KR101681951B1

KR101681951B1 - 나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경

Info

Publication number: KR101681951B1
Application number: KR1020100039815A
Authority: KR
Inventors: 천홍구
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2010-04-29
Publication date: 2016-12-05
Also published as: WO2011136527A9; KR20110120415A; WO2011136527A3; WO2011136527A2

Abstract

나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경이 제공된다. 본 형광 근접장 현미경은, 입사광원을 좁은공간에 집중시키고 상기 좁은공간 안에 존재하는 형광시료의 양자수율(quantum yield)을 변경시키며 상기 좁은공간 안에서 발생한 형광신호출력을 특정방향으로 집중시키도록 구성된 나노안테나, 상기 나노안테나의 상기 좁은공간에 연결되어, 상기 좁은공간으로 형광시료를 도입하기 위한 이동통로를 제공하는 나노포어 또는 나노채널을 포함한다. 이에 의해, 나노안테나의 특정 좁은공간에 입사광원을 집중시키고 형광시료의 낮은 양자수율을 높이며 형광신호출력을 특정방향에서 효율적으로 검출할 수 있게되어, 높은 신호대잡음비 및 고분해능 형광검출이 가능해지고, 나노포어 또는 나노채널을 통해 형광시료를 나노안테나로 도입시킴으로써, 나노안테나의 기계적 움직임 없이 시료의 스캐닝이 가능해진다. 상기 나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경은, 형광표지된 DNA를 상기 나노포어 또는 나노채널을 통해 선형화하여 통과 시키면서, 상기 좁은공간 안에서 순차적으로 발생한 형광신호를 읽음으로써 DNA 염기서열 분석이 가능하다.

Description

나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경{Nanofluidic fluorescence apertureless near-field microscopy}

본 발명은 형광시료 검출 시스템 및 그 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 나노안테나와 나노포어(또는 나노채널)를 결합하여 높은 신호대잡음비 및 고분해능 형광검출이 가능하고, 기계적 움직임 없이 시료의 스캐닝이 가능한 나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경에 관한 것이다.

DNA sequencing 방법의 가장 중요한 성능 지표는 DNA read length와 throughput이다. 최근 나노포어 또는 나노채널에서의 전류측정을 이용한 direct DNA sequencing 방법이 주목을 받고 있는데, 이는 이 방법이 가진 높은 공간 분해능, 높은 throughput, 그리고 이론상 무제한의 read length의 장점 때문이다. 하지만, 마이크로 채널 또는 나노채널에서의 시료검출감도는 일반적으로 형광신호검출법이 가장 높다. 그러나, 회절한계(diffraction limit)에 의해, excitation 광원은 각 염기서열을 읽을 만큼 충분히 작게 모아질 수 없다. 예를 들어, 488 nm 레이저는 244 nm 이하의 크기로 focus 될 수 없다. DNA 각 염기 사이의 거리는 0.33 nm이므로, 이 244 nm의 focused excitation 광원은 700개 이상의 염기를 한꺼번에 exite시켜, 출력신호의 deconvolution이 어렵다. 따라서, 고감도의 단분자 DNA sequencing을 위해서는 이 회절한계를 극복해야한다.

형광 근접장 현미경(near-field scanning optical microscopy, NSOM)는 입사광원의 파장보다 작은 스케일의 나노안테나를 사용하여 회절한계를 넘는 국부적 excitation와 검출을 가능하게 하며, 그 결과 약 10 nm의 분해능이 가능하다. 나노안테나의 가장 큰 장점은 렌즈와 같이 입사광원을 특정 좁은공간에 집중시켜 optical field를 enhance할 수 있다는 것이다. 한편, 나노안테나는 렌즈와 다른 장점이 두 가지 있는데, 첫째는 형광시료의 낮은 양자수율(quantum yield)이 나노안테나의 상기 좁은공간에서 증가한다는 점이고, 둘째는 상기 좁은공간에서 발생한 형광신호출력이 방향성을 갖게 되어 특정방향에서 효율적으로 형광신호를 검출할 수 있다는 것이다.

이 세가지 효과-입사광 집중 및 증폭, 형광시료 양자수율 증가, 형광신호출력의 방향성-에 의해 형광 근접장 현미경의 높은 신호대잡음비 및 고분해능 형광검출이 가능해진다.

형광 근접장 현미경을 이용해 DNA sequencing을 하기 위해서는, 형광표지된 DNA를 시료 스테이지 위에 겹치지않게 선형으로 펼치고 고정한 뒤 2차원 영상을 획득해야 한다. 시료 스테이지 위에 DNA를 겹치지 않게 선형으로 펼치고 고정하는 것은 복잡한 과정이며, 2차원 영상 획득을 위한 나노안테나의 기계적인 스캐닝은 구현이 복잡하며 긴 시간을 소요한다. 따라서, 나노안테나의 기계적 스캐닝과 DNA 펼침 및 고정 과정이 필요 없으며 영상획득 속도를 높일 수 있는 형광 근접장 현미경의 개발이 필요하다.

DNA는 선형 고분자이기 때문에, 염기서열 분석을 위한 영상획득은 기계적 스캐닝을 통한 2차원 영상일 필요가없다. 나노안테나에 나노포어(또는 나노채널)를 위치시켜 DNA를 선형으로 통과시키면 1차원 영상이 얻어진다. 이 나노안테나-나노포어(또는 나노채널) 통합구조는 형광시료를 정확히 나노안테나에 위치시킬 수 있어, 전통적 형광 근접장 현미경에서 2차원 기계적 스캐닝 스테이지, 위치 feedback 제어, 입사광원 초점 alignment 등의 요소를 제거할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은, 나노안테나와 나노포어(또는 나노채널)를 결합하여 높은 신호대잡음비 및 고분해능 형광검출이 가능하고, 기계적 움직임 없이 시료의 스캐닝이 가능한, 나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경 및 그 방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른, 나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경은, 입사광원을 좁은공간에 집중시키고, 상기 좁은공간 안에 존재하는 형광시료의 양자수율을 변경시키며, 상기 좁은공간 안에서 발생한 형광신호출력을 특정방향으로 집중시키도록 구성된 나노안테나; 및 상기 나노안테나의 상기 좁은공간에 연결되어, 상기 좁은공간으로 형광시료를 도입하기 위한 이동통로를 제공하는 나노포어 또는 나노채널;을 포함한다.

그리고, 상기 나노안테나는 두 개 이상의 근접한 도체로 구성될 수 있다.

또한, 상기 나노안테나는 하나 이상의 동심원 구조로 구성될 수 있다.

또한, 상기 나노안테나는 이트리움실리사이드 (YSi₂) 나노와이어로 구성된 다이폴안테나(dipole antenna)일 수 있다.

또한, 상기 나노안테나는 탄소나노튜브(carbon nanotube)로 구성된 다이폴안테나일 수 있다.

또한, 형광 근접장 현미경은, 형광표지된 DNA를 상기 나노포어 또는 나노채널을 통해 선형화하여 통과 시키면서, 상기 좁은공간 안에서 순차적으로 발생한 형광신호를 읽어 DNA 염기서열을 분석할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른, 형광 근접장 현미경을 사용하여 형광시료를 검출하는 방법은, 상기 형광 근접장 현미경이 입사광원을 좁은공간에 집중시키고, 상기 좁은공간 안에 존재하는 형광시료의 양자수율을 변경시키며, 상기 좁은공간 안에서 발생한 형광신호출력을 특정방향으로 집중시키도록 구성된 나노안테나; 및 상기 나노안테나의 상기 좁은공간에 연결되어, 상기 좁은공간으로 형광시료를 도입하기 위한 이동통로를 제공하는 나노포어 또는 나노채널;을 포함하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에 따른, 형광 근접장 현미경을 사용하여 DNA 염기서열을 분석하는 방법은, 상기 형광 근접장 현미경이 입사광원을 좁은공간에 집중시키고, 상기 좁은공간 안에 존재하는 형광시료의 양자수율을 변경시키며, 상기 좁은공간 안에서 발생한 형광신호출력을 특정방향으로 집중시키도록 구성된 나노안테나; 및 상기 나노안테나의 상기 좁은공간에 연결되어, 상기 좁은공간으로 형광시료를 도입하기 위한 이동통로를 제공하는 나노포어 또는 나노채널;을 포함하는 것이 바람직하다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 나노안테나와 나노포어(또는 나노채널)를 결합하여 높은 신호대잡음비 및 고분해능 형광검출이 가능하고, 기계적 움직임 없이 시료의 스캐닝이 가능한 나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경 구성이 가능하다. 또한, 나노안테나의 기계적 스캐닝과 DNA 펼침 및 고정 과정이 필요 없으며 1차원 영상획득 속도를 높일 수 있어, DNA sequencing에 응용 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 나노안테나-나노포어 통합 시스템의 블록도,
도 2는 나노안테나-나노채널 통합 시스템의 제작 과정의 설명에 제공되는 도면,
도 3은 나노안테나-나노포어 통합 시스템의 다양한 나노안테나 구조의 설명에 제공되는 도면, 그리고,
도 4는 나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경을 사용한 DNA 염기서열분석 방법의 설명에 제공되는 도면이다.

이하에서는 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노안테나-나노포어 통합 시스템의 블록도이다. 도 1에 표시된 나노안테나-나노포어 통합 시스템은, 나노안테나와 상기 나노안테나로 형광시료를 도입하기 위한 이동통로를 제공하는 나노포어를 포함하여, 상기 나노안테나의 특정 좁은공간에 입사광원을 집중시키고 형광시료의 낮은 양자수율을 높이며 형광신호출력을 특정방향에서 효율적으로 검출할 수 있게하여, 높은 신호대잡음비 및 고분해능 형광검출이 가능해지고, 나노포어를 통해 형광시료를 나노안테나로 도입시킴으로써, 나노안테나의 기계적 움직임 없이 시료의 스캐닝이 가능하게 하는 시스템이다.

본 실시예에 따른 나노안테나-나노포어 통합 시스템은 도 1의 side view(10a)와 bottom view(10b)에 도시된 바와 같이, 나노멤브레인지지층(11), 나노멤브레인(12), 나노포어(14) 및 나노안테나(13a)로 이루어진다.

나노멤브레인지지층(11)은 나노포어(14)가 뚫려있는 나노멤브레인(12)을 고정하기 위한 층이다.

나노멤브레인(12)은 나노안테나(13a)와 나노포어(14)가 위치한 박막이다.

나노안테나(13a)는 입사광원을 좁은공간에 집중시키고 상기 좁은공간 안에 존재하는 형광시료의 양자수율을 변경시키며 상기 좁은공간 안에서 발생한 형광신호출력을 특정방향으로 집중시키도록 구성된 구조체이다. 본 실시예에 따른 나노안테나(13a)는 다이폴안테나이다.

나노포어(14)는 나노안테나의 상기 좁은공간으로 형광시료를 도입하기 위한 이동통로이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노안테나-나노채널 통합 시스템의 제작 과정의 설명에 제공되는 도면이다. 도 2에 표시된 나노안테나-나노채널 통합 시스템은, 나노안테나와 상기 나노안테나로 형광시료를 도입하기 위한 이동통로를 제공하는 나노채널을 포함하여, 상기 나노안테나의 특정 좁은공간에 입사광원을 집중시키고 형광시료의 낮은 양자수율을 높이며 형광신호출력을 특정방향에서 효율적으로 검출할 수 있게하여, 높은 신호대잡음비 및 고분해능 형광검출이 가능해지고, 나노채널을 통해 형광시료를 나노안테나로 도입시킴으로써, 나노안테나의 기계적 움직임 없이 시료의 스캐닝이 가능하게 하는 시스템이다.

본 실시예에 따른 나노안테나-나노채널 통합 시스템은 도 2의 side view(20a, 20c, 20e, 20g)와 top view(20b, 20d, 20f, 20h)에 도시된 바와 같이, 나노안테나지지층(21), 나노안테나(13a), 나노안테나커버박막층(23), 나노안테나커버층(24), 나노채널(25), 나노채널시료도입부(26) 및 나노채널시료출구부(27)로 이루어진다.

첫 단계 side view(20a)와 top view(20b)는 나노안테나지지층(21) 위에 나노안테나(13a)를 공정한 상태를 보여준다.

두번째 단계 side view(20c)와 top view(20d)는 공정된 나노안테나(13a)를 나노안테나커버박막층(23)으로 덮는 단계를 보여준다.

세번째 단계 side view(20e)와 top view(20f)는 나노안테나커버박막층(23), 나노안테나(13a), 나노안테나지지층(21)에 나노채널(25), 나노채널시료도입부(26) 및 나노채널시료출구부(27)를 공정하는 단계를 보여준다. 필요에 따라서는 나노안테나커버박막층(23) 공정 없이 본 단계를 시행할 수 있다. 본 단계의 나노채널(25), 나노채널시료도입부(26) 및 나노채널시료출구부(27)를 공정은 focused ion beam (FIB) milling을 사용하는 것이 바람직하다. 나노채널(25)의 길이는 입사광원의 회절한계보다 긴 것이 바람직하며, 나노채널시료도입부(26) 및 나노채널시료출구부(27)는 마이크로채널인 것이 바람직하다. 상기 나노채널(25), 나노채널시료도입부(26) 및 나노채널시료출구부(27) 공정이 끝난 뒤, 나노안테나커버층(24)을 bonding 시켜준다.

네번째 단계 side view(20g)와 top view(20h)는 나노안테나커버층(24)의 bonding이 끝난 상태를 보여준다. 나노안테나커버층(24)을 bonding함으로써 나노채널(25)이 완성된다.

본 실시예에 따른 나노안테나-나노채널 통합 시스템의 나노안테나-나노포어 통합 시스템에 대한 장점은, 높은 신호대잡음비 형광 검출이 가능하다는 것이다. 나노안테나-나노포어 통합 시스템의 경우는 입사광원이 시료가 담긴 공간을 통해 나노안테나로 조사되기 때문에, 이 공간 안에 존재하는 형광시료로부터 높은 background 형광신호출력이 발생할 수 있다. 나노안테나-나노채널 통합 시스템의 나노채널(25)의 길이를 입사광원의 회절한계보다 길에 공정하면, 입사광원을 나노채널(25)에만 국한되도록 모을 수 있어, 많은 양의 시료가 담겨있는 나노채널시료도입부(26) 및 나노채널시료출구부(27)에 입사광원이 조사되지 않게 할 수 있다. 따라서, 나노채널시료도입부(26) 및 나노채널시료출구부(27)로부터의 background 형광신호출력을 크게 낮출 수 있어 결과적으로 높은 신호대잡음비 형광 검출이 가능해진다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노안테나-나노포어 통합 시스템의 다양한 나노안테나 구조의 설명에 제공되는 도면이다. 전체 구조는 도 1에 예시된 바와 동일하다.

본 실시예에 따른 나노안테나-나노포어 통합 시스템의 다양한 나노안테나 구조 도 2가 도 1의 예시와 다른 점은, 도 1의 나노안테나(13a)가 bowtie 형태의 나노안테나(13b)와 동심원 형태의 나노안테나(13c)로 바뀐 것이다.

Bowtie 나노안테나(13b)를 이용한 나노안테나-나노포어 통합 시스템의 side view(10c)와 bottom view(10d)에 도시된 바와 같이, bowtie 나노안테나(13b)에 의해 입사광원이 집중되고 형광시료의 낮은 양자수율을 높이며 형광신호출력에 방향성을 갖게하는 특정 좁은영역에, 시료를 도입하기 위한 나노포어(14)가 위치해있다. 도 1에 예시된 다이폴안테나 형태의 나노안테나(13a)와 도 2에 예시된 bowtie 나노안테나(13b)는 두 개 이상의 근접한 도체로 나노안테나를 구현한 예이다.

동심원 나노안테나(13c)를 이용한 나노안테나-나노포어 통합 시스템의 side view(10e)와 bottom view(10f)에 도시된 바와 같이, 동심원 나노안테나(13c)에 의해 입사광원이 집중되고 형광시료의 낮은 양자수율을 높이며 형광신호출력에 방향성을 갖게하는 특정 좁은영역에, 시료를 도입하기 위한 나노포어(14)가 위치해있다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경을 사용한 DNA 염기서열분석 방법의 설명에 제공되는 도면이다.

도 4에 표시된 나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경을 사용한 DNA 염기서열분석 방법은, 나노안테나에 의해 입사광원이 집중되고 형광시료의 낮은 양자수율을 높이며 형광신호출력에 방향성을 갖게하는 특정 좁은영역으로, 형광표지된 DNA를 나노포어(또는 나노채널)를 통해 선형화하여 통과 시키면서 순차적으로 발생한 형광신호를 읽어 DNA 염기서열을 분석하는 방법이다.

본 실시예에 따른 나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경을 사용한 DNA 염기서열분석 방법에는 도 4에 도시된 바와 같이, 나노멤브레인지지층(11), 나노멤브레인(12), 나노포어(14), 나노안테나(13), 전극(31), 파워서플라이(32), DNA(33), 형광레이블(34a, 34g, 34t, 34c), 입사광원(35i), 형광신호출력(35e), 디텍터(36)가 필요하다.

전극(31)은 파워서플라이(32)의 출력 전압 또는 전류를 나노포어(14) 양단에 걸어 DNA(33)을 전기영동에 의해 나노포어(14)를 통과하도록 하기 위한 것이다.

파워서플라이(32)는 DNA(33)의 전기영동을 제어하기 위해 전압 또는 전류를 걸어주는 시스템이다.

입사광원(35i)은 형광레이블(34a, 34g, 34t, 34c)을 excite 시키기 위해 비춰주는 것이다.

형광신호출력(35e)은 나노안테나(13)에 의해 입사광원(35i)이 모아진 좁은공간에서 발생한 형광레이블(34a, 34g, 34t, 34c)의 형광신호이다.

디텍터(36)은 형광신호출력(35e)을 검출하는 것이다.

형광레이블(34a, 34g, 34t, 34c)은 각각 A, G, T, C에 해당하는 형광신호출력(35e)을 내기 위해 DNA에 부착된 형광물질로써, 각기 다른 출력 파장을 갖는 것이 바람직하다. DNA(33)의 각염기 간격은 0.33nm로 모든 염기를 형광부착하는 것은 어려운 공정이다. 만약 모든 염기에 형광부착을 할 수 있다 해도, 각 형광레이블 사이의 가까운 거리는 fluorescence resonance energy transfer를 일으켜, 형광신호 출력 해석이 복잡해진다. 따라서, 형광레이블은 특정 간격을 갖고 위치하는 것이 바람직하다. 또는 Designed DNA polymer 기술을 사용해 target DNA를 augmentation시킨 다음 각 염기에 해당하는 코드에 형광레이블을 부착하여, 각 염기에 해당하는 형광레이블(34a, 34g, 34t, 34c)이 서로 일정 간격 떨어져 있게 하는 것이 바람직하다.

13: 나노안테나 14: 나노포어
25: 나노채널 33: DNA
34: 형광레이블 36: 디텍터

Claims

나노유체역학 기반의 형광 근접장 현미경으로서,
입사광원을 좁은공간에 집중시키고, 상기 좁은공간 안에 존재하는 형광시료의 양자수율(quantum yield)을 변경시키며, 상기 좁은공간 안에서 발생한 형광신호출력을 특정방향으로 집중시키도록 구성된 나노안테나;
상기 나노안테나의 상기 좁은공간에 연결되어, 상기 좁은공간으로 형광시료를 도입하기 위한 이동통로를 제공하는 나노포어 또는 나노채널; 및
파워서플라이의 출력 전압 또는 전류를 상기 나노포어 또는 상기 나노채널 양단에 걸어주는 전극;을 포함하는 형광 근접장 현미경.
제 1항에 있어서, 상기 나노안테나가 두 개 이상의 근접한 도체로 구성된 형광 근접장 현미경.
제 1항에 있어서, 상기 나노안테나가 하나 이상의 동심원 구조로 구성된 형광 근접장 현미경.
제 1항에 있어서, 상기 나노안테나가 이트리움실리사이드 (YSi₂) 나노와이어로 구성된 다이폴안테나인 형광 근접장 현미경.
제 1항에 있어서, 상기 나노안테나가 탄소나노튜브로 구성된 다이폴안테나인 형광 근접장 현미경.
제 1항에 있어서, 형광표지된 DNA를 상기 나노포어 또는 나노채널을 통해 선형화하여 통과시키면서, 상기 좁은공간 안에서 순차적으로 발생한 형광신호를 읽어 DNA 염기서열을 분석하는 형광 근접장 현미경.
형광 근접장 현미경을 사용하여 형광시료를 검출하는 방법에 있어서, 상기 형광 근접장 현미경이 제1항에 따른 형광 근접장 현미경인 것을 특징으로 하는 형광시료 검출 방법.
형광 근접장 현미경을 사용하여 DNA 염기서열을 분석하는 방법에 있어서, 상기 형광 근접장 현미경이 제1항에 따른 형광 근접장 현미경인 것을 특징으로 하는 DNA 염기서열 분석 방법.