KR101669142B1

KR101669142B1 - A novel adjuvant of vaccine for eye-drop vaccination

Info

Publication number: KR101669142B1
Application number: KR1020120112198A
Authority: KR
Inventors: 서경률
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2016-10-25
Also published as: KR20140046143A

Abstract

본 발명은 poly(I:C)를 포함하는 안약형 백신 아쥬반트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 poly(I:C)(Polyinosinic acid-polycytidylic acid)를 안구 접종시 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 아쥬반트로 사용하는 경우, CT와 유사한 수준의 우수한 항체 생성 증진 효과를 가지고, CT와 달리 세포독성 및 염증반응이 거의 없는 안정성을 가지고 있음을 확인함으로써, poly(I:C)는 안약형 인플루엔자 바이러스 백신의 아쥬반트로 유용하게 사용할 수 있다.The present invention relates to an ophthalmic vaccine adjuvant comprising poly (I: C), and more particularly to an ophthalmic vaccine adjuvant comprising a poly (I: C) polyunosinic acid-polycytidylic acid as an adjuvant to an influenza virus antigen (I: C) was found to be effective as an anti-infective agent for influenza vaccine against influenza virus, which has excellent cytotoxic effect and similar cytotoxic and inflammatory response. You can use it as a bonus.

Description

안약형 백신의 신규 아쥬반트{A novel adjuvant of vaccine for eye-drop vaccination}A novel adjuvant for vaccine for eye-drop vaccination,

본 발명은 poly(I:C)를 안약형 백신 아쥬반트로 사용하는 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to the use of poly (I: C) as an ophthalmic vaccine adjuvant.

점막 면역을 강화함에 의한 면역 반응을 유도하는 백신은 감염이 발생하기 이전에 병원체를 표적화하는 효과적인 방법이다(비특허문헌 1 및 2). 점막 백신 접종은, 비경구 백신 접종과 대조적으로, 대부분의 감염성 병원체의 침입의 입구에서 시스템 및 점막 면역 반응, 주로 분비형 IgA(sIgA) 항체들을 모두 유도할 수 있기 때문에 특별히 주목받는다(비특허문헌 3). 백신 개발은 전세계 여행의 시대에서 급속한 질환의 확산에 비해 뒤떨어져 있다. 점막 백신 접종은 투여가 용이하고 특별한 훈련이 요구되지 않으며, 이는 새로운 병원체가 대유행이 되기 이전에 억제하는 전략이다. Vaccines that induce immune responses by enhancing mucosal immunity are effective methods for targeting pathogens prior to infection (Non-Patent Documents 1 and 2). Mucosal vaccination is of particular interest because it can induce systemic and mucosal immune responses, mainly secretory IgA (sIgA) antibodies, at the entrance of most infectious pathogens, in contrast to parenteral vaccination 3). Vaccine development is lagging behind the rapid spread of disease in the age of travel around the world. Mucosal vaccination is easy to administer and requires no special training, which is a strategy to stop new pathogens before they become pandemic.

이러한 점막 면역의 특징은 유도조직과 실행조직으로 구성되는 점막 면역 경로를 통해 지금까지의 주사제를 통한 면역 유도로는 획득할 수 없었던 점막 조직과 그 분비액 중에 항원-특이적 면역반응을 유도할 수 있다는 점이다. 최근 문제가 되고 있는 대부분의 감염원이 호흡기, 소화기, 생식기 등의 점막을 통해서 침입하는 것을 고려할 때, 그 침입통로에 효과적인 면역방어를 구축하는 일은 매우 중요하다. 이와 같이 점막 면역체계를 이용한 감염 예방 대책의 개발이 최근 많은 주목을 받고 있다.These features of mucosal immunity are that the mucosal immune pathway, which consists of the inducible and the active tissues, can induce antigen-specific immune responses in mucosal tissues and their secretions It is a point. Considering that most of the infectious agents in recent years are infiltrating through the mucous membranes of the respiratory, digestive, and reproductive tracts, it is very important to establish an effective immune defense for the invading pathways. Thus, the development of infection prevention measures using the mucosal immune system has received much attention in recent years.

그러나, 점막 백신 접종의 경우, 주로 분비형 IgA(SIgA) 항체를 통해 면역반응이 유도되는데, 백신 투여 속도가 질병 진행속도를 따라가지 못한다면, 백신 투여를 통한 예방효과가 충분히 발현되지 못할 위험이 있다. 광역 유행성 질환이 대량의 가축에 전염되는 경우, 백신투여를 신속하게 하는 것이 필요하고, 이를 위해서는 특별한 기술이 없이도 용이하게 투여가 가능하고, 동시에 백신 투여의 효과가 충분히 발현될 수 있어야 한다. 그러나, 점막 투여 루트 중의 하나인 비강 접종의 경우 항원이 중추신경계로 침투할 위험이 있어 바람직하지 못하다.
However, in the case of mucosal vaccination, an immune response is mainly induced by secretory IgA (SIgA) antibody. If the vaccine administration rate does not follow the disease progression rate, there is a risk that the vaccine preventive effect can not be sufficiently expressed . When a wide-area epidemic disease is transmitted to a large number of livestock, it is necessary to expedite the administration of the vaccine. For this purpose, it is possible to administer the vaccine easily without any special technique, and at the same time, the effect of the vaccine administration should be sufficiently exhibited. However, nasal inoculation, one of the mucosal routes of administration, is undesirable because of the risk of the antigen penetrating into the central nervous system.

안구 점막은 환경성 항원들 및 대부분의 외부 눈 표면을 차지하는 감염성 물질들에 대한 중요한 침입 부위이기 때문에 점막 백신을 위한 가능한 경로이다(비특허문헌 4-6). 안구 점막의 부분인 결막은 다른 점막 조직과 마찬가지로 면역학적 특징을 가진다. 결막은 상피에 CD8+ T 세포가 있고, 프로프리아층에 CD4+ 및 CD8+ T 세포, B 세포 및 비만세포를 동등한 비율로 있으며, 수지상세포(DC) 및 랑게르한스 세포가 있다(비특허문헌 7 및 8). 이런 결막은 외부 환경에 노출되어 있고 다른 점막 부분의 많은 공통된 면역학적 특징을 공유하고 있는 점막 장벽의 부위이다. 이전 연구에서는 새 및 소 모델에서 아이드롭(eyedrop) 백신 접종에 의한 성공적인 보호를 보였다(비특허문헌 9 및 10). 그러나, 원하는 면역 반응의 유도 메커니즘, 및 결막 및 비강(i.n.) 경로의 시스템적 비교는 아직 설명하지 못하고 있다(비특허문헌 11-13).
The ocular mucosa is a viable pathway for mucosal vaccines because it is an important site of entry for environmental antigens and infectious agents that occupy most of the external eye surface (Non-Patent Documents 4-6). The conjunctiva, which is part of the ocular mucosa, has immunologic features similar to other mucosal tissues. The conjunctiva has CD8 + T cells in the epithelium, and the proliferation layer has equivalent ratios of CD4 + and CD8 + T cells, B cells and mast cells, and dendritic cells (DC) and Langerhans cells (Non-Patent Documents 7 and 8). These conjunctiva are areas of the mucosal barrier that are exposed to the external environment and share many common immunological features of other mucosal parts. Previous studies have shown successful protection by eyedrop vaccination in new and small models (Non-Patent Documents 9 and 10). However, the systematic comparison of the induction mechanism of the desired immune response and the conjunctival and nasal passages has not been described yet (Non-Patent Documents 11-13).

지금까지 기존의 인플루엔자 바이러스 백신(influenza virus vaccine) 접종은 피하 및 비강을 통해 접종했으며, 사(死)백신의 눈으로의 접종 후 인플루엔자 바이러스에 대한 면역력 유발은 보고된 바가 없다. 또한 눈을 통한 인플루엔자 바이러스 백신 접종 시 특정 눈에서 보이는 백신 사용에 따른 아쥬반트에 대한 효과와 안전성을 보고한 사례가 없다. 또한, 점막 백신에 가장 좋은 효과를 보이는 아쥬반트인 CT(cholera toxin)는 비강점막 접종 시 CNS 손상과 염증 유발의 단점이 많이 보고되고 있다. 따라서 CT 이외의 CT 만큼 효과적이지만 안전한 안구 점막용 아쥬반트를 개발할 필요가 요구되고 있다.
Until now, the influenza virus vaccine has been inoculated subcutaneously and nasally, and there has been no reported case of influenza virus immunization after eye vaccination with dead vaccine. There is no report on the efficacy and safety of adjuvant due to the use of certain visible vaccines for influenza virus vaccination through the eye. In addition, cholera toxin (CT), which is the most effective adjuvant for mucosal vaccine, has been reported to cause CNS damage and inflammation during nasal mucosal inoculation. Therefore, there is a need to develop an effective, but safe, ocular mucosal adjuvant as CT other than CT.

이에, 본 발명자들은 새로운 안구 점막용 안약백신 아쥬반트를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 안구 점막에 점안시 poly(I:C)(Polyinosinic acid-polycytidylic acid)가 인플루엔자 바이러스 백신에 대한 아쥬반트로 사용하는 경우, CT와 유사한 우수한 항체 생성 증진 효과를 가지고, CT와 달리 염증반응이 거의 없는 안정성을 가지고 있음을 확인함으로써, poly(I:C)를 안구 점막용 인플루엔자 바이러스 백신의 아쥬반트로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
The present inventors have made intensive efforts to develop a novel ophthalmic vaccine adjuvant for ocular mucosa. As a result, the present inventors have found that poly (I: C) (polyunosinic acid-polycytidylic acid) is used as an adjuvant for influenza virus vaccine (I: C) can be used as an adjuvant for influenza virus vaccines for ocular mucosa by confirming that it has excellent antibody production enhancing effect similar to CT and has almost no inflammatory reaction stability unlike CT The present invention has been completed.

Brandtzaeg, P., and R. Pabst. 2004. Let’s go mucosal: communication on slippery ground. Trends Immunol. 25: 570-577.Brandtzaeg, P., and R. Pabst. 2004. Let's go mucosal: communication on slippery ground. Trends Immunol. 25: 570-577. Holmgren, J., and C. Czerkinsky. 2005. Mucosal immunity and vaccines. Nat. Med. 11(4, Suppl)S45-S53.Holmgren, J., and C. Czerkinsky. 2005. Mucosal immunity and vaccines. Nat. Med. 11 (4, Suppl) S45-S53. Yuki, Y., and H. Kiyono. 2003. New generation of mucosal adjuvants for the induction of protective immunity. Rev. Med. Virol. 13: 293-310. Yuki, Y., and H. Kiyono. 2003. New generation of mucosal adjuvants for the induction of protective immunity. Rev. Med. Virol. 13: 293-310. Chandler, J. W., and T. E. Gillette. 1983. Immunologic defense mechanisms of the ocular surface. Ophthalmology 90: 585-591.Chandler, J. W., and T. E. Gillette. 1983. Immunologic defense mechanisms of the ocular surface. Ophthalmology 90: 585-591. Franklin, R. M. 1989. The ocular secretory immune system: a review. Curr. Eye Res. 8: 599-606.Franklin, R. M. 1989. The ocular secretory immune system: a review. Curr. Eye Res. 8: 599-606. Montgomery, R. D., W. R. Maslin, C. R. Boyle, T. Pledger, and C. C. Wu. 1991. Effects of an Arkansas strain of infectious bronchitis vaccine on the headassociated lymphoid tissue (HALT). Avian Dis. 35: 302-307.Montgomery, R. D., W. R. Maslin, C. R. Boyle, T. Pledger, and C. C. Wu. 1991. Effects of an Arkansas strain of infectious bronchitis vaccine on the headassociated lymphoid tissue (HALT). Avian Dis. 35: 302-307. Sacks, E. H., R. Wieczorek, F. A. Jakobiec, and D. M. Knowles, II. 1986. Lymphocytic subpopulations in the normal human conjunctiva. A monoclonal antibody study. Ophthalmology 93: 1276-1283.Sacks, E. H., R. Wieczorek, F. A. Jakobiec, and D. M. Knowles, II. 1986. Lymphocytic subpopulations in the normal human conjunctiva. A monoclonal antibody study. Ophthalmology 93: 1276-1283. Rodrigues, M. M., G. Rowden, J. Hackett, and I. Bakos. 1981. Langerhans cells in the normal conjunctiva and peripheral cornea of selected species. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 21: 759-765.Rodrigues, M. M., G. Rowden, J. Hackett, and I. Bakos. 1981. Langerhans cells in the normal conjunctiva and peripheral cornea of selected species. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 21: 759-765. Jayawardane, G. W., and P. B. Spradbrow. 1995. Mucosal immunity in chickens vaccinated with the V4 strain of Newcastle disease virus. Vet. Microbiol. 46: 69-77.Jayawardane, G. W., and P. B. Spradbrow. 1995. Mucosal immunity in chickens vaccinated with the V4 strain of Newcastle disease virus. Vet. Microbiol. 46: 69-77. Zundel, E., J. M. Verger, M. Grayon, and R. Michel. 1992. Conjunctival vaccination of pregnant ewes and goats with Brucella melitensis Rev 1 vaccine: safety and serological responses. Ann. Rech. Vet. 23: 177-188.Zundel, E., J. M. Verger, M. Grayon, and R. Michel. 1992. Conjunctival vaccination of pregnant ewes and goats with Brucella melitensis Rev 1 vaccine: safety and serological responses. Ann. Rech. Vet. 23: 177-188. Nesburn, A. B., T. V. Ramos, X. Zhu, H. Asgarzadeh, V. Nguyen, and L. BenMohamed. 2005. Local and systemic B cell and Th1 responses induced following ocular mucosal delivery of multiple epitopes of herpes simplex virus type 1 glycoprotein D together with cytosine-phosphate-guanine adjuvant. Vaccine 23: 873-883.Nesburn, A. B., T. V. Ramos, X. Zhu, H. Asgarzadeh, V. Nguyen, and L. Ben Mohamed. 2005. Local and systemic B cell and Th1 responses induced following ocular mucosal delivery of multiple epitopes of herpes simplex virus type 1 glycoprotein D together with cytosine-phosphate-guanine adjuvant. Vaccine 23: 873-883. Muneta, Y., I. S. Panicker, A. Kanci, D. Craick, A. H. Noormohammadi, A. Bean, G. F. Browning, and P. F. Markham. 2008. Development and immunogenicity of recombinant Mycoplasma gallisepticum vaccine strain ts-11 expressing chicken IFN-g. Vaccine 26: 5449-5454.Muneta, Y., I. S. Panicker, A. Kanci, D. Craick, A. H. Noormohammadi, A. Bean, G. F. Browning, and P. F. Markham. 2008. Development and immunogenicity of recombinant Mycoplasma gallisepticum vaccine strain ts-11 expressing chicken IFN-g. Vaccine 26: 5449-5454. Corner, L. A., and B. M. Buddle. 2005. Conjunctival vaccination of the brushtail possum (Trichosurus vulpecula) with bacille Calmette-Gue´rin. N. Z. Vet. J. 53: 133-136.Corner, L. A., and B. M. Buddle. 2005. Conjunctival vaccination of the brushtail possum (Trichosurus vulpecula) with bacille Calmette-Gue'rin. N. Z. Vet. J. 53: 133-136.

본 발명의 목적은 poly(I:C)를 포함하는 안약형 백신 아쥬반트 조성물, 및 상기 아쥬반트를 포함하는 안약형 백신을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide an ophthalmic vaccine adjuvant composition comprising poly (I: C), and an ophthalmic vaccine comprising said adjuvant.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 poly(I:C)를 포함하는 안약형 백신 아쥬반트을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an ophthalmic vaccine adjuvant comprising poly (I: C).

또한, 본 발명은 i) poly(I:C); 및 ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을 포함하는 안약형 백신을 제공한다.The present invention also relates to a composition comprising i) poly (I: C); And ii) a subunit antigen or an inactivated antigen of the pathogen.

또한, 본 발명은 i) poly(I:C); 및 ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을 포함하는 백신을 개체의 안구에 투여하는 것을 포함하는 안구 면역을 유도하는 방법을 제공한다.The present invention also relates to a composition comprising i) poly (I: C); And ii) administering to the individual's eye a vaccine comprising a subunit antigen or an inactivated antigen of the pathogen.

아울러, 본 발명은 i) poly(I:C); 및 ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을 포함하는 백신, 및 상기 백신의 안구 투여방법, 투여량 또는 투여횟수 등에 관한 설명서를 포함하는 안약형 백신용 키트를 제공한다.
In addition, the present invention relates to a composition comprising i) poly (I: C); And ii) a vaccine comprising a subunit antigen or an inactivated antigen of a pathogen, and instructions on an ocular administration method, dose, or administration frequency of the vaccine, and the like.

본 발명은 poly(I:C)를 인플루엔자 바이러스 백신의 안구 접종시 아쥬반트로 사용하는 경우, CT와 유사한 우수한 항체 생성 증진 효과를 가지고, CT와 달리 세포독성 및 염증반응이 거의 없는 안정성을 가지고 있음을 확인함으로써, poly(I:C)를 안약형 인플루엔자 바이러스 백신의 유용한 아쥬반트로 사용할 수 있음을 제공한다. 따라서, 본 발명은 지금까지 CT가 점막을 통해 면역성을 유발시키는 아쥬반트 중 가장 효과적인 제재로 알려져 있으나 세포독성을 가지고 염증을 일으키는 부작용을 가지고 있는 문제점이 있었는데, CT를 대신해서 poly(I:C)가 인플루엔자 바이러스를 포함한 다양한 백신의 아쥬반트로 유용하게 사용할 수 있음을 제공한다.
When poly (I: C) is used as an adjuvant in the inoculation of an influenza virus vaccine, the present invention has excellent cytotoxic and cytotoxic and inflammatory response stability similar to that of CT , The poly (I: C) can be used as a useful adjuvant for an influenza A virus vaccine. Therefore, the present invention has been known as the most effective agent of adjuvant which induces immunity through mucous membrane. However, the present invention has a problem in that it has side effects that cause cytotoxicity and inflammation. Instead of CT, poly (I: C) Can be usefully used as adjuvants for a variety of vaccines, including influenza viruses.

도 1은 BALB/c 마우스 안구 점막에 PBS 또는 OVA 단독, 및 각종 아쥬반트(CT, poly(I:C), MPLA, Alum)를 함께 점안한 후, 혈청 및 점막 조직 세척액에서 OVA 특이적인 항체 생성 증가를 ELISA를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 BALB/c 마우스 안구 점막에 PBS 또는 OVA 단독, 및 각종 아쥬반트(CT, poly(I:C), MPLA, Alum)를 함께 점안한 후, 혈청 및 점막 조직 세척액에서 HA 특이적인 항체 생성 증가를 ELISA를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 BALB/c 마우스의 눈에 10 ug poly(I:C)와 0.1 ~ 2 ug의 HA 백신 항원을 2주 간격으로 두 번 안구 점막에 접종한 후 ELISA로 항 HA 항체 생성 효과를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 BALB/c 마우스의 눈에 1 ug의 HA 백신 항원을 1 ~ 30ug poly(I:C)와 함께 2주 간격으로 두 번 안구 점막에 접종한 후 마지막 접종 2주 후 혈청과 점막 세척액에서 각각의 HA 특이 IgG와 IgA 항체 생성 효과를 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, HA 단독 그룹과 비교하여 '*': p < 0.05, '**': p < 0.01, '***': p < 0.001의 유의성을 나타내고, HA + 1ug poly(I:C) 그룹과 비교하여 '†': p < 0.05의 유의성을 나타내며, 'n.s.'는 두 그룹 간에 유의적 차이가 없는 것을 나타낸다.
도 5는 6 ~ 8주령의 BALB/c 마우스의 눈에 1 ug의 HA 백신 항원을 1 ug 또는 10 ug poly(I:C)와 함께 2주 간격으로 두 번 안구점막 또는 비강점막에 접종한 후, 마지막 접종 2주 후 혈청과 점막 세척액에서 각각의 HA 특이 IgG와 IgA 항체 생성 효과를 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, HA 단독 그룹과 비교하여 '*': p < 0.05, '**': p < 0.01의 유의성을 나타내고, HA + 1 ug poly(I:C)_eye 그룹과 비교하여 '§': p < 0.05, '§§§': p < 0.001의 유의성을 나타내며, 'n.s.'는 두 그룹 간에 유의적 차이가 없는 것을 나타낸다.
도 6은 6 ~ 8주령의 BALB/c 마우스의 눈에 1 ug의 인플루엔자 A 바이러스 H1N1의 분할 백신 항원을 1 ug 또는 10 ug poly(I:C)와 함께 2주 간격으로 두 번 안구 점막 또는 비강 점막에 접종한 후, 마지막 접종 2주 후 혈청과 점막 세척액에서 각각의 H1N1 특이 IgG와 IgA 항체 생성 효과를 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, H1N1 단독 그룹과 비교하여, '†': p < 0.05, '††': p < 0.01의 유의성을 나타내고, H1N1 + 1 ug poly(I:C)_eye 그룹과 비교하여 '§': p < 0.05의 유의성, '§§': p < 0.001의 유의성을 나타내며, 'n.s.'는 두 그룹 간에 유의적 차이가 없는 것을 나타낸다.
도 7은 6 ~ 8주령의 BALB/c 마우스의 눈에 PBS, HAs 단독, 및 HAs+poly(I:C)를 각각 안구 점막에 접종한 후, 결막 조직(conjunctival tissue)에서 세포를 얻은 후 CD8α 및 CD11c를 염색한 후 유세포분석기를 이용하여 세포분포 변화를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 6 ~ 8주령의 BALB/c 마우스의 눈에 1 ug의 HA 백신 항원 단독, 항원 + 10g poly(I:C), 및 항원 + CT를 각각 안구 점막에 접종한 후, 각 시간별(1h, 6h, 12h, 24h)로 조직에서 총 RNA를 추출한 후에 역전사 RNA로 cDNA를 합성한 다음, 이를 주형으로 사용하여 IL-1alpha와 TNF-alpha의 mRNA 발현 증가 여부를 실시간(real-time) PCR로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.FIG. 1 is a graph showing the results of OVA-specific antibody production in serum and mucosal tissue washings after PBS or OVA alone and various adjuvants (CT, poly (I: C), MPLA, And the increase was measured using an ELISA.
FIG. 2 is a graph showing the results of immunohistochemical staining of BALB / c mouse ocular mucosa with PBS or OVA alone and various adjuvants (CT, poly (I: C), MPLA, And the increase was measured using an ELISA.
FIG. 3 shows the results of ELISA for the production of anti-HA antibody after inoculation of 10 ug of poly (I: C) and 0.1 ~ 2 ug of HA vaccine antigen in the eye of BALB / Fig.
FIG. 4 shows the results of immunization of two BALB / c mice with 1 ug HA vaccine antigen (1 ~ 30 ug poly (I: C) Specific IgG and IgA antibody production by ELISA. At this time, the significance of '*': p <0.05, '**': p <0.01, '***': p <0.001, HA + 1ug poly (I: C) '†': p <0.05, and 'ns' indicates no significant difference between the two groups.
Figure 5 shows the results obtained after inoculation of ocular mucosa or nasal mucosa twice a week with 1 ug or 10 ug poly (I: C) of 1 ug HA vaccine antigen at 6 to 8 weeks of age in BALB / c mice , And the results of measurement of the HA specific IgG and IgA antibody production by ELISA in serum and mucosal washing solution two weeks after the last inoculation. In comparison with HA alone group, '*': p <0.05, '**': significance of p <0.01 and '§' as compared with HA + 1 ug poly (I: C) 0.05, '§§§': p <0.001, and 'ns' indicates that there is no significant difference between the two groups.
FIG. 6 is a graph showing the effect of 1 ug of influenza A virus H1N1 split vaccine antigen in 6 to 8 weeks old BALB / c mice with 1 ug or 10 ug of poly (I: C) The results are shown in the graphs showing the results of measurement of the H1N1-specific IgG and IgA antibody production effects in the sera and mucosal washing solution after the inoculation on the mucosa and 2 weeks after the last inoculation by ELISA. Compared to H1N1 alone group, '†': p <0.05, '††': p <0.01 compared to H1N1 alone group, and '§': p <0.05, significance of '§§': p <0.001, and 'ns' represents no significant difference between the two groups.
FIG. 7 shows the results obtained by inoculating PBS, HAs alone, and HAs + poly (I: C) into the ocular mucosa of eyes of 6 to 8 weeks old BALB / c mice and then obtaining cells from conjunctival tissues, &Lt; / RTI > and CD11c, and then analyzed for changes in cell distribution using a flow cytometer.
Fig. 8 shows the results obtained by inoculating 1 ug HA vaccine antigen alone, antigen + 10 g poly (I: C), and antigen + CT into the ocular mucosa, respectively, in 6 to 8 weeks old BALB / , 6h, 12h, 24h), cDNA was synthesized with reverse transcriptase, and then RT-1alpha and TNF-alpha mRNA expression was measured using real-time PCR And FIG.

이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 정의한다.
Hereinafter, terms used in the present invention are defined.

본 발명에서 "백신" 이란 용어는 본원에서, 보통 감염성 인자 또는 감염성 인자의 일부를 포함하는 항원성 현탁액 또는 용액으로서, 체내에 투여할 경우 활성 면역성을 일으키는 것을 일컫는다. 백신을 구성하는 항원성 부분으로는, 미생물체(예를 들어, 바이러스 또는 세균 등) 또는 미생물체로부터 정제된 천연 물질, 합성 또는 유전자 조작 단백질, 펩티드, 다당류 또는 유사 물질이 될 수 있다. 생백신의 예로는, BCG, 천연두 백신, 소아마비, 수두, 홍역, 풍진, 유행성 이하선염, 우역(rinderpest), NDV, 마렉병(Marek's disease) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 사백신에는, 백일해, 디프테리아(톡소이드), 파상풍균(톡소이드), 인플루엔자, 일본 뇌염 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.The term "vaccine" as used herein refers to an antigenic suspension or solution, usually comprising an infectious agent or part of an infectious agent, which causes active immunity when administered into the body. The antigenic portion constituting the vaccine can be a natural substance purified from a microorganism (e.g., a virus or a bacterium) or a microorganism, a synthetic or genetically modified protein, a peptide, a polysaccharide or the like. Examples of live vaccines include, but are not limited to, BCG, smallpox vaccines, poliomyelitis, varicella, measles, rubella, mumps, rinderpest, NDV, Marek's disease. The vaccine includes, but is not limited to, pertussis, diphtheria (toxoid), tetanus (toxoid), influenza, Japanese encephalitis and the like.

본 발명에서 "불활성화된 항원" 이란 용어는 감염성이 제거된 항원으로서 백신 항원으로 사용되는 항원을 말한다. 그러한 항원에는, 완전 바이러스 입자인 비리온, 불완전 바이러스 입자, 비리온-구성 입자, 바이러스 비(非)-구성 단백질, 감염을 방지하는 항원, 중화 반응 에피토프 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 상기 "불활성화된 항원" 이란 용어는 감염성은 제거되었으나 면역원성은 보유하는 항원을 말한다. 그런 항원이 백신으로 사용될 때, 이를 "사백신" 이라 부른다. 그런 불활성화된 항원의 예에는, 물리적(예컨대, X-선 조사, 열, 초음파), 화학적(포르말린, 수은, 알코올, 염소) 또는 기타 방법에 의해 불활성화된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. In the present invention, the term " inactivated antigen "refers to an antigen used as a vaccine antigen as an antigen whose infectivity has been removed. Such antigens include, but are not limited to, virions, virion, incomplete virus particles, virion-constituent particles, virus non-constituent proteins, antigens to prevent infection, neutralization reaction epitopes, and the like. The term "inactivated antigen" refers to an antigen that has been removed from infectivity but retains immunogenicity. When such an antigen is used as a vaccine, it is called "vaccine". Examples of such inactivated antigens include, but are not limited to, those that are inactivated by physical (e.g., x-ray irradiation, thermal, ultrasonic), chemical (formalin, mercury, alcohol, chlorine)

본 발명에서 "서브유닛 항원" 이란 용어는 자연 발생적 바이러스와 같은 병원체로부터 정제되거나, 또는 합성 또는 재조합 기술로 제조될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있고 통상적으로 이용되며, 시판되는 장비, 시약, 벡터 등을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 경우, 서브유닛 항원은 바람직하게는 입자의 표면에 노출된 분자, 예컨대 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), 매트릭스(M1, M2), 비-구조물(non-structures, NS), 폴리머라제 (PB1, PB2: 염기성 폴리머라제 1 과 2, 산성 폴리머라제 (PA)), 및 핵 단백질 (NP)이다. HA는 15 종류로 나타나고, NA는 9 종류로 나타난다고 알려져 있으며, 그 종류가 변하면 신균주가 발생될 수 있다.In the present invention, the term "subunit antigen" may be purified from pathogens such as naturally occurring viruses, or may be produced by synthetic or recombinant techniques. Such methods are well known and commonly used in the art and can be performed using commercially available equipment, reagents, vectors, and the like. For example, in the case of influenza virus, the subunit antigen is preferably a molecule exposed to the surface of the particle, such as hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), matrix (M1, M2) Non-structures (NS), polymerases (PB1, PB2: basic polymerases 1 and 2, acidic polymerases (PA)), and nuclear proteins (NP). There are 15 kinds of HA and 9 kinds of NA. It is known that when the kind is changed, a new strain is generated.

본 발명에서 "아쥬반트(보강제)" 란 용어는 투여된 면역원과 함께 혼합할 경우, 면역 반응을 증가 내지는 변화시키는 물질을 일컫는다. "아쥬반트(보강제)"란 용어는 항원과 혼합할 경우 항체 생성을 증가시키고, 면역 반응을 증강시키는 물질을 총칭하여 일컫는다. 더 신속하거나, 더 강력한 또는 지속적인 반응을 유발하기 위해서는 아쥬반트를 통상의 백신 항원과 함께 사용할 것이 요구된다. 따라서, 항원 공급이 제한되거나 항원 생산에 비용이 많이 드는 경우에도 아쥬반트가 유용하다. 아쥬반트는 무기물, 박테리아성, 식물성, 합성 물질, 또는 숙주 물질로 분류될 수 있다.The term " adjuvant "in the present invention refers to a substance that increases or changes an immune response when mixed with an administered immunogen. The term " adjuvant "refers collectively to substances that, when mixed with an antigen, increase antibody production and enhance the immune response. To induce a faster, more potent, or sustained response, it is desirable to use adjuvants with conventional vaccine antigens. Thus, adjuvants are useful even when the antigen supply is limited or the cost of antigen production is high. The adjuvant can be classified as inorganic, bacterial, vegetable, synthetic, or host material.

본 발명에서 "CT"란 용어는 비브리오 콜레라에 의해 생성되는 외독소를 말하며, 이는 비브리오 콜레라 감염으로 인한 설사 증상의 원인 물질이다. 콜레라 독소가 효과적인 아쥬반트로 사용되긴 하나, 그 독성 때문에 임상적 적용 방법은 발견되지 않았다. 따라서, CT는 보통 효과적인 백신용 아쥬반트를 찾을 때 양성 대조군으로서 이용된다.The term "CT" in the present invention refers to an exotoxin produced by V. cholera, which is a causative agent of diarrhea caused by V. cholera infection. Although the cholera toxin is used as an effective adjuvant, no clinical application has been found due to its toxicity. Thus, CT is usually used as a positive control when looking for an effective vaccine adjuvant.

본 발명에서 "Poly(I:C)" 란 용어는 폴리이노신산(pI) 및 폴리시티딜산(pc) 을 포함하는 이중-가닥 RNA를 말한다.In the present invention, the term " Poly (I: C) "refers to a double-stranded RNA comprising polyinosinic acid (pI) and poly-cytidyl acid (pc).

본 발명에서 "점막 투여" 란 용어는 점막을 통한 투여 형태를 말한다. 여기서, 점막은 속이 빈 기관, 특히 척추 동물의 신체 외부와 소통하는 기관의 내벽을 말한다. In the present invention, the term " mucosal administration "refers to a mode of administration through the mucosa. Here, the mucous membrane refers to the inner wall of the hollow organ, particularly the organs communicating with the outside of the body of the vertebrate.

본 발명에서 "병원체" 란 용어는 숙주에서 질병 또는 장애를 일으킬 수 있는 유기체를 말한다. 인간 병원체의 예에는, 바이러스, 박테리아, 원생동물, 리케차, 클라미디아, 진균 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 백신으로 효과를 볼 수 있는 병원체에는, 통상적으로 바이러스, 박테리아 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.The term "pathogen" as used herein refers to an organism capable of causing disease or disorder in a host. Examples of human pathogens include, but are not limited to, viruses, bacteria, protozoa, rickettsia, chlamydia, fungi, and the like. Pathogens that can be effective with vaccines include, but are not limited to, viruses, bacteria, and the like.

본 발명에서 "분비성 IgA 를 생성하기에 충분한 농도" 란 어구는 아쥬반트 또는 백신 그 자체의 능력, 즉 투여 후 면역 반응의 개시시 분비성 IgA를 생성시키는 아쥬반트 또는 백신 그 자체의 농도를 말한다. 상기 농도는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 달성할 수 있다.As used herein, the phrase "sufficient concentration to produce secretory IgA" refers to the ability of the adjuvant or vaccine itself, i.e. the concentration of the adjuvant or vaccine itself which produces IgA secreted at the onset of the post-administration immune response . The concentration can be achieved in vitro or in vivo using methods known in the art.

본 발명에서 "분비성 IgA" 란 용어는 분비되는 IgA를 일컫는다. IgA는 외분비액 내의 주요 면역글로불린으로서, 점막 표면상의 감염을 막는 데 도움이 된다. 상기 IgA는 타액, 콧물, 및 장, 기관(氣管) 등에서 분비된 체액, 또는 초유에서 풍부하게 발견되지만, 혈청에도 존재한다.In the present invention, the term "secretory IgA" refers to secreted IgA. IgA is the major immunoglobulin in the secretory fluid and helps prevent infection on the mucosal surface. The IgA is found abundantly in saliva, runny nose, and body fluids secreted from intestines, organs, or colostrum, but also in serum.

본 발명에서 "투여"란 용어는 본 발명의 백신 또는 이를 함유한 약학적 조성물을 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 치료 대상 숙주에 공급하는 것을 의미한다. 상기 백신 또는 조성물을, 예컨대 혼합 상태로 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
The term "administration" in the present invention means supplying the vaccine of the present invention or a pharmaceutical composition containing the vaccine, alone or in combination with another therapeutic agent, to the host to be treated. The vaccine or composition can be administered, for example, in a mixed state, either simultaneously or sequentially.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 poly(I:C)를 포함하는 안약형 백신 아쥬반트 조성물을 제공한다.The present invention provides an ophthalmic vaccine adjuvant composition comprising poly (I: C).

상기 병원체는 인플루엔자 바이러스인 것이 바람직하고, A/New Caledonia/20/99(H1N1), A/Panama/2007/97(H3N2) 또는 B/Shandong/7/97(B)의 인플루엔자 종인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The pathogen is preferably an influenza virus and more preferably an influenza species of A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Panama / 2007/97 (H3N2) or B / Shandong / 7/97 But is not limited thereto.

상기 서브유닛은 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 서브유닛인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The subunit is preferably one or more subunits selected from the group consisting of influenza virus subunits HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA and NS2.

상기 아쥬반트 조성물 또는 백신은 안구 점막에 투여하는 제형인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 안약형 등과 같이 안구 부위에 투여하는 모든 제형으로 사용 가능하다.
The adjuvant composition or vaccine is preferably a formulation to be administered to the mucous membranes of the eye, but it is not limited thereto and can be used in all the formulations to be administered to the eye area such as eye drops.

본 발명의 실시예 및 실험예에서는 poly(I:C)를 인플루엔자 바이러스 백신의 안구 점막의 접종시 아쥬반트로 사용하는 경우, CT와 유사한 우수한 항체 생성 증진 효과를 가지고, CT와 달리 세포독성 및 염증반응이 거의 없는 안정성을 가지고 있음을 확인함으로써, poly(I:C)를 안구 점막용 인플루엔자 바이러스 백신의 유용한 아쥬반트로 사용할 수 있음을 확인하였다(도 1 내지 도 8 참조).In the Examples and Experimental Examples of the present invention, when poly (I: C) is used as an adjuvant when inoculating the mucous membrane of an influenza virus vaccine, it has an excellent antibody production enhancing effect similar to that of CT, It was confirmed that poly (I: C) can be used as a useful adjuvant for ocular mucosal influenza virus vaccine (see FIG. 1 to FIG. 8).

결론적으로, 본 발명은 poly(I:C)가 CT가 가진 문제점인 세포독성이 있고 염증을 유발하는 부작용을 해결할 수 있으므로, CT를 대신하여 인플루엔자 바이러스 백신의 새로운 유용한 아쥬반트로 사용할 수 있음을 확인하였다.
In conclusion, the present invention can confirm that poly (I: C) can be used as a new useful adjuvant for influenza virus vaccine in place of CT since it can solve the cytotoxic and inflammatory side effects of CT Respectively.

본 발명에 따른 조성물 또는 백신은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. The composition or vaccine according to the invention may additionally comprise a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 조성물 또는 백신에 사용가능한 약학적으로 허용가능한 담체에는, 항산화제, 방부제, 착색제, 방향약, 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전재, 벌킹제(bulking agent), 완충제, 전달용 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학적 보강제가 포함되나 이제 한정되지 않는다. 통상적으로, 본 발명의 조성물 또는 백신을, 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 백신 또는 이의 변형체(modification) 또는 유도체를 포함하는 조성물 형태로 투여한다. 본 발명에 사용되는 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 수용체에 대하여 비독성이고, 바람직하게는 사용량 및 사용 농도에서 불활성이다. 적절한 담체의 예로서, 중화 완충된 생리식염수, 또는 혈청 알부민과 혼합된 생리식염수를 들 수 있다. 기타 표준 담체, 희석제 및 부형제는 필요에 따라 함유될 수 있다. Pharmaceutically acceptable carriers for use in the compositions or vaccines of the present invention include, but are not limited to, antioxidants, preservatives, colorants, aromatics and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, Vehicles, diluents, excipients, and / or pharmaceutical adjuvants. Typically, the compositions or vaccines of the invention are administered in the form of a composition comprising the vaccine or modifications or derivatives thereof, together with one or more physiologically acceptable carriers, excipients or diluents. The acceptable carriers, excipients or stabilizers used in the present invention are non-toxic to the receptor and preferably inert at the dose and concentration used. Examples of suitable carriers include neutralized buffered physiological saline, or physiological saline mixed with serum albumin. Other standard carriers, diluents and excipients may be included if desired.

본 발명의 조성물 또는 백신의 일반적 제조 방법은 다음과 같을 수 있다. 동물 의약 조성물, 유사 약물, 수산 양식용(aquaculture) 의약 조성물, 식품 조성물 및 미용 조성물 등 또한 공지된 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 백신 등을 약학적으로 허용가능한 담체와 블렌딩하여 안구로 투여할 수 있다.
A general method of preparing the composition or vaccine of the present invention may be as follows. An animal pharmaceutical composition, a similar drug, aquaculture drug composition, a food composition and a cosmetic composition can be also produced by a known production method. The vaccine or the like of the present invention may be blended with a pharmaceutically acceptable carrier and administered into the eye.

상기 투여는 분비성 IgA를 생성하기에 충분한 농도로 투여할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.The administration can be carried out at a concentration sufficient to produce secretory IgA, but is not limited thereto.

상기 백신은 안구 점막에 투여하는 제형인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 안약형 등과 같이 안구 부위에 투여하는 모든 제형으로 사용 가능하다.The vaccine is preferably a formulation to be administered to the mucous membrane of the eye, but it is not limited thereto, and the vaccine can be used in all the formulations to be administered to the eye area such as eye drops.

본 발명의 백신의 양은, 사용 목적, 대상 질병(그 종류 등), 환자 연령, 체중, 병력 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명의 치료 방법에 있어서 대상체(또는 환자)의 투여 빈도 또한, 사용 목적, 대상 질병(그 종류, 경중도 등), 환자 연령, 체중, 병력, 경과 등을 고려하여 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다. 투여 빈도의 예로서, 매일 내지 수개월마다 투여(예를 들어, 매주 내지 매월), 또는 매 전염병 유행기 전에 한 번 투여 등을 언급할 수 있다. 경과를 살피면서 매주 내지 매월 투여를 실시하는 것이 바람직하고, 최소한 약 1 주 간격으로 추가 면역을 실시하는 것이 유리하다. 추가 면역 간격은 약 3주 이상인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The amount of the vaccine of the present invention can be easily determined by those skilled in the art in consideration of the intended use, the target disease (kind thereof, etc.), the patient's age, body weight, The frequency of administration of the subject (or patient) in the treatment method of the present invention can also be easily determined by those skilled in the art considering the purpose of use, the type of the subject (its kind, severity, etc.), the patient's age, body weight, medical history, As an example of the frequency of administration, mention may be made of administration every day to several months (for example, every week to month), or once before every epidemic epidemic. It is preferable to administer weekly to monthly administration with consideration of progress, and it is advantageous to perform additional immunization at least about one week apart. The additional immunization interval is more preferably about 3 weeks or more, but is not limited thereto.

본 발명의 백신의 투여량은 대상체의 연령, 체중, 증상 또는 투여 방법 등에 따라 다르며, 한계가 있는 것은 아니지만, 안구 점막 투여의 경우, 투여량은 0.001 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 0.1 mg 내지 1 mg 일 수 있다.
The dose of the vaccine of the present invention varies depending on the age, body weight, symptom or method of administration of the subject, and is not limited. In the case of ocular mucosa administration, the dose is 0.001 mg to 10 mg, preferably 0.1 mg to 1 mg mg.

아울러, 본 발명은 i) poly(I:C); 및 ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을 포함하는 백신(1), 및 In addition, the present invention relates to a composition comprising i) poly (I: C); And ii) a vaccine (1) comprising a subunit antigen or an inactivated antigen of the pathogen, and

상기 백신의 안구로의 투여방법, 투여량 또는 투여횟수 등에 관한 설명서(2)를 포함하는 안약형 백신용 키트를 제공한다.(2) regarding the administration method, administration amount, or the number of administration of the vaccine to the eyeball.

상기 키트에 있어서, 설명서는 본 발명의 약제 등의 투여 방법 또는 내과의사 또는 환자와 같이 투여를 수행하는 사람, 및 진단을 수행하는 사람(환자일 수 있음)을 위한 진단 등의 방법에 대한 정보를 담고 있는 문서를 포함한다. 상기 설명서는 본 발명의 진단약, 예방약, 약제 등의 투여 절차에 관한 안내를 포함할 수 있다. 상기 설명서는 본 발명이 실시되는 국가의 감독 기관이 정한 약식에 따라 제조되고, 감독 기관으로부터 승인을 얻었음을 명시할 수 있다. 상기 설명서는 제품첨부서라 불리는 것으로, 보통 서면으로 제공되나 이에 한정되지 않는다. 상기 설명서는, 예컨대 약병에 붙인 필름, 또는 전자 매체(예컨대, 인터넷, 이메일을 통해 제공되는 홈페이지(웹사이트)) 형태로 제공될 수도 있다.In the above kit, the manual includes information on a method of administering the medicament or the like of the present invention, a method of performing administration such as a physician or a patient, and a method of diagnosis for a person (who may be a patient) Includes documents containing. The instructions may include instructions on the administration procedure of the diagnostic agent, preventive agent, medicament, etc. of the present invention. The description may be made in accordance with the short form prescribed by the national supervisory body in which the invention is carried out and may indicate that it has been approved by the supervisory body. These instructions are referred to as product attachments and are normally provided in writing, but are not limited to these. The instructions may be provided in the form of, for example, a film affixed to a vial, or in the form of an electronic medium (e.g., a web site provided via the Internet or e-mail).

상기 키트에 있어서, 용기에는 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의하여 정해진 형식으로 된 통지서가 임의로 부착되어 있을 수 있는데, 이는 정부 기관에 의해 인간에의 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매를 승인함을 명시할 수 있다.
In the kit, the container may optionally be accompanied by a notice in the form prescribed by a governmental agency regulating the manufacture, use or sale of a medicament or biological product, which may be manufactured, Use or sale of the product.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples and experimental examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples and experimental examples.

<< 실시예Example 1> 마우스의 준비 1> Preparation of mouse

특정 병원체 부재 BALB/c 마우스로서 6-10주령의 마우스들을 준비하였다(Orient Bio, Sungnam, Korea). 모든 마우스는 국제백신연구소(Seoul, Korea)에서 특정 병원체 부재 조건 하에서 실험 동물 시설에 유지시켰고 살균된 음식 및 여과된 수돗물을 자유식으로 제공되었다. 모든 동물 실험은 국제백신연구소(Seoul, Korea)의 동물연구위원회에 의해 승인받았다. 실험 조작 이전에, 마우스를 케타민(100 mg/kg body weight) 및 자일라진 염산염(10 mg/kgbody weight)의 복강(i.p.) 주사에 의해 마취시켰다.
Specific pathogen-free BALB / c mice were prepared at 6-10 weeks of age (Orient Bio, Sungnam, Korea). All mice were maintained in laboratory animal facilities under the conditions of a specific pathogen in the International Vaccine Institute (Seoul, Korea), and sterile foods and filtered tap water were provided free-of-charge. All animal experiments were approved by the Animal Research Committee of the International Vaccine Institute (Seoul, Korea). Prior to experimental manipulation, mice were anesthetized by intraperitoneal (ip) injection of ketamine (100 mg / kg body weight) and xylazine hydrochloride (10 mg / kg body weight).

<< 실험예Experimental Example 1> 안구 점막에서 1> in the ocular mucosa polypoly (I:C)의 (I: C) 아쥬반트로서의As an adjuvant 효과 검증 Verification of effect

BALB/c 마우스 안구 점막에 OVA(100ug)와 각종 아쥬반트(adjuvants)[CT(2 ug), poly(I:C)(10 ug), MPLA(10 ug), Alum(1 mg)]를 마이크로피페트를 이용하여 2주일에 한 번씩 총 3번 점안한 후, 마지막 점안 후 일주일 뒤 각종 점막 세척액(Tear, Nasal, Fecal, Vaginal)을 획득한 후, ELISA 분석법으로 IgG 및 IgA를 관찰하였다. OVA (100 ug) and various adjuvants (CT (2 ug), poly (I: C) (10 ug), MPLA (10 ug) and Alum (1 mg) After the application of a pipette for 3 times a total of 3 times a week, various mucosal washing solutions (Tear, Nasal, Fecal, Vaginal) were obtained one week after the last instillation and IgG and IgA were observed by ELISA.

이때, 시료의 채취는 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로, 혈청(Serum)은 레트로-오비탈 채혈(retro-orbital bleeding)을 통해 획득하였다. 눈물(Tear) 세척 샘플은 눈 마다 10 ml PBS로 세척함에 의해 획득하였다. 배설물(Fecal) 추출물은 0.1% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS에 배설물을 첨가함으로써 획득하였다. 상기 배설물은 볼텍싱에 의해 교반시킨 후, 원심분리한 다음, 상층액을 분석을 위해 채취하였다. 질(Vaginal) 세척 샘플은 100 ml PBS로 세척함에 의해 채취하였다. 마우스를 희생한 다음, 코(nasal) 세척 샘플을 피펫을 이용하여 비강의 내부 입구를 통해 100 ml PBS를 수세함에 의해 획득하였다. At this time, sample collection was performed as follows. Specifically, Serum was obtained via retro-orbital bleeding. Tear wash samples were obtained by washing with 10 ml PBS per eye. Fecal extracts were obtained by adding feces to PBS containing 0.1% sodium azide. The excrement was stirred by vortexing, then centrifuged and the supernatant was collected for analysis. Vaginal wash samples were collected by washing with 100 ml PBS. The mice were sacrificed and the nasal wash samples were obtained by flushing 100 ml PBS through the internal nares of the nasal cavity using a pipette.

이때, ELISA 분석은 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로, ELISA 플레이트(Falcon, Franklin Lakes, NJ)를 OVA(100 mg/ml) 또는 비활성 A/PR/8(5 mg/ml) 또는 LPS(1 mg/ml)를 포함하는 PBS로 코팅시킨 다음, 4℃에서 밤새 인큐베이트시켰다. 블락킹은 1% BSA(Sigma-Aldrich)를 포함한 PBS로 수행하였고, 2배 순차적으로 희석한 샘플을 플레이트에 적용하였다. HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG 또는 IgA 항체(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)를 각 웰에 첨가한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이트시켰다. 칼라 형성을 위해, 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine) 용액(Moss, Pasadena, MD)을 사용하였다. 그런 다음, 플레이트를 정지 용액(0.5 N HCl)을 첨가한 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 450 nm에서 측정하였다. 항원 특이적인 항체의 탐지가능한 역가(Endpoint titer)는 배경 수준 보다 >0.1 흡광도를 보이는 최종 희석의 역수 log₂ 역가로 나타내었다. 총 IgA 수준의 검출을 위해, 플레이트를 염소 F(ab9)2 항-마우스 Ig로 코팅한 후, HRP-결합된 염소 항-마우스 IgA 항체(Southern Biotechnology Associates)를 검출 항체로서 사용하였다. OVA-특이적인 sIgA 항체 수준의 검출을 위해, 플레이트를 OVA(100 mg/ml)로 코팅한 후, 염소 항-pIgR(R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 HRP-결합된 래빗 항-염소 IgG(Southern Biotechnology Associates)를 검출 항체로서 사용하였다.At this time, ELISA analysis was performed as follows. Specifically, ELISA plates (Falcon, Franklin Lakes, NJ) were coated with PBS containing OVA (100 mg / ml) or inactive A / PR / 8 (5 mg / ml) or LPS (1 mg / ml) , &Lt; / RTI > incubated at 4 C overnight. Blocking was performed with PBS containing 1% BSA (Sigma-Aldrich), and a 2-fold diluted sample was applied to the plate. HRP-conjugated goat anti-mouse IgG or IgA antibody (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) was added to each well and incubated overnight at 4 ° C. For color formation, a tetramethylbenzidine solution (Moss, Pasadena, MD) was used. The plates were then measured at 450 nm with an ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.) After addition of stop solution (0.5 N HCl). Detectable titers of antigen-specific antibody (Endpoint titer) are shown horizontally reciprocal log ₂ of the inverse final dilution showing a> 0.1 absorbance than the background level. For detection of total IgA levels, plates were coated with chlorine F (ab9) 2 anti-mouse Ig and HRP-conjugated goat anti-mouse IgA antibody (Southern Biotechnology Associates) was used as detection antibody. (R & D Systems, Minneapolis, MN) and HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (Southern ' s) for detection of OVA-specific sIgA antibody levels. Biotechnology Associates) was used as a detection antibody.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, CT를 함께 접종한 그룹에서 가장 많은 항원-특이적인 항체(IgG 및 IgA)를 생성하였음을 확인할 수 있었다. 혈청에서는 CT 접종 그룹 이외에 다른 아쥬반트를 접종한 그룹들에서도 항원-특이적인 IgG 항체가 유의적으로 증가하였다. 그러나, 점막 조직에서의 항원 특이 IgA 항체 분비는 CT를 첨가한 그룹 이외에 poly(I:C)를 접종한 그룹에서만 항체가 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다(도 1). 이를 통해 안구 점막 접종 시 poly(I:C)가 CT 이외의 면역반응 유도에 효과적인 아쥬반트임을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Fig. 1, it was confirmed that most of the antigen-specific antibodies (IgG and IgA) were generated in the CT inoculated group. In serum, antigen-specific IgG antibody was also significantly increased in the groups inoculated with adjuvants other than CT inoculation group. However, antibody-specific IgA antibody secretion in mucosal tissues was significantly increased only in the group inoculated with poly (I: C) other than the group to which CT was added (FIG. 1). This suggests that poly (I: C) is an effective adjuvant to induce immune responses other than CT in ocular mucosal inoculation.

<< 실험예Experimental Example 2> 인플루엔자 백신으로서 2> As an influenza vaccine polypoly (I:C)의 (I: C) 아쥬반트로서의As an adjuvant 효과 확인 Check the effect

상기 <실험예 1>과 같은 조건 하에 항원을 OVA에서 인플루엔자 백신(influenza vaccine)으로 사용됐던 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)(CJ, Korea) 으로 대체한 후, 각 아쥬반트들의 항체 생성 증진 효과를 확인하였다. The antigens were replaced with hemagglutinin (HA) (CJ, Korea), which was used as an influenza vaccine in OVA under the same conditions as in Experimental Example 1, and the effect of each adjuvant on antibody production Respectively.

이때, HA는 TIV(trivalent influenza vaccine)(Biken)의 HA로서 A/New Caledonia/20/99(H1N1), A/Panama/2007/97(H3N2) 및 B/Shandong/7/97(B)의 세 가지 인플루엔자 종을 사용하였다.In this case, the HA was used as the HA of the trivalent influenza vaccine (Biken), A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Panama / 2007/97 (H3N2) and B / Shandong / 7/97 Three influenza species were used.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, CT 및 poly(I:C)를 접종한 그룹들에서 가장 많은 항체 생성 증진 효과가 확인되었으며, 특히 poly(I:C) 그룹에서는 CT와 비슷한 수준의 항체생성 증진효과를 보였다(도 2). 이를 통해 poly(I:C)가 CT 이외의 안구 점막에서의 인플루엔자 백신 항원 사용시 효과적인 면역 반응을 유도하는 아쥬반트임을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 2, most of the antibody production enhancement effects were confirmed in CT and poly (I: C) -infected groups, and in the poly (I: C) (FIG. 2). This confirms that poly (I: C) is an adjuvant that induces an effective immune response when using influenza vaccine antigens in ocular mucosa other than CT.

<< 실험예Experimental Example 3> 안구 점막에서의 백신 항원의 적정 투여량 확인 3> Confirmation of proper dose of vaccine antigen in ocular mucosa

안구 점막에서의 poly(I:C) 아쥬반트와 함께 사용되는 백신의 최소 및 적정 사용량을 확인하기 위해, BALB/c 마우스에 HA 항원의 양을 농도별로 2주 간격으로 두 번 접종한 후 혈청 및 점막조직 세척액에서의 항원 특이 항체 생성 수준을 확인 및 비교하였다.To determine the minimum and proper dose of the vaccine to be used with the poly (I: C) adjuvant in the mucosa of the eye, BALB / c mice were inoculated with HA antigen twice at intervals of 2 weeks, The level of antigen - specific antibody production in mucosal tissue was examined and compared.

구체적으로, 백신 항원의 적정 접종량을 확인하기 위해 0.1 ug ~ 2 ug의 HA(CJ, Korea)를 10 ug의 poly(I:C)와 함께 2주 간격으로 두 번 접종한 후 마지막 접종 2주 후 혈청과 점막조직 세척액에서의 항원 특히 IgG 및 IgA 생성량을 ELISA 분석법으로 측정하였다. 이때, 혈청에서는 IgG 항체, 그리고 각 점막 세척액에서는 IgA 항체의 생성량을 측정하였다.Specifically, 0.1 μg to 2 μg of HA (CJ, Korea) was inoculated with 10 μg of poly (I: C) twice at two-week intervals to confirm the optimal vaccination dose of the vaccine antigen. Antigen, especially IgG and IgA, production in serum and mucosal tissue was determined by ELISA. At this time, the amount of IgG antibody was measured in serum and the amount of IgA antibody was measured in each mucosal washing solution.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 혈청에서의 HA 백신 항원-특이적인 IgG 항체 생성량이 항원 단독 접종 그룹에 비해 유의하게 증가한 그룹은 1 ug의 HA 백신 항원을 10 ug의 poly(I:C)와 함께 접종한 그룹뿐이었으며, HA 항원을 0.1 ug 또는 2 ug을 접종한 그룹들은 유의적인 항체 생성 증가가 없었다(도 3).As a result, as shown in FIG. 3, in the group in which the amount of HA vaccine antigen-specific IgG antibody production in the serum was significantly increased compared to the antigen alone group, 1 μg of HA vaccine antigen was added to 10 μg of poly (I: And the groups inoculated with 0.1 .mu.g or 2 .mu.g of HA antigen showed no significant increase in antibody production (FIG. 3).

특히, 1 ug 항원의 두 배를 접종한 그룹인 2 ug HA 항원 접종 그룹에서의 항체 생성 증진 효과가 1 ug HA 항원 접종 그룹에 비해 낮은 것은 HA 백신 제재의 낮은 농도(1 ug/11ul)에 기인한 것으로 추정되었다. 1 ug/11 ul 농도의 백신 항원을 2 ug/head로 접종을 하게 되면 안구점막 백신의 총 부피는 26 ul(항원 22 ul + poly(I:C) 4 ul)가 되며 이는 항원 1 ug을 접종하는 경우(안구점막 백신의 총량: 15 ul)에 비해 poly(I:C)의 양이 절반 가량으로 희석이 됨과 동시에, 마우스의 눈에 방울 형태로 접종이 되는 백신이 부피가 많아짐에 따라 방울의 크기가 커지고 그에 따라 마취에서 깨어난 마우스가 움직일 때 손실되는 양이 15 ul의 백신에 비해 컸을 것이라 추정되었다. 따라서 이에 따라 항원을 2 ug을 접종한 그룹에서는 poly(I:C)의 효과가 반감 또는 상당량 손실되었기에 1 ug의 항원을 접종한 그룹보다 항체 생성 증진 효과가 낮았으리라 추정되었다. 따라서, 이후에 진행되는 실험은 모두 HA 백신 항원을 1 ug으로 고정하여 투여하였다.
In particular, the effect of increasing the antibody production in the 2 ug HA antigen-inoculated group, which was twice the 1 ug antigen group, was lower than that of the 1 ug HA antigen-inoculated group due to the lower concentration of the HA vaccine (1 ug / 11 ul) Respectively. When vaccinated with 1 ug / 11 μl of vaccine antigen at 2 ug / head, the total volume of ocular mucosal vaccine is 26 μl (22 μl of antigen + poly (I: C) 4 μl) The amount of poly (I: C) was diluted by half compared with the case of ocular mucosal vaccine (total amount of ocular mucosal vaccine: 15 μl), and as the volume of the vaccine to be inoculated into the eye of the mouse was increased, It was assumed that the size would be larger and thus the amount lost when moving the anesthetized mouse was greater than the 15 ul vaccine. Therefore, it was estimated that the effect of poly (I: C) was reduced or significantly lost in the 2 ug vaccinated group, so that the effect of 1 ug vaccination was lower than that of the vaccinated group. Therefore, all subsequent experiments were performed by immobilizing HA vaccine antigen at 1 ug.

<< 실험예Experimental Example 4> 안구 점막에서의 4> In the ocular mucosa polypoly (I:C) (I: C) 아쥬반트의Adjuvant 적정 투여량 확인 Identify the correct dose

안구 점막에서의 poly(I:C) 아쥬반트의 최소 및 적정 사용량을 확인하기 위해, BALB/c 마우스에 poly(I:C)의 양을 농도별로 2주 간격으로 두 번 접종한 후 혈청 및 점막조직 세척액에서의 항원 특이 항체 생성 수준을 확인 및 비교하였다.To determine the minimum and proper amount of poly (I: C) adjuvant in the mucosa of the eye, BALB / c mice were inoculated twice with poly (I: C) The level of antigen - specific antibody production in tissue washes was determined and compared.

구체적으로, BALB/c 마우스에 1 ug HA 백신 항원과 함께 1 ug, 10 ug, 30 ug의 poly(I:C)를 각각 눈에 2주 간격으로 두 번 투여한 후 마지막 접종 2주 후에 혈액과 점막 세척액의 HA 특이적인 항체 생성 수준을 ELISA로 확인하였다.Specifically, BALB / c mice were injected with 1 ug HA, 30 ug of poly (I: C) with 1 ug HA vaccine antigen every two weeks in the eyes and then 2 weeks after the last inoculation. The level of HA - specific antibody production in the mucosal washes was confirmed by ELISA.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 눈물과 질 세척액의 샘플에서만 1 ug와 10 ug poly(I:C) 투여 그룹 간의 유의적인 IgA 항체 생성 수준 차이가 있었을 뿐 혈액과 나머지 점막 세척액의 poly(I:C)가 투여된 그룹들 간의 유의적인 IgG 또는 IgA 항체 생성 수준의 차이는 없었다(도 4). As a result, as shown in FIG. 4, there was a significant difference in IgA antibody production level between 1 ug and 10 ug poly (I: C) administration groups only in samples of tear and vaginal lavage fluid. : C), there was no significant difference in the level of IgG or IgA antibody production between the groups (Fig. 4).

이는 소량(1 ug)의 poly(I:C)를 투여하더라도 그 이상의 poly(I:C)를 투여한 것과 비슷한 수준의 항체 생성 증진 효과를 보일 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 아쥬반트로서의 poly(I:C)를 눈으로 백신 접종할 때, 최소한의 효과적인 poly(I:C)의 투여량은 1 ug임을 알 수 있었다. 그리고 10 ug 이상의 poly(I:C)를 투여하더라도 항체 생성 증진 효과는 10 ug poly(I:C)를 투여한 것과 효과가 비슷하며 더 이상의 부가적인 증진 효과는 보이지 못함을 알 수 있었다. 따라서 이후 실험에서는 최적의 아쥬반트성을 발휘하며 이에 따른 효과를 확인하기 위해 10 ug의 poly(I:C)를 투여하였다.
This means that even a small amount (1 ug) of poly (I: C) can give a similar level of antibody production enhancement to that of poly (I: C). Therefore, when eye was vaccinated with poly (I: C) as an adjuvant, the least effective poly (I: C) dose was 1 ug. The effect of 10 ug of poly (I: C) was similar to that of 10 ug of poly (I: C) and no additional enhancement was observed. Therefore, in the subsequent experiment, 10 ug of poly (I: C) was administered in order to demonstrate the optimum adjuvant effect and to confirm its effect.

<< 실험예Experimental Example 5> 안구 점막 접종과 비강점막 접종에서의 항체 생산 증진 효과 비교 5> Comparison of efficacy of antibody production in ocular mucosal inoculation and nasal mucosal inoculation

안구 점막에서의 poly(I:C)의 효과를 다른 접종 경로와의 비교를 통한 객관적인 확인을 하고자 하였다. 한편, 비강 접종법은 혈청과 점막 항체 생성을 가장 잘 촉진시킨다고 알려져 있다. 이에, poly(I:C)의 아쥬반트성을 점안 접종법과 비강 접종법 각각의 효과 비교를 통해 확인하였다. Objective confirmation of the effect of poly (I: C) on the mucosa of the eye was made by comparison with other inoculation routes. On the other hand, nasal vaccination is known to best promote serum and mucosal antibody production. Therefore, the adjuvant properties of poly (I: C) were confirmed by comparing the effects of inoculation with nasal spray.

<5-1> <5-1> HAHA 백신 항원을 이용한 확인 Identification with vaccine antigen

BALB/c 마우스에 1 ug의 HA 백신 항원에 1 ug 또는 10 ug의 poly(I:C)를 함께 눈과 코에 각각 2주 간격으로 두 번 접종한 후 마지막 접종 2주 후 HA 특이적인 항체를 ELISA로 혈청과 점막 세척액 샘플들에서 확인하였다. BALB / c mice were inoculated with 1 ug HA or 10 ug of poly (I: C) to the eyes and nose at 2-week intervals, respectively. Two weeks after the last inoculation, HA-specific antibodies Serum and mucosal wash samples were identified by ELISA.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 혈청에서는 비강으로 접종한 그룹들이 점안 접종 그룹들보다 유의적으로 높은 HA-특이적인 IgG 항체 생성 수준을 보였다. 먼저, 점안과 비강 경로로 poly(I:C)를 항원과 같은 양 처리한 그룹 간의 비교 시 비강 접종 그룹에서의 poly(I:C)에 의한 항체 생성 증진 효과가 점안 경로 그룹의 효과보다 큰 것을 알 수 있었다. 그러나, 타액 샘플을 제외한 모든 점막 세척액에서의 HA-특이적인 IgA 항체 생성 수준을 poly(I:C)의 양이 같은 두 그룹들 중 점안접종 그룹과 비강접종 그룹들을 각각 비교하였을 때, 두 접종 경로별 간의 항체 생성 증진효과가 통계적으로 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 5). As a result, as shown in Fig. 5, the nasal-inoculated groups in the serum showed HA-specific IgG antibody production levels significantly higher than those in the inoculated groups. First, the effect of poly (I: C) on antibody production in the nasal inoculation group compared to the group treated with poly (I: C) Could know. However, when comparing the levels of HA-specific IgA antibodies in all mucosal flushes except saliva samples compared to the inoculated group and the nasal inoculation groups of two groups with the same amount of poly (I: C) It was confirmed that there was no statistically significant difference in the effect of enhancing antibody production between stars (FIG. 5).

<5-2> <5-2> H1N1H1N1 분할 백신 항원을 이용한 확인 Identification with split vaccine antigen

또한 poly(I:C)의 아쥬반트 효과를 인플루엔자 바이러스의 서브유닛 백신이 아닌 비활성 전분할 백신(inactivated whole split vaccine)의 항원을 사용할 경우에도 점안 접종과 비강 접종 간에 유의적 효능의 차이가 없는 지를 확인하기 위해 H1N1 influenza virus A/California/7/2009의 분할 백신을 항원으로 사용하여 점안 및 비강접종을 한 후 poly(I:C)의 아쥬반트성을 확인하였다.In addition, the adjuvant effect of poly (I: C) was not significantly different between instillation and nasal administration, even when an inactivated whole split vaccine antigen was used instead of influenza virus subunit vaccine To confirm the adjuvant nature of the poly (I: C) after intravenous infusion of the H1N1 influenza virus A / California / 7/2009 split vaccine as an antigen.

구체적으로, 6 ~ 8주령의 BALB/c mice에 1ug 또는 10ug의 poly(I:C)를 1 ug의 H1N1 분할 백신과 함께 점안 및 비강 경로로 각각 2주 간격으로 두 번 접종한 후, 마지막 접종 2주 후에 혈청 및 점안 세척액 샘플에서 H1N1 분할 백신 항원-특이적인 IgG와 IgA 항체 생성 수준을 각각 ELISA 분석법으로 확인하였다. Specifically, 6 to 8 weeks old BALB / c mice were inoculated with 1 ug or 10 ug of poly (I: C) twice a week with an instillation and nasal route along with 1 ug of H1N1 split vaccine, After two weeks, the H1N1 split vaccine antigen-specific IgG and IgA antibody production levels were determined in serum and eye wash samples by ELISA assay, respectively.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 혈청에서는 비강 접종 그룹이 점안 접종 그룹들보다 같은 양의 poly(I:C)를 처리한 그룹에 비해 항원 특이적인 IgG 항체 생성 수준이 더 높았다. 이는 HA-백신과 마찬가지로 poly(I:C)는 비강 접종법에서 점안접종보다 혈청에서의 시스템적 IgG 항체 형성을 더 효과적으로 증진시킨다고 할 수 있겠다. 그러나, 점막 세척액 샘플들에서의 IgA 항체 생성 증진 효과는 거의 대부분의 점막 샘플에서 점안 접종과 비강 접종 간의 경로 특이적 항체 생성 증진 효과의 차이는 없는 것으로 관찰되었다(도 6). As a result, as shown in Fig. 6, nasal immunization group was higher in antigen-specific IgG antibody production level than the group treated with the same amount of poly (I: C) than in the inoculation group. This suggests that poly (I: C) improves systemic IgG antibody formation in serum more than oocyte inoculation in nasal vaccination, like HA-vaccine. However, the effect of increasing IgA antibody production in the mucosal wash liquor samples was not observed in almost all of the mucosal samples, as there was no difference in the effect of enhancing pathogen-specific antibody production between instillation and nasal inoculation (Fig. 6).

따라서, 이를 통해 poly(I:C) 아쥬반트를 HA 백신 또는 H1N1 분할 백신의 항원과 함께 점안으로 접종하는 것으로도 비강으로 접종한 후 항체생성을 증진시키는 것과 비슷한 효율적인 아쥬반트성을 나타낼 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
Thus, inoculation of the poly (I: C) adjuvant with the antigen of the HA vaccine or H1N1-split vaccine into the nasal cavity may exhibit efficient adjuvant properties similar to the enhancement of antibody production after inoculation into the nasal passages I could confirm.

<< 실험예Experimental Example 6> 6> PolyPoly (I:C)의 안전성 확인(I: C)

<6-1> 세포분포 변화 확인<6-1> Confirmation of cell distribution change

CT는 점막을 통해 면역성을 유발시키는 아쥬반트 중 가장 효과적인 제재이지만 세포독성을 가지고 염증을 일으키는 부작용을 가지고 있다. 그러나 poly(I:C)는 이미 임상에서도 사용될 정도로 안전성이 확인된 아쥬반트이다. 이에 대한 확인을 점안 후, 세포분포 변화로 한 번 더 확인하였다. CT is the most effective adjuvant that causes immunity through the mucosa, but it has cytotoxic and inflammatory side effects. However, poly (I: C) is an adjuvant that has already been identified as safe for clinical use. Confirmation was confirmed once more by cell distribution after instillation.

구체적으로, 6-8주령의 BALB/c 마우스에에 PBS, 1 ug의 HA 단독, 및 1 ug의 HAs+ 10 ug poly(I:C)를 각각 점안 접종한 후 결막 조직에서 CD8α 및 CD11c 세포를 얻은 후 상기 세포들을 각각 FITC 및 APC로 염색한 다음, 24시간째에 결막 조직에서의 세포변화를 유세포분석기를 이용하여 확인하였다. Specifically, CD8α and CD11c cells were obtained from conjunctival tissues after instillation of PBS, 1 μg of HA alone, and 1 μg of HAs + 10 μg poly (I: C) in 6-8 week old BALB / The cells were stained with FITC and APC, respectively, and cell changes in the conjunctival tissue at 24 hours were confirmed using a flow cytometer.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, CT를 접종한 그룹에서는 다른 그룹에서와는 달리 결막 조직이 부어있는 것을 확인하였고, 이에 따른 CD8α+ 세포들이 매우 증가했음을 확인하였다(도 7). As a result, as shown in FIG. 7, in the group inoculated with CT, unlike the other groups, it was confirmed that the conjunctival tissue was swollen, and thus CD8α + cells were greatly increased (FIG. 7).

따라서 이를 통해 CT와는 달리 poly(I:C)에서는 접종 후에도 염증이 없는 안전한 아쥬반트임을 확인할 수 있었다. 또한 HAs를 백신으로 사용할 경우에도 PBS 대조군과 차이가 없을 정도로 변화가 없음을 확인하면서 점안용 백신으로 HA 백신이 안전하게 사용될 수 있음도 확인할 수 있었다. Therefore, unlike CT, it was confirmed that poly (I: C) is a safe adjuvant without inflammation after inoculation. In addition, when HAs was used as a vaccine, it was confirmed that there was no significant difference between the vaccine and PBS control.

<6-2> 염증성 사이토카인 발현 여부 확인<6-2> Confirmation of the expression of inflammatory cytokines

poly(I:C)를 투여한 후 눈에서의 염증성 사이토카인 발현 여부를 확인하기 위해, HA 백신 항원과 함께 poly(I:C)를 투여한 후 24시간 후에 염증성 사이토카인 의 발현 여부를 확인하였다. In order to confirm the expression of inflammatory cytokines in the eyes after administration of poly (I: C), expression of inflammatory cytokines was confirmed 24 hours after poly (I: C) administration with HA vaccine antigen .

구체적으로, 6-8주령의 BALB/c 마우스에 1 ug의 HA 백신 항원 단독, 항원 + 10 ug poly(I:C), 또는 항원 + CT와 함께 점안접종을 한 후, 각 시간별(1h, 6h, 12h, 24h)로 조직에서 총 RNA를 추출한 다음, 역전사 RNA로 cDNA를 합성하였다. 이를 주형으로 사용하여 IL-1alpha 및 TNF-alpha의 mRNA 발현 증가 여부를 실시간(real-time) PCR로 확인하였다. Specifically, 6-8 week old BALB / c mice were instilled with 1 μg of HA vaccine alone, antigen + 10 μg poly (I: C), or antigen + CT, , 12h, 24h), and cDNA was synthesized with reverse transcriptase. Using this as a template, we confirmed the increase of mRNA expression of IL-1alpha and TNF-alpha by real-time PCR.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, PBS, HA 백신 항원 단독, 및 HA 항원 + poly(I:C)을 처리한 그룹들 모두 IL-1alpha mRNA 및 TNF-alpha mRNA 발현 증가가 유발되지 않았다(도 8).As a result, as shown in Fig. 8, no increase in expression of IL-1alpha mRNA and TNF-alpha mRNA was observed in all of the groups treated with PBS, HA vaccine antigen alone, and HA antigen + poly (I: C) 8).

Claims

poly(I:C)를 포함하는 안약형 인플루엔자 바이러스 백신 아쥬반트(adjuvants).
flu vaccine adjuvants comprising poly (I: C).

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제 1항에 있어서, 상기 poly(I:C)는 안구 점막 투여시 항체 생성을 증진시키고, 세포독성 및 염증 반응이 없는 것을 특징으로 하는 안약형 인플루엔자 바이러스 백신 아쥬반트.
The vaccine according to claim 1, wherein the poly (I: C) enhances antibody production upon ocular mucosal administration, and is free from cytotoxicity and inflammatory reaction.

하기를 포함하는 안약형 인플루엔자 바이러스 백신:
i) poly(I:C); 및
ii) 인플루엔자 바이러스의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원.
An influenza virus vaccine comprising:
i) poly (I: C); And
ii) Subunit antigens or inactivated antigens of influenza virus.

삭제delete

제 4항에 있어서, 상기 서브유닛은 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 안약형 인플루엔자 바이러스 백신.
5. The composition according to claim 4, wherein the subunit comprises at least one subunit selected from the group consisting of influenza virus subunits HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA and NS2. Influenza virus vaccine.

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하기를 포함하는 안약형 인플루엔자 바이러스 백신용 키트:
A) 하기를 포함하는 안약형 인플루엔자 바이러스 백신:
i) poly(I:C); 및
ii) 인플루엔자 바이러스의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원; 및
B) 상기 백신의 안구 점막 투여를 위한 방법, 투여량 또는 투여횟수를 포함한 내용의 설명서.
An anti-influenza virus vaccine kit comprising:
A) An influenza virus vaccine comprising:
i) poly (I: C); And
ii) subunit antigens or inactivated antigens of influenza virus; And
B) A description of the procedure, including the method, dosage or frequency of administration, for the ocular mucosal administration of the vaccine.

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제 10항에 있어서, 상기 서브유닛은 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 안약형 인플루엔자 바이러스 백신용 키트.11. The composition of claim 10, wherein the subunit comprises one or more subunits selected from the group consisting of influenza virus subunits HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, Influenza virus back credit kit.