KR101674447B1 - Protease Sensors and Protease Activity Assay Method Using the Protease Sensors - Google Patents

Protease Sensors and Protease Activity Assay Method Using the Protease Sensors Download PDF

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KR101674447B1 KR1020160057463A KR20160057463A KR101674447B1 KR 101674447 B1 KR101674447 B1 KR 101674447B1 KR 1020160057463 A KR1020160057463 A KR 1020160057463A KR 20160057463 A KR20160057463 A KR 20160057463A KR 101674447 B1 KR101674447 B1 KR 101674447B1
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Abstract

The present invention relates to a sensor used to measure protease activity, and a measurement method of protease activity using the same. According to the present invention, the measurement method of protease activity using recombinant pro-caspase solves various problems which occur in an existing measurement method of protease activity, like high background noise signals, interference (disturbance) between biological samples, the use of unrefined protein, and difficulties in using an experiment apparatus. The measurement method of protease activity is accurate and sensitive and secures high user convenience. Accordingly, the measurement method of protease activity can be used as a standard protocol for measuring protease activity, and further can be developed into a disease diagnosis method. Recombinant pro-caspase-3 includes: a linker including an amino acid sequence which is cleaved by matrix metalloproteinases (MMP) 2. The linker is at least one selected from the group consisting of GPLGVR, GIETGPLGVRS, GIETGSGPLGVRGS, GIETGGSGPLGVRGGS, and GIETGGGSGPLGVRGGGS.

Description

프로테아제 센서 및 이를 이용한 프로테아제의 활성 측정 방법{Protease Sensors and Protease Activity Assay Method Using the Protease Sensors}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a protease sensor and a method for measuring the activity of a protease using the protease sensor.

본 발명은 프로테아제 센서 및 이를 이용한 프로테아제의 활성 측정 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a protease sensor and a method for measuring the activity of a protease using the protease sensor.

프로테아제(단백질 가수분해효소; protease)는 자연계에 풍부하게 존재한다. 인간 게놈의 대략 2%가 프로테아제 또는 유사프로테아제인 것으로 알려져 있다(Doucet and Overall 2008; Turk 2006). Proteases (proteases) are abundant in nature. Approximately 2% of the human genome is known to be proteases or similar proteases (Doucet and Overall 2008; Turk 2006).

이러한 프로테아제는 거의 모든 생물학적 과정에 관련되어 있고 이것의 비정상적인 활성은 다양한 질병 상태와 연관되어 있다(Artal-Sanz and Tavernarakis 2005; Craik et al. 2011; Edwards and Murphy 1998). 따라서 프로테아제는 질병 치료의 표적이 되기도 하고 질병 마커이기도 하다. These proteases are involved in almost all biological processes and their abnormal activity is associated with various disease states (Artal-Sanz and Tavernarakis 2005; Craik et al. 2011; Edwards and Murphy 1998). Thus, proteases are both targets for disease treatment and disease markers.

그 동안 생물학적 샘플 안의 프로테아제를 효과적으로 분석하기 위해 다양한 방법들이 개발되어왔다. 예를 들어, 공명 에너지 전달(resonance energy transfer; RET)에 기초한 방법들이 매우 넓게 연구되었다(Kim and Kim 2012; Welser et al. 2011; Yoon et al. 2012). RET에 관련된 두 개의 분자는 펩티드 물질에 의해 연결되는데 펩티드가 프로테아제에 의해 분해(cleavage)될 때, 연결된 두 분자는 서로 분리가 되며 이때 특정 형광 시그널의 감지가 가능케 된다. In the meantime, various methods have been developed to effectively analyze proteases in biological samples. For example, methods based on resonance energy transfer (RET) have been extensively studied (Kim and Kim 2012; Welser et al 2011; Yoon et al. 2012). The two molecules involved in RET are connected by a peptide material. When a peptide is cleaved by a protease, the two molecules connected are separated from each other, allowing the detection of a specific fluorescent signal.

최근 프로테아제에 의해 발광(luminescence) 또는 형광(fluorescence) 시그널을 발생시키는, 유전공학적으로 변형된 루시퍼라아제(luciferase) 및 락타마제(lactamase)에 대한 연구가 보고되었다(Fan et al. 2008; Shekhawat et al. 2009). 위와 같은 리포터 효소(reporter enzyme)는 그 자체로 불활성이며 프로테아제의 분해 반응에 의해 활성화될 수 있다. 프로테아제 시그널은 효소 연쇄반응(cascade of enzymatic reaction)을 통해서 증폭될 수 있다. 그러나, 리포터 단백질은 in vitro 해독(translation) 시스템을 사용하여 발현되며, 본질적으로 불안정하여 정제 없이 사용되기 때문에 이들 리포터 단백질을 이용하여 표준화된 방법을 개발하는데 있어서 어려움이 있다.Recently, studies have been reported on genetically engineered luciferase and lactamases that generate luminescence or fluorescence signals by proteases (Fan et al. 2008; Shekhawat et < RTI ID = 0.0 > al., 2009). Such a reporter enzyme is in itself inert and can be activated by the decomposition reaction of the protease. Protease signals can be amplified through a cascade of enzymatic reactions. However, reporter proteins are expressed using an in vitro translation system and are inherently unstable and are used without purification, making it difficult to develop standardized methods using these reporter proteins.

즉, 지금까지 다양한 프로테아제 분석 방법이 개발되었지만, 그 방법들은 높은 백그라운드 잡음 시그널(background noise signals), 생물학적 샘플들의 상호간섭(방해), 실험장치로의 접근성 및 기술적 어려움 등과 같은 한계를 갖는다는 문제가 있다.Thus, although various protease assay methods have been developed so far, they have limitations such as high background noise signals, mutual interference of biological samples, accessibility to experimental apparatus, and technical difficulties have.

한편, 지모겐(Zymogen)은 비활성상태인 전구체로서 지모겐의 펩티드결합이 단백질가수분해효소에 의해 가수분해가 되면 활성을 갖는 효소로 전환이 된다. 지모겐의 활성화된 효소로의 전환은 매우 다양한 생물학적인 현상을 조절함에 있어서 중요한 역할을 한다. 특히, 단백질가수분해효소는 다른 프로테아제에 의해 활성화되는 지모겐으로 종종 스스로 존재한다. 이것은 생물학적인 프로세스를 제어하는 것뿐만 아니라 본질적으로 활성화된 프로테아제들의 존재로 인해 잠재적으로 발생할 수 있는 악영향을 극복할 수 있게 해준다. 또한 생물학적 중요성 이외에 본래 형태의 지모겐이나 특별히 제작된(engineering) 지모겐은 잠재적으로 센서로서의 개발에 이용되거나 합성 신호 전달 연속 반응에 구성성분으로서 적용될 수 있다. 지모겐의 펩티드 결합이 잘리면서 활성화되는 것을 이용하여 본래 형태의 지모겐이나 제작된 지모겐으로 프로테아제의 활성을 측정하는 방법들이 개발되어 왔다. On the other hand, Zymogen is an inactive precursor, and when the peptide bond of zymogen is hydrolyzed by a protein hydrolyzing enzyme, it is converted into an enzyme having activity. The conversion of zymogen to activated enzymes plays an important role in regulating a wide variety of biological phenomena. In particular, proteolytic enzymes are often zymogens that are activated by other proteases. This allows not only to control the biological process but also to overcome the potential adverse effects due to the presence of essentially activated proteases. In addition to its biological importance, native forms of zymogen or engineering zymogens can potentially be used as a sensor for development or as a component in synthetic signaling sequencing reactions. There have been developed methods for measuring the activity of the protease using native zymogens or zymogens using the fact that the peptide bonds of zymogen are activated by cleavage.

예를 들면, 효소의 활성에 요구되는 구조적 변형을 제한함으로 인해 리포터효소가 비활성화되도록 제작할 수 있으며 이 구조적 변형의 제한은 프로테아제의 활성에 의해 완화될 수 있다.For example, the reporter enzyme can be made inactive so as to limit the structural modification required for the activity of the enzyme, and the limitation of this structural modification can be alleviated by the activity of the protease.

프로테아제 활성 측정뿐만 아니라, 생물학 프로세스에 관여하는 지모겐의 역할에 대해 고려하여 제작된 지모겐은 새로운 신호전달 체계에 중요한 부분을 담당할 수 있는데 그러한 분야에서의 적용 사례는 아직까지 크게 보고되지 않았다. In addition to the measurement of protease activity, Zymogen prepared considering the role of zymogen involved in biological processes can play an important role in the new signaling system.

기질금속단백질분해효소(Matrix Metalloprotease-2, MMP-2)는 암의 전이과정에 연관되어 있는 프로테아제로서 암 진단에 사용될 수 있는 마커 중 하나이다. MMP-2를 검출하는 것으로 암 진단이 가능하기 때문에 MMP-2를 더 민감하게 검출하기 위하여 많은 방법들이 연구되어 왔다. 특히, 예를 들어 공명 에너지 전달(Resonance Energy Transfer, RET)에 기초한 접근들이 많이 연구되었다. Matrix Metalloprotease-2 (MMP-2) is one of the markers that can be used to diagnose cancer as a protease that is involved in the process of cancer metastasis. Many methods have been studied to detect MMP-2 more sensitively because it is possible to diagnose cancer by detecting MMP-2. In particular, approaches based on resonance energy transfer (RET), for example, have been extensively studied.

카스파제-3는 세포의 자가사멸 과정에 연관되어 있는 프로테아제로서 17 kDa의 대단위체(large subunit)과 12 kDa의 소단위체(small subunit)로 이루어져있다. 카스파제-3는 활성이 없는 지모겐 형태로 만들어져 다른 프로테아제에 의해서 활성화된다.Caspase-3 is a protease involved in the autocleavage of cells, consisting of a large subunit of 17 kDa and a small subunit of 12 kDa. Caspase-3 is made into an inactive zymogen form and is activated by other proteases.

카스파제-3의 활성화를 모니터링하기 위하여 가장 대중적으로 사용되는 실험적인 방법은 카스파제-3에 대한 인공적인 형광생성 기질 (fluorogenic substrate, DEVD-AFC)을 사용한 형광기반 분석(fluorometric assay)이다(Stennicke, H.R. & Salvesen, G.S., J. Bioi. Chern., 272:25719, 1997). 그러나, 비록 형광기반분석이 민감하고 적은 양의 효소활성을 측정하는데 적합하다고 해도, 펩티드 기질의 생물학적 활성이 인위적인 표지(label)에 의해 영향을 받을 수 있고, 이로 인하여 카스파제-3과 펩티드 기질간의 상호작용시 간섭이 일어날 수 있는 문제점이 있다 (Su, J. et al., Anal. Chern., 78:4945, 2006). 또한, 한국공개특허 제2002-8122호의 발명도 세포소기관 막에 존재하는 카스파제의 활성을 측정하기 위하여 DEVD-amc 기질을 혼합반응시켜 방출된 amc 형광을 측정하는 것이나, 상술한 것과 동일한 문제점이 있다.The most popular experimental method used to monitor activation of caspase-3 is a fluorometric assay using an artificial fluorogenic substrate (DEVD-AFC) for caspase-3 (Stennicke , HR & Salvesen, GS, J. Bio. Chern., 272: 25719, 1997). However, even if the fluorescence-based assay is sensitive and suitable for measuring a small amount of enzyme activity, the biological activity of the peptide substrate may be affected by an artificial label, (Su, J. et al., Anal. Chern., 78: 4945, 2006). In addition, Korean Patent Laid-Open No. 2002-8122 discloses that amc fluorescence is measured by mixing DEVD-amc substrate to measure the activity of caspase existing in cell organelle membrane, but the same problem as described above .

본 발명자는 새로운 프로테아제 활성 분석 방법을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 지모겐인 카스파제의 링커가 '목적의 특정 프로테아제에 의해 인식되어 절단(분해)되는 절단 부위에 해당하는 펩티드 서열 및 추가적인 펩티드 서열'을 포함하도록 디자인하여, 상기 재조합 프로-카스파제를 제작하였으며, 상기 재조합 프로-카스파제에 목적의 프로테아제를 처리한 경우, 상기 목적의 프로테아제에 의해 프로-카스파제의 해당 서열이 절단되어, 지모겐 형태의 프로-카스파제가 효과적으로 활성화되었을 뿐만 아니라, 상기 카스파제의 활성형과 결합하는 검출제로부터 발생하는 시그널을 측정하여, 목적의 프로테아제의 수준을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventor has made an effort to develop a new protease activity assay method. As a result, the present inventors have designed the linker of the caspase, which is a zymogen, to include a peptide sequence corresponding to a cleavage site recognized and cleaved (cleaved) by a specific protease of interest and an additional peptide sequence, Caspase was prepared and when the desired protease was treated with the recombinant pro-caspase, the corresponding sequence of the pro-caspase was cleaved by the above-mentioned protease of interest to effectively activate the zymogen-type pro-caspase However, the present invention was completed by measuring the signal generated from the detection agent bound to the active form of the caspase, and confirming the level of the desired protease.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 재조합 프로-카스파제(pro-Caspase)를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel recombinant pro-caspase.

본 발명의 다른 목적은, 프로테아제(protease) 활성 측정용 센서를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a sensor for measuring protease activity.

본 발명의 또 다른 목적은, 프로테아제 활성 측정용 키트를 제공하는 데 있다.Still another object of the present invention is to provide a kit for measuring protease activity.

본 발명의 또 다른 목적은, 프로테아제의 활성 측정 방법을 제공하는 데 있다.It is still another object of the present invention to provide a method for measuring the activity of a protease.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 프로테아제(protease)에 의해 분해(cleavage)되는 아미노산 서열이 삽입되어 있는 링커(linker)를 포함하는 재조합 프로-카스파제(pro-Caspase)을 제공한다.According to an aspect of the present invention, there is provided a recombinant pro-caspase comprising a linker having an inserted amino acid sequence cleaved by a protease.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 카스파제는 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 7 및 카스파제 9로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이고, 보다 바람직하게는 카스파제 2 또는 카스파제 3이고, 가장 바람직하게는 카스파제 3이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the caspase is at least one selected from the group consisting of caspase 2, caspase 3, caspase 6, caspase 7 and caspase 9, more preferably caspase 2 or 3 < / RTI > and most preferably is caspase 3.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 링커는 상기 카스파제의 대단위체(large subunit) 및 소단위체(small subunit)를 연결할 수 있는 펩티드 서열이며, 프로테아제가 분해 반응을 용이하게 수행할 수 있도록, 유연한 펩티드로 구성될 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the linker is a peptide sequence capable of linking a large subunit and a small subunit of the caspase, wherein the protease is a flexible Peptide < / RTI >

또한, 상기 링커는 링커 내에 프로테아제가 분해 반응을 수행할 수 있는 분해 서열을 포함하는, 펩티드 서열을 의미한다. 상기 링커는 프로테아제가 분해 반응을 용이하게 수행할 수 있도록, 유연한 펩티드로 구성될 수 있는 펩티드를 모두 포함한다.In addition, the linker means a peptide sequence containing a degradation sequence in which the protease can undergo a degradation reaction in the linker. The linker includes all of the peptides that can be composed of flexible peptides so that the protease can easily perform the degradation reaction.

본 발명의 링커는 프로테아제(protease)에 의해 분해(cleavage)되는 아미노산 서열을 포함하는 한, 당업계에 공지된 어떠한 링커도 이용될 수 있으며, 바람직하게는 프로테아제(protease)에 의해 분해(cleavage)되는 아미노산 서열인 절단 부위 도메인을 포함하는 4 내지 30개의 연속적인 아미노산으로 구성된 펩티드를 포함할 수 있다.As long as the linker of the present invention includes an amino acid sequence cleaved by a protease, any linker known in the art may be used, and preferably, a linker cleaved by a protease And a peptide consisting of 4 to 30 contiguous amino acids comprising a cleavage site domain that is an amino acid sequence.

또한, 본 발명의 링커는 링커로서 작용하는 한, 절단 부위 도메인(프로테아제에 의해 분해되는 아미노산 서열) 이외에도, 가요성 입체 링커의 중립(neutral) 서열/서열들을 함유할 수 있다. In addition, the linker of the present invention may contain, in addition to the cleavage site domain (the amino acid sequence to be cleaved by the protease), the neutral sequence / sequences of the flexible three-dimensional linker, so long as it functions as a linker.

이러한 입체 링커는 잘 공지되어 있으며, 문헌에 기재되어 있다. 재조합 단백질에 대한 이들의 혼입은 숙주 세포에서 이의 과발현의 과정에 의해 생성된 단백질의 정확한 접기(folding)를 제공하는 것으로 의도된다. Such three dimensional linkers are well known and are described in the literature. Their incorporation into the recombinant protein is intended to provide an accurate folding of the protein produced by the process of overexpression thereof in the host cell.

본 발명의 입체 링커는 글라이신과 세린 잔기의 조합, 예를 들면, Gly　Ser(GS), Gly　Gly　Ser(GGS), Gly　Gly　Gly　Ser(GGGS), Gly　Gly　Gly　Gly　Ser(GGGGS), 또는 입체 링커로서 작용하는 임의의 이의 단편, 예를 들면, 단편 Gly　Ser(GS), Gly　Gly　Ser(GGS), Gly　Gly　Gly　Ser(GGGS), Gly　Gly　Gly(GGG) 또는 Gly Gly　Gly　Gly(GGGG)일 수 있으며, 바람직하게는 Gly　Ser(GS), Gly　Gly　Ser(GGS) 및 Gly　Gly　Gly　Ser(GGGS)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이다.The three dimensional linker of the present invention may be a combination of glycine and serine residues such as Gly Ser (GS), Gly Gly Ser (GGS), Gly Gly Gly Ser (GGGS), Gly Gly Gly Gly Ser (GGG), Gly Gly Gly (GGG), or Gly Gly Gly Gly (GGGG), which function as a fragment, such as a fragment Gly Ser (GS), Gly Gly Ser And preferably at least one selected from the group consisting of Gly Ser (GS), Gly Gly Ser (GGS) and Gly Gly Gly Ser (GGGS).

또한, 상기 입체 링커는 글라이신, 세린 및 알라닌 잔기의 조합의 임의의 조합, 예를 들면, Ala　Ser　Gly　Gly(ASGG), 또는 입체 링커로서 작용하는 임의의 이의 단편, 예를 들면, Ala Ser Gly(ASG)일 수 있다. 입체 링커, 예를 들면, 서열 Gly Gly Gly Ser Gly(GGGGS), 또는 입체 링커로서 작용하는 임의의 이의 단편, 예를 들면, 단편 Gly　Gly　Gly(GGG)와 입체 링커로서 작용하는 또 다른 단편의 조합을 사용하는 것도 또한 가능하다. 이러한 경우, 입체 링커는 글라이신, 세린 및 알라닌 잔기의 조합, 예를 들면, Gly　Gly　Gly　Ser　Ala　Ser　Gly　Gly(GGGSASGG)일 수 있다. 또한, 입체 링커는 세린과 히스티딘 잔기의 조합, 예를 들면, Ser　His　His　Ser(SHHS) 또는 Ser　His　His　Ala　Ser(SHHAS)일 수 있다.In addition, the three dimensional linker may be any combination of glycine, serine, and alanine residues such as Ala Ser Gly Gly (ASGG), or any fragment thereof acting as a three dimensional linker, such as Ala Ser Gly ( ASG). A three dimensional linker such as the sequence Gly Gly Gly Ser Gly (GGGGS), or any fragment thereof acting as a three dimensional linker, such as a combination of another fragment acting as a three dimensional linker with the fragment Gly Gly Gly (GGG) May also be used. In this case, the three dimensional linker may be a combination of glycine, serine, and alanine residues, for example, Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly (GGGSASGG). In addition, the three dimensional linker may be a combination of serine and histidine residues, for example, Ser His His (SHHS) or Ser His His Ala Ser (SHHAS).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 링커 내에 삽입되는 프로테아제에 의해 분해되는 아미노산 서열은 MMP(matrix metalloproteinases)에 의해 분해되는 아미노산 서열(서열번호 1 내지 9), 카스파제(caspase)에 의해 분해되는 아미노산 서열(서열번호 10 내지 19), 및 카텝신(Cathepsin B, E, K, L, S)에 의해 분해되는 아미노산 서열(서열번호 20 내지 24)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the amino acid sequence to be degraded by the protease inserted in the linker is an amino acid sequence (SEQ ID NOS: 1 to 9) which is degraded by MMP (matrix metalloproteinases), a protein which is degraded by a caspase (SEQ ID NOS: 10 to 19), and an amino acid sequence (SEQ ID NOS: 20 to 24) which is degraded by cathepsin (Cathepsin B, E, K, L, S).

본 발명에서 사용되는 용어 "프로테아제(protease)"는 펩티드 결합을 가수분해하는 효소의 총칭을 의미한다. 상기 프로테아제는 저분자 펩티드에 작용하는 단백질 가수분해효소로 펩티다아제(peptidase), 단백질에 작용하는 단백질 가수분해효소(proteinase)로 구분되는 프로테아제를 모두 포함한다.As used herein, the term "protease" refers to a generic term for enzymes that hydrolyze peptide bonds. The protease is a protein hydrolyzing enzyme that acts on low molecular weight peptides and includes proteases classified into peptidases and proteinases acting on proteins.

본 발명의 프로테아제는 예컨대, MMP(MMP-1, -2, -3, -7, -8 및 -9), 카스파제(caspase-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 및 -9) 및 카텝신(Cathehpsin B, E, K, L 및 S) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The protease of the present invention may be, for example, MMP (MMP-1, -2, -3, -7, -8 and -9), caspase-1, -2, -3, -4, , -7, -8, and -9) and cathepsin B (E, K, L and S), and the like.

본 발명에서 링커를 언급하면서 사용되는 표현 '프로테아제(protease)에 의해 분해(cleavage)되는 아미노산 서열이 삽입된'에서 상기 아미노산 서열은 '프로테아제가 인식하여 절단시키는 절단 부위 도메인'으로서, 측정하고자 하는 목적의 프로테아제가 분해할 수 있는 어떠한 아미노산 서열도 포함할 수 있다. In the present invention, the amino acid sequence is referred to as a cleavage site domain in which a protease is recognized and cleaved, in which the amino acid sequence cleaved by a protease is inserted, Lt; RTI ID = 0.0 > protease. ≪ / RTI >

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 링커 내에 삽입되는, 프로테아제에 의해 분해(cleavage)되는 아미노산 서열은 MMP(matrix metalloproteinases-1, -2, -3, -7, -8 또는 -9)에 의해 분해되는 아미노산 서열(서열번호 1 내지 9), 카스파제(caspase-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 또는 -9)에 의해 분해되는 아미노산 서열(서열번호 10 내지 19), 및 카텝신(Cathepsin B, E, K, L 또는 S)에 의해 분해되는 아미노산 서열(서열번호 20 내지 24)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 MMP(matrix metalloproteinases)에 의해 분해되는 아미노산 서열(서열번호 1 내지 9)이고, 보다 더욱 바람직하게는 MMP2에 의해 분해되는 아미노산 서열(서열번호 2 내지 4)이며, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 Gly Pro Leu Gly Val Arg(GPLGVR) 로 이루어진 아미노산 서열이다.In a preferred embodiment of the invention, the amino acid sequence cleaved by the protease, which is inserted into the linker, is cleaved by MMP (matrix metalloproteinases-1, -2, -3, -7, -8 or -9) (SEQ ID NOS: 1 to 9), an amino acid sequence which is degraded by a caspase (caspase-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 or -9) (SEQ ID NOS: 10 to 19) and an amino acid sequence (SEQ ID NOS: 20 to 24) which is degraded by cathepsin (Cathepsin B, E, K, L or S), more preferably selected from the group consisting of matrix metalloproteinases (SEQ ID NOS: 1 to 9), more preferably an amino acid sequence (SEQ ID Nos. 2 to 4) which is degraded by MMP2 and most preferably Gly Pro Leu Gly Val of SEQ ID NO: 3 Arg (GPLGVR). ≪ / RTI >

본 발명의 프로-카스파제(pro-Caspase)는 지모겐 형태의 재조합 단백질로서, 상기 '링커(linker)'의 분해(cleavage)는 대단위체와 소단위체 분자간의 상호작용을 통하여 활성을 갖는 카스파제 구조를 형성하도록 한다. The pro-caspase of the present invention is a zymogen-type recombinant protein, and the cleavage of the 'linker' described above is caused by the interaction between a large unit and a small unit molecule, Structure.

본 발명의 일 실시예에서, 프로테아제에 의해 활성화되는 지모겐(zymogen)인 프로-카스파제-3을 제작하기 위하여, 야생형 프로-카스파제-3의 대단위체(large subunit) 및 소단위체(small subunit)를 연결시키는 링커를, 프로테아제(MMP2)가 인식하고 절단하는 부위를 포함하는 펩티드 시퀀스로 치환시켰다.In one embodiment of the invention, in order to produce pro-caspase-3, which is a protease-activated zymogen, a large subunit and a small subunit of wild-type pro-caspase- ) Was replaced with a peptide sequence containing a site at which the protease (MMP2) recognizes and cleaves.

또한, 본 발명의 상기 재조합 프로-카스파제-3는 MMP2에 의해 활성화되며, MMP2로 인해 활성화된 활성형 카스파제-3가 검출가능한 시그널을 발생시키는 카스파제-3 기질과 반응하여 시그널을 생성 및 증폭시킨다.In addition, the recombinant pro-caspase-3 of the present invention is activated by MMP2, and the activated caspase-3 activated by MMP2 reacts with a caspase-3 substrate generating a detectable signal to generate and generate signals Amplified.

본 발명의 일 실시예에서 5 종류의 재조합 프로-카스파제-3을 구축하였고, 이들을 MMP2 센서로 명명하였다.In one embodiment of the present invention, five types of recombinant pro-caspase-3 were constructed and named as MMP2 sensor.

상기 제작된 재조합 프로-카스파제-3들은 다음과 같다:The prepared recombinant pro-caspase-3 is as follows:

(1) 프로-카스파제-3 컨스트럭트 Ｉ(MMP2 센서 Ｉ)으로서, 야생 프로-카스파제-3(컨스트럭트 0)의 GIETD↓S를 제거하고, MMP2에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열(MMP2-인식 절단 서열)인 GPL↓GVR을 포함하는 링커(GPLGVR)로 치환한 형태(서열번호 25);(1) Pro-caspase-3 construct I (MMP2 sensor I) was constructed by removing GIETD ↓ S from wild pro-caspase-3 (construct 0) and recognizing the amino acid sequence (GPLGVR) comprising GPL ↓ GVR (SEQ ID NO: 25), which is a (MMP2-recognized truncated sequence);

(2) 프로-카스파제-3 컨스트럭트 Ⅱ(MMP2 센서 Ⅱ)으로서, 야생 프로-카스파제-3(컨스트럭트 0)의 GIETD↓S 중 D 대신, MMP2에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열 GPL↓GVR(MMP2-인식 절단 서열)을 포함하는 링커(GIETGPLGVRS)로 치환한 형태(서열번호 26);(2) Pro-caspase-3 construct II (MMP2 sensor II), which is recognized and cleaved by MMP2 instead of D in GIETD ↓ S of wild pro-caspase-3 (construct 0) (GIETGPLGVRS) comprising GPL ↓ GVR (MMP2-recognized truncation sequence) (SEQ ID NO: 26);

(3) 프로-카스파제-3 컨스트럭트 Ⅲ(MMP2 센서 Ⅲ)로서, 야생 프로-카스파제-3(컨스트럭트 0)의 GIETD↓S 중 D 대신, MMP2에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열(MMP2-인식 절단 서열)인 GPL↓GVR 및 상기 MMP2-인식 절단 서열을 중심으로 GS를 포함하는 링커(GIETGSGPLGVRGS)로 치환한 형태(서열번호 27); (3) Pro-caspase-3 construct (III) (MMP2 sensor III), which is recognized and cleaved by MMP2 instead of D in GIETD ↓ S of wild pro-caspase-3 (MMP2-recognized truncation sequence) and a linker (GIETGSGPLGVRGS) containing GS (SEQ ID NO: 27) centered on the MMP2-recognized truncation sequence;

(4) 프로-카스파제-3 컨스트럭트 Ⅳ(MMP2 센서 Ⅳ)로서, 야생 프로-카스파제-3(컨스트럭트 0)의 GIETD↓S 중 D 대신, MMP2에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열(MMP2-인식 절단 서열)인 GPL↓GVR 및 상기 MMP2-인식 절단 서열을 중심으로 GGS을 포함하는 링커(GIETGGSGPLGVRGGS)로 치환된 형태(서열번호 28).(4) Pro-caspase-3 Construct IV (MMP2 sensor IV), which is recognized and cleaved by MMP2 instead of D in GIETD ↓ S of wild pro-caspase-3 (Construct 0) (MMP2-recognized truncation sequence) and a linker (GIETGGSGPLGVRGGS) containing GGS centered on the MMP2-recognized truncation sequence (SEQ ID NO: 28).

(5) 프로-카스파제-3 컨스트럭트 V(MMP2 센서 V)로서, 야생 프로-카스파제-3(컨스트럭트 0)의 GIETD↓S 중 D 대신, MMP2에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열(MMP2-인식 절단 서열)인 GPL↓GVR 및 상기 MMP2-인식 절단 서열을 중심으로 GGGS을 포함하는 링커(IETGGGSGPLGVRGGGS)로 치환된 형태(서열번호 29).(5) Pro-caspase-3 construct V (MMP2 sensor V), which is recognized and cleaved by MMP2 instead of D in GIETD ↓ S of wild pro-caspase-3 (construct 0) (MMP2-recognized truncation sequence) and a form (SEQ ID NO: 29) substituted with a linker (IETGGSGPLGVRGGGS) containing GGGS centered on the MMP2-recognized truncation sequence.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 재조합 프로-카스파제는 추가적으로 정제용 또는 검출용 태그(tag)를 포함할 수 있다.In a preferred embodiment of the invention, the recombinant pro-caspase may further comprise a tag for purification or detection.

상기 '정제용 또는 검출용 태그(tag)'는 재조합 단백질에 태깅(tagging)을 하여, 친화성 정제(affinity purification)를 통해 정제를 용이하게 해주는 단백질 정제를 위해 결합된 물질을 모두 포함한다. 상기 태그는 정제 외에 프로테아제에 의한 반응 시그널을 분석하는 용도로도 유용하게 쓰일 수 있다. 상기 정제 및 검출용 태그는 His-태그, Flag-태그, HA-태그, GST-태그 및 GFP-태그로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.The " purification or detection tag " includes all substances bound for protein purification that tag the recombinant protein and facilitate purification through affinity purification. The tag may be useful for analyzing the reaction signal by protease in addition to purification. The purification and detection tag includes, but is not limited to, a tag selected from the group consisting of a His tag, a Flag tag, an HA tag, a GST tag, and a GFP tag.

본 발명의 재조합 프로-카스파제는 카스파제 3의 대단위체와 소단위체를 이어주는, MMP2에 의해 분해되는 아미노산 서열이 삽입되어 있는 링커 및 정제 및 검출용 태그가 His-태그인 것을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.The recombinant pro-caspase of the present invention preferably comprises a linker to which a large unit of caspase 3 and a subunit are linked, an amino acid sequence to be degraded by MMP2 is inserted, and a tag for purification and detection is His-tag , But is not limited thereto.

본 발명에서 사용되는 용어 '재조합 단백질'은 두 개 혹은 그 이상의 DNA를 유전자 재조합 기술로 이어 붙여 만든 재조합 DNA에서 만들어지는 단백질이다. 상기 재조합 DNA 기술을 통해 과거 자연 상태로부터 미량으로밖에 얻을 수 없던 의료용 단백질 또는 산업용 효소 등을 박테리아(예컨대 E. coli)와 동물세포 등을 이용하여 합성할 수 있다. 박테리아(예컨대 E. coli)를 비롯한 효모(Yeast)와 동물 세포(Mammalian cell)의 발효 및 배양, 의약품 원료 수준의 정제 과정을 통하여 합성 가능하다.The term " recombinant protein " used in the present invention is a protein produced from recombinant DNA prepared by joining two or more DNAs with recombinant DNA technology. The recombinant DNA technology can be used to synthesize a medical protein or an industrial enzyme that can only be obtained in a trace amount from the natural state by using bacteria (for example, E. coli) and animal cells. It can be synthesized by fermentation and culture of yeast and mammalian cells including bacteria (for example, E. coli), and purification processes at the drug substance level.

본 발명의 프로-카스파제-3 컨스트럭트를 제조하기 위해 사용된 용어 "벡터(vector)"는 외부의 유전 물질을 다른 세포로 옮기는데 사용되는 전달 수단인 DNA 분자이다. 대표적으로 플라스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 코스미드 벡터, 인공 염색체를 이용한 벡터(예컨대, YAC, BAC) 등이 존재한다. 벡터를 이용하여 원하는 유전 물질을 대량 발현할 수 있으므로 벡터로서의 기능을 하기 위해 필요한 공통 요소가 존재하는데, 복제 원점(replication origin), 여러 제한효소 자리(multicloning site), 선택표지(selective marker)가 반드시 존재하여야 한다. 벡터 그 자체는 DNA 염기 서열로 이식할 유전자(transgene)와 벡터 백본(backbone)을 포함한다.The term "vector" used to produce the pro-caspase-3 construct of the present invention is a DNA molecule that is a delivery means used to transfer external genetic material to other cells. Typically, plasmid vectors, bacteriophage vectors, cosmid vectors, vectors using artificial chromosomes (e.g., YAC, BAC) and the like are present. Since the desired genetic material can be expressed in large quantities using a vector, there is a common element necessary for functioning as a vector. The replication origin, a plurality of multicloning sites, and a selective marker must be present It must exist. The vector itself contains the transgene and vector backbone to be transplanted into the DNA sequence.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 진핵세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 진핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed by using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts. It is preferable that the polynucleotide of the present invention is derived from eukaryotic cells and that eukaryotic cells are used as a host in consideration of the convenience of culture. The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lac UV5 프로모터, lpp 프로모터, pL 프로모터, pR 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 [Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)], 그리고 파아지의 좌향 프로모터[pL 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980)]가 조절 부위로서 이용될 수 있다.For example, when the vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (such as a tac promoter, lac promoter, lac UV5 promoter, lpp promoter, pL promoter, pR Promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, and T7 promoter), a ribosome binding site for initiation of detoxification, and a transcription / When E. coli is used as a host cell, the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984)) and the phage left promoter [pL Promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399-445 (1980)] can be used as a regulatory region.

본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR 등), 파지(예: gt4B, -Charon, z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 벡터는 발현 벡터이고, 바람직하게는 pET-28a 플라스미드이다.Vectors that can be used in the present invention include plasmids such as pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR etc., phage such as gt4B, -Charon, z1 and M13) or a virus (e.g., SV40 or the like). Preferably, the vector of the present invention is an expression vector, preferably a pET-28a plasmid.

상기 발현벡터를 숙주에 형질 감염 또는 형질도입할 수 있으며, 숙주세포를 이용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.The expression vector can be transfected or transfected into a host, and the recombinant protein can be expressed using the host cell. When a eukaryotic cell is used as a host, a promoter derived from the genome of a mammalian cell (e.g., a metallothionein promoter) or a mammalian virus (e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, and tk promoter of HSV) can be used, and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 프로테아제(protease) 활성 측정용 센서를 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a sensor for measuring protease activity, comprising:

(a) 상술한 재조합 프로-카스파제(pro-Caspase); 및(a) the above-mentioned recombinant pro-Caspase; And

(b) 프로테아제에 의해 활성화된 프로-카스파제의 활성형에 대한 검출제.(b) a detection agent for the active form of the protease-activated pro-caspase.

상기 프로테아제(protease) 활성 측정용 센서는 상술한 재조합 프로-카스파제에 프로테아제를 처리했을 때, 상기 프로테아제에 의해 활성화된 프로-카스파제의 활성형을 검출할 수 있는 검출제를 이용하여, 프로테아제(protease) 활성을 측정 및/또는 검출하는 센서를 의미한다.In the sensor for measuring the protease activity, when the protease is treated with the recombinant pro-caspase, a protease capable of detecting the active form of the pro-caspase activated by the protease is used. quot; protease ") activity.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 검출제는 상기 활성형과 결합하며 프로-카스파제의 활성형 기질로서 검출 가능한 시그널을 발생시키며, 상기 검출제는 상기 활성형을 검출할 수 있는 한, 어떠한 검출제도 이용할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the detecting agent binds to the active form and generates a detectable signal as an active substrate of the pro-caspase, and the detecting agent can be any Detection system can be used.

상기 검출제는 형광성, 발광성 또는 발색성 검출제이고, 바람직하게는 형광성이며, 당업계에 공지된 방법에 따라 임의의 형광성 검출제를 이용할 수 있다.The detecting agent is a fluorescent, luminescent or coloring detecting agent, preferably fluorescent, and any fluorescent detecting agent can be used according to methods known in the art.

본 발명의 센서는 상술한 재조합 프로-카스파제를 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the sensors of the present invention use the above-described recombinant pro-caspases, the redundant description is omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 프로테아제(protease) 활성 측정용 키트를 제공한다:According to still another aspect of the present invention, the present invention provides a kit for measuring protease activity, comprising:

(a) 상술한 재조합 프로-카스파제(pro-Caspase); 및(a) the above-mentioned recombinant pro-Caspase; And

(b) 프로테아제에 의해 활성화된 프로-카스파제의 활성형에 대한 검출제.(b) a detection agent for the active form of the protease-activated pro-caspase.

본 발명의 '프로테아제 활성 측정용 키트'는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 '프로테아제 활성 측정용 키트'는 재조합 단백질을 발현하는 재조합 세포에서 발현된 재조합 단백질 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정 및/또는 검출할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다. The 'kit for measuring protease activity' of the present invention can be produced using a method commonly used in the art. The 'kit for measuring protease activity' includes not only recombinant proteins expressed in recombinant cells expressing recombinant proteins, but also tools and reagents commonly used in the art for immunological analysis. Such tools / reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling agents capable of producing a detectable signal, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like. When the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring and / or detecting the enzyme activity and a reaction terminator. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers, e. G., Physiologically acceptable buffers such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose and combinations thereof.

본 발명의 키트는 상술한 재조합 프로-카스파제를 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the kits of the present invention utilize the recombinant pro-caspases described above, redundant descriptions are omitted so as to avoid undue complexity of the present disclosure.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 프로테아제의 활성 측정 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for measuring the activity of a protease comprising the steps of:

(a) 상술한 재조합 프로-카스파제(pro-Caspase)에 활성을 측정하고자 하는 프로테아제를 처리하는 단계; 및 (a) treating the recombinant pro-caspase described above with a protease to be assayed for activity; And

(b) 상기 프로테아제에 의해 분해되어 활성화된 상기 프로-카스파제의 활성형을 검출하는 단계.(b) detecting the active form of the pro-caspase which is degraded and activated by the protease.

본 발명의 프로테아제 활성 측정방법의 두 가지 주요 구성요소는, (1) 측정하고자 하는 프로테아제에 의해 활성화될 수 있는 재조합 프로-카스파제와 (2) 상기 재조합 프로-카스파제 내 링커의 분해(cleavage)로 인해 활성화된 생성물을 검출하는 검출성 기질이다.Two major components of the protease activity measuring method of the present invention are (1) a recombinant pro-caspase which can be activated by a protease to be measured and (2) a cleavage of a linker in the recombinant pro-caspase, ≪ / RTI > is a detectable substrate that detects the activated product.

상기 (b) 단계의 '재조합 프로-카스파제의 활성형을 검출하는 단계'는 당업계에서 일반적으로 사용할 수 있는 측정 또는 검출 방법을 모두 포함한다.The step of detecting the active form of the recombinant pro-caspase in step (b) includes all the methods of measurement or detection commonly used in the art.

본 발명자들은 지모겐 형태의 전구체를 유전공학적으로 제작 및 변형시키고, 이를 검출할 수 있는 기질에 의해 측정 또는 검출되는 수준을 확인하는 방법을 이용하여 분석, 정량화하는 새로운 프로테아제 분석 방법을 개발하였다.The present inventors have developed a novel protease assay method that genetically engineers and transforms a zymogen-type precursor, and analyzes and quantifies the level of the precursor detected or detected by a substrate capable of detecting it.

본 발명의 방법은 상술한 재조합 프로-카스파제를 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the method of the present invention utilizes the recombinant pro-caspases described above, redundant descriptions are omitted to avoid excessive complexity of the present disclosure.

본 발명에 따른 재조합 프로-카스파제를 이용한 프로테아제 활성의 측정 방법은 기존의 프로테아제 활성 측정법에서 나타나는, 높은 백그라운드 잡음 시그널, 생물학적 샘플들의 상호간섭(방해), 정제되지 않은 단백질 사용, 실험장치 사용의 어려움과 같은 다양한 문제점들을 해결하여, 견고하고 민감하며 사용 편의성이 높아 프로테아제 활성 측정의 표준 프로토콜(standard protocol)로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 나아가 질병 진단 방법으로 개발될 수 있다.The method for measuring protease activity using the recombinant pro-caspase according to the present invention is characterized by high background noise signal, mutual interference of biological samples, use of undefined protein, difficulty in using an experimental apparatus, And can be used as a standard protocol for the measurement of protease activity as well as being developed as a disease diagnosis method.

도 1a는 본 프로테아제 활성 분석 방법을 도식적으로 나타낸 도이다. MMP-2에 의해 프로-카스파제-3가 절단되면 활성을 갖는 카스파제-3로 활성화되고 이 활성에 의한 카스파제-3 발색 기질과의 반응으로 검출되는 시그널 측정을 통해서 최종적으로 MMP-2를 검출한다.
도 1b는 이량체 카스파제-3(PDB:1I3O)의 구조를 나타내며, 대단위체(large subunit) 및 소단위체(small subunit) 사이의 절단 부위를 적색(D175 및 S176)으로 나타내었다.
도 2a는 야생형 및 제작된 프로-카스파제-3의 컨스트럭트들을 보여준다.
야생형 카스파제-3(wt-caspase-3)의 경우, 화살표로 표시된 부분이 다른 프로테아제에 의해서 절단되고, 대단위체(large subunit)와 소단위체(small subunit)는 상호작용을 통하여 활성을 갖는 카스파제-3 구조를 형성하게 된다. 또한, 대단위체와 소단위체 사이에 세린계 프로테아제에 의해서 잘리는 IETD/SGVD라는 서열이 존재한다.
본 발명에서는 상기 서열 위치를 클로닝을 통해 MMP-2에 의해서 잘리는 염기서열을 삽입한 총 5 종의 구조를 디자인하였다(컨스트럭트 I 내지 V). 각각의 구조에 따라 서열을 삽입하는 위치 및 방법, 링커의 유무 및 길이 등의 차이점을 표시하였다. 컨스트럭트 I의 경우 기존의 서열에서 IETD/S 부분을 제거하고 MMP-2에 의해 잘리는 서열(PLGVR)이 삽입되었고, 컨스트럭트 II의 경우 D만 제거하고 GPLGVR 서열이 삽입되었다. 또한, 컨스트럭트 III 내지 V는 각각 컨스트럭트 II의 방법에서 앞뒤에 추가적인 서열을 링커로 삽입하였다.
도 2b는 본 재조합 프로-카스파제-3 발현 플라스미드를 나타낸 도이다. 프로-카스파제-3는 pET21b 벡터에 NdeI과 XhoI 효소를 이용하여 삽입되었다. 또한, 프로-카스파제-3의 N-말단에 T7 프로모터가 있어 이를 통해 발현되었고 C-말단에는 6x His tag이 있어 이를 통해 정제하였다. 또한, 상기 플라스미드는 암피실린 항생제에 대한 내성을 가지고 있다.
도 3은 본 재조합 프로-카스파제-3(컨스트럭트 I 내지 V)의 MMP-2 반응에 의한 절단 반응 혼합물을 SDS-PAGE를 이용하여 분석한 결과를 보여준다.
도 4는 컨스트럭트 Ⅳ를 이용하여 MMP-2 활성 분석 결과를 보여준다. 도 4a는 절차를 보여준다: (1) MMP-2 및 컨스트럭트 Ⅳ의 인큐베이션 단계; (2) Ac-DEVD-pNA를 함유하는 카스파제-3 어세이 완충액으로 MMP-2 반응의 희석 단계; (3) 405 nm에서의 흡광도 측정 단계. 도 4b는 1.25 nM MMP-2와 인큐베이션시킨 컨스트럭트 Ⅳ의 시간-분해 흡광도 측정 결과를 보여준다. 도 4c 및 4d는 각각 4 시간 및 16 시간 동안 MMP-2와 컨스트럭트 Ⅳ를 인큐베이션 시킨 후 MMP-2 농도의 기능으로서 Ac-DEVD-pNA의 가수분해 속도를 측정한 결과를 보여준다. 삽입된 플롯은 저농도의 MMP2에 대한 선형 관계를 보여준다.FIG. 1A is a diagram schematically showing the present protease activity assay method. FIG. When pro-caspase-3 is cleaved by MMP-2, it is activated by caspase-3, which is active. Finally, by measuring signals detected by reaction with caspase-3 chromogenic substrate by this activity, MMP- .
FIG. 1B shows the structure of dimeric caspase-3 (PDB: 1I3O), showing the cleavage sites between large and small subunits as red (D175 and S176).
Figure 2a shows the constructs of wild-type and constructed pro-caspase-3.
In the case of the wild-type caspase-3, the portion indicated by an arrow is cleaved by another protease, and a large subunit and a small subunit interact with each other to form a caspase -3 structure. There is also a sequence called IETD / SGVD which is cleaved by a serine protease between the large and small units.
In the present invention, five types of structures were designed (Constructs I to V) in which the nucleotide sequence in which the sequence position was cleaved by MMP-2 through cloning was inserted. The position and method of inserting the sequence according to each structure, the presence or absence of the linker, and the length are shown. In the case of construct I, the IETD / S part was removed from the existing sequence and the sequence truncated by MMP-2 (PLGVR) was inserted. In the case of construct II, only D was deleted and the GPLGVR sequence was inserted. In addition, Constructs III to V each inserted an additional sequence into the linker both before and after in the method of Construct II.
Fig. 2b is a view showing the present recombinant pro-caspase-3 expression plasmid. Pro-caspase-3 was inserted into the pET21b vector using NdeI and XhoI enzymes. In addition, the T7 promoter at the N-terminus of pro-caspase-3 was expressed through it and the 6-His tag was found at the C-terminus thereof. In addition, the plasmid is resistant to ampicillin antibiotics.
FIG. 3 shows the result of analysis of the cleavage reaction mixture of the present recombinant pro-caspase-3 (Constructs I to V) by MMP-2 reaction using SDS-PAGE.
Figure 4 shows the results of MMP-2 activity assay using Construct IV. Figure 4a shows the procedure: (1) Incubation step of MMP-2 and Construct IV; (2) diluting the MMP-2 reaction with caspase-3 assay buffer containing Ac-DEVD-pNA; (3) Absorbance measurement step at 405 nm. Figure 4b shows the results of time-resolved absorbance measurements of Construct IV incubated with 1.25 nM MMP-2. Figures 4c and 4d show the results of measuring the rate of hydrolysis of Ac-DEVD-pNA as a function of MMP-2 concentration after incubating MMP-2 and Construct IV for 4 hours and 16 hours, respectively. The inserted plots show a linear relationship to low concentrations of MMP2.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.

실시예Example 1. 본 발명의 프로- 1. Pro- 카스파제Caspase -3 제작-3 production

본 발명에서, 카스파제-3 불활성 전효소(proenzyme)인 프로-카스파제-3는 MMP2에 의해 활성화되는 자모겐으로서 제작하기 위하여 선택되었다. 카스파제-3는 시스테인-아스파르트 산 프로테아제 패밀리 중 하나이고 세포내 사멸 경로에 있어 중심 역할을 한다. 이러한 프로테아제는 카스파제-8 및 카스파제와 같은 다른 프로테아제에 의한 두 개의 Asp 잔기(Asp28 및 Asp175)에서의 절단을 통해 활성화될 수 있는 전효소로서 세포질에 존재한다. 이러한 단백질 분해는 활성형 효소를 형성하는 이량체로 구성된 대단위체(17 kDa) 및 소단위체의 두 개의 서브 유닛을 생산한다. 이러한 두 개의 동일한 이종이량체는 성숙한 카스파제-3(도 1b)의 테트라머를 형성한다. 프로-카스파제-3의 활성화 메카니즘외에, 상기 효소를 본 연구를 위해 선택한 것은 몇 가지 이유가 있다. 본 발명자들은 흡광도를 기반으로 하는 프로테아제 활성 분석 방법을 개발하기 위하여, 절단 위치의 카르복실 측 펩티드 서열에 따른 비특이적 기질 때문에 카스파제-3(Ac-DEVD-pNA)에 대한 발색 기질을 개발하였다. 이에 따라 본 재조합 카스파제-3는 적절한 수율(~mg/L 대장균 배양)로 발현될 수 있을 뿐만 아니라, 그의 C-말단 His6-tag를 통해 단일 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다.In the present invention, the caspase-3 inactive proenzyme, pro-caspase-3, was selected for production as a mammagene activated by MMP2. Caspase-3 is one of the cysteine-aspartic acid protease family and plays a central role in the intracellular killing pathway. This protease is present in the cytoplasm as a proenzyme that can be activated through cleavage at two Asp residues (Asp28 and Asp175) by another protease such as caspase-8 and caspase. Such proteolysis produces large units (17 kDa) consisting of dimers that form active enzymes and two subunits of subunits. These two identical heterodimers form the tetramer of mature caspase-3 (Figure 1b). In addition to the activation mechanism of pro-caspase-3, there are several reasons why the enzyme has been selected for this study. We developed a chromogenic substrate for caspase-3 (Ac-DEVD-pNA) due to the nonspecific substrate according to the carboxyl-side peptide sequence at the cleavage site in order to develop a protease activity assay based on absorbance. Thus, this recombinant caspase-3 can be expressed in a suitable yield (~ mg / L E. coli culture) as well as purified by a single affinity chromatography through its C-terminal His6-tag.

또한, 본 발명의 재조합 프로-카스파제-3는 프로-카스파제-3 이량체(dimer)의 형태에 영향을 미치지 않고 발현에 필수적이지 않은 것으로 알려져 있는 프로-도메인을 제거하였고, 특정 MMP2 절단 서열을 단백질 절단 서열(P4-I172ETDS176-P1')을 포함하는 부위에 도입하였다: 5 개의 잔기 서열을 PLGVR로 대체(컨스트럭트 I); D175 대신 MMP2 절단 서열(GPLGVR) 삽입(컨스트럭트 II); 및 컨스트럭트 II의 구조에 추가 서열 삽입(컨스트럭트 III 내지 V).In addition, the recombinant pro-caspase-3 of the present invention eliminated the pro-domain that was not essential for expression without affecting the morphology of the pro-caspase-3 dimer and the specific MMP2 cleavage sequence Was introduced at the site containing the protein cleavage sequence (P4-I172ETDS176-P1 '): replacing the 5 residue sequence with PLGVR (Constit I); Insertion of MMP2 cleavage sequence (GPLGVR) instead of D175 (Construct II); And the insertion of additional sequences into the structure of Construct II (Constructs III to V).

1-1. 프로-1-1. Pro- 카스파제Caspase -3 발현 플라스미드 구축(-3 expression plasmid construction ( plasmidplasmid construction) construction)

본 발명자들은 프로테아제에 의해 활성화되는 지모겐(zymogen)인 프로-카스파제-3을 제작하기 위하여, 야생형 프로-카스파제-3의 대단위체(large subunit) 및 소단위체(small subunit)를 연결시키는 링커에 프로테아제(MMP2)가 인식하고 절단하는 부위를 포함하는 펩티드 시퀀스로 치환시켰다.The present inventors have found that in order to produce pro-caspase-3, which is a protease-activated zymogen, a large subunit of wild-type pro-caspase-3 and a linker Was replaced with a peptide sequence containing a site where the protease (MMP2) recognizes and cleaves.

또한, 상기 프로-카스파제-3는 프로테아제에 의해 활성화되며, 프로테아제로 인해 활성화된 활성형 카스파제-3가 발색성의 카스파제-3 기질과 반응하여 시그널을 생성 및 증폭시킬 수 있다.In addition, the pro-caspase-3 is activated by protease, and activated protease-activated active caspase-3 can generate and amplify a signal by reacting with a chromogenic caspase-3 substrate.

이러한 본 발명의 접근법은 도 1a에 도식적으로 나타내었고, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 링커의 종류에 따라 5 종의 프로-카스파제-3를 디자인하였다(컨스트럭트(Construct) 1 내지 V). 본 실시예에 이용된 해당 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.This approach of the present invention is diagrammatically shown in FIG. 1A, and as shown in FIG. 2, the present inventors designed 5 types of pro-caspase-3 according to the type of linker (Construct 1 to 3) V). The corresponding primer sequences used in this example are shown in Table 1.

간략하게, 프로도메인(prodomain)이 없는 카스파제-3를 코딩하는 유전자인 컨스트럭트 0(Construct 0)은 프라이머 1 및 2를 사용하여 pHC33226에서 증폭하고, NdeI 및 XhoI 부위를 통해 pET-21a로 클로닝하였다. 컨스트럭트 1을 위한 유전자는 어셈블리 PCR을 통해 획득하였고, 주형으로 pHC332를 사용하여 대단위체(large subunit) 단편은 프라이머 1 및 4, 소단위체(small subunit) 단편은 프라이머 2 및 4로 증폭하여, NdeI 및 XhoI 부위를 통해 pET-21a로 클로닝하였다. 컨스트럭트 II, III, IV 및 V를 발현하는 플라스미드는 컨스트럭트 1과 동일한 방법으로 구축하였다. 즉, 어셈블리 PCR을 통해 필요한 유전자를 획득하였고 주형으로 pHC332를 사용하여 대단위체(large subunit) 단편과 소단위체(small subunit) 단편을 각각의 프라이머로 증폭하여, NdeI 및 XhoI 부위를 통해 pET-21a로 클로닝하였다(컨스트럭트 II의 경우 프라이머 1 및 6, 및 프라이머 2 및 5; 컨스트럭트 III의 경우 프라이머 1 및 8, 및 프라이머 2 및 7; 컨스트럭트 IV의 경우 프라이머 1 및 10, 및 프라이머 2 및 9; 컨스트럭트 V의 경우 프라이머 1 및 12, 및 프라이머 2 및 11).Briefly, Construct 0, a gene encoding caspase-3 with no prodomain, was amplified at pHC33226 using primers 1 and 2 and ligated into pET-21a through the NdeI and XhoI sites Respectively. Genes for Construct 1 were obtained by assembly PCR and primers 1 and 4 and small subunit fragments were amplified with primers 2 and 4 using pHC332 as template, And cloned into pET-21a through the NdeI and XhoI sites. Constructs II, III, IV and V expressing plasmids were constructed in the same manner as construct 1. In other words, the required gene was obtained by assembly PCR, and large and small subunit fragments were amplified with each primer using pHC332 as a template and ligated to pET-21a through NdeI and XhoI sites Primers 1 and 6 and Primers 2 and 5 in the case of Construct II, Primers 1 and 8 and Primers 2 and 7 in the case of Construct III, Primers 1 and 10 in the case of Construct II, 2 and 9; primers 1 and 12 for Construct V, and primers 2 and 11).

또한, 도 2에서, 파란색으로 나타낸 서열 중 아래로 향하는 화살표가 있는 P4-P1'는 카스파제-3 도메인 구조 내에서 절단되는 결합의 위치를 나타내고, 빨간색으로 나타낸 서열 중 아래로 향하는 화살표가 있는 P3-P3'는 카스파제-3 도메인 구조 내에서 절단되는 결합의 위치를 나타낸다.2, P4-P1 'having a downward arrow in the sequence shown in blue indicates the position of a bond to be cleaved in the caspase-3 domain structure, and P3 -P3 ' represents the position of the bond cleaved within the caspase-3 domain structure.

상세하게는 다음과 같다: The details are as follows:

본 발명자들은 MMP2에 의해 활성화되는 프로-카스파제-3의 DNA를 NdeI 및 XhoI 제한효소 위치를 이용하여 pET-21a 플라스미드 내로 클로닝하였다(도 1c).The present inventors cloned the pro-caspase-3 DNA activated by MMP2 into pET-21a plasmid using NdeI and XhoI restriction sites (Fig. 1C).

먼저, 유전자 전체 염기 서열이 밝혀진 야생형(Wt.) 프로-카스파제-3(860bp)의 시퀀스를 포함하고 있는 pHC332 플라스미드(Pop et al. (2001) Biochemistry, 40, 14224. http://biochem.ncsu.edu/faculty/clark/CP3vectors.html)를 주형으로 사용하여 MMP-2에 의해서 활성화되는 프로-카스파제-3 DNA를 어셈블리 PCR을 통해서 합성하였다. 어셈블리 PCR은 3 단계(Fragmentation, Annealing, Amplification)를 거치고 그 방법은 다음과 같다. First, a pHC332 plasmid containing a sequence of wild-type (Wt.) Pro-caspase-3 (860 bp) in which the entire gene base sequence is revealed (Pop et al. (2001) Biochemistry, 40, 14224. http: //biochem. pro-caspase-3 DNA, which is activated by MMP-2, was synthesized by assembly PCR using ncsu.edu/faculty/clark/CP3vectors.html as a template. Assembly PCR is performed in three steps (Fragmentation, Annealing, Amplification) and the method is as follows.

단편화(Fragmentation)에서 PCR의 반응 조성은 DDW, 10x pfu 버퍼, 0.2mM dNTP, 20 pmol 프라이머 F/R, 주형, 5 units Pfu 폴리머라제(polymerase)를 넣어서 반응 부피를 총 50 ㎕로 만들었다. 하기 표 1의 프라이머들을 이용하여 단편 산물(fragment product)을 얻었다. 이 과정은 95℃에서 10 분간 반응 후, 95℃ 30분, 56℃ 1분, 72℃ 1분을 한 사이클로 하여 35 사이클을 반응시키고 반응 종료 후 72℃에서 10 분간 처리하였다.In the fragmentation, the reaction composition of the PCR was made up to a total reaction volume of 50 μl by adding DDW, 10 × pfu buffer, 0.2 mM dNTP, 20 pmol primer F / R, template and 5 units Pfu polymerase. A fragment product was obtained using the primers shown in Table 1 below. The reaction was carried out at 95 ° C for 10 minutes, followed by 35 cycles of 95 ° C for 30 minutes, 56 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute, followed by treatment at 72 ° C for 10 minutes.

어닐링(Annealing)은 단편 산물을 어닐링하여 MMP-2를 인지하는 서열이 삽입되어 있는 하나의 프로-카스파제-3 유전자를 만드는 과정이므로 따로 주형이 필요하지 않고 대신 단편 간의 몰 비를 1:1로 넣어주었다. 나머지 dNTP, 10x pfu 버퍼, pfu, DDW는 단편화에서와 동일한 조건으로 넣어주었고 상기와 같은 온도 조건에서 7 사이클을 반응시켰다.Annealing is the process of annealing a fragment product to produce a pro-caspase-3 gene with a sequence that recognizes MMP-2. Therefore, a template is not necessary and instead the molar ratio between fragments is 1: 1 I put it. The remaining dNTPs, 10x pfu buffer, pfu, and DDW were placed under the same conditions as in the fragmentation, and 7 cycles were performed at the temperature conditions as described above.

증폭화(Amplification)는 어닐링하여 얻은 유전자를 주형으로 하여 하기 표 1의 프라이머들을 사용해서 많은 양의 유전자 산물을 얻는 과정이므로, 단편화에서와 동일한 온도 조건 및 사이클 수로 반응시킨 후 예상한 크기의 PCR 산물을 얻었다.Amplification is a process of obtaining a large amount of gene products using the primers shown in Table 1 below using the gene obtained by annealing as a template. Therefore, after PCR was performed at the same temperature condition and number of cycles as in the fragmentation, ≪ / RTI >

PCR 반응을 통해 얻은 프로-카스파제-3 지모겐 유전자와 pET21b 벡터를 Nde I과 Xho I으로 양쪽을 접착 말단(sticky end)로 만들었다. 두 제한 효소(Restriction enzyme)의 반응 버퍼 조성이 NEBuffer 2.1와 동일하므로 같이 넣어 절단하였다. 제한효소 처리는 DDW, 10x NEBuffer 2.1, DNA, 제한효소로 총 부피를 50 ㎕로 하여 37℃, 4시간 동안 처리하였다.The pro-caspase-3 zymogene gene and the pET21b vector obtained from the PCR reaction were made sticky ends with Nde I and Xho I, respectively. The reaction buffer composition of the two restriction enzymes was the same as that of NEBuffer 2.1. The restriction enzymes were treated with DDW, 10x NEBuffer 2.1, DNA and restriction enzymes at a total volume of 50 μl for 4 hours at 37 ° C.

제한효소를 처리하여 양끝이 접착 말단으로 절단된 pET21b 벡터와 인서트(insert) DNA를 T4 DNA 리가제(NEB, England)를 이용하여, 몰 비 1:3으로 혼합하고 총 부피 10 ㎕로 하여 상온에서 2 시간 반응시켰다.The pET21b vector and insert DNA, which had been cleaved at both ends with a restriction enzyme, were mixed at a molar ratio of 1: 3 using T4 DNA ligase (NEB, England), and the total volume was adjusted to 10 μl. And reacted for 2 hours.

라이게이션(Ligation)된 DNA 혼합용액을 BL21(DE3) 컴페턴트 셀 50 ㎕에 넣은 후 부드럽게 섞어주고 전기천공 큐벳(Electroporation cuvette)에 옮기고 전기천공기(Bio-Rad, USA)에 놓고 펄스(pulse)를 주었다. 그리고 2xYT 배지 1 ㎖를 넣고 1.5 ㎖ 멸균-마이크로원심분리 튜브에 옮겨 37℃에서 180rpm으로 60분 진탕 배양한 후 암피실린이 포함된 LB 아가 배지에 스프레딩하여 37℃에서 12~14시간 배양한 후 형질 전환된 균주를 얻었다.The ligation mixture was added to 50 μl of the BL21 (DE3) complex cell, gently mixed, transferred to an electroporation cuvette, placed in an electric perforator (Bio-Rad, USA) . Then, 1 ml of 2xYT medium was added and transferred to a 1.5 ml sterilization-microcentrifuge tube. The mixture was shaken at 37 ° C and 180 rpm for 60 minutes, spread on LB agar medium containing ampicillin, cultured at 37 ° C for 12 to 14 hours, The transformed strain was obtained.

올리고뉴클레오티드Oligonucleotide 서열 (5' → 3')The sequence (5 '- > 3') 프라이머 1(서열번호 30)Primer 1 (SEQ ID NO: 30) AAGGTTCATATGTCTGGAATATCCCTGGACAACAGAAGGTTCATATGTCTGGAATATCCCTGGACAACAG 프라이머 2(서열번호 31)Primer 2 (SEQ ID NO: 31) GTGGTGCTCGAGGTGATAAAAATAGAGGTGGTGCTCGAGGTGATAAAAATAGAG 프라이머 3(서열번호 32)Primer 3 (SEQ ID NO: 32) GTGGCCCGCTGGGTGTGCGTGGTGTTGATGATGACATGGCGTGTCGTGGCCCGCTGGGTGTGCGTGGTGTTGATGATGACATGGCGTGTC 프라이머 4(서열번호 33)Primer 4 (SEQ ID NO: 33) CACCACGCACACCCAGCGGGCCACAGTCCAGTTCTGTACCACCACCACGCACACCCAGCGGGCCACAGTCCAGTTCTGTACCAC 프라이머 5(서열번호 34)Primer 5 (SEQ ID NO: 34) ACAGGCCCTCTGGGTGTGCGTAGTGGTGTTGATGATGACATGGCGTGACAGGCCCTCTGGGTGTGCGTAGTGGTGTTGATGATGACATGGCGTG 프라이머 6(서열번호 35)Primer 6 (SEQ ID NO: 35) ACTACGCACACCCAGAGGGCCTGTCTCAATGCCACAGTCCAGTTCACTACGCACACCCAGAGGGCCTGTCTCAATGCCACAGTCCAGTTC 프라이머 7(서열번호 36)Primer 7 (SEQ ID NO: 36) ACAGGTAGCGGCCCTCTGGGTGTGCGTGGCAGTGGTGTTGATGATGACACAGGTAGCGGCCCTCTGGGTGTGCGTGGCAGTGGTGTTGATGATGAC 프라이머 8(서열번호 37)Primer 8 (SEQ ID NO: 37) ACTGCCACGCACACCCAGAGGGCCGCTACCTGTCTCAATGCCACAGTCACTGCCACGCACACCCAGAGGGCCGCTACCTGTCTCAATGCCACAGTC 프라이머 9(서열번호 38)Primer 9 (SEQ ID NO: 38) ACAGGCGGTAGCGGCCCTCTGGGTGTGCGTGGCGGTAGTGGTGTTGATGACAGGCGGTAGCGGCCCTCTGGGTGTGCGTGGCGGTAGTGGTGTTGATG 프라이머 10(서열번호 39)Primer 10 (SEQ ID NO: 39) ACTACCGCCACGCACACCCAGAGGGCCGCTACCGCCTGTCTCAATGCCACAGTCACTACCGCCACGCACACCCAGAGGGCCGCTACCGCCTGTCTCAATGCCACAGTC 프라이머 11(서열번호 40)Primer 11 (SEQ ID NO: 40) ACAGGTGGCGGTAGCGGCCCTCTGGGTGTGCGTGGTGGCGGTAGTGGTGTTGATGACAGGTGGCGGTAGCGGCCCTCTGGGTGTGCGTGGTGGCGGTAGTGGTGTTGATG 프라이머 12(서열번호 41)Primer 12 (SEQ ID NO: 41) ACTACCGCCACCACGCACACCCAGAGGGCCGCTACCGCCACCTGTCTCAATGCCACAGTCACTACCGCCACCACGCACACCCAGAGGGCCGCTACCGCCACCTGTCTCAATGCCACAGTC

본 발명자는 상술한 바와 같이 상기 링커(linker)에 MMP2 프로테아제 분해 서열(GPLGVR)의 삽입 및/또는 추가적인 아미노산 서열을 추가한 5 종의 재조합 프로-카스파제-3를 구축하였다. 이들을 MMP2 센서로 명명하였다.As described above, the present inventors constructed five recombinant pro-caspase-3 having the linker inserted with the MMP2 protease digestion sequence (GPLGVR) and / or an additional amino acid sequence. These were named as MMP2 sensors.

상기 제작된 재조합 프로-카스파제-3은 다음과 같다:The prepared recombinant pro-caspase-3 is as follows:

(1) 프로-카스파제-3 컨스트럭트 Ｉ(MMP2 센서 Ｉ)으로서, 야생 프로-카스파제-3(컨스트럭트 0)의 GIETD↓S를 제거하고, MMP2에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열(MMP2-인식 절단 서열)인 GPL↓GVR을 포함하는 링커(GPLGVR)로 치환한 형태(서열번호 25);(1) Pro-caspase-3 construct I (MMP2 sensor I) was constructed by removing GIETD ↓ S from wild pro-caspase-3 (construct 0) and recognizing the amino acid sequence (GPLGVR) comprising GPL ↓ GVR (SEQ ID NO: 25), which is a (MMP2-recognized truncated sequence);

(2) 프로-카스파제-3 컨스트럭트 Ⅱ(MMP2 센서 Ⅱ)으로서, 야생 프로-카스파제-3(컨스트럭트 0)의 GIETD↓S 중 D 대신, MMP2에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열 GPL↓GVR(MMP2-인식 절단 서열)을 포함하는 링커(GIETGPLGVRS)로 치환한 형태(서열번호 26);(2) Pro-caspase-3 construct II (MMP2 sensor II), which is recognized and cleaved by MMP2 instead of D in GIETD ↓ S of wild pro-caspase-3 (construct 0) (GIETGPLGVRS) comprising GPL ↓ GVR (MMP2-recognized truncation sequence) (SEQ ID NO: 26);

(3) 프로-카스파제-3 컨스트럭트 Ⅲ(MMP2 센서 Ⅲ)로서, 야생 프로-카스파제-3(컨스트럭트 0)의 GIETD↓S 중 D 대신, MMP2에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열(MMP2-인식 절단 서열)인 GPL↓GVR 및 상기 MMP2-인식 절단 서열을 중심으로 GS를 포함하는 링커(GIETGSGPLGVRGS)로 치환한 형태(서열번호 27); (3) Pro-caspase-3 construct (III) (MMP2 sensor III), which is recognized and cleaved by MMP2 instead of D in GIETD ↓ S of wild pro-caspase-3 (MMP2-recognized truncation sequence) and a linker (GIETGSGPLGVRGS) containing GS (SEQ ID NO: 27) centered on the MMP2-recognized truncation sequence;

(4) 프로-카스파제-3 컨스트럭트 Ⅳ(MMP2 센서 Ⅳ)로서, 야생 프로-카스파제-3(컨스트럭트 0)의 GIETD↓S 중 D 대신, MMP2에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열(MMP2-인식 절단 서열)인 GPL↓GVR 및 상기 MMP2-인식 절단 서열을 중심으로 GGS을 포함하는 링커(GIETGGSGPLGVRGGS)로 치환된 형태(서열번호 28).(4) Pro-caspase-3 Construct IV (MMP2 sensor IV), which is recognized and cleaved by MMP2 instead of D in GIETD ↓ S of wild pro-caspase-3 (Construct 0) (MMP2-recognized truncation sequence) and a linker (GIETGGSGPLGVRGGS) containing GGS centered on the MMP2-recognized truncation sequence (SEQ ID NO: 28).

(5) 프로-카스파제-3 컨스트럭트 V(MMP2 센서 V)로서, 야생 프로-카스파제-3(컨스트럭트 0)의 GIETD↓S 중 D 대신, MMP2에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열(MMP2-인식 절단 서열)인 GPL↓GVR 및 상기 MMP2-인식 절단 서열을 중심으로 GGGS을 포함하는 링커(IETGGGSGPLGVRGGGS)로 치환된 형태(서열번호 29).(5) Pro-caspase-3 construct V (MMP2 sensor V), which is recognized and cleaved by MMP2 instead of D in GIETD ↓ S of wild pro-caspase-3 (construct 0) (MMP2-recognized truncation sequence) and a form (SEQ ID NO: 29) substituted with a linker (IETGGSGPLGVRGGGS) containing GGGS centered on the MMP2-recognized truncation sequence.

1-2. 재조합 프로-1-2. Recombinant pro- 카스파제Caspase -3의 발현 및 정제-3 expression and purification

실시예 1에서 제작한 프로-카스파제-3 발현 플라스미드가 들어가 형질 전환된 E.coli BL21(DE3)을 접종하여 37℃, 180rpm, 12 시간 동안 종균 배양하였다. 이것을 500 ㎖ 2xYT (8 g Trypton, 5 g Yeast Extract, 2.5 g NaCl, 200 mg/L 암피실린) 배지에 접종한 후 37℃, 180 rpm 조건에서 약 3 시간 정도 배양하였다. 600 nm에서의 흡광도가 0.6이 되었을 때 단백질의 발현을 위해 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 IPTG를 넣어주고, 30℃에서 8시간 동안 배양하였다. 세포들을 모으기 위해 4℃에서 15 분 동안 9300 g의 속도로 원심분리하였다. 상등액을 버린 후 20 ㎖ 용해 버퍼(50 mM NaPO3, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole)에 재현탁시키고 리소좀(lysozyme) 0.05 g/㎖로 넣어준 얼음에서 30분간 반응하였다. 그리고 35% amp의 초음파로 15 초 간격으로 5초 동안 60 회씩 초음파 파쇄하였다. 파쇄액을 4℃, 9300 g에서 1 시간 동안 원심분리하였고, 상등액은 무세포 추출물(cell free extract)로 얻어졌다.E. coli BL21 (DE3) transformed with the pro-caspase-3 expression plasmid prepared in Example 1 was inoculated and cultured at 37 DEG C and 180 rpm for 12 hours. This was inoculated into a 500 ml 2xYT (8 g Trypton, 5 g Yeast Extract, 2.5 g NaCl, 200 mg / L ampicillin) medium and cultured at 37 ° C and 180 rpm for about 3 hours. When the absorbance at 600 nm reached 0.6, IPTG was added to a final concentration of 0.2 mM for protein expression and cultured at 30 ° C for 8 hours. The cells were centrifuged at 9300 g for 15 minutes at 4 ° C to collect them. The supernatant was discarded and resuspended in 20 ml dissolution buffer (50 mM NaPO 3 , 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole) and reacted for 30 min on ice with lysogen (0.05 g / ml). And ultrasonicated by ultrasonic wave of 35% amp for 60 seconds for 15 seconds at intervals of 5 seconds. The lysate was centrifuged at 9300 g for 1 hour at 4 ° C, and the supernatant was obtained as a cell-free extract.

히스티딘 태깅 단백질(Histidine tagged protein)의 정제를 위해서 Ni-NTA 슈퍼플로우 레진(Clonetech, USA)을 사용하였으며, 무세포 추출물 20 ㎖에 50% 레진 슬러리를 1 ㎖ 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 회전시키면서 6x His-tag 프로-카스파제-3를 레진과 결합시켰다. 이 반응액을 빈 컬럼에 로딩한 후 레진이 완전하게 가라앉도록 시간을 두었다. 이후 컬럼의 마개를 열어 무세포 추출물 용액을 모두 떨어뜨렸다. 세척액(50 mM NaPO3, 300 mM NaCl, 40mM Imidazole)를 5 ㎖씩 3번 로딩하여 레진을 세척하였다. 용출 버퍼(50 mM NaPO3, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazole) 를 2 ㎖씩 용출하여 6x His-tag 카스파제-3 자모겐을 2ml 튜브에 모았다. 용출(Elution)은 4 회 진행하였다.Ni-NTA superfluorescent resin (Clonetech, USA) was used for the purification of histidine tagged protein. One ml of a 50% resin slurry was added to 20 ml of cell-free extract, and the mixture was rotated at 4 ° C for 1 hour 6x His-tagged pro-caspase-3 was bound to the resin. After loading the reaction solution into an empty column, the resin was allowed to settle completely. The column was then opened and the cell-free extract solution was dropped. The resin was washed three times with 5 ml of washing solution (50 mM NaPO 3 , 300 mM NaCl, 40 mM Imidazole). The elution buffer (50 mM NaPO 3 , 300 mM NaCl, 300 mM Imidazole) was eluted with 2 ml each, and 6x His-tag caspase- 3 zymogen was collected in a 2 ml tube. Elution was carried out 4 times.

정제된 카스파제-3 지모겐을 농축하기 위하여 코닝 Spin-X UF 농축기 amicon ultra-4 (Millipore, USA)에 용출된 단백질들을 넣고 4℃, 4000rpm로 원심분리하였다. 그리고 이 과정에서 0.22 ㎛ 실린지 필터에 필터링된 1x PBS (Phosphate buffer saline, 150mM NaCl, 10mM KH2PO4, pH 7.4)를 4 ㎖씩 3 회에 걸쳐 넣어주어 버퍼 교환을 통해 버퍼에 들어있는 이미다졸을 제거하였다. 농축이 끝난 단백질들은 분광계로 280nm에서의 흡광도 값으로 농도를 측정하였다. 단백질 농도 계산을 위한 흡광계수(extinction coefficient) 값은 ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)에 있는 ProtParam tool에 프로-카스파제-3 서열을 입력하여 25900 M-1cm-1의 값으로 얻었다.Proteins eluted in a Corning Spin-X UF concentrator amicon ultra-4 (Millipore, USA) were added to concentrate the purified caspase-3 zymogens and centrifuged at 4000 rpm at 4 ° C. In this procedure, 1 ml of PBS (phosphate buffer saline, 150 mM NaCl, 10 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4) was added to the 0.22 ㎛ syringe filter in 4 ml increments of 3 ㎖, The dissolve was removed. Concentrated proteins were measured by spectrophotometer at absorbance at 280 nm. The extinction coefficient for the protein concentration calculation was calculated by entering the pro-caspase-3 sequence in the ProtParam tool at ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/) to 25900 M -1 cm -1 Respectively.

실시예Example 2.  2. MMPMMP -2 반응에 의한 재조합 프로--2 < / RTI > 카스파제Caspase -3의 절단 확인Confirm cutting of -3

2-1. 효소의 반응속도(Enzyme kinetics) 측정2-1. Measurement of Enzyme Kinetics

제작된 프로-카스파제-3 및 카스파제-3 효소의 MMP2에 의한 활성은, Ac-DEVD-pNA (N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide, SIGMA)의 가수 분해 속도를 측정하여 특성화하였다. 제작된 카스파제-3 효소의 특이적 활성을 측성하기 위하여, 4 μM의 각 제작된 프로-카스파제-3를, MMP2 분석 완충액(100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.05% (w/v) Brij-35, pH 7.5)에 넣은 30 nM의 MMP2(Recombinant Human MMP-2, R&D systems, USA)로 25℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 프로-카스파제-3와 인큐베이션하기 전에, MMP2를 MMP2 활성화 용액 (100 mM Tris, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.05% (w/v) Brij- 35, pH 8.0, 1 mM p-aminophenylmercuric acetate)에 37℃에서 1 시간 동안 활성화시켰다. 100 ㎕ 단백질 용액(프로-카스파제-3의 경우 400 nM 및 카스파제-3의 경우 10 nM)에 100 ㎕ Ac-DEVD-pNA 용액(10-400 μM)를 첨가하여 반응을 개시하였다. 카스파제-3 반응은 카스파제-3 분석 완충액(25 mM HEPES, 0.1 % CHAPS, 10 mM DTT, pH 7.5)에서 실시하였다. Ac-DEVD-pNA의 가수분해 속도는 플레이트 리더(Eon microplate spectrophotometer, BioTek, USA)를 이용하여 405 nm(콸 = 10500M-1cm-1)에서의 흡광도를 모니터링함으로써 측정하였다. 반응속도 상수(Kinetic constants)는 오리진 소프트웨어(Origin Lab, USA)를 이용하여 초기 속도에 대한 미카엘리스-멘텐(Michaelis–Menten) 모델을 피팅하여 결정하였다.The activity of the prepared pro-caspase-3 and caspase-3 enzyme by MMP2 was measured by measuring the hydrolysis rate of Ac-DEVD-pNA (N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide, SIGMA) Respectively. To measure the specific activity of the produced caspase-3 enzyme, 4 μM of each prepared pro-caspase-3 was dissolved in MMP2 assay buffer (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 , 0.05% (Recombinant Human MMP-2, R & D systems, USA) in DMEM (W / v) Brij-35, pH 7.5) at 25 ° C for 4 hours. Prior to incubation with pro-caspase-3, MMP2 was incubated with MMP2 activation solution (100 mM Tris, 10 mM CaCl 2 , 150 mM NaCl, 0.05% (w / v) Brij- 35, pH 8.0, 1 mM p -aminophenylmercuric acetate ) At 37 < 0 > C for 1 hour. 100 [mu] l of Ac-DEVD-pNA solution (10-400 [mu] M) was added to 100 [mu] l of protein solution (400 nM for pro-caspase-3 and 10 nM for caspase-3). The caspase-3 reaction was performed in caspase-3 assay buffer (25 mM HEPES, 0.1% CHAPS, 10 mM DTT, pH 7.5). The hydrolysis rate of Ac-DEVD-pNA was measured by monitoring the absorbance at 405 nm (Kwal = 10500 M -1 cm -1 ) using a plate reader (Eon microplate spectrophotometer, BioTek, USA). Kinetic constants were determined by fitting a Michaelis-Menten model for initial velocity using Origin Lab (USA).

2-2. 2-2. MMPMMP -2의 활성화 분석Activation analysis of -2

MMP2 분석 완충액에 다양한 농도의 활성화된 MMP2 및 프로-카스파제-3(8 μM)을 혼합하여 4 시간 또는 적당한 시간 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을, Ac-DEVD-pNA(최종 농도 50 μM)을 함유하는 카스파제-3 분석 완충액으로 10 배 희석하였다. Ac-DEVD-pNA 가수 분해 속도는 405 nm에서의 흡광도를 모니터링함으로써 측정하였다. 검출 한계(LOD)는 농도 0 일때 3X 표준 편차의 평균값을 더한 것에 해당하는 시그널 값에 대하여 계산된 MMP2의 농도로 결정하였다. Various concentrations of activated MMP2 and pro-caspase-3 (8 [mu] M) were mixed in MMP2 assay buffer and incubated at 25 [deg.] C for 4 hours or for an appropriate time. The reaction mixture was diluted 10-fold with caspase-3 assay buffer containing Ac-DEVD-pNA (final concentration 50 [mu] M). Ac-DEVD-pNA hydrolysis rate was measured by monitoring the absorbance at 405 nm. The detection limit (LOD) was determined by the concentration of MMP2 calculated for the signal value corresponding to the addition of the mean value of the 3X standard deviation at zero concentration.

대조군인 각각의 절단되지 않은 프로-카스파제-3 구조의 샘플과 함께 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다.Was confirmed by SDS-PAGE along with samples of each un-cleaved pro-caspase-3 construct that was the control.

반응 혼합물을 SDS-PAGE를 이용하여 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.The reaction mixture was analyzed by SDS-PAGE and the result is shown in FIG.

SDS-PAGE 결과, 모든 구조에서 29kDa 위치에서 Full size의 시그널이 줄어드는 경향을 보였으나, 특히, 컨스트럭트 IV에서는 시그널이 거의 보이지 않는 결과를 나타냈다. As a result of SDS-PAGE, the signal of full size at 29 kDa position tended to decrease in all structures, but in Construct IV, the signal was almost invisible.

이를 통해서 재조합 프로-카스파제-3는 MMP-2에 의해서 절단된다는 것을 확인하였고, 특히 컨스트럭트 IV가 가장 잘 절단되는 구조라는 것을 확인할 수 있었다. This confirmed that recombinant pro-caspase-3 was cleaved by MMP-2, and in particular, Construct IV was the most cleaved structure.

또한, 표 2에 나타낸 바와 같이, 프로도메인이 없는 야생형 카스파제-3(컨스트럭트 0)은 발현 및 정제 단계에서 완전히 절단되었고, 발색 기질(Ac-DEVD-pNA)을 이용하여 K CAT 및 K M로 결정된 그 촉매 활성은 공지된 것과 유사하였다. 디자인된 컨스트럭트 I 및 II는, 단일 폴리펩티드로 정제하였다. 흥미롭게도, 제작된 프로-카스파제-3 효소의 수율(컨스트럭트 I 의 경우, 9.70 ㎎/L 및 컨스트럭트 II의 경우 10.30 ㎎/L)은 야생형 효소의 것(3.07 ㎎/L)보다 높았다(표 2). 이는 발현 동안 프로-카스파제-3의 완전 자가절단은 세포 독성을 유발하며, 대장균에서의 발현량을 제한한 것으로 보이며, 이러한 결과는 공지된 트롬빈-절단가능 프로-카스파제-3의 결과와 일치하였다.In addition, as shown in Table 2, the pro domain is the wild type caspase-3 (construct 0) is not expressed and has been completely cut in the purification step, CAT K and K by using a chromogenic substrate (Ac-DEVD-pNA) Its catalytic activity as determined by M was similar to that known in the art. The designed constructs I and II were purified into a single polypeptide. Interestingly, the yield of the prepared pro-caspase-3 enzyme (9.70 mg / L for construct I and 10.30 mg / L for construct II) was higher than that of wild type enzyme (3.07 mg / (Table 2). This suggests that complete autocleavage of pro-caspase-3 during expression leads to cytotoxicity and limits the amount of expression in E. coli, consistent with the results of the known thrombin-cleavable pro-caspase-3 Respectively.

Figure 112016044824519-pat00001
Figure 112016044824519-pat00001

또한, Asp175 대신 MMP2 절단 서열(P3-GPLGVR-P3')을 삽입한 컨스트럭트 II가, 카스파제-3 절단 부위(P4-I172ETDS176-P1')를 GPLGVR로 대체한 컨스트럭트 I보다 훨씬 더 효율적으로 MMP2에 의해 절단되었다. MMP2에 의한 컨스트럭트 I의 낮은 절단 효율에 대한 이유는 명확하지 않으나, 보다 긴 길이 및/또는 보다 유연한 루프 구조가 MMP2의 활성 부위에 대한 접근에 유리하다는 것을 보여준다. 비절단(unprocessed) 및 절단(processed)된 효소의 촉매 활성을 발색 기질(Ac-DEVD-pNA)을 이용하여 특징화하였다. 절단된 컨스트럭트 II는 비절단된 컨스트럭트 II보다 훨씬 더 높은 촉매 활성을 나타내었다. 컨스트럭트 II의 (k cat/K M)unprocessed에 대한 (k cat/K M)processed의 비율은 137.3이었다(표 2). 그러나, Ac-Deve-pNA 가수 분해는 비절단 및 절단된 효소 모두에 대한 컨스트럭트 I에서는 관찰되지 않았다. 이전의 연구는, 대단위체 및 소단위체 사이의 링커 상의 일부 잔기의 돌연변이가 프로테아제의 활성에 영향을 미친다고 보고하였다. 컨스트럭트 I에서 내부단위체(intersubunit) 링커 (I172ETDS176)의 절단 서열은 PLGVR의 새로운 서열로 대체하였다.Also, Construct II, in which the MMP2 cleavage sequence (P3-GPLGVR-P3 ') was inserted in place of Asp175, and Constit II, which replaced the caspase-3 cleavage site (P4-I 172 ETDS 176 -P1') with GPLGVR Lt; RTI ID = 0.0 > MMP2. ≪ / RTI > The reason for the low cleavage efficiency of Construct I by MMP2 is unclear, but it shows that longer lengths and / or more flexible loop structures are advantageous for access to active sites of MMP2. The catalytic activity of unprocessed and processed enzymes was characterized using a chromogenic substrate (Ac-DEVD-pNA). The truncated construct II showed much higher catalytic activity than the uncut truncated construct II. The ratio of ( k cat / K M ) processed to ( k cat / K M ) unprocessed of Construct II was 137.3 (Table 2). However, Ac-Deve-pNA hydrolysis was not observed in Construct I for both uncut and cleaved enzymes. Previous studies have reported that mutations of some residues on linkers between large and small units affect the activity of the protease. In Construct I, the cleavage sequence of the internalubject linker (I 172 ETDS 176 ) was replaced by a new sequence of PLGVR.

상술한 바와 같이, 컨스트럭트 I은 절단 효율 및 활성이 다소 떨어지므로, 본 발명자들은 컨스트럭트 II를 최적화하였다. 본 발명자들은 절단 부위의 길이 및/또는 유연성이 MMP2에 의한 절단 효율 및/또는 촉매 활성에 중요할 수 있다고 가정하고, 세 개의 프로-카스파제-3 효소들(도 2에 나타낸 컨스트럭트 III, IV 및 V)을 추가적으로 구축하였다. MMP2 절단 부위의 양 말단은 Gly 및 Ser로 구성된 서열을 추가하여 확장시켰다. 이들 모두는 컨스트럭트 II와 유사한 정도로 MMP2에 의해 절단되었다. As described above, Construct I has a somewhat lowered cutting efficiency and activity, so the inventors have optimized Construct II. The inventors have hypothesized that three pro-caspase-3 enzymes (Construct III as shown in FIG. 2, SEQ ID NO: 3) and / IV and V) were additionally constructed. Both ends of the MMP2 cleavage site were extended by addition of sequences consisting of Gly and Ser. All of these were cleaved by MMP2 to a similar extent as Construct II.

그러나, 비절단 및 절단된 효소의 촉매 활성은 내부단위체 링커의 길이에 의존적이었다. 특히, 비절단 효소의 k cat 값은 절단된 것들보다 내부단위체 링커의 종류에 따라 변화하였다. 컨스트럭트 IV의 (k cat/K M)unprocessed에 대한 (k cat/K M)processed의 비율은 컨스트럭트 III의 것보다 3 배 이상 높았다(255.9 대 81.6). 또한 내부단위체 링커는 단백질 발현 수율에 영향을 미쳤다(표 2). However, the catalytic activity of the uncut and cleaved enzymes was dependent on the length of the inner unit linker. In particular, k cat value of the non-cutting enzyme was changed according to the type of the internal units linker than the cut ones. The ratio of ( k cat / K M ) processed to ( k cat / K M ) unprocessed of Construct IV was three times higher than that of Construct III (255.9 vs. 81.6). In addition, the internal monomer linker influenced the protein expression yield (Table 2).

이에 따라 MMP2 활성 분석 방법 정립을 위하여 컨스트럭트 IV를 선택하였다.Therefore, Construct IV was selected for the analysis of MMP2 activity.

이후, 정제된 컨스트럭트 IV를 이용하여 MMP2 농도 및 Ac-DEVD-pNA의 가수 분해 속도 간의 관계를 조사하였다. Thereafter, the relationship between MMP2 concentration and the hydrolysis rate of Ac-DEVD-pNA was investigated using purified Construct IV.

해당 분석 절차는 도 4a에 나타내었다. 다양한 농도의 활성화된 MMP2를 4 μM 프로-카스파제-3(컨스트럭트 IV)와 함께 4 시간 동안 MMP2 활성 분석 완충액에서 인큐베이션하였다. 이어서, 반응 혼합물을 AC-DEVD-pNA를 함유한 카스파제-3 분석 완충액으로 10 배 희석하고, 카스파제-3 기질 가수 분해를 측정하였다. 컨스트럭트 IV의 최종 농도는 비절단된 프로-카스파제-3 효소의 백그라운드 시그널을 기반으로 하여 결정하였다. 선형 관계는 0-2.5 nM에서 관찰되었고, 쌍곡선은 전체 MMP2 농도 범위에서 얻어졌다. MMP2 고농도에서 관찰된 시그널의 포화는 카스파 제-3 고농도에서의 초기 속도를 측정하는데 한계를 초래하였다. MMP2에 대한 검출 한계(LOD)는 52 pM으로 낮았다. MMP2 반응 시간을 증가시킴으로써 LOD를 감소시킬 수 있는 지의 가능성을 조사하기 위해, MMP2와 프로-카스파제-3의 인큐베이션 기간 을 16 시간으로 연장시켰다. The analysis procedure is shown in FIG. 4A. Various concentrations of activated MMP2 were incubated with MMP2 activity assay buffer for 4 hours with 4 [mu] M pro-caspase-3 (Constit IV). The reaction mixture was then diluted 10-fold with caspase-3 assay buffer containing AC-DEVD-pNA and the caspase-3 substrate hydrolysis was measured. The final concentration of Construct IV was determined based on the background signal of the un-cleaved pro-caspase-3 enzyme. Linear relationships were observed at 0-2.5 nM and hyperbola was obtained at the entire MMP2 concentration range. Saturation of the signal observed at high concentrations of MMP2 has limited its ability to measure the initial rate at high caspase-3 concentrations. The detection limit (LOD) for MMP2 was as low as 52 pM. To investigate the possibility of reducing LOD by increasing the MMP2 response time, the incubation period of MMP2 and pro-caspase-3 was extended to 16 hours.

그 결과, 도 4c 및 4d에 나타낸 바와 같이, 저농도의 MMP2에서 시그널이 크게 증가하고, MMP2에 대한 LOD는 6.5 pM까지 감소하였다. As a result, as shown in Figs. 4C and 4D, the signal increased significantly at low concentration of MMP2 and the LOD for MMP2 decreased to 6.5 pM.

본 발명에서, 본 발명자들은 본 발명의 재조합 프로-카스파제-3 효소가 MMP2에 의해 절단될 수 있도록 설계하였으며, 또한 이러한 맞춤형 자모겐을 이용하는 발색성 MMP2 활성 분석 방법을 개발하였다. MMP2 및 프로-카스파제-3의 효소적 캐스케이드는 프로-카스파제-3의 절단을 통해 MMP2의 활성 시그널을 증폭시키고, 발색성 카스파제-3 기질을 가수분해함으로써 흡광도 시그널을 생성한다. 상기 방법은, 흡광도 시그널을 기반으로 하는 분석 시스템에서도 pM 범위의 농도에서 MMP2의 활성을 평가할 수 있다. 특히, 이러한 MMP2에 대한 프로-카스파제-3 센서를 제작하는데 이용된 설계 전략은 다른 프로테아제에 적용 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 플랫폼 기술로서, 프로테아제 활성 및 프로테아제를 포함하는 합성 시그널 경로를 기반으로 하는 진단 방법으로 개발될 수 있다.In the present invention, the inventors designed the recombinant pro-caspase-3 enzyme of the present invention to be cleaved by MMP2, and developed a method of assaying chromogenic MMP2 activity using such customized zymogen. The enzymatic cascade of MMP2 and pro-caspase-3 amplifies the active signal of MMP2 through cleavage of pro-caspase-3 and produces an absorbance signal by hydrolyzing the chromogenic caspase-3 substrate. The method can also assess the activity of MMP2 at concentrations in the pM range, even in analytical systems based on absorbance signals. In particular, the design strategy used to construct pro-caspase-3 sensors for such MMP2 can be applied to other proteases. Thus, the method of the present invention can be developed as a platform technology, a diagnostic method based on synthetic signal pathways including protease activity and proteases.

결론적으로, 본 발명자는 유전공학적으로 변형된 지모겐에 기초하여 고감도의, 사용 편의성이 높은 프로테아제 활성 측정 방법을 개발하였다. 프로테아제 센서는 모듈식이기 때문에, 본 발명은 다른 프로테아제들의 분석 방법을 위해 쉽게 수정되고 개발될 수 있다.In conclusion, the inventors have developed a highly sensitive and easy-to-use method for measuring protease activity based on genetically modified zymogens. Since protease sensors are modular, the present invention can be easily modified and developed for methods of analysis of other proteases.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Protease Sensors and Protease Activity Assay Method Using the Protease Sensors <130> P-1-73-1 <150> KR 1020150172163 <151> 2015-12-04 <160> 41 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the MMP1 protease <400> 1 Pro Leu Ala Leu Trp Ala Arg 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the MMP2 protease <400> 2 Pro Leu Gly Val Arg 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the MMP2 protease <400> 3 Gly Pro Leu Gly Val Arg 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the MMP2 protease <400> 4 Ser Pro Leu Gly Val Arg 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the MMP3 protease <400> 5 Pro Tyr Ala Tyr Trp Met Arg 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the MMP7 protease <400> 6 Arg Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ser 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the MMP8 protease <400> 7 Ser Pro Leu Gly Val Arg 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the MMP8 protease <400> 8 Pro Leu Ala Tyr Trp Ala Arg 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the MMP9 protease <400> 9 Pro Leu Gly Met Trp Ser Arg 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 1 <400> 10 Tyr Val Ala Asp 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 1 <400> 11 Trp Glu His Asp 1 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 2 <400> 12 Val Asp Val Ala Asp 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 3 <400> 13 Ser Gly Asp Glu Val 1 5 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 4 <400> 14 Leu Glu Val Asp 1 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 5 <400> 15 Trp Glu His Asp 1 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 6 <400> 16 Val Glu Ile Asp 1 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 7 <400> 17 Val Asp Gln Val Asp Gly Trp Lys 1 5 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 8 <400> 18 Ile Glu Thr Asp 1 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 9 <400> 19 Leu Glu His Asp 1 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Cathepsin B <400> 20 Gly Ile Val Arg Ala Lys 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Cathepsin E <400> 21 Ala Gly Phe Ser Leu Pro Ala Lys 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Cathepsin K <400> 22 Lys Pro Arg Gly Ser Lys Gln 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Cathepsin L <400> 23 Lys Leu Arg His Ser Lys Gln 1 5 <210> 24 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Cathepsin S <400> 24 Leu Glu Gln 1 <210> 25 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> It is amino acid sequence of the MMP2 protease sensor I <400> 25 Met Glu Asn Thr Glu Asn Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Leu 1 5 10 15 Glu Pro Lys Ile Ile His Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly Ile Ser 20 25 30 Leu Asp Asn Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Leu Cys Ile 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His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys Ile Val Ser Met Leu Thr Lys Glu 260 265 270 Leu Tyr Phe Tyr His Leu Glu His His His His His His 275 280 285 <210> 26 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> It is amino acid sequence of the MMP2 protease sensor II <400> 26 Met Glu Asn Thr Glu Asn Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Leu 1 5 10 15 Glu Pro Lys Ile Ile His Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly Ile Ser 20 25 30 Leu Asp Asn Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Leu Cys Ile 35 40 45 Ile Ile Asn Asn Lys Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Thr Ser Arg 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg Glu Thr Phe Arg Asn 65 70 75 80 Leu Lys Tyr Glu Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Ile 85 90 95 Val Glu Leu Met Arg Asp Val Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser 100 105 110 Ser Phe Val Cys Val Leu Leu Ser His Gly Glu Glu Gly Ile Ile Phe 115 120 125 Gly Thr Asn Gly Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Thr Asn Phe Phe Arg 130 135 140 Gly Asp Arg Cys Arg Ser Leu Thr Gly Lys Pro Lys Leu Phe Ile Ile 145 150 155 160 Gln Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp Cys Gly Ile Glu Thr Gly Pro 165 170 175 Leu Gly Val Arg Ser Gly Val Asp Asp Asp Met Ala Cys His Lys Ile 180 185 190 Pro Val Glu Ala Asp Phe Leu Tyr Ala Tyr Ser Thr Ala Pro Gly Tyr 195 200 205 Tyr Ser Trp Arg Asn Ser Lys Asp Gly Ser Trp Phe Ile Gln Ser Leu 210 215 220 Cys Ala Met Leu Lys Gln Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Phe Met His Ile 225 230 235 240 Leu Thr Arg Val Asn Arg Lys Val Ala Thr Glu Phe Glu Ser Phe Ser 245 250 255 Phe Asp Ala Thr Phe His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys Ile Val Ser 260 265 270 Met Leu Thr Lys Glu Leu Tyr Phe Tyr His Leu Glu His His His His 275 280 285 His His 290 <210> 27 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> It is amino acid sequence of the MMP2 protease sensor III <400> 27 Met Glu Asn Thr Glu Asn Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Leu 1 5 10 15 Glu Pro Lys Ile Ile His Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly Ile Ser 20 25 30 Leu Asp Asn Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Leu Cys Ile 35 40 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Ser Phe Asp Ala Thr Phe His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys 260 265 270 Ile Val Ser Met Leu Thr Lys Glu Leu Tyr Phe Tyr His Leu Glu His 275 280 285 His His His His His 290 <210> 28 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> It is amino acid sequence of the MMP2 protease sensor IV <400> 28 Met Glu Asn Thr Glu Asn Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Leu 1 5 10 15 Glu Pro Lys Ile Ile His Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly Ile Ser 20 25 30 Leu Asp Asn Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Leu Cys Ile 35 40 45 Ile Ile Asn Asn Lys Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Thr Ser Arg 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg Glu Thr Phe Arg Asn 65 70 75 80 Leu Lys Tyr Glu Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Ile 85 90 95 Val Glu Leu Met Arg Asp Val Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser 100 105 110 Ser Phe Val Cys Val Leu Leu Ser His Gly Glu Glu Gly Ile Ile Phe 115 120 125 Gly Thr Asn Gly Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Thr Asn Phe Phe Arg 130 135 140 Gly Asp Arg Cys Arg Ser Leu 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ctgtctcaat gccacagtcc agttc 45 <210> 36 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 36 acaggtagcg gccctctggg tgtgcgtggc agtggtgttg atgatgac 48 <210> 37 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 37 actgccacgc acacccagag ggccgctacc tgtctcaatg ccacagtc 48 <210> 38 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 38 acaggcggta gcggccctct gggtgtgcgt ggcggtagtg gtgttgatg 49 <210> 39 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 39 actaccgcca cgcacaccca gagggccgct accgcctgtc tcaatgccac agtc 54 <210> 40 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 11 <400> 40 acaggtggcg gtagcggccc tctgggtgtg cgtggtggcg gtagtggtgt tgatg 55 <210> 41 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 12 <400> 41 actaccgcca ccacgcacac ccagagggcc gctaccgcca cctgtctcaa tgccacagtc 60 60 <110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Protease Sensors and Protease Activity Assay Method Using the          Protease Sensors <130> P-1-73-1 <150> KR 1020150172163 <151> 2015-12-04 <160> 41 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it cleavage sequence of the MMP1 protease <400> 1 Pro Leu Ala Leu Trp Ala Arg   1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it cleavage sequence of the MMP2 protease <400> 2 Pro Leu Gly Val Arg   1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it cleavage sequence of the MMP2 protease <400> 3 Gly Pro Leu Gly Val Arg   1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it cleavage sequence of the MMP2 protease <400> 4 Ser Pro Leu Gly Val Arg   1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it cleavage sequence of the MMP3 protease <400> 5 Pro Tyr Ala Tyr Trp Met Arg   1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it cleavage sequence of the MMP7 protease <400> 6 Arg Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ser   1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it cleavage sequence of the MMP8 protease <400> 7 Ser Pro Leu Gly Val Arg   1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it cleavage sequence of the MMP8 protease <400> 8 Pro Leu Ala Tyr Trp Ala Arg   1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it cleavage sequence of the MMP9 protease <400> 9 Pro Leu Gly Met Trp Ser Arg   1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 1 <400> 10 Tyr Val Ala Asp   One <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 1 <400> 11 Trp Glu His Asp   One <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 2 <400> 12 Val Asp Val Ala Asp   1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 3 <400> 13 Ser Gly Asp Glu Val   1 5 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 4 <400> 14 Leu Glu Val Asp   One <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 5 <400> 15 Trp Glu His Asp   One <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 6 <400> 16 Val Glu Ile Asp   One <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 7 <400> 17 Val Asp Gln Val Asp Gly Trp Lys   1 5 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 8 <400> 18 Ile Glu Thr Asp   One <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the Caspase 9 <400> 19 Leu Glu His Asp   One <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is cleavage sequence of the cathepsin B <400> 20 Gly Ile Val Arg Ala 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Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Thr Ser Arg      50 55 60 Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg Glu Thr Phe Arg Asn  65 70 75 80 Leu Lys Tyr Glu Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Ile                  85 90 95 Val Glu Leu Met Arg Asp Val Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser             100 105 110 Ser Phe Val Cys Val Leu Ser Ser His Gly Glu Glu Gly Ile Ile Phe         115 120 125 Gly Thr Asn Gly Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Thr Asn Phe Phe Arg     130 135 140 Gly Asp Arg Cys Arg Ser Leu Thr Gly Lys Pro Lys Leu Phe Ile Ile 145 150 155 160 Gln Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp Cys Gly Pro Leu Gly Val Arg                 165 170 175 Gly Val Asp Asp Asp Met Ala Cys His Lys Ile Pro Val Glu Ala Asp             180 185 190 Phe Leu Tyr Ala Tyr Ser Thr Ala Pro Gly Tyr Tyr Ser Trp Arg Asn         195 200 205 Ser Lys Asp Gly Ser Trp Phe Ile Gln Ser Leu Cys Ala Met Leu Lys     210 215 220 Gln Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Phe Met His Ile Leu Thr Arg Val Asn 225 230 235 240 Arg Lys Val Ala Thr Glu Phe Glu Ser Phe Ser Phe Asp Ala Thr Phe                 245 250 255 His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys Ile Val Ser Met Leu Thr Lys Glu             260 265 270 Leu Tyr Phe Tyr His Leu Glu His His His His His         275 280 285 <210> 26 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> It is amino acid sequence of the MMP2 protease sensor II <400> 26 Met Glu Asn Thr Glu Asn Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Leu   1 5 10 15 Glu Pro Lys Ile Ile His Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly Ile Ser              20 25 30 Leu Asp Asn Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Leu Cys Ile          35 40 45 Ile Ile Asn Asn Lys Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Thr Ser Arg      50 55 60 Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg Glu Thr Phe Arg Asn  65 70 75 80 Leu Lys Tyr Glu Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Ile                  85 90 95 Val Glu Leu Met Arg Asp Val Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser             100 105 110 Ser Phe Val Cys Val Leu Ser Ser His Gly Glu Glu Gly Ile Ile Phe         115 120 125 Gly Thr Asn Gly Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Thr Asn Phe Phe Arg     130 135 140 Gly Asp Arg Cys Arg Ser Leu Thr Gly Lys Pro Lys Leu Phe Ile Ile 145 150 155 160 Gln Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp Cys Gly Ile Glu Thr Gly Pro                 165 170 175 Leu Gly Val Arg Ser Gly Val Asp Asp Asp Met Ala Cys His Lys Ile             180 185 190 Pro Val Glu Ala Asp Phe Leu Tyr Ala Tyr Ser Thr Ala Pro Gly Tyr         195 200 205 Tyr Ser Trp Arg Asn Ser Lys Asp Gly Ser Trp Phe Ile Gln Ser Leu     210 215 220 Cys Ala Met Leu Lys Gln Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Phe Met His Ile 225 230 235 240 Leu Thr Arg Val Asn Arg Lys Val Ala Thr Glu Phe Glu Ser Phe Ser                 245 250 255 Phe Asp Ala Thr Phe His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys Ile Val Ser             260 265 270 Met Leu Thr Lys Glu Leu Tyr Phe Tyr His Leu Glu His His His         275 280 285 His His     290 <210> 27 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> It is amino acid sequence of the MMP2 protease sensor III <400> 27 Met Glu Asn Thr Glu Asn Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Leu   1 5 10 15 Glu Pro Lys Ile Ile His Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly Ile Ser              20 25 30 Leu Asp Asn Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Leu Cys Ile          35 40 45 Ile Ile Asn Asn Lys Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Thr Ser Arg      50 55 60 Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg Glu Thr Phe Arg Asn  65 70 75 80 Leu Lys Tyr Glu Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Ile                  85 90 95 Val Glu Leu Met Arg Asp Val Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser             100 105 110 Ser Phe Val Cys Val Leu Ser Ser His Gly Glu Glu Gly Ile Ile Phe         115 120 125 Gly Thr Asn Gly Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Thr Asn Phe Phe Arg     130 135 140 Gly Asp Arg Cys Arg Ser Leu Thr Gly Lys Pro Lys Leu Phe Ile Ile 145 150 155 160 Gln Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp Cys Gly Ile Glu Thr Gly Ser                 165 170 175 Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Ser Gly Val Asp Asp Asp Met Ala Cys             180 185 190 His Lys Ile Pro Val Glu Ala Asp Phe Leu Tyr Ala Tyr Ser Thr Ala         195 200 205 Pro Gly Tyr Tyr Ser Trp Arg Asn Ser Lys Asp Gly Ser Trp Phe Ile     210 215 220 Gln Ser Leu Cys Ala Met Leu Lys Gln Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Phe 225 230 235 240 Met His Ile Leu Thr Arg Val Asn Arg Lys Val Ala Thr Glu Phe Glu                 245 250 255 Ser Phe Ser Phe Asp Ala Thr Phe His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys             260 265 270 Ile Val Ser Met Leu Thr Lys Glu Leu Tyr Phe Tyr His Leu Glu His         275 280 285 His His His His His     290 <210> 28 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> It is amino acid sequence of the MMP2 protease sensor IV <400> 28 Met Glu Asn Thr Glu Asn Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Leu   1 5 10 15 Glu Pro Lys Ile Ile His Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly Ile Ser              20 25 30 Leu Asp Asn Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Leu Cys Ile          35 40 45 Ile Ile Asn Asn Lys Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Thr Ser Arg      50 55 60 Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg Glu Thr Phe Arg Asn  65 70 75 80 Leu Lys Tyr Glu Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Ile                  85 90 95 Val Glu Leu Met Arg Asp Val Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser             100 105 110 Ser Phe Val Cys Val Leu Ser Ser His Gly Glu Glu Gly Ile Ile Phe         115 120 125 Gly Thr Asn Gly Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Thr Asn Phe Phe Arg     130 135 140 Gly Asp Arg Cys Arg Ser Leu Thr Gly Lys Pro Lys Leu Phe Ile Ile 145 150 155 160 Gln Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp Cys Gly Ile Glu Thr Gly Gly                 165 170 175 Ser Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Ser Gly Val Asp Asp Asp Met             180 185 190 Ala Cys His Lys Ile Pro Val Glu Ala Asp Phe Leu Tyr Ala Tyr Ser         195 200 205 Thr Ala Pro Gly Tyr Tyr Ser Trp Arg Asn Ser Lys Asp Gly Ser Trp     210 215 220 Phe Ile Gln Ser Leu Cys Ala Met Leu Lys Gln Tyr Ala Asp Lys Leu 225 230 235 240 Glu Phe Met His Ile Leu Thr Arg Val Asn Arg Lys Val Ala Thr Glu                 245 250 255 Phe Glu Ser Phe Ser Phe Asp Ala Thr Phe His Ala Lys Lys Gln Ile             260 265 270 Pro Cys Ile Val Ser Met Leu Thr Lys Glu Leu Tyr Phe Tyr His Leu         275 280 285 Glu His His His His His     290 295 <210> 29 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> It is amino acid sequence of the MMP2 protease sensor V <400> 29 Met Glu Asn Thr Glu Asn Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Leu   1 5 10 15 Glu Pro Lys Ile Ile His Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly Ile Ser              20 25 30 Leu Asp Asn Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Leu Cys Ile          35 40 45 Ile Ile Asn Asn Lys Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Thr Ser Arg      50 55 60 Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg Glu Thr Phe Arg Asn  65 70 75 80 Leu Lys Tyr Glu Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Ile                  85 90 95 Val Glu Leu Met Arg Asp Val Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser             100 105 110 Ser Phe Val Cys Val Leu Ser Ser His Gly Glu Glu Gly Ile Ile Phe         115 120 125 Gly Thr Asn Gly Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Thr Asn Phe Phe Arg     130 135 140 Gly Asp Arg Cys Arg Ser Leu Thr Gly Lys Pro Lys Leu Phe Ile Ile 145 150 155 160 Gln Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp Cys Gly Ile Glu Thr Gly Gly                 165 170 175 Gly Ser Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Ser Gly Val Asp Asp             180 185 190 Asp Met Ala Cys His Lys Ile Pro Val Glu Ala Asp Phe Leu Tyr Ala         195 200 205 Tyr Ser Thr Ala Pro Gly Tyr Tyr Ser Trp Arg Asn Ser Lys Asp Gly     210 215 220 Ser Trp Phe Ile Gln Ser Leu Cys Ala Met Leu Lys Gln Tyr Ala Asp 225 230 235 240 Lys Leu Glu Phe Met Ile Leu Thr Arg Val Asn Arg Lys Val Ala                 245 250 255 Thr Glu Phe Glu Ser Phe Ser Phe Asp Ala Thr Phe His Ala Lys Lys             260 265 270 Gln Ile Pro Cys Ile Val Ser Met Leu Thr Lys Glu Leu Tyr Phe Tyr         275 280 285 His Leu Glu His His His His His     290 295 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 30 aaggttcata tgtctggaat atccctggac aacag 35 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 31 gtggtgctcg aggtgataaa aatagag 27 <210> 32 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 32 gtggcccgct gggtgtgcgt ggtgttgatg atgacatggc gtgtc 45 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 33 caccacgcac acccagcggg ccacagtcca gttctgtacc ac 42 <210> 34 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 34 acaggccctc tgggtgtgcg tagtggtgtt gatgatgaca tggcgtg 47 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 35 actacgcaca cccagagggc ctgtctcaat gccacagtcc agttc 45 <210> 36 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 36 acaggtagcg gccctctggg tgtgcgtggc agtggtgttg atgatgac 48 <210> 37 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 37 actgccacgc acacccagag ggccgctacc tgtctcaatg ccacagtc 48 <210> 38 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 38 acaggcggta gcggccctct gggtgtgcgt ggcggtagtg gtgttgatg 49 <210> 39 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 39 actaccgcca cgcacaccca gagggccgct accgcctgtc tcaatgccac agtc 54 <210> 40 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 11 <400> 40 acaggtggcg gtagcggccc tctgggtgtg cgtggtggcg gtagtggtgt tgatg 55 <210> 41 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 12 <400> 41 actaccgcca ccacgcacac ccagagggcc gctaccgcca cctgtctcaa tgccacagtc 60                                                                           60

Claims (16)

MMP(Matrix metalloproteinases) 2에 의해 분해(cleavage)되는 아미노산 서열이 삽입되어 있는 링커(linker);를 포함하는 재조합 프로-카스파제(pro-Caspase)-3로서, 상기 링커는 GPLGVR, GIETGPLGVRS, GIETGSGPLGVRGS, GIETGGSGPLGVRGGS 및 GIETGGGSGPLGVRGGGS로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 프로-카스파제-3. 3. A recombinant pro-Caspase-3 comprising a linker inserted with an amino acid sequence cleaved by Matrix metalloproteinases (MMP) 2, wherein the linker is selected from the group consisting of GPLGVR, GIETGPLGVRS, GIETGSGPLGVRGS, GIETGGSGPLGVRGGS and GIETGGGSGPLGVRGGGS. 3. Recombinant pro-caspase-3. 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 링커는 상기 카스파제-3의 대단위체(large subunit) 및 소단위체(small subunit)를 연결하는 것을 특징으로 하는, 재조합 프로-카스파제(pro-Caspase)-3.2. The recombinant pro-caspase-3 according to claim 1, wherein the linker connects the large and small subunits of caspase-3. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 프로-카스파제-3는 추가적으로 정제용 또는 검출용 태그(tag)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 프로-카스파제(pro-Caspase)-3.2. The recombinant pro-caspase-3 according to claim 1, wherein the recombinant pro-caspase-3 further comprises a tag for purification or detection. 제 9 항에 있어서, 상기 태그는 His-태그, Flag-태그, HA-태그, GST-태그 및 GFP-태그로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 재조합 프로-카스파제(pro-Caspase)-3.10. The method according to claim 9, wherein the tag is at least one selected from the group consisting of a His tag, a Flag tag, an HA tag, a GST tag, and a GFP tag. ) -3. 다음을 포함하는 MMP(Matrix metalloproteinases) 2 활성 측정용 센서:
(a) 제 1 항, 제 4 항, 제 9 항 및 제 10 항 중 어느 한 항의 프로-카스파제(pro-Caspase)-3; 및
(b) MMP(Matrix metalloproteinases) 2에 의해 활성화된 프로-카스파제-3의 활성형에 대한 검출제.Sensors for measuring MMP (Matrix metalloproteinases) 2 activity including:
(a) the pro-Caspase-3 of any one of claims 1, 4, 9 and 10; And
(b) a detection agent for the active form of pro-caspase-3 activated by MMP (Matrix metalloproteinases) 2. 제 11 항에 있어서, 상기 (b)의 검출제는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 것을 특징으로 하는 센서.12. The sensor according to claim 11, wherein the detecting agent of (b) generates a detectable signal. 제 11 항에 있어서, 상기 (b)의 검출제는 형광성, 발광성 또는 발색성 검출제인 것을 특징으로 하는, 프로테아제 활성 측정용 센서.12. The sensor for measuring a protease activity according to claim 11, wherein the detecting agent (b) is a fluorescent, luminescent or coloring agent. 다음을 포함하는 MMP(Matrix metalloproteinases) 2 활성 측정용 키트:
(a) 제 1 항, 제 4 항, 제 9 항 및 제 10 항 중 어느 한 항의 프로-카스파제(pro-Caspase)-3; 및
(b) MMP(Matrix metalloproteinases) 2에 의해 활성화된 프로-카스파제-3의 활성형에 대한 검출제.A kit for measuring Matrix metalloproteinases (MMP) 2 activity comprising:
(a) the pro-Caspase-3 of any one of claims 1, 4, 9 and 10; And
(b) a detection agent for the active form of pro-caspase-3 activated by MMP (Matrix metalloproteinases) 2. 다음 단계를 포함하는 MMP(Matrix metalloproteinases) 2 활성 측정 방법:
(a) 제 1 항, 제 4 항, 제 9 항 및 제 10 항 중 어느 한 항의 프로-카스파제(pro-Caspase)-3에 활성을 측정하고자 하는 MMP(Matrix metalloproteinases) 2를 처리하는 단계; 및
(b) 상기 MMP(Matrix metalloproteinases) 2에 의해 분해되어 활성화된 상기 프로-카스파제-3의 활성형을 검출하는 단계.Method for measuring MMP (Matrix metalloproteinases) 2 activity comprising the steps of:
(a) treating MMPs (Matrix metalloproteinases) 2 to be assayed for activity with pro-Caspase-3 of any one of claims 1, 4, 9 and 10; And
(b) detecting the active form of the pro-caspase-3 degraded by the MMP (Matrix Metalloproteinases) 2 and activated. 제 15 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 프로-카스파제-3의 활성형 검출은 상기 활성형과 결합하는 검출제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.16. The method according to claim 15, wherein the detection of pro-caspase-3 active form of step (b) uses a detection agent that binds to the active form.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Int J Oncol., Vol. 40, No. 4, pp. 1210-1219 (2012.04.) *

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