KR101667118B1

KR101667118B1 - Magnetic resonance beacon to detect target molecule

Info

Publication number: KR101667118B1
Application number: KR1020140179720A
Authority: KR
Inventors: 김순학
Original assignee: 가톨릭관동대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2016-10-17
Also published as: KR20160071925A

Abstract

본 발명은 타겟 분자 탐지를 위한 자기 공명 비콘에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 인 비보 및 인 비트로 타겟 분자의 존재에 따라 자기공명신호의 온-오프가 조절되는 방식을 취하고 있어 타겟 분자의 동정, 발현 평가, 세포발달 및 질환 진단 및 평가에 유용하게 사용할 수 있는 이미징 프로브를 제공한다.The present invention relates to a magnetic resonance beacon for detecting a target molecule, and more particularly, to a magnetic resonance beacon for detecting a target molecule, An imaging probe that can be useful for expression evaluation, cell development and disease diagnosis and evaluation.

Description

타겟 분자 탐지를 위한 자기 공명 비콘{Magnetic resonance beacon to detect target molecule}Magnetic resonance beacon to detect target molecule for target molecule detection [

본 발명은 자기 공명 영상 기술 분야에 사용할 수 있는 타겟 분자 탐지를 위한 자성 형광 나노입자 기반 자기 공명 비콘에 관한 것이다.
The present invention relates to a magnetic fluorescent nanoparticle-based magnetic resonance beacon for target molecule detection usable in the field of magnetic resonance imaging.

전리방사선을 사용하지 않고, 심부 조직을 고해상도로 안전하게 이미징할 수 있는 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging, MRI)에 의한 비침습적 세포 추적은 상자성 금속 이온 및 초상자성 철 산화물 나노입자 같은 새로운 이미징 프로브의 개발로 훨씬 발전하게 되었다. 더욱이, 최근 타겟 세포 또는 조직의 표면에 존재하는 항원과 결합하는 나노입자가 결합된 항체, 앱타머 및 펩타이드의 발전은 인 비트로 및 인 비보에서 민감하고 특이적인 표적화된 MRI를 향상시켰다. 그러나, 세포에서 다른 분자와 타겟 분자를 구별하기가 어렵기 때문에 세포내 타겟 분자, 및 분화와 세포사멸을 포함한 유전자 발현-기반 세포 과정을 모니터링 하기 위한 나노입자-기반 MRI 방법에는 한계가 있다. 예컨대, 의도한 타겟에 결합하지 못한 MRI 프로브는 비특이적 타겟에 결합하여 세포에서 배출되지 않고 세포질 내에 정착하거나, 세포 내 식세포에 의해 전달된다.Non-invasive cell tracking by magnetic resonance imaging (MRI), which can safely image deep tissues in high resolution without ionizing radiation, is the development of new imaging probes such as paramagnetic metal ions and superparamagnetic iron oxide nanoparticles . Moreover, the development of antibodies, aptamers, and peptides that have recently been associated with nanoparticles that bind antigen present on the surface of target cells or tissues have enhanced sensitive and specific targeted MRI in in vitro and in vivo. However, there are limitations to nanoparticle-based MRI methods for monitoring intracellular target molecules, and gene expression-based cellular processes, including differentiation and cell death, because it is difficult to distinguish target molecules from other molecules in the cell. For example, an MRI probe that fails to bind to an intended target binds to a nonspecific target and is not released from the cell, but is settled in the cytoplasm or is delivered by a cell macrophage.

나노입자 조립체는 인 비트로에서 DNA 및 단백질을 포함한 세포내 생체분자 타겟에 성공적으로 사용되어 왔다. 생체분자에 의해 유도된 자성 나노입자의 조립 또는 분해는 키나아제/포스파타아제 활성 또는 아데노신 발현에 대하여 자성 조영제를 생산할 수 있다. 예컨대, 자가조립하는 아데노신 앱타머-기반 자성 나노입자의 T2-강조 자기 공명 신호는 아데노신이 없는 경우 소거되고, 아데노신의 서열 특이적 결합으로 인해 앱타머를 포함하는 올리고머가 나노입자 클러스터로부터 떨어져 나올 때 회복된다. 자가조립된 자성 나노입자의 메커니즘은 부분적으로 이중가닥의 올리고뉴클레오타이드, 형광물질 및 형광 소거제로 구성된 광학 분자 비콘과 매우 유사하다. 즉, 타겟 분자가 존재하지 않을 때 광학 신호는 소거되지만, 타겟 분자가 올리고뉴클레오타이드에 결합할 때 형광 소거제가 비콘에서 떨어져 나오면서 극적으로 회복된다. 불행히도, 아직까지 살아있는 세포 또는 생체에서 유전자의 세포내 발현을 모니터링하기 위해 자성 나노입자 조립체를 이용하는 연구는 보고되어 있지 않다.Nanoparticle assemblies have been used successfully in in vitro biomolecular targets including DNA and proteins in in vitro. Assembly or degradation of magnetic nanoparticles induced by biomolecules can produce magnetic contrast agents for kinase / phosphatase activity or adenosine expression. For example, the T2-weighted magnetic resonance signal of self-assembling adenosine aptamer-based magnetic nanoparticles is erased in the absence of adenosine, and when oligomers containing aptamers are removed from the nanoparticle clusters due to sequence specific binding of adenosine Recovered. The mechanism of self-assembled magnetic nanoparticles is very similar in part to optical molecular beacons composed of double-stranded oligonucleotides, fluorescent materials and fluorescent scavengers. That is, when the target molecule is not present, the optical signal is canceled, but when the target molecule binds to the oligonucleotide, the fluorescence scavenger disappears from the beacon and is dramatically recovered. Unfortunately, no studies have yet reported on the use of magnetic nanoparticle assemblies to monitor intracellular expression of genes in living cells or in vivo.

한편, microRNA(miRNAs 또는 miRs)는 증식, 분화 및 질병을 포함한 세포 과정의 주요 조절자로서 세포내에서 작용하는 작은 암호화되지 않는 RNA이다. 따라서, 인 비보에서 실시간으로 miRNA를 영상화하기 위한 비침습적 방법은 치료적 진단적 도구로서 엄청난 잠재력을 가지는 것이다.
On the other hand, microRNAs (miRNAs or miRs) are small unencrypted RNAs that act in cells as a major regulator of cellular processes including proliferation, differentiation and disease. Therefore, non-invasive methods for imaging miRNA in real time in InVivo have tremendous potential as therapeutic diagnostic tools.

대한민국 공개특허 제2011-0103009호Republic of Korea Open Patent No. 2011-0103009 미국 등록 특허 제7485419호U.S. Patent No. 7485419

본 발명의 목적은 살아있는 세포 또는 생체 내 분자의 세포내 발현을 탐지하기 위한 자성 형광 나노입자 기반 자기 공명 비콘, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a magnetic fluorescent nanoparticle-based magnetic resonance beacon for detecting intracellular expression of living cells or molecules in vivo, a method for producing the same, and its use.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1접속(adaptor)분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자; 제2접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자; 및 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역과 상기 제1접속분자 및 제2접속분자와 혼성화될 수 있는 링커 영역을 함유하는 핵산 프로브를 포함하며, 상기 자성 형광 나노입자들의 제1접속분자 및 제2접속분자와 상기 핵산 프로브의 링커 영역이 혼성화되어 자가조립(self-assembly) 형 구조를 나타내는 자기 공명 비콘을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a magnetic nanoparticle comprising: a magnetic fluorescent nanoparticle surface-bonded with a first adapter molecule; A magnetic fluorescent nanoparticle surface-bonded with a second connecting molecule; And a nucleic acid probe containing a region specifically binding to the target molecule and a linker region capable of hybridizing with the first connecting molecule and the second connecting molecule, wherein the first connecting molecule and the second connecting molecule of the magnetic fluorescent nanoparticles And a linker region of the nucleic acid probe are hybridized with each other to provide a self-assembled beacon.

본 발명은 또한 제1접속(adaptor)분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자, 제2접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자 및 핵산 프로브를 혼성화 조건에서 반응시켜 상기 자성 형광 나노입자들의 제1접속분자 및 제2접속분자와 핵산 프로브의 링커 영역이 혼성화되어 자가조립(self-assembly) 형 구조를 형성하도록 하는 것을 포함하고, 상기 핵산 프로브는 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역과 상기 제1접속분자 및 제2접속분자와 혼성화될 수 있는 링커 영역을 함유하는 것인, 자기 공명 비콘의 제조방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing a magnetic nanoparticle by reacting magnetic fluorescent nanoparticles having surface-bonded first adapter molecules, magnetic fluorescent nanoparticles having surface-bonded second binding molecules and a nucleic acid probe under hybridization conditions, And a linker region of the nucleic acid probe is hybridized to form a self-assembly structure, wherein the nucleic acid probe has a region specifically binding to the target molecule and a second region And a linker region that is capable of hybridizing with the second molecule and the second connecting molecule.

본 발명은 또한 상기 자기 공명 비콘을 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting target molecules comprising said magnetic resonance beacon.

본 발명은 또한 상기 타겟 분자 탐지용 조성물을 생체 또는 시료에 투여하고, 상기 생체 또는 시료 내 타겟 분자와 자기 공명 비콘의 혼성화에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 것을 포함하는 생체 또는 시료의 영상 수득 방법을 제공한다.
The present invention also relates to a method for detecting a target molecule, comprising the steps of: administering a composition for detecting a target molecule to a living body or a sample; sensing a signal emitted by hybridization of the target molecule and a magnetic resonance beacon in the living body or sample to obtain an image; Thereby providing an image obtaining method.

본 발명에 따른 자기 공명 비콘은 세포 내 타겟 분자의 존재에 따라 자기공명영상 신호의 온-오프가 조절되는 방식을 취하고 있어 특이적인 타겟 분자의 동정 또는 평가, 세포 발달 및 질환 진단/치료 평가를 위해 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 자성 형광 나노입자를 기반으로 한 본 발명에 따른 자기 공명 비콘은 인 비트로 및 인 비보에서의 타겟 분자의 탐지에 따른 자기 공명 영상을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 자기 공명 비콘을 이용하면 살아있는 대상체에서의 비침습적이고 반복적인 분석이 가능해진다.
The magnetic resonance beacon according to the present invention takes the form in which the on / off of the magnetic resonance image signal is controlled according to the presence of the intracellular target molecule, so that the identification or evaluation of the specific target molecule, the cell development and diagnosis / Can be usefully used. In particular, the magnetic resonance beacon according to the present invention based on magnetic fluorescent nanoparticles can provide magnetic resonance imaging according to detection of target molecules in in vitro and in vivo. In addition, the use of the magnetic resonance beacon according to the present invention enables non-invasive and repetitive analysis in living subjects.

도 1은 miRNA 이미징을 위한 본 발명의 miR MR 비콘의 구조 및 MR 영상화 메커니즘을 도시한 것이다.
도 2는 자성 형광(MF) 나노입자(좌측), 3a-MF 나노입자(중간) 및 5a-MF 나노입자(우측)의 투과전자현미경 사진도이다(스케일바는 50 nm를 의미함).
도 3은 자성 형광(MF) 나노입자, 3a-MF 나노입자 및 5a-MF 나노입자의 동적광산란법 분석 결과이다.
도 4는 3a-MF 나노입자 및 5a-MF 나노입자의 혼합물에 miR124a 링커와 miR124a mt 링커를 부가하여 제작한 miR124a MR 비콘과 miR124a mt MR 비콘에 miR124a를 첨가하면서 나노입자가 다시 분해되는 과정을 형광 이미지를 통해서 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다("miR124a 링커 없음"는 miR124a 링커를 첨가하지 않은 3a-MF 나노입자 및 5a-MF 나노입자의 혼합물을 의미함).
도 5는 3a-MF 나노입자 및 5a-MF 나노입자의 혼합물에 miR124a 링커와 miR124a mt 링커를 부가하여 제작한 miR124a MR 비콘과 miR124a mt MR 비콘에 miR124a를 첨가하면서 나노입자가 다시 분해되는 과정을 공초점 현미경을 통해서 비교, 분석한 결과이다.
도 6은 인 비트로에서의 miR124a MR 비콘의 물리적 특성을 도시한 것으로, (a)는 miR124a 링커를 포함시키지 않은 조건 하에서 3a-MF와 5a-MF 나노입자 혼합물의 TEM 사진도와 miR124a MR 비콘과 miR124a mt MR 비콘에 miR124a를 첨가시켜 가면서 나노입자가 다시 분해되는 과정을 확인한 TEM 사진도이고, (b)는 miR124a 농도 별 T2-강조 MR 영상 분석 결과이다.
도 7은 3a-MF 나노입자 및 5a-MF 나노입자의 혼합물에 miR124a 링커와 miR124a mt 링커를 부가하여 제작한 miR124a MR 비콘과 miR124a mt MR 비콘에 miR124a를 첨가하면서 나노입자가 다시 분해되는 과정 중 나노입자 크기 변화를 확인한 DLS 분석 결과이다.
도 8은 miR124a 링커가 없는 조건에서 3a-MF 나노입자와 5a-MF 나노입자 혼합물의 함량 별 T2-강조 MR 영상을 보여주는 결과이다.
도 9는 3a-MF 나노입자와 5a-MF 나노입자 혼합물의 함량별 세포 독성을 확인한 MTT 분석 결과이다.
도 10은 2종의 MR 비콘을 트랜스펙션 시킨 HeLa 세포에 miR124a를 농도별로 첨가한 다음 공초점 주사전자현미경을 이용하여 나노입자의 형광 이미지를 분석한 결과(a; 붉은색은 나노입자, 푸른색은 세포의 핵을 의미, "miR124a 링커 없음"은 miR124a 링커없이 2종의 나노입자 혼합물을 트랜스펙션 시킨 HeLa 세포를 보여주는 나노입자가 뭉쳐지지 않은 상태의 이미지임)와, (a) 조건에 해당하는 세포 시료를 회수하여 MR 영상을 분석한 결과(b)를 나타낸 것이다.
도 11은 miR124a MR 비콘 안정성 실험 결과를 나타낸 것이다(푸른색은 세포핵, 붉은색은 나노입자, 스케일바=1 ㎛).
도 12는 P19 세포에 RA를 첨가하여 신경분화를 유도하고, 미분화 마커(Oct-4)와 신경세포 마커(NeuroD)의 발현 여부를 면역형광염색법으로 확인한 결과이다(푸른색은 세포핵, 붉은색은 Oct4, NeuroD).
도 13은 P19 세포에 RA를 첨가하여 신경분화를 유도하고, 분화 과정 중 신경분화 특이 miR124a의 발현량 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 14는 miR124a MR 비콘을 P19 세포에 트랜스펙션 시키고, RA를 첨가하여 신경분화를 유도한 다음, 공초점 형광 현미경을 이용하여 miR124a MR 비콘 크기 변화 여부를 관찰한 결과(a)와, (a) 조건에서 사용한 세포를 회수하고 이의 MR 영상을 나타낸 결과(b) 및 인 비보 신경분화 과정에서의 T2-강조 MR 영상을 보여주는 결과(c)이다(RA(+)는 RA 첨가를 의미하고, 노란색 화살표로 표기함. RA(-)는 RA 미첨가를 의미하고, 붉은색 화살표로 표기함).
도 15는 miR124a MR 비콘을 사용한 누드 마우스의 신경분화유도 조직에서 Oct와 NeuroD 발현 여부를 확인한 결과이다(푸른색은 세포핵, 붉은색은 Oct4, NeuroD).
도 16은 miR124a mt MR 비콘을 사용한 누드 마우스의 신경분화유도 조직에서 Oct와 NeuroD 발현 여부를 확인한 결과이다(푸른색은 세포핵, 붉은색은 Oct4, NeuroD).Figure 1 illustrates the structure of a miR MR beacon of the present invention for miRNA imaging and the MR imaging mechanism.
2 is a transmission electron micrograph (scale bar means 50 nm) of magnetic fluorescent (MF) nanoparticles (left), 3a-MF nanoparticles (middle) and 5a-MF nanoparticles (right).
3 shows the results of dynamic light scattering analysis of magnetic fluorescent (MF) nanoparticles, 3a-MF nanoparticles and 5a-MF nanoparticles.
FIG. 4 shows the process of decomposing nanoparticles again by adding miR124a to miR124a MR beacons and miR124a mt MR beacons prepared by adding miR124a linker and miR124a mt linker to a mixture of 3a-MF nanoparticles and 5a-MF nanoparticles, ("No miR124a linker" means a mixture of 3a-MF nanoparticles and 5a-MF nanoparticles without miR124a linker).
5 shows the process of decomposing nanoparticles again by adding miR124a to miR124a MR beacons and miR124a mt MR beacons prepared by adding miR124a linker and miR124a mt linker to a mixture of 3a-MF nanoparticles and 5a-MF nanoparticles. The results are compared and analyzed through a focusing microscope.
Figure 6 shows the physical properties of the miR124a MR beacon in in vitro, (a) TEM photographs of a mixture of 3a-MF and 5a-MF nanoparticles with the miR124a MR beacon and miR124a mt (B) is the result of T2-weighted MR image analysis by miR124a concentration.
Figure 7 shows that miR124a MR beacon and miR124a mt MR beacons prepared by adding miR124a linker and miR124a mt linker to a mixture of 3a-MF nanoparticles and 5a-MF nanoparticles, while miR124a is added, The results of DLS analysis confirmed particle size change.
Figure 8 shows T2-weighted MR images of 3a-MF nanoparticles and 5a-MF nanoparticle mixtures in the absence of miR124a linker.
FIG. 9 shows the results of MTT analysis of cytotoxicity of 3a-MF nanoparticles and 5a-MF nanoparticle mixture.
Fig. 10 shows the result of analyzing the fluorescence image of nanoparticles using a confocal scanning electron microscope after addition of miR124a to HeLa cells transfected with two kinds of MR beacons (a: red nanoparticles, blue Color is the nucleus of the cell, "miR124a linker is absent" is an image of a non-aggregated nanoparticle showing HeLa cells transfected with a mixture of two nanoparticles without the miR124a linker) and (a) (B) shows the result of analyzing the MR image by recovering the corresponding cell sample.
Fig. 11 shows the results of miR124a MR beacon stability experiment (blue nucleus, red nanoparticle, scale bar = 1 mu m).
FIG. 12 shows the results of immunohistochemical staining for the expression of undifferentiated markers (Oct-4) and neuronal markers (NeuroD) by inducing neural differentiation by adding RA to P19 cells (blue nucleus, nucleus red, Oct4, NeuroD).
FIG. 13 shows the results of qRT-PCR for the induction of neural differentiation by adding RA to P19 cells and the change in the expression level of neuronal differentiation-specific miR124a during the differentiation process.
FIG. 14 shows the results of (a) and (b) showing the change in miR124a MR beacon size using a confocal fluorescence microscope after transfection of miR124a MR beacon into P19 cells, induction of neural differentiation by addition of RA, (B) and (c) showing the T2-weighted MR images in the in vivo differentiation of neurons (RA (+) means RA addition, yellow RA (-) means no RA, marked with a red arrow).
FIG. 15 shows the results of examining the expression of Oct and NeuroD in nerve differentiation-inducing tissues of nude mice using miR124a MR beacons (blue nucleus, red, Oct4, NeuroD).
FIG. 16 shows the results of examining the expression of Oct and NeuroD in nerve differentiation-inducing tissues of a nude mouse using miR124a mt MR beacon (blue nucleus, red color, Oct4, NeuroD).

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.

본 발명은 제1접속(adaptor)분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자; 제2접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자; 및 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역과 상기 제1접속분자 및 제2접속분자와 혼성화될 수 있는 링커 영역을 함유하는 핵산 프로브를 포함하며, 상기 자성 형광 나노입자들의 제1접속분자 및 제2접속분자와 상기 핵산 프로브의 링커 영역이 혼성화되어 자가조립(self-assembly) 형 구조를 나타내는 자기 공명 비콘에 관한 것이다.The present invention relates to magnetic fluorescent nanoparticles having surface-bonded first adapter molecules; A magnetic fluorescent nanoparticle surface-bonded with a second connecting molecule; And a nucleic acid probe containing a region specifically binding to the target molecule and a linker region capable of hybridizing with the first connecting molecule and the second connecting molecule, wherein the first connecting molecule and the second connecting molecule of the magnetic fluorescent nanoparticles And a linker region of the nucleic acid probe are hybridized to form a self-assembly type structure.

본 발명의 자기 공명 비콘은 타겟 분자의 영상화를 위한 자성 형광 나노입자 기반의 이미징 프로브로서, 도 1을 참조하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.The magnetic resonance beacon of the present invention is a magnetic fluorescent nanoparticle-based imaging probe for imaging target molecules, which will be described in detail with reference to FIG.

상기 자기 공명 비콘은 자성 형광 나노입자의 표면에 결합된 제1접속분자 및 자성 형광 나노입자의 표면에 결합된 제2접속분자가 핵산 프로브의 링커 영역과 혼성화되어 응집된 자가조립 형 구조로 되어 있다.The magnetic resonance beacon has a self-assembled structure in which the first connecting molecule bonded to the surface of the magnetic fluorescent nanoparticle and the second connecting molecule bonded to the surface of the magnetic fluorescent nanoparticle hybridize with the linker region of the nucleic acid probe and coagulate .

상기 자성 형광 나노입자는 코어부가 금속, 자성 또는 자성합금으로 되어 있고, 표면은 형광물질이 결합되어 있는 코어-쉘 구조를 가지고 있으며, 아울러 접속분자가 결합할 수 있도록 기능기로 표면 개질되어 있다. 또한, 접속분자는 말단에 기능기가 도입되어 있어 자성 형광 나노입자의 표면에 고정된다.The magnetic fluorescent nanoparticles have a core-shell structure in which a core part is made of a metal, a magnetic or a magnetic alloy, a surface is a fluorescent material, and the surface is modified to function as a binding molecule. Further, the connecting molecule is fixed to the surface of the magnetic fluorescent nanoparticle with the functional group introduced at the terminal.

접속분자가 표면에 고정된 자성 형광 나노입자는 타겟 분자를 탐지할 수 있도록 디자인된 핵산 프로브와 혼성화하여 응집된다. 이러한 응집된 상태를 본 명세서에서는 자가조립(self-assembly)형 구조로 명명한다. 이때 핵산 프로브는 타겟 분자와 특이적으로 결합하는 영역과 접속분자와 혼성화될 수 있는 링커 영역을 함께 포함한다. 따라서, 핵산 프로브는 타겟 분자가 존재하지 않을 때는 접속분자와 혼성화될 수 있는 링커 영역에 의해 자성 형광 나노입자에 혼성화되어 자가조립 형 구조를 형성한다. 그러나, 타겟 분자가 존재하는 경우 핵산 프로브는 타겟 분자와의 결합을 위해 자성 형광 나노입자의 자가조립 형 구조에서 떨어져 나와 자성 형광 나노입자의 자가조립 형 구조 즉, 자기 공명 비콘은 자가조립 형 구조가 해체되면서 자성 형광 나노입자와, 타겟 분자와 핵산 프로브의 혼성화물이 분산되어 존재하게 된다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 인 비트로 실험에서 자가조립 형 구조는 시험관 내에서 침전을 형성하고, 타겟 분자에 의해 분해가 일어나는 경우, 침전되었던 자성 형광 나노입자가 서로 분리되면서 상층부로 떠오르는 현상이 일어난다.Magnetic fluorescent nanoparticles with attached molecules immobilized on their surface hybridize with and hybridize with nucleic acid probes designed to detect target molecules. This aggregated state is referred to herein as a self-assembly type structure. Wherein the nucleic acid probe includes a region specifically binding to the target molecule and a linker region capable of hybridizing with the connecting molecule. Thus, when the target molecule is not present, the nucleic acid probe hybridizes to the magnetic fluorescent nanoparticle by a linker region that can hybridize with the connecting molecule to form a self-assembled structure. However, when the target molecule is present, the nucleic acid probe is separated from the self-assembled structure of the magnetic fluorescent nanoparticle for binding with the target molecule, and the self-assembled structure of the magnetic fluorescent nanoparticle, that is, the self- The magnetic fluorescent nanoparticles and the hybrid of the target molecule and the nucleic acid probe are dispersed and present. According to one embodiment of the present invention, the self-assembly type structure in the in-vitro experiment forms a precipitate in a test tube, and when the target molecule decomposes, the precipitated magnetic fluorescent nanoparticles separate from each other and float to the upper layer It happens.

한편, 본 발명의 자기 공명 비콘은 타겟 분자가 존재하지 않을 경우 자기조립 형 구조로 인해 약한 MRI 신호를 나타내기 때문에 자성 형광 나노입자로 흩어져 있을 때보다 낮은 T2 값을 가진다. 그러나, 타겟 분자가 존재하면 자기 공명 비콘에 혼성화되어 있던 핵산 프로브가 타겟 분자와의 결합을 위해 자기 공명 비콘에서 떨어져 나오게 되어 응집되어 있던 자가조립 형 구조는 분해되고, MRI 신호는 활성화되어 T2 값이 증가하게 된다. On the other hand, the magnetic resonance beacon of the present invention exhibits a weak MRI signal due to the self-assembled structure when the target molecule is not present, and thus has a value T2 lower than that when dispersed in the magnetic fluorescent nanoparticles. However, in the presence of the target molecule, the nucleic acid probe hybridized to the magnetic resonance beacon is separated from the magnetic resonance beacon for binding with the target molecule, so that the self-assembled structure that has been aggregated is decomposed and the MRI signal is activated, .

요약하면, 본 발명에 따른 자기 공명 비콘은 타겟 분자가 존재하지 않을 때에는 시그널-오프 되어 있다가, 타겟 분자가 본 발명의 자기 공명 비콘 내 핵산 프로브와 결합하게 되면 자가조립 형 구조가 분해되면서 시그널-온 되는 분자 탐지 시스템을 제공한다. 따라서 이러한 본 발명의 자기 공명 비콘을 이용하면 탐지하고자 하는 타겟 분자의 존재 여부를 자기 공명 신호의 on-off를 통해 확인하고, 이를 MR 이미지로 나타냄과 동시에 형광 이미지로도 나타낼 수 있게 된다. In summary, the magnetic resonance beacon according to the present invention is signal-off when the target molecule is absent, and when the target molecule is bound to the nucleic acid probe in the magnetic resonance beacon of the present invention, the self- On < / RTI > Therefore, by using the magnetic resonance beacon of the present invention, the presence or absence of the target molecule to be detected can be confirmed by on-off of the magnetic resonance signal, and can be represented as a fluorescent image as well as an MR image.

본 발명에 있어서, 자성 나노입자는 자성을 가지고, 직경이 1nm 내지 1000nm, 더 구체적으로는 2nm 내지 100nm, 보다 구체적으로는 40 내지 70nm인 입자라면 제한 없이 사용될 수 있다. 한편, 자성 나노입자에 접속분자가 결합되는 경우 상기 직경은 측정 가능한 정도의 일부 증가를 보이며, 핵산 프로브가 도입될 경우 자성 나노입자와 핵산 프로브의 응집으로 인해 자기 공명 비콘의 평균 직경은 300nm 내지 600nm, 더 구체적으로는 400nm 내지 500nm로 증가할 수 있다. 여기에 타겟 분자를 도입할 경우 자기 공명 비콘의 구조가 분해되면서, 타겟 분자의 농도 의존적으로 자기 공명 비콘의 평균 직경은 감소하는 패턴을 보일 수 있다. In the present invention, the magnetic nanoparticles may be used without limitation as long as they are magnetic and have a diameter of 1 nm to 1000 nm, more specifically 2 nm to 100 nm, and more specifically 40 to 70 nm. On the other hand, when the connecting molecule is bonded to the magnetic nanoparticles, the diameter shows a measurable increase in some extent. When the nucleic acid probe is introduced, the average diameter of the magnetic resonance beacons due to the agglomeration of the magnetic nanoparticles and the nucleic acid probe is 300 nm to 600 nm , More specifically from 400 nm to 500 nm. When the target molecule is introduced into the magnetic beacon, the structure of the magnetic resonance beacon is decomposed, and the average diameter of the magnetic resonance beacon decreases depending on the concentration of the target molecule.

한 구체예에서, 자성 나노입자는 금속 물질(metal material), 자성 물질(magnetic material), 또는 자성 합금(magnetic alloy)일 수 있다. In one embodiment, the magnetic nanoparticles may be a metal material, a magnetic material, or a magnetic alloy.

상기 금속 물질은 특별히 제한되지는 않으나 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.The metal material is not particularly limited, but may be at least one selected from the group consisting of Pt, Pd, Ag, Cu and Au.

상기 자성 물질 역시 특별히 제한되지는 않으나, Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄,및 M_pO_q (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 "0 < P = 3" 및 "0 < q = 5" 를 만족한다.)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.But it is not particularly limited and the magnetic material, too, Co, Mn, Fe, Ni , Gd, Mo, MM '2 O 4, And M _p O _q (Wherein M and M 'each independently represent Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, or Cr; p and q satisfy the expressions "0 & .). &Lt; / RTI >

또한 상기 자성 합금 역시 특별히 제한되지는 않으나, CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.Also, the magnetic alloy is not particularly limited, but may be at least one selected from the group consisting of CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe, and NiFeCo.

또한, 본 발명의 자성 나노입자는 표면에 형광물질이 코팅되어 있고, 상기 형광물질은 생체 이미징에 사용할 수 있는 형광물질이면 어떠한 것이든 가능하다. 한 구체예에서, 상기 형광물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 로다민과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체, 및 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 형광 물질을 보다 구체적으로 예시하면 다음과 같다:Further, the magnetic nanoparticles of the present invention are coated with a fluorescent substance on the surface, and the fluorescent substance can be any fluorescent substance that can be used for biological imaging. In one embodiment, the fluorescent material includes, but is not limited to, rhodamine and its derivatives, fluorescein and its derivatives, coumarin and its derivatives, acridine and its derivatives, pyrene and its derivatives, erythrosine and its derivatives, And derivatives thereof, and 4-acetamido-4'-isothiocyanatostilbene-2,2 'disulfonic acid. A more specific example of the fluorescent substance is as follows:

로다민 및 그의 유도체: 6-카복시-X-로다민 (ROX), 6-카복시로다민 (R6G), 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(Texas Red), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민 (TAMRA), 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 리보플라빈, 로졸산, 터븀 킬레이트 유도체, Alexa 유도체, Alexa-350, Alexa-488, Alexa-547, Alexa-647; Rhodamine and its derivatives : 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), 6-carboxyidamine (R6G), lysaminrodamine B sulfonyl chloride, rhodamine, rhodamine B, rhodamine 123, N, N, N ' -tetramethyl-6-carboxyhodamine < RTI ID = 0.0 > (R) < / RTI & (TAMRA), tetramethylrhodamine, tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), riboflavin, rosol acid, terbium chelate derivatives, Alexa derivatives, Alexa-350, Alexa-488, Alexa-547, Alexa-647;

플루오레세인 및 그의 유도체: 5-카복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, QFITC(XRITC), 플루오레스카민(fluorescamine), IR144, IR1446, 말라카이트 그린 이소티오시아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오르토 크레졸 프탈레인, 니트로티로신, 파라로자닐린, 페놀 레드, B-피코에리트린, o-프탈디알데히드; Fluoresceins and derivatives thereof : 5-carboxyfluorescein (FAM), 5- (4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF), 2'7'-dimethoxy- (JOE), fluorescein, fluorescein isothiocyanate, QFITC (XRITC), fluorescamine, IR144, IR1446, malachite green isothiocyanate, 4-methylumbelliferone, orthocresolphthalein, nitrotyrosine, pararosaniline, phenol red, B-picoerythrine, o-phthalaldehyde;

쿠마린 및 그의 유도체: 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린(쿠마린 151), 시아노신, 4'-6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5',5''-디브로모피로갈롤-설폰프탈레인(Bromopyrogallol Red), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4-(4'-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산, 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디설폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드(DNS, dansyl chloride), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL) 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트(DABITC); Coumarin and its derivatives : coumarin, 7-amino-4-methylcoumarin (AMC, coumarin 120), 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (coumarin 151), cyanosine, 2-phenylindole (DAPI), 5 ', 5 " -dibromopirogol Bromopyrogallol Red, 7-diethylamino-3- (4 ' -isothiocyanatophenyl) -4- Methylcoumarin diethylenetriamine pentaacetate, 4- (4'-diisothiocyanato dihydro-stilbene-2,2'-disulfonic acid, 4,4'-diisothiocyanatostilbene- 4-dimethylaminophenyl azophenyl-4'-disulfonic acid, 5- [dimethylamino] naphthalene-1-sulfonyl chloride, 4- (4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (DABCYL) - isothiocyanate (DABITC);

아크리딘 및 그의 유도체: 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈이미드-3,5디설포네이트(LuciferYellow VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, Brilliant Yellow; Acridine and its derivatives : acridine, acridine isothiocyanate, 5- (2'-aminoethyl) aminonaphthalene-1-sulfonic acid (EDANS) Phenyl] naphthalimide-3,5 disulfonate (Lucifer Yellow VS), N- (4-anilino-1-naphthyl) maleimide, anthranylamide, Brilliant Yellow;

피렌 및 그의 유도체: 피렌, 피렌 부티레이트, 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트, Reactive Red 4(Cibacron^®Brilliant Red 3B-A); Pyrene and its derivatives : pyrene, pyrene butyrate, succinimidyl 1-pyrene butyrate, Reactive Red 4 (Cibacron ^® Brilliant Red 3B-A);

에리트로신 및 그의 유도체: 에리트로신 B, 에리트로신 이소티오시아네이트, 에티듐; Erythrosine and its derivatives : erythrosine B, erythrosine isothiocyanate, ethidium;

에오신 및 그의 유도체: 에오신, 에오신 이소티오시아네이트; Eosin and its derivatives : eosin, eosin isothiocyanate;

4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디설폰산.4-acetamido-4 ' -isothiocyanato stilbene-2,2 ' disulfonic acid.

본 발명의 자성 형광 나노입자는 표면에 접속분자가 고정되어 있다.In the magnetic fluorescent nanoparticles of the present invention, the connecting molecule is fixed on the surface.

본 명세서에서 "접속분자"는 생물학 분야에서 사용되는 용어로, 분자간 연결을 위해 사용되는 분자를 의미한다. 본 발명에서는 자성 형광 나노입자와 핵산 프로브가 응집될 수 있도록 하는 연결 분자로 자성 형광 나노입자의 표면에 접속분자가 고정되어 있고, 상기 접속분자와 혼성화될 수 있는 링커 영역을 핵산 프로브가 함유하고 있어 접속분자와 링커 영역의 혼성화에 의해 자성 형광 나노입자와 핵산 프로브가 연결 또는 응집될 수 있다. 본 명세서에서, 상기 접속분자는 제1접속분자와 제2접속분자로 나눌 수 있다. 상기 제1접속분자 또는 제2접속분자는 링커 영역의 일정 서열과 상보적이되, 서로 상이한 염기서열로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 상기 제1접속분자와 제2접속분자는 "3'-어답터 또는 5'-어답터"와 혼용되어 사용될 수 있다.As used herein, the term "connecting molecule" refers to a molecule used for intermolecular coupling, as used in the biological field. In the present invention, the connecting molecule is immobilized on the surface of the magnetic fluorescent nanoparticle as a connecting molecule capable of aggregating the magnetic fluorescent nanoparticle and the nucleic acid probe, and the nucleic acid probe contains a linker region capable of hybridizing with the connecting molecule By hybridization of the linking molecule and the linker region, the magnetic fluorescent nanoparticle and the nucleic acid probe can be linked or aggregated. In the present specification, the connecting molecule may be divided into a first connecting molecule and a second connecting molecule. The first connecting molecule or the second connecting molecule is complementary to a constant sequence of the linker region, and may be represented by a different base sequence. In this specification, the first connecting molecule and the second connecting molecule may be used in combination with a "3'-adapter or a 5'-adapter".

상기 접속분자는 4 내지 30개의 핵산 서열을 갖는 뉴클레오타이드일 수 있다. 더 구체적으로 10 내지 25개의 핵산 서열을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, SEQ ID NO: 1 또는 2에 기재된 염기서열로 표시될 수 있다. 가장 구체적으로, 제1접속분자는 SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열로, 제2접속분자는 SEQ ID NO: 2에 기재된 염기서열로 표시될 수 있다. 또는 제1접속분자는 SEQ ID NO: 2에 기재된 염기서열로, 제2접속분자는 SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열로 표시될 수 있으나, 핵산 프로브의 링커 영역과 혼성화를 이룰 수 있는 서열이라면 제한 없이 사용할 수 있다. The connecting molecule may be a nucleotide having 4 to 30 nucleotide sequences. More specifically from 10 to 25 nucleic acid sequences. More specifically, it can be represented by the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1 or 2. Most specifically, the first connecting molecule may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the second connecting molecule may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. Or the first connecting molecule may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and the second connecting molecule may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but if it is a sequence capable of hybridizing with the linker region of the nucleic acid probe Can be used without restrictions.

상기 접속분자는 일 말단에 기능기가 도입되어 있어 자성 형광 나노입자에 존재하는 기능기와 공유결합을 통해 자성 형광 나노입자의 표면에 고정될 수 있다.The functional molecule is introduced at one end of the connecting molecule and can be immobilized on the surface of the magnetic fluorescent nanoparticle through a covalent bond with a functional group existing in the magnetic fluorescent nanoparticle.

본 발명에서 있어서, 상기 핵산 프로브는 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역 및 상기 접속분자, 구체적으로 제1접속분자와 제2접속분자와 혼성화될 수 있는 링커 영역을 함유하는 단일 가닥의 올리고머로 디자인된다. In the present invention, the nucleic acid probe is designed as a single strand oligomer containing a region specifically binding to a target molecule and a linker region capable of hybridizing with the connecting molecule, specifically, the first connecting molecule and the second connecting molecule do.

상기 핵산 프로브에 포함되어 있는 "타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역"은 타겟 분자의 일부분과 상보적인 서열을 가져 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 예를 들어, 상기 "타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역"은 타겟 분자의 일부분과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다. 만일 타겟 분자가 단백질인 경우, 상기 "타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역"은 핵산 프로브로서 작용하는 앱타머에 있어서 타겟 분자인 단백질과 혼성화될 수 있는 영역을 의미한다. 상기 "타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역"은 타겟 분자에 따라 적절히 그 길이를 조절할 수 있으며, 특정 길이로 한정될 필요가 없다. 예를 들어, 타겟 분자가 miRNA인 경우 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역은 22개 내외의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있으나, 타겟 분자가 mRNA인 경우 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역은 그보다 짧거나 더 길 수 있다.The "region specifically binding to the target molecule" contained in the nucleic acid probe refers to a sequence having a sequence complementary to a part of the target molecule and capable of hybridizing with the target molecule. For example, the "region specifically binding to the target molecule" may have a sequence complementary to at least 90%, preferably 95% or more, of a portion of the target molecule. If the target molecule is a protein, the "region specifically binding to the target molecule" means a region capable of hybridizing with a protein as a target molecule in an aptamer serving as a nucleic acid probe. The "region specifically binding to the target molecule" can appropriately adjust its length according to the target molecule, and need not be limited to a specific length. For example, when the target molecule is miRNA, the region specifically binding to the target molecule may be composed of about 22 nucleotides or more, but when the target molecule is mRNA, the region that can hybridize with the target molecule is shorter or longer It can be long.

상기 접속분자와 혼성화될 수 있는 링커 영역은 제1접속분자 및 제2접속분자 각각에 상보적인 서열을 함유하는 4 내지 30개의 핵산 서열을 갖는 뉴클레오타이드일 수 있다. 더 구체적으로 10 내지 20개의 핵산 서열을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, SEQ ID NO: 3에 기재된 염기서열로 표시될 수 있으나, 상기 접속분자와 혼성화 조건에서 혼성화를 이룰 수 있는 서열이라면 제한 없이 사용할 수 있다. The linker region capable of hybridizing with the connecting molecule may be a nucleotide having 4 to 30 nucleotide sequences containing a sequence complementary to each of the first connecting molecule and the second connecting molecule. More specifically 10 to 20 nucleic acid sequences. More specifically, it can be represented by the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 3, but it can be used without limitation as long as it is capable of hybridization under hybridization conditions with the above-mentioned connecting molecule.

한편, 본 발명의 자기 공명 비콘으로 탐지 가능한 타겟 분자의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 상기 타겟 분자는 microRNA, mRNA, RNA, DNA, 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 본 발명의 하기 실시예에서는 타겟 분자로서 microRNA를 대상으로 하여 이를 탐지할 수 있는 자기 공명 비콘을 설계하고, 이를 제조하여 microRNA를 탐지한 결과를 보여주고 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 타겟 분자가 단백질일 경우 이를 탐지할 수 있는 핵산 프로브로서 적당한 앱타머를 합성하고 이를 자기 공명 비콘에 도입하여 특정 단백질을 탐지할 수도 있다.On the other hand, the kind of the target molecule which can be detected by the magnetic resonance beacon of the present invention is not particularly limited. In one embodiment, the target molecule may be a microRNA, mRNA, RNA, DNA, peptide or protein. In the following example of the present invention, a magnetic resonance beacon capable of detecting microRNA as a target molecule is designed and manufactured and microRNA is detected, but the present invention is not limited thereto. For example, when a target molecule is a protein, a suitable aptamer may be synthesized as a nucleic acid probe capable of detecting the target molecule, and the specific aptamer may be introduced into a magnetic resonance beacon to detect a specific protein.

본 발명의 자기 공명 비콘은 엔도사이토시스 또는 트랜스펙션에 의해 세포내로 도입될 수 있다.The magnetic resonance beacons of the present invention may be introduced into cells by endocytosis or by transfection.

한 구체예에서, 상기 자기 공명 비콘에는 추가로 세포내 전달 리간드가 결합되어 있을 수 있다. 세포내 전달 리간드는 본 발명의 자기 공명 비콘이 세포막 또는 추가적인 세포내 기관 막을 쉽게 통과할 수 있도록 도와주는 물질을 말한다. 예컨대, 이러한 세포내 전달 리간드로는 단백질 전달 도메인(protein transduction domain), 막투과 도메인(transmembrane domain) 또는 세포 침투 펩타이드(cell penetrating peptide)를 이용할 수 있다. 이들 세포내 전달 리간드 및 이를 이미징 프로브에 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.In one embodiment, the magnetic resonance beacon may further comprise an intracellular delivery ligand. Intracellular delivery ligand refers to a substance that facilitates the passage of the magnetic resonance beacons of the present invention through cell membranes or additional intracellular tracheal membranes. For example, a protein transduction domain, a transmembrane domain, or a cell penetrating peptide may be used as the intracellular delivery ligand. These intracellular delivery ligands and methods for introducing them into an imaging probe are well known in the art.

또한, 상기 자기 공명 비콘에는 추가로 세포 또는 조직 타겟팅 리간드가 결합되어 있을 수 있다. 세포 또는 조직 타겟팅 리간드는 본 발명의 자기 공명 비콘이 원하는 표적 핵산 분자가 존재하는 조직 또는 세포 내로 도입될 수 있도록 유도해 주는 역할을 할 수 있다. 이러한 세포 또는 조직 타겟팅 리간드로는 항체, 앱타머, 펩타이드 등을 이용할 수 있으며, 세포나 조직의 유형에 따른 특이적 마커나 이에 대해 결합할 수 있는 타겟팅 리간드, 그리고 이러한 타겟팅 리간드를 이미징 프로브에 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.In addition, the magnetic resonance beacon may further have a cell or tissue targeting ligand bound thereto. The cell or tissue targeting ligand may serve to induce the magnetic resonance beacon of the present invention to be introduced into a tissue or cell in which a desired target nucleic acid molecule exists. Such a cell or tissue targeting ligand can be an antibody, an aptamer, a peptide, or the like, and can be a targeting ligand capable of binding to a specific marker or a cell or tissue type-specific ligand, and a targeting ligand Methods are well known in the art.

상기 자기 공명 비콘은 자성 형광 나노입자, 제1접속분자, 제2접속분자 및 핵산 프로브의 혼성화를 통한 자가조립을 통해 이루어질 수 있다.The magnetic resonance beacon may be achieved through self-assembly through hybridization of the magnetic fluorescent nanoparticles, the first connecting molecule, the second connecting molecule and the nucleic acid probe.

이를 위해, 제1접속분자 또는 제2접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자를 제조한다. For this purpose, magnetic fluorescent nanoparticles having surface-bound first binding molecules or second binding molecules are prepared.

상기 제1접속분자 또는 제2접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자는 자성 형광 나노입자에 존재하는 기능기와 접속분자에 도입된 기능기 간의 공유결합을 통해 제조할 수 있다. The magnetic fluorescent nanoparticles having the first binding molecule or the second binding molecule surface-bonded can be produced through a covalent bond between a functional group existing in the magnetic fluorescent nanoparticle and a functional group introduced into the connecting molecule.

상기 자성 형광 나노입자의 표면에 존재하는 기능기는 본래 존재하거나, 표면 개질한 것일 수 있다. 자성 형광 나노입자의 표면에 존재하는 기능기의 종류는 접속분자에 도입된 기능기를 어떠한 것으로 선택하느냐에 따라 달라질 수 있다. 즉, 자성 형광 나노입자의 표면에 존재하는 기능기와 접속분자 상에 도입된 기능기는 서로 결합을 형성할 수 있도록 공지의 기능기 결합예로부터 선택될 수 있다. 이러한 공지의 기능기 결합예 중 대표적인 예를 하기 표 1에 나타내었다.The functional groups present on the surface of the magnetic fluorescent nanoparticles may be inherently or surface-modified. The type of functional groups present on the surface of the magnetic fluorescent nanoparticles may vary depending on what functional groups are introduced into the connecting molecule. That is, the functional groups existing on the surface of the magnetic fluorescent nanoparticles and the functional groups introduced on the connecting molecules can be selected from known functional group binding examples so as to form bonds with each other. Representative examples of these known functional group binding examples are shown in Table 1 below.

II IIII IIIIII R-NH₂ R-NH ₂ R'-COOHR'-COOH R-NHCO-R'R-NHCO-R ' R-SHR-SH R'-SHR'-SH R-SS-RR-SS-R R-OHR-OH R'-(에폭시기)R '- (epoxy group) R-OCH₂C(OH)CH₂-R'R-OCH ₂ C (OH) CH ₂ -R ' RH-NH₂ RH-NH ₂ R'-(에폭시기)R '- (epoxy group) R-NHCH₂C(OH)CH₂-R' _{R-NHCH 2 C (OH)} CH 2 -R ' R-SHR-SH R'-(에폭시기)R '- (epoxy group) R-SCH₂C(OH)CH₂-R'R-SCH ₂ C (OH) CH ₂ -R ' R-NH₂ R-NH ₂ R'-COHR'-COH R-N=CH-R'R-N = CH-R ' R-NH₂ R-NH ₂ R'-NCOR'-NCO R-NHCONH-R'R-NHCONH-R ' R-NH₂ R-NH ₂ R'-NCSR'-NCS R-NHCSNH-R'R-NHCSNH-R ' R-SHR-SH R'-COCH₂ R'-COCH ₂ R'-COCH₂S-RR'-COCH ₂ SR R-SHR-SH R'-O(C=O)XR ' -O (C = O) X R-OCH₂(C=O)O-R' _{R-OCH 2 (C = O} ) O-R ' R-(아지리딘기)R- (aziridine group) R'-SHR'-SH R-CH₂CH(NH₂)CH₂S-R'R-CH ₂ CH (NH ₂ ) CH ₂ S-R ' R-CH=CH₂ R-CH = CH ₂ R'-SHR'-SH R-CH₂CHS-R'R-CH ₂ CHS-R ' R-OHR-OH R'-NCOR'-NCO R'-NHCOO-RR'-NHCOO-R R-SHR-SH R'-COCH₂XR'-COCH ₂ X R-SCH₂CO-R'R-SCH ₂ CO-R ' R-NH₂ R-NH ₂ R'-CON₃ R'-CON ₃ R-NHCO-R'R-NHCO-R ' R-COOHR-COOH R'-COOHR'-COOH R-(C=O)O(C=O)-R' + H₂OR- (C = O) O (C = O) -R '+ H ₂ O R-SHR-SH R'-XR'-X R-S-R'R-S-R ' R-NH₂ R-NH ₂ R'CH₂C(NH² ⁺)OCH₃ _{^{^{R'CH 2 C (NH 2 +)}}} OCH 3 R-NHC(NH² ⁺)CH₂-R' ^{^{R-NHC (NH 2 +)}} CH 2 -R ' R-OP(O² ^-)OH ^{^{R-OP (O 2 -)}} OH R'-NH₂ R'-NH ₂ R-OP(O² ^-)-NH-R' ^{^{R-OP (O 2 -)}} -NH-R ' R-CONHNH₂ R-CONHNH ₂ R'-COHR'-COH R-CONHN=CH-R'R-CONHN = CH-R ' R-NH₂ R-NH ₂ R'-SHR'-SH R-NHCO(CH₂)₂SS-R'R-NHCO (CH ₂ ) ₂ SS-R ' I 또는 II: 자성 형광 나노입자 상에 존재하는 기능기 또는 접속분자 상에 도입된 기능기
III: I과 II의 반응에 따른 결합예I or II: a functional group existing on the magnetic fluorescent nanoparticle or a functional group introduced on the connecting molecule
III: Examples of bonding by reactions of I and II

한 구체예에서, 상기 자성 형광 나노입자 상에 존재하는 기능기는 -COOH, -CHO, -NH₂, -SH, -CONH₂, -PO₃H, -PO₄H, -SO₃H, -SO₄H, -OH, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기 및 -알킬기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In an embodiment, the functionality present on the magnetic fluorescent nanoparticle group _{-COOH, -CHO, -NH 2, -SH} , -CONH 2, -PO 3 H, -PO 4 H, -SO 3 H, -SO ₄ H, -OH, -sulfonate, -nitrate, -phosphonate, -succinimidyl, -maleimide and -alkyl groups.

한 구체예에서, 상기 접속분자에 도입된 기능기는 -NH₂, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -COCH₂, -SH, -CON₃ 및 -CH₂C(NH² ⁺)OCH₃로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment, the functional groups introduced into the connecting molecule are -NH ₂ , -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -COCH ₂ , -SH, -CON ₃ and -CH ₂ C (NH ² ⁺ ) OCH ₃ < / RTI >

한 구체예에서, 상기 자성 형광 나노입자 상에 존재하는 기능기는 -COOH이고, 상기 접속분자에 도입된 기능기는 -NH₂일 수 있다. 즉, 표면에 -COOH를 갖는 자성 형광 나노입자에 5' 말단에 -NH₂를 갖는 접속분자를 결합시킴으로써 자성 형광 나노입자의 표면에 핵산 프로브와 혼성화할 수 있는 접속분자가 연결되는 것이다.In one embodiment, the functional group present on the magnetic fluorescent nanoparticles is -COOH, and the functional group introduced into the connecting molecule may be -NH ₂ . That is, by connecting a connecting molecule having -NH ₂ at the 5 'end to a magnetic fluorescent nanoparticle having -COOH on its surface, a connecting molecule capable of hybridizing with the nucleic acid probe is connected to the surface of the magnetic fluorescent nanoparticle.

상기 자성 형광 나노입자 상에 존재하는 기능기와 접속분자에 도입된 기능기 간의 결합은 공지의 가교제를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 가교제는 이에 제한되는 것은 아니나, N-에틸-N’디메틸아미노프로필 카보디이미드(N-ethyl-N’dimethylaminopropyl carbodiimide), 1,4-디이소티오시아나토벤젠(1,4-Diisothiocyanatobenzene), 1,4-페닐린 디이소시아네이트(1,4-Phenylene diisocyanate), 1,6-디이소시아나토헥산(1,6-Diisocyanatohexane), 4-(4-말레이미도페닐)뷰트릭산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(4-(4-Maleimidophenyl)butyric acid N-hydroxysuccinimide ester), 포스겐(Phosgene solution), 4-(말레이미도)페닐 이소시아네이트(4-(Maleinimido)phenyl isocyanate), 1,6-헥산디아민(1,6-Hexanediamine), 파라-니트로페닐클로로포르메이트(p-Nitrophenyl chloroformate), 노말-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide), 1,3-디사이클로헥실카르보이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide), 1,1′-카르보닐디이미다졸(1,1′-Carbonyldiimidazole), 3-말레이미도벤조익산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(3-Maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester), 에틸렌디아민(Ethylenediamine), 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(Bis(4-nitrophenyl) carbonate), 숙시닐 클로라이드(Succinyl chloride), N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride), N,N′-디숙신이미딜 카르보네이트(N,N′-Disuccinimidyl carbonate), N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), 및 숙시닉 언하이드라이드(sucinic anhydride) 로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 이러한 결합 반응은 당업계에 공지된 적절한 용매 중에서 수행될 수도 있다.The binding between the functional groups existing on the magnetic fluorescent nanoparticles and the functional groups introduced into the connecting molecule can be carried out by using a known crosslinking agent. Such cross-linking agents include, but are not limited to, N-ethyl-N'dimethylaminopropyl carbodiimide, 1,4-diisothiocyanatobenzene, 1,4-phenylene diisocyanate, 1,6-diisocyanatohexane, 4- (4-maleimidophenyl) butyric acid, n-hydroxysuccinic acid (4-maleimidophenyl) butyric acid N-hydroxysuccinimide ester, Phosgene solution, 4- (maleinimido) phenyl isocyanate, 1,6-hexanediamine 1,6-hexanediamine, p-nitrophenyl chloroformate, N-hydroxysuccinimide, 1,3-dicyclohexylcarbodiimide, ), 1,1'-carbonyldiimidazole, 3-maleimidobenzoic acid n-hydroxy-succinic acid 3-maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester, ethylenediamine, bis (4-nitrophenyl) carbonate, succinyl chloride, N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide Hydrochloride, N, N'-disuccinimidyl carbonate (N, N ' -Disuccinimidyl carbonate, N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate, and succinic anhydride. &Lt; / RTI > Such coupling reaction may be carried out in an appropriate solvent known in the art.

한 구체예에서, 상기 자성 형광 나노입자와 제1접속분자를 반응시켜 제1접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자와, 자성 형광 나노입자와 제2접속분자를 반응시켜 제2접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자를 각각 제조할 수 있다. In one embodiment, the magnetic fluorescent nanoparticles and the first connecting molecule are allowed to react with each other so that the first connecting molecule is surface-coupled with the magnetic fluorescent nanoparticles, and the second connecting molecule is reacted with the magnetic fluorescent nanoparticles, The combined magnetic fluorescent nanoparticles can be respectively prepared.

상기 단계에서 제조된 제1접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자 및 제2접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자를 핵산 프로브와 혼성화 조건에서 반응시키는 경우, 핵산 프로브에 존재하는 링커 영역과, 제1접속분자 및 제2접속분자의 혼성화에 의해 자성 형광 나노입자는 서로 응집되어 자가조립 형 구조를 이루게 되고, 본 명세서에서는 이를 자기 공명 비콘이라 한다.
In the case of reacting the magnetic fluorescent nanoparticles surface-coupled with the first connecting molecule surface-bound magnetic fluorescent nanoparticles and the second connecting molecule surface-bound to the nucleic acid probe under the hybridization condition, the linker region present in the nucleic acid probe, By the hybridization of the first connecting molecule and the second connecting molecule, the magnetic fluorescent nanoparticles aggregate to form a self-assembled structure, which is referred to as a magnetic resonance beacon in this specification.

또한, 본 발명은 상기 자기 공명 비콘을 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물을 제공한다. 앞서 설명한 바와 같이 본 발명의 자기 공명 비콘은 인 비보 또는 인 비트로에서 세포 내 타겟 분자 탐지하고 이를 이미징하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 타겟 분자 탐지용 조성물은 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함할 수 있다. 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.The present invention also provides a composition for detecting a target molecule comprising the magnetic resonance beacon. As described above, the magnetic resonance beacons of the present invention can be used to detect and image intracellular target molecules in in vivo or in vitro. The composition for detecting a target molecule according to the present invention may comprise a carrier and a vehicle commonly used in the medical field. Particularly preferred are ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins such as human serum albumin, buffer substances such as various phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids ), Water, salts or electrolytes (such as protamine sulfate, disodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride and zinc salts), colloidal silica, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose based substrates, polyethylene glycol, sodium carboxy Methyl cellulose, polyarylate, wax, polyethylene glycol or wool, and the like. The composition of the present invention may further comprise, in addition to the above components, a lubricant, a wetting agent, an emulsifying agent, a suspending agent, or a preservative.

한 구체예에서, 본 발명에 따른 타겟 분자 탐지용 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.In one embodiment, the composition for detecting a target molecule according to the present invention may be prepared as an aqueous solution for parenteral administration, preferably a solution of Hans's solution, Ringer's solution or physically buffered saline solution Can be used. Aqueous injection suspensions may contain a substrate capable of increasing the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol or dextran.

본 발명의 타겟 분자 탐지용 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.
Another preferred embodiment of the target molecule detection composition of the present invention may be in the form of a sterile injectable preparation of a sterile injectable aqueous or oleaginous suspension. Such suspensions may be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (e. G., Tween 80) and suspending agents. The sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, for example a solution in 1,3-butanediol. Vehicles and solvents that may be used include mannitol, water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile, nonvolatile oils are conventionally used as a solvent or suspending medium. For this purpose, any non-volatile oil including synthetic mono or diglycerides and less irritant may be used.

본 발명은 또한 상기 타겟 분자 탐지용 조성물을 생체 또는 시료에 투여하고, 상기 생체 또는 시료 내 타겟 분자와 자기 공명 비콘의 혼성화에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 것을 포함하는 생체 또는 시료의 영상 수득 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for detecting a target molecule, comprising the steps of: administering a composition for detecting a target molecule to a living body or a sample; sensing a signal emitted by hybridization of the target molecule and a magnetic resonance beacon in the living body or sample to obtain an image; Thereby providing an image obtaining method.

상기에서 사용된 용어 "시료"는 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직 또는 세포를 의미한다. 또한 상기 타겟 분자 탐지용 조성물을 생체 또는 시료에 주입하는 단계는 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.As used herein, the term "sample" refers to a tissue or cell isolated from a subject to be diagnosed. In addition, the step of injecting the composition for detecting a target molecule into a living body or a sample may be administered through a route commonly used in the medical field, and parenteral administration is preferred. For example, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous Or via a local route.

상기 방법에 있어서, 상기 자기 공명 비콘에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서 자기공명영상(MRI)장치와 형광 이미징의 이용이 바람직하다. In this method, it is preferable to use a magnetic resonance imaging (MRI) apparatus and fluorescence imaging to sense a signal emitted by the magnetic resonance beacon.

자기 공명영상장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 상기 자기공명영상장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기공명영상장치일 수 있다. 한편, 광학 이미징을 위해서는 공초점현미경, 형광현미경, 생체용광학장비 등을 사용할 수 있다. A magnetic resonance imaging apparatus puts a living body in a strong magnetic field and irradiates a radio wave of a specific frequency to absorb energy into an atomic nucleus such as hydrogen in a biological tissue to make the state high in energy, And the energy is converted into a signal, processed by a computer, and imaged. The magnetic resonance imaging apparatus may be a T2 spin-spin relaxation magnetic resonance imaging apparatus. On the other hand, for optical imaging, a confocal microscope, a fluorescence microscope, an optical equipment for a living body and the like can be used.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as being limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art. Is provided to fully convey the scope of the invention to those skilled in the art, and the invention is only defined by the scope of the claims.

<실시예 1> miR124a MR 비콘 제작Example 1 Production of miR124a MR beacon

50 nm 크기의 자성나노입자 MNP@SiO₂(RITC)-PEG/COOH(MF, 2mg/mL)를 Biterials(Seoul, Korea)에서 구매하였으며, 제조 방법은 이전 보고된 방법과 동일하다[Hwang DW et al . Small. 2010;6:81-8]. 4종의 올리고머를 다음과 같이 디자인 하였다. Magnetic nanoparticles with a size of 50 nm MNP @ SiO ₂ (RITC) -PEG / COOH (MF, 2 mg / mL) were purchased from Biterials (Seoul, Korea) and the manufacturing method was the same as previously reported [Hwang DW et al . Small . 2010; 6: 81-8]. Four oligomers were designed as follows.

1) 3'-어댑터 (3' adaptor): 5'-TCACAGATGAGTAAAAAAAAAA-3'(밑줄은 링커 영역에 상보적인 서열 부위임)1) 3'-adapter: 5'- TCACAGATGAGT AAAAAAAAAA-3 '(underlined is a sequence complementary to the linker region)

2) 5'-어댑터 (5' adaptor): 5'-CACGGAATCTCG-3'(박스 표시는 링커 영역에 상보적인 서열 부위임)2) 5'-adapter (5'-adapter): 5'-CACGGAATCTCG-3 '(the box designation is a sequence region complementary to the linker region)

3) miRNA124a 링커 (miR124a linker): 5'-ACTCATCTGTGACGAGATTCCGT GCGCCACTTACGG-3': 볼드체는 miR124a에 결합하는 염기서열 부위, 밑줄은 3'-어댑터와 혼성화하는 부위, 박스 표시는 5'-어댑터와 혼성화하는 부위를 표시함)3) miRNA124a linker: 5'- ACTCATCTGTGA CGAGATTCCGT GCGCCACTTACGG-3 ': The bold is the nucleotide sequence that binds miR124a and the underlined is the site that hybridizes with the 3'-adapter. Area)

4) miRNA124a 변이 링커 (miR124a mutated linker): 5'-ACTCATCTGTGACGAGATTCCGTGTTTCTTCATACATA-3': 3)번 올리고머에 대한 대조군으로 사용하기 위한 링커로, miR124a에 결합하는 염기서열 일부를 다른 종류의 염기로 바꿔서 결합이 안되도록 변이 형태를 만든 것임.4) miRNA124a mutated linker: 5'-ACTCATCTGTGACGAGATTCCGTG TTTCTTCATACATA -3 ': 3) As a linker for use as a control for the oligomer, a part of the base sequence binding to miR124a was replaced with another kind of base, It is a variant form that can not be made.

상기 4종의 올리고머는 Bioneer(Daejeon, Korea)에서 주문, 구매하였다. The four oligomers were ordered and purchased from Bioneer (Daejeon, Korea).

miRBase database(www.mirbase.org)에서 3번 올리고머의 miR124a 결합 염기서열은 mature miR124a(최종 microRNA 124a)의 서열과 상보적인 것을 확인하였다. 자성 형광 나노입자는 N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodimide를 사용하여 3'-어댑터 및 5'-어댑터와 공유결합을 형성하도록 한 다음, miR124a 링커 또는 miR124a mt 링커를 첨가하고 각각 24시간을 반응시켜 miR124a MR 비콘 또는 miR124a mt MR 비콘을 만들었다. 구체적인 반응 몰 비율은 MF : 3'-어댑터 : 5'-어댑터 : 링커 = 1:16 :16:16으로 하였다. In the miRBase database (www.mirbase.org), the miR124a binding sequence of oligomer 3 was found to be complementary to the sequence of mature miR124a (final microRNA 124a). The magnetic fluorescent nanoparticles were allowed to form covalent bonds with 3'-adapter and 5'-adapter using N- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodimide, followed by addition of miR124a linker or miR124a mt linker, To produce miR124a MR beacons or miR124a mt MR beacons. The specific reaction molar ratio was MF: 3'-adapter: 5'-adapter: linker = 1:16:16:16.

MF(자성 형광) 나노입자의 자가조립(self-assembly) 및 miR124a 첨가에 대한 miR124a MR 비콘, miR124a mt MR 비콘의 분해(disassembly)를 확인하기 위한 실험방법은 다음과 같다. The following is an experimental procedure to confirm miR124a MR beacon and miR124a mt MR beacon disassembly for self-assembly of MF (magnetic fluorescence) nanoparticles and addition of miR124a.

각각의 시료를 시험관에 넣고 상온에서 24시간 방치하여 나노입자가 크기에 따라서 침전되는 현상을 비교하였다. 형광이미지는 Maestro imaging system(Cri Inc, Woburn, MA, USA)를 사용하여 획득하였다. miR124a가 존재할 때와 존재하지 않는 조건 하의 MF, 3a-MF, 5a-MF, miR124a MR 비콘, miR124a mt MR 비콘의 분포와 크기 변화는 TEM(투과전자현미경, JEM 1010 system(JEOL, Japan)) 및 DLS(dynamic light scattering. 동적광산란법)를 이용하여 분석하였다. 사용한 DLS 장비는 Zetasizer Nano ZS system (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) 이다.
Each sample was placed in a test tube and allowed to stand at room temperature for 24 hours to compare the phenomenon of precipitation of nanoparticles depending on their size. Fluorescence images were acquired using a Maestro imaging system (Cri Inc, Woburn, MA, USA). The distribution and size changes of MF, 3a-MF, 5a-MF, miR124a MR beacons and miR124a mt MR beacons in the presence and absence of miR124a were measured by TEM (transmission electron microscope, JEM 1010 system (JEOL, Japan)) and DLS (Dynamic Light Scattering). The DLS equipment used is the Zetasizer Nano ZS system (Malvern Instruments, Worcestershire, UK).

(세포배양 및 트랜스펙션)(Cell culture and transfection)

HeLa 세포와 P19 세포의 배양방법은 이전 문헌[Jo MH et al . Biomaterials. 2012;33:6456-67] 대로 수행하였다. P19 세포를 신경분화 유도에 사용한 배지 조성은 다음과 같다: DMEM/F12 (1:1) 배지에(Gibco) N2 supplement(Gibco)와 0.5 mM all-trans-retinoic acid(RA, Sigma)를 첨가하여 배양하였고, 배양 2일 뒤, RA만 제거하고 나머지는 동일한 조건에서 배양하였다. HeLa 세포에 전구체 miR124a를(Ambion) 트랜스펙션하기 위해 Lipofectamine^®LTX & PLUS™Reagent(Invitrogen)를 사용하였다. MF, 3a-MF, 5a-MF, miR124a MR 비콘, miR124a mt MR 비콘을 HeLa 세포에 트랜스펙션하기 위해 자성 플레이트(chemicell)를 사용하였다. 모든 트랜스펙션 실험은 각각의 조건에 대하여 3개의 시료를 만들어 진행하였다(3 반복).
Methods for culturing HeLa cells and P19 cells are described in a previous article [Jo MH et al . Biomaterials . 2012; 33: 6456-67]. (Gibco) supplemented with Gibco and 0.5 mM all-trans-retinoic acid (RA, Sigma) were added to the DMEM / F12 (1: 1) medium After 2 days of culture, only RA was removed and the remainder was cultured under the same conditions. Lipofectamine ^® LTX & PLUS ™ Reagent (Invitrogen) was used to transfect HeLa cells with precursor miR124a (Ambion). MF, 3a-MF, 5a-MF, miR124a MR beacon, miR124a mt A magnetic plate was used to transfect MR beacons into HeLa cells. All transfection experiments were carried out with 3 samples for each condition (3 repetitions).

(세포생존도 분석)(Cell viability analysis)

5×10³개의HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 배지 200㎕를 부가하여 배양하였다. 링커를 첨가하지 않은 3a-MF와 5a-MF 나노입자 혼합물을 함량별(0, 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10, 및 20㎍)로 세포에 첨가하고 24시간 배양하였다. 그 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT, 1mg/mL) 20㎕를 첨가하고 37℃에서 4시간을 더 배양하였다. 포마잔 결정을 녹이기 위한 용매로는 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 사용하였다. Microplate reader(Microplate Reader 680, BIORAD, Hercules, CA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 각각의 조건에 대하여 3개의 시료를 만들어 진행하였다.
5 x 10 ³ HeLa cells were cultured in a 96-well plate with addition of 200 배 of medium. A mixture of 3a-MF and 5a-MF nanoparticles without the linker was added to the cells by the contents (0, 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10, and 20 μg) . Then, 20 3- of 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, 1 mg / mL) was added and further incubated at 37 캜 for 4 hours. Dimethyl sulfoxide (DMSO) was used as a solvent to dissolve the formazan crystals. Absorbance was measured using a microplate reader (Microplate Reader 680, BIORAD, Hercules, Calif.). All experiments were carried out by making three samples for each condition.

(공초점 현미경 분석)(Confocal microscopy analysis)

웰당 1×10⁵개의 HeLa 세포와 P19 세포를 직경 25mm의 유리 커버글라스가 첨가된 배양 플레이트에 씨딩하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 3a-MF, 5a-MF, miR124a MR 비콘, miR124a mt MR 비콘을 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션은 miR124a를 추가하거나 추가하지 않은 조건으로 나눠서 진행하였다. 4% 포름알데히드 용액(Sigma)에 20분간 세포를 고정하였다. PBS 버퍼(phosphate buffered saline, 인산완충식염수)로 10분간 3회 세척하였다. 커버글라스에 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride(DAPI) 용액(Vector Laboratories, Inc)을 첨가하여 분석을 위한 시료를 준비하였다. 사용한 현미경은 Confocal laser scanning microscope(LSM 510; Carl Zeiss, Germany)이고, 여기파장은 555nm, 방출파장은 578nm으로 설정하여 분석하였다.1 × 10 ⁵ HeLa cells and P19 cells per well were seeded on a culture plate to which 25 mm diameter glass cover glass was added and cultured at 37 ° C. for 24 hours. 3a-MF, 5a-MF, miR124a MR beacon, and miR124a mt MR beacon were transfected. Transfection was performed in conditions with or without miR124a. Cells were fixed in 4% formaldehyde solution (Sigma) for 20 minutes. And washed three times with PBS buffer (phosphate buffered saline) for 10 minutes. A sample for analysis was prepared by adding 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) solution (Vector Laboratories, Inc) to a cover glass. The microscope used was Confocal laser scanning microscope (LSM 510, Carl Zeiss, Germany), and the excitation wavelength was set to 555 nm and the emission wavelength to 578 nm.

신경분화 유도 확인을 위해서는 이전 문헌[Jo MH et al . Biomaterials. 2012;33:6456-67] 대로 면역형광염색법(immune-fluorescence staining)으로 확인하였다. 방법은 다음과 같다. P19 세포를 스캐폴드와 섞고, 항-Oct4(Chemicon, Millipore) 또는 항-NeuroD (Chemicon, Millipore)를 각각 1/1000 비율로 희석하여 첨가하였다. 5회 세척 후, Alexa-488 또는 Alexa-594 형광물질이 표지된 2차 항체를 첨가하고, 90분을 더 반응시켰다. P19 세포를 커버글라스에 옮기고 DAPI를 첨가하여 시료를 완성하고 현미경 분석을 진행하였다.
In order to induce neuronal differentiation confirmed previous literature [Jo MH et al . Biomaterials . 2012; 33: 6456-67] as immunity-fluorescence staining. The method is as follows. P19 cells were mixed with the scaffold and anti-Ot4 (Chemicon, Millipore) or anti-NeuroD (Chemicon, Millipore) were diluted in 1/1000 ratio, respectively. After 5 washes, the secondary antibody labeled with Alexa-488 or Alexa-594 fluorescent material was added and reacted for 90 minutes. P19 cells were transferred to cover glasses and DAPI was added to complete the samples and microscopic analysis was performed.

(miR124a 발현 정량분석)(miR124a expression quantitative analysis)

실시간 PCR을 사용하여 miR124a 발현을 확인하였다. 이를 위해, P19 세포로부터 mirVana^TM miRNA 분리 키트(Ambion)로 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다. 성숙한 miR124a의 qRT-PCR 분석은 mirVana^TM qRT-PCR 프라이머 세트와 mirVana^TM qRT-PCR miRNA 키트(Ambion)를 사용하여 진행하였다. qRT-PCR에 사용한 장치는 iCycler(Bio-Rad, USA)이며, SYBR Premix Ex Taq^TM(2×; Takara, Japan)을 반응액에 첨가하여 발현여부를 확인하는데 사용하였다. PCR 반응조건은 초기 95℃, 3분 반응 후, 95℃, 15초- 64℃, 30초 동안 반응을 40회 반복하여 진행하였다. miR124a 발현의 상대적 비교를 위한 대조군으로 U6를 사용하여 결과를 표준화 하였다. 통계적 비교를 위하여 t-test를 수행하였고 P-value 0.005를 기준으로 판별하였다.
Real-time PCR was used to confirm miR124a expression. To this end, from P19 cells mirVana ^TM RNA was extracted with miRNA isolation kit (Ambion) and cDNA was synthesized. QRT-PCR analysis of mature miR124a was performed using the mirVana ^TM qRT-PCR primer set and the mirVana ^TM qRT-PCR miRNA kit (Ambion). The device used for qRT-PCR was iCycler (Bio-Rad, USA) and SYBR Premix Ex Taq ^™ (2 ×; Takara, Japan) was added to the reaction solution to confirm the expression. The PCR reaction conditions were 95 ° C for 3 minutes, 95 ° C for 15 seconds, and 64 ° C for 30 seconds. The results were normalized using U6 as a control for the relative comparison of miR124a expression. Statistical comparisons were made by t-test and P-value 0.005.

(T2-강조 자기 공명 영상 분석)(T2-weighted MRI)

HeLa 세포와 P19 세포 내에서, 일반 시험관 내에서 3a-MF, 5a-MF, miR124a MR 비콘, miR124a mt MR 비콘 혼합물이 miR124a가 존재하고, 존재하지 않는 각각의 조건에 대한 T2-강조 팬텀 이미지를 1.5T MR 이미징 시스템(GE Medical Systems, Milwaukee, WI., USA)를 이용하여 분석하였다. MR 이미징 장치에는 micro-47 surface coil(Intera; Philips Medical Systems, Best, Netherlands)을 장착하여 사용하였다. T2-강조 영상은 상온에서 Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG) sequence를 사용하여 획득하였다. 이미지 획득을 위한 조건은 다음과 같다. TR = 1400ms, TE = 55.8ms, 슬라이스 두께 = 2.0mm.In the HeLa cells and P19 cells, the T2-emphasized phantom image for each of the 3a-MF, 5a-MF, miR124a MR beacon, miR124a mt MR beacon mixture miR124a is present and nonexistent in a normal test tube is 1.5 T MR imaging system (GE Medical Systems, Milwaukee, Wis., USA). MR imaging devices were equipped with a micro-47 surface coil (Intera; Philips Medical Systems, Best, Netherlands). T2-weighted images were acquired at room temperature using the Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) sequence. The conditions for image acquisition are as follows. TR = 1400 ms, TE = 55.8 ms, slice thickness = 2.0 mm.

인 비보 MRI 분석을 위해서, 1×10⁶ 개의 P19세포를 150㎕의 PBS 버퍼로 회수하고, PLLA(poly-L-lactide) 스캐폴드와 섞었다. P19-스캐폴드 복합체를 7주령 수컷 balb/c 누드 마우스 6마리의 양쪽 허벅지에 피하이식(subcutaneous implantation) 하였다. 오른쪽 허벅지에 삽입한 실험군에는 RA(레티노산)를 추가하여 신경분화가 유도되도록 하였고, 왼쪽 허벅지에는 RA를 추가하지 않은 대조군으로 설정하였다. 마취는 Zoletil(Virbac, Carros, France)과 Rompun(Bayer, Seoul, Korea) 용액(2:1) 70㎕를 사용하였다. 인 비보 MR 영상은 micro-47 surface coil(Intera)이 장착된 3T clinical MRI instrument를 사용하여 획득하였다. 이미지 획득을 위한 조건은 다음과 같다. TR = 4000ms, TE = 114ms, 슬라이스 두께 = 1.0mm.
For in vivo MRI analysis, 1 x ¹⁰⁶ P19 Cells were recovered with 150 [mu] l PBS buffer and mixed with PLLA (poly-L-lactide) scaffold. The P19-scaffold complex was subcutaneously implanted into both thighs of six 7-week-old male balb / c nude mice. RA (retinoic acid) was added to induce neural differentiation in the right thigh, and RA was not added to the left thigh. Anesthesia was performed with 70 μl of Zoletil (Virbac, Carros, France) and Rompun (Bayer, Seoul, Korea) solution (2: 1). In vivo MR imaging was obtained using a 3T clinical MRI instrument equipped with a micro-47 surface coil (Intera). The conditions for image acquisition are as follows. TR = 4000 ms, TE = 114 ms, slice thickness = 1.0 mm.

<실험예 1> 자가조립형 miR124a MR 비콘 제작 및 특성분석Experimental Example 1 Construction and Characterization of self-assembled miR124a MR beacon

비콘(beacon)은 직경 50nm 크기의 자성 나노입자를 가지고 제작하였다. 자성 나노입자의 성분은 다음과 같다. 중심부(core)는 코발트 페라이트 성분이고, 표면에 로다민 B 이소티오시아네이트(RITC, Ex/Em, 555/578 nm)가 붙어있다. 또한, 표면은 카르복실기(-COOH)로 개질되어 있다. miR MR 비콘은 MF 나노입자를 3'- 또는 5'-어댑터 그리고 링커 (miR linker)를 1 : 16 : 16 : 16의 비율로 섞어서 만들었다. 3'-, 5'-어댑터는 올리고머 말단에 아민기(-NH₂)가 붙어 있기 때문에 MF 나노입자의 카르복실기와 공유결합에 의해 표면에 결합되어 있다. 또한 3'-, 5'-어댑터는 miR 링커와 혼성화 된다. miR 링커에는 miRNA-결합 서열이 있기 때문에 miR MR 비콘이 만들어지게 된다. 목적 miRNA가 없을 때는 miR MR 비콘이 자가조립되기 때문에 약한 MRI 신호를 나타내어 개별 MF 나노입자로 흩어져 있을 때보다 낮은 T2 값을 가진다. 목적 miRNA가 존재하면 miR 링커와 결합을 유도하기 때문에, 링커가 miR MR 비콘에서 떨어져 나오게 되면서, 뭉쳐져 있던 비콘이 다시 분해(disassembly)된다. 따라서 MRI 신호가 활성화되어 T2 값이 증가한다(도 1).Beacons were made with magnetic nanoparticles of 50 nm in diameter. The components of the magnetic nanoparticles are as follows. The core is a cobalt ferrite component, and Rhodamine B isothiocyanate (RITC, Ex / Em, 555/578 nm) is attached to the surface. In addition, the surface is modified with a carboxyl group (-COOH). miR MR beacons were made by mixing MF nanoparticles in a 1: 16: 16: 16 ratio with a 3'- or 5'-adapter and a linker (miR linker). The 3'- and 5'-adapters are bound to the surface by covalent bonds with the carboxyl groups of the MF nanoparticles because they have an amine group (-NH ₂ ) attached to the end of the oligomer. The 3'-, 5'-adapters also hybridize to the miR linker. Because miR linkers have miRNA-binding sequences, miR MR beacons are created. In the absence of the target miRNA, the miR MR beacons self-assemble and thus exhibit weak MRI signals, which are lower than T2 values when dispersed into individual MF nanoparticles. When the target miRNA is present, it induces binding with the miR linker, so that the linker is removed from the miR MR beacon and the beacon that has been assembled is disassembled again. Thus, the MRI signal is activated and the T2 value increases (Fig. 1).

본 실시예에서 miR124a를 선택하여 진행한 이유는 해당 miR124a가 신경재생 과정에 많이 발현되는 것으로 알려져 있어서, miR MR 비콘의 활용가능성을 평가할 수 있는 모델 시스템으로 적합하기 때문이다. The reason why miR124a was selected in the present embodiment is that the miR124a is known to be expressed in the nerve regeneration process, so that it is suitable as a model system for evaluating the availability of miR MR beacons.

MF 나노입자(2mg/mL)를 3'-, 5'-어댑터와 상온에서 1시간 반응시켜서 결합시켜 TEM으로 확인한 결과, 모든 MF, 3a-MF, 5a-MF 나노입자가 수용액 상에서 고르게 분포하고 있고, 구 형태의 모양인 것을 확인하였다(도 2). MF nanoparticles (2 mg / mL) were reacted with 3'- and 5'-adapters for 1 hour at room temperature. As a result, all MF, 3a-MF and 5a-MF nanoparticles were uniformly dispersed in the aqueous solution , And a spherical shape (Fig. 2).

DLS 분석을 통해서 3종의 나노입자의 입도를 측정한 결과, 각각 평균 54.1±0.25nm, 57.2±1.25nm, 57.9±0.49nm의 크기를 갖는 것으로 확인되었다(도 3).As a result of DLS analysis, the particle sizes of the three kinds of nanoparticles were found to be 54.1 ± 0.25 nm, 57.2 ± 1.25 nm and 57.9 ± 0.49 nm, respectively (FIG. 3).

상기 결과로부터 3a-MF, 5a-MF 나노입자가 잘 만들어졌음을 알 수 있다. From the above results, it can be seen that the 3a-MF, 5a-MF nanoparticles are well formed.

그 다음으로 3a-MF, 5a-MF 나노입자를 miR124a 링커와 혼합하여 자가조립형 miR124a MR 비콘을 만들었다. 대조군으로 miR124a 결합이 안되는 링커(miR124a mt linker)를 사용하여 만든 miR124a mt MR 비콘을 제작하였다. Next, 3a-MF, 5a-MF nanoparticles were mixed with the miR124a linker to create self-assembled miR124a MR beacons. A miR124a mt MR beacon was constructed using a miR124a mt linker with no miR124a binding as a control.

miR124a MR 비콘과 miR124a mt MR 비콘을 시험관 상에서 miR124a(0, 500 및 1000 pmol)를 혼합하고, 24시간 배양하면서 자가조립에 의하여 크기가 커진 MF 나노입자가 침전되는 현상을 확인하였다. miR124a MR 비콘은 miR124a 농도에 비례하여 침전되는 정도가 다름을 확인하였다(도 4). 침전된 패턴은 miR124a가 없는 조건에서도 잘 유지되었다. miR124a MR beacon and miR124a mt MR beacon were mixed with miR124a (0, 500, and 1000 pmol) in vitro and cultured for 24 hours, confirming the precipitation of MF nanoparticles grown by self-assembly. The miR124a MR beacon was found to be different in degree of precipitation in proportion to the miR124a concentration (Fig. 4). The precipitated pattern was well maintained even in the absence of miR124a.

또한, miR124a MR 비콘에 miR124a가 결합하여 자가조립된 MR 비콘의 분해를 유도하기 때문에 침전되었던 MR 비콘이 다시 분해되어 고르게 분포하게 되었다(붉은색 형광이 0에서는 시험관 아래에 집중되어 있다가 500-1000pmol로 농도가 바뀌면서 점차 시험관 내에 고르게 분포하는 것을 알 수 있다. 즉 MR 비콘이 분해된다는 의미이다. miR124a가 존재하는 경우, miR124a의 결합에 의하여 miR124a 링커가 나노입자로부터 떨어져 나가 대부분의 MF 나노입자는 시험관의 상층부에 존재하였다. In addition, since miR124a binds to miR124a MR beacon to induce degradation of self-assembled MR beacons, the precipitated MR beacon is resolved and distributed evenly (red fluorescence is concentrated at the bottom of the test tube at 0, The miR124a linker is separated from the nanoparticles by the binding of miR124a and most of the MF nanoparticles are separated from the test tubes by the binding of miR124a, .

반면, 대부분의 miR124a mt MR 비콘은 miR124a가 결합하지 못하기 때문에 아무런 변화를 유도할 수 없다. 따라서, miR124a 처리와 관계없이 시험관의 바닥에 침전상태로 머물러 있고, 침전된 상태의 이미지가 0, 500, 1000 pmol 조건에서 변하지 않는다.On the other hand, most miR124a mt MR beacons can not induce any change because miR124a does not bind. Therefore, it remained in the bottom of the test tube regardless of the miR124a treatment, and the image of the precipitated state did not change at 0, 500, and 1000 pmol.

한편, miR124a 링커를 첨가하지 않은 3a-MF 나노입자 및 5a-MF 나노입자의 혼합물(도 4의 좌측 도면)은 링커가 없기 때문에 나노입자의 자가조립이 이루어지지 않아 24시간 뒤에 침전되는 현상이 없었다.On the other hand, the mixture of the 3a-MF nanoparticles and the 5a-MF nanoparticles without the miR124a linker (left side of FIG. 4) did not have a linker and thus did not self-assemble the nanoparticles, .

다음으로, 공초점 현미경을 이용하여 miR124a에 대한 miR124a MR 비콘 크기 감소를 추가로 확인하였다(도 5). 즉, 자가조립되어 커다란 크기 때문에 0pmol 조건에서는 잘 보이지만 500, 1000pmol로 miR124a 농도가 높아질수록 MR 비콘이 분해되어 크기가 작아지므로 점점 안보이게 된다. miR124a mt MR 비콘의 경우는 아무런 변화가 없었다. Next, miR124a MR beacon size reduction for miR124a was further confirmed using a confocal microscope (Fig. 5). In other words, it is self-assembled and large, so it can be seen at 0 pmol condition, but when miR124a concentration is increased to 500 or 1000 pmol, the MR beacon is decomposed and becomes smaller. There was no change in the miR124a mt MR beacon.

TEM 이미지 분석에 의하면, miR124a 링커를 포함시키지 않은 조건 하에서 3a-MF와 5a-MF 나노입자는 서로 뭉쳐져 있지 않고 각각 고르게 분포되어 있는 것을 알 수 있다. miR124a가 없는 조건에서 3a-MF, 5a-MF 나노입자를 miR124a 링커 또는 miR124a mt 링커와 같이 반응시켰을 때 MF가 서로 뭉쳐서 커다란 클러스터를 형성하는 것을 확인하였다(도 6a).TEM image analysis shows that 3a-MF and 5a-MF nanoparticles are not clustered and uniformly distributed under conditions not including the miR124a linker. When 3a-MF, 5a-MF nanoparticles were reacted with miR124a linker or miR124a mt linker under the absence of miR124a, it was confirmed that the MFs aggregated with each other to form a large cluster (FIG. 6A).

또한, miR124a MR 비콘과 miR124a mt MR 비콘에 miR124a를 첨가시켜 가면서 나노입자가 다시 분해되는 과정을 확인한 결과, miR124a MR 비콘에는 miR124a가 결합하고 miR124a MR 비콘의 분해를 유도하기 때문에 뭉쳐져 있던 miR124a MR 비콘이 점점 분해되면서 흩어졌다. 이는 miR124a 농도가 증가할수록 MF 나노입자가 분리되는 정도에 차이를 나타낸다. 반면, miR124a mt MR 비콘의 경우에는 miR124a 농도가 500, 1000pmol으로 달라지더라도 miR124a가 miR124a mt MR 비콘에 전혀 결합할 수가 없기 때문에 뭉쳐져 있었던 miR124a mt MR 비콘 형태에 변화가 전혀 없는 것을 알 수 있다. In addition, miR124a MR beacons and miR124a mt MR beacons were added to miR124a. As a result, miR124a MR beacons were bound to miR124a and miR124a MR beacons were degraded. As a result, miR124a MR beacons It gradually disintegrated and disintegrated. The difference in the degree of separation of MF nanoparticles increases with increasing miR124a concentration. On the other hand, in the case of miR124a mt MR beacons, miR124a mt MR beacons did not change to miR124a mt MR beacons because miR124a could not bind to miR124a mt MR beacons at all, even if miR124a concentrations were changed to 500 and 1000 pmol.

또한, miR124a 농도를 다양하게 조절하면서(0, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 pmol) T2-강조 MR 영상 분석을 수행한 결과. 첨가되는 miR124a 농도가 증가될수록 miR124a MR 비콘에 결합하는 miR124a 양이 증가하기 때문에, 결과적으로 초기에 뭉쳐져 있었던 miR124a MR 비콘이 분해되는 경향성에 차이가 생겼다. 다시 말하자면, 분해되는 MR 비콘의 양이 점점 증가한다. 따라서 MR 영상이 점진적으로 밝아졌다. 대조군 miR124a mt MR 비콘의 경우 miR124a가 결합하지 못하기 때문에 MR 비콘의 흩어짐을 유도할 수가 없었다. 따라서 MR 영상에 전혀 변화가 없다. 계속 뭉쳐진 상태로 존재하기 때문에 모두 어두운 영상이 나왔다(도 6b).In addition, T2-weighted MR imaging analysis was performed with (0, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 pmol) while varying miR124a concentration. As the added miR124a concentration increased, the amount of miR124a binding to the miR124a MR beacon increased, resulting in a difference in the tendency of the miR124a MR beacon to be disintegrated at the early stage. In other words, the amount of MR beacons to be degraded increases gradually. Thus, the MR image gradually brightened. In the case of the control miR124a mt MR beacon, miR124a did not bind and thus the MR beacon scattering could not be induced. Therefore, there is no change in the MR image. Since they existed in a continuous state, dark images appeared (FIG. 6B).

상술한 miR124a MR 비콘의 분리과정을 DLS를 통하여 확인하였다. 우선, miR124a 링커가 없는 조건에서 3a-MF 나노입자와 5a-MF 나노입자 혼합물의 평균 크기는 57.6±1.2nm 이었다. miR124a 농도가 0, 500, 1000pmol인 경우 miR124a MR 비콘의 평균 지름은 각각 417±5nm, 264±61nm, 121±89nm 이었다. 이는 뭉쳐져 있던 MR 비콘이 분해되면서 크기가 작아지는 것을 정량적으로 분석한 결과라 할 것이다. 그와는 반대로 miR124a mt MR 비콘의 크기는 각각 401±23nm, 459±46nm 및 585±25nm로 miR124a 농도 변화와 관계없이 전혀 달라지지 않았다(도 7). The separation process of miR124a MR beacon was confirmed by DLS. First, under the absence of the miR124a linker, the average size of the mixture of 3a-MF and 5a-MF nanoparticles was 57.6 ± 1.2 nm. The mean diameters of miR124a MR beacons were 417 ± 5 nm, 264 ± 61 nm and 121 ± 89 nm, respectively, when miR124a concentrations were 0, 500, and 1000 pmol. This is the result of quantitative analysis that the size of the MR beacon which has been gathered has been decomposed. Conversely, the size of the miR124a mt MR beacon did not change at all at 401 ± 23 nm, 459 ± 46 nm, and 585 ± 25 nm, regardless of the miR124a concentration change (FIG. 7).

1.5 T에서의 T2-강조 MRI 분석에 의하면 miR124a 링커없이 3a-MF, 5a-MF 나노입자만 배양하는 경우, 나노입자의 양이 증가할수록 MR 강도가 점점 감소하였다(도 8).According to T2-weighted MRI analysis at 1.5 T, when only 3a-MF, 5a-MF nanoparticles were cultured without the miR124a linker, the MR intensity decreased gradually as the amount of nanoparticles increased (FIG.

상기 결과로부터 miR124a MR 비콘이 miR124a 발현을 MRI에 의해서 감지하는데 높은 특이성을 나타내고 있음을 알 수 있다.
From the above results, it can be seen that the miR124a MR beacon exhibits high specificity for the detection of miR124a expression by MRI.

<실험예 2> HeLa 세포에서 외인성 miR124a 발현 검출EXPERIMENTAL EXAMPLE 2 Expression of Exogenous miR124a in HeLa Cells

miR124a MR 비콘을 이용하여 세포에서 외인성 miR124a 발현을 검출하기 위해, 자체적으로 miR124a을 발현하지 않는 세포로 알려져 있는 HeLa 세포를 사용하였다. To detect exogenous miR124a expression in cells using the miR124a MR beacon, HeLa cells, known as miR124a-expressing cells, were used.

먼저, HeLa 세포 배양액에 링커없이 2종의 나노입자(3a-MF, 5a-MF)를 첨가하여 24시간 배양 후 MTT 분석을 수행하였다. 각각의 조건 당 3회 반복 실험을 하였고 그래프에 표준오차를 표시하였다. First, two kinds of nanoparticles (3a-MF, 5a-MF) were added to the HeLa cell culture without linker, and MTT analysis was performed after culturing for 24 hours. The experiment was repeated three times for each condition and the standard error was displayed on the graph.

도 9에 나타난 바와 같이, 고농도의 나노입자를 첨가해도 세포에 전혀 독성이 없음을 MTT 분석을 통해 확인하였다.As shown in FIG. 9, it was confirmed through MTT analysis that no toxicity was observed in cells even when high concentration of nanoparticles were added.

다음으로, miR124a 링커를 포함시켜 자가조립이 유도된 2종의 MR 비콘을 트랜스펙션 시킨 HeLa 세포에 miR124a를 농도별로 첨가한 다음 공초점 주사전자현미경을 이용하여 나노입자의 형광 이미지를 분석한 결과, miR124a 농도가 증가할수록 MR 비콘 분해 정도에 차이가 생겨 붉은색 형광 이미지의 크기가 점점 작아짐을 통해 HeLa 세포에 트랜스펙션된 miR124a MR 비콘의 크기가 따로 첨가한 miR124a 농도가 증가할수록 작아지는 것을 알 수 있었다(도 10a). 반면, miR124a mt MR 비콘의 경우에는 miR124a 처리에 무관하게 크기 변화가 전혀 관찰되지 않았다. Next, miR124a was added to HeLa cells transfected with self-assembly-induced two MR beacons containing miR124a linker, and fluorescence images of nanoparticles were analyzed using a confocal scanning electron microscope , and the degree of MR beacon degradation was increased as the miR124a concentration was increased. As a result, the size of the red fluorescence image became smaller and the size of the miR124a MR beacon transfected into HeLa cells decreased as miR124a concentration (Fig. 10A). On the other hand, no change in size was observed in miR124a mt MR beacons regardless of miR124a treatment.

각각의 세포를 회수하여 인 비트로 T2-강조 MR 영상 분석을 수행한 결과, miR124a MR 비콘 실험군에서 밝기가 점점 증가함을 확인하여 miR124a MR 비콘 크기가 작아질수록 MR 신호가 증가하는 것을 알 수 있었다(도 10b). miR124a mt MR 비콘의 경우에는 예상한 대로 MR 신호 변화가 전혀 없었다. Each cell was recovered and in vitro T2-weighted MR imaging analysis revealed that the intensity of miR124a MR beacon increased with increasing miR124a MR beacon, and MR signal increased with decreasing miR124a MR beacon size 10b). In the case of the miR124a mt MR beacon, there was no MR signal change as expected.

또한, miR124a MR 비콘을 HeLa 세포에 트랜스펙션시키고 4일간 배양하였다. 뭉쳐져 있는 구조가 잘 유지되는 것을 확인하는 것이 목적이기 때문에 miR124a는 첨가하지 않았다. 4일간 배양하여도 붉은색 형광의 크기 변화가 확인되지 않는 것으로 보아 miR124a MR 비콘은 세포 내에서 구조적인 안정성을 가짐을 알 수 있었다(도 11).
In addition, miR124a MR beacons were transfected into HeLa cells and cultured for 4 days. MiR124a was not added because it was aimed to confirm that the cohesive structure was well maintained. As a result, the miR124a MR beacon had structural stability in the cells (Fig. 11).

<실험예 3> P19 세포의 신경분화 과정 중 세포내에서 발현되는 miR124a 검출<Experimental Example 3> Detection of miR124a expressed in cells during neural differentiation of P19 cells

상술한 HeLa 세포와는 달리 P19 세포(mouse embryonic teratocarcinoma cell line)는 분화과정에서 자체적으로 miR294a를 발현하는 세포로 알려져 있다. P19 세포의 신경분화를 유도하기 위하여 RA를 첨가하여 배양하였다. 분화가 제대로 진행되는지에 대한 확인 실험으로서, 면역형광염색법(immunocytochemistry staining)을 이용하였다. 사용한 분화 마커로는 NeuroD(신경분화마커)와 Oct4(미분화마커) 두 가지를 사용하였다. Unlike the above-described HeLa cells, P19 cells (mouse embryonic teratocarcinoma cell line) are known to express miR294a by itself during differentiation. RA was added to induce neural differentiation of P19 cells. Immunofluorescence staining (immunocytochemistry staining) was used to confirm whether the differentiation proceeded properly. NeuroD (neurogenesis marker) and Oct4 (undifferentiated marker) were used as the differentiation markers used.

분화가 진행되면 Oct4는 감소하고 NeuroD는 증가하게 될 것으로 예상하였고, 기대했던 대로 3일 후 Oct4는 없어졌고, NeuroD가 증가하는 것을 확인하여 P19 세포는 RA 첨가에 의해 정상적인 신경세포로 분화되는 것을 알 수 있었다(도 12). As the differentiation progressed, Oct4 decreased and NeuroD increased. As expected, Oct4 disappeared after 3 days and NeuroD increased, confirming that P19 cells were differentiated into normal neurons by RA addition (Fig. 12).

신경분화 과정 중 특이적으로 발현하는 miR124a의 발현량 차이를 qRT-PCR로 분석하여 추가 검증하였다. 각각의 조건에 대해서 3개의 시료를 따로 준비하여 분석하였고, 표준오차를 나타내었다. 통계학적 분석을 위해서 Students t-test를 하였고 유의성은 P값으로 표기하였다(**, P < 0.005), 그 결과, miR124a가 분화유도 후 배양일이 지남에 따라 miR124a가 증가하였다(도 13). Differential expression of miR124a specifically expressed during neuronal differentiation was further verified by qRT-PCR analysis. For each condition, three samples were separately prepared and analyzed, and the standard error was shown. For statistical analysis, Student's t-test was used and the significance was expressed as P value (**, P <0.005). As a result, miR124a increased with the cultivation day after induction of differentiation (Fig. 13).

다음으로, miR124a MR 비콘을 P19 세포에 트랜스펙션 시키고, RA를 첨가하여 신경분화를 유도한 다음, 공초점 형광 현미경을 이용하여 miR124a MR 비콘 크기 변화 여부를 관찰하였다. Next, miR124a MR beacons were transfected into P19 cells, RA was added to induce neuronal differentiation, and miR124a MR beacon size changes were observed using a confocal fluorescence microscope.

도 14a에 나타난 바와 같이, 분화가 진행됨에 따라서 붉은색 형광으로 관찰되는 miR124a MR 비콘의 덩어리 크기가 점점 작아지는 것을 확인함으로써, 분화 과정중 생성되는 mir124a가 miR124a MR 비콘에 결합하여 MR 비콘의 분해를 유도하는 것을 알 수 있었다. 대조군인 miR124a mt MR 비콘 세포 실험에서는 크기 차이를 확인하지 못했다. As shown in FIG. 14A, by confirming that the size of the miR124a MR beacon observed in red fluorescence becomes smaller as the differentiation progresses, mir124a generated in the differentiation process binds to the miR124a MR beacon and degrades the MR beacon . In the control, miR124a mt MR beacon cell experiment, the size difference was not confirmed.

추가 검증을 위하여 상기 실험 과정에서 얻어진 세포를 회수하여 MR 영상을 분석하였다. 도 14b에 나타난 바와 같이, miR124a MR 비콘을 사용한 실험군에서는 시간이 지남에 따라 MR 비콘의 분해가 유도되었고 그 크기가 점점 작아짐으로 인하여 MR 신호가 점점 증가하였다. 반면에, miR124a mt MR 비콘을 사용한 대조군에서는 MR 비콘 크기 변화가 없기 때문에 MR 신호에서도 차이를 확인할 수 없었다. For further verification, the cells obtained in the above procedure were collected and analyzed for MR imaging. As shown in FIG. 14B, in the experimental group using the miR124a MR beacon, the degradation of the MR beacon was induced over time, and the MR signal gradually increased due to the smaller size. On the other hand, in the control group using the miR124a mt MR beacon, there was no change in the MR beacon size, so no difference was found in the MR signal.

인 비보 신경분화 과정에서의 MR 영상 분석을 위해 miR124a MR 비콘과(실험군) miR124a mt MR 비콘(대조군)을 각각 트랜스펙션 시킨 2×10⁶개의 P19 세포를 회수하여 스캐폴드와 섞고, 누드 마우스의 오른쪽 허벅지에는 RA를 추가하여 3일간 신경분화를 유도하였고, 왼쪽 허벅지에는 RA 추가하지 않은 비교군을 삽입하여 시간의 경과에 따른 T2 MR 영상을 비교 분석하였다. 누드 마우스는 총 6마리 사용하였고, 실험군과 대조군 각각에 대해 3마리씩 진행하였다. For analysis of MR images in the in vivo non-neuronal differentiation, 2x10 ⁶ P19 cells transfected with miR124a MR beacon and (experimental group) miR124a mt MR beacon (control group) were collected and mixed with a scaffold, RA was added to the right thigh to induce neural differentiation for 3 days, and a comparison group without RA was added to the left thigh. A total of six nude mice were used and three mice were used for each of the experimental group and the control group.

도 14c에 나타난 바와 같이, 각각의 MR 비콘을 삽입한 직후의 MR 영상은, 검은색 신호로 나타난다(도면의 0D에 해당). 3일 후에는(도면의 3D) 신경분화 유도에 의해서 miR124a MR 비콘에 RA를 처리한 오른쪽 허벅지 부위의 MR 영상이 밝게 변한 것을 확인할 수 있었다. RA를 처리하지 않은 왼쪽 부위(대조군)는 여전히 어두운 영상을 나타내었다. miR124a mt MR 비콘을 사용한 대조군 실험에서는 RA 처리 여부에 관계없이 MR 시그널 변화가 전혀 없었다. 신경분화에 따라서 miR124a가 발현되고, MR 비콘의 구조적 변화를(disassembly) 유도하여 MR 영상의 변화를 확인하는 과정이 누드 마우스를 모델로 한 인 비보 영상에도 성공적으로 적용할 수 있음을 알 수 있는 결과이다.As shown in Fig. 14C, the MR image immediately after inserting each MR beacon appears as a black signal (corresponding to 0D in the drawing). After 3 days (3D in the drawing), MR imaging of the right thigh region treated with RA in the miR124a MR beacon was brightened by induction of neural differentiation. The left side (control) without RA treatment still showed dark images. In the control experiment using miR124a mt MR beacons, there was no MR signal change regardless of the RA treatment. It is shown that miR124a is expressed according to neural differentiation and the process of confirming the MR image change by inducing the structural change of MR beacon disassembly can be successfully applied to in vivo image modeled by nude mice to be.

해당 마우스의 영상 분석을 마치고 조직을 다시 채취하고, 각각의 조직에 대하여 NeuroD 신경분화마커와 Oct4 미분화마커를 처리하고 전자현미경으로 확인하였다. After the image analysis of the mice was completed, the tissues were collected again, and NeuroD neurogenesis markers and Oct4 undifferentiated markers were treated for each tissue and confirmed by electron microscopy.

도 15 및 16에서 볼 수 있듯이, RA 첨가 여부에 따라서 양쪽 조직의 신경분화는 모두 정상적으로 유도된 것을 알 수 있었다. 이는 MR 영상에서 차이를 나타낸 것이 다른 추가 요인이 아닌 miR124a MR 비콘에 의한 것임을 추가로 확인한 결과이다.
As shown in Figs. 15 and 16, it was found that all of the neural differentiation of both tissues was normally induced depending on whether RA was added or not. This is the result of further confirmation that the differences in MR images are due to miR124a MR beacons, not other additional factors.

<110> Catholic Kwandong University Industry Foundation <120> Magnetic resonance beacon to detect target molecule <130> P14U17C1478 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' adaptor <400> 1 tcacagatga gtaaaaaaaa aa 22 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' adaptor <400> 2 cacggaatct cg 12 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR124a linker <400> 3 actcatctgt gacgagattc cgtgcgccac ttacgg 36 <110> Catholic Kwandong University Industry Foundation <120> Magnetic resonance beacon to detect target molecule <130> P14U17C1478 <160> 3 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 'adapter <400> 1 tcacagatga gtaaaaaaaaaa 22 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 'adapter <400> 2 cacggaatct cg 12 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR124a linker <400> 3 actcatctgt gacgagattc cgtgcgccac ttacgg 36

Claims

제1접속(adaptor)분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자;
제2접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자; 및
타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역과 상기 제1접속분자 및 제2접속분자와 혼성화될 수 있는 링커 영역을 함유하는 핵산 프로브를 포함하며,
상기 자성 형광 나노입자들의 제1접속분자 및 제2접속분자와 상기 핵산 프로브의 링커 영역이 혼성화되어 자가조립(self-assembly) 형 구조를 나타내고,
상기 제1접속분자와 제2접속분자는 각각 상기 핵산 프로브의 링커 영역에 상보적이되, 서로 상이한 염기서열로 표시되는 올리고머인, 자기 공명 비콘.
A magnetic fluorescent nanoparticle surface-bonded with a first adapter molecule;
A magnetic fluorescent nanoparticle surface-bonded with a second connecting molecule; And
A nucleic acid probe comprising a region that specifically binds to a target molecule and a linker region that can hybridize with the first connecting molecule and the second connecting molecule,
The first connecting molecule and the second connecting molecule of the magnetic fluorescent nanoparticles and the linker region of the nucleic acid probe are hybridized to form a self-assembly structure,
Wherein the first connecting molecule and the second connecting molecule are oligomers complementary to the linker region of the nucleic acid probe and represented by different base sequences, respectively.

제1항에 있어서,
자성 형광 나노입자는 금속 물질, 자성 물질, 또는 자성 합금으로 제조된 것인 자기 공명 비콘.
The method according to claim 1,
Wherein the magnetic fluorescent nanoparticles are made of a metal material, a magnetic material, or a magnetic alloy.

제2항에 있어서,
금속 물질은 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 자기 공명 비콘.
3. The method of claim 2,
Wherein the metallic material is at least one selected from the group consisting of Pt, Pd, Ag, Cu and Au.

제2항에 있어서,
자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄, 및 MpOq (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 "0 < p =3"및 "0 < q =5"을 만족한다.)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 자기 공명 비콘.
3. The method of claim 2,
Magnetic material is Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM '2 O 4, and MpOq (M and M' are each independently selected from Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, or represents Cr, p And q satisfy the expressions "0 <p = 3" and "0 < q = 5 ", respectively.

제2항에 있어서,
자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 자기 공명 비콘.
3. The method of claim 2,
Wherein the magnetic alloy is at least one selected from the group consisting of CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe, and NiFeCo.

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제1항에 있어서,
제1접속분자는 SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열로 표시되는 자기 공명 비콘.
The method according to claim 1,
The first connecting molecule is a magnetic resonance beacon represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

제1항에 있어서,
제2접속분자는 SEQ ID NO: 2에 기재된 염기서열로 표시되는 자기 공명 비콘.
The method according to claim 1,
And the second connecting molecule is a magnetic resonance beacon represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

제1항에 있어서,
타겟 분자는 microRNA, mRNA, RNA, DNA, 펩타이드 또는 단백질인 자기 공명 비콘.
The method according to claim 1,
The target molecule is a microRNA, mRNA, RNA, DNA, peptide or protein magnetic resonance beacon.

제1항에 있어서,
링커 영역은 제1접속분자 및 제2접속분자 각각에 상보적인 염기서열을 함유하는 올리고머인 자기 공명 비콘.
The method according to claim 1,
Wherein the linker region is an oligomer containing a base sequence complementary to each of the first connecting molecule and the second connecting molecule.

제1항에 있어서,
링커 영역은 SEQ ID NO: 3에 기재된 염기서열로 표시되는 자기 공명 비콘.
The method according to claim 1,
The linker region is a magnetic resonance beacon represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3.

제1접속(adaptor)분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자, 제2접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자 및 핵산 프로브를 혼성화 조건에서 반응시켜 상기 자성 형광 나노입자들의 제1접속분자 및 제2접속분자와 핵산 프로브의 링커 영역이 혼성화되어 자가조립(self-assembly) 형 구조를 형성하도록 하는 것을 포함하고,
상기 핵산 프로브는 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 영역과 상기 제1접속분자 및 제2접속분자와 혼성화될 수 있는 링커 영역을 함유하며,
상기 제1접속분자와 제2접속분자는 각각 상기 핵산 프로브의 링커 영역에 상보적이되, 서로 상이한 염기서열로 표시되는 올리고머인, 자기 공명 비콘의 제조방법.
A first connecting molecule of the magnetic fluorescent nanoparticles and a second connecting molecule of the magnetic fluorescent nanoparticles are formed by reacting magnetic fluorescent nanoparticles having surface-bonded first adapter molecules, magnetic fluorescent nanoparticles surface- And hybridizing the linker region of the nucleic acid probe and the connecting molecule to form a self-assembly structure,
Wherein the nucleic acid probe contains a region specifically binding to a target molecule and a linker region capable of hybridizing with the first connecting molecule and the second connecting molecule,
Wherein the first connecting molecule and the second connecting molecule are oligomers complementary to a linker region of the nucleic acid probe and represented by different base sequences, respectively.

제12항에 있어서,
제1접속분자 또는 제2접속분자가 표면 결합된 자성 형광 나노입자는 자성 형광 나노입자에 존재하는 기능기와 제1접속분자 또는 제2접속분자에 도입된 기능기 간의 공유결합을 통해 제조되는 것인 자기 공명 비콘의 제조방법.
13. The method of claim 12,
The magnetic fluorescent nanoparticles having the first binding molecule or the second binding molecule surface-bound are produced through a covalent bond between the functional group existing in the magnetic fluorescent nanoparticle and the functional group introduced into the first connecting molecule or the second connecting molecule Method of manufacturing a magnetic resonance beacon.

제13항에 있어서,
자성 형광 나노입자에 존재하는 기능기는 -COOH, -CHO, -NH₂, -SH, -CONH₂, -PO₃H, -PO₄H, -SO₃H, -SO₄H, -OH, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기 및 -알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 자기 공명 비콘의 제조방법.
14. The method of claim 13,
Functional groups present in the magnetic fluorescent nanoparticle _{-COOH, -CHO, -NH 2, -SH} , -CONH 2, -PO 3 H, -PO 4 H, -SO 3 H, -SO 4 H, -OH, - A sulfonate, a sulfonate, a nitrate, a phosphonate, a succinimidyl group, a maleimide group, and an alkyl group.

제13항에 있어서,
제1접속분자 또는 제2접속분자에 도입된 기능기는 -NH₂, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -COCH₂, -SH, -CON₃ 및 -CH₂C(NH² ⁺)OCH₃로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 자기 공명 비콘의 제조방법.
14. The method of claim 13,
The functional groups introduced into the first connecting molecule or the second connecting molecule include -NH ₂ , -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -COCH ₂ , -SH, -CON ₃ and -CH ₂ C (NH ² ⁺ ) the method of producing a magnetic resonance beacon is selected from the group consisting of OCH _3.

제13항에 있어서,
자성 형광 나노입자에 존재하는 기능기는 -COOH이고, 제1접속분자 또는 제2접속분자에 도입된 기능기는 -NH₂인 자기 공명 비콘의 제조방법.
14. The method of claim 13,
Wherein the functional group existing in the magnetic fluorescent nanoparticle is -COOH, and the functional group introduced into the first connecting molecule or the second connecting molecule is -NH ₂ .

제1항에 따른 자기 공명 비콘을 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물.
A composition for detecting a target molecule comprising a magnetic resonance beacon according to claim 1.

제17항의 타겟 분자 탐지용 조성물을 생체로부터 분리된 세포 또는 조직에 주입하고, 상기 세포 또는 조직 내 타겟 분자와 자기 공명 비콘의 혼성화에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 것을 포함하는 생체로부터 분리된 세포 또는 조직의 영상 수득 방법.

18. A method for detecting a target molecule, comprising: injecting a composition for detecting a target molecule of claim 17 into a cell or tissue separated from a living body, and detecting a signal emitted by hybridization of a target molecule in the cell or tissue and a magnetic resonance beacon, A method for imaging an isolated cell or tissue.