KR101673553B1 - 단실 구조의 신규 하이드로젠 퍼옥사이드 센서의 합성방법과 이를 활용한 하이드로젠 퍼옥사이드 탐지법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단실 유도체의 새로운 용도에 대한 것으로, 구체적으로 단실 유도체가 활성산소종을 검출하는데 유용하게 활용될 수 있음을 밝힌 것이다. 본 발명의 제조 방법 및 이를 통해 제조된 다양한 단실 유도체는 활성산소종과 접촉시 방출 파장이 변화하므로, 이를 통하여 활성산소종의 존재 여부를 검출하는데 유용하게 활용될 수 있다. 따라서, 이러한 분자들은 시료내 존재하는 활성산소종의 존재를 용이하게 이미지화 하므로, 다양한 연구 및 산업적인 용도로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 단실 화합물을 이용한 신규한 화합물의 합성 및 이를 이용한 과산화 수소 검출 방법에 대한 것이다.
형광 화합물은 다양한 종류의 생체 효소의 활성을 측정하는 에세이 방법에서 이용되고 있다. 에세이 개발에서 시그널을 만드는 방법으로는 형광 기질의 색깔, 세기 변화를 측정하는 방법이나, 혹은 주변의 다른 형광체를 이용하여 FRET (Fluorescence resonance energy transfer) 방법으로 개발되어 오고 있다. 형광을 띄고 있는 화합물로서 특정 생리활성 물질과의 상호작용을 통해서 시그널을 만드는 화합물을 화학센서(Chemosensor)라 하는데, 생체 물질을 탐지한다는 의미에서 형광 프로브(Fluorescence probe)라고 부르기도 한다. 2000년 초기부터 형광 화합물의 구조특성을 이용한 형광 프로브의 개발이 본격화되었는데, 초기에는 이미 알려진 금속 킬레이터 등을 직접 공유결합으로 연결하는 접근법을 이용했다(J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 10124-10125). 그러나 여기에는 타겟 할 수 있는 분자의 종류가 제한적이라는 단점이 있었다.
이에 대안으로 제시된 연구법은 조합화학을 이용한 접근법으로 뉴욕대 연구팀은 DOFLA (diversity-oriented fluorescence library approach)라 명명하였다. 이들은 형광 화합물의 라이브러리를 합성하고 이들의 구조 다양성에 따라 특정 생체 분자를 인식하는 센서화합물을 개발하였다(Mol . BioSyst. 5, 411-421 (2009), J Am Chem Soc 131, 10077-10082 (2009). Angew Chem Int Edit 43, 6331-6335 (2004)). 현재까지 coumarin, dapoxyl, styryl, rosamine, hemicyanine bodipy 등의 구조에 대한 라이브러리를 개발하였고, 이들 중 특정 단백질, 지질과 상호작용하는 화합물이 개발된 바 있다.
한편, 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS)는 생체 시스템 속의 다양한 작용에 관여를 하는데, 그 중에서도 자유라디칼에 의한 노화 (Free radical theory of aging, FRTA) 및 질병 관련 메커니즘 연구에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 왔다(Science 2006, 312:1882-1883., Nat Mol Cell Biol 2007, 8:813-824.)(도 1 참조).
U.C. Berkeley 대학 Chang 연구팀에서는 다양한 활성산소 센서를 플루오레신 (Fluorescein), 란탄족 금속 배위 센서 (lanthanide chelating sensor), 덴드리머 구조체 (dendrimer based imaging probe)등을 개발해왔다. 하지만 단실(Dansyl) 구조의 하이드로젠 퍼옥사이드 센서는 아직까지 개발된 적이 없다. 본 연구자들은 새로운 하이드로젠 퍼옥사이드 센서를 개발하는 도중 단실 구조의 유도체 중 하나가 하이드로젠 퍼옥사이드 센서 분자의 기능을 함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Mol. BioSyst. 5, 411-421 (2009), J Am Chem Soc 131, 10077-10082 (2009). Angew Chem Int Edit 43, 6331-6335 (2004) 초록
본 발명은 단실 구조의 형광 화합물 라이브러리의 병렬 합성 제조 방법을 제시하고, 이 신규 화합물을 활용한 실시간 분자영상 프로브를 개발하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 그의 수화물 또는 그의 용매화물을 제공하는 것이다.
<화학식 1>
이때, 상기 화합물은 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)에 대한 탐지를 위한 형광 분자 영상 프로브로서 이용될 수 있다. 또한, 상기 화합물을 포함하는 활성산소종 검출용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "활성산소종"은 자유 라디칼(free radical)을 가지고 있어, 안정하지 못한 상태의 산소 분자를 의미한다. 또한, 상기 활성산소종은 슈퍼옥시드(O2-), 과산화수소(H2O2), 히드록시라디칼(OH), 과산화지질(lipid peroxide), 리트릭 올리드(rlitric olride, NO), 퍼록시니트리트(peroxinitrite, NO3 2-) 및 티올 퍼록시 라디칼(thiol peroxy radical, R-SO2 -) 등이 있을 수 있다. 바람직하게는, 상기 활성산소종은 과산화수소일 수 있다.
상기 활성 산소는 유기호흡을 하는 생물에 필수적인 산소가, 세포 내의 효소에 의해, 그리고 대부분의 전자 운반 과정 혹은 에너지대사 과정 중에 불완전하게 환원되거나 펩티드 성장인자, 사이토카인들 및 다양한 작용의 자극에 의해 발생될 수 있다. 이 활성산소종은 과잉 생산되면 생체에 대한 독성 즉, 산화적 손상(oxidative stress)을 가져온다 하여, 유해산소라고 명명되기도 한다. 세포내의 거대한 분자(단백질, 지질 등)를 산화시킴으로써 세포의 항상성을 파괴하고, 세포를 사멸시키는 등 세포조직 내에 치명적인 손상을 유발하며, 암, 근이형증, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 허혈성질환, 동맥경화증과 같은 다양한 퇴행성 질병의 원인 및 일반적인 노화와 관계가 있기 때문이다.
하지만 연구가 진행됨에 따라 활성산소종이 낮은 농도에 있어서는 세포내 신호전달 반응에 관여하는 2차 신호전달 물질(second messenger)임이 밝혀졌다. 이러한 2차 신호전달 물질은 오히려 유전자 발현, 세포 성장, 세포 분화, 분비, 세포 이동과 신경전달과정 등의 생리적 반응을 유도하는 기능을 갖는다. 따라서 세포 사멸을 유도하는 인자로 인식되어 왔던 활성산소가, 근래에 와서는 세포 사멸을 억제할 수도 있음이 확인되고 있다. 암세포에 있어서도 그 정상생리를 교란시켜 apoptosis를 유발할 수 있고, cell cycle arrest 효과를 나타내어 암세포수의 증식을 억제할 수 있기에, 활성 산소는 발암과 항암의 병리 과정에 공통으로 관여하는 양면성을 지니고 있다고 여겨지고 있다.
본 화합물은 생체내 또는 생체외에 존재하는 활성산소종을 검출하는데 활용될 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물은 활성산소종과 접촉시 분해되어 특정 파장의 형광을 방출하게 된다. 따라서, 활성산소종의 존재 여부를 용이하게 판단할 수 있다. 활성산소종의 검출을 위해 상기 화합물은 1 μM 내지 10 mM의 농도로 이용될 수 있다. 또한, 10 μM 내지 1 mM의 농도, 또는 100 μM 내지 500 μM의 농도로 이용될 수 있다. 사용 농도는 예측되는 활성산소종의 농도에 따라 다양할 수 있다.
또한, 상기 화합물은 일 구체예로 하기 반응식 1의 방법으로 합성될 수 있다.
<반응식 1>
상기 반응식 1과 같이 형광을 띄지 않는 단실 클로라이드(dansyl-chloride) 와 아민 화합물의 치환 반응을 통하여 형광을 띄는 단실 화합물을 제조할 수 있다. 상기와 같은 방법은 가열 반응을 통하여 수행된다. 즉, 단실-클로라이드로 표시되는 5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl chloride 화합물과 아민 화합물을 THF 상에 녹인 후 가열하면 상기 화학식 1의 생성물를 제조할 수 있다. 또한, 이러한 생성물은 컬럼크로마토그래피법을 사용하여 정제할 수 있다.
또 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물을 시료에 접촉하는 단계를 포함하는 과산화수소 검출 방법을 제공한다. 이때, 상기 시료는 활성산소종을 포함하고 있을 수 있다. 상기 시료는 인체로부터 얻어지는 혈액, 혈장, 세포 추출물일 수 있다. 또한, 상기 시료는 음식물, 물, 토양 등으로부터 채취될 수 있다. 또한, 상기 활성산소종은 과산화수소일 수 있다.
다음은 형광 여기(excitation)를 위한 광을 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 형광 여기를 위해 화합물에 조사되는 광의 파장은 300 nm 내지 400 nm일 수 있다. 또한, 상기 파장은 320 nm 내지 380 nm, 또는 340 nm 내지 360 nm 일 수 있다. 가장 바람직하게는 350 nm의 파장일 수 있다. 상기 광은 형광 여기를 위한 광원에서 방출되는 것이면, 어떠한 것이든 이용할 수 있다. 가장 바람직한 광원은 레이저 광원이 사용될 수 있다.
또한, 상기 검출 방법은 상기 화합물과 시료가 접촉한 후 방출되는 형광의 검출을 통해 수행되는 것일 수 있다. 상기 화합물이 활성산소종과 접촉하기 전에는 방출되는 파장은 528 nm 내지 535 nm일 수 있다. 바람직하게는 531 nm의 파장을 방출할 수 있다. 그러나, 상기 화합물이 활성산소종과 반응하게 되면 방출되는 파장이 변화하게 된다. 변화되어 방출되는 형광의 파장은 535 nm 내지 560 nm일 수 있다. 또한, 상기 파장은 538 nm 내지 550 nm, 또는 540 nm 내지 545 nm일 수 있다. 이러한 방출 파장의 변화의 확인하여 활성산소종의 존재 여부를 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명은 상기 5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl chloride 화합물로부터 반응식 1의 제조 단계를 통해 단실 유도체인. 5-(디메틸아미노)-N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보란-2-닐)벤질)나프탈렌-1-술폰아마이드 화합물을 합성할 수 있는 제조 방법과 이 화합물들을 이용한 H2O2 검출법을 제공한다. 이러한 합성법 및 분자 검출법은 신규 형광 화합물의 분자영상 및 에세이법 개발에 응용될 수 있다.
도 1은 현재까지 개발된 활성산소(ROS) 선택적인 형광 센세분자의 구조에 대한 예시이다.
도 2는 화학식 1의 화합물의 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 화학식 1의 화합물의 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 화학식 1의 화합물이 활성산소종과 반응시 방출 스펙트럼의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 화학식 1의 화합물의 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 화학식 1의 화합물의 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 화학식 1의 화합물이 활성산소종과 반응시 방출 스펙트럼의 변화를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 5-(디메틸아미노)-N-(4-(4,4,5,5-
테트라메틸
-1,3,2-
디옥사보란
-2-닐)벤질)나프탈렌-1-
술폰아마이드
(화합물 1)
<화학식 1>
둥근 바닥 플라스크에 5-(디메틸아미노)나프탈랜-1-술포닐 클로라이드 (4.7 mg, 0.0174 mmol) 를 넣고 질소로 충진 후 THF (18 ml, dried)를 넣어 충분히 녹인다. 2-아미노-4-클로로페놀을 THF 1ml에 녹인 후 천천히 첨가한다. 60℃ 로 가열하며 90 분동안 교반한다. 반응의 정도를 TLC를 이용하여 확인한다. 반응 완결 후 반응 혼합물을 즉시 감압증류로 용매를 제거한 후 관 크로마토그래피 (EtOAc : n-Hexane = 1 : 2) 를 통해 정제하여 5-(디메틸아미노)-N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보란-2-닐)벤질)나프탈렌-1-술폰아마이드 (6.0 mg, 수율 73.9%) 을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.56 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.30 (t, J = 8 Hz, 2H), 7.6 (m, 5H), 7.22 (d, J = 7.2 Hz 1H), 7.08 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.85 (t, J = 6 Hz, 1H), 4.11 (d, J = 6 Hz 2H), 2.93 (s, 6H), 1.35 (s, 12H).
실시예
2. 화합물의 광학특성
| λex (nm) | λem (nm) | |
| 화합물 1 | 338 | 531 |
흡광 스팩트럼은 1mM DMSO 상의 화합물 1 로부터 Flexstation (Molecular Device, Inc.)의 Abs-Spectrum 모드(250 nm - 750 nm)에서 3 nm 간격으로 얻었다 (도 2 참조). 또한, 형광 스팩트럼은 1 mM DMSO 상의 화합물-1 로부터 Flexstation의 Flu-Spectrum 모드(excitation 340 nm)에서 3 nm 간격으로 얻었다(도 3 참조).
실시예
3. 화합물의
H
2
O
2
검출 효과
<반응식 2>
화합물 1은 하이드로젠 퍼옥사이드와 반응하여 5-(디메틸아미노)-N-(4-하이드록시벤질)나프탈랜-1-설폰아마이드 를 형성하며 형광 특성의 변화를 갖게 된다.
형광 특성 변화 측정법은 하기와 같은 방법으로 수행하였다. 50 ul, 1 mM 화합물-1 DMSO 용액에 20 ul H2O 를 섞은 용액과 50 ul, 1 mM 화합물-1 DMSO 용액에 20 ul, 10 mM H2O2 의 형광 스팩트럼을 Flexstation (Molecular Device, Inc.)의 Flu-Spectrum 모드 (excitation 340 nm)에서 3 nm 간격으로 얻었다. 위의 실시예에서 보여주는 바와 같이 화합물-1의 형광 특성 중 색과 세기가 변화하였다. Emission maximum 파장의 값은 531 nm에서 540 nm로 길어졌으며, 형광 세기는 0.65배로 줄어들었다. 이 변화를 통해 하이드로젠 퍼옥사이드를 탐지하는 것이 가능함을 확인하였다(도 4 참조).
활성산소종 검출 기술은 지속적으로 개발이 되고 있으나, 여전히 다양한 형광 물질에 대한 개발이 요구되고 있다. 본 발명의 경우 단실 유도체 중 하나를 새로운 형광 이미징용 조성물로 이용 가능함을 규명함으로서, 형광 물질의 다양화를 가능하게 하였다. 이러한 분자는 다양한 종류의 시료로부터 활성산소종을 용이하게 검출하게 하므로, 다양한 연구 및 산업적인 용도로 활용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
Claims (6)
- 하기 화학식 1의 화합물, 그의 수화물 또는 그의 용매화물.
<화학식 1>
- 청구항 1의 화합물을 포함하는 활성산소종 검출용 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 활성산소종은 과산화수소인 것인 조성물.
- 청구항 1의 화합물을 시료에 접촉하는 단계를 포함하는 활성산소종을 검출하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 시료는 과산화수소를 포함하고 있는 것인 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 검출 방법은 상기 화합물과 시료가 접촉한 후 방출되는 형광의 검출을 통해 수행되는 것인 방법.
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Citations (1)
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
| 논문: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, 398, PP. 571-575, 2010 |
| 논문: PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY, 43, 2, PP. 133-131, 1986 |
| 논문: SCIENCE CHINA CHEMISTRY, 56, 11, PP. 1667-1670, 2013 |
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