KR101679609B1

KR101679609B1 - 큰뱀무 함유 약학적 조성물 또는 식품 조성물

Info

Publication number: KR101679609B1
Application number: KR1020130137509A
Authority: KR
Inventors: 김혜영; 류미라; 김경; 박민; 이유미
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2016-11-25
Also published as: KR20150077393A; KR20140083867A

Abstract

본 발명은 부작용이 적어 안전하면서도 장 내분비세포 자극 활성이 뛰어난 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것으로서, 큰뱀무 추출물을 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 조성물은 당뇨병 예방 및 개선, 심장질환 개선, 소화 장애 및 흡수 장애 개선 또는 치료, 항비만 또는 식욕 억제, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용, 또는 간질환 치료 또는 개선 등을 위한 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 GLP-1, CCK 또는 5-HT의 분비 자극 또는 hTGR5 활성화에 영향을 미치고, TRP, TRPA1, 지 단백(G protein) 및 PLCβ2 활성제로 작용할 수 있다.

Description

큰뱀무 함유 약학적 조성물 또는 식품 조성물{Pharmaceutical or food composition comprising Geum aleppicum}

본 발명은 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이며, 더 구체적으로 본 발명은 장 내분비세포로부터 장 호르몬 또는 신경펩타이드의 분비를 촉진시키는 추출물을 유효성분으로 함유하는 특정 질병 또는 질환에 유용한 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

장(gastrointestinal tract)에 존재하는 내분비세포인 장 내분비세포 (enteroendocrine cells)는 장(腸)의 내강(內腔)(intestinal lumen)에 유입된 성분에 의해 자극되어, 장 호르몬(gut hormones) 또는 신경펩타이드(neuropeptides)를 분비한다. 동일한 성분일지라도 혈액을 통하여 표적 장기로 이동하여 작용하면 호르몬이라 지칭하며 미주신경 활성화의 신호전달물질로 작용하면 신경펩타이드라 지칭한다.

장 내분비세포에서 분비되는 장 호르몬 또는 신경펩타이드로는 글루카곤-유사 펩타이드-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1), 콜레시스토키닌(Cholecystokinin, CCK), 세로토닌(Serotonin, 5-hydroxytryptamine, 5-HT) 등을 들 수 있다.

먼저, GLP-1은 회장(ileum) 및 결장(colon)에 존재하는 장 내분비세포의 일종인 L-cells에서 분비된다.

상기 GLP-1은 뇌혈관 질환 및 신경세포 염증 치료 효과(Salcedo I et al., Neuroprotective and neurotrophic actions of glucagon-like peptide-1 (GLP-1): an emerging opportunity to treat neurodegenerative and cerebrovascular disorders. British Journal of Pharmacology (2012) 166, 1586-1599), 동맥경화증 치료 효과 [Burgmaier M et al., Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and its split products GLP-1(9-37) and GLP-1(28-37) stabilize atherosclerotic lesions in apoe^-/- mice. Atherosclerosis (2013) 231, 427-435], 등이 있는 것으로 알려져 있다.

췌장에서 포도당 의존적 인슐린 분비 자극, 인슐린 유전자 발현 증진, 췌장 베타세포 증식 증진 효과, 췌장 베타세포 생존 증진 효과, 글루카곤 분비 저해 효과, 혈당 강하 등을 통해 당뇨병 치료 효과를 나타내는데 관여하며, 위장이 비워지는 속도를 늦추고, 식욕을 억제하고, 포만감을 증진시키며 음식 섭취를 억제하는데 관여하여 비만 치료 효과를 나타내는데 관여한다.

그리고 국소 빈혈(ischemia)로부터 심장세포(cardiomyocytes) 보호 효과 및 심장마비 우려가 있는 환자의 심장기능 향상 효과를 통해 심장병 치료 효과를 나태고, 췌장 및 소장에서 소화효소 분비를 증진시켜 효율적인 소화, 흡수 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다.(Sokos, G.G. et al ., Glucagon-like peptide-1 infusion improves left ventricular ejection fraction and functional status in patients with chronic heart failure. J. Card. Fail. (2006) 12: 694-699., Ban, K., et al ., Cardioprotective and vasodilatory actions of glucagon-like peptide-1 receptor are mediated through both glucagon-like peptide-1 receptor-dependent and -independent pathways. Circulation (2008) 117: 2340-2350. 참고).

상기 GLP-1은 G protein-coupled receptors(GPCRs)의 일종인 TGR5 및 GPR119의 활성화(Reimann, F., et al ., Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. (2008) 8: 532-539; Lauffer, L.M., et al ., GPR119 is essential for oleoylethanolamide-induced glucagon-like peptide-1 secretion from the intestinal enteroendocrine L-cell. Diabetes (2009) 58:1058-1066. 참고) 또는 α-gustducin의 활성화(Jang, H.J., et al ., 2007. Gut expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceeding of the National Academy of Science 104, 1506915074. 참고)에 의해 분비가 촉진되는 것으로 알려져 있다. 특히, 갈색 지방조직(brown adipose tissue) 및 근육(muscle)에 발현된 G protein-coupled receptor(GPCR) TGR5(GPR131)의 활성화는 에너지 소비를 증가시켜서 비만 치료 효과를 보이며, 간질환 개선에 관련이 있는 것으로 알려져 있으며(참고문헌 : Lieu T et al., GPBA: A G protein-coupled receptor for bile acids and an emerging therapeutic target for disorders of digestion and sensation. British Journal of Pharmacology (2013) in press), 동맥경화증을 억제하는 것으로 보고되었다(Pols TWH et al., TGR5 activation inhibits atherosclerosis by reducing macrophage inflammation. Cell Metabolism (2011) 14, 747).

다음으로, CCK는 십이지장(duodenum) 및 공장(jejunum)에 존재하는 장 내분비세포의 일종인 I-cells에서 합성되어 분비되며, 십이지장 점막에서 분비된 CCK는 미주신경섬유의 CCK-A 수용체의 활성화를 통해 포도당 생성을 억제하여 항당뇨 효과를 유도하며, 음식물 섭취를 억제 하여 항비만 효과를 가져오고, 소화 및 흡수 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다.

상기 CCK 분비에는 G단백 결합 수용체(G protein-coupled receptors (GPCRs)와 신호전달 분자들(G proteins, PLCβ2), transient receptor potential(TRP) channels 등이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다(FEBS Letters (2008) 582: 229-232).

그리고 5-HT는 위장관 전체에 존재하는 Enterochromaffin cells(EC cells)에서 분비되는 호르몬으로 소화 및 흡수 조절에 관여하고, 식욕 억제를 통해 항비만 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Gershon, M.D., Tack, J. (2007) The serotonin signaling system: from basic understanding to drug development for functional GI disorders. Gastroenterology 132, 397-414).

장 호르몬 또는 신경펩타이드 분비는 섭취한 음식을 소화의 단계에서 모니터링하여 음식 섭취와 소화 작용과 관련된 체내 항상성 (장 운동성, 장에서의 소화효소 분비 작용, 식욕 등)을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 체내 항상성은 흡수한 에너지와 소비된 에너지 사이의 균형을 나타내며, 이러한 균형이 깨지면 당뇨병, 심혈관 질환 등을 유발할 수 있다.

전 세계적으로 당뇨병, 심혈관 질환 등과 같은 심각한 질병에 효과적인 약물을 개발하려는 노력이 꾸준히 이어져 오고 있다. 그러나, 효과가 매우 높으면서도 비만, 간독성, 부종과 같은 부작용이 적은 약물을 개발하는 것이 쉽지 않다.

한편, 비만의 예방 또는 치료를 위해 항비만 효과를 갖는 약물이 사용되고 있으나, 이러한 약물은 기름변이나 복부 팽만감, 어지러움, 구갈, 변비, 혈압상승 등과 같은 부작용을 유발하는 것으로 알려지면서 보다 안전하고 효력이 강한 천연 기능성 물질의 개발이 절실히 요구되고 있다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 부작용이 적어 안전하면서도 장 내분비세포 활성이 뛰어나 여러 가지 유용한 효능을 나타낼 수 있는 약학적 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

특히 본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 당뇨병 치료 효과, 식욕 억제 효과, 항비만 효과, 심장질환 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 및 간질환 치료 또는 개선 중 어느 하나 이상의 효과를 나타내는 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 안전한 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 또는 식품 조성물의 유효한 양을 치료 또는 개선이 필요한 개체 또는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 개체 또는 환자에 있어 당뇨병 치료 효과, 식욕 억제 효과, 항비만 효과, 심장질환 개선, 동맥경화증 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 신경보호 작용 및 간질환 치료 또는 개선 중 어느 하나 이상의 효과를 달성하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 GLP-1, CCK 또는 5-HT의 분비 자극 또는 hTGR5 활성화에 영향을 미치고, 결과적으로 TRP, TRPA1, 지 단백(G protein), 또는 PLCβ2 활성제로 작용하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 큰뱀무(Geum aleppicum Jacq.) 추출물을 유효성분으로 포함하고, 장 내분비세포 활성을 가져, 결과적으로는 당뇨병 치료 효과; 식욕 억제 효과; 항비만 효과; 심장질환 개선; 소화 및 흡수 장애 개선 효과; 동맥경화증 개선; 신경보호 작용; 또는 간질환 치료 또는 개선 효과를 나타내는 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 오랫동안 사용되어 안전성이 입증된 천연물 중에서 큰뱀무의 추출물이 장 내분비세포의 활성화로 인해 분비되는 장 호르몬 및/또는 신경펩타이드의 분비에 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 일 실시예에서는 큰뱀무 추출물이 인슐린 유전자 발현 증가, 글루카곤 분비 저해 효과, 혈당강하 등의 효과를 나타낼 수 있음을 실험을 통해 밝혀내어 큰뱀무 추출물의 당뇨병 예방 및 개선 효과에 대한 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 큰뱀무 추출물이 식욕 억제 효과를 가지고, 포만감을 증진시킨다는 것을 실험을 통해 밝혀내어 큰뱀무 추출물의 식욕 억제를 통한 항비만 효과에 대한 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 큰뱀무 추출물이 췌장 및 소장에서 소화효소 분비를 증진시키고, 장 수축작용 및 운동성을 조절한다는 것을 실험을 통해 밝혀내어 큰뱀무 추출물의 소화 및 흡수 장애 개선 효과에 대한 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 큰뱀무 추출물이 심장근육으로 전달되는 혈류를 조절하여 심장근육세포를 보호하는 효과가 뛰어나다는 사실을 밝혀내어 큰뱀무 추출물의 심장질환 개선 효과에 대한 용도를 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명의 큰뱀무 추출물은 국소빈혈로부터 심장세포를 보호하고, 심장마비 우려가 있는 환자의 심장 기능 향상 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 큰뱀무 추출물이 동맥경화증을 예방할 수 있다는 것을 확인하고, 상기 추출물의 동맥경화증 개선 효과에 대한 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 큰뱀무 추출물에 의해 뇌의 Arcuate nucleus in hypothalamus(ARC)를 활성화시키고, 미주신경 (vagus nerves)을 활성화시킨다는 사실을 밝혀내어 큰뱀무 추출물의 신경보호 효과에 대한 용도를 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명의 큰뱀무 추출물은 신경변성(Neurodegenerative) 질환 및 뇌혈관(cerebrovascular) 질환을 치료하고, 신경세포 염증(Neuroinflammation)을 치료하고, 신경 조직 발생(Neurogenesis) 증진 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 큰뱀무 추출물의 간질환 치료 또는 개선 효과에 대한 용도를 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명의 큰뱀무 추출물은 간 염증(Hepatic inflammation) 감소 효과, 장간 혈액순환(enterohepatic blood flow) 증진효과, 간 기능 개선 효과, cholestatic liver diseases 치료 효과, 소양병 (搔痒病; pruritus) 및 무통증 황달 (painless jaundice) 치료 효과, 장 기능 (intestinal functions) 개선 효과, 신경전달 반응 촉진 효과를 기대할 수 있다.

또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 GLP-1, CCK 또는 5-HT의 분비 자극 또는 영향을 미치거나 TRP, TRPA1, 지 단백(G protein), PLCβ2 활성제로 작용하는 조성물을 제공한다.

구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 큰뱀무 추출물이 GLP-1 분비를 자극한다는 것을 실험을 통해 밝혀내어 큰뱀무 추출물의 GLP-1 분비 자극 효과에 대한 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 큰뱀무 추출물이 CCK 분비를 자극하고, 세포내 칼슘 농도 및 cAMP 증가로 GPCRs이 활성화되는 것을 실험을 통해 밝혀내어 큰뱀무 추출물의 CCK 분비 자극 효과에 대한 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 큰뱀무 추출물이 5-HT분비를 자극하고, 세포내 칼슘 농도 변화를 유발하는 것을 실험을 통해 밝혀내어 큰뱀무 추출물의 5-HT 분비 자극 효과에 대한 용도를 제공한다.

또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 TRP, TRPA1, 지 단백(G protein) 또는 PLCβ2 활성제로 작용하는 조성물을 제공한다.

구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 큰뱀무 추출물이 TGR5를 활성화시키는 것을 실험을 통해 밝혀내어 TGR5 활성 효과에 대한 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 큰뱀무 추출물이 칼슘농도를 증가시키는 것을 발견하고, 큰뱀무 추출물이 TRP, TRPA1 채널을 활성화시키는 것을 실험을 통해 밝혀내어 TRP, TRPA1 채널 활성 효과에 대한 용도를 제공한다. 또한 본 발명의 큰뱀무 추출물에 의해 지 단백(G protein)이 활성화되어 세포내 칼슘이온 농도가 증가하는 것을 밝혀내어 지 단백 활성 효과에 대한 용도를 제공한다.

또 다른 실시예에서 큰뱀무 추출물에 의해 PLCβ2가 활성화되어 세포내 칼슘이온 농도와 cAMP 농도가 증가하는 것을 밝혀내어 PLCβ2 활성 효과에 대한 용도를 제공한다.

본 발명의 큰뱀무 추출물은 본 발명이 속한 분야에서 통상적인 방법으로 추출해낸 추출물을 의미하며, 추출 후 분획, 분리, 여과 등의 방법으로 추가적으로 정제될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 상기 큰뱀무 추출물은 큰뱀무의 용매 추출물 또는 이의 건조물일 수 있다. 큰뱀무 추출 시 추출 용매는 천연물 추출에 사용되는 용매이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 정제수; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 등의 다가 알코올; 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들은 혼합 용매를 이용할 수 있으나, 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하고, 정제수, 에탄올 또는 이들의 혼합용매를 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 정제수와 에탄올의 혼합용매를 사용하는 것이 본 발명의 목적상 더욱 바람직하다.

상기 추출 용매의 양은 큰뱀무 중량대비 10 내지 100배가 이용될 수 있고, 바람직하게는 20 내지 80배가 이용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 30 내지 50배가 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 큰뱀무 추출물을 추출하는 방법은 교반 추출, 냉침 추출, 열수 추출, 침지 추출, 초임계 추출, 아임계 추출, 고온 추출, 고압 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 가온하여 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하다. 추출 시 온도는 10 내지 30℃인 것이 바람직하고, 상기 추출 시간은 1일 내지 20일인 것이 바람직하며, 1 내지 5일인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

더욱 구체적으로, 큰뱀무를 음건하여 분쇄한 후, 추출용매를 큰뱀무 분쇄물의 1 내지 20배 부피량 만큼 가하여 추출하고 나서, 선택적으로 (감압)농축, 건조 또는 정제 과정을 거쳐 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 전술한 방법과 같이 추출용매를 가하여 유효성분물질을 추출하되 (a) 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50 내지 100℃의 온도 조건에서 1 내지 20시간 가열하여 추출하거나, (b) 5 내지 37℃의 온도 조건에서 1 내지 15일간 침적시켜 유효성분을 추출할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 또 다른 실시예에 따르면, 상기 장 내분비세포 활성화를 위한 큰뱀무 추출물은 큰뱀무 추출물의 분획물일 수 있다.

본 발명의 큰뱀무 분획물은 상기 큰뱀무 추출물(바람직하게는 탄소수 1-4의 저급 알코올 추출물)을 헥산, 클로로포름, 부탄올 및 에틸 아세테이트와 같은 물보다 극성이 낮은 용매로 분획하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 헥산 또는 클로로포름을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

특히, 본 발명에 따른 효과를 달성한다는 목적에서 본 발명에 따른 큰뱀무 추출물은 탄소수 1-4의 저급 알코올 추출물의 헥산 또는 클로로포름 분획물인 것이 바람직하다.

상기 분획물은 건조시키기 전의 액상 상태의 큰뱀무 추출물을 이용하거나 건조된 큰뱀무 추출물을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 등 적당한 용매에 현탁 또는 용해시킨 후, 헥산, 클로로포름, 부탄올 또는 에틸 아세테이트와 같은 물보다 극성이 낮은 용매를 순차적으로 첨가하여 각각의 층을 분리한 다음 각 층을 감압 농축 및/또는 건조시켜 수득할 수 있다.

이때, 상기 감압 농축은 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 “건조”는 감압 건조, 진공 건조, 비등 건조, 분무 건조, 상온 건조 또는 동결 건조일 수 있으나, 동결 건조를 하는 것이 더욱 바람직하다. 다만 본 발명은 이러한 건조 방법에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 큰뱀무의 추출물은 글루카곤 유사 펩타이드-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1, GLP-1-(7-36) amide), 콜레시스토키닌(Cholecystokinin (CCK)), 세레토닌(Serotonin, 5-hydroxytryptamine, 5-HT) 등과 같은 장 호르몬 및/또는 신경펩타이드를 분비하는 장 내분비세포를 활성화시켜 상기 장 호르몬 및/또는 신경펩타이드의 분비를 촉진시키는 것을 발견하게 되었다.

따라서, 본 발명은 큰뱀무 추출물이 장 호르몬 및 신경펩타이드의 분비를 촉진시켜, 활성화된 장 호르몬 및/또는 신경 펩타이드에 의해 당뇨병 치료 효과, 식욕 억제 효과, 항비만 효과, 심장질환 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 효과, 또는 간질환 치료 또는 개선 등을 갖는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 큰뱀무 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료 효과, 식욕 억제 효과, 항비만 효과, 심장질환 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 효과, 또는 간질환 치료 또는 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 상기 조성물은 의약품, 건강 보조 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 등에 이용될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 예를 들어, 산제는 본 발명의 추출물과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 추출물; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 큰뱀무 조성물은 치료해야할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약제학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다. 일정 시간 동안 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 데포(depot) 제형 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 큰뱀무 추출물은 매일 약 0.001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 큰뱀무 추출물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 큰뱀무 추출물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 큰뱀무 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 큰뱀무 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물 중 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 큰뱀무 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

본 발명의 큰뱀무 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 큰뱀무 추출물의 치료학적으로 유효한 양 또는 건강 개선을 위해 유효한 양을 치료 또는 상태 개선이 필요한 환자 또는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 식욕 억제 효과, 항비만 효과, 심장질환 개선, 당뇨병 예방 또는 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 및/또는 간질환 치료 또는 개선 방법을 제공한다.

즉, 본 발명은 큰뱀무 추출물의 식욕 억제 효과, 항비만 효과, 심장질환 개선, 당뇨병 예방 또는 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 및/또는 간질환 치료 또는 개선 효과를 갖는 의약 또는 건강기능식품 용도를 제공한다.

본 발명은 큰뱀무 추출물의 당뇨병 치료 효과, 식욕 억제 효과, 항비만 효과, 심장질환 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 및/또는 간질환 치료 또는 개선 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 식품 조성물은 천연 추출물을 이용하여 부작용이 적고 안전하며, 당뇨병 치료 효과, 식욕 억제 효과, 항비만 효과, 심장질환 개선, 소화 및 흡수 장애 개선 효과, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 및/또는 간질환 치료 또는 개선 효과가 탁월하다.

도 1은 큰뱀무 추출물 투여에 의한 Caudal DVC(Dorsal vagal comlpex)에서의 c-Fos 활성화를 나타낸 사진이다.
도 2는 큰뱀무 추출물 투여에 의한 Arcuate nucleus in hypothalamus(ARC)에서의 c-Fos 활성화를 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 큰뱀무 추출물의 제조

본 실험에 사용된 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 제주테크노파크에서 분양받은 것을 사용하였다(분양번호 JBRI-10611). 구체적으로, 뿌리를 제외한 큰뱀무 전초를 동결 건조시킨 후 마쇄하여 시료 1g당 80 중량% 에탄올 50 mL을 가하고 상온에서 3일 간 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No. 1, England)를 사용하여 2회 여과하고 회전감압 농축기(B-480, Buchi, Switzerland)로 농축한 후 다시 동결건조를 한 후 분말화 것을 본 실험의 시료로 사용하였다.

이하에서는, 상기 방법으로 얻어진 큰뱀무 추출물이 장 호르몬 또는 신경펩타이드 분비에 효과적임을 보여주는 실험 및 그 결과를 나타내었다.

<실시예 2> NCI-H716 세포에서의 결과

1) 세포배양

인체 유래 세포주인 NCI-H716 cells는 ATCC (the American Type CultureCollection (Manassas, VA))으로부터 구입하였다. 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100IU/ml 페니실린, 100/ml 스트렙토마이신이 함유된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.

2) 시료의 GLP-1 분비 작용 측정 방법

NCI-H716 세포를 2 x 10⁵cells/mL의 농도로 96-wellplate에 3일간 배양하였다. 실험 당일, 세포는 phosphated buffered saline(PBS)로 수세과정을 거친 뒤, Krebs-Ringer bicarbonate buffer (KRB, 128.8mmol/l NaCl, 4.8mmol/l KCl, 1.2mmol/l KH₂PO₄, 1.2mmol/l MgSO₄, 2.5 mmol/l CaCl₂, 5mmol/l NaHCO₃, 및 10mmol/l HEPES, 0.2% BSA, pH 7.4)에서 시료를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 1시간 배양 후 GLP-1 분석을 위하여 상층액을 취하고(100μL), GLP-1 활성 ELISA 키트(EGLP-35K, Millipore)에 의하여 분석하였다. GLP-1의 농도는 공급된 GLP-1 표준물질에 준하여 (pmole/mL) 계산되었으며, 결과는 시료의 자극에 의해 분비된 GLP-1의 농도를 대조군의 자극에 의해 분비된 농도와 비교하여 fold of control로 나타내었다.

3) 세포내 칼슘 농도 변화 측정 방법

세포내 칼슘의 변화를 살펴보기 위하여 형광-기반 에세이(Fluorescence-based assay) 방법을 이용하였다. 96-well plate에 4.0 x10⁴ cells/well의 농도로 세포를 분취한 후 48 시간 후 Molecular device에서 구입한 칼슘-5 에세이 키트(Calcium-5 assay kit)를 사용하여 Fluorometric imaging plate reader (FLIPR^TM)인 Flexstation III (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 세포내 Ca²⁺ 농도를 측정하였다. 즉 시료를 주입한 후 120초간 칼슘이 염색되어 나오는 형광을 파장 488nm (excitation)과 525 (emmision)에서 측정하였으며, 결과는 최대 형광치(maximum fluorescent value) - 최소 형광치(minimum fluorescent value) = 상대 형광 단위(delta relative fluorescent units (ΔRFU))로 자동으로 계산되었다.

특정 성분이 GPCRs를 활성화시키면 GPCRs과 연결된 G protein complex (Gα-gustducin, Gα-transtducin, Gα14, Gβ3, Gβ1, Gγ13)가 활성화되고, 이는 phospholipase 를 활성화시켜서 type Ⅲ IP3-receptor를 활성화시키게 되고, 세포질 (cytoplasm) 내에 Ca²⁺ 농도의 증가를 일으키므로 상기 세포내 Ca²⁺ ion 농도 변화를 측정하는 방법을 통하여 GPCRs의 활성화를 측정할 수 있을 것으로 판단하였다.

또한, TRP channels이 활성화되면 세포막 바깥의 칼슘 이온이 세포내로 들어오게 되므로, 세포내 Ca²⁺ ion 의 농도를 측정함으로써 TRP channels의 활성화를 측정할 수 있을 것으로 생각된다.

4) cAMP 측정 방법

NCI-H716 세포주는 1 x 10⁶cells/mL의 농도로 24-wellcultureplate에 분취한 후 3일간 배양하였다. 실험 당일 시료와 함께 KRB 버퍼 안에서 37℃ in 5% CO₂배양기에서 배양되었으며, 반응된 배지는 제거하고 세포는 KRB 버퍼로 3회 수세과정을 거친 뒤 0.1N HCl 0.5mL을 넣고 150 rpm, 상온에서 20분간 반응시켰다. 반응된 세포는 1000g에서 10분 동안 원심분리 과정을 거쳐 상층액을 얻고 바로 효소 면역분석법(EIA, enzyme immunoassay)을 이용한 cyclic AMP kit를 이용하였다.

5) 결과

GLP-1과 cAMP의 농도는 EIA 방법에 따라 실시하였다. 세포내 칼슘 농도 변화는 상대 형광 단위(△RFU)로 표현하였다. 모든 값은 triplicate로 실험한 3회 반복 실험으로 mean ± S.E.M (n=9)으로 나타내었다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 vs control (대조군)

2-1. NCI-H716 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물의 GLP-1 분비 효과

	농도	GLP-1 분비 (fold of control)
대조군		1.000 ± 0.088
큰뱀무(80% 에탄올 추출)	500μg/mL	2.396± 0.226*

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 큰뱀무(80% 에탄올 추출물)은 NCI-H716 세포에서 GLP-1 분비효과가 있음을 알 수 있었다. 이로부터 큰뱀무(80% 에탄올 추출물)은 장 내분비세포로부터 GLP-1 분비 효과가 매개됨으로써 췌장에서 포도당 의존적 인슐린 분비 자극, 인슐린 유전자 발현 증진, 췌장 베타세포 증식 증진 효과, 췌장 베타세포 생존 증진 효과, 글루카곤 분비 저해 효과, 혈당 강하 등을 통해 당뇨병 치료 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.

또한, 위장이 비워지는 속도를 늦추고, 식욕을 억제하고, 포만감을 증진시키며 음식 섭취를 억제하는데 관여하여 비만 치료 효과를 나타내며, 국소 빈혈(ischemia)로부터 심장세포(cardiomyocytes) 보호 효과 및 심장마비 우려가 있는 환자의 심장기능 향상 효과를 통해 심장병 치료 효과를 나타내고, 췌장 및 소장에서 소화효소 분비를 증진시켜 효율적인 소화, 흡수 조절이 가능할 것으로 생각된다.

또한, 이로부터 상기 추출물은 신경변성(Neurodegenerative) 질환 및 뇌혈관(cerebrovascular) 질환을 치료하고, 신경세포 염증(Neuroinflammation)을 치료하고, 신경 조직 발생(Neurogenesis) 증진 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.

그리고, 간 염증(Hepatic inflammation) 감소 효과, 장간 혈액순환(enterohepatic blood flow) 증진효과, 간 기능 개선 효과, cholestatic liver diseases 치료 효과, 소양병 (搔痒病; pruritus) 및 무통증 황달 (painless jaundice) 치료 효과, 장 기능 (intestinal functions) 개선 효과, 신경전달 반응 촉진 효과를 기대할 수 있어 간질환 개선에 유용할 것으로 생각된다.

뿐만 아니라, 상기 추출물은 동맥경화 개선에도 효과적일 것으로 생각된다.

2-2. NCI - H716 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물의 세포내 Ca ² ⁺ 농도 변화

	농도	Ca² ⁺ 반응 (ΔRFU)
대조군		9.181 ± 0.632
큰뱀무(80% 에탄올 추출)	500 μg/mL	35.003 ± 1.984**
포도당	100 mM	10.240± 0.352**

표 2에 나타난 결과에 따르면, 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물 500μg/mL은 대조군에 비하여 유의적으로 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 것으로 나타났다. 세포 내 칼슘 농도가 증가했다는 것은 GPCRs의 활성화로 칼슘 이온이동이 활발해진 것으로 생각된다.

따라서, 본 발명의 큰뱀무 추출물이 인슐린 유전자 발현 증가, 글루카곤 분비 저해 효과, 혈당강하 등의 효과를 나타내어 당뇨병 치료에 효과가 있을 것으로 생각되며, 식욕 억제 효과를 가지고, 포만감을 증진시켜 항비만 효과가 있을 것으로 생각된다.

또한, 장 수축작용 및 운동성을 조절하여 큰뱀무 추출물의 소화 및 흡수 장애를 개선하고, 큰뱀무 추출물이 심장근육으로 전달되는 혈류를 조절하여 심장근육세포를 보호하는 효과가 있을 것으로 생각된다.

2-3. NCI - H716 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물의 세포내 cAMP 증가 효과

시료	농도	cAMP (fold of control)
대조군		1.000± 0.100
큰뱀무(80% 에탄올 추출)	500 μg/mL	13.365 ± 3.321*
OEA (oleoylethanolamide)	20 μM	6.813± 1.634*

상기 표 3에 나타난 바와 같이 대조군에 비해서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 세포내 cAMP 증가에 효과가 있는 것으로 나타났다. 즉, 칼슘농도와 관련이 높은 cAMP 농도를 측정하여 큰뱀무 추출물이 GLP-1 분비 증가에 영향을 미치는 것으로 판단하였다. 따라서, 식욕 억제, 포만감 증진 등 비만 치료 효과를 보일 것으로 생각되고, 심장세포 보호 작용을 통해 심장질환 개선 효과를 보일 것으로 생각되며, 인슐린 분비를 증가시켜 당뇨병 치료에 효과적일 것으로 생각된다.

<실시예 3> TGR5 활성 측정

1) 세포배양

CHO-K1세포는 ATCC (Mnassas, VA)로부터 분양받았으며 10% (v/v) 소 태아 혈청(FBS), 100U/mL 페니실린, 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 함유한 Ham's F-12K 배지에 배양하였다.

2) TGR5 활성 측정

hTGR5 plasmid DNA는 G-protein-coupled bile acid receptor 1[Homo sapiens](GPBAR1, TGR5), transfection-ready DNA로서 transcript variant 3는 Origene 사로부터 구입하였으며 vector는 4.5Kb의 pCMV6-XL5이며 insert인 GPBAR1(TGR5)은 1.4 Kb이었다. TGR5 플라스미드를 얻기 위해 일단 100μg/mL 앰피실린(ampicillin)이 포함된 형질전환 E. coli에 증식시킨 후 Invitrogen Purelink(High pure filter maxiprep kit)를 이용하여 플라스미드를 얻었다. TGR5 발현 플라스미드 (pCMV6-XL5/TGR5) 400ng/well을 CHO-K1에 100ng/well CRE-driven luciferase reporter plasmid와 함께 Neon^TM (Invitrogen, Cergy Pontoise, France)을 이용하여 트렌스펙션한 후 48시간 후에 5시간 동안 시료를 처리하여 반응시킨 후 dual-glo^TM luciferase assay system kit(promega)를 이용하여 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다. 루미네선스(luminescence)는 Victor3^TM(PerkinElmer)를 이용하였다.

3) 결과

3-1. CHO - K1 세포에 hTGR5 를 트렌스펙션시킨 세포에서의 큰뱀무 80% 에탄올 추출물의 TGR5 활성 증진 효과

TGR5 플라스미드로 트렌스펙션된 CHO-K1 세포가 이용되었으며 여기에 큰뱀무 80% 에탄올 추출물이 5시간 동안 처리되었다. TGR5 활성은 앞서 방법에서 언급했듯이 루시퍼레이즈 측정에 의해 평가되었으며 모든 값은 means± SEM으로 나타내었다. n=9. *p<0.05, ***p<0.001 vs control(대조군)

시료	농도	TGR5 활성 측정 (fold of control)
대조군		1.000 ± 0.120
큰뱀무 (80% 에탄올 추출물)	100 μg/mL	2.012 ± 0.332*
Lithocholic acid (LCA)	5 μM	3.483 ± 0.119***

상기 표 4에 나타난 바와 같이, hTGR5를 트렌스펙션시킨 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의해 TGR5 활성이 증가하였다. 따라서, 큰뱀무 추출물에 의해 식욕 억제, 포만감 증진 등 비만 치료 효과를 보일 것으로 생각되고, 심장세포 보효 작용을 통해 심장질환 개선 효과를 보일 것으로 생각되며, 인슐린 분비를 증가시켜 당뇨병 치료에 효과적일 것으로 생각된다.

또한, 장 수축작용 및 운동성을 조절하여 큰뱀무 추출물이 소화 및 흡수 장애를 개선하는 효과가 있을 것으로 생각된다.

뿐만 아니라, 상기 추출물은 동맥경화증 개선에도 효과적일 것으로 생각된다.

<실시예 4> STC-1 세포 이용한 CCK 분비 실험

1) 세포 배양

STC-1 cell은 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)을 사용하였으며, 온도 37℃와 5%의 CO₂를 유지하면서 배양기에서 배양하였다.

배양에 사용된 소 태아 혈청(FBS), 페니실린-스트렙토마이신, Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)은 Gibco에서 구입하였다.

2) CCK 분비 측정 방법

세포를 배양하여 24well plate에 각 well당 2×10⁵cells/well의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 72시간 후 HEPES 버퍼(4.5mM KCl, 1.2mM CaCl2, 1.2mM MgCl2, 10mM glucose, 140mM NaCl, 및 20mM Hepes-Tris, pH7.4)로 2회 세척하고 HEPES 버퍼에 물질을 첨가한 후 37℃에서 60분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 배지를 모아 10000rpm에서 10분간 원심분리 하였으며 얻어진 상층액은 -70℃에 보관하여 분석에 사용하였다. 실험에 사용된 kit는 효소 면역분석법(enzyme immunoassay (EIA)) kit (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont CA)이다.

3) 세포내 칼슘 반응 측정 방법

Poly-D-Lysine cotead black 96-well clear-bottom plates (Thermo)에 8.0 x 10⁴cells/well의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 72시간 후 Calcium-5 assay kit (Moelcular device)로 37°C에서 60분 배양하고 Flexstation III을 이용하여 Ca² ⁺ 반응을 측정하였다. 형광 파장은 488nm(ex)과 525(em)으로 약 120초간 반응을 보았으며 화합물의 주입은 20초에 실시하여 2초간의 반응을 보았다.

4) 결과

CCK 분비 효과

4-1. STC -1 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 CCK 분비 효과

시료	농도	Fold of control (mean ± S.E.M.)	t-test	P-Value
대조군		1.00 ± 0.01
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	100μg/ml	20.37 ± 3.94	**	0.008
	250μg/ml	33.12 ± 3.40	***	<0.001
	500μg/ml	60.49 ± 2.21	***	<0.001
AITC	0.1mM	21.57 ± 0.59	***	<0.001
	1mM	21.99 ± 0.64	***	<0.001
	10mM	25.59 ± 0.59	***	<0.001

Fold of control = 샘플 value/미처리 대조군 value

± S.E.M.(n=9) **P<0.01, ***P<0.001 vs. 대조군(1% DMSO)

상기 표 5에 나타난 바에 따르면, STC-1 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 CCK 분비 활성화에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

4-2. STC -1 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 CCK 분비에서 저해제가 미치는 영향(1)

STC-1 세포는 100μM 루테늄 레드(ruthenium red) 또는 50μΜ HC-030031로 30분간 사전 처리하였다. 500μg/ml의 추출물을 추가한 후에 37°C에서 60분간 배양하였다. ± S.E.M.(n=9) **P<0.05, ***P<0.001 vs. 대조군

시료	농도	저해제	Fold of control (mean ± S.E.M.)	t- test	P- Value	Inhibition(%)
대조군	1% DMSO		1.00 ± 0.04
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	500 μg/ml	무처리	34.22 ± 0.98
		RR	12.22 ± 0.41	***	<0.001	64.29
		HC-030031	29.44 ± 0.82	*	0.02	13.97
AITC	0.1 mM	무처리	22.56 ± 0.65
		RR	6.04 ± 0.73	***	<0.001	73.21
		HC-030031	10.70 ± 0.92	***	<0.001	52.58

상기 표 6에 나타난 결과에 따르면, TRP 길항제인 RR, TRPA1 길항제인 HC-030031을 큰뱀무 80% 에탄올 추출물과 함께 배양하였을 때 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 CCK 분비가 각각 47.89%, 6% 저해되었다. 이는 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 TRP 작용제, TRPA1 작용제로 작용하여 CCK를 분비시킴을 의미한다.

또한, 장 수축작용 및 운동성을 조절하여 큰뱀무 추출물의 소화 및 흡수 장애를 개선하는 효과가 있을 것으로 생각된다.

4-3. STC -1 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 CCK 분비에서 저해제가 미치는 영향(2)

STC-1 세포는 400μM TPPO 또는 20μΜ U-73122로 30분간 사전처리하였다.

500μg/ml의 추출물을 첨가한 후에 37°C에서 60분간 배양하였다.

Fold of control =sample value/untreated control value

± S.E.M.(n=9) ***P<0.001 vs. 무처리

시료	농도	저해제	Fold of control (mean ± S.E.M.)	t-test	P-Value	Inhibition(%)
대조군	1% DMSO		1.00 ± 0.07
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	500 μg/ml	무처리	30.49 ± 0.45
		TPPO	21.19 ± 0.24	***	<0.001	30.50
		U-73122	14.35 ± 0.27	***	<0.001	52.93
DB	10 mM	무처리	25.01 ± 0.77
		TPPO	17.05 ± 0.03	***	<0.001	31.83
		U-73122	15.53 ± 0.01	***	<0.001	37.92

상기 표 7에 나타난 바에 따르면, 지 단백 저해제인인 TPPO, PLCβ2 저해제인 U-73122을 큰뱀무 80% 에탄올 추출물과 함께 배양하였을 때 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 CCK 분비가 각각 30.50%, 52.93% 저해되었다. 이는 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 지 단백 활성화제 및/또는 PLCβ2 활성화제로 작용하여 CCK를 분비시킴을 의미한다.

또한, 큰뱀무 추출물이 장 수축작용 및 운동성을 조절하여 소화 및 흡수 장애를 개선하는 효과가 있을 것으로 생각된다.

세포내 칼슘 반응

4-4. STC -1 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물이 Ca ² ⁺ 반응에 미치는 영향

시료	농도	ΔRFU (mean ± S.E.M.)	t-test	P-Value
대조군	0.5% DMSO	75.93 ± 4.26
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	100μg/ml	148.82 ± 4.69	**	0.006
	250μg/ml	170.79 ± 2.46	***	0.001
	500μg/ml	206.37 ± 5.37	***	<0.001
AITC	0.1mM	105.41 ± 2.12	**	0.003
	1mM	151.04 ± 5.65	***	<0.001
	10mM	168.68 ± 5.79	***	<0.001

± S.E.M.(n=9) **P<0.01, ***P<0.001 vs. 대조군(0.5% DMSO)

상기 표 8에 나타난 바에 따르면, 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 칼슘이온 분비에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 큰뱀무 추출물은 GPCRs 활성화에 영향을 미쳐 항당뇨 효과, 식욕억제, 항비만 효과, 소화 및 흡수 장애 조절 효과를 보일 것으로 생각되었다.

4-5. STC -1 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 Ca ² ⁺ 반응에서 저해제가 미치는 영향(1)

STC-1 세포는 100μM 루테늄 레드(ruthenium red) 또는 50μΜ HC-030031로 60분간 사전 처리하였다. 이후 1mg/ml의 추출물을 처리하였다. ± S.E.M.(n=9) ***P<0.001 vs. 무처리

시료	농도	저해제	ΔRFU (mean ± S.E.M.)	t-test	P-Value	Inhibition(%)
대조군	0.5% DMSO		34.34 ± 1.63
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	1 mg/ml	무처리	137.18 ± 3.10
		RR	17.25 ± 2.77	***	<0.001	87.43
		HC-030031	39.31 ± 1.02	***
AITC	0.1 mM	무처리	400.52 ± 6.90
		RR	27.47 ± 1.77	***	<0.001	93.14
		HC-030031	66.07 ± 2.56	***	<0.001	83.50

상기 표 9에 나타난 결과에 따르면, TRP 길항제인 RR, TRPA1 길항제인 HC-030031을 큰뱀무 80% 에탄올 추출물과 함께 배양하였을 때 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 Ca² ⁺ 분비가 각각 52.68%, 10.19% 저해되었다. 이는 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 TRP 작용제, TRPA1 작용제로 작용하여 TRP 채널 활성화로 세포막 바깥의 칼슘 이온이 세포내로 유입된 결과를 의미한다.

4-6. STC -1 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 Ca ² ⁺ 반응에서 저해제가 미치는 영향(2)

STC-1 세포는 400μM TPPO 또는 20μΜ U-73122로 60분간 사전 처리하였다.

이후 1mg/ml의 추출물을 처리하였다. ± S.E.M.(n=9) ***P<0.001 vs. 무처리

시료	농도	저해제	ΔRFU (mean ± S.E.M.)	t- test	P- Value	Inhibition(%)
대조군	0.5% DMSO		71.14 ± 7.10
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	1 mg/ml	무처리	219.36 ± 31.64
		TPPO	126.38 ± 16.25	**	0.853
		U-73122	22.23 ± 2.35	**	0.003	89.37
DB	10 mM	무처리	217.79 ± 15.99
		TPPO	100.56 ± 2.16	**	0.002	53.83
		U-73122	130.60 ± 6.04	**	0.007	40.03

상기 표 10에 나타난 바에 따르면, 지 단백 저해제인인 TPPO, PLCβ2 저해제인 U-73122을 큰뱀무 80% 에탄올 추출물과 함께 배양하였을 때 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 Ca² ⁺ 분비가 각각 20.33%, 78.80% 저해되었다. 이는 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 지 단백 활성화제 및/또는 PLCβ2 활성화제로 작용하여 세포질내에 Ca² ⁺ 농도의 증가를 일으킨 것으로 생각되며 이를 통해 상기 큰뱀무 추출물은 GPCRs 활성화에 영향을 미친 것을 알 수 있었다.

상기 표 9 및 10에 나타난 결과를 통하여 상기 큰뱀무 추출물은 항당뇨 효과, 식욕억제, 항비만 효과, 심장질환 개선 효과, 소화 및 흡수 장애 조절 효과를 보일 것으로 생각되었다.

4-7. STC -1 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물이 세포막 전위 변화에 미치는 영향

시료	농도	ΔRFU (mean ± SEM)	t-test	P-Value
대조군	0.5% DMSO	59.12 ± 2.09
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	500μg/ml	248.80 ± 3.25	***	<0.001
KCl	0.1mM	17.01 ± 0.93	***	<0.001
	1mM	35.08 ± 3.43	**	0.004
	10mM	270.08 ± 9.57	***	<0.001

± S.E.M.(n=3-4) **P<0.01, ***P<0.001 vs. 대조군(0.5% DMSO)

상기 표 11에 나타난 결과에 따르면, 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 세포막 전위 변화에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 GPCRs의 활성화로 세포내 이온이동이 활발해진 것으로 생각된다. 따라서, 큰뱀무 추출물은 GPCRs를 활성화시켜 GLP-1 분비를 증가시키고 당뇨병 치료 효과, 심장질환 개선 효과, 식욕억제, 항비만 효과, 소화 및 흡수 조절 효과 등이 있을 것으로 생각된다.

<실시예 5> RIN14B 세포 이용한 5-HT 측정 방법

1) 세포배양

RIN14B cell은 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 RPMI medium 1640을 사용하였으며, 온도 37℃와 5%의 CO₂를 유지하면서 배양기에서 배양하였다.

2) 5-HT 분비 측정 방법

세포를 배양하여 24well plate에 각 well당 2×10⁵cells/well의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 72시간 후 5-HT 에세이 버퍼(HBSS, 0.1% BSA, 1.25mM CaCl2, 2μM 플록세틴, pH 7.4)로 2회 수세하고 5-HT 에세이 버퍼에 물질을 첨가한 후 37℃에서 60분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 배지를 모아 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였으며 얻어진 상층액은 -70℃에 보관하여 분석에 사용하였다. 실험에 사용된 kit는 Serotonin(EIA) kit (Enzo Life Sciences)이다

3) 세포내 칼슘 반응 측정 방법

Black 96-well clear-bottom plates (Corning)에 5.0 x 10⁴cells/well의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 48시간 후 Calcium-5 assay kit (Moelcular device)로 37°C에서 60분 배양하고 Flexstation III을 이용하여 Ca² ⁺ 반응을 측정하였다. 형광파장은 488nm(ex)과 525(em)으로 약 120초간 반응을 보았으며 화합물의 주입은 20초에 실시하여 2초간의 반응을 보았다.

4) 결과

5-1. RIN14B 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 5- HT 분비 효과

시료	농도	Fold of control (mean ± S.E.M.)	t-test	P-Value
대조군	1% DMSO	1.00 ± 0.26
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	100μg/ml	10.54 ± 0.36	***	<0.001
	250μg/ml	24.46 ± 2.14	***	<0.001
	500μg/ml	33.29 ± 0.38	***	<0.001
AITC	300μM	8.11 ± 2.70

Fold of control =sample value/untreated control value

Values are presented as the mean ± S.E.M.(n=9) ***P<0.001 vs. 대조군

상기 표 12의 결과에 따르면, 큰뱀무 추출물은 효율적인 소화 흡수 조절 작용, 식욕 억제를 통한 항비만 효과를 갖는 것으로 알려진 5-HT 분비에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

5-2. RIN14B 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 5- HT 분비에서 저해제가 미치는 영향

RIN14B 세포는 100μM 루테늄 레드 또는 50μΜ HC-030031로 30분간 사전 처리하였다. 500μg/ml의 추출물을 첨가한 후에, 37°C에서 60분간 배양하였다

Fold of control =sample value/untreated control value

Values are presented as the mean ± S.E.M.(n=3-4)

시료	농도	저해제	Fold of control (mean ± S.E.M.)	t-test	P-Value	Inhibition(%)
대조군	1% DMSO		1.00 ± 0.19
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	500 μg/ml	무처리	35.34 ± 4.03
		RR	12.20 ± 6.45			65.49
		HC-030031	17.38 ± 9.21			50.82
AITC	300uM	무처리	8.11 ± 2.70
		RR	3.60 ± 1.80			55.56
		HC-030031	9.02 ± 6.37			-11.27

상기 표 13에 나타난 결과에 따르면, TRP 길항제인 RR, TRPA1 길항제인 HC-030031을 큰뱀무 80% 에탄올 추출물과 함께 배양하였을 때 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 5-HT 분비가 각각 65.49%, 50.82% 저해되었다. 이는 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 TRP 작용제, TRPA1 작용제로 작용하여 TRP 채널 활성화로 세포막 바깥의 칼슘 이온이 세포내로 유입된 결과를 의미한다.

5-3. RIN14B 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물이 Ca ² ⁺ 반응에 미치는 영향

시료	농도	ΔRFU (mean ± S.E.M.)	t-test	P-Value
대조군	0.5% DMSO	3.34 ± 0.44
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	100μg/ml	11.08 ± 0.74	***	<0.001
	250μg/ml	25.24 ± 0.23	***	<0.001
	500μg/ml	37.04 ± 1.28	***	<0.001

각각의 well의 반응은 ΔRFU로 결정하였다.

± S.E.M.(n=9)*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. 대조군

상기 표 14에 나타난 바에 따르면, 큰뱀무 추출물을 처리한 RIN14B 세포의 ΔRFU 값은 처리하지 않은 대조군에 비해 더 큰 값을 나타냈다. 이러한 결과로부터 큰뱀무 추출물은 CCK 분비에 관여하는 TRP에 channel 활성화에 영향을 미치는 것으로 생각된다.

5-4. RIN14B 세포에서 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 Ca ² ⁺ 반응에서 저해제가 미치는 영향

RIN14B는 100μM 루테늄 레드 또는 50μΜ HC-030031로 60분간 사전처리하였다 이후에 500μg/ml의 추출물을 추가하였다.

± S.E.M.(n=9) **P<0.01, ***P<0.001 vs. 무처리

시료	농도	저해제	ΔRFU (mean ± S.E.M.)	t-test	P-Value	Inhibition(%)
대조군	0.5% DMSO		3.61 ± 0.15
큰뱀무 80% 에탄올 추출물	500 μg/ml	무처리	24.99 ± 0.88
		RR	12.68 ± 2.41	**	0.003	49.24
		HC-030031	11.11 ± 0.92	**	0.003
AITC	300uM	무처리	13.42 ± 1.08
		RR	4.51 ± 1.40	**	0.005	66.36
		HC-030031	3.98 ± 0.80	***	<0.001	70.31

상기 표 15에 나타난 결과에 따르면, TRP 길항제인 RR, TRPA1 길항제인 HC-030031을 큰뱀무 80% 에탄올 추출물과 함께 배양하였을 때 큰뱀무 80% 에탄올 추출물에 의한 Ca² ⁺ 분비가 각각 52.68%, 10.19% 저해되었다. 이는 큰뱀무 80% 에탄올 추출물은 TRP 작용제, TRPA1 작용제로 작용하여 TRP 채널 활성화로 세포막 바깥의 칼슘 이온이 세포내로 유입된 결과를 의미한다.

<실시예 6> 큰뱀무 추출물을 이용한 동물실험

실시예 1에서 얻은 큰뱀무 추출물을 증류수에 용해하여 실험용 쥐에 경구투여하여 1) 뇌조직의 면역염색에 의한 중추 활성화 실험, 2) Glucose tolerance tests, 3) Gastric emptying rate, 4) Food intake 측정, 5) Chloride 분비 효과 실험을 실시하였다.

(1) 실험방법

1) 뇌조직의 면역염색에 의한 중추 활성화 실험

큰뱀무 추출물을 위내로 투여하고 뇌부위의 활성화를 분석하기 위해 c-Fos 면역 염색을 하였다. 실험동물을 12시간 금식 시킨 후, 증류수에 녹인 큰뱀무 추출물(500 mg/kg BW)을 경구 투여한 후 2시간을 방치한다. 이후 urethan으로 깊은 마취 상태를 유도한다. 차가운 PBS 200 mL를 심장을 통해 관류 시키고, 이어서 4% paraformaldehyde을 300 mL 관류 시킨 후 뇌를 적출하여 4% paraformaldehyde에 4시간동안 4^oC에서 보관한다. 그 후 30% sucrose 용액에 옮겨 4 ^oC에서 충분히 가라앉게 하였다. 고정 작업이 끝난 뇌 조직은 OCT 용액을 이용하여 얼린다. 얼린 조직은 -20^oC에서 30um의 두께로 목표 영역을 중심으로 잘라준다. 목표 영역은 Arcuate nucleus in hypothalamus(ARC)와 Dorsal vagal complex (DVC)이다. 잘라진 조직은 PBS로 이동 시킨 후 PBS를 이용하여 세척한다. 이 조직은 0.3% H₂O₂에 15분간 담가 둔 후, 3회에 걸쳐 PBS로 세척한다. 이 조직은 3% normal goat serum을 포함한 PBS에 30분간 반응시킨다. 이 조직은 세척과정 없이 polyclonal rabbit c-Fos antibody (sc-25, Santa Cruz Biotech, USA)를 1:1000의 비율로 0.3%의 normal goat serum이 들어있는 PBST로 희석시켜 실온에서 24시간 반응시킨다. 반응이 끝난 조직은 PBST로 10분간 3회에 걸쳐 세척한다. 그 후 두 번째 anti-rabbit antibody (BA-1000, Vector, USA)를 30분간 실온에서 반응시킨 후 3회에 걸쳐 5분씩 세척한다. 이 조직은 avidin-giotinyated horseradish peroxidase complex(ABC) (PK-6100, Vector, USA)를 실온에서 30분간 반응 시킨 후 5분씩 3회에 걸쳐 PBST로 세척한 후 DAB kit (Zytomed Systems, Germany)을 이용하여 발색 시킨 후 PBS로 반응을 종결한다. 염색이 끝난 조직은 슬라이드로 옮겨 충분히 건조시킨 후, 탈수 반응을 수행한다. 탈수반응이 끝난 슬라이드는 커버슬라이드를 덮어 현미경으로 관찰 한다.

염색이 끝난 조직은 현미경(AXio. 4. 8. 1, Zeiss, Germany)을 이용하여 목표 영역을 Paxinos and Watson의 좌표에 따라 결정한 후, 슬라이드 3-6장의 c-Fos antibody로 염색된 핵의 수를 세어 그 평균값을 구한다.

2) 흰쥐에서의 경구당부하 검사에 미치는 영향 평가 ( Glucose tolerance tests )

스프래그 돌리 흰쥐 (Sprague-Dawley rats; 체중 약 400g; 수컷)를 16시간 절식시킨 후 포도당 (2g/kg 체중)과 동시에 큰뱀무 추출물 (500 mg/kg BW)을 경구 투여한다. 투여 후 0, 30, 60, 90, 120분에 꼬리 끝 부분을 절개하여 혈액을 채취하여 아쿠첵 혈당측정기(로슈사 제품)를 이용하여 혈당치를 측정한다. 포도당 (2g/kg 체중)만 투여한 군을 대조군으로 실험하였다.

3) Gastric emptying rate (위장이 비워지는 속도)를 늦추는 효과

Gastric emptying rate 측정은 Izbeki와 Doihara 등(1,2)의 방법을 이용하여 측정하였다. 본 실험에 사용한 흰쥐는 실험 시작 하루 전 절식 후 큰뱀무 추출물 (100, 250, 500 mg/kg BW)을 증류수에 녹여 경구 투여 후 30분 동안 방치한다. 흰쥐에 0.05% phenol red solution (1.5 mL)를 경구투여 후 20분이 지나고 경추탈골 후 위를 제거 한 후, 식염수에 세척하고 바로 0.1N NaOH (100 mL)에 잘게 균질화시킨다. 1시간 실온에서 안정화시킨 후 상층액(5 mL)을 20% trichloroacetic acid (0.5 mL)과 혼합 후 20분 간 4^oC에서 3000 rpm으로 원심분리 시킨다. 상층액을 0.5 N NaOH (4 mL)과 혼합 후 UV-spectrophotometer로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 증류수를 경구 투여하여 위와 같은 방법으로 실시하였다.

참고문헌

(1) F. Izbeki, T. Wittmann, S. Csati, J. Lonovics. 2004. The mechani는 of the inhibitory effect of ethanol on gastric emptying involve type A CCK receptors. Regulatory Peptides. 117: 101-105

(2) H. Doihara, K. Nosawa, E. Kawabata-Shoda, R. Kojima, T. Yokoyama, H. Ito. 2009. TRPA1 agonists delay gastric emptying in rats through serotonergic pathways. Naunyn-Schmied Arch Pharmacol. 380: 353-357

Gastric emptying rate(위장이 비워지는 속도) 는 다음과 같이 계산하였다.

Gastric emptying rate (%) = 100 (A/B) × 100,

A : 실험군의 phenol red solution을 경구투여 20분 후 위장 간 내에 phenol red가 남아 있는 양

B : 대조군의 phenol red solution을 경구투여 후 즉시 위장 간 내에 phenol red의 양

4) Food intake 측정

큰뱀무 추출물을 위내로 투여하고 Food intake를 측정하기 위해, 흰쥐를 실험 시작 하루 전 절식하였다. 각 군당 5마리씩 큰뱀무 추출물 (500 mg/kg)을 증류수에 녹여 경구 투여 후 120분 경과 후의 food intake를 측정하였다(3). 대조군은 증류수를 경구 투여하여 위와 같은 방법으로 실시하였다.

참고문헌:

(3) A. Serrano, FJ. Pav, S. Tovar, F. Casanueva, R. Se, C. Di, F.R. Fonseca. 2011. Oleoylethanolamide: Effects on hypothalamic transmitters and gut peptides regulating food intake. Neurohparmacology 60: 593-601

5) Chloride 분비 효과 실험

흰쥐의 혈청 중 chloride 함량 측정을 위해서 실험 시작 하루 전 절식 후 각 군당 5마리씩 큰뱀무 추출물(500 mg/kg BW)을 경구 투여하여 30분 경과 후 안와 채혈하였다. 혈액을 실온에서 30분간 방치한 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 Chloride Assay Kit (BioAssay Systems, USA)를 사용하여 측정하였다.

(2) 실험결과

1) 뇌조직의 면역염색에 의한 중추 활성화 실험 결과

큰뱀무 추출물을 위내로 투여하고 뇌부위의 활성화를 c-Fos 면역 염색으로 분석하였다. 큰뱀무 추출물의 자극에 의하여 장에서 GLP-1, CCK, 5-HT 등이 분비되면 이들은 혈액으로 분비되어 호르몬으로서 작용하며 또한 신경펩타이드로서도 작용한다. GLP-1, CCK, 5-HT 등은 호르몬으로 작용하여 뇌의 Arcuate nucleus in hypothalamus(ARC)를 직접 활성화시킨다. 또한 GLP-1, CCK, 5-HT 등은 미주신경 (vagus nerves)을 활성화시킨 후 이는 Dorsal vagal complex (DVC)를 활성화시키며 이는 다시 Arcuate nucleus in hypothalamus(ARC)를 활성화시킴으로써 식품섭취 정보를 중추에 전달하며 중추는 이 정보를 습득 후 말초 조직에 항당뇨, 항비만 등과 관련된 명령을 내 보내어 신체 활동을 조절한다 (Yi C-X and Tschop MH, Brain-gut-adipose-tissue communication pathways at a glance. Disease Models & Mechanisms, 5, 583, 2012).

그 결과 큰뱀무 추출물은 DVC 및 ARC 활성화 효과가 있었다 (도 1 및 도 2 참조). 이는 GLP-1, CCK, 5-HT가 분비됨으로써 항당뇨, 항비만 등과 관련된 각종 체내 항상성과 관련된 작용이 일어남을 예상할 수 있다.

2) 흰쥐에서의 경구당부하 검사에 미치는 영향 평가 ( 항당뇨 효과 확인)

그 결과 본 발명의 큰뱀무 추출물은 포도당 부하에 의한 30분후의 혈당치 상승분이 대조군은 102.7mg/dl인데 비하여 60.8mg/dl로 40.8% 낮추었으며, 60분후의 혈당치 상승분이 대조군은 110.7mg/dl인데 비하여 67.8mg/dl로 38.8% 낮추었으며, 혈당증가곡선 아래 면적 (Area under the curve; AUC)은 대조군은 17465 mg/dlmin인데 비하여 13841 mg/dlmin로 20.8% 낮추었으며, 이를 표 16에 나타내었다.

큰뱀무 추출물이 흰쥐의 경구 당부하에 의한 혈당 상승에 미치는 영향

실험군¹ ⁾	당부하후 시간별 혈당치 (mg / dL)					AUC² ⁾
실험군¹ ⁾	0분	30분	60분	90분	120분	AUC² ⁾
대조군³ ⁾	65.3± 5.9	168± 22.9	176± 14.7	130± 15.1	121± 11.2	17465± 1500
큰뱀무추출물	64.2± 5.1	125± 9.6	132± 11.2	121± 7.1	98± 5.2	13841± 984

¹⁾Values are mean± SD(n=10).

²⁾AUC : Area under the curve (포도당 부하 후 120분 동안의 혈당치 상승 곡선 아래의 면적이며 단위는 minmg/dl)

³⁾포도당만 투여한 군

3) Gastric emptying rat (위장이 비워지는 속도)를 늦추는 효과( 항비만 효과 확인)

큰뱀무 추출물 100, 250, 500 mg/kg 투여에 의하여 위장이 비워지는 속도가 낮아졌다 (표 17 참조). 이는 음식물이 위에 머무는 시간을 연장시켜서 식품섭취량을 감소시켜 항비만효과를 보일 수 있다.

큰뱀무 추출물 투여가 위가 비워지는 속도를 늦추는 효과

실험군	경구 투여 용량(mg/kg BW)	Gastric emptying rate (%)
대조군	-	90 ± 7.4
큰뱀무 추출물 투여군	100	73 ± 4.9
	250	36 ± 2.3
	500	29 ± 0.8

페놀 레드(phenol red) 투여 후 20분후 위장에 남아 있는 페놀 레드의 양을 측정하여 위가 비워지는 속도를 측정하였다.

대조군은 증류수 투여군임. Values are means SEM (N=6).

상기 표 17에 나타난 바에 따르면, 큰뱀무 추출물을 투여한 투여군은 추출물의 농도 의존적으로 위장이 비워지는 속도가 낮아지는 것을 알 수 있었다. 이는 음식물이 위에 머무는 시간을 연장시켜서 항비만 효과를 보일 수 있다.

4) Food intake 측정 ( 항비만 효과 관련 실험)

큰뱀무 추출물을 위내로 투여하고 120분 경과 후 섭취한 식이량에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 큰뱀무 추출물은 식이섭취량을 79.5% 감소시켰다 (하기 표 18 참조).

큰뱀무 추출물 투여가 흰쥐 식이 섭취량에 미치는 영향

실험군	경구 투여 용량(mg/kg BW)	2시간 동안의 식이섭취량(g)
대조군	-	1.9 ± 0.18
큰뱀무추출물 투여군	500	0.39 ± 0.05

상기 표 18에 나타난 결과에 따르면, 2시간 동안의 식이섭취량은 큰뱀무 추출물 투여군이 대조군에 비해 훨씬 더 적은 것으로 나타났다. 이러한 결과를 볼 때, 큰뱀무 추출물을 투여한 군에서 항비만 효과가 우수할 것으로 생각되었다.

5) Chloride 분비에 미치는 효과 (소화작용 촉진 효과 관련)

큰뱀무 추출물 투여가 위산 분비에 미치는 영향을 간접적으로 평가하기 위하여, 흰쥐의 혈청 중 chloride 농도를 측정하였다. 큰뱀무 추출물(500 mg/kg BW)을 경구 투여하여 30분 경과 후 혈액 중 chloride 농도를 측정한 결과, 큰뱀무 추출물 투여는 혈청 중 chloride 농도를 대조군에 비해 33.6% 증가시키는 효과가 있었다 (표 19 참조). 이는 위산 분비 자극으로 인한 염산이 혈액으로 분비된 것으로 사료되어 소화작용 촉진 효과를 기대할 수 있다.

큰뱀무 추출물 투여가 흰쥐 혈청 chloride 농도에 미치는 영향

실험군	경구 투여 용량(mg/kg BW)	혈청 chloride 농도(mg/dL)
대조군	-	265 ± 19.1
큰뱀무 추출물 투여군	500	354 ± 18.5

상기 표 19에 나타난 결과에 따르면, 큰뱀무 추출물을 투여한 흰쥐의 혈청 클로라이드 농도가 더 높은 것을 알 수 있었다. 따라서, 상기 결과로 부터 큰뱀무 추출물이 위산 분비를 촉진시켜 소화작용을 촉진할 것으로 생각되었다.

Claims

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큰뱀무(Geum aleppicum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항비만 또는 식욕 억제용 약학적 조성물.
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큰뱀무(Geum aleppicum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항비만 또는 식욕 억제용 식품 조성물.
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