KR101680164B1 - 단구 증식제, 단구 증식용 배지, 단구의 제조방법, 수지상 세포의 제조방법, 및 수지상 세포 백신의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

단구를 고효율 또한 간편하게 증식시킬 수 있는 수단을 제공하는 것. 본 발명은 Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상으로 이루어지고, 단구로부터 수지상 세포로의 분화처리 전에 사용되는 단구 증식제를 제공한다. 또, 본 발명은 Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상을 포함하고, 단구로부터 수지상 세포로의 분화처리 전에 사용되는 단구 증식용 배지를 제공한다. 본 발명의 단구 증식용 배지는 GM-CSF를 포함할 수도 있다.

Description

단구 증식제, 단구 증식용 배지, 단구의 제조방법, 수지상 세포의 제조방법, 및 수지상 세포 백신의 제조방법{PROLIFERATING AGENT FOR MONOCYTE, CULTURE MEDIUM FOR PROLIFERATING MONOCYTE, METHOD FOR PRODUCING MONOCYTE, METHOD FOR PRODUCING DENDRITIC CELL, AND METHOD FOR PRODUCING DENDRITIC CELL VACCINE}
본 발명은 단구 증식제, 단구 증식용 배지, 단구의 제조방법, 수지상 세포의 제조방법, 및 수지상 세포 백신의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 암의 치료에 있어서, 수지상 세포 백신의 사용이 주목 받고 있다. 수지상 세포 백신은 백신이 투여되는 대상(예를 들면, 암환자) 유래의 수지상 세포에 암 항원을 통합시킨(펄싱한) 수지상 세포로부터 조제되고, 백신이 투여되는 대상의 체내에 투여된다. 투여된 수지상 세포는 T세포에 암 항원을 제시하고, 항원이 제시된 T세포(CTL)는 암 세포를 특이적으로 공격하기 때문에, 체내의 정상세포를 손상시키지 않고 암을 치료할 수 있다.
그런데, 수지상 세포 백신의 제조를 위해서 필요한 수지상 세포는 체내로부터 직접 분리할 수 없다. 그 때문에 수지상 세포는 백신이 투여되는 대상으로부터 채취한 혈액으로부터 단구를 분리하고, 이 단구를 수지상 세포로 분화시킴으로써 수득된다.
종래 알려져 있는 수지상 세포 백신을 제조하기 위해서 사용되는 단구를 채취하는 방법으로서는, 성분 채혈장치를 사용해서 혈액 중의 백혈구를 분리하는 방법(이하, 이 방법을 「아페레시스」라 한다.)이 알려져 있다. 그러나, 아페레시스는 장치의 운용에 비용이 드는 데다가, 장치의 조작을 위해서 고도의 기술이 요구된다. 또, 아페레시스에서는 단구뿐만 아니라, 단구 이외의 성분(백혈구나 적혈구나 혈소판 등)도 포함하는 혼합물을 채취한다. 그 때문에 아페레시스 후에, 적혈구나 혈소판 등의 단구 이외의 성분을 제거하기 위해서 단구의 분리공정을 수행하는 것이 일반적이다.
수지상 세포 백신을 임상응용하기 위해서는 1회의 투여에 대략 1×107개의 세포 수를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 세포 수를 확보하기 위해서, 통상, 동일한 대상으로부터 간격을 두고 8회 정도의 아페레시스가 수행된다. 또, 혈액 중에 존재하는 단구의 비율은 적기 때문에, 수지상 세포 백신을 제조할 수 있을 정도로 충분한 양의 단구를 얻기 위해서 아페레시스를 사용하면, 혈액을 아페레시스 장치 내에서 순환시켜서 백혈구 성분을 충분하게 채취할 필요가 있는데, 이것은 체력적 또 시간적으로 환자에게 부담이 매우 크다. 그 때문에 아페레시스 중, 환자의 용태가 급변하면, 아페레시스를 도중에 중단하고, 수지상 세포 백신요법 그 자체를 단념해야만 하는 경우가 있다. 또, 아페레시스에서 단구의 성분을 채취했을 경우에는 통상 5∼8회분 정도의 수지상 세포 백신을 제작할 수 있다고 하지만, 수득되는 수지상 세포 백신의 실제의 양은 환자의 혈액상태 등에 따라서 변동한다.
또, 말초혈을 팔 등으로부터 채취하는 등의 종래의 채혈방법에서는 환자의 부담은 가볍지만, 수득된 단구를 그대로 종래법으로 수지상 세포로 분화시켜도 충분한 양의 세포수가 수득되지 않는다는 결점이 있다. 그 때문에 말초혈의 채혈로부터 수득된 단구로부터 충분한 세포 수의 수지상 세포 백신을 제작하기 위해서는, 그 과정에 있어서 단구를 증식시키는 것이 과제이고, 그것을 극복하는 기술이 소망되고 있었다. 또, 이러한 기술에 있어서는 수지상 세포 백신의 제작기간은 수지상 세포 백신의 투여간격을 고려했을 경우, 2주간 정도로 제작할 수 있는 것이 더 바람직하다.
그래서, 상기의 과제를 해결하기 위해서, 혈액으로부터 분리된 단구를 체외에서 증식시키는 것을 생각할 수 있다. 이러한 방법으로서, 특허문헌 1에는 단구 중의 특정한 물질의 발현을 저해한 상태에서 단구를 배양하는 것이 개시되어 있다. 그러나, 이 방법은 재조합체의 제작공정이나, 장기의 배양시간이 필요하다.
일본공표특허공보 제2010-515442호
본 발명은 단구(monocyte)를 고효율 또한 간편하게 증식시킬 수 있는 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 조혈간세포의 증식 등에 관여하는 특정한 사이토카인이 단구를 고효율로 증식시킬 수 있는 것임을 발견하고, 본 발명을 완성했다. 본 발명은 구체적으로는 이하와 같은 것을 제공한다.
(1) Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상으로 이루어지고, 단구로부터 수지상 세포로의 분화처리 전에 사용되는 단구 증식제.
(2) Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상을 포함하고, 단구로부터 수지상 세포로의 분화처리 전에 사용되는 단구 증식용 배지.
(3) 상기 (2)에서, GM-CSF 을 포함하는 단구 증식용 배지.
(4) 원료단구를 상기 (2) 또는 (3)에 기재된 단구 증식용 배지 중에서 배양하는 것에 의해서 증식시키는 증식공정을 포함하는 단구의 제조방법.
(5) 상기 (4)에서, 상기 원료단구로서 단구 및 단구 이외의 백혈구 성분을 포함하는 혼합물을 사용하는 단구의 제조방법.
(6) 상기 (4) 또는 (5)에서, 상기 증식공정 전에, 체액 중의 단구 이외의 성분의 함유율을 저감시켜서 상기 원료단구를 얻는 저감공정을 포함하는 단구의 제조방법.
(7) 상기 (6)에서, 상기 저감은 상기 원료단구 중의 단구 및 단구 이외의 백혈구 성분, 혈장, 적혈구의 적어도 하나에 대해서 다른 쪽보다 높은 친화성을 가지는 자성비드를 사용해서 실시하는 단구의 제조방법.
(8) 상기 (6) 또는 (7)에서, 100㎖ 이하의 말초혈로부터 상기 원료단구를 얻는 단구의 제조방법.
(9) 상기 (6) 내지 (8) 중 어느 하나에서, 상기 단구를 동결 보존하는 동결 보존공정을 포함하지 않는 단구의 제조방법.
(10) 상기 (4) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 단구의 제조방법에 의해서 단구를 제조하는 단구 제조공정과, 상기 단구 제조공정에서 수득된 단구를 수지상 세포로 분화시키는 분화공정을 포함하는 수지상 세포의 제조방법.
(11) 상기 (10)에서, 상기 분화공정에 있어서, 상기 단구는 Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상을 포함하는 배지 중에서 배양되는 수지상 세포의 제조방법.
(12) 상기 (10) 또는 (11)에서, 상기 수지상 세포를 펄싱하는 펄싱공정을 포함하는 수지상 세포의 제조방법.
(13) 상기 (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 수지상 세포의 제조방법에 의해서 수지상 세포를 제조하는 수지상 세포 제조공정과, 상기 수지상 세포 제조공정에서 수득된 수지상 세포를 수지상 세포 백신으로 조제하는 조제공정을 포함하는 수지상 세포 백신의 제조방법.
(14) 상기 (13)에서, 상기 단구 및 상기 수지상 세포 중 적어도 한쪽을 동결 보존하는 동결 보존공정을 포함하지 않는 수지상 세포 백신의 제조방법.
(15) 상기 (13) 또는 (14)에서, 상기 원료단구는 상기 수지상 세포 백신이 투여되는 대상으로부터 채취한 체액으로부터 얻은 것인 수지상 세포 백신의 제조방법.
본 발명에 의하면, 단구를 고효율 또한 간편하게 증식시킬 수 있는 수단이 제공된다.
도 1은 말초혈로부터 단구를 분리하기 전(A), 및, 분리한 후(B)에 있어서의 각각의 세포시료(3×105cells) 중에 포함되는 단구 수를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시형태에 따른 단구 증식제의 존재 하에서 3일간 배양하고, 그 후에 단구를 11일간 배양해서 수지상 세포로 분화시켰을 때의 세포 수의 경시적 변화를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 단구 증식제에 의해서 증식시킨 단구가 성숙 수지상 세포로 분화된 것을 나타내는 도면(A) 및 (B), 및, (A) 및 (B)에 있어서 수득된 성숙 수지상 세포가 항원제시능을 가지는 것을 나타내는 도면(C)이다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대해서 설명하지만, 본 발명을 한정하는 것을 의도하는 것은 아니다.
<단구 증식제>
본 발명의 단구 증식제는 Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상으로 이루어지고, 단구로부터 수지상 세포로의 분화처리 전에 사용된다. 또, 본 발명의 단구 증식제의 사용형태는 특별하게 한정되지 않지만, 단구를 배양 가능한 배지에 첨가하고, 또는 배지의 성분으로서 프리믹스된 형태로 사용할 수 있는 것을 일반적으로 생각할 수 있다.
「단구로부터 수지상 세포로의 분화처리」란 단구를 수지상 세포로 분화시키는데 호적한 조건, 즉, 소정량의 특정한 사이토카인(GM-CSF, IL-4, 및 IL-6 등)의 존재 하에서 단구를 배양하는 것을 가리킨다. 분화처리의 과정에서도 단구 수는 어느 정도 증가하는 것이 알려져 있지만, 본 발명의 단구 증식제는 이 분화처리에 사용되는 것이 아니라, 그 전 단계에서 사용된다.
상기 각 사이토카인에 대해서, 단구를 수지상 세포로 분화시키는 양은 그 양의 사이토카인을 포함하는 배지에서, 37℃, 5% CO2의 조건으로 6일간 배양했을 때에, 전체 세포 수에 있어서의 수지상 세포의 수가 20% 이상인 양을 가리키고, 구체적인 양은 배지의 성분이나 배양조건에 따라 다르다.
본 발명의 단구 증식제에 의하면, 상기의 분화처리에 적용하기 전에, 수지상 세포 백신을 제조하는데 충분한 양(예를 들면, 106∼107cells/㎖ 이상)까지 단구를 증식시킬 수 있고, 수지상 세포 백신을 위해서 단구의 배양공정을 수회 반복할 필요가 없기 때문에 간편하다.
Flt-3L(Flt3-Ligand), IL-3(인터류킨-3), IFN-γ(인터페론-γ)는 조혈간세포의 증식 등에 관여하는 사이토카인으로 알려져 있지만, 본원 발명자들의 검토결과, 놀랍게도, 효과적으로 단구를 증식할 수 있음이 발견되었다.
(Flt-3L)
단구를 증식시키기 위해서 호적한 Flt-3L의 양은 특별하게 한정되지 않지만, 단구를 배양 가능한 배지당, 100∼10000 IU/㎖, 바람직하게는 1000∼5000 IU/㎖, 가장 바람직하게는 1000∼3000 IU/㎖일 수도 있다.
(IL-3)
단구를 증식시키기 위해서 호적한 IL-3의 양은 특별하게 한정되지 않지만, 단구를 배양 가능한 배지당, 100∼10000 IU/㎖, 바람직하게는 100∼5000 IU/㎖, 가장 바람직하게는 500∼3000 IU/㎖일 수도 있다.
(IFN-γ)
단구를 증식시키기 위해서 호적한 IFN-γ의 양은 특별하게 한정되지 않지만, 단구를 배양 가능한 배지당, 1∼1000 ng/㎖, 바람직하게는 1∼500 ng/㎖, 가장 바람직하게는 1∼50 ng/㎖일 수도 있다.
본 발명의 단구 증식제는 Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ중 어느 하나를 단독으로 사용할 수도 있고, 2 이상을 조합시킬 수도 있다. 상기한 바와 같이, Flt-3L, IL-3 및 IFN-γ는 유사한 기능을 가지기 때문에, 조합시켜서 사용해도 서로의 기능을 저해하는 것은 상정되지 않는다. 이들 중 2 이상을 조합시키는 경우, 각각의 사이토카인의 배합량은 상기한 범위 내일 수 있고, 그것보다 적을 수도 있다.
본 발명의 단구 증식제에 의해 증식한 세포가 단구인지의 여부는, Flow cytometry에 의해서, 수득된 세포의 세포표면마커를 해석함으로써 확인한다. 단구의 세포표면의 마커로서는 CD14 등을 들 수 있다. 이러한 마커를 가지는 세포는 단구라고 인정된다.
<단구 증식용 배지>
본 발명의 단구 증식용 배지는 Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상을 포함하고, 단구로부터 수지상 세포로의 분화처리 전에 사용된다. 구체적으로, 단구 증식용 배지는 추가로, 단구를 배양 가능하게 하기 위한 영양성분, pH조정제 등을 포함할 수 있다. 이러한 성분을 포함하는 배지로서는 특별하게 한정되지 않지만, 림프구용 무혈청 합성 배지, AIM-V, RPMI-1640 등을 들 수 있다. 또, 본 명세서에 있어서의 「배지」란 액체화된 이미 조제된 형태뿐만 아니라, 조제 전의 성분 혼합물(통상, 분체)도 포함한다.
본 발명의 단구 증식용 배지는 단구의 분화에 관여하는 사이토카인(GM-CSF(Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor; 과립구 단구 콜로니 자극인자))을 더 포함할 수도 있다.
단구는 GM-CSF의 존재 하에서 마크로퍼지로 분화되고, GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에서 수지상 세포로 분화되기 쉬운 경향이 있다. 그러나, 본 발명자에 의한 검토의 결과, GM-CSF를 포함하는 본 발명의 단구 증식용 배지에 의하면, 단구의 증식을 현저하게 촉진시킬 수 있음이 발견되었다. GM-CSF 자체에도, 단구의 증식효과가 있는 것은 종래 알려져 있었지만, GM-CSF를 포함하는 본 발명의 단구 증식용 배지에 의하면, 단구를 분화시키지 않고, 단구의 증식을 현저하게 촉진시킬 수 있다. 또, 본 발명의 단구 증식용 배지에는 GM-CSF에 부가해서, 추가로, 단구를 수지상 세포로 분화시키는 양(예를 들면, 500∼2,000 IU/㎖) 미만의 IL-4을 포함할 수도 있다. 본 발명의 단구 증식용 배지에 포함되는 GM-CSF는 500∼2,000 IU/㎖의 범위를 들 수 있다.
본 발명의 단구 증식용 배지에는 세포배양에 있어서 통상 사용되는 시약이 포함될 수도 있다. 이러한 시약으로서, 항생물질(겐타마이신, 카나마이신 등), 알부민, 혈청(소태아 혈청 등) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 단구 증식용 배지에는 생체(예를 들면, 인간, 돼지, 소, 말, 염소, 양, 토끼, 캥거루, 원숭이 등의 포유류 동물) 유래의 자기혈장(즉, 증식시키려고 하는 단구와 자기혈장은 동일한 생체로부터 수득된 것을 의미한다.)이 포함될 수도 있다. 또, 본 발명의 단구 증식용 배지에는 수지상 세포로의 분화 유도를 촉진한다는 목적에서 염화 피시바닐, 프로스타글란딘E2(PGE2) 등이 포함될 수도 있다.
<단구의 제조방법>
본 발명의 단구의 제조방법은 원료단구를 본 발명의 단구 증식용 배지 중에서 배양하는 것에 의해서 증식시키는 증식공정을 포함한다.
(증식공정)
본 발명에서의 증식공정에서 사용되는 조건으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 많은 단구가 분화되기 시작하기 전에 단구를 증식시키는 관점에서, 30∼40℃, 2∼8% CO2의 조건으로 배양할 수 있다. 배양시간은 소요되는 단구의 양에 따라서 적절하게 조정할 수 있고, 3∼20일, 3∼18일, 3∼14일, 3∼10일 수도 있다. 배양 중, 종래 공지의 방법으로 적당하게 배지교환을 수행할 수 있다.
본 발명의 단구의 제조방법에 의하면, 예를 들면 14일간이라는 짧은 배양시간으로 원료단구 중의 단구를 임상사용 가능한 레벨(예를 들면, 106∼107cells/㎖ 이상)까지 증식시킬 수 있다. 임상사용 가능한 레벨이란 증식시킨 단구를 분화시킨 수지상 세포를 수지상 세포 백신으로 조제했을 경우, 수득된 수지상 세포 백신이 그대로 비동결 처리 백신으로서 사용 가능한 레벨을 가리킨다.
본 발명의 단구의 제조방법에 있어서는 본 발명의 단구 증식용 배지 내에서 단구를 배양하며, 단구로의 부하가 적은 조건하에서 단구를 증식시킨다. 그 때문에 본 발명의 단구의 제조방법에 의하면, 높은 생세포율(예를 들면, 90%초)로 단구를 얻는 것을 기대할 수 있다.
(원료단구)
본 발명에 있어서의 원료단구란 단구를 포함하는 시료이다. 원료단구는 단구만으로 이루어질 수도 있고, 또, 본 발명의 단구의 제조방법에 의하면 단구를 선택적으로 효율적으로 증식할 수 있기 때문에, 단구와, 단구 이외의 백혈구 성분(예를 들면, 림프구, NK세포, NKT세포)을 포함하는 혼합물일 수도 있다. 이 혼합물은 추가로 혈장, 적혈구를 포함할 수도 있다. 혼합물로서는 혈액 등의 체액의 시료로부터 밀도구배 원심분리 등으로 수득된다, 주로 단구 및 림프구를 포함하는 단구　분획일 수도 있다.
(저감공정)
상기 증식공정 전에, 체액 중의 단구 이외의 성분의 함유율을 저감시켜서 상기 원료단구를 얻는 저감공정을 실시하는 것이 바람직하다. 저감은 예를 들면, 자성비드를 사용한 방법, 밀도구배 원심법, 체액 중의 성분 중 단구만을 배양접시에 접착시켜서 단구를 분리하는 방법이나, 이들 방법의 조합 등으로 실시할 수 있다.
간편하게 또는 고수율로 단구를 회수할 수 있고, 단구에 대한 손상이 작다는 점에서, 자성비드를 사용하는 것이 바람직하다.이 자성비드는　원료단구　중의 단구 및 단구 이외의 백혈구 성분, 혈장, 적혈구의 적어도 하나(바람직하게는 전부)에 대해서 다른 쪽 보다 높은 친화성을 가지는 자성비드이다. 이러한 자성비드는 자성을 띤 담체에, 분리하려고 하는 물질에 대한 항체 등이 결합한 구조를 가질 수 있다. 또, 체액을 밀도구배 원심해서 수득된 단구 분획에 대해서, 자성비드에 의한 처리를 실시하는 것은 단구의 수율이 더욱 높아진다는 점에서 바람직하다.
단구에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 가지는 자성비드를 사용하면, 체액으로부터 주로 단구를 분리할 수 있다(이것은, 단구의 양성선택이라 불린다.). 분리된 단구로부터 종래 공지방법으로 자성비드를 제거하는 것으로, 원료단구가 수득된다. 이 형태는, 준비하는 자성비드의 종류가 적다는 점에서 유리하지만, 자성비드를 단구로부터 제거하는 공정이 필요해서, 단구로의 손상이 약간 걱정될 수 있다.
단구 이외의 백혈구 성분, 혈장, 적혈구의 적어도 하나에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 가지는 자성비드를 사용하면, 체액으로부터 단구 이외의 성분을 제거 할 수 있다(이것은, 단구의 음성선택이라 불린다.). 그 결과, 단구를 주로 포함하는 원료단구가 수득된다. 이 형태는 준비하는 자성비드의 종류가 많다는 점에서 불리하게 될 수 있지만, 자성비드를 단구로부터 제거하는 공정이 불필요해서, 양질의 단구가 확실하게 수득된다는 점에서 바람직하다. 단구의 음성선택이 이루어진다 시료는 체액을 밀도구배 원심해서 수득된 단구 분획일 수도 있다. 이 경우, 림프구에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 가지는 자성비드를 사용한다.
자성비드를 사용하는 경우, 자기세포 분리장치를 사용할 수 있다. 자기세포 분리장치는 혈액등의 체액의 시료와 함께 자성비드 등의 시약을 장치 내에 세팅함으로써, 소정의 프로그램에 의거해서 체액에서 단구를 분리한다. 이러한 장치의 사용은 체액으로부터 단구를 신속 또한 고수율로 분리할 수 있다는 점에서 바람직하다. 단구를 고수율로 분리하면, 본 발명의 단구 증식제에 의한 단구의 증식 효율을 현저하게 높일 수 있다.
본 발명에 있어서 바람직한 자기세포 분리장치로서는 예를 들면, 「RoboSep(상표)」(VERITAS Corporation.) 등을 들 수 있다.
(체액)
원료단구를 얻기 위한 시료로서 혈액이나 골수액과 같은 체액을 들 수 있다. 혈액은 생체(예를 들면, 인간 암환자)로부터 채취되고, 말초혈, 제대혈 등을 들 수 있다. 이 중, 피채취자의 부담경감이라는 관점에서 말초혈이 바람직하다. 체액의 채취방법으로서는 특별하게 한정되지 않고, 팔, 손목, 발 등의 부위로부터 시린지, 익상침 등을 사용해서 채취하는 방법 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 단구의 제조방법에 있어서는 사용하는 체액의 양이 적어도 되기 때문에, 종래 사용되어 온 아페레시스 등의 방법과 비교해서, 체액을 채취할 때의 생체에 대한 부담(비용, 시간 등)이 현저하게 적다.
종래는 수지상 세포 백신의 제조를 위해서, 예를 들면 300∼400㎖라는 대량의 혈액을 생체로부터 채취하고 있었다. 그러나, 본 발명의 단구의 제조방법에 의하면, 사용하는 체액의 양은 100㎖ 이하, 90㎖ 이하, 80㎖ 이하, 70㎖ 이하, 60㎖ 이하, 50㎖ 이하, 40㎖ 이하, 35㎖ 이하, 30㎖ 이하, 25㎖ 이하, 20㎖ 이하, 15㎖ 이하, 10㎖ 이하, 5㎖ 이하, 1㎖ 이하, 0.5㎖ 이하라고 하는 소량일 수도 있다. 체액량의 하한은 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 0.1㎖ 이상일 수 있다.
본 발명의 단구의 제조방법에 의해 수득된 단구는 그대로 분화공정을 거쳐서 수지상 세포로 분화시킬 수도 있고, 종래의 공지된 방법으로 동결 보존할 수도 있다. 동결 보존된 단구는 해동한 후에, 단구의 분화공정에 제공할 수 있다. 단, 분화시킬 수 있는 단구의 손실을 방지한다는 관점에서 단구를 동결 보존하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 분화공정에 적용할 수 있는 단구를 얻기 위해서 수 차례나 단구의 배양을 실시하는 필요가 없기 때문에 단구를 동결 보존 하지 않고 단구의 분화공정에 제공할 수 있다.
<수지상 세포의 제조방법>
본 발명의 수지상 세포의 제조방법은 본 발명의 단구의 제조방법에 의해 단구를 제조하는 단구 제조공정과, 상기 단구 제조공정에서 수득된 단구를 수지상 세포로 분화시키는 분화공정을 포함한다.
(분화공정)
단구를 수지상 세포로 분화시키는 방법 자체는 종래 공지이다. 즉, 예를 들면 IL-4 등을 포함하는 분화용 배지 중에서 단구를 배양하면, 단구는 미성숙 수지상 세포로 분화된다. TNF-α 등을 포함하는 배지 중에서 수득된 미성숙 수지상 세포를 배양하면, 미성숙 수지상 세포는 성숙 수지상 세포로 분화된다. 본 발명에 있어서의 수지상 세포란 미성숙 수지상 세포 또는 성숙 수지상 세포의 양쪽을 포함한다.
본 발명의 분화공정에 있어서도 Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상을 포함하는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 이에 따라 단구를 증식시키면서 수지상 세포로 분화시킬 수 있고, 보다 다수의 수지상 세포를 얻을 수 있다. 단, 증식공정에서 수득된 단구의 수가 충분하다든가, 소요되는 수지상 세포의 수가 그다지 많지 않다는 경우에는 상기 성분을 포함하는 배지를 사용하지 않을 수도 있다.
(펄싱공정)
수득된 미성숙 수지상 세포 또는 성숙 수지상 세포에, 암 세포로부터 추출한 물질(펩티드 등)이나 암특이적 항원, 인공항원 등을 통합시킴으로써(펄싱한다), 소망하는 항원을 제시할 수 있는 수지상 세포를 얻을 수 있다. 또, 펄싱공정은 수지상 세포를 제조하는 과정에서 수행할 수도 있고, 후술하는 바와 같이 수지상 세포의 제조 후의 백신 조제의 과정에서 수행할 수도 있다.
펄싱방법으로서는, 수지상 세포에 소망하는 항원을 통합시킬 수 있는 방법이라면 특별하게 한정되지 않지만, 수지상 세포를 소망하는 항원과 함께 배양하는 것 등을 들 수 있다. 일반적으로, 항원의 용이한 통합은 성숙 수지상 세포보다도 미성숙 수지상 세포 쪽이 높기 때문에, 펄싱은 미성숙 수지상 세포에 대해서 실시하는 것이 바람직하다.
수득된 세포가 수지상 세포인지의 여부는, Flow cytometry에 의해 수지상 세포의 세포표면 마커를 해석함으로써 확인한다. 수지상 세포의 세포표면의 마커로서는 CD83 등을 들 수 있다. 이러한 마커를 가지는 세포는 수지상 세포라고 인정된다.
본 발명의 수지상 세포의 제조방법에 의해 수득된 수지상 세포가 항원제시능을 가지는 것인지의 여부는 Flow cytometry에 의해 수지상 세포의 세포표면 마커를 해석함으로써 확인한다. 항원제시능을 가지는 수지상 세포의 세포표면의 마커로서는 MHC클래스 I 분자(HLA-A, B, C), 및, MHC클래스 II 분자(HLA-DR) 등을 들 수 있다. 이러한 마커를 가지는 수지상 세포는 항원제시능을 가진다고 인정된다.
<수지상 세포 백신의 제조방법>
본 발명의 수지상 세포 백신의 제조방법은 본 발명의 수지상 세포의 제조방법에 의해 수지상 세포를 제조하는 수지상 세포 제조공정과, 상기 수지상 세포 제조공정에서 수득된 수지상 세포를 수지상 세포 백신에 조제하는 조제공정을 포함한다.
(조제공정)
수지상 세포를 수지상 세포 백신에 조제하는 방법은 특별하게 한정되지 않지만, 수지상 세포를 통상의 백신 제제에 처방되는 약제(생리식염수, 링거액 등)과 혼합하는 것을 들 수 있다. 또, 펄싱공정을 거치지 않은 수지상 세포를 사용하는 경우, 수지상 세포에 대해서 펄싱공정을 실시한다.
본 발명의 수지상 세포 백신의 제조방법은 단구 및 수지상 세포 중 적어도 한쪽을 동결 보존하는 동결 보존공정을 포함하지 않을 수도 있다. 본 발명의 수지상 세포 백신의 제조방법에 있어서는 수지상 세포 백신을 제조할 수 있을 정도로 충분한 양의 단구나 수지상 세포를 단기간으로 수득되기 때문에, 단구나 수지상 세포를 스톡할 필요없이 적시 조제할 수 있다. 그 때문에 필요에 따라서 제조한 단구나 수지상 세포를 동결 보존하지 않고 수지상 세포 백신의 제조에 사용할 수 있다. 이에 따라 동결에 의해 발생할 가능성이 있는 세포의 손상이나, 수지상 세포의 항원제시능의 저하를 회피할 수 있다.
수득된 수지상 세포 백신은 피내주사 등의 종래 알려진 방법에 의해 생체에 투여할 수 있다.
원료단구는 수지상 세포 백신이 투여되는 대상으로부터 채취한 체액으로부터 얻은 것이 바람직하다. 수지상 세포 백신이 투여되는 대상으로부터 유래하는 원료단구를 사용함으로써, 유해한 부작용이 적은 수지상 세포 백신을 얻을 수 있다. 단, 수지상 세포 백신의 투여에 의해 발생할 수 있는 면역반응이 허용되는 것인 경우, 투여되는 대상이 아닌 자로부터 채취한 체액을 사용할 수도 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의거해서 설명하지만, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1; 단구의 분리>
3 명의 암환자의 팔로부터 말초혈을 25㎖ 채취했다. 이 말초혈을 각각, 피콜 용액(GE Healthcare Japan Company.)을 사용해서 밀도구배 원심을 실시하고, 단구 분획의 세포를 얻었다. 수득된 단구 분획의 세포를 자기세포 분리장치(상품명; RoboSep, VERITAS Corporation.)에 세팅하고, 단구분리용으로 설정된 프로그램에 따라서, CD14+ 단구, 및 CD16+ 단구를 분리했다.
단구를 분리하기 전의 말초혈, 및, 말초혈로부터 단구를 분리한 후의 시료에 대해서, 각 시료 중의 단구 수를 하기의 조건에 따라서 계측했다.
각 시료 중의 3×105cells의 세포에 대해서, 세포표면의 마커를 Flow cytometry에 의해 해석했다. 또, 마커로서 단구의 마커인 CD14을 사용했다. 그 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에 나타내는 바와 같이, 단구를 분리하기 전(A)과 분리한 후(B)를 비교하면, 분리공정에 의해, 시료 중의 세포수당의 단구의 개수(분리 전; 534개, 분리 후; 2938개)가 현저하게 증가하고 있어, 단구가 농축된 시료가 수득된 것임을 알 수 있다.
<실시예 2; 단구의 증식>
상기의 방법에 따라서 분리한 암환자 유래의 단구(CD14+ 단구, 및 CD16+ 단구)를 하기의 조건에 따라서, 본 발명의 단구 증식제(본 예에서는 Flt-3L을 사용)를 포함하는 단구 증식용 배지 중에서 배양했다.
(단구 증식용 배지의 조성)
림프구용 무혈청 합성 배지(X-VIVO15, TAKARA BIO INC.)
Flt-3L(Cellgenix사) 2000 IU/㎖
GM-CSF(Miltenyi Biotec사) 1000 IU/㎖
겐타마이신 50 ng/㎖
5% 자기혈장(각 암환자로부터 수득된 혈장)
상기의 단구 증식용 배지에, 분리된 단구를 배지당 2×105cells/㎖이 되도록 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건으로 3일간 배양했다. 배양 4일째에 실시예 3에 있어서의 단구 분화용 배지(1)에서 8일간 배양했다. 배양 12일째에 실시예 3에 있어서의 단구 분화용 배지(1)에서 3일간 배양했다. 즉, 배양기간의 합계는 14일간이다.
배양 개시 시점, 배양 3일후, 배양 6일후, 배양 11일후 및 배양 14일후의 각 시점의 단구를 회수하고, 트리판블루 염색하고, 현미경 관찰에 의해, 세포수를 계측했다. 그 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 배양 3일째의 시점에서 단구가 2×106cells/㎖ 정도까지 증식하고 있다. 이 시점에서 분화공정에 적용하는 것이 가능하다. 또한, 분화공정에 있어서도 본 발명의 단구 증식제의 존재 하에서 배양함으로써, 107cells/㎖ 이상의 수지상 세포를 얻는 것을 기대할 수 있다.
<실시예 3; 단구의 분화>
상기에서 수득된 단구를 하기의 조건에 따라서 배양했다.
(단구 분화용 배지(1)의 조성)
단구 증식용 배지에, 1000IU IL-4(Miltenyi Biotec사)을 첨가함으로써, 단구를 미성숙 수지상 세포로 분화시키기 위한 배지를 조제했다. 이하, 이 배지를 「단구 분화용 배지(1)」라고 부른다.
(단구 분화용 배지(2)의 조성)
단구 분화용 배지(1)에, 추가로 하기의 성분을 첨가함으로써, 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 분화시키기 위한 배지를 조제했다. 이하, 이 배지를 「단구 분화용 배지(2)」라고 부른다.
IL-1β(Miltenyi Biotec사) 10 ng/㎖
IL-6(Miltenyi Biotec사) 1000 IU/㎖
PGE2(Cayman Chemical사) 1 ㎍/㎖
TNF-α(Miltenyi Biotec사) 20 ng/㎖
0.1KE 염화피시바닐(CHUGAI PAHRMACEUTICAL CO., LTD.)
겐타마이신 50ng/㎖
5% 자기혈장(각 암환자로부터 수득된 혈장)
증식한 단구(즉, 실시예 2의 조건으로 3일째 배양해서 수득된 단구)를, 단구 분화용 배지(1) 중에서, 단구의 증식과 동일한 조건으로 8일간 배양해서 미성숙 수지상 세포로 분화시켰다. 8일간의 배양의 종료 시점에서, 항원 펩티드를 첨가해서 펄싱을 실시했다.
수득된 미성숙 수지상 세포를 단구 분화용 배지(2) 중에서 단구의 증식과 동일한 조건으로 3일간 배양해서 성숙 수지상 세포로 분화시켰다.
수득된 성숙 수지상 세포에 대해서, 세포표면의 마커를, Flow cytometry에 의해 해석했다. 또, 마커로서 성숙 수지상 세포의 마커인 CD83, 및, 단구의 마커인 CD14를 사용했다. 그 결과를 도 3(A)에 나타낸다. 또, 수득된 성숙 수지상 세포의 수를 마커로서 성숙 수지상 세포의 마커인 CD83을 사용해서 Flow cytometry에 의해 해석했다. 그 결과를 도 3(B)에 나타낸다. 도3(A) 및 (B)에 나타내는 바와 같이 분화후의 세포 중에는 CD14을 발현하고 있는 세포(즉 단구)는 존재하지 않고, CD83을 발현하고 있는 세포(즉 성숙 수지상 세포)가 존재하는 것으로부터, 단구가 성숙 수지상 세포로 분화된 것임을 알 수 있다.
또, 수득된 성숙 수지상 세포의 항원제시능을 마커로서 MHC클래스 I 분자(HLA-A, B, C), 및, MHC클래스 II 분자(HLA-DR)를 사용해서 Flow cytometry에 의해 해석했다. 그 결과를 도 3(C)에 나타낸다. 도 3(C)에 나타내는 바와 같이, 수득된 성숙 수지상 세포는 MHC클래스 I 분자 및 MHC클래스 II 분자를 발현하고 있어, 항원제시능을 가지는 것임을 알 수 있다.
<실시예 4; 각종 사이토카인에 의한 단구의 증식으로의 영향에 관한 검토>
본 발명의 단구 증식제(Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ) 및 각종 사이토카인(SCF, IFN-α 또는 IFN-β)이 단구의 증식에 미치는 영향을 하기의 조건에 따라서 검토했다.
실시예 1에 기재된 방법에 따라서 분리한 단구를, 배지 중에서, 1×103cells/well이 되도록 96구-배양접시 내에 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건으로 6일간 배양했다. 또, 당해 배지의 조성은 하기한 바와 같다.
(배지조성)
림프구용 무혈청 합성 배지(X-VIVO15, TAKARA BIO INC.)
표 1의 매트릭스에 따라서 조합한 사이토카인(각 사이토카인의 사용량은 하기한 바와 같다.)
2000 IU/㎖ Flt-3L
1000 IU/㎖ IL-3
10 ng/㎖ IFN- γ
10 ng/㎖ SCF
10 ng/㎖ IFN-α
10 ng/㎖ IFN-β
1000 IU/㎖ GM-CSF
1000 IU/㎖ IL-4
또한, 표 1 중, 「증식인자」란 본 발명의 단구 증식제(Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ) 및 각종 사이토카인(SCF, IFN-α 및 IFN-β)을 합친 호칭이다.
배양 종료 후의 세포 수를 현미경 하에서 육안관측하고, 각종 사이토카인에 의한 단구의 증식에 대한 영향을 「증식인자 무첨가」 또한 「GM-CSF 및 IL-4 무첨가」의 조건의 결과와 비교해서 판정했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. 이때, 판정기준은 아래와 같다.
±: 변화 없음
+: 단구의 증식을 약간 촉진시켰다
++: 단구의 증식을 촉진켰다
+++: 단구의 증식을 현저하게 촉진시켰다
Figure 112014085399407-pct00001
표 1에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 단구 증식제(Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ)에 의하면, 단구의 증식이 촉진된다. 또, 본 발명의 단구 증식제에 부가해서, 추가로 GM-CSF를 조합시킴으로써 단구의 증식은 현저하게 촉진된다.
<실시예 5; 단구의 생세포율에 관한 검토>
본 발명의 단구 증식제에 의해 증식시킨 단구를 분화시켜서 수득된 수지상 세포의 생세포율에 대해서 하기의 조건에 따라서 검토했다.
20명의 암환자의 팔로부터 말초혈을 약 25㎖ 채취했다. 수득된 말초혈로부터, 실시예 1과 동일하게, 단구를 분리했다. 이어서, 실시예 2와 동일하게 단구를 증식시키고, 수득된 단구를 실시예 3과 동일하게 성숙 수지상 세포로 분화시켰다.
수득된 성숙 수지상 세포에 대해서, 트리판블루 염색을 실시하고 총세포수(수득된 성숙 수지상 세포의 총수)와 생세포율을 계측했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 이때, 생세포율은 하기 식에 의거하여 산출했다.
생세포율(%) = 생세포의 총수(미염색 세포의 수) / 총세포수(염색세포의 수와 미염색 세포 수의 합계)×100
Figure 112014085399407-pct00002
표 2에 나타내는 바와 같이, 본 발명에 의하면 1.0×107 이상의 세포수와 약 97% 이상의 생세포를 안정적으로 얻는 것을 기대할 수 있다.

Claims (15)

  1. Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상으로 이루어지고, 단구(monocyte)로부터 수지상 세포로의 분화처리 전에 사용되는 단구 증식제.
  2. Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상을 포함하고, 단구로부터 수지상 세포로의 분화처리 전에 사용되는 단구 증식용 배지.
  3. 제 2 항에 있어서,
    GM-CSF를 포함하는 단구 증식용 배지.
  4. 원료단구를, 제 2 항 또는 제 3 항에 기재된 단구 증식용 배지 중에서 배양하는 것에 의해서 증식시키는 증식공정을 포함하는 단구의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 원료단구로서 단구 및 단구 이외의 백혈구 성분을 포함하는 혼합물을 사용하는 단구의 제조방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 증식공정 전에, 체액 중의 단구 이외의 성분의 함유율을 저감시켜서 상기 원료단구를 얻는 저감공정을 포함하는 단구의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 저감은 상기 원료단구 중의 단구 및 단구 이외의 백혈구 성분, 혈장, 적혈구의 적어도 하나에 대해서 다른 쪽보다 높은 친화성을 가지는 자성비드를 사용해서 실시하는 단구의 제조방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    100㎖ 이하의 말초혈로부터 상기 원료단구를 얻는 단구의 제조방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 단구를 동결 보존하는 동결 보존공정을 포함하지 않는 단구의 제조방법.
  10. 제 4 항에 기재된 단구의 제조방법에 의해서 단구를 제조하는 단구 제조공정과,
    상기 단구 제조공정에서 수득된 단구를 수지상 세포로 분화시키는 분화공정을 포함하는 수지상 세포의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 분화공정에 있어서, 상기 단구는 Flt-3L, IL-3 또는 IFN-γ 중의 하나 이상을 포함하는 배지 중에서 배양되는 수지상 세포의 제조방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 수지상 세포를 펄싱하는 펄싱공정을 포함하는 수지상 세포의 제조방법.
  13. 제 10 항에 기재된 수지상 세포의 제조방법에 의해서 수지상 세포를 제조하는 수지상 세포 제조공정과,
    상기 수지상 세포 제조공정에서 수득된 수지상 세포를 수지상 세포 백신으로 조제하는 조제공정을 포함하는 수지상 세포 백신의 제조방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 단구 및 상기 수지상 세포 중 적어도 한쪽을 동결 보존하는 동결 보존공정을 포함하지 않는 수지상 세포 백신의 제조방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 원료단구는 상기 수지상 세포 백신이 투여되는 대상으로부터 채취한 체액으로부터 얻은 것인 수지상 세포 백신의 제조방법.
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