KR101681886B1 - 지르코니아 결합능을 가지는 펩타이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 지르코니아 무기질 표면에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 펩타이드에 기능성 약물을 추가 도입하여 지르코니아 표면에 안정하게 고정시켜 약물의 활성을 장기간 유지시키도록 하는 연결 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지르코니아에 결합하는 펩타이드는 지르코니아 표면에 안정적으로 고정됨으로써, 상기 펩타이드에 도입된 생리활성물질의 활성을 지르코니아 표면에서 안정하게 장기간 동안 유지시킬 수 있으므로, 이를 이용한 외과적 재생 치료에 유용하다.
Description
본 발명은 지르코니아 무기질 표면에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 펩타이드에 기능성 약물을 추가 도입하여 지르코니아 표면에 안정하게 고정시켜 약물의 활성을 장기간 유지시키도록 하는 연결 펩타이드에 관한 것이다.
생체 내 이식되는 재료인 임플란트, 특히 치과용 임플란트는 결손된 치아를 대체할 수 있는 인공치아로서, 일부 또는 전체 손상부위의 저작기능 회복을 위해 널리 사용되고 있다. 임플란트의 성공률 및 장기적인 예후는 환자의 골량 및 골질 등에 의해 영향을 받으며, 이는 임플란트의 안정성에 의해 좌우된다. 상기 임플란트 안정성은 임플란트 식립과 동시에 주변골에 접촉됨으로써 발생하는 물리적인 고정력 및 식립 후 임플란트 주변에 신생골조직이 형성되고 주변골에 골유착이 일어남으로써 얻어지는 생물학적인 고정력으로 나뉠 수 있다 (지르코니아 소재 평가 가이드라인, 식품의약품 안정청 2011).
성인 환자의 치조골에 임플란트를 식립하면 먼저 기존 골에서 신생골을 만들기 위한 골흡수가 일어나면서 임플란트의 안정성이 저하되지만, 이와 동시에 임플란트 주변에 신생골이 생겨나면서 임플란트와 치조골 사이의 골유착을 통해 임플란트의 안정성이 점차 다시 높아지게 된다. 하지만, 노인 환자의 경우 골량의 부족 또는 골질의 저하로 인해 골유착에서 중요한 초기 안정성 확보가 어려운 경우, 임플란트의 조기 실패가 일어날 수 있으며 초기 안정성이 낮은 임플란트에 하중이 가해지는 경우 미세동요에 의한 골유착 지연이 발생할 수 있다. 현재까지는 이를 극복하는 방안으로 임플란트 자체의 길이 또는 직경을 변화시키거나 표면처리를 통한 골세포 부착능을 높이는 방법들로 초기 안정성 증진을 시도하고 있다. 그러나, 이러한 물리적인 변화를 통해 임플란트 식립 후 초기 안정성을 확보하기에는 아직 어려움이 있다 (Nakamura K et al., International Journal of Prosthodontics 23:299-309, 2010).
따라서, 저하된 골질과 적은 골량을 가진 노인 환자뿐만 아니라 일반 성인환자에서 임플란트 식립 후 초기 생착 및 치료기간의 단축을 위해 생물학적 인자의 적용이 필수적이다. 아직까지는 치과용 임플란트 표면에 생리활성물질을 화학적으로 고정한 제품이 상용화 되어있지 않다. 하지만 임플란트 식립 시 골량을 추가적으로 이식하기 위한 합성재료로 사용되는 아파타이트의 경우, 세포외 기질 단백질, 조직성장인자나 골형성 단백질과 같은 생리활성 물질을 함께 사용된 연구들이 진행되었고, 재료와 생리활성 물질을 함께 적용하거나 재료표면에 물질을 코팅한 GEM21S (PDGF 함유), INFUSE (BMP-2 함유)등의 제품이 개발되었다. 그러나 생체 내 이식 시, 이들 생리활성물질이 재료표면에서 안정하게 고정되어 있지 않고 재료표면에서 쉽게 방출되어 전신혈에 노출되어 분해되므로, 생리활성능의 저하 뿐만 아니라 목적 조직 외 다른 조직 등에서는 부작용이 일어날 수 있는 문제점이 있다. 이런 이유로, 임플란트를 통한 조직재생을 위해서는 생리활성물질이 생체재료 표면에 안정하게 고정되어 장시간 동안 유효한 활성을 유지하는 것이 필요하다 (KR 10-1213355).
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 임플란트 표면에 강한 결합 친화도를 가지는 짧은 펩타이드 서열을 발굴하여 상기 펩타이드가 지르코니아 임플란트 표면에 쉽게 결합하여 안정한 상태로 유지되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드에 생리활성 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 펩타이드 결합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드 또는 상기 펩타이드 결합체를 포함하는 생체재료를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드에 생리활성 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 펩타이드 결합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드 또는 상기 펩타이드 결합체를 포함하는 생체재료를 제공한다.
본 발명에 따른 지르코니아에 결합하는 펩타이드는 지르코니아 표면에 안정적으로 고정됨으로써, 상기 펩타이드에 도입된 생리활성물질의 활성을 지르코니아 표면에서 안정하게 장기간 동안 유지시킬 수 있으므로, 이를 이용한 외과적 재생 치료에 유용하다.
도 1은 지르코니아 결합 펩타이드 서열과 비교예 1의 결합 친화성을 확인하기 위해 아비딘-비오틴 콤플렉스 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행한 결과이다.
도 2는 지르코니아 결합 펩타이드 서열과 비교예 2 및 3의 결합 친화성을 확인하기 위해 아비딘-비오틴 콤플렉스 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행한 결과이다.
도 3은 지르코니아 결합 펩타이 서열의 지르코니아 디스크 표면에 대한 최대 결합량을 확인하기 위해 아비딘-비오틴 콤플렉스 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행한 결과이다.
도 2는 지르코니아 결합 펩타이드 서열과 비교예 2 및 3의 결합 친화성을 확인하기 위해 아비딘-비오틴 콤플렉스 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행한 결과이다.
도 3은 지르코니아 결합 펩타이 서열의 지르코니아 디스크 표면에 대한 최대 결합량을 확인하기 위해 아비딘-비오틴 콤플렉스 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 지르코니아 임플란트 표면에 화학적인 수식없이 결합 가능한 펩타이드를 링커(linker)로 사용하여 생리활성물질을 안정적으로 고정하여 활성을 장기간 유지시킬 수 있도록 하기 위해, 지르코니아를 재료로 한 임플란트에 대한 펩타이드 서열을 파지 디스플레이(Phage display) 기법을 통해 발굴하고, 상기 펩타이드가 지르코니아 표면에 안정한 상태로 존재하여 가능한 것을 규명하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드는 생체재료로 사용되는 지르코니아에 화학적인 수식 없이 결합하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드에 생리활성 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 펩타이드 결합체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드와 생리활성 펩타이드의 결합체는 화학적 합성으로 펩타이드 합성장치를 이용하여 제조할 수 있으며, 지르코니아 결합능을 가지는 펩타이드의 C' 또는 N' 말단 부위에 생리활성 도메인을 순차적으로 화학 합성되도록 하여, N' 말단-지르코니아 결합 펩타이드-생리활성 도메인-C' 말단의 순서 또는 N' 말단-생리활성 도메인-지르코니아 결합 펩타이드-C'말단의 순서'로 합성하여 지르코니아 결합 펩타이드-생리활성 펩타이드(예: 골분화 유도서열) 결합체를 제조할 수 있다.
상기 생리활성 도메인인 펩타이드는 임플란트 식립 시 요구되는 골분화유도 또는 항염증 작용뿐만 아니라 세포 내 (In vitro) 혹은 생체 내 (In vivo)에서 유전표현과 생리기능을 조절하는 물질로서 생체 내에서 기능 조절에 관여하는 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의해 비정상적인 병태를 보일 때 바로잡아 주는 역할을 할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 체내에서의 안정성을 고려하여 L-형 또는 D-형으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성 펩타이드는 항염증, 항미생물, 세포부착, 골조직재생 및 세포이동 기능성 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성 단백질은 조직재생인자, 조직성장인자, 세포내 전사인자, 세포 외 기질 단백질 및 항염증 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 지르코니아 결합 펩타이드 및 생리활성 단백질 혹은 저분자 물질 결합체는 가교제를 이용하여 화학적 결합을 유도시켜 만들 수 있다. 가교제를 이용하여 화학적 결합을 유도 시킬 경우, 지르코니아 결합 펩타이드의 N' 말단에 자유 아미노기를 지니고 있어 가교제에 의한 복합체 형성이 용이하다.
본 발명에서 사용할 수 있는 가교제는 1,4-비스-말레이미 도부탄(1,4-bis-maleimidobutane, BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜(1,11-bismaleimidotetraethyleneglycol, BM[PEO]4), 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride, EDC), 숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]](succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy- [6-amidocaproate]], SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도]헥사노에이트](succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate, SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시니미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 숙시미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트](succimidyl[4-(p-maleimidophenyl) butyrate], SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB) 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드 또는 상기 펩타이드 결합체를 포함하는 생체재료에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 생체재료는 지르코니아가 표면에 코팅된 금속, 천연 고분자, 합성 고분자 및 지르코니아로 제작된 생체 이식용 임플란트인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "임플란트"는 외과적으로 결손이 있는 부위에 골 이식 또는 골 신장술 등의 부가적인 수술을 통하여 생체 적합한 재료를 이식해 기능을 회복시켜주는 외과적 재료 또는 술식을 지칭한다. 이는 정상적인 기능이 유지되고 있는 주변 조직과 식립된 임플란트 본체 표면과의 생리적, 형태적, 직접적 결합인 골유착이 이루어진 후 본격적인 재생단계에 들어간다.
본 발명의 "지르코니아"는 산화지르코늄을 통들어 이르는 말로서 ZrO2로 나타내며, 이온교환작용을 통해 칼슘이온의 증가 및 세포의 운동성 등이 증가되어 골밀착성이 향상됨으로 초기 임플란트 식립시 양호한 생체 친화성 및 높은 골결합을 튜도할 수 있다는 장점을 가진다.
현재 임플란트 재료로 널리 사용되는 순수 티타늄은 금속 알러지 반응을 보일 수 있는 문제나 재료의 성질에 따른 세균 부착 가능성이 높은 단점 등이 있기 때문에 면역력이 저하되어 있는 환자의 경우, 생체 적합한 다른 소재의 임플란트 적용을 고려해야 한다. 최근에 티타늄을 대체하여 사용되는 재료인 지르코니아로 이루어져 있는 세라믹 임플란트는 생체 친화성이 우수하며, 치과에서 사용하는 세라믹 재료 중 가장 기계적 강도가 높은 것으로 알려져 있으며, 급격한 온도 변화에 견딜 수 있고, 심미성이 뛰어나 치아를 대체하는 재료로 널리 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 지르코니아는 순수 산화지르코늄에 3~5%의 안정화제를 첨가한 정방정계 물질인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 천연고분자는 콜라겐, 알긴산, 프로필렌글리콜, 알긴산, 황산 콘드로이틴 및 키토산으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 합성고분자는 폴리락틱글리콜산, 폴록사머 및 프로필렌 글리콜로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
지르코니아가 코팅된 금속, 천연 고분자, 합성 고분자 및 치과용 또는 정형외과용 임플란트는 생체내 이식시, 상기 펩타이드와 화학적 결합 유도 없이 공유결합되어 활성을 유지한 채 생리활성물질을 안정한 상태로 존재할 수 있다. 즉, 임플란트 주변의 골조직 재생관련 세포의 이행, 증식 및 분화를 촉진하여 최종적으로 효율적인 조직재생 효과가 단시간내에 발생할 수 있어 치료시간이 단축되며, 또한 임플란트 표면의 불안정 결합으로 인해 유도될 수 있는 전신 또는 타 조직에 대한 부작용을 감소시킬 수 있으므로, 외과적 재생 치료에 유용하다.
본 발명에서는 Subtractive panning이라는 새로운 파지 디스플레이 기법을 추가하여 지르코니아 디스크 표면 외에 결합하는 서열일 가능성을 차단하였다.
본 발명의 "Subtractive panning"이란 특정 물질에는 결합하면서 다른 특정 물질에는 결합하지 않는 서열을 발굴하고자 할 때 사용할 수 있는 파지 디스플레이 기법으로, 먼저 결합을 원치 않는 물질에 파지 라이브러리 (phage library)를 붙이고 결합하지 않은 파지를 회수한 뒤, 결합을 원하는 물질에 붙인 이후 결합하지 않은 파지를 버리고 결합한 파지는 회수하는 방법이다(Munirathinam, Gnanasekar et. al., Novel Phage Display-Based Subtrative Screening To Identify Vaccine Candidates of Brugia malayi, Infect Immun., 72:4707-4715, 2004).
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 파지 디스플레이를 이용한 지르코니아 결합 펩타이드 서열 발굴
지르코니아 디스크 표면에 결합하는 특정한 펩타이드 서열을 발굴하기 위하여 파지 디스플레이 방법 (Phage display)을 이용하였다. 다양성과 복잡성이 높은 랜덤 펩타이드 라이브러리를 표지한 M13 파지를 지르코니아 디스크 표면에 붙인 뒤, 결합하지 않은 파지는 씻어내고 결합한 파지를 회수하는 것을 여러 번 반복하였고, Subtractive panning 과정을 추가하여 최종적으로 얻은 파지에 표지된 펩타이드의 DNA 서열 분석을 통해 지르코니아 결합 펩타이드 서열을 발굴하였다. Subtractive panning은 특정 물질에는 결합하면서 다른 특정 물질에는 결합하지 않는 서열을 발굴하고자 할 때 사용할 수 있는 새로운 파지 디스플레이 기법이다.
본 실시예에서는 파지 디스플레이를 통한 지르코니아 결합 펩타이드 발굴에 폴리스티렌 플레이트 (polystrene plate) 웰(well)을 사용하므로, 지르코니아 디스크 표면 외에 폴리스티렌 플레이트 (polystyrene plate)에 결합하는 서열을 배제하고자 이 기법을 적용하였다.
상기 언급된 보편적인 파지 디스플레이의 반복 사이클을 마친 이후에 얻은 파지를 다시 증폭시켜, 폴리스티렌 플레이트 (polystrene plate)의 빈 웰 (well) 에 대해 분주한 다음 웰 (well) 표면과 결합하지 않은 파지를 회수하였다. 이로써 폴리스티렌 플레이트에 결합하지 않는 파지들만 획득하였고 이를 다시 한 번 지르코니아 디스크 표면에 결합시킨 뒤, 워싱 용액으로 강하게 세척하여 최종적으로 남아있는 결합된 파지들만 회수하였다.
파지 디스플레이 키트는 New England Biolabs (USA)의 Ph.D.-12 Phage Display Kit를 구입하여 사용하였다. 상기 키트는 12 개 아미노산으로 구성된 랜덤 펩타이드 라이브러리가 파지에 표지되어 있으며, 이를 이용하여 발굴한 최종 16 개 클론을 대장균 배양액 상태로 (주)코스모진텍에 서열 분석을 의뢰하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 15 개의 클론이 모두 동일한 DNA 서열을 나타냄을 확인하였고 이를 번역하여 12 개 아미노산으로 구성된 최종 펩타이드 서열 Zr-BP (VSPFGTKWSPFV: 서열번호 1)를 얻을 수 있었다. 상기 펩타이드 서열은 지르코니아 디스크 표면에 결합하는 특이적 서열일 가능성이 높으므로, 지르코니아 디스크 표면에 결합하는 특이적인 펩타이드 서열의 후보로 상기 펩타이드 서열을 선택하였다.
실시예 2: 지르코니아 결합 펩타이드의 합성
서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 합성장치를 이용하여 C 말단으로부터 F-moc 고체상 화학합성방법으로 합성하였다. 즉, 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Rink resin (0.075mmol/g, 100 ~ 200 mesh, 1% DVB crosslinking)을 사용하여 합성하였으며, 합성기에 50mg의 Rink resin을 넣은 뒤 DMF로 resin을 스웰링(swelling) 시킨 후 Fmoc-group의 제거를 위해 20% piperidine/DMF 용액을 사용하였다. C 말단부터 서열대로 0.5M amino acid 용액(용매: 디메틸포름아마이드, DMF), 1.0M DIPEA(용매: 디메틸포름아마이드&엔메틸피롤리돈, DMF&NMP), 0.5M HBTU (용매: 디메틸포름아마이드, DMF)를 각각 5, 10, 5 당량씩 넣어 질소 기류하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF와 NMP로 두 번씩 세척하는 과정을 거쳤다. 마지막 아미노산을 커플링(coupling) 시킨 후에도 디프로텍션(deprotection)을 해주어 Fmoc-group을 제거하였다.
합성의 확인은 닌하이드린 테스트(ninhydrin test) 방법을 이용하였고, 테스트를 거치고 합성이 완료된 레진(resin)은 테트라하이드로퓨란(THF)이나 디클로로메탄(DCM)으로 건조시킨 후 트리플루오로아세트산 (TFA) cleavage cocktail을 resin 1g 당 20ml의 비율로 넣어 3시간 shaking 시킨 후 필터링을 통해 resin과 펩타이드가 녹아 있는 cocktail을 분리하였다. 필터로 걸러진 용액을 진공증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 제거한 후 콜드 에테르(cold ether)를 넣어주거나 펩타이드가 녹아있는 TFA cocktail용액에 직접 콜드 에테르를 과량 넣어주어 펩타이드를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리하여 분리해내었다. 이때 에테르로 여러 번 세척과 원심분리 과정을 거쳐 TFA cocktail을 완전히 제거하였다. 이렇게 해서 얻어진 펩타이드는 증류수에 녹여 동결건조하였다.
합성된 펩타이드는 레진으로부터 절단시켜 세척하고, 동결건조한 후 액체크로마토그래피에 의해 분리, 정제하였다. 정제된 펩타이드의 분자량을 Mass spectrometry를 통해 확인하였다.
비교예 1: Zr-BPC (VSAAGTKASPAV; 서열번호 2) 펩타이드 합성
서열번호 1의 서열에서 C 말단으로부터 2번째, 9번째 페닐알라닌, 5번째 트립토판 및 10번째 프롤린이 알라닌으로 치환된 Zr-BPC (VSAAGTKASPAV; 서열번호 2)을 펩타이드 합성장치를 이용하여 F-moc 고상 화학합성 방법으로 합성하였다.
비교예 2: 지르코니아 디스크를 넣지 않은 빈 용기 표면에 결합하는 펩타이드 합성
파지 디스플레이를 통해 지르코니아 디스크를 넣지 않은 빈 용기 표면에 결합하는 12 개 아미노산으로 구성된 펩타이드 서열을 발굴하였다. 4 개의 클론을 대장균 배양액 상태로 (주)코스모진텍에 서열 분석을 의뢰하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 4 개 중 2 개의 클론이 각각의 특정 DNA 서열을 나타냄을 확인하였다. 그 중 2 개의 DNA 서열을 번역하여 12 개 아미노산으로 구성된 펩타이드 PL1 (IGNSFSFPAVYR; 서열번호 3) 및 PL2 (LRLDVDRAISLL; 서열번호 4)를 얻을 수 있었고, 펩타이드 합성장치를 이용하여 상기 펩타이드를 F-moc 고상 화학합성 방법으로 합성하였다.
실시예 3: 지르코니아 결합 펩타이드의 결합 친화성 (Binding affinity) 확인
3-1: 지르코니아 결합 펩타이드의 비오틴 표지 합성
합성된 실시예 1 및 비교예 1, 2 펩타이드의 결합 친화성을 확인하기 위하여 비오틴을 표지하였다. 합성된 도메인을 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce Biotechnology, USA)를 사용하여 제조사의 실험법에 따라 비오틴화(Biotinylation) 하여 압력차를 추진력으로 하는 막분리법인 한외여과(Ultrafiltration)를 통해 결합되지 않은 부산물을 제거한 후, 이를 Mass spectrometry를 이용하여 분자량을 측정함으로써 합성물의 분자량을 확인하였다. 분석용 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (reverse phase liquid chromatography)를 이용하여 분석, 정제 하였다. 분석에는 직경 4.6mm의 C18 컬럼을 이용하여 유속 1ml/min 의 속도로 0.1% TFA/H2O 와 0.092% TFA/아세토 나이트릴 (acetonitrile)를 0~60%의 변화를 주면서 30분간 흘려주었다. 이때 자외선 검출기의 파장은 220nm로 하였으며, 정제에는 직경 2.2cm의 컬럼을 이용하여 유속 20ml/min의 속도로 용매와 검출파장을 같은 조건으로 실시하였다. 비오틴이 결합된 펩타이드만을 분취하여 진공 증발 농축기(rotary evaporator)를 이용하여 용매를 제거 한 후 동결 건조하였다.
3-2: 지르코니아 결합 펩타이드의 결합 친화성 (Binding affinity) 측정
지르코니아 결합 펩타이드의 결합 친화성을 측정하기 위하여, 아비딘-비오틴 복합체 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행하였다. 12-웰 (well) 폴리스티렌 플레이트 (polystyrene plate)의 각 well에 지르코니아 디스크를 1 개씩 넣은 다음, 블로킹 용액 (0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3 (optional), filter sterilize)으로 최소 1 시간 이상 블록 (block) 한다. 이후 블로킹 용액을 버리고 워싱 용액 (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20) 으로 강하게 6 번 이상 세척한 뒤, 지르코니아 디스크 표면에 실시예 3-1 에서 비오틴 표지하여 합성, 분리, 정제한 실시예 1의 지르코니아 결합 펩타이드 Zr-BP (서열번호 1) 및 비교예 1, 2의 펩타이드 Zr-BPC (서열번호 2), PL1 (서열번호 3), PL2 (서열번호 4)를 100 nM 에서 1μM 까지 농도별로 200㎕ 씩 분주하였다. 상온에서 15 시간 동안 반응시킨 뒤 워싱 용액으로 강하게 세척하고 ExtrAvidin-Peroxidase (Cat. #E2886, Sigma-Aldrich, USA)를 블로킹 용액에 1 : 500 으로 희석하여 지르코니아 디스크 표면에 200㎕ 씩 분주하였다. 상온에서 1 시간 반응시킨 뒤 워싱 용액으로 강하게 세척한 뒤, 기질 용액 (2,2'-AZINO-BIS, Cat. #A3219, Sigma-Aldrich, USA) 을 지르코니아 디스크 표면에 200㎕ 분주하고 상온에서 20분 반응시켜 발색하였다. 반응을 멈추기 위해 1 % SDS 용액 200㎕ 씩 처리하고 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 지르코니아 결합 펩타이드 Zr-BP (서열번호 1) 및 비교예 1의 펩타이드 Zr-BPC (서열번호 2)를 처리하였을 때, 지르코니아 결합 펩타이드 Zr-BP의 흡광도 값이 비교예 1의 펩타이드 Zr-BPC에 비해 높게 나타났으며 농도 의존적인 경향을 보였다. 이는 지르코니아 결합 펩타이드 서열이 지르코니아 디스크 표면에 농도 의존적으로 결합하는 서열임을 입증하며 일부 아미노산의 알라닌 치환으로 인해 결합 친화성이 줄어들 뿐, 상기 펩타이드 서열이 결합 모티프를 가지고 있음을 입증하는 결과이다.
또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 지르코니아 결합 펩타이드 Zr-BP (서열번호 1) 및 비교예 2의 펩타이드 PL1 (서열번호 3), PL2 (서열번호 4)를 처리하였을 때, 지르코니아 결합 펩타이드 Zr-BP의 흡광도 값이 비교예 2의 펩타이드 PL1 및 PL2에 비해 높게 나타났으며 농도 의존적인 경향을 보였다. 비교예 2의 펩타이드 PL1 및 PL2의 경우 농도와 관련 없이 경향성 없는 흡광도 값을 보였으며 이는 비교예 2의 펩타이드 서열이 지르코니아 디스크 표면에 결합하지 않는 것을 보여주는 결과이다.
실시예 4: 지르코니아 결합 펩타이드의 최대 결합량 확인
지르코니아 결합 펩타이드 Zr-BP (서열번호 1)의 지르코니아 디스크 표면의 단위 면적 당 최대 결합량을 확인하기 위해 아비딘-비오틴 콤플렉스 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행하였다. 12-웰 (well) 폴리스테렌 플레이트 (polystyrene plate)의 각 well에 지르코니아 디스크를 1 개씩 넣은 다음, 블로킹 용액 (0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3 (optional), filter sterilize)으로 최소 1 시간 이상 블록 (block) 한다. 이후 블로킹 용액을 버리고 워싱 용액 (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20) 으로 강하게 6 번 이상 세척한 뒤, 지르코니아 디스크 표면에 실시예 3-1 에서 비오틴 표지하여 합성, 분리, 정제한 실시예 1의 지르코니아 결합 펩타이드 Zr-BP (서열번호 1) 및 비교예 1, 2의 펩타이드 Zr-BPC (서열번호 2), PL1 (서열번호 3), PL2 (서열번호 4)를 100 nM 에서 40 mM 까지 농도별로 200㎕ 씩 분주하였다. 상온에서 15 시간 동안 반응시킨 뒤 워싱 용액으로 강하게 세척하고 ExtrAvidin-Peroxidase (Cat. #E2886, Sigma-Aldrich, USA) 를 블로킹 용액에 1 : 500 으로 희석하여 지르코니아 디스크 표면에 200㎕ 씩 분주하였다. 상온에서 1 시간 반응시킨 뒤 워싱 용액으로 강하게 세척한 뒤, 기질 용액 (2,2'-AZINO-BIS, Cat. #A3219, Sigma-Aldrich, USA) 을 지르코니아 디스크 표면에 200㎕ 분주하고 상온에서 20 분 반응시켜 발색하였다. 반응을 멈추기 위해 1 % SDS 용액 200㎕ 씩 처리하고 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 지르코니아 결합 펩타이드 Zr-BP (서열번호 1)의 2 mM 농도에서 최대로 포화된 흡광도 값이 나타났다. 이후 10 mM 이상에서 보여지는 흡광도 변화는 고농도-후크 효과 (High dose hook effect)로 설명할 수 있는 위음성 (False negative) 결과로 사료된다. 지르코니아 결합 펩타이드의 분자량과 분주량을 통해 역산해보면 622.8 ㎍의 지르코니아 결합 펩타이드가 지르코니아 디스크 1 개 표면에 최대 결합하는 양이다. 따라서, 지르코니아 디스크의 지름이 15.5 mm이므로, 지르코니아 디스크 표면 면적 1 mm2 당 약 3.3 ㎍의 지르코니아 결합 펩타이드가 고정될 수 있다고 계산할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> Peptide Having Zirconia Binding Affinity
<130> P15-B085
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zr-BP
<400> 1
Val Ser Pro Phe Gly Thr Lys Trp Ser Pro Phe Val
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zr-BPC
<400> 2
Val Ser Ala Ala Gly Thr Lys Ala Ser Pro Ala Val
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PL1
<400> 3
Ile Gly Asn Ser Phe Ser Phe Pro Ala Val Tyr Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PL2
<400> 4
Leu Arg Leu Asp Val Asp Arg Ala Ile Ser Leu Leu
1 5 10
Claims (10)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 화학적인 수식 없이 지르코니아에 결합하는 것은 특징으로 하는 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드.
- 제1항의 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드에 생리활성 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 펩타이드 결합체.
- 제3항에 있어서, 상기 생리활성 펩타이드는 항염증, 항미생물, 세포부착, 골조직재생 및 세포이동 기능성 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 결합체.
- 제3항에 있어서, 상기 생리활성 단백질은 조직재생인자, 조직성장인자, 세포내 전사인자, 세포 외 기질 단백질 및 항염증 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 결합체.
- 제1항의 지르코니아 결합능이 있는 펩타이드 또는 제3항의 펩타이드 결합체를 포함하는 생체재료.
- 제6항에 있어서, 상기 생체재료는 지르코니아가 표면에 코팅된 금속, 천연 고분자, 합성 고분자 및 지르코니아로 제작된 생체 이식용 임플란트인 것을 특징으로 하는 생체재료.
- 제7항에 있어서, 상기 지르코니아는 순수 산화지르코늄에 3~5%의 안정화제를 첨가한 정방정계 물질인 것을 특징으로 하는 생체재료.
- 제7항에 있어서, 상기 천연고분자는 콜라겐, 알긴산, 프로필렌글리콜, 황산 콘드로이틴 및 키토산으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체재료.
- 제7항에 있어서, 상기 합성고분자는 폴리락틱글리콜산, 폴록사머 및 프로필렌 글리콜로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체재료.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150048441A KR101681886B1 (ko) | 2015-04-06 | 2015-04-06 | 지르코니아 결합능을 가지는 펩타이드 |
| PCT/KR2016/003505 WO2016163711A1 (ko) | 2015-04-06 | 2016-04-05 | 지르코니아 결합능을 가지는 펩타이드 |
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