람직하다. 이와 같이, 본 발명의 복합체를 초음파에서 고에너지 또는 높은 기계지수에 노출시키는 것을 플래쉬(flash)라고 하며, 이하 실시예에서 플래쉬라는 용어로도 설명한다.
In the present invention, when the complex approaches the target cell by the targeting ligand on the surface, it can be destroyed through the external sound stimulus to transfer the therapeutic agent such as the therapeutic gene and the drug and the fluorescent substance carried in the complex structure simultaneously into the target cell At this time, the intensity of the sound wave stimulus is not particularly limited, but the mechanical index is preferably 0.01 to 2.0. Thus, exposing the composite of the present invention to high energy or high mechanical index in ultrasound is referred to as flash, and is also referred to in the following examples as the term flash.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 포함하는 형광, 초음파(US) 및 자기공명(MR)에 대한 다중 모드(multi-modal) 분석용 조영제를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a contrast agent for multi-modal analysis for fluorescence, US and magnetic resonance imaging (MR) comprising said microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex do.

본 발명에서, 상기 조영제는 생체 내에서 강력하고 특이적으로 암세포 등을 조영(contrast) 또는 영상화(imaging) 하기 위해 체내 투여되는 물질을 말하는 것으로, 현재 의료, 진단 분야에서 조직 및 세포의 이미지 강화를 위해 광범위하게 사용되고 있다. 본 발명의 조영제라는 용어는 종래 알려진 CT 또는 MRI 조영제의 범위로 한정되지 않으며 초음파(US) 이미지 분석용 영상제, 형광 이미지 분석용 영상제 등을 포함하는 의미로 사용된다.In the present invention, the contrast agent refers to a substance that is administered in the body to contrast or image cancer cells in a strong and specific manner in vivo. Is widely used. The term contrast agent of the present invention is not limited to the range of conventional CT or MRI contrast agents, and is used to include an imaging agent for ultrasound (US) image analysis, an imaging agent for fluorescence image analysis, and the like.

본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 조영제에 포함되는 ML-MNP(Fe) 입자의 이미징 양상을 시판중인 임상의 초음파(US) 조영제인 SonoVue와, MR 조영제인 Gadovist과 비교해 본 결과, SonoVue와 유사한 에코발생도를 나타내면서 (도 8), Gadovist보다 2배 더 높은 T ₁ -w MR 조영 신호를 나타내었다 (도 9). 따라서 본 발명의 복합체를 포함하는 조영제는 초음파 조영과 MR 조영의 다중 모드로 이용할 수 있으며 조영 효과에 있어서도 기존 조영제와 비교하여 우수하다.According to the embodiment of the present invention, the imaging pattern of ML-MNP (Fe) particles included in the contrast agent of the present invention was compared with SonoVue, a commercially available clinical ultrasound (US) contrast agent, and Gadovist, Showing similar echo occurrence (FIG. 8), showing a T ₁ -w MR imaging signal twice as high as Gadovist (FIG. 9). Thus, the contrast agent comprising the complex of the present invention can be used in multiple modes of ultrasound and MR imaging, and is superior in contrast to conventional contrast agents.

또한, 본 발명의 복합체는 마이크로버블과, 리포좀과, 멜라닌 나노입자의 복합체 형성으로 현저하게 향상된 MR 이미징 영상을 나타낸다. 본 발명의 실시예에서, 마이크로버블-리포좀(ML)이 없는 멜라닌 나노입자에 항체가 결합된 MNP(Fe)-HER2 입자는 낮은 T ₁ -w MR 신호를 나타낸 반면, 본 발명의 ML-MNP(Fe)-HER2 입자는 현저하게 밝은 이미지를 나타내었다 (도 3의 c 참조). 이는 ML 복합체 없는 MNP(Fe)만으로는 MR 이미징 효율을 증가시키는 것이 충분치 않음을 나타내는 것이다.
In addition, the complexes of the present invention exhibit remarkably enhanced MR imaging images with the formation of microbubbles, liposomes, and complex formation of melanin nanoparticles. MNP (Fe) -HER2 particles conjugated to melanin nanoparticles without microbubble-liposomes (ML) exhibited low T ₁ -w MR signals, while ML-MNPs of the present invention Fe) -HER2 particles displayed a remarkably bright image (c in Fig. 3). This indicates that it is not enough to increase the MR imaging efficiency only with MNP (Fe) without the ML complex.

본 발명의 조영제에 있어서, 상기 복합체는 리포좀 내부에 치료 유전자 또는 약물을 더 포함할 수 있다. 상기 치료 유전자 또는 약물 등의 치료제를 리포좀 구조 내에 담지시키는 공정은, 상기 치료제가 유전자인 경우 프로타민(protamine) 등의 생체고분자와의 혼성체 형태로 나노리포좀과 반응시켜 수행할 수 있고, 상기 치료제가 약물인 경우에는 통상적인 황산암모늄 농도구배법[ammonium sulfate gradient method, Bowen T 등, International Journal of Pharmaceutics (2011), 416, 443-447]을 통해 상온에서 교반시켜 수행할 수 있다.
In the contrast agent of the present invention, the complex may further contain a therapeutic gene or drug inside the liposome. The step of carrying a therapeutic agent such as the therapeutic gene or drug in the liposome structure can be carried out by reacting the therapeutic agent with a nanoliposome in the form of a hybrid body with a biological polymer such as protamine when the therapeutic agent is a gene, In the case of a drug, it can be carried out by stirring at room temperature through a conventional ammonium sulfate gradient method (Bowen T et al., International Journal of Pharmaceutics (2011), 416, 443-447).

본 발명의 조영제는 암세포 또는 암조직의 표적 및 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 비경구 제형은 바람직하게는 본 발명의 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 포함하는 멸균 수용액 또는 현탁액을 포함하며, 약학적 수용액 또는 현탁액의 다양한 제조기술이 당업계에 공지되어 있다. 상기 용액은 또한 약학적으로 허용되는 완충제, 안정제, 항산화제 및 염화나트륨과 같은 전해질을 포함할 수 있다. 비경구 제형은 직접 주사되거나 대용량의 비경구 제형과 혼합될 수 있다.The contrast agent of the present invention can be useful for targeting and diagnosis of cancer cells or cancer tissues and can be formulated into oral or parenteral administration forms. Parenteral formulations preferably comprise sterile aqueous solutions or suspensions comprising the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complexes of the present invention, and various techniques for the preparation of pharmaceutical aqueous solutions or suspensions are known in the art. The solution may also contain pharmaceutically acceptable buffers, stabilizers, antioxidants and electrolytes such as sodium chloride. Parenteral formulations may be injected directly or mixed with large amounts of parenteral formulations.

경구 투여용 제형은 매우 다양할 수 있으며, 이는 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로 그러한 제형은 진단적 유효량의 본 발명에 따른 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 포함하는 수용액 또는 현탁액을 포함한다. 상기 경구 제형은 선택적으로 완충제, 계면활성제, 보조제(adjuvant), 요변성제(thixotropic agent) 등을 포함할 수 있다. 또한 경구 투여용 제형은 향미료 및 기타 관능성을 증가시키기 위한 성분을 포함할 수 있다.Formulations for oral administration may vary widely and are known in the art. Such formulations generally comprise an aqueous solution or suspension comprising a diagnostically effective amount of a microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex according to the present invention. The oral formulations may optionally include buffers, surfactants, adjuvants, thixotropic agents, and the like. Formulations for oral administration may also contain ingredients for increasing spices and other functionalities.

본 발명에 따른 조영제는 이미징 영상의 목적하는 조영 효과를 달성하는데 유효한 양으로 투여된다. 그러한 투여량은 영상 절차의 대상인 기관 또는 조직, 사용되는 영상 장치 등에 따라 광범위하게 변할 수 있다.Contrast agents according to the present invention are administered in an amount effective to achieve the desired imaging effect of the imaging image. Such dosage can vary widely depending on the organ or tissue to be imaged, the imaging device used, and the like.

상기 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 조영제로서 사용하기 위한 투여 농도는 0.1 mM 내지 10 M이 될 수 있다.The administration concentration for using the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex as the contrast agent may be 0.1 mM to 10 M.

본 발명의 조영제는 영상 진단 분석의 통상적인 방식으로 사용된다. 예를 들어, 상기 조영제는 포유동물에 전신적으로 또는 영상화되는 기관 또는 조직에 국부적으로, 적절한 시각화를 제공하는데 충분한 양으로 투여한 다음, 포유동물을 형광 촬영, 초음파 촬영 또는 MRI 촬영할 수 있다.The contrast agents of the present invention are used in a conventional manner for imaging analysis. For example, the contrast agent may be administered to a mammal in an amount sufficient to provide appropriate visualization locally to the organ or tissue to be systemically or imaged, and then the mammal may be fluoroscopically, sonographically, or MRI-scored.

본 발명의 조영제는, 상술한 바와 같이 특정세포 특이적 타겟팅을 통한 일반적인 조영 효과 뿐만 아니라, 진단에 앞서 환자에 필요한 병리학적 또는 약리학적 정보를 제공하는 수단으로서도 유용하게 이용될 수 있다. 예들 들어, 상기 조영제에 포함되는 타겟팅 리간드를 통해 특정 조직이나 세포에서 발현되는 특이적인(specific) 단백질, 즉 마커 단백질을 타겟팅할 수 있으므로 종래에는 병리학적인 조직 검사에 의존하였던 환자 개인의 병리학적 또는 약리학적 정보, 예컨대 암의 종류, 진행 정도, 전이 범위 등에 따라 다르게 발현되는 마커 단백질에 대한 정보를 조직 검사 이전에 이미 영상을 통하여 알 수 있다. 따라서 해당 환자에 특정 약물의 효과가 어떠할지를 미리 알 수 있어서 환자의 치료 계획 및 치료 약물의 선택에 도움이 될 수 있다.
The contrast agent of the present invention can be useful not only as a general imaging effect through specific cell-specific targeting as described above, but also as a means for providing pathological or pharmacological information necessary for a patient prior to diagnosis. For example, targeting ligands included in the contrast agent can target a specific protein, that is, a marker protein expressed in a specific tissue or cell, so that the pathological or pharmacological Information on marker proteins that are differentially expressed depending on the type of information, such as the type of cancer, progression, and metastasis range, can be known through imaging before the biopsy. Therefore, it is possible to know the effect of the specific drug on the patient in advance, which may be helpful in selecting the treatment plan and the therapeutic drug of the patient.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체와, 항암 유전자 또는 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided an anticancer pharmaceutical composition comprising the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex, an anticancer gene or an anticancer agent as an active ingredient.

본 발명에서, 복합체 구조 내부에 담지되는 항암 유전자는 항암 효과가 공지된 유전자를 발현시키거나 암 발생에 관련된 유전자의 발현을 저해할 수 있는 발현 플라스미드, siRNA, shRNA, 마이크로 RNA 또는 마이크로 RNA의 길항제 등의 DNA 또는 RNA가 사용될 수 있다. 또한 상기 약물은 항암 효과가 알려진 공지의 항암제가 사용될 수 있으며, 예를 들면 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel) 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 유전자 및 약물은 통상적인 방법에 따라 리포좀과 반응시켜 복합체 구조 내에 담지시킬 수 있는데, 유전자의 경우 프로타민(protamine) 등의 생체고분자와의 혼성체 형태로 나노리포좀과 반응시켜 담지시킬 수 있으며, 약물의 경우 통상적인 황산암모늄 농도구배법을 통해 리포좀 내부에 담지시킬 수 있다.In the present invention, the anticancer gene carried on the inside of the complex structure may be an expression plasmid, an siRNA, an shRNA, an antagonist of microRNA or microRNA capable of inhibiting the expression of a gene having known antitumor effect, Of DNA or RNA can be used. For example, doxorubicin, paclitaxel or docetaxel may be used as the above-mentioned drugs, but the present invention is not limited thereto. These genes and drugs can be reacted with liposomes according to a conventional method to be carried in a complex structure. In the case of a gene, the gene and the drug can be supported by reacting with a nanoliposome in the form of a hybrid with a biopolymer such as protamine, , It can be carried in the liposome through the usual ammonium sulfate concentration gradient method.

본 발명의 구현예에 따르면, 상기 항암 유전자의 하나의 예로서 세포자살 억제 유전자(Survivin)에 대한 siRNA를 복합체 내부에 담지시킨 후 본 발명의 복합체를 암세포에 타겟팅 하여 암세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, siRNA 유전자는 초음파-매개된 흡수 향상 과정으로 인하여 효과적으로 세포에 내재화되었으며, 이러한 흡수는 세포에서 서바이빈 발현을 효과적으로 하향-조절시켰다 (도 4의 c). siRNA 전달 후 세포 생존율은 현저하게 감소하였다. 이러한 본 발명의 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 이용한 진단 치료적 적용(theranostics)에 대한 개념은 도 10에 나타나 있다.According to embodiments of the present invention, as an example of the anti-cancer gene, siRNA against a cell suicide-suppressing gene (Survivin) is carried in the complex, and the complex of the present invention is targeted to cancer cells to measure cancer cell viability. As a result, the siRNA gene was effectively internalized into cells due to the ultrasound-mediated uptake process, and this absorption effectively down-regulated survivin expression in the cells (Fig. 4c). Cell viability after siRNA delivery was significantly decreased. The concept of theranostics using the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex of the present invention is shown in FIG.

따라서 본 발명의 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체는 높은 표적 특이성을 통해 부작용을 최소화하면서 암세포에 특이적인 형광, 초음파 또는 형광 조영을 이용한 다중 영상 분석을 통해 암을 진단함과 동시에 치료 유전자 및 약물 등의 하나 이상의 치료제를 표적 암세포에 효과적으로 전달하여 암을 치료할 수 있으므로, 유방암, 간암, 췌장암, 뇌암, 위암, 폐암, 식도암, 대장암, 전립선암, 신장암, 난소암 등의 암 질환의 효과적인 진단 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
Therefore, the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex of the present invention diagnoses cancer through multiple image analysis using fluorescence, ultrasound, or fluorescence imaging specific to cancer cells while minimizing adverse effects through high target specificity, Can effectively treat cancer by effectively delivering one or more therapeutic agents to the target cancer cells so that effective diagnosis of cancer diseases such as breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, brain cancer, stomach cancer, lung cancer, esophageal cancer, colon cancer, prostate cancer, kidney cancer and ovarian cancer And can be usefully used for the development of therapeutic agents.

본 발명의 항암용 약학 조성물이 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서 공지의 항암제 또는 항암 유전자를 담지시킨 본 발명의 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제화 시에 통상적으로 이용되는 것으로서 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인살 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.In order to use the pharmaceutical composition for anti-cancer medicine of the present invention as a medicine, it may be prepared by a method known in the pharmaceutical field. In this case, microbubble-liposome-melanin of the present invention, which contains a known anti- In addition to nanoparticle complexes, pharmaceutically acceptable carriers may be included. The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the formulation and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, phosphorus calcium, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, no. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc., in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약학 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 주사제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이들은 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in a unit dose form by being formulated using a pharmaceutically acceptable carrier or excipient according to a method which can be easily carried out by those having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Into a capacity container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or milks, or they may be in the form of excipients, powders, granules, tablets, capsules or injectables, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents. They may be administered parenterally (e. G., Intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 건강상태, 질병 증상의 정도, 음식, 투여시간, 투여방법 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 당 0.01 ~ 100 mg이 투여될 수 있다.
The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be appropriately selected depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, health condition, disease symptom, food, administration time, administration method, And preferably 0.01 to 100 mg per adult standard daily may be administered.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 암세포 특이적이고 형광, 초음파 및 자기공명(MR)에 대한 다중 모드(multi-modal) 이미징이 가능한 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex capable of multimodal imaging for fluorescence, ultrasound, and magnetic resonance (MR) Lt; RTI ID = 0.0 > of:

a) 형광물질이 첨가된 인지질 화합물로부터 인지질 필름을 형성시킨 후 이를 유기용매에 넣고 소수성 가스의 버블링(bubbling) 및 기계적 진동(vibrating)을 통해 마이크로버블을 합성하는 단계;a) forming a phospholipid film from a phospholipid compound to which a fluorescent substance is added, adding the phospholipid film to an organic solvent, and synthesizing a microbubble through bubbling and mechanical vibrating of a hydrophobic gas;

b) 형광물질이 첨가된 인지질 화합물로부터 형성된 인지질 필름을 유기용매에 넣고 초음파 분산 및 나노필터를 이용한 압출을 통해 리포좀을 합성하는 단계;b) adding a phospholipid film formed from a phospholipid-containing phospholipid compound to an organic solvent, and ultrasonically dispersing the liposomes, and synthesizing liposomes by extrusion using a nanofilter;

c) 멜라닌 나노입자를 포함하는 용액에 상자성 금속이온을 포함하는 용액을 첨가하여 상자성 금속이온을 멜라닌 나노입자에 결합시키는 단계;c) adding a solution containing paramagnetic metal ions to a solution containing melanin nanoparticles to bind paramagnetic metal ions to the melanin nanoparticles;

d) 상기 b)단계에서 합성된 리조좀에 티올기를 도입시킨 후, 상기 a)단계에서 합성된 마이크로버블과 진탕(shaking)시켜 마이크로버블-리포좀 복합체를 합성하는 단계;d) synthesizing a microbubble-liposome complex by introducing a thiol group into the ziazospores synthesized in the step b) and then shaking the microbubble with the microbubble synthesized in the step a);

e) 상기 d)의 티올화된 마이크로버블-리포좀 복합체를 상기 c)단계의 상자성 금속이온이 결합된 멜라닌 나노입자와 혼합하여 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 제조하는 단계; 및e) preparing a microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex by mixing the thiolated microbubble-liposome complex of d) with melanin nanoparticles bound to paramagnetic metal ions of step c); And

f) 상기 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체에 말레이미드(maleimide) 기를 도입한 후 이를 암세포 특이적인 항체와 결합시키는 단계.f) introducing a maleimide group into the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex, and then binding the maleimide group to the cancer cell-specific antibody.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 b) 단계에서 인지질 화합물로부터 형성된 인지질 필름을 유기용매에 넣기 전에, 전기영동 프로토콜을 이용하여 생체고분자와 치료 유전자의 혼성체 용액으로 균질화하여 치료 유전자를 담지시키는 공정을 더 수행할 수 있다.
In the method of the present invention, before the phospholipid film formed from the phospholipid compound in the step b) is homogenized with the mixed solution of the biopolymer and the therapeutic gene using an electrophoresis protocol, You can do more.

본 발명자들은 MB, Lipo 및 MNP(Fe)로 구성된 하이브리드 다중 가능 입자를 제조하였다. 제조된 복합체 입자들은 높은 생체적합성 및 선택성을 나타내었으며, 형광, US 및 MR에 대한 다중-모드 이미징 성능을 입증하였다. 흥미롭게도, 연결된 치료적 Lipos 및 MNP(Fe)s는 US 플래쉬에 노출된 후 암세포로 신속하게 침투하였으며, 최종적으로 MB 캐비테이션(cavitation) 및 소노포레이션(sonoporation)으로 인하여 치료 효과와 MR 이미징을 향상시켰다. 독성이 없는 치료 진단 물질로서, 본 발명의 하이브리드 복합체는 임상 적용에 있어서 US 및 MR-가이드된 암 치료까지 손쉽게 이어질 수 있다.
The present inventors have produced hybrid multiplexable particles composed of MB, Lipo and MNP (Fe). The prepared composite particles showed high biocompatibility and selectivity and demonstrated multi-mode imaging performance for fluorescence, US and MR. Interestingly, the associated therapeutic Lipos and MNP (Fe) s rapidly penetrated into cancer cells after exposure to the US flash and ultimately improved treatment effects and MR imaging due to MB cavitation and sonoporation . As a non-toxic therapeutic diagnostic agent, the hybrid complexes of the present invention can easily lead to US and MR-guided cancer treatment in clinical applications.

도 1은 마이크로버블(MB), 나노리포좀(Lipo), 멜라닌 나노입자(MNP(Fe)), 및 그들의 복합체의 특성을 나타낸 것이다.
인지질 화합물들로부터 제조된 MB 및 Lipo 입자의 구형 모양은 현미경(a, 왼쪽) 및 동결-전자 현미경(a, 오른쪽)으로 각각 확인되었다. 또한 Fe^{3 +} 이온 킬레이팅된 MNP, MNP(Fe)도 TEM 분석(b)으로 명백한 것처럼, 구형 모양을 나타내었으며, MNP 표면에 결합된 이온 금속의 강도는 주사 TEM (b, 오른쪽 위)으로 맵핑되었다. 정량 분석 역시 EDX가 장착된 TEM으로 수행되었으며, 여러 에너지-분산 피크들은 이온 금속의 존재를 나타내었다 (b, 오른쪽 아래, 해당 피크들은 검정색 화살표로 표시되어 있음). ML상에 MNP(Fe)를 연결(anchoring)시킨 후, 하이브리드 입자 용액은 실리콘 웨이퍼 플레이트 상에 로딩된 후 천천히 건조되었다. 박혀있는(sunken) 입자들은 적색 점선 원으로 표시되었으며 (c) 검정색 화살표는 ML 상에 있는 연결된 MNP(Fe) 입자들을 나타내었다. 제조된 모든 입자들의 크기 분포는 DLS 분석(d)으로 측정되었다.
도 2는 특이적 타겟팅, US 플래쉬 효과, 및 세포독성 평가를 나타낸 것이다.
(a, 스케일 바 = 25 μm) 녹색 및 적색 형광 M_GL_R-MNP(Fe)-HER2 입자들은 음성 세포(MCF7)과 비교하여 유방암 세포(SKBR3)에서 발현된 Her2 수용체를 특이적으로 인지하였다. HER2 결합된(conjugated) 입자들은 세포막 상에 나타났다 (a, 위-오른쪽, 청색은 DAPI-염색된 핵을 나타냄). 항체가 결합되지 않은 입자들로 처리된 SKBR3 세포는 US 플래쉬(MI = 0.61) 노출 후 거의 형광을 나타내지 않았다 (a, 아래-왼쪽). 그러나 US 플래쉬와 함께 M_GL_R-MNP(Fe)-HER2 입자들로 처리된 SKBR3 세포는 세포 시토졸에서 형광 염료를 나타내었다 (a, 아래-오른쪽). 방출된 MNP(Fe)s는 bio-TEM 분석(b)을 이용하여 SKBR3 세포의 세포질 내에 위치하는 것으로 확인되었으며 MNP의 크기와 모양에서 아무런 변화가 없었다 (b, 삽입된 도면). M_GL_R-MNP(Fe)-HER2 및 US 플래쉬 처리된 세포는 다양한 농도 및 배양시간에 대해 90% 이상의 생존율을 나타내었다 (c). 단백질 수준으로 측정된 세포독성 분석을 위해, 0.66 mg/ml의 입자들이 세포에 첨가된 후, 웨스턴 블로팅을 이용하여, 세포 소기관 기능과 관련된 단백질 수준의 변화에 대해 측정되었다 (d). 이들 세포는 비처리된 대조군 세포와 같이 유사한 발현 수준을 나타내었다 (c 및 d에서 모든 실험은 세 번 수행되었다. 데이터는 평균 +/- SD를 보여준다.
도 3은 타겟팅된 세포의 US 및 MR 이미징, 및 플래쉬 자극의 효과를 나타낸 것이다.
팬텀 US 분석(iU22, Philips)에서, 처리된 SKBR3 세포 용액은 비처리된 세포 용액(a, 왼쪽과 중간, MI = 0.08)과 비교하여 현저히 높은 에코발생도를 나타내었다. 신호는 플래쉬 6시간 후 완전하게 사라졌다 (a, 오른쪽, 도 8의 b 참조). HER 양성의 SKBR3 및 음성의 MCF7 세포는 웨스턴 블로팅으로 HER2 수용체의 발현 수준에 대해 특성화되었다 (b). US 플래쉬 후, 처리된 세포는 대조군 세포와 비교하여 SKBR3에 대한 현저한 T ₁ -w MR 조영 신호를 나타내었다 (c, I: 플래쉬, ii: MNP(Fe)-HER2, iii: ML-MNP(Fe)-HER2)
도 4는 in vitro에서 siRNA의 치료적 적용을 나타낸 것이다.
치료 유전자를 도입하기 위해, 서바이빈(Survivin)에 대한 siRNA를 프로타민(PA)과 둘 사이의 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)을 통해 혼합(blend)하였다. 최적의 복합체 비율(50 μM siSurv와 40 μM PA)은 전기영동을 이용하여 측정되었다 (a). Lipo에서 siSurv-PA 복합체의 로딩 용량은 UV-Vis 분광광도계에 의해 생성된 흡수 스펙트럼을 모니터링함으로서 계산되었다 (b). 타겟 단백질은 웨스턴 블로팅으로 명백한 것처럼, siSurv만 있는 세포와 비교하여, 8배 감소된 발현 수준을 나타내었다 (c). 처리 후, 세포 생존능은 시간 함수로서 관찰되었다. ML _siSurv -MNP(Fe)-HER2 및 플래쉬 처리된 세포는 3일째 생존능(60% 이하 생존)에서 현저한 감소를 나타낸 반면, 다른 대조군들은 90%까지 유지된 생존능을 나타내었다 (d). (c와 d에서 모든 실험은 세 번 수행되었다. 데이터는 평균+/- SD를 나타낸다. * P < 0.05, ** P < 0.01)
도 5는 MNP에 대한 Fe^{3 +} 이온의 킬레이팅 용량을 나타낸 것이다.
멜라닌 나노입자(MNP)에 대한 Fe^{3 +} 이온의 킬레이팅 용량(chelating capacity)을 시험하기 위해, Fe(NO₃)₃·6H₂O를 다양한 농도(210 μmol)로 증류된 내에 용해시킨 후, 분산된 MNPs (1 mg/ml)이 포함된 용액 1 ml과 혼합하였다. 완료 후, 이를 세척한 후 13,000 rpm에서 10분 동안의 침전시킴으로써 과량의 Fe^{3 +} 이온을 제거하였다. 로드된(roaded) Fe^{3 +} 이온의 양은 ICP-AES 분석에 의해 직접적으로 측정되었다 (a). 8 μmol의 Fe^{3 +} 이온 용액을 처리하는 동안, Fe^{3 +} 이온들은 MNP mg 당 3 μmol의 로딩 용량까지 최대로 증가하였다. 더 중요한 것으로, 킬레이팅된 Fe^{3 +} 이온들은 다양한 pH 수준에서 MNP 입자로부터 방출되어서는 안되며, 이는 조영제에 대한 유지능을 의미한다. ICP-AES 분석에 따르면, 극히 적은 양의 Fe^{3 +} 이온들(<5%)이 다양한 pH 수준(4, 7 및 10)에서 교반 72시간 후에 검출되었다 (b).
도 6은 ML-MNP(Fe)-HER2 하이브리드 입자의 제조과정 및 특성을 나타낸 것이다.
적색 및 녹색 형광 M_GL_R-MNP(Fe)-HER2 입자 복합체를 3단계의 화학반응에 의해 합성하였다; MB-Lipo 하이브리드 반응, MNP(Fe) 앵커링(anchoring), 및 항체 접합(a). ML 제조(a, i)를 위해, Lipo-DPPE의 티올화 후 MB에 있는 DSPE-PEG-SPDP를 설프히드릴 기와 교차결합시키고, 완전한 하이브리드 반응은 화학적 탈리기(leaving chemical group)로서의 피리딘-2-티온의 검출을 통해 UV-Vis 분광 광도계로 확인하였다 (b). MNP(Fe) 는 티올화된 Lipo(a, ii)에 부착되었고, 이는 수성 환경에서 용해도를 증가시키기 위해 추가적으로 HS-PEG 케미컬로 처리되었다. 최종적으로, 입자에 특이성을 부여하기 위해, DPPE와 Sulfo-SMCC의 반응 후, HER2 반쪽 항체(HER2)를 MB 및 Lipo 상의 말레이미드 작용기에 결합시켰다 (a, iii). 모든 과정은 실시예에 완벽하게 설명되어 있다. Lipo 및 MB 복합체에 도입된 적색 및 녹색의 유기염료는 공초점 레이저 현미경(confocal laser scanning microscope)으로 특성화되었다 (c). MB는 코어 SF₆ 가스로 인하여 속이 빈 구형으로 나타났고, 녹색의 MB 주위에 있는 Lipos는 적색의 작은 점으로 나타났다 (c, 삽입된 도면).
도 7은 특이적 타게팅 및 US 플래시 자극을 통한 흡수 효율의 향상을 나타낸 것이다.
ML-MNP(Fe)-HER2 입자들은 HER2 양성 SKBR3 세포들에 대한 특이적 타겟팅을 나타내어 상기 세포들에 부착될 수 있다. 1분간 US 플래시 (MI = 0.61) 후, 입자의 MB는 빠르게 파괴되어 Lipo- 및 MNP(Fe)-연결된 물질들을 세포 내로 방출하였다.
또한, MB의 파괴력은 세포막에 포어(pore)(약 220 nm 직경)를 유도하여, 그 결과 연결된 물질들을 흡수하였다 (a). 대조군으로서, 매우 낮은 수준의 HER2 리셉터를 발현하는 MCF7 세포(도 3의 b)는 동일한 조건 하에서 입자들로 처리되었다. 드문 정도의 MNP(Fe) 입자들이 비-특이적 내포작용으로 인하여 세포 시토졸(cytosol)에서 확인되었다 (b). MB 및 Lipo로부터의 적색 및 녹색의 형광 유기염료를 FACS를 이용하여 정량적으로 분석하였다 (c).
도 8은 플래시 처리 하에서 조영제들의 에코발생도(echogenicity) 및 MB 캐비테이션(cavitation)의 모니터링 비교를 위한 US 팬텀 분석 결과이다.
US 팬텀 플라스틱 튜브를 로딩한 후, 합성된 M_GL_R-MNP (Fe)-HER2 입자 용액은 US 이미징 모드 (MI = 0.08) 하에서 동일한 농도의 인지질(DPPC, 10.5 mM)에서 임상적으로 사용되고 있는 SonoVue US 조영제와 유사한, 에코발생도 및 강도를 나타내었다 (a). 플래시 적용(MI = 0.61) 후 에코발생도는 점차 사라졌다 (b). 제조된 입자들은 6번의 플래시 처리 이내에 파괴됨을 확인하였다.
도 9는 팬텀 분석에서 세로축 이완도(r ₁ ) 및 T ₁ -w MR의 측정 결과이다.
본 발명자들은 제조된 ML-MNP(Fe)-HER2 입자들의 세로축 이완도(longitudinal relaxivity) 값 및 임상적으로 사용되고 있는 T ₁ MR 제제(Gadovist)를 0.47-T magnetic relaxometer (mq20, Bruker)를 이용하여 비교하였다. 세로축 이완시간은 다양한 농도의 금속 이온에서 측정되었고, 또한 ICP-AES 분석을 이용하여 정확하게 계산되었다. 입자 용액은 Gadovist 보다 2배 더 높은 r ₁ 을 나타내었다 (a). Solomon-Bloembergen-Morgan(SBM) 가설에 따르면, Fe^{3 +} 킬레이트된 카테콜(catechol) 복합체에서 물 분자와 산소 원자의 2차-구조(second sphere)는 r ₁ 을 증가시켜, MNPs의 나노미립자 특성은 증가된 r ₁ 및 제한된 회전운동성(rotational mobility)을 나타낸다. 임상적으로 사용되고 있는 MRI 기기(3.0-T, Philips)를 이용한 MR 팬텀 분석에서, ML-MNP(Fe)-HER2 입자 용액은 동일한 금속 이온 농도에서 대략 2배 더 높은 흰색 조영 강도를 나타내었다 (b).
도 10은 본 발명에 따른 마이크로버블-리포좀-나노복합체를 이용한 진단-치료적 적용의 개념을 설명하는 것이다. Figure 1 shows the properties of microbubbles (MB), nanoliposomes (Lipo), melanin nanoparticles (MNP (Fe)), and their complexes.
Spherical shapes of MB and Lipo particles prepared from the phospholipid compounds were confirmed with a microscope (a, left) and a frozen-electron microscope (a, right), respectively. In addition, the Fe ^{3 +} ion-chelated MNP and MNP (Fe) also showed a spherical shape as evidenced by the TEM analysis (b), and the intensity of the ion metal bound to the MNP surface was mapped to the scanning TEM (b, . Quantitative analysis was also performed with EDX equipped TEM and several energy-dispersion peaks indicated the presence of ionic metal (b, lower right, corresponding peaks indicated by black arrows). After MNP (Fe) was anchored on the ML, the hybrid particle solution was loaded onto a silicon wafer plate and then slowly dried. The sunken particles are marked with a red dotted circle circle and the black arrows indicate connected MNP (Fe) particles on the ML. The size distribution of all particles produced was measured by DLS analysis (d).
Figure 2 shows specific targeting, US flash effect, and cytotoxicity assays.
green and red fluorescence M _G L _R -MNP (Fe) -HER2 particles specifically recognized Her2 receptors expressed in breast cancer cells (SKBR3) as compared to negative cells (MCF7) . HER2 conjugated particles appeared on the cell membrane (a, stomach-right, blue represents DAPI-stained nuclei). SKBR3 cells treated with antibody-unbound particles showed little fluorescence after US flash (MI = 0.61) (a, bottom-left). However, SKBR3 cells treated with M _G L _R -MNP (Fe) -HER2 particles with US Flash showed fluorescent dyes in the cell cytosol (a, bottom-right). The released MNP (Fe) s was found to be located in the cytoplasm of SKBR3 cells using bio-TEM analysis (b), and there was no change in the size and shape of MNP (b, inserted drawing). M _G L _R -MNP (Fe) -HER2 and US flushed cells exhibited a survival rate of 90% or more (c) for various concentrations and incubation times. For cytotoxicity analysis measured at the protein level, 0.66 mg / ml of particles were added to the cells and then measured for protein level changes associated with cell organelle function using Western blotting (d). These cells exhibited similar expression levels as untreated control cells (all experiments were performed three times in c and d). Data show mean +/- SD.
Figure 3 shows the effect of US and MR imaging of the targeted cells, and flash stimulation.
In phantom US analysis (iU22, Philips), the treated SKBR3 cell solution showed significantly higher echogenicity compared to the untreated cell solution (a, left and middle, MI = 0.08). The signal disappeared completely after 6 hours of flash (a, right, see Figure 8b). HER positive SKBR3 and negative MCF7 cells were characterized for expression levels of HER2 receptor by Western blotting (b). After US flash, treated cells showed a significant T ₁ -w MR imaging signal for SKBR3 as compared to control cells (c, I: flash, ii: MNP (Fe) -HER2, iii: ML-MNP ) -HER2)
4 is in RTI ID = 0.0 &gt; siRNA < / RTI &gt; in vitro .
To introduce the therapeutic gene, siRNA against Survivin was blended with protamine (PA) via electrostatic interaction between the two. Optimal complexity ratios (50 μM siSurv and 40 μM PA) were measured using electrophoresis (a). The loading capacity of the siSurv- PA complex in Lipo was calculated by monitoring the absorption spectrum generated by the UV-Vis spectrophotometer (b). The target protein showed an 8-fold reduced level of expression, as evidenced by Western blotting, compared to siSurv alone cells (c). After treatment, cell viability was observed as a function of time. ML _siSurv -MNP (Fe) -HER2 and the flashed cells showed a significant reduction in viability (survival less than 60%) at day 3, while other controls showed sustained viability up to 90% (d). (All experiments in c and d were performed three times, with data representing mean +/- SD * P <0.05, ** P <0.01)
Figure 5 shows the chelating capacity of Fe ^{3 +} ions for MNP.
To test the chelating capacity of Fe ^{3 +} ions for melanin nanoparticles (MNP), Fe (NO ₃ ) ₃ .6H ₂ O was dissolved in distilled at various concentrations (210 μmol) And mixed with 1 ml of solution containing dispersed MNPs (1 mg / ml). After completion, it was washed and then precipitated at 13,000 rpm for 10 minutes to remove excess Fe ^{3 +} ions. The amount of Fe ^{3 +} ions loaded was directly measured by ICP-AES analysis (a). During the treatment of 8 μmol Fe ^{3 +} ion solution, the Fe ^{3 +} ions increased to a maximum of 3 μmol loading per mg MNP. More importantly, the chelated Fe ^{3 +} ions should not be released from the MNP particles at various pH levels, indicating retention of the contrast agent. According to ICP-AES analysis, very small amounts of Fe ^{3 +} ions (<5%) were detected at various pH levels (4, 7 and 10) after 72 hours of stirring (b).
FIG. 6 shows the production process and characteristics of ML-MNP (Fe) -HER2 hybrid particles.
The red and green fluorescent M _G L _R -MNP (Fe) -HER 2 particle complexes were synthesized by a three-step chemical reaction; MB-Lipo hybrid reaction, MNP (Fe) anchoring, and antibody conjugation (a). For ML fabrication (a, i), DSPE-PEG-SPDP in MB after thiolation of Lipo-DPPE was cross-linked with a sulfhydryl group and the complete hybrid reaction was carried out using pyridine-2 as a chemical leaving group -Thione (b) was confirmed by UV-Vis spectrophotometer. MNP (Fe) was attached to the thiolated Lipo (a, ii), which was further treated with HS-PEG chemistry to increase solubility in an aqueous environment. Finally, in order to impart specificity to the particles, the HER2 antibody (HER2) was bound to the maleimide functional group on MB and Lipo after reaction of DPPE and Sulfo-SMCC (a, iii). All processes are fully described in the Examples. The red and green organic dyes introduced into the Lipo and MB complexes were characterized by a confocal laser scanning microscope (c). The MB appeared as a hollow spherical shape due to the core SF ₆ gas, and the Lipos around the green MB appeared as a small point of red (c, inset drawing).
Figure 7 shows an improvement in absorption efficiency through specific targeting and US flash stimulation.
ML-MNP (Fe) -HER2 particles can be attached to the cells with specific targeting to HER2-positive SKBR3 cells. After 1 minute of US flash (MI = 0.61), the MB of the particles quickly disintegrated and released the Lipo- and MNP (Fe) -conjugated materials into the cells.
In addition, the destructive force of MB induces a pore (about 220 nm in diameter) in the cell membrane, thereby absorbing the connected substances (a). As a control, MCF7 cells (FIG. 3 b) expressing very low levels of HER2 receptor were treated with the particles under the same conditions. Rare MNP (Fe) particles were identified in cell cytosol due to non-specific inclusion (b). Red and green fluorescent organic dyes from MB and Lipo were quantitatively analyzed using FACS (c).
8 is a US phantom analysis result for monitoring comparison of contrast agents echogenicity and MB cavitation under flash processing.
After loading the US Phantom plastic tube, the synthesized M _G L _R -MNP (Fe) -HER2 particle solution was used clinically in the same concentration of phospholipid (DPPC, 10.5 mM) under US imaging mode (MI = 0.08) Similar to SonoVue US contrast agent, echogenicity and intensity were shown (a). After flash application (MI = 0.61), the echogenicity gradually disappeared (b). The particles were found to be destroyed within 6 flashes.
Fig. 9 shows measurement results of longitudinal axis relaxation ( r ₁ ) and T ₁ -w MR in phantom analysis.
The present inventors measured the longitudinal relaxivity value of the ML-MNP (Fe) -HER2 particles and the clinically used T ₁ MR agent (Gadovist) using a 0.47-T magnetic relaxometer (mq20, Bruker) Respectively. The longitudinal relaxation time was measured at various concentrations of metal ions and also accurately calculated using ICP-AES analysis. The particle solution showed a r ₁ that was two times higher than Gadovist (a). According to the Solomon-Bloembergen-Morgan (SBM) hypothesis, the second sphere of water molecules and oxygen atoms in Fe ^{3 +} chelated catechol complexes increases r _1, and the nanoparticle properties of MNPs Shows increased r ₁ and limited rotational mobility. In the MR phantom analysis using a clinically used MRI device (3.0-T, Philips), the ML-MNP (Fe) -HER2 particle solution showed a roughly two-fold higher white intensity at the same metal ion concentration (b ).
Figure 10 illustrates the concept of diagnostic-therapeutic application using the microbubble-liposome-nanocomposite according to the present invention.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, these examples are intended to further illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1. MB, Lipo, MNP(Fe) 및 이들의 복합체 제조Example 1. Preparation of MB, Lipo, MNP (Fe) and composite thereof

(1) 마이크로버블(MB)의 제조(1) Preparation of micro bubble (MB)

DPPC(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine) 15.4 mg, DCP(diacetyl phosphate) 1.0 mg, DPPE(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 1.2 mg, DSPE-PEG-PDP (1,2-distearoyl-sn-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000) 5.0 mg, 및 콜레스테롤(cholesterol) 3.5 mg을 5 ml 클로로포름(99.9 %, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 용해시켰다. 혼합된 용액을 실온에서 5분간 증발시킨 다음 -45℃에서 24시간 동안 동결건조 하여, 인지질 필름(phospholipid film)의 형성을 유도하였다. 이어서, 글리세린, 프로필렌, 및 H₂O (부피비: 1:2:7)를 포함하는 용액 2 ml을 상기 필름에 첨가한 후, 용액을 부드럽게 진탕(shake)하였다. 그 후, 이를 밀폐된 바이알(hermetic vial; Wheaton, NJ, USA)에 옮기고, SF₆ 가스로 버블링(bubbling)하는 동안 기계적 고속 진동장치(high-speed shaking-device; KIMS, South Korea)로 15초간 격렬하게 혼합하여 마이크로버블(MB)을 제조하였다. 제조된 MB 입자 용액을 냉장고에 저장하였다.
DPPE (1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), 1.0 mg of DCP (diacetyl phosphate), 1.2 mg of DPPE (1,2-dipalmitoyl- 5.0 mg of PDP (1,2-distearoyl-sn-phosphoethanolamine-N- [PDP (polyethylene glycol) -2000) and 3.5 mg of cholesterol were dissolved in 5 ml of chloroform (99.9%, Sigma-Aldrich, , USA). The mixed solution was evaporated at room temperature for 5 minutes and lyophilized at -45 ° C for 24 hours to induce the formation of a phospholipid film. Subsequently, 2 ml of a solution containing glycerin, propylene, and H ₂ O (volume ratio: 1: 2: 7) was added to the film and the solution was gently shaken. After that, it was transferred to a hermetic vial (Wheaton, NJ, USA), and a high-speed shaking-device (KIMS, South Korea) was used for bubbling with SF ₆ gas. Microbubbles (MB) were prepared. The prepared MB particle solution was stored in a refrigerator.

(2) 나노리포좀(Lipo)의 제조(2) Production of nanoliposome (Lipo)

Lipo는 DPPC, DCP, DPPE 및 콜레스테롤을 포함하는 클로로포름 용액으로부터 제조하였다 (각 성분의 사용량은 상기 (1)과 동일함). 상기 용액을 상술한 바와 동일하게 증발시키고 동결건조 하였다. 2 ml H₂O를 첨가한 후, 지질 필름을 60℃에서 5분간 초음파 처리하였다. 액체 질소 및 항온 수조를 이용하여, 상기 용액을 동결-해동 사이클(freeze-thaw cycle)을 5회 반복하였다. 제조된 Lipo 분산 용액을 60℃에서 200 nm 필터를 통해 압출하여 (mini-extruder; Avanti polar lipids), 나노리포좀(Lipo)을 제조하였다.
Lipo was prepared from a chloroform solution containing DPPC, DCP, DPPE and cholesterol (the amount of each ingredient used is the same as in (1) above). The solution was evaporated and lyophilized as described above. After addition of 2 ml H ₂ O, the lipid film was sonicated at 60 ° C for 5 minutes. The liquid was subjected to a freeze-thaw cycle five times using liquid nitrogen and a constant temperature bath. The prepared Lipo dispersion solution was extruded at 60 ° C through a 200 nm filter (mini-extruder; Avanti polar lipids) to prepare a nanoliposome (Lipo).

(3) 형광물질의 담지(3) Carrying of fluorescent substance

녹색 및 적색 형광을 띠게 하기 위해, MB 및 Lipo 필름을 각각 형성시키기 전에, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, Sigma-Aldrich) 1 mg, 및 텍사스-레드(Texas-red, Sigma-Aldrich) 1 mg을 상기 지질 혼합 용액에 균일하게 첨가하였다. 과량의 유기 염료들은 원심분리(13,000 rpm에서 5분), 및 H₂O를 이용한 세척으로, 상청액의 색이 완전히 사라질 때까지 연속적으로 제거하였다.
1 mg of fluorescein isothiocyanate (Sigma-Aldrich) and 1 mg of Texas-red (Sigma-Aldrich) were added prior to forming the MB and Lipo films, respectively, 1 mg was uniformly added to the lipid mixed solution. Excess organic dyes were continuously removed by centrifugation (5 min at 13,000 rpm) and washing with H ₂ O until the color of the supernatant completely disappeared.

(4) 설프히드릴기의 도입(4) Introduction of Sulphor drill machine

Lipo 입자 상에 설프히드릴(sulfhydryl) 작용기를 만들기 위해, 1 M NaHCO₃로 pH를 8.2로 조정 후, DPPE로부터 유도된 2 ml 아민 활성 Lipo (21 mg)를 5 mg의 2-이미노티오레인·HCl(2-iminothiolane·HCl; Traut’s reagent, Pierce)과 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 2 ml 티올화된(thiolated) Lipo(10.5 mg/mL) 및 1.5 ml MB(13.1 mg/ml) 용액을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 진탕하였고, 복합체 반응을 UV-Vis 분광법으로 상청액에 있는 피리딘-2-티온(pyridine-2-thione)의 양을 계산함으로써 모니터링 하였다.
After adjusting the pH to 8.2 with 1 M NaHCO ₃ to make the sulfhydryl functional group on the lipo particles, 2 ml of amine active Lipo (21 mg) derived from DPPE was added to 5 mg of 2-iminothiorene HCl (2-iminothiolane · HCl; Traut's reagent, Pierce) at room temperature for 2 hours. The 2 ml thiolated Lipo (10.5 mg / ml) and 1.5 ml MB (13.1 mg / ml) solution was gently shaken for 2 hours at room temperature and the complex reaction was monitored by UV-Vis spectroscopy, Was monitored by calculating the amount of 2-thione (pyridine-2-thione).

(5) 멜라닌 나노입자(MNP)의 제조(5) Preparation of melanin nanoparticles (MNP)

MNP 입자들을 제조하기 위해, 180 mg의 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)를 50℃에서 증류수에 용해시켰고, 780 μl의 NaOH 용액 (1 M)을 격렬하게 교반시켰다. 6시간 후, 검은색으로 변하면, 용액을 원심분리(20,000 rpm에서 10분) 하고, 증류수로 여러 번 세척하였다. TEM 및 DLS로 측정된 것과 같이, MNP 입자들은 특징적인 크기(직경 = 100 nm)를 나타내었고, 균일한 크기 분포를 나타내었다.
To prepare MNP particles, 180 mg of dopamine hydrochloride was dissolved in distilled water at 50 캜 and 780 μl of NaOH solution (1 M) was vigorously stirred. After 6 hours, when it turned black, the solution was centrifuged (20,000 rpm for 10 minutes) and washed several times with distilled water. As measured by TEM and DLS, the MNP particles exhibited a characteristic size (diameter = 100 nm) and exhibited a uniform size distribution.

(6) 상자기성 금속이온이 결합된 MNP의 제조(6) Preparation of boxed metal ion-bound MNP

Fe³⁺ 이온을 결합시키기 위해, 210 μmol 농도 범위를 갖는 4 ml의 Fe(NO₃)₃·6H₂O를 10 ml의 MNP 분산 용액(1 mg/ml)과 혼합하였다. 3시간 동안 교반 후, 용액을 원심분리(20,000 rpm에서 10분) 하고, 전체 로딩 용량(loading capacity)을 결정하기 위해 상청액 용액에 있는 비결합 Fe³⁺ 이온을 정량적으로 평가하였다. 이는 ICP-AES(inductively coupled plasma atomic emission spectrometer)로 이루어졌다.
To bind Fe ³⁺ ions, 4 ml of Fe (NO ₃ ) ₃ .6H ₂ O with a concentration range of 210 μmol was mixed with 10 ml of MNP dispersion (1 mg / ml). After stirring for 3 hours, the solution was centrifuged (20,000 rpm for 10 minutes) and unbound Fe ³⁺ ions in the supernatant solution were quantitatively evaluated to determine the total loading capacity. This was done by ICP-AES (inductively coupled plasma atomic emission spectrometer).

(7) ML-MNP(Fe) 복합체의 제조(7) Preparation of ML-MNP (Fe) complex

티올화된 MB-Lipo (이하, ‘ML’ 이라고 함) 복합체 용액(30 mg, 15 mg/ml)은 실온에서 0.5시간 동안 1 ml의 MNP(Fe) 용액(1 mg/ml)과 균일하게 혼합하였다. 과량의 MNP(Fe) 입자들은 ML-MNP(Fe) 복합체들을 원심분리(13,000 rpm에서 5분) 및 증류수로 3회 세척함으로써 제거하였다. 수성 환경(aqueous environments)에서 안정성을 증가시키기 위해, 수득된 복합체 입자 용액을 실온에서 1시간 동안 2 ml의 PEG-SH(methoxy-poly(ethylene glycol), 2 kDa, 0.5 mM)로 처리한 후 과량의 PEG-SH는 원심분리(13,000 rpm에서 2분)로 제거하였다. 복합체의 크기 및 모양은 FE-SEM, TEM 및 DLS 측정을 이용하여 특성화하였다. 본 발명에서, 모든 인지질 케미컬(chemicals)은 Avanti Polar Lipids로부터 구입하였으며, 다른 모든 화학 시약들은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 모든 케미컬들은 추가 정제 없이 사용하였다.
(30 mg, 15 mg / ml) was mixed homogeneously with 1 ml of MNP (Fe) solution (1 mg / ml) for 0.5 hour at room temperature Respectively. Excess MNP (Fe) particles were removed by washing the ML-MNP (Fe) complexes three times with centrifugation (5 min at 13,000 rpm) and distilled water. To increase stability in aqueous environments, the resulting composite particle solution was treated with 2 ml of PEG-SH (methoxy-poly (ethylene glycol), 2 kDa, 0.5 mM) for 1 hour at room temperature, Of PEG-SH was removed by centrifugation (2 min at 13,000 rpm). The size and shape of the complexes were characterized using FE-SEM, TEM and DLS measurements. In the present invention, all phospholipid chemicals were purchased from Avanti Polar Lipids, and all other chemical reagents were purchased from Sigma-Aldrich. All chemicals were used without further purification.

실시예 2. HER2 항체 접합Example 2. HER2 antibody conjugation

활성의 말레이미드(maleimide) 작용기를 만들기 위해, 1 M NaHCO₃ 용액으로 pH를 8.2로 조정한 후, 아민(amine) 작용기를 포함하는 2 ml의 ML-MNP(Fe) 입자 용액(14.9 mg/ml)을 Sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate; 5 mg, Sigma-Aldrich)와 3시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 통상의 생물-접합(bio-conjugation) 방법을 이용하여 말레이미드 모이어티(moiety)를 적당한 HER2 반쪽 항체(half antibody)에 연결시켰다. 항체-포함 입자들을 전형적인 단백질 평가 분석(protein estimation assay)을 이용하여 정량적으로 분석하였다.
To make an active maleimide functional group, the pH was adjusted to 8.2 with 1 M NaHCO ₃ solution and then 2 ml of ML-MNP (Fe) particle solution (14.9 mg / ml ) Was reacted with Sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate; 5 mg, Sigma-Aldrich) for 3 hours. Next, the maleimide moiety was conjugated to the appropriate half-antibody HER2 using a conventional bio-conjugation method. The antibody-containing particles were quantitatively analyzed using a typical protein assay assay.

실시예 3. 세포독성 분석Example 3. Cytotoxicity assay

MTT 분석 키트(Invitrogen)를 사용하여 ML-MNP(Fe) 입자의 존재 하에 세포생존능을 평가하였다. SKBR3 세포(ATCC, VA, USA)를 10% FBS, 페니실린 및 1% 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI에서 배양하였다. 세포들은 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 유지되었다. 세포들이 80% 컨플루언스(confluence)에 도달한 후, 세포들을 세척하고, 트립신 처리하여, 배양 배지에 재현탁하였다. 다음으로, 세포들을 96-웰 조직 배양 플레이트에 5,000 세포/웰 농도로 접종한 후, CO₂ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 1 ml PBS 버퍼 용액에 있는 다양한 농도의 ML-MNP(Fe) 입자들을 세포 배양 용액에 첨가하고, 세포들을 각각 24, 48, 및 72 시간 동안 배양하였다. 세포 생존능을 측정하기 위해, 배양 배지를 MTT 용액으로 교체하였다. CO₂ 인큐베이터 내부에서 배양 3시간 후, MTT 용액을 첨가하여 수득된 포르마잔(formazan) 결정들을 녹였다. 세포 생존율은 690 nm에서 백그라운드를 빼고, 570 nm에서 분광광도법으로 측정하였다.
MTT assay kit (Invitrogen) was used to assess cell viability in the presence of ML-MNP (Fe) particles. SKBR3 cells (ATCC, VA, USA) were cultured in RPMI supplemented with 10% FBS, penicillin and 1% streptomycin. Cells were maintained in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C. After the cells reached 80% confluence, the cells were washed, trypsinized and resuspended in the culture medium. Next, cells were inoculated into 96-well tissue culture plates at a concentration of 5,000 cells / well and then cultured overnight in a CO ₂ incubator. Various concentrations of ML-MNP (Fe) particles in 1 ml PBS buffer solution were added to the cell culture solution, and the cells were cultured for 24, 48, and 72 hours, respectively. To measure cell viability, the culture medium was replaced with MTT solution. After 3 hours of incubation in a CO ₂ incubator, the formazan crystals obtained by adding MTT solution were dissolved. Cell viability was measured by spectrophotometry at 570 nm, subtracting background at 690 nm.

실시예 4. 초음파 팬텀 분석Example 4. Ultrasonic phantom analysis

ML-MNP(Fe)-HER2의 에코발생능(echogenicity)은 팬텀 샘플을 이용하여 평가하였다. 이 용액은 물로 채워진 챔버에 위치된, 2 mm의 내부 직경을 갖는 플라스틱 연결 튜브(connecting tube)를 이용하여 제조하였다. 2 ml PBS에 녹인 8.7 mg의 입자들 또는 Sonovue 용액을 0.1 ml/s로 플라스틱 튜브를 통과시켰다. 512 MHz 광대역 선형 프로브가 장착된 초음파 스캐너(iU22, Philips, Bothell, WA, USA)를 이미징하는데 사용하였다 (기계지수: Mechanical Index, MI = 0.08).
The echogenicity of ML-MNP (Fe) -HER2 was evaluated using phantom samples. This solution was prepared using a plastic connecting tube with an internal diameter of 2 mm, placed in a chamber filled with water. 8.7 mg of particles or Sonovue solution dissolved in 2 ml of PBS was passed through the plastic tube at 0.1 ml / s. (Mechanical Index, MI = 0.08) was used to image an ultrasound scanner (iU22, Philips, Bothell, WA, USA) equipped with a 512 MHz broadband linear probe.

실시예Example 5. 팬텀 및  5. Phantom and inin vitrovitro MRMR 분석 analysis

T ₁ 강조(T ₁ -w) MR 팬텀 분석을 위해, 다양한 농도(0 1000 nM, [Fe] 또는 [Gd])의 ML-MNP(Fe) 입자들 또는 Gadovist를 0.5% 아가로즈 겔(agarose gel)에 녹여(1:1 부피비) 제조하였다. in vitro MR 이미징을 시험하기 위해, 3 μM [Fe] 농도의 입자들을 HER2-positive SKBR3 및 HER2-negative MCF7 세포들과 함께 1시간 동안 5% CO₂ 인큐베이터에서 반응시켰다. 이어서, US 프로브(probe)를 웰 플레이트의 뒷면에 놓고, 6번의 플래시 펄스(MI=0.61)를 1분간 적용하였다. 과량의 입자들은 배양 배지로 세포 배양물을 세척함으로써 제거하였고, 처리된 세포들을 트립신 처리로 분리한 다음, 3,000 rpm에서 원심분리 하였다. 모든 T ₁ -w MR 이미지들은 3.0-T 임상 MR 스캐너(Philips medical system, Netherland, archieva Release 3.2.1.0 version) 상에서 획득하였다. 축상(axial) 및 관상(coronal) T ₁ -w 이미지들은 TR 400 ms, TE 10 ms, 240 × 240 매트릭스(matrix), 플립 각도(flip angle) 90도, 슬라이스 두께 3 mm, number of averages with 4, 밴드너비 115 Hz/pixel 및 120 × 120 mm의 FOV로 획득하였다.
T ₁ emphasized (T ₁ -w) for MR phantom analysis, various concentrations (0 1000 nM, [Fe] or [Gd]) ML-MNP ( Fe) particles or Gadovist 0.5% agarose gel (agarose gel of ) (1: 1 by volume). in To test the in vitro MR imaging, particles at a concentration of 3 μM [Fe] were reacted with HER2-positive SKBR3 and HER2-negative MCF7 cells in a 5% CO ₂ incubator for 1 hour. The US probe was then placed on the back of the well plate and six flash pulses (MI = 0.61) were applied for one minute. Excess particles were removed by washing the cell culture with the culture medium, the treated cells were separated by trypsin treatment, and then centrifuged at 3,000 rpm. All T ₁ -w MR images were acquired on a 3.0-T clinical MR scanner (Philips medical system, Netherland, archieva Release 3.2.1.0 version). The axial and coronal T ₁ -w images have a TR 400 ms, a TE 10 ms, a 240 × 240 matrix, a flip angle of 90 degrees, a slice thickness of 3 mm, a number of averages with 4 , A bandwidth of 115 Hz / pixel and a 120 × 120 mm FOV.

실시예Example 6.  6. siSurvsiSurv 도입 및 세포 처리 Introduction and cell treatment

서바이빈(Survivin)에 대한 siRNA(siSurv, 19mer)를 Lipo에 로드(load)하기 위해, siSurv (50 μM)와 PA(protamine, 7.5 kDa, 40 )의 복합체들을 전기영동(electrophoresis)을 이용하여 상온에서 5분간 지질 필름(21 mg, 2 ml)에 균질화 시켰다. siSurv-PA를 포함하는 Lipo를 원심분리(13,000 rpm에서 5분)로 2회 세척하여 로딩되지 않은 유전자 복합체를 제거한 다음, 로딩 용량(loading capacity)을 UV-Vis 분광광도기로 측정하였다. 상기 유전자-PA 복합체들을 ML-MNP(Fe)-HER2 제조 과정에 적용하였다. 이어서, 3×10⁴ 세포들을 48-웰 플레이트(BD Falcon) 상에 접종하고, 0.5 ml PBS에 녹인 ML_siSurv-MNP(Fe)-HER2 입자들(1 mg)을 10% FBS를 포함하는 배양 배지의 세포들에 첨가하였다. 배양 1시간 후, 과량의 입자들을 PBS 용액으로 세척하였다. 플래시 적용을 위해, 임상 US 스캐너 프로브를 48-웰 플레이트의 뒷면에 놓고, 플래시 펄스(MI=0.61)를 1분간 적용하였다. 또한 처리된 세포들을 배양 배지로 두 번 세척한 후, 2일 동안 계대배양(sub-cultured)하였다.
To load the siRNA ( siSurv , 19mer) to Lipo against Survivin, siSurv (50 μM) and PA (protamine, 7.5 kDa, 40) were homogenized in lipid film (21 mg, 2 ml) for 5 minutes at room temperature using electrophoresis. Lipo containing siSurv -PA was washed twice by centrifugation (5 min at 13,000 rpm) to remove the unloaded gene complex and the loading capacity was measured by UV-Vis spectrophotometer. The gene-PA complexes were applied to the ML-MNP (Fe) -HER2 preparation process. Subsequently, 3 x 10 ⁴ cells were inoculated on a 48-well plate (BD Falcon) and ML _siSurv- MNP (Fe) -HER2 particles (1 mg) dissolved in 0.5 ml PBS were added to a culture medium Lt; / RTI &gt; cells. After 1 hour of incubation, the excess particles were washed with PBS solution. For flash application, a clinical US scanner probe was placed on the back of a 48-well plate and a flash pulse (MI = 0.61) was applied for 1 minute. The treated cells were also washed twice with culture medium and subcultured for 2 days.

시험예Test Example 1.  One. 마이크로버블Micro bubble (( MBMB ) 및 ) And 나노리포좀(Lipo)의Nanoliposomes (Lipo) 특성 확인 Identify characteristics

다양한 인지질과 콜레스테롤을 균질하게 혼합한 후, 필름 형성 및 기계적 진동을 동반한 소수성 SF₆ 가스의 버블링(bubbling)에 의해 MBs를 합성하였다. 유사하게, Lipos는 필름 형성, 초음파 처리 및 압출(without gas)을 통해 제조되었다. MBs와 Lipos의 모양과 크기 분포는 현미경, 저온전자현미경(cryo-electron microscopy) 및 동적광산란(dynamic light scattering, DLS)에 의해 분석되었다 (도 1의 a와 d). 합성된 MBs와 Lipos는 구형(spherical)으로 각각 평균 직경 1.3 μm와 200 nm를 나타내었다. MB와 Lipo 코어(core)는 각각 소수성의 기체상(hydrophobic gas phase) 및 친수성의 수상(hydrophilic aqueous phase)로 구성되어 있다. 또한 제조 시, MB 쉘(shell)의 알킬 사슬(alkyl chain)을 위치시키기 위한 소수성 염료(fluorescein isothiocyanate, G), 및 수성 Lipo 코어에 도입을 위한 적색의 친수성 염료(Texas Red, R)를 추가하였다.
MBs was synthesized by homogeneous mixing of various phospholipids and cholesterol, followed by bubbling of hydrophobic SF ₆ gas with film formation and mechanical vibrations. Similarly, Lipos was prepared through film formation, sonication, and without gas. The shape and size distributions of MBs and Lipos were analyzed by microscopy, cryo-electron microscopy and dynamic light scattering (DLS) (Fig. 1 (a) and (d)). The synthesized MBs and Lipos were spherical with mean diameters of 1.3 μm and 200 nm, respectively. The MB and Lipo cores are composed of a hydrophilic gas phase and a hydrophilic aqueous phase, respectively. In addition, during the preparation, a hydrophilic dye (fluorescein isothiocyanate, G) for positioning the alkyl chain of the MB shell and a red hydrophilic dye (Texas Red, R) for introduction into the aqueous Lipo core were added .

시험예Test Example 2. 멜라닌 나노입자( 2. Melanin nanoparticles ( MNPMNP )의 특성 확인)

MNPs는 다음과 같이 제조되었다. 간략히 설명하면, 780 μl의 NaOH 용액(1 M)을 90 ml의 도파민 하이드로클라이드 용액(2 mg/ml)에 50℃, 격렬한 교반 하에서 첨가하여 도파민의 자발적인 산화 및 중합반응을 용이하게 함으로써 MNPs를 형성시켰다. 6시간 후, 입자들을 20,000 rpm (10분)에서 원심분리하여 수집하고 증류수로 여러 번 세척하였다. 수득한 구형의 MNP 입자들은 평균 직경 100 nm 및 레귤러 크기 분포를 나타내었다. 자기적 특성(magnetic property)을 도입하기 위해, 1 mg의 MNPs를 2 ml Fe(NO₃)₃·6H₂O (1.85 mM) 용액에 용해시켜 Fe^{3 +} 이온을 MNP 표면에 있는 카테콜(catechol) 유닛의 o-디하이드록실기(o-dihydroxyl group) 상에 킬레이팅시켰다. 이러한 과정은 MNP mg 당 3 μmol의 Fe³⁺ 이온을 로드하였으며, 이는 ICP-AES(inductively coupled plasma atomic emission spectrometer)로 측정되었다. Fe^{3 +} 이온의 킬레이트화는 다양한 pH 수준에서 MNP 표면에 강력하게 유지되었다 (도 5). Fe^{3 +}-도핑된(doped) 입자, 즉 MNP(Fe)는 STEM(scanning-transmission electron microscopy)으로 분석되었다 (도 1의 b). 로드된(loaded) Fe^{3 +} 이온은 입자 표면에 균질하게 위치되고 STEM-장착된 EDX(energy-dispersive x-ray spectrometer)를 이용하여 정성적으로 분석되었다. 따라서 Fe^{3 +} 이온은 T ₁ -강조(T ₁ -w) MR 조영제로서 물 양성자(water protons)의 세로축(longitudinal)(T ₁ ) 감소를 효과적으로 유도할 수 있다.
MNPs were prepared as follows. Briefly, 780 μl NaOH solution (1 M) was added to 90 ml of dopamine hydrochloride solution (2 mg / ml) at 50 ° C under vigorous agitation to facilitate spontaneous oxidation and polymerization of dopamine to form MNPs . After 6 hours, the particles were collected by centrifugation at 20,000 rpm (10 min) and washed several times with distilled water. The obtained spherical MNP particles showed an average diameter of 100 nm and a regular size distribution. To introduce the magnetic properties, 1 mg of MNPs was dissolved in 2 ml of Fe (NO ₃ ) ₃ .6H ₂ O (1.85 mM) solution and Fe ^{3 +} ions were added to the catechol 0.0 &gt; o-dihydroxyl &lt; / RTI &gt; group. This procedure loaded 3 μmol of Fe ³⁺ ions per mg of MNP, which was measured by ICP-AES (inductively coupled plasma atomic emission spectrometer). The chelation of the Fe ^{3 +} ions was strongly maintained on the MNP surface at various pH levels (Figure 5). Fe ^{3 +} -doped particles, MNP (Fe), were analyzed by STEM (scanning-transmission electron microscopy) (FIG. Loaded (loaded) Fe ^{3 +} ions are analyzed qualitatively by using a homogenizer located on the particle surface is mounted STEM- EDX (energy-dispersive x-ray spectrometer). Therefore, Fe ^{3 +} ion T ₁ - it is possible to effectively induce highlighted (T ₁ -w) and the vertical axis (longitudinal) (T ₁₎ reduction of the water protons (water protons) as an MR contrast agent.

시험예Test Example 3.  3. MLML -- MNPMNP 복합체의 구조 분석 Structural Analysis of Composites

MB와 Lipo의 하이브리드를 제조하기 위해 (도 6 참조), Lipo에 있는 DPPE와 함께 타우르트 시약(Traut‘s reagent)을 처리한 후, MB에 있는 DSPE-PEG-SPDP는 설프히드릴 케미컬 작용기(-SH)와 교차-연결(cross-linked) 되었다. 엘만 시약(Ellman’s reagent)은 Lipos 상에 존재하는 설프히드릴 기의 수를 측정하는데 사용되었다. 상기 연결은 UV-Vis 분광광도기를 이용하여 피리딘-2-티온 (탈리기: leaving group)을 측정함으로써 확인되었다 (도 6의 b). ML의 평균 직경은 약 1.6 μm였다. 이어서, 합성된 MNP(Fe)는 Schiff’s 염기 또는 Michael 추가 반응(H. Lee, et al. Science 2007, 318, 426)을 통해, ML 복합체의 Lipo 상에 존재하는 과량의 설프히드릴 모이어티(sulfhydryl moiety)에 부착되었다. ML-MNP(Fe) 복합체 입자들은 메톡시-폴리(에틸렌글리콜)(PEG-SH, 2 kDa)로 처리되어 수성 버퍼에서의 용해도가 증가되었다. After processing the Traut's reagent with DPPE in Lipo to produce a hybrid of MB and Lipo (see FIG. 6), the DSPE-PEG-SPDP in MB has a sulfhydryl chemical functional group (-SH And cross-linked. Ellman's reagent was used to determine the number of sulfhydryl groups present on Lipos. The connection was confirmed by measuring the pyridine-2-thione (leaving group) using a UV-Vis spectrophotometer (Fig. 6 (b)). The mean diameter of ML was about 1.6 μm. The synthesized MNP (Fe) was then purified via Schiff's base or Michael addition reaction (H. Lee, et al. Science 2007, 318, 426) with an excess of sulfhydryl moiety moiety. ML-MNP (Fe) composite particles were treated with methoxy-poly (ethylene glycol) (PEG-SH, 2 kDa) to increase solubility in aqueous buffer.

ML-MNP(Fe) 입자에 의한 암세포 특이적 타겟팅을 위해, HER2(human epidermal growth factor receptor 2)에 대한 항체가 전형적인 반쪽-항체 접합(half-antibody conjugation) 과정에 의해 상기 입자들에 도입되었고, 결합된(anchored) 항체들은 단백질 측정 방법에 의해 정량적으로 분석되었다 (입자의 DPPC mM 당 70 nM HER2 항체) (S. C. Owen, et al. J. Control Release 2013, 172, 395). 녹색 및 적색의 형광 염료-도입된 입자들(M_GL_R-MNP(Fe)-HER2)은 SEM(scanning electron microscope) 및 CLSM(confocal laser scanning microscopy)으로 각각 확인되었다 (도 1c 및 도 6의 c). CLSM에서, MBs는 녹색 형광 염료를 이용하여 관찰하는 경우 쉘(shell) 구조를 명확하게 나타내었으며, 주로 적색 Lipos와 연결되어 있었다. MNP(Fe)s는 SEM 분석에 의해 ML 입자 표면에 아주 작은 점으로 확인되었다.
For cancer cell-specific targeting by ML-MNP (Fe) particles, antibodies against human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) were introduced into the particles by a typical half-antibody conjugation process, Anchored antibodies were quantitatively analyzed by protein assay method (70 nM HER2 antibody per DPPC of particle) (SC Owen, et al., J. Control Release 2013, 172, 395). Green and red fluorescent dye-introduced particles (M _G L _R -MNP (Fe) -HER 2) were confirmed by scanning electron microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy (CLSM) c). In CLSM, MBs clearly showed a shell structure when observed with a green fluorescent dye, and was mainly associated with red Lipos. MNP (Fe) s was confirmed to be a very small point on the surface of ML by SEM analysis.

시험예Test Example 4.  4. MLML -- MNPMNP 복합체의 특이적  Complex specific 타겟팅Targeting 및  And 흡수능Absorption capacity

US 자극에 의한 특이적 타겟팅 능력 및 흡수(uptake) 향상을 조사하기 위해, 제조된 입자들을 유방암 세포와 배양하였다. 형광 염료 및 MNPs의 위치이동(translocation)은 CLSM 및 bio-TEM을 이용하여 분석되었다 (도 2의 a와 b). HER2 양성 세포(SKBR3)는 M_GL_R-MNP(Fe)-HER2 입자 용액(1 ml, 0.33 mg/ml PBS 버퍼)으로 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃, 1시간 동안 처리되었다. 처리 동안, 상기 입자들은 큰-크기의 MBs로 인하여 세포막에 부착하였다. 1분간의 US 자극 (기계지수, MI = 0.61, 플래쉬 기법 사용됨)은 MB 캐비테이션(cavitation)을 유발하여, 세포 시토졸 내로 연결된 Lipos와 MNP(Fe) 입자들의 침투를 증가시켰다. To investigate the specific targeting ability and uptake enhancement by US stimulation, the prepared particles were cultured with breast cancer cells. The translocation of fluorescent dyes and MNPs was analyzed using CLSM and bio-TEM (FIGS. 2 a and b). HER2 positive cells (SKBR3) were treated with a solution of M _G L _R -MNP (Fe) -HER2 (1 ml, 0.33 mg / ml PBS buffer) in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C for 1 hour. During the treatment, the particles adhered to the cell membrane due to the large-sized MBs. One minute of US stimulation (mechanical index, MI = 0.61, flash technique used) induced MB cavitation and increased penetration of Lipos and MNP (Fe) particles bound into the cell cytosol.

그 결과, HER2 양성 세포들은 시토졸에서 녹색 및 적색 형광을 나타내었으며, 그 강도는 유세포분석을 이용하여 분석되었다 (도 7의 c). 비교하여, M_GL_R-MNP(Fe)-HER2 입자들로 동일한 처리를 받은 HER2 음성 세포(MCF7)는, 그 대부분이 비특이적 흡수로 인하여 시토졸에서 작은 양의 입자 내포(particle inclusion)를 나타내었다 (도 7의 a와 b). 따라서 상기 입자 시스템은 암세포 특이적인 선택적 전달 및 외부의 US 플래쉬로 현저히 향상된 흡수 효율을 나타내었다.
As a result, HER2-positive cells showed green and red fluorescence in cytosol, and their intensities were analyzed using flow cytometry (FIG. 7C). In comparison, HER2 negative cells (MCF7) that underwent the same treatment with M _G L _R -MNP (Fe) -HER2 particles showed a small amount of particle inclusion in the cytosol due to their nonspecific uptake (A and b in Fig. 7). The particle system thus exhibited significantly enhanced absorption efficiency with cancer cell specific selective delivery and external US flash.

시험예Test Example 5.  5. MLML -- MNPMNP 복합체의 독성 평가 Toxicity assessment of complex

타겟팅 및 플래쉬 처리 후 세포 생존능은 전형적인 세포 증식 분석법(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium bromide, MTT)을 이용하여 측정되었으며, 여기서 본 발명자들은 입자 농도 및 배양 시간의 효과를 측정하였다. 세포들은 90% 이상의 생존율을 나타내었다 (도 2의 c). 또한 본 발명자들은 세포 소기관 기능들, [예컨대, VDAC(voltage-dependent anion channel; 미토콘드리아 기능-관련된 단백질), 뉴클레오포린 p62 (Nucleoporin p62; 핵막과 관련된 단백질 복합체), 및 항-세포자살 단백질 BAD(Bcl-2-관련된 사멸 프로모터)]의 평가를 통해 입자들의 생체적합성을 조사하였다 (도 2의 d). 모든 마커들은 처리 및 비처리 대조군 세포들에서 유사한 발현 수준을 나타내었으며, US 플래쉬 자극은 세포독성 또는 기능적 이상을 전혀 유발하지 않았다.
Cell viability after targeting and flash treatment was measured using a typical cell proliferation assay (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) The effect of time was measured. The cells showed a survival rate of 90% or more (Fig. 2 (c)). Also, the present inventors have found that the present invention provides a method of screening for a cell organelle function, such as a voltage-dependent anion channel (VDAC), a nucleoporin p62 (nucleoporin p62 protein complex), and an anti- Bcl-2-related death promoter)], the biocompatibility of the particles was investigated (FIG. 2 d). All markers showed similar expression levels in treated and untreated control cells, and US flash stimulation did not cause any cytotoxic or functional abnormalities.

시험예Test Example 6.  6. MLML -- MNPMNP (( FeFe ) 복합체의 ) Complex 이미징Imaging 효과 effect

다음으로, 본 발명자들은 제조된 M_GL_R-MNP(Fe)-HER2 입자의 이미징 양상을 시판중인 임상의 US (SonoVue, Bracco) 또는 T ₁ -w MR (Gadovist, Bayer Schering Pharma) 제제와 비교하였다. Next, the present inventors compared the imaging aspect of the produced M _G L _R -MNP (Fe) -HER 2 particle with that of commercially available clinical US (SonoVue, Bracco) or T ₁ -w MR (Gadovist, Bayer Schering Pharma) Respectively.

US 이미지 조영제로서, 제조된 입자들은 임상의 US 스캐너(iU22, Philips, Bothell, WA, USA)로 측정한 결과, SonoVue와 유사한 에코발생도를 나타내었다 (도 8). 또한 상기 입자들은 0.47 T 자기 이완측정기(magnetic relaxometer; r ₁ = 6.7 mM^-1·s^-1, mq-20, Bruker) 상에서 나타난 바와 같이, Gadovist 보다 2배 더 높은 T ₁ -w MR 조영 신호를 나타내었다. MR 팬텀의 비교 연구는 T ₁ -w MR 조영제로서 상기 입자들의 우수성을 확인한 것이며, 대략 2배 정도 더 낮은 용량으로 동일한 신호 세기를 나타내었다 (도 9).
As US image contrast agents, the particles produced were similar to SonoVue echogenicity as measured by clinical US scanners (iU22, Philips, Bothell, WA, USA) (Fig. 8). The particles also had a T ₁ -w MR imaging signal twice as high as Gadovist, as shown on a 0.47 T magnetic relaxometer ( r ₁ = 6.7 mM ^-1 s ^-1 , mq-20, Bruker) Respectively. A comparative study of MR phantoms confirmed the superiority of the particles as a T ₁ -w MR contrast agent and showed the same signal intensity at approximately two-fold lower capacity (FIG. 9).

시험예Test Example 7. 암세포  7. Cancer cells 타겟팅Targeting 및  And MRMR 이미징Imaging 향상 Improving

암세포 특이적 US 이미징 능력을 파악하기 위해, SKBR3 세포들은 상기 입자들로 타겟팅된 후 PBS 버퍼에 수집되었다. 그런 다음 상기 용액은 5 mm 플라스틱 튜브에 옮겨져, 표준 이미징-모드 조명(MI = 0.08) 하에서 현저한 US 에코발생도를 나타내었다 (도 3의 a). US 플래쉬 (MI = 0.61) 적용한 후, MB는 완전하게 파괴되었고(cavitated), 그로 인해 6 플래쉬 내에 에코발생도를 감소시켰다 (도 8의 b). To understand cancer cell specific US imaging capabilities, SKBR3 cells were targeted to the particles and collected in PBS buffer. The solution was then transferred to a 5 mm plastic tube and exhibited significant US echo generation under standard imaging-mode illumination (MI = 0.08) (FIG. 3 a). After applying the US Flash (MI = 0.61), the MB was completely destroyed (cavitated), thereby reducing the echo occurrence within the 6 flashes (FIG. 8b).

T ₁ -w MR 이미징의 US 플래쉬-매개된 향상을 확인하기 위해, HER2 양성(SKBR3) 및 음성(MCF7) 세포들은 입자 타겟팅 (도 3의 b), 플래쉬 노출 (1분) 및 잔류물 제거 처리되었다. 처리된 세포들이 MR 이미징에 사용되었다 (3.0-T, Philips, 도 3의 c). (입자 처리가 없는 상태에서) 플래쉬-처리된 세포는 HER 발현에 관계없이 가장 낮은 T ₁ -w MR 신호를 나타내었다. (ML 복합체 없는) MNP(Fe)-HER2는 마찬가지로 낮은 신호를 나타내었으며, 그것들만으로는 MR 이미징 효율을 증가시키기에 항체-접합된 MNP(Fe) 입자들이 충분치 않았음을 나타내고 있다. 그러나 M_GL_R-MNP(Fe)-HER2- 및 플래쉬-처리된 SKBR3 세포들은 현저하게 밝은 이미지를 나타내었다. 본 발명자들은 외부의 플래쉬 자극을 통해서도 T ₁ -w MR 신호의 증가를 확인하였다.
T ₁ -w US flash of MR Imaging - in order to check the parameters increase, HER2-positive (SKBR3) and negative (MCF7) cells to target particles (Fig. 3 b), a flash exposure (1 min) and a residue removal process . Treated cells were used for MR imaging (3.0-T, Philips, Fig. 3c). (In the absence of particle treatment) the flash-treated cells exhibited the lowest T ₁ -w MR signal regardless of HER expression. MNP (Fe) -HER2 (without ML complex) showed a similarly low signal, indicating that only MNP (Fe) particles antibody-conjugated to increase MR imaging efficiency were not sufficient. However, M _G L _R -MNP (Fe) -HER2- and flash-treated SKBR3 cells displayed a significantly bright image. The present inventors confirmed the increase of the T ₁ -w MR signal even through an external flash stimulus.

시험예Test Example 8. 치료 유전자 전달 및  8. Therapeutic gene transfer and 치료적Therapeutic 적용 apply

마지막으로, 본 발명은 유전자 전달을 위한 복합체 입자의 효율성을 확인하였다. 서바이빈(Survivin)에 대한 유전자(siSurv)는 세포자살을 촉발시키는 치료 유전자로 잘 알려져 있으며; 서바이빈에 대한 siRNA(siSurv, 19-mer, Thermo-scientific)는 Lipo 입자들 내부에 도입될 수 있다 (A. Gabizon, et al. Eur. J. Pharm . Sci. 2012, 45, 388). Finally, the present invention confirmed the efficiency of the composite particles for gene delivery. The gene for survivin ( siSurv ) is well known as a therapeutic gene that triggers apoptosis; SiRNA ( siSurv , 19-mer, Thermo-scientific) for survivin can be introduced into Lipo particles (A. Gabizon, et al., Eur. J. Pharm . Sci .

간략히 설명하면, 지질 필름을 동결건조 한 후 PA 당 1.25 유전자로 최적화된 비율로서, 전기영동 프로토콜을 이용하여, siSurv (50 μM) 및 프로타민(protamine, PA; 7.5 kDa, 40 μM)의 복합 용액으로 균질화하였다 (도 4의 a). 로딩 용량(loading capacity)은 UV-Vis 분광광도기로 측정된 바와 같이, 약 82%였다 (도 4의 b). siSurv-PA를 포함하는 Lipos는 MB에 부착(ML_siSurv)된 후 MNP(Fe) 및 HER2 항체에 연결(anchored)되고 접합(conjugated)되었다. 이러한 유전자 도입은 참조 역할을 하는 ML-MNP(Fe)-HER2와 형태 및 입자 크기의 비교로도 명백한 것처럼, 입자 시스템을 변경시키지는 않았다. 타겟 세포(SKBR3)는 1시간 동안 치료 입자들과 배양된 후, US 플래쉬(1분)에 제시되었다. 운반 유전자는 US-매개된 흡수 향상 과정으로 인하여 효과적으로 세포에 내재화되었으며, 이러한 흡수는 대조군과 비교하여 이들 세포에서 서바이빈 발현을 효과적으로 하향-조절시켰다 (도 4의 c). Briefly, the lipid film was lyophilized and then mixed with a complex solution of siSurv (50 μM) and protamine (PA; 7.5 kDa, 40 μM) using an electrophoresis protocol at an optimized ratio of 1.25 genes per PA And homogenized (Fig. 4 (a)). The loading capacity was about 82% as measured by the UV-Vis spectrophotometer (Figure 4b). Lipos containing siSurv- PA were attached to MB (ML _siSurv ) and then anchored and conjugated to MNP (Fe) and HER2 antibodies. This gene transfer did not alter the particle system, as evidenced by the comparison of ML-MNP (Fe) -HER2, which serves as a reference, with morphology and particle size. The target cells (SKBR3) were incubated with the therapeutic particles for 1 hour and then presented in US flash (1 minute). The delivery gene was effectively internalized into the cells due to the US-mediated uptake of the proteins, and this absorption effectively down-regulated survivin expression in these cells as compared to the control (Fig. 4c).

siRNA 전달 후 세포 생존율은 플래쉬 72시간 후 60% 이하로 감소하였으나, 대조군 세포들은 90% 이상의 세포생존율을 나타내었다 (도 4의 d). 이러한 결과는 MB-기반 입자 시스템이 연결된 Lipo에 도입된 생체-분자(bio-molecules)의 선택적 전달 효율을 향상시킬 수 있음을 나타내었다.
Cell viability after siRNA delivery decreased to less than 60% after 72 hours of flash but control cells showed cell viability above 90% (FIG. 4 d). These results demonstrate that the MB-based particle system can enhance the selective delivery efficiency of bio-molecules introduced into linked Lipo.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims (14)

마이크로버블;
상기 마이크로버블과 공유결합된 리포좀;
상기 리포좀 및 마이크로버블의 표면에 부착되고 철 이온이 결합된 멜라닌 나노입자; 및
상기 마이크로버블 또는 리포좀 표면에 부착된 HER2 항체를 포함하는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체.
Microbubbles;
Liposomes covalently bonded to the microbubbles;
Melanin nanoparticles attached to the surfaces of the liposome and microbubbles and bound with iron ions; And
A microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex comprising a HER2 antibody attached to the surface of said microbubble or liposome.
제 1항에 있어서, 상기 마이크로버블은 필름형성물질인 DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), 음전하 화합물인 DCP (dicetyl phosphate), 아민기를 갖는 화합물인 DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 다이설파이드기를 갖는 화합물인 DSPE-PEG-SPDP {1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000]}, 및 콜레스테롤의 혼합물을 필름 형성 및 기계적 진동을 동반한 소수성 가스의 버블링에 의해 합성된 것을 특징으로 하는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체.
The microbubble according to claim 1, wherein the microbubble is selected from the group consisting of 1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC), dicetyl phosphate (DCP) DSPE-PEG-SPDP {1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N- [PDP (polyethylene glycol) -2000]], which is a compound having a disulfide group, and dipalmitoyl- Liposome-melanin nanoparticle complex characterized in that the mixture of cholesterol is synthesized by bubbling a hydrophobic gas with film formation and mechanical vibration.
제 1항에 있어서, 상기 리포좀은 필름형성물질인 DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), 음전하 화합물인 DCP (dicetyl phosphate), 아민기를 갖는 화합물인 DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 및 콜레스테롤의 혼합물을 필름 형성, 초음파 처리 및 압출을 통해 제조된 것을 특징으로 하는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체.
The liposome according to claim 1, wherein the liposome is selected from the group consisting of 1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC), dicetyl phosphate (DCP) dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, and cholesterol is produced through film formation, ultrasonic treatment and extrusion.
제 1항에 있어서, 상기 마이크로버블 또는 리포좀은 내부에 FITC, 텍사스 레드(Texas-red). RITC, Cy3, Cy5 및 Cy7 으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체.
3. The microbubble or liposome of claim 1, wherein the microbubble or liposome comprises FITC, Texas-red. RITC, Cy3, Cy5, and Cy7. The microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex according to claim 1,
제 1항에 있어서, 상기 멜라닌 나노입자는 멜라닌 전구체인 도파민의 자발적인 산화 및 중합반응으로부터 합성된 것을 특징으로 하는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체.
The microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex according to claim 1, wherein the melanin nanoparticles are synthesized from spontaneous oxidation and polymerization of dopamine as a melanin precursor.
삭제delete 삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 HER2 항체는 마이크로버블과 리포좀 표면 모두에 부착된 것을 특징으로 하는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체.
2. The microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex of claim 1, wherein the HER2 antibody is attached to both the microbubble and the liposome surface.
제 1항에 따른 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 포함하는 형광, 초음파 및 자기공명(MR)에 대한 다중 모드(multi-modal) 분석용 조영제.
A contrast agent for multi-modal analysis of fluorescence, ultrasound and magnetic resonance (MR) comprising the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex according to claim 1.
제 9항에 있어서, 상기 복합체는 리포좀 내부에 항암 유전자인 서바이빈 siRNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조영제.
10. The contrast agent according to claim 9, wherein the complex further comprises a survivin siRNA, which is an anti-cancer gene, in the liposome.
삭제delete 삭제delete 하기 단계들을 포함하는, 암세포 특이적이고 형광, 초음파 및 자기공명(MR)에 대한 다중 모드(multi-modal) 이미징이 가능한 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체의 제조방법:
a) 필름형성물질인 DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), 음전하 화합물인 DCP (dicetyl phosphate), 아민기를 갖는 화합물인 DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 다이설파이드기를 갖는 화합물인 DSPE-PEG-SPDP {1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000]}, 및 콜레스테롤의 혼합물에 FITC, 텍사스 레드(Texas-red). RITC, Cy3, Cy5 및 Cy7 으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질을 첨가하여 인지질 필름을 형성시킨 후 이를 유기용매에 넣고 소수성 가스의 버블링(bubbling) 및 기계적 진동(vibrating)을 통해 마이크로버블을 합성하는 단계;
b) 필름형성물질인 DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), 음전하 화합물인 DCP (dicetyl phosphate), 아민기를 갖는 화합물인 DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 및 콜레스테롤의 혼합물에 FITC, 텍사스 레드(Texas-red). RITC, Cy3, Cy5 및 Cy7 으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질을 첨가하여 형성된 인지질 필름을 유기용매에 넣고 초음파 분산 및 나노필터를 이용한 압출을 통해 리포좀을 합성하는 단계;
c) 멜라닌 나노입자를 포함하는 용액에 철 이온을 포함하는 용액을 첨가하여 철 이온을 멜라닌 나노입자에 결합시키는 단계;
d) 상기 b)단계에서 합성된 리포좀에 티올기를 도입시킨 후, 상기 a)단계에서 합성된 마이크로버블과 진탕(shaking)시켜 마이크로버블-리포좀 복합체를 합성하는 단계;
e) 상기 d)의 티올화된 마이크로버블-리포좀 복합체를 상기 c)단계의 철 이온이 결합된 멜라닌 나노입자와 혼합하여 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체를 제조하는 단계; 및
f) 상기 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체에 말레이미드(maleimide) 기를 도입한 후 이를 HER2 항체와 결합시키는 단계.
A method of preparing microbubble-liposome-melanin nanoparticle complexes capable of multi-modal imaging for cancer, cell specific, fluorescence, ultrasound and magnetic resonance (MR), comprising the steps of:
a) a film forming material, DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), a negative charge DCP (dicetyl phosphate), a compound having an amine group, DPPE -Phosphoethanolamine), a compound having a disulfide group, DSPE-PEG-SPDP {1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine- N- (Texas-red). RITC, Cy3, Cy5, and Cy7 to form a phospholipid film, and then introducing the phospholipid film into an organic solvent to synthesize a microbubble through bubbling and mechanical vibrating of a hydrophobic gas;
b) DPP (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), which is a film forming material, dicetyl phosphate (DCP) -phosphoethanolamine, and a mixture of cholesterol and FITC, Texas-red. RITC, Cy3, Cy5, and Cy7 is added to an organic solvent, followed by ultrasonic dispersion and synthesis of a liposome by extrusion using a nanofilter;
c) adding a solution containing iron ions to a solution containing melanin nanoparticles to bind iron ions to the melanin nanoparticles;
d) synthesizing a microbubble-liposome complex by introducing a thiol group into the liposome synthesized in the step b) and then shaking the microbubble with the microbubble synthesized in the step a);
e) preparing a microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex by mixing the thiolated microbubble-liposome complex of d) with iron ion-bound melanin nanoparticles of step c); And
f) introducing a maleimide group into the microbubble-liposome-melanin nanoparticle complex and then binding it to the HER2 antibody.
제 13항에 있어서, 상기 b) 단계에서 형성된 인지질 필름을 유기용매에 넣기 전에, 생체고분자와 항암 유전자인 서바이빈 siRNA의 혼성체 용액으로 균질화하여 항암 유전자인 siRNA를 담지시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.14. The method according to claim 13, further comprising, before the phospholipid film formed in step b) is homogenized with a hybrid solution of a biopolymer and a survivin siRNA, which is an anti-cancer gene, &Lt; / RTI &gt;

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