KR101659846B1 - Hematopoietic stem cells derived from HAR-NDS, isolation method and use thereof - Google Patents

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    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors

Abstract

본 발명은 HAR-NDS(Hyaluronic acid-rich node and duct system)에 존재하는 세포들 중에서 혈액세포로의 분화능력을 가지는 조혈줄기세포 및 그 분리방법에 관한 것이다.
본 발명은 골수, 말초혈액 및 탯줄혈액(제대혈)으로부터 다소 수득이 용이하지 않은 조혈줄기세포의 대체 공급원으로 HAR-NDS로부터 분리할 수 있으므로, 각종 난치성 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to hematopoietic stem cells capable of differentiating into hematopoietic cells among cells present in HAR-NDS (Hyaluronic acid-rich node and duct system) and a method for separating hematopoietic stem cells.
INDUSTRIAL APPLICABILITY Since the present invention can be isolated from HAR-NDS as an alternative source of hematopoietic stem cells, which is not easily obtained from bone marrow, peripheral blood and umbilical cord blood (cord blood), it can be usefully used for the treatment of various intractable diseases.

Description

HAR-NDS 유래 조혈줄기세포, 그 분리방법 및 용도{Hematopoietic stem cells derived from HAR-NDS, isolation method and use thereof}HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells, methods for their isolation, and uses {HAR-NDS, isolation method and use thereof}

본 발명은 HAR-NDS(Hyaluronic acid-rich node and duct system)에 존재하는 세포들 중에서 혈액세포로의 분화능력을 가지는 조혈줄기세포 및 그 분리방법에 관한 것이다.
The present invention relates to hematopoietic stem cells capable of differentiating into hematopoietic cells among cells present in HAR-NDS (Hyaluronic acid-rich node and duct system) and a method for separating hematopoietic stem cells.

HAR-NDS(Hyaluronic acid-rich node and duct system)는 1960년대에 경락 및 경혈에 있어서 제3의 순환계로 발견된 구조체로서 봉한관(Bonghan) 또는 프리모관계(Primo Vascular System)라는 별칭을 가진다. HAR-NDS는 절(node)과 도관(duct)으로 구성되며 전신에 걸쳐 망상 구조로 장기 표면(Organ surface), 혈관내(inside blood vessel), 림프관내(inside lymphatics), 피부 및 신경계(nervous system)를 따라 네트워크를 형성하는 것으로 확인되었다(Kim BH[비특허문헌1]; Soh KS[비특허문헌2]; Lee et al[특허문헌1]). 또한, HAR-NDS의 절에는 선천성 면역세포로 채워져 있으며, 특히 마스트세포, 호산구, 호염기성구, 호중구 및 대식세포(histiocytes)가 풍부하게 존재하는 것으로 밝혀졌다(Kwon BS et al[비특허문헌3]).HAR-NDS (Hyaluronic acid-rich node and duct system) is a structure found in the 1960s as a third circulatory system for meridian and menstrual blood, and has the nickname Bonghan or Primo Vascular System. HAR-NDS consists of nodes and ducts. It has a network structure extending throughout the whole body. It has an organ surface, inside blood vessel, inside lymphatics, nervous system (nervous system) (Kim BH [Non-Patent Document 1]; Soh KS [Non-Patent Document 2]; Lee et al [Patent Document 1]). In addition, the section of HAR-NDS is filled with innate immune cells, and mast cells, eosinophils, basophils, neutrophils and histiocytes are abundantly found (Kwon BS et al. [Non-Patent Document 3 ]).

줄기세포(stem cell)란 자가 재생과 증식 능력을 가지면서 다양한 조직세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 말하며, 전능성 줄기세포(totipotent stem cell), 만능성 줄기세포(pluripotent stem cell) 및 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. Stem cells are cells that have the ability to regenerate and proliferate and to differentiate into various tissue cells. They are totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and pluripotent stem cells. It can be classified as multipotent stem cells.

최적화된 조혈줄기세포의 배양을 위해서는 조혈 성장인자들의 적절한 조합이 필수적이다. 대표적으로, 조혈줄기세포의 생존, 증식 및 성숙(분화)에 필요한 SCF(stem cell factor) (Broudy et al[비특허문헌4]), FL(flt3/flt2 ligand), IL(interleukin), LIF(Leukemia inhibitory factor), TPO(thrombopoietin) 등과 같은 사이토카인(cytokine)이 이러한 역할을 수행한다. 아울러, 조혈지지세포인 생쥐 골수 유래의 OP9 세포와의 공동배양으로 코블스톤-에리어 포밍 세포들(Cobblestone-area forming cells (CAFCs))을 형성함으로써 조혈줄기세포의 증식 및 분화유도 체계가 한 층 개선되었다(Nakahata et al[비특허문헌5], Eaves et al[비특허문헌6]).An appropriate combination of hematopoietic growth factors is essential for the cultivation of optimized hematopoietic stem cells. Representative examples include SCF (stem cell factor) (Broudy et al (Non-Patent Document 4)), FL (flt3 / flt2 ligand), IL (interleukin), LIF Leukemia inhibitory factor (TPO), thrombopoietin (TPO), and other cytokines play a role. In addition, the formation of Cobblestone-area forming cells (CAFCs) by co-culturing with OP9 cells derived from mouse bone marrow, which is a hematopoietic support cell, resulted in an improvement of the proliferation and differentiation induction system of hematopoietic stem cells (Nakahata et al [Non-Patent Document 5], Eaves et al [Non-Patent Document 6]).

골수에 존재하는 성체 비조혈 줄기세포(non-hematopoietic stem cell)로는 VSELs(very small embryonic-like stem cell), 다능성 성체 줄기세포(multipotent adult stem cell), 다능성 성체 모세포(multipotent adult progenitor cell), 골수 유래의 성체 다혈통 유도성 세포(marrow-isolated adult multilineage inducible cell), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 내피 모세포(endothelial progenitor cell)가 있다(Zuba-Surma EK et al[비특허문헌7]; Beltrami AP et al[비특허문헌8]; Jiang Y et al[비특허문헌9], Pittenger SC et al[비특허문헌10]).Non-hematopoietic stem cells present in the bone marrow include VSELs (very small embryonic-like stem cells), multipotent adult stem cells, multipotent adult progenitor cells, , Adult bone marrow-derived adult multilineage inducible cells, mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells (Zuba-Surma EK et al [Non-Patent Document 7]; Beltrami AP et al. [Non-Patent Document 8]; Jiang Y et al [Non-Patent Document 9], Pittenger SC et al [Non-Patent Document 10]).

특히, VSELs는 설치류와 인간의 골수에 드물게 존재하는 작은 크기의 배아유사 줄기세포로 계통(lineage) 및 CD45에 대해 음성이고 줄기세포 표지자를 발현하며, 체외(in vitro)에서 외배엽, 중배엽, 내배엽의 3배엽으로 분화할 수 있다(Kucia M et al[비특허문헌11]).In particular, the VSELs and express stem cell markers, negative and for small rodents and size similar to embryonic stem cells in the grid (lineage) and CD45 in that rarely present in human bone marrow in vitro (in vitro) ectoderm, mesoderm can differentiate into three germ layers of endoderm (Kucia M et al [Non-Patent Document 11]) in.

이와 같이 골수 유래의 조혈줄기세포가 동정되었고, 이들의 체외 제조방법이 발견되었으나, 여전히 조혈줄기세포의 원천적인 공급에는 한계가 있다.As described above, hematopoietic stem cells derived from bone marrow have been identified, and their in vitro production methods have been found, but there is still a limit to the original supply of hematopoietic stem cells.

이에, 본 발명자들은 조혈줄기세포의 새로운 공급원(source)을 개발하고자 예의 노력한 결과, HAR-NDS로부터 조혈줄기세포를 분리하고, 상기 분리된 세포가 증식될 수 있고, 혈액세포로의 분화능력이 우수하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to develop a new source of hematopoietic stem cells. As a result, they have found that hematopoietic stem cells can be isolated from HAR-NDS, and that the isolated cells can proliferate and have excellent ability to differentiate into blood cells And the present invention was completed.

1. KR 10-0950246, 2010년03월23일1. KR 10-0950246, March 23, 2010

1. Kim BH, The KyungrakSystem. J Jo Sun Med., 108: 1-38, 19651. Kim BH, The KyungrakSystem. J Jo Sun Med., 108: 1-38, 1965 2. Soh KS, Bonghan circulatory system as an extension of acupuncture meridians. J Acupunt Meridian Stud., 2: 93-106, 20092. Soh KS, Bonghan circulatory system as an extension of acupuncture meridians. J Acupunt Meridian Stud., 2: 93-106, 2009 3. Kwon BS et al., Microscopic nodes and ducts inside lymphatics and on the surface of internal organs are rich in granulocytes and secretory granules. Cytokine., 60: 587-592, 20123. Kwon BS et al., Microscopic nodes and ducts inside lymphatics and on the surface of internal organs are rich in granulocytes and secretory granules. Cytokine., 60: 587-592, 2012 4. Broudy et. al., Stem cell factor and hematopoiesis. Blood, 90 (4): 1345-64, 19974. Broudy meat. al., Stem cell factor and hematopoiesis. Blood, 90 (4): 1345-64, 1997 5. Nakahata et al., Hemopoietic colony-forming cells in umbilical cord blood with extensive capability to generate mono- and multipotential hemopoietic progenitors. J. Clin. Invest., 70: 1324-1328, 19825. Nakahata et al., Hemopoietic colony-forming cells in umbilical cord blood with extensive capability to generate mono- and multipotential hemopoietic progenitors. J. Clin. Invest., 70: 1324-1328, 1982 6. Eaves et al., Methology of long-term culture of human hematopoiesis, J. Tissue Cult. Methods., 13: 55-62, 19916. Eaves et al., Meth. Of long-term culture of human hematopoiesis, J. Tissue Cult. Methods., 13: 55-62, 1991 7. Zuba-Surma EK et al., "Small stem cells" in adult tissues: very small embryonic-like stem cells stand up!. Cytometry A., 75: 4-13, 20097. Zuba-Surma EK et al., "Small stem cells" in adult tissues: very small embryonic-like stem cells stand up !. Cytometry A., 75: 4-13, 2009 8. Beltrami AP et al., Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood, 110: 3438-3446, 20078. Beltrami AP et al., Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood, 110: 3438-3446, 2007 9. Jiang Y et al., Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature, 418: 41-49, 20029. Jiang Y et al., Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature, 418: 41-49, 2002 10. Pittenger SC et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 284: 143-147, 199910. Pittenger SC et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 284: 143-147, 1999 11. Kucia M et al., A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4(+)SSEA1(+)Oct-4+ stem cells identified in adult bone marrow. Leukemia. 20: 857-869, 200611. Kucia M et al., A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4 (+) SSEA1 (+) Oct-4 + stem cells identified in adult bone marrow. Leukemia. 20: 857-869, 2006 12. Baum et al., Isolation of a candidate human hematopoietic stem-cell population. PNAS, 89(7): 2804-2808, 199212. Baum et al., Isolation of a candidate human hematopoietic stem-cell population. PNAS, 89 (7): 2804-2808, 1992

본 발명의 목적은 HAR-NDS(hyaluronic acid-rich node and duct system) 유래 세포로서 혈액세포로의 분화능력을 가지는 조혈줄기세포 배양 및 그 분리 방법을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a method for culturing hematopoietic stem cells and a method for separating hematopoietic stem cells derived from HAR-NDS (hyaluronic acid-rich node and duct system).

본 발명의 다른 목적은 상기 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 분화시켜 성숙한 혈액세포를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for producing mature blood cells by differentiating the HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells.

본 발명의 다른 목적은 상기 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 유효성분으로 함유하는 골수 및 비장 유래 조혈기능을 대체할 필요가 있는 질환, 또는, 마스트세포(mast cell) 및 호산구(eosinophil)에 의하여 매개되는 질환, 또는, 골수 유래 면역기능의 저하 또는 항진에 의한 질환의 치료제를 제공하는 데 있다.
It is another object of the present invention to provide a method for treating a hematopoietic stem cell comprising the HAR-NDS-derived hematopoietic stem cell as an active ingredient, which is capable of mediating a disease requiring replacement of bone marrow and spleen-derived hematopoietic functions or a mast cell and an eosinophil Or a therapeutic agent for a disease caused by lowering or hyperactivity of immune function derived from bone marrow.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HAR-NDS(hyaluronic acid-rich node and duct system) 유래 조혈줄기세포를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides hematopoietic stem cells derived from HAR-NDS (hyaluronic acid-rich node and duct system).

본 발명은 또한, (a) HAR-NDS를 HAR-NDS용 염색시료로 염색하고 추출하여 그 구성 세포들을 분리하는 단계; (b) 상기 (a)에서 분리된 HAR-NDS의 구성 세포들을 혈청 및 사이토카인을 함유하는 메틸셀룰로오스 배지에서 배양하여 집락형성세포(CFCs; colony forming cells)를 형성시키는 단계를 포함하는 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포의 분리방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing HAR-NDS, comprising the steps of: (a) staining and extracting HAR-NDS with HAR-NDS staining sample and separating the constituent cells; (b) culturing the constituent cells of HAR-NDS isolated in (a) above in a methylcellulose medium containing serum and cytokine to form colony forming cells (CFCs) The present invention provides a method for separating hematopoietic stem cells.

본 발명은 또한, (a) HAR-NDS 유래 조혈줄기세포 중에서 조혈아세포(hemangioblast)를 기원으로 하는 세포를 혈청 및 사이토카인을 함유하는 배지에서 조혈지지세포와 공동 배양하여 코블스톤-에리어 포밍 세포(CAFCs, cobblestone-area forming cells)를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 (a)에서 형성된 CAFCs를 CFCs용 메틸셀룰로오스 배지에서 계대배양하여 성숙한 혈액세포(hematopoietic cell)를 형성시키는 단계를 포함하는 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포의 분화방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for the treatment of hematopoietic stem cells comprising the steps of: (a) harvesting hemangioblast-derived cells from HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells by co-culturing with hematopoietic support cells in a medium containing serum and cytokine, CAFCs, cobblestone-area forming cells); And (b) subculturing the CAFCs formed in (a) in a methylcellulose medium for CFCs to form mature hematopoietic cells. The present invention also provides a method for differentiating HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells.

본 발명은 또한, HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 유효성분으로 함유하는 골수 또는 비장 유래 조혈기능을 대체할 필요가 있는 질환의 치료제를 제공한다.The present invention also provides a therapeutic agent for a disease in which bone marrow or spleen-derived hematopoietic function containing HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells as an active ingredient needs to be replaced.

본 발명은 또한, HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 유효성분으로 함유하는 마스트세포(mast cell) 및 호산구(eosinophil)에 의하여 매개되는 질환의 치료제를 제공한다.The present invention also provides a therapeutic agent for diseases mediated by mast cells and eosinophils containing HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells as an active ingredient.

본 발명은 또한, HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 유효성분으로 함유하는 골수 유래 면역기능의 저하 또는 항진에 의한 질환의 치료제를 제공한다.
The present invention also provides a therapeutic agent for a disease caused by a decrease in bone marrow-derived immune function or hyperactivity, comprising HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells as an active ingredient.

본 발명은 골수, 말초혈액 및 탯줄혈액(제대혈)으로부터 다소 수득이 용이하지 않은 조혈줄기세포의 대체 공급원으로 HAR-NDS로부터 분리할 수 있으므로, 각종 난치성 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
INDUSTRIAL APPLICABILITY Since the present invention can be isolated from HAR-NDS as an alternative source of hematopoietic stem cells, which is not easily obtained from bone marrow, peripheral blood and umbilical cord blood (cord blood), it can be usefully used for the treatment of various intractable diseases.

도 1은 생쥐 장의 표면 및 정맥과 림프관(lymphatics) 내부에 존재하는 HAR-NDS를 나타낸 것으로, (A)는 C57BL/6 생쥐(5~6주령)를 마취하고 정맥과 림프관 내부에 존재하는 HAR-NDS를 1% 알시안 블루로 염색한 결과이고, (B)는 스캐닝 전자현미경(SEM)으로 관찰한 HAR-NDS를 나타낸 것이며, (C)는 투과용 전자현미경(TEM)으로 관찰한 HAR-node을 나타낸 사진이다. 또한, (D)는 HAR-NDS, 혈청, 소변, 복막액(PF) 및 림프관(LV)의 히알루론산(HA)의 농도를 비교한 것이다.
도 2는 HAR-NDS에서 발견한 조혈모세포를 나타낸 것이다. (A)는 조혈모세포 콜로니를 나타내며, (B)는 Wright-Giemsa로 염색된 각 콜로니 유래의 세포들을 나타낸 사진이다. 또한, (C)는 BM 및 HAR-NDS에 존재하는 MCPs의 총합계를 나타낸 그래프이고, (D)는 MCPs 콜로니에 존재하는 세포의 표현형을 유세포분석한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 HAR-NDS에서 발견한 조혈줄기세포를 나타낸 것이다. (A)는 체외(in vitro)에서 배양한 코블스톤-에리어 포밍 세포들(cobblestone-area forming cells, CAFCs)의 사진이고(왼쪽 패널: 배율, × 50; 오른쪽 패널: 단일 콜로니의 확대, x100), (B)는 HAR-NDS/OP9 공동배양에서의 조혈아세포(hemangioblast)의 존재여부를 유세포분석에 의해 나타낸 그래프이며, (C)는 HAR-NDS/OP9 공동배양에서 존재여부가 확인된 조혈줄기세포(Hematopoietic stem cell, HSC)를 나타낸 것이다. 또한, (D)는 Lin-CAFCs 및 각 표지자에 대한 lin-CD45+CAFCs의 상대적 백분율을 나타낸 것이고, (E)는 HAR-NDS/OP9 공동배양에서의 CAFCs가 마일로이드(myeloid), B-계통 세포 및 T-계통 세포로 분화한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 조혈줄기세포를 유도하여 형성된 콜로니의 특징을 나타낸 것으로, (A)는 HAR-NDS/OP9 공동배양으로 형성된 CAFCs를 나타낸 것이고, (B)는 CFCs의 표현형을 유세포분석하여 나타낸 그래프이다. 또한, (C)는 CFCs의 증식능력을 나타내는 그래프이고, (D)는 Wright-Giemsa 또는 톨루이딘 블루로 염색된 CFCs를 나타내는 사진이다(눈금 막대: 10μm; 배율: x 400).
도 5는 골수, 비장 및 HAR-NDS 유래 MCPs의 출현에 관여하는 IFN-γ의 조절양상을 나타낸 것으로, (A)는 정상 생쥐 및 다양한 유전자 결핍 생쥐의 HAR-NDS에서의 MCPs 콜로니의 출현빈도를 나타낸 것이며, (B)는 정상 생쥐 대 IFN-γ-KO 생쥐의 비장으로부터 형성된 조혈모세포의 수를 비교한 것이다. 또한, (C)는 c-kitW - sh /W-sh 및 c-kitW - sh /+의 HAR-NDS에 존재하는 MCPs 콜로니의 출현빈도를 나타낸 것이다.
도 6은 골수 세포가 HAR-NDS로 이동되는 양상을 나타낸 것이다.FIG. 1 shows HAR-NDS present on the surface and veins and lymphatics of a mouse intestine. FIG. 1 (A) shows an image of HAR-NDS present in an intravenous and lymphatic canal by anesthetizing C57BL / 6 mice (5-6 weeks old) (B) shows HAR-NDS observed with a scanning electron microscope (SEM), (C) shows HAR-node observed with a transmission electron microscope (TEM) FIG. (D) compares the concentrations of HAR-NDS, serum, urine, peritoneal fluid (PF), and hyaluronic acid (HA) in lymphatic vessels (LV).
Figure 2 shows hematopoietic stem cells found in HAR-NDS. (A) shows hematopoietic stem cell colonies, and (B) shows cells derived from each colony stained with Wright-Giemsa. (C) is a graph showing the sum of MCPs present in BM and HAR-NDS, and (D) is a flow cytometric analysis of the phenotype of cells present in MCPs colonies.
3 shows hematopoietic stem cells found in HAR-NDS. (A) is a photograph of cobblestone-area forming cells (CAFCs) cultured in vitro (left panel: magnification, × 50; right panel: enlargement of single colonies, x100) (B) is a graph showing the presence of hemangioblast in co-culture of HAR-NDS / OP9 by flow cytometry. (C) is a graph showing the presence of hematopoietic stem Cells (hematopoietic stem cells, HSC). Further, (D) is Lin - CAFCs and lin markers for each - will showing the relative percentage of CD45 + CAFCs, (E) is HAR-NDS / OP9 co-culture at a CAFCs miles Lloyd (myeloid), B- strains Cell and T-lineage cells.
FIG. 4 shows the characteristics of colonies formed by inducing hematopoietic stem cells. FIG. 4 (A) shows CAFCs formed by HAR-NDS / OP9 co-culture, and FIG. 4 (B) is a graph showing flow cytometry analysis of CFCs. (D) is a photograph showing CFCs stained with Wright-Giemsa or toluidine blue (scale bar: 10 μm; magnification: x 400).
FIG. 5 shows the regulatory patterns of IFN-y involved in the appearance of bone marrow, spleen and HAR-NDS-derived MCPs. (A) shows the frequency of MCPs colonization in HAR-NDS of normal and various gene- (B) compares the number of hematopoietic stem cells formed from the spleen of normal mouse versus IFN-y-KO mice. (C) shows the frequency of occurrence of MCPs colonies present in HAR-NDS of c-kit W - sh / W-sh and c-kit W - sh / + .
FIG. 6 shows the manner in which bone marrow cells are transferred to HAR-NDS.

'조혈세포'는 조혈 경로 기원의 임의의 세포를 지칭한다. 상기 세포는 허용되는 형태학적 특징 및 조혈 계통의 특징인 표현형적(면역학적) 표지자를 발현한다. 조혈모세포, 콜로니 형성세포 및 완전히 분화된 세포가 여기에 포함된다. '조혈아세포(전구체)', '조혈모세포' 또는 '조혈줄기세포'는 완전히 분화된 혈액세포를 생성하는 능력을 갖추고 자기 복제능력을 갖는 세포이다. 'Hematopoietic cell' refers to any cell of hematopoietic origin. The cells express phenotypic (immunologic) markers that are characteristic of acceptable morphological features and hematopoietic lineage. Hematopoietic stem cells, colony forming cells and fully differentiated cells. 'Hematopoietic stem cells' or 'hematopoietic stem cells' are cells capable of self-replicating ability with the ability to produce fully differentiated blood cells.

본 발명에서 말하는 전구세포란 미분화 상태의 세포로부터 완전 분화에 이르는 조혈아세포(hemangioblast) 및 조혈모세포(Hematopoietic progenitor cells(HSC))를 포함한 모든 중간단계의 자기 복제능력 및 분화능력을 가지는 조혈세포를 지칭한다. 조혈아세포로부터 기원한 조혈줄기세포는 각종 사이토카인에 의해 마일로이드(myeloid)계통의 거핵구, 적혈구, 마스트세포 및 호염기성구, 호중구, 호산구 및 단핵구(대식세포), 또는 림프(lymphoid)계통의 자연살해세포(natural killer cell), T-림프구 및 B-림프구 등의 혈액세포로 분화한다.The term " progenitor cells " used herein refers to hematopoietic cells having all intermediate stages of self-replication and differentiation, including hemangioblast and hematopoietic progenitor cells (HSC) from undifferentiated cells to complete differentiation do. Hematopoietic stem cells originated from hematopoietic stem cells are classified into various types of hematopoietic stem cells such as megakaryocytes, red blood cells, mast cells and basophils, neutrophils, eosinophils and monocytes (macrophages) or lymphoid system Such as natural killer cells, T-lymphocytes and B-lymphocytes.

HAR-NDS 유래 조혈줄기세포는 장기 표면, 혈관내, 림프관내 및 피부에 존재하는 절(node)과 도관(duct)으로 구성된 망상구조로부터 추출할 수 있으며, 특히 사람의 경우에서는 태반(placenta)으로부터 추출할 수 있다. 이 방법은 윤리적으로 허용 가능하면서도 연구자 또는 환자에게 생물 의학적으로 부담을 지우지 않는 신속하고도 효율적으로 조혈줄기세포를 채취할 수 있는 방법이 될 수 있다.HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells can be extracted from a reticulum composed of nodes and ducts existing on the surface of the organs, intravascularly, in the lymphatic vessels and in the skin. Especially in humans, the placenta Can be extracted. This method can be a method to obtain hematopoietic stem cells quickly and efficiently, which is ethically acceptable but does not put biomedical burden on researchers or patients.

투명한 HAR-NDS 조직을 체내로부터 분리해 내기 위해서는 HAR-NDS를 선별적으로 염색할 수 있는 시료인 메틸렌 블루(Methylene blue), 야누스 그린 B(Janus green B, JGB) 또는 알시안 블루(Alcian blue) 등을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 1% 알시안 블루를 체내에 주입하여 조직의 존재를 원활하게 시각화하는 것이 바람직하다.In order to isolate the transparent HAR-NDS tissue from the body, Methylene blue, Janus green B, JGB or Alcian blue, which can selectively dye HAR-NDS, Or the like. Specifically, it is preferable to inject 1% Alcian blue into the body to smoothly visualize the presence of the tissue.

본 발명에서, 조혈줄기세포를 동정하는 3가지 방법으로는: 1) 세포 특이적인 표지자(마커, Marker)를 대상으로 세포의 표현형을 파악하는 유세포분석; 2) 세포 재생능력(증식능력)을 세포 도말 효율(plating efficiency) 및 세포 집락형성의 형태로 측정하는 방법; 및 3) 분화 유도제 및 지지세포와의 공동배양을 이용한 분화능력 측정법이 있다. 상기 방법들은 본 명세서에 기재되어 있거나 공지된 내용으로 구현할 수 있다.In the present invention, three methods for identifying hematopoietic stem cells include: 1) flow cytometry analysis of cell phenotype targeting cell-specific markers (markers); 2) a method of measuring cell regeneration ability (proliferation ability) in the form of cell plating efficiency and cell colonization formation; And 3) a method of measuring differentiation ability by co-culturing with differentiation inducer and supporting cells. These methods may be implemented as described or known in the art.

HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 분리해내기 위해서는 유세포분석(Flow cytometry) 방법을 사용할 수 있다. 즉, FACS(Fluorescence-activated cell sorting)로 세포의 표면에 발현되는 표지자(항원)를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합으로 표지하고 항체에 부착된 형광물질로 항원의 존재 여부를 분석하고, 필요로 하는 세포를 분리, 획득할 수 있다. 여기서 사용 가능한 형광물질로는 FITC(Fluorescein isothiocyanate), PE(Phycoerythrin), APC(allo-phycocyanin), TR(TexasRed), Cy3, Cy5, CyChrome, Red613, Red670, Tri-Color, QuantumRed, Alexa Fluor 647 등이 있다.Flow cytometry can be used to isolate HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells. That is, an antibody that specifically recognizes a marker (antigen) expressed on the surface of a cell by fluorescence-activated cell sorting (FACS) is singly or in combination, and the presence or absence of the antigen is analyzed using a fluorescent substance attached to the antibody, The necessary cells can be isolated and obtained. Fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (AP), allo-phycocyanin, TR (TexasRed), Cy3, Cy5, CyChrome, Red613, Red670, Tri-Color, QuantumRed, Alexa Fluor 647 .

미분화된 조혈줄기세포의 일반적인 면역학적 표현형 표지자는 생쥐와 사람에서 다소 다르며, 생쥐의 경우, CD34low /-, SCA-1+, Thy1+/ low, CD38+, C-kit+ 및 lin- 을 가지며, 인간의 경우는 CD34+, CD59+, Thy1+, CD38low /-, C-kit-/ low 및 lin- 을 가진다(Baum et al[비특허문헌12]).Typical immunological phenotypic markers of undifferentiated hematopoietic stem cells differs somewhat from mouse and human, in the case of mice, CD34 low / -, SCA-1 +, Thy1 + / low, CD38 +, C-kit + and lin - has a , CD34 + , CD59 + , Thy1 + , CD38 low / - , C-kit - / low And lin - (Baum et al [Non-Patent Document 12]).

CD135(FLK2, FLT3, STK1)는 조혈줄기세포에서 발현되지 않으나 다능성 줄기세포와 림프계 모세포에서 발현되는 표지자이다.CD135 (FLK2, FLT3, STK1) is not expressed in hematopoietic stem cells but is a marker expressed in pluripotent stem cells and lymphoid cells.

조혈아세포의 일반적인 면역학적 표현형 표지는 CD31(PECAM-1), CD34, ECadherin(CD324), Endoglin(CD105), EphB4, Tie2(CD202b), VE-Cadherin(CD144) 및 VEGFR2(Flk1) 등이 있다.Common immunologic phenotypic markers of hematopoietic cells include CD31 (PECAM-1), CD34, ECadherin (CD324), Endoglin (CD105), EphB4, Tie2 (CD202b), VE-Cadherin (CD144) and VEGFR2 (Flk1).

본 발명에서 조혈줄기세포의 증식에 사용되는 배지는 기본 배지(basal medium)로 MEM(Minimum Essential Medium), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM-F12, RPMI(Roswell Park Memorial Institute), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium), NeuroCult Basal Medium 등이 있으며, 이 외에 당해 업계에서 이용되는 배지이면 충분하다.In the present invention, the medium used for the proliferation of hematopoietic stem cells is basal medium such as MEM (Minimum Essential Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM-F12, RPMI (Roswell Park Memorial Institute) (Keratinocyte Serum Free Medium), and NeuroCult Basal Medium. In addition, the medium used in the industry is sufficient.

본 발명에서 허혈성(ischemia) 질환이란, 조직으로의 혈액공급의 감소 또는 두절에 의한 기능 이상 또는 조직변성 또는 괴사를 말하고, 구체적으로는 심근경색 및 협심증 등의 허혈성 심질환 및 사지허혈, 혈류부전을 수반하는 손상 및 절단 등의 외상 및 골절 등이 포함된다. 즉, 본 발명에서 허혈성 질환에는, 허혈성 질병뿐 아니라, 손상 및 상해에 의한 허혈 상태도 포함된다.In the present invention, ischemia disease refers to a decrease in blood supply to a tissue or dysfunction or tissue degeneration or necrosis caused by discontinuity, and specifically refers to ischemic heart disease and limb ischemia such as myocardial infarction and angina pectoris, And trauma and fracture such as amputation and fracture. That is, the ischemic diseases in the present invention include not only ischemic diseases, but also ischemic conditions caused by injuries and injuries.

'치료'란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화하거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에서 질환의 '치료' 또는 '치료요법'은 하기의 하나 이상을 포함한다: (1) 해당 질환의 성장을 저해함; (2) 질환의 확산을 예방함; (3) 질환을 경감시킴; (4) 질환의 재발을 예방함; 및 (5) 질환의 증상을 완화함(palliating).The term " treatment " means, unless otherwise stated, means reversing, alleviating, inhibiting, or preventing the disease or condition to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or disorder do. As used herein, the term " treatment " refers to an act of treating when " treating " is defined as above. Thus, " treatment " or " therapy " of a disease in a mammal includes one or more of the following: (1) inhibiting the growth of the disease; (2) preventing the spread of the disease; (3) relieving the disease; (4) preventing the recurrence of the disease; And (5) palliating the symptoms of the disease.

허혈성 질환을 치료하기 위해, 본 발명의 조성물을 약리학적 유효량으로 투여한다. '약리학적 유효량(therapeutically effective amount)'은 투여되는 화합물의 양이 치료하는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 낮추는 것을 의미한다. 따라서 약리학적 유효량은: (1) 질환의 진행 속도를 역전시키거나, (2) 질환의 그 이상의 진행을 어느 정도 금지하게 하는 것을 의미하며, (3) 질환과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바람직하게는, 제거)하는 효과가 있는 양을 의미한다.In order to treat ischemic diseases, the composition of the present invention is administered in a pharmacologically effective amount. A " therapeutically effective amount " means that the amount of the compound administered is to some extent lowered to one or more symptoms of the disorder being treated. Thus, a pharmacologically effective amount means: (1) reversing the rate of progression of the disease, (2) inhibiting further progression of the disease to some extent, (3) modifying one or more symptoms associated with the disease to some degree Quot; means an amount that has an effect of alleviation (preferably, elimination).

본 발명의 세포치료제는 약학적으로 허용할 수 있는 담체(운반체) 및/또는 첨가물 등을 포함하는 조성물일 수 있다. 예를 들면, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함해도 된다. 국소 투여를 위해, 바이오 폴리머 등의 유기물, 히드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 폴리머 또는 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜 폴리머 또는 코폴리머 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The cell therapeutic agent of the present invention may be a composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier (carrier) and / or an additive or the like. Examples thereof include sterilized water, physiological saline, buffers for common use (phosphoric acid, citric acid and other organic acids), stabilizers, salts, antioxidants (such as ascorbic acid), surfactants, suspending agents, isotonic agents, You can. For local administration, it is also preferable to combine an organic substance such as a biopolymer, an inorganic substance such as hydroxyapatite, specifically, a collagen matrix, a polylactic acid polymer or a copolymer, a polyethylene glycol polymer or a copolymer and a chemical derivative thereof. Carriers and formulation with appropriate pharmaceutically acceptable are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19 th ed ., 1995).

양적 투여량은 예를 들면 허혈 부위 주변의 생존근(골격근 또는 심근 등)에 1개소 또는 복수 개소에 투여할 수 있으며, 투여량은 1.0×105~1.0×108 세포/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0×106~1.0×107 세포/kg(체중)이 바람직하다. 다만, 투여량은 환자의 체중, 나이, 성별, 증상, 투여조성물의 형태, 투여방법 등에 따라 상이해도 되고, 당업자라면 적절히 조정하는 것이 가능하다. 투여횟수는 1회 또는 임상상 용인 가능한 부작용의 범위에서 복수회 가능하고, 투여부위에 대해서도 1개소 또는 복수개소 투여해도 된다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 같은 투여량으로 한다. 본 발명의 치료 대상동물로서는, 인간과 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.The quantitative dose can be administered, for example, to one or more sites of survival muscle (skeletal muscle or myocardium) around the ischemic site, and the dosage is 1.0 × 10 5 to 1.0 × 10 8 cells / kg (body weight) And more preferably 1.0 × 10 6 to 1.0 × 10 7 cells / kg (body weight). However, the dosage may be different depending on the patient's body weight, age, sex, symptom, form of administration composition, method of administration, and the like, and can be appropriately adjusted by those skilled in the art. The number of administrations may be once or multiple times within the range of possible adverse effects, and the administration site may be administered at one site or at multiple sites. For animals other than humans, the dose is the same as that for humans per kg. Examples of the animal to be treated of the present invention include humans and other mammals. Examples of such mammals include humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cows, dogs, horses, pigs and the like.

본 발명의 허혈성 질환 치료제는 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여 등을 포함하는 비경구 투여가 바람직하고, 보다 바람직하게는 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있으며, 주로 손상 부위에 직접 주입하는 방법으로 투여할 수 있다.The therapeutic agent for ischemic diseases of the present invention is preferably parenteral administration including intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or local administration, more preferably subcutaneous administration or local administration And can be administered by direct injection mainly to the injured area.

본 세포치료제의 형태는 주사기나 디바이스(장치)에 담긴 최종 주입 형태, 냉동이 가능한 크라이오바이알(cryovial)의 형태, 또는 액상의 약품을 담을 수 있는 파이로젠이 없는 유리병과 고무전, 알루미늄 캡 형태로 충진될 수 있다. 디바이스의 형태로는 주사기, 멀티실린지 등이 사용될 수 있으며 사지 허혈성 질환의 경우에는 세포가 투여되는 동안 세포가 shear 되어 손상을 입히지 않으면서 고통을 최소화할 수 있는 주사바늘을 이용하며 바람직하게는 20 Guage에서 31 Guage 범위에서 투여할 부위나 근육의 깊이를 고려하여 사용하며, 실린지나 디바이스가 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 소재를 사용한다.
The form of the present cell therapy agent can be a final injection form contained in a syringe or a device, a cryovial form capable of being frozen, or a pyrogen-free glass bottle capable of holding a liquid medicine, ≪ / RTI > In the case of limb ischemic diseases, the needles can be used to minimize the pain while the cells are sheared during the administration of the cells, preferably 20 It is used in Guage considering the area to be administered in the 31 Guage range or the depth of muscles, and materials that do not affect cell viability are used for syringes or devices.

본 발명은 일 관점에서, HAR-NDS(hyaluronic acid-rich node and duct system) 유래 조혈줄기세포에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to hematopoietic stem cells derived from hyaluronic acid-rich node and duct system (HAR-NDS).

본 발명에 있어서, 상기 HAR-NDS를 가지는 동물은 척추동물인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 적용 가능한 척추동물은 생쥐, 쥐, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지, 원숭이 및 인간이 있으나 이에 한정되지 않는다.In the present invention, the animal having HAR-NDS may be a vertebrate animal, and the applicable vertebrate animal is a mouse, a rat, a rabbit, a sheep, a cattle, a dog, a horse, a pig, a monkey, But is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 HAR-NDS는 장기 표면, 혈관내, 림프관내 및 피부에 존재하는 절(node)과 도관(duct)으로 구성된 망상구조인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the HAR-NDS may be a network structure composed of nodes and ducts existing in the long-term surface, intravascular, lymphatic, and skin.

본 발명에 있어서, HAR-NDS 유래 조혈줄기세포는 CD45-, B220- 및 FLK-1+ 면역학적 특성을 가지는 세포군집의 조혈아세포(hemangioblast)에서 기원하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells are CD45 - can be characterized in that it originated in and FLK-1 + hematopoietic immunological fibroblasts (hemangioblast) of cell clusters having the properties -, B220.

본 발명에 있어서, HAR-NDS 유래 조혈줄기세포는 상기 조혈아세포로부터 기원한 Sca-1+, CD59+, Lin-, CD45+, B220+, c-kit+, CD34- 및 CD135- 면역학적 특성을 가지는 세포군집의 조혈모세포(hematopoietic progenitor cell)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells is a Sca-1 +, CD59 +, Lin originated from the hematopoietic fibroblasts -, CD45 +, B220 +, c-kit +, CD34 - immunological characteristics - and CD135 May contain hematopoietic progenitor cells of cell clusters.

본 발명에 있어서, HAR-NDS 유래 혈액세포는 상기 조혈모세포부터 분화한 마일로이드(myeloid)계통의 거핵구, 적혈구, 마스트세포 및 호염기성구, 호중구, 호산구 및 단핵구(대식세포), 또는, 림프(lymphoid)계통의 자연살해세포(natural killer cell), T-림프구 및 B-림프구로 분화된 세포집단에서 선택되는 세포를 특징으로 할 수 있다.In the present invention, HAR-NDS-derived blood cells are derived from the myeloid lineage differentiated from the hematopoietic stem cells, such as megakaryocytes, red blood cells, mast cells and basophils, neutrophils, eosinophils and monocytes (macrophages) lymphocytes, natural killer cells, T-lymphocytes, and B-lymphocytes.

본 발명은 다른 관점에서, (a) HAR-NDS를 HAR-NDS용 염색시료로 염색하고 추출하여 그 세포들을 분리하는 단계; (b) 상기 (a)에서 분리된 HAR-NDS의 구성 세포들을 혈청 및 사이토카인을 함유하는 CFCs용 메틸셀룰로오스 배지에서 배양하여 집락형성세포(CFCs; colony forming cells)를 형성시키는 단계를 포함하는 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포의 분리방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a method for producing HAR-NDS, comprising: (a) staining and extracting HAR-NDS with a HAR-NDS staining sample to separate the cells; (b) culturing HAR-NDS constituent cells isolated in (a) above in a methylcellulose medium for CFCs containing serum and cytokine to form colony forming cells (CFCs) -NDS-derived hematopoietic stem cells.

본 발명에 있어서, 상기 HAR-NDS는 장기 표면, 혈관내, 림프관내 및 피부에 존재하는 절(node)과 도관(duct)으로 구성된 망상 구조인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the HAR-NDS may be a network structure composed of nodes and ducts existing in the long-term surface, intravascular, lymphatic, and skin.

본 발명에 있어서, 상기 HAR-NDS용 염색시료는 알시안 블루(Alcian blue), 메틸렌 블루(Methylene blue) 및 야누스 그린 B(Janus green B, JGB)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the dye sample for HAR-NDS may be selected from the group consisting of Alcian blue, Methylene blue, and Janus green B (JGB) .

본 발명에 있어서, 상기 사이토카인은 에리트로포이에틴(erythropoietin), SCF(stem cell factor), GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor), IL-3/-7, FL(flt3/flt2 ligand), LIF(Leukemia inhibitory factor) 및 TPO(thrombopoietin)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the cytokine may be erythropoietin, stem cell factor (SCF), granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), IL-3/7, FL (flt3 / flt2 ligand) LIF (Leukemia inhibitory factor) and TPO (thrombopoietin).

본 발명에 있어서, 상기 CFCs용 메틸셀룰로오스 배지는 CFU-GEMM 메틸셀룰로스(methylcellulose)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the methylcellulose medium for CFCs may be CFU-GEMM methylcellulose.

본 발명에 있어서, 상기 형성된 집락형성세포(CFCs)를 CFCs용 염색시료로 염색하여 콜로니의 유형을 CFU-GEMM(colony-forming unit-granulocyte erythroid macrophage,megakaryocyte), CFU-GM(colony forming unit-granulocyte, macrophage), BFUE(burst-forming unit-erythroid colonies) 및 MCPs(mast cell progenitors)로 구분하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the formed colony forming cells (CFCs) are stained with a staining sample for CFCs, and the type of colonies are classified into CFU-GEMM (colony-forming unit-granulocyte erythroid macrophage, megakaryocyte), colony forming unit-granulocyte , macrophage), burst-forming unit-erythroid colonies (BFUE), and mast cell progenitors (MCPs).

본 발명에 있어서, 상기 CFCs용 염색시료는 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 또는 Wright-Giemsa인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the dye sample for CFCs may be Toluidine blue or Wright-Giemsa.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) HAR-NDS 유래 조혈줄기세포 중에서 조혈아세포(hemangioblast)를 기원으로 하는 세포를 혈청 및 사이토카인을 함유하는 배지에서 조혈지지세포와 공동 배양하여 코블스톤-에리어 포밍 세포(CAFCs,cobblestone-area forming cells)를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 (a)에서 형성된 CAFCs를 CFCs용 메틸셀룰로오스 배지에서 계대배양하여 성숙한 혈액세포(hematopoietic cell)를 형성시키는 단계를 포함하는 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포의 분화방법에 관한 것이다.(A) HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells are co-cultured with hematopoietic support cells in a medium containing serum and cytokine to produce a Cobblestone- Forming cobblestone-area forming cells (CAFCs); And (b) subculturing the CAFCs formed in (a) in a methylcellulose medium for CFCs to form mature blood cells (hematopoietic cells).

본 발명에 있어서, 상기 조혈지지세포는 OP9 또는 OP9-DL1인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the hematopoietic support cell may be characterized as OP9 or OP9-DL1.

본 발명에 있어서, 상기 사이토카인은 에리트로포이에틴(erythropoietin), SCF(stem cell factor), GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor), IL-3/-7, FL(flt3/flt2 ligand), LIF(Leukemia inhibitory factor) 및 TPO(thrombopoietin)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the cytokine may be erythropoietin, stem cell factor (SCF), granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), IL-3/7, FL (flt3 / flt2 ligand) LIF (Leukemia inhibitory factor) and TPO (thrombopoietin).

본 발명에 있어서, 상기 집락형성세포(CFCs)용 배지는 CFU-GEMM 메틸셀룰로스(methylcellulose)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the medium for the colony forming cells (CFCs) may be CFU-GEMM methylcellulose.

본 발명에 있어서, 상기 성숙한 혈액세포를 CFCs용 염색시료로 염색하여 콜로니를 형성하는 세포의 크기와 분화형태를 구분하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the method may further include the step of staining the mature blood cells with a staining sample for CFCs to distinguish the size and differentiation pattern of the cells forming the colonies.

본 발명에 있어서, 상기 CFCs용 염색시료는 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 또는 Wright-Giemsa인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the dye sample for CFCs may be Toluidine blue or Wright-Giemsa.

본 발명은 또 다른 관점에서, HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 유효성분으로 함유하는 골수 또는 비장 유래 조혈기능을 대체할 필요가 있는 질환의 치료제에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 질환은 골수의 질병에 의한 조혈기능의 마비, 허혈성 질환 및 장기이식시 발생하는 골수 파괴로 인한 질병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In another aspect, the present invention relates to a therapeutic agent for a disease in which HARS-NDS-derived hematopoietic stem cells are used as an active ingredient and bone marrow or spleen-derived hematopoietic functions need to be replaced. In the present invention, the disease may be selected from the group consisting of paresis of hematopoietic function due to disease of bone marrow, ischemic disease, and diseases caused by bone marrow destruction caused by organ transplantation.

본 발명은 또 다른 관점에서, HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 유효성분으로 함유하는 마스트세포(mast cell) 및 호산구(eosinophil)에 의하여 매개되는 질환의 치료제에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 질환은 국소 또는 전신성 알레르기(allergy), 천식(Asthma), 암 및 기생충 감염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In another aspect, the present invention relates to a therapeutic agent for diseases mediated by mast cells and eosinophils containing HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells as an active ingredient. In the present invention, the disease may be selected from the group consisting of local or systemic allergies, asthma, cancer and parasitic infections.

본 발명은 또 다른 관점에서, HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 유효성분으로 함유하는 골수 유래 면역기능의 저하 또는 항진에 의한 질환의 치료제에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 질환은 자가면역, 암, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
The present invention relates, in another aspect, to a therapeutic agent for a disease caused by a decrease in immune function or enhancement of bone marrow derived from HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells as an effective ingredient. In the present invention, the disease may be selected from the group consisting of autoimmune, cancer, viral infection, and bacterial infection.

본 발명은 일 양태에서, HAR-NDS 조직 및 HAR-NDS에 존재하는 조혈세포의 특성을 분석하기 위해서 생쥐 장기의 표면, 정맥 및 림프관 내부에 존재하는 HAR-NDS를 분리하여 혈액세포의 생산의 원천인 골수, 말초혈액 및 탯줄혈액(제대혈)과는 이질적인 HAR-NDS라는 체계에서 다양한 혈액세포 및 면역세포들이 분포하는 것으로 확인되었으나(도 1) 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment, in order to analyze the characteristics of hematopoietic cells present in HAR-NDS tissues and HAR-NDS, HAR-NDS present in the surface, vein, and lymphatic vessels of the mouse organs is isolated, It has been found that various blood cells and immune cells are distributed in a system called HAR-NDS which is heterogeneous from bone marrow, peripheral blood and umbilical cord blood (cord blood) (Fig. 1).

본 발명의 다른 양태에서, HAR-NDS 유래 콜로니(세포집락)의 특성을 분석한 결과 HAR-NDS에 조혈모세포(Hematopoietic progenitor cells, HPC)가 존재한다는 것과 HAR-NDS 유래의 세포들은 생체 외 조건에서 배양하게 되면 다양한 유형의 조혈 콜로니를 이룰 수 있음을 확인하였고, HAR-NDS에서 조혈아세포-유사 세포가 존재한다는 것은 조혈이 일어난다는 것을 의미하였으나(도 2) 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the analysis of the characteristics of HAR-NDS-derived colonies showed that HAR-NDS had hematopoietic progenitor cells (HPC) and HAR-NDS- Cultured to obtain various types of hematopoietic colonies. The presence of hematopoietic cells in HAR-NDS indicated that hematopoiesis occurred (FIG. 2), but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 양태에서, HAR-NDS에서 수득한 조혈줄기세포의 특성을 규명하기 위해서 HAR-NDS 유래의 세포에 적절한 사이토카인을 첨가하고 조혈지지세포 상에서 배양하게 되면 만능 줄기세포(Pluripotent stem cell, PSC)를 조혈아세포(hemangioblast)에 기원하여 조혈줄기세포로부터 혈액 세포로 분화할 수 있었으나(도 3) 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, in order to characterize the hematopoietic stem cells obtained in HAR-NDS, when appropriate cytokine is added to cells derived from HAR-NDS and cultured on hematopoietic support cells, pluripotent stem cells , PSC) could be derived from hematopoietic stem cells into hematopoietic cells based on hemangioblast (FIG. 3), but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 양태에서, HAR-NDS 유래 조혈모세포를 유도하여 구성된 콜로니의 특징을 살펴본 결과, HAR-NDS 유래 만능 줄기세포(Pluripotent stem cell, PSC)에 기원하여 조혈아세포-유사 세포로 분화한 후 조혈모세포(Hematopoietic progenitor cells, HSC)로 추가 분화가 가능하여 다양한 혈액세포를 생산할 수 있었으나(도 4 및 표 1) 이에 한정되는 것은 아니다.
In another embodiment of the present invention, the characteristics of the colonies constructed by inducing HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells are as follows: HAR-NDS-derived pluripotent stem cells (PSC) Hematopoietic progenitor cells (HSC), and thus it was possible to produce various blood cells (Fig. 4 and Table 1). However, the present invention is not limited thereto.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for illustrating the present invention and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.

[실시예 1] HAR-NDS 조직(tissue) 및 HAR-NDS 유래 혈액세포 특성[Example 1] HAR-NDS tissue and HAR-NDS-derived blood cell characteristics

1-1: 1-1: HARHAR -- NDSNDS 의 수득 과정Process of obtaining

야생형 IFN-γ-/- 또는 IFN-γ+/- C57BL/6의 형질을 가지는 생쥐(Orient, Korea)에게 Zoletil(2.5mg/kg) 및 Rompun(0.5mg/kg)을 근육 주사하여 마취하였다. 다음으로, HAR-NDS는 입체현미경(stereomicroscope, Zeiss Stereo Discovery.V20)를 이용하여 하기의 방법으로 HAR-NDS를 수득하였다.Zoletil (2.5 mg / kg) and Rompun (0.5 mg / kg) were intramuscularly anesthetized with wild-type IFN-? - or IFN-? +/- C57BL / 6 mice (Orient, Korea). Next, HAR-NDS was obtained by the following method using a stereomicroscope (Zeiss Stereo Discovery.V20).

1) 소장(또는 간) 표면에 존재하는 HAR-NDS를 수득하기 위해서는 복부의 백색선(linea alba)을 따라 절개하여 복부벽을 조심스럽게 들어올려 개복하는 가운데 전벽(anterior wall)과 소장(또는 간) 사이 및 장기 표면의 HAR-NDS를 수득하였고,1) In order to obtain HAR-NDS present on the small intestine (or liver) surface, the incision is made along the linea alba of the abdomen, carefully lifting the abdominal wall and lapping. In the anterior wall and small intestine ) And HAR-NDS on the organ surface,

2) 정맥 HAR-NDS를 수득하기 위해서는, 약 0.5ml의 1% 알시안 블루(alcian blue)를 장골정맥(iliac veins)에 주사하고, 상단 및 하단의 허리정맥(lumbar vein)을 집게로 채운 다음 혈관을 절개하여 혈액을 배출한 후 정맥내에서 청색선을 이루는 HAR-NDS를 수득하였으며,2) In order to obtain intravenous HAR-NDS, approximately 0.5 ml of 1% alcian blue is injected into the iliac veins and the upper and lower lumbar veins are filled with forceps After dissecting the blood vessels and discharging the blood, HAR-NDS, which forms a blue line in the vein, was obtained.

3) 림프관 내부(Intra-lymphatic) HAR-NDS를 수득하기 위해서는 0.5ml의 1%알시안 블루를 측면 꼬리 저변에 피하주사(Subcutaneous Injection, SC)하여 직장의 1cm 뒤끝과 꼬리 정맥 중간에 주입한 후 HAR-NDS를 수득하였다.3) Intra-lymphatic In order to obtain HAR-NDS, 0.5 ml of 1% Alcian blue was injected subcutaneously in the lateral side of the lateral tail (SC) to the middle of the rectum and the tail vein HAR-NDS was obtained.

그 결과, 도 1A에서 보는 바와 같이, C57BL/6 생쥐(5∼6주령)를 마취하고 정맥과 림프관 내부에 존재하는 HAR-NDS를 1% 알시안 블루로 염색하면 HAR-NDS의 절(★)을 중심으로 대장(LI), 소장(SI) 및 복부벽(AW)으로 연결된 3개의 도관이 있는 것을 확인할 수 있었다(a). HAR-NDS(

Figure 112014041040716-pat00001
)는 요정맥(
Figure 112014041040716-pat00002
) 내부(b; 정맥의 경계는 파선으로 표시) 및 림프관 중앙에서 관찰되었다(c,
Figure 112014041040716-pat00003
). 도 1A의 확대된 사진은 림프관(LV)의 경계를 파선으로 나타낸 것이며(d), 절(★)로부터 유래한 몇 갈래의 가지도 확인되었다(b).As a result, as shown in FIG. 1A, HAR-NDS stained with C57BL / 6 mice (5-6 weeks old) and HAR-NDS present in veins and lymphatic vessels were stained with 1% (LI), small intestine (SI), and abdominal wall (AW). HAR-NDS (
Figure 112014041040716-pat00001
) Were in the vein
Figure 112014041040716-pat00002
) B (vein border is marked by a dashed line) and in the center of the lymphatic canal (c,
Figure 112014041040716-pat00003
). The enlarged photograph of FIG. 1A shows the boundary of the lymphatic vessel (LV) with a dashed line (d), and a few branches from the section (*) were also identified (b).

1-2: 1-2: HARHAR -- NDSNDS 의 전자현미경 관찰Electron microscope observation of

수득한 장기 표면 유래 HAR-NDS는 2시간 동안 4℃에서 카노브스키(Karnovsky) 고정액(2% 파라포름알데히드, 2% 글루타르알데히드, 0.05M 나트륨 카코딜레이트 완충용액(sodium cacodylate buffer, pH 7.2))으로 고정하였다. 투과형 전자현미경(Transmission EM)을 이용하는 경우, HAR-NDS를 2시간 동안 4℃에서 1% 사산화오스뮴(EMS, Washington)으로 최종 고정하였고, 에탄올로 탈수하고 SURR 레진(ERL, DER, NSA 및 DMAE 혼합물) (EMS, Washington)에 심어 70℃에서 하룻밤 중합하였다. 울트라마이크로톰(RMC MTX, USA)의 다이아몬드 칼(Diatome, Switzerland)을 이용하여 초박막(0.5∼1.0μm) 절편을 자른 후 우라닐 아세테이트(EMS, Washington)로 20분간 염색한 후 10분간 레드 시트르산(lead citrate)을 처리하였다. 절편은 80-kV의 가속 전압으로 운영되는 투과형 전자현미경(Transmission EM: TEM; JEM1010; JEOL, JAPAN)을 이용하여 분석하였다.The HAR-NDS derived from the long-term surface was suspended in Karnovsky fixative (2% paraformaldehyde, 2% glutaraldehyde, 0.05M sodium cacodylate buffer, pH 7.2 )). HAR-NDS was finally fixed with 1% osmium oxide (EMS, Washington) at 4 ° C for 2 hours, dehydrated with ethanol, and SURR resin (ERL, DER, NSA and DMAE Mixture (EMS, Washington) overnight at 70 < 0 > C. Ultrathin (0.5-1.0 μm) sections were cut using a diamond knife (Diatome, Switzerland) of Ultramicrotome (RMC MTX, USA), stained with Uranyl acetate (EMS, Washington) for 20 minutes, citrate. The sections were analyzed using a transmission electron microscope (TEM (JEM1010; JEOL, JAPAN) operating at an accelerating voltage of 80-kV.

스캐닝 전자현미경(Scanning EM: SEM)을 이용하는 경우 HAR-NDS는 카노브스키 고정액으로 고정 후 0.05M 나트륨 카코딜레이트 완충용액(pH 7.2, 4℃)으로 10분간 3회 세척하였다. 다음으로, HAR-NDS는 1% 사산화오스뮴을 이용하여 0.05M 나트륨 카코디레이트 완충용액(pH 7.2)에서 최종 고정한 후 실온에서 증류수로 2회 세척하였다. HAR-NDS의 탈수과정은 에탄올을 이용하여 실온에서 각각 10분간 수행하였다. HAR-NDS는 100% 아세트산이소아밀을 사용하여 2회 10분간 실온에서 굳히고 액체 이산화탄소에 의해 중요한 시점(critical point)에서 건조시켰다. 상기 건조된 HAR-NDS를 금속 스탑(stubs)에 마운트(장착)하고 스파터 코우터(Sputter Coater)를 이용하여 금으로 도금한 후 필드-이미션 스캐닝 전자현미경(Field-Emission SEM; Carl Zeiss SUPRA 55VP, Germany)을 이용하여 HAR-NDS를 관찰하였다.When scanning electron microscopy (SEM) was used, HAR-NDS was fixed with Kanovsky fixative and washed three times for 10 minutes with 0.05M sodium chocodilate buffer solution (pH 7.2, 4 ° C). Next, HAR-NDS was finally fixed in 0.05M sodium cocodate buffer (pH 7.2) using 1% osmium tetroxide and then washed twice with distilled water at room temperature. The dehydration process of HAR-NDS was performed for 10 minutes at room temperature using ethanol. HAR-NDS was 100% acetic acid hardened at room temperature for 10 minutes twice using a poultry mill and dried at critical point by liquid carbon dioxide. The dried HAR-NDS was mounted on metal stubs, plated with gold using a sputter coater, and then subjected to field-emission scanning electron microscopy (SEM) 55VP, Germany) was used to observe HAR-NDS.

그 결과, 도 1(B)에서 보는 바와 같이, HAR-NDS의 절의 표면(a), 절의 내부(b) 및 도관(c 및 d)을 스캐닝 전자현미경(SEM)으로 관찰할 수 있었으며, 각 서브-도관(sub-duct)(경계선: 파선(c))의 소도관(ductules)(1, 2 및 3)으로 구성된 것을 관찰할 수 있었다. 도 1(C)의 투과용 전자현미경(TEM) 하에서 관찰된 HAR-절을 관찰한 결과, 절은 3개의 도관(a, 화살표) 및 많은 종류의 세포를 함유하고 있었다. 또한, 이들 세포에는 마스트세포, 다핵성 세포, 단핵구, 호산구(에오시노필), 그리고 작은 크기의 미성숙의 다양한 세포들이 관찰되었다(b-g).As a result, as shown in Fig. 1 (B), the surface (a) of the section of the HAR-NDS, the inside (b) of the section and the conduits (c and d) could be observed with a scanning electron microscope (SEM) - ductules (1, 2 and 3) of the sub-duct (borderline: dashed line (c)). As a result of observing the HAR-section observed under a transmission electron microscope (TEM) of Fig. 1 (C), the section contained three conduits (a, arrows) and many kinds of cells. In addition, mast cells, polynuclear cells, mononuclear cells, eosinophils (eosinophil), and small sized immature cells were observed in these cells (bg).

1-3: 히알루론산(1-3: hyaluronic acid ( HyaluronicHyaluronic acidacid ) 정량 분석) Quantitative analysis

생쥐의 장기 표면에 존재하는 HAR-NDS를 수득 및 정량하고, 인산완충용액(Phosphate buffered saline: PBS)에 담궈 질소액체로 급속동결하였다. 동결된 HAR-NDS는 분쇄기로 균질화하고 원심분리(20분, 4℃, 2,000 x g)한 후 상층액을 수득하였다. 상층액에 존재하는 히알루론산의 함량은 생쥐 히알루론산 ELISA 키트(SunRed, Shanghai Sunred Biological Technology)를 사용하여 제조사(SunRed)의 실험방법으로 측정하였다. 또한, 혈청, 소변, 복막액체 및 림프관의 히알루론산에 대해서도 비교 정량측정하였다.HAR-NDS present on the long-term surface of the mice was obtained and quantified, and was rapidly frozen in a nitrogen liquid by dipping in phosphate buffered saline (PBS). The frozen HAR-NDS was homogenized with a pulverizer and centrifuged (20 min, 4 캜, 2,000 x g) to obtain a supernatant. The content of hyaluronic acid present in the supernatant was measured by a manufacturer's (SunRed) method using a mouse hyaluronic acid ELISA kit (SunRed, Shanghai Sunred Biological Technology). In addition, serum, urine, peritoneal fluid, and hyaluronic acid of lymphatic vessels were also compared and quantitatively measured.

그 결과, 도 1(D)에서 보는 바와 같이, 혈청, 소변, 복강액(PF), 림프관(LV)과 비교시, HAR-NDS에서 가장 높은 농도의 히알루론산(HA)이 검출되었다.As a result, the highest concentration of hyaluronic acid (HA) in HAR-NDS was detected in comparison with serum, urine, peritoneal fluid (PF) and lymphatic vessel (LV), as shown in Fig. 1 (D).

1-4: 통계적 분석1-4: Statistical analysis

모든 데이터는 통계 프로그램인 프리즘 5.0 그래프패드(San Diego, CA)를 이용하여 분석하였고, 스튜던드 t-검정을 사용하여 그룹간의 통계적 유의성을 확인하였다(**P < 0.01, *P < 0.05). 통계적 분석은 도 1∼13의 결과에 대해서도 같게 적용하였다.All data were analyzed using a statistical program, Prism 5.0 graph pads (San Diego, Calif.), And statistical significance was determined between groups using the Student's t-test (** P <0.01, * P <0.05). Statistical analysis was also applied to the results of Figs.

상기 결과에 의하면, HAR-NDS는 생쥐의 장기 표면상에서 거미줄 형상으로 절과 도관을 형성하는 것으로 확인되었다(도 1A-a). HAR-NDS의 용이한 수득을 위해서는 알시안 블루 염색이 필요하였으며, 정맥 내부(도 1A-b) 및 림프관(lymphatics)(도 1A-c, -d)을 염색한 결과, HAR-도관이 절로부터 가지를 치는 것을 관찰할 수 있었다(도 1A-a, -b의 별표(*)).According to the above results, it was confirmed that HAR-NDS forms a cave-like duct in a spider web on the long-term surface of a mouse (Fig. 1A-a). In order to obtain HAR-NDS easily, Alcian blue staining was necessary. As a result of staining intravenous (Fig. 1A-b) and lymphatic (Figs. 1A-c and -d) (FIG. 1A-a, -b in FIG. 1A).

전자현미경을 이용한 HAR-NDS의 SEM 결과를 보게 되면, 장기표면의 HAR-절은 타원형 주머니 모양을 하고 양쪽 끝으로 장형의 도관을 가진 것으로 확인되었다(도 1B-a). 덧붙여, HAR-절 내부는 세포들로 차 있었으며(도 1B-b), HAR-도관은 3개의 소도관(subducts, ductules)으로 이루어져 있는 것을 확인할 수 있었다(도 1B-c, -d).SEM results of the HAR-NDS using electron microscope revealed that the HAR-section of the organ surface had an elliptical bag shape and had a long conduit at both ends (Fig. 1B-a). In addition, it was confirmed that the HAR-conduit was composed of three subducts (Fig. 1B-c).

또한, TEM 결과에 의하면 HAR-절의 3개의 누관(sinuses, 화살)은 3개 도관의 경로 역할을 하고 있고, 세포로 차 있었으며(도 1C-a), 그 중 몇몇은 마스트세포(도 1C-b), 다형핵백혈구(polymorphonuclear leukocytes)(도 1C-c), 단핵구(monocytes)(도 1C-d), 호산구(도 1C-e) 및 큰 핵과 상대적으로 적은 비율의 세포질을 갖는 작은 크기의 미성숙 세포들(도 1C-f, -g)로 확인되었다.In addition, according to the TEM results, the three fissures (sinuses, arrows) of the HAR- section act as a pathway for three ducts and were involved in cells (Fig. 1C-a), some of them mast cells ), Polymorphonuclear leukocytes (Figure 1C-c), monocytes (Figure 1C-d), eosinophils (Figure 1C-e), and large nuclei and a relatively small proportion of cytoplasm (Fig. 1C-f, -g).

아울러, HAR-NDS, 림프관(LV), 혈청, 소변 및 복강액(PF) 중에서 HAR-NDS가 가장 높은 농도의 히알루론산을 가지는 것으로 확인되었다(도 1D).In addition, HAR-NDS was found to have the highest concentration of hyaluronic acid among HAR-NDS, lymphatic (LV), serum, urine and peritoneal fluid (PF) (FIG. 1D).

결국, 조혈세포의 생산의 원천인 골수, 말초혈액 및 탯줄혈액(제대혈)과는 이질적인 HAR-NDS라는 높은 농도의 히알루론산을 가지는 조직(tissue)은 다양한 혈액세포 및 면역세포들을 함유하는 것으로 확인되었다.
As a result, tissue having a high concentration of hyaluronic acid called HAR-NDS, which is heterogeneous from bone marrow, peripheral blood and umbilical cord blood (cord blood), which are sources of hematopoietic cells, has been confirmed to contain various blood cells and immune cells .

[실시예 2] HAR-NDS 유래 조혈 콜로니(세포집락)의 특성[Example 2] Characterization of HAR-NDS-derived hematopoietic colonies (cell colonies)

클로노제닉Clonogenic 분석( analysis( ClonogenicClonogenic assayassay ))

2-1: 골수 단핵구들(Bone marrow mononuclear cells, BM-MNCs)은 생쥐의 경골과 대퇴골의 골수강을 25 G 바늘주사를 사용하여 PBS(pH 7.4)로 세척하여 수득하였다. HAR-NDS의 단일 세포 현탁액은 상기 수득한 HAR-NDS를 셀 스트레이너를 이용하여 세포를 해리하고 수득하였다. HAR-NDS는 0.1mM 헤민 및 30% FBS(Hyclone)가 함유된 1% 메틸셀룰로스 배양배지에 1 x 105 cells/mL 농도로 분주하였고, BM-MNC는 0.25 x 105 cells/mL의 농도로 분주하였다. 이 과정에서 사용된 사이토카인은, 1U/mL의 재조합 인간 에리트로포이에틴(STEMCELL Technologies), 50 ng/mL 쥣과 rSCF(R&D Systems), 10 ng/mL 쥣과 rGM-CSF(STEMCELL Technologies) 및 10 ng/mL 쥣과 rIL-3(STEMCELL Technologies)을 사용하거나, GM-CSF와 IL-3을 대신해서 생쥐의 비장 세포로 생산된 5%(v/v) 포크위드 미토겐(pokeweed mitogen)의 조건 배지(conditioned medium)를 이용하였다. HAR-NDS와 BM으로부터 유래한 콜로니는 7일과 14일 사이에 도립현미경(Inverted microscope, Olympus CKX31)을 사용하여 스코어(score) 되었다.2-1: Bone marrow mononuclear cells (BM-MNCs) were obtained by washing the tibia and femur bone marrow of mice with PBS (pH 7.4) using a 25 G needle injection. A single cell suspension of HAR-NDS was obtained by dissociating the cells using the cell strainer obtained from HAR-NDS. HAR-NDS was distributed at a concentration of 1 × 10 5 cells / mL in a 1% methylcellulose culture medium containing 0.1 mM of hemin and 30% FBS (Hyclone), and BM-MNC was cultured at a concentration of 0.25 × 10 5 cells / mL Respectively. The cytokines used in this procedure were 1 U / mL recombinant human erythropoietin (STEMCELL Technologies), 50 ng / mL 쥣 and rSCF (R & D Systems), 10 ng / mL 쥣 and rGM-CSF (STEMCELL Technologies) (v / v) porkweed mitogen produced in mice as spleen cells using ng / mL 쥣 and rIL-3 (STEMCELL Technologies) or in place of GM-CSF and IL-3 A conditioned medium was used. Colonies from HAR-NDS and BM were scored between 7 and 14 days using an inverted microscope (Olympus CKX31).

그 결과, 도 2A에서 나타난 바와 같이, 정맥 내부(intravein), 림프관 내부(intralymphatics) 및 장기의 표면에 존재하는 HAR-NDS로부터 유래한 조혈모세포 콜로니를 검출할 수 있었고, 체외에서 (a) CFU-GEMM, (b) CFU-GM, (c) BFU-E 및 (d) MCPs인 4가지 유형의 콜로니를 형성할 수 있었다.As a result, it was possible to detect hematopoietic stem cell colonies derived from HAR-NDS present in the intravein, intralymphatics and organ surfaces as shown in FIG. 2A, and (a) CFU- GEMM, (b) CFU-GM, (c) BFU-E and (d) MCPs.

2-2: 메틸셀룰로스에서의 콜로노제닉 분석을 이용하여 HAR-NDS 및 BM(Bone marrow, 골수)에 존재하는 조혈모세포를 형성하였다. 세포 형태를 확인하기 위해서 단일 콜로니를 PBS에 현탁하여 10% 중성 완충화된 포말린(NBF(Neutral buffered formalin), pH 7.4)으로 고정하였다. 그 다음, 상기 콜로니의 세포들을 원심분리하고 다시 PBS에 현탁하여 슬라이드에 마운트하였다. 상기 수득한 세포들은 Wright-Giemsa 또는 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색 후 광학현미경(Leica DMD108) 하에서 관찰하였다.2-2: Colonoscopic analysis on methylcellulose was used to form hematopoietic stem cells present in HAR-NDS and BM (bone marrow, bone marrow). To confirm cell morphology, single colonies were suspended in PBS and fixed with 10% neutral buffered formalin (NBF, pH 7.4). The cells of the colonies were then centrifuged and suspended in PBS to mount on a slide. The cells were stained with Wright-Giemsa or toluidine blue, and then observed under an optical microscope (Leica DMD108).

상기 HAR-NDS 유래 세포들을 Wright-Giemsa로 염색한 결과(도 2B), CFU-GEMM 콜로니는 호염기성구, 거핵구, 호산구 및 적혈구; CFU-GM 콜로니는 호중구 및 대식세포; BFU-E 콜로니는 적혈구/적아구(erythrocyte/erythroblast); 및 MCPs 콜로니는 마스트세포를 함유하는 것으로 확인되었다.The HAR-NDS-derived cells were stained with Wright-Giemsa (Fig. 2B). The CFU-GEMM colonies were stained with basophils, megakaryocytes, eosinophils and red blood cells; CFU-GM colonies include neutrophils and macrophages; BFU-E colonies are known as erythrocyte / erythroblast; And MCPs colonies were found to contain mast cells.

2-3: HAR-NDS로부터 유래한 마스트모세포들(MCPs)로 구성된 콜로니를 수득하여 10ng/ml 쥣과 rIL-3(STEMCELL Technologies) 및 10 ng/mL 쥣과 rSCF(STEMCELL Technologies)를 첨가한 10% FBS, 2mM L-글루타민(Gibco), 0.1mM NEAA(Gibco), 50uM 2-ME 및 100U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 세포들을 2∼4주간 37℃ 및 5% CO2 하에서 배양하고 유세포분석(flow cytometric analysis)을 수행하였다. FcεRI 발현의 측정은 1μg/mL αDNP IgE(Sigma)로 24시간 동안 37℃에서 자극을 주어 강화된 FcεRI 발현량을 얻을 수 있도록 하였다.2-3: Colonies composed of mast cells (MCPs) derived from HAR-NDS were obtained and treated with 10 ng / ml 쥣 and rIL-3 (STEMCELL Technologies) and 10 ng / mL 쥣 and rSCF (STEMCELL Technologies) Were cultured in RPMI 1640 medium containing 1% FBS, 2 mM L-glutamine (Gibco), 0.1 mM NEAA (Gibco), 50 uM 2-ME and 100 U / ml penicillin / streptomycin. Cells were cultured for 2 to 4 weeks at 37 ° C and 5% CO 2 and flow cytometric analysis was performed. FcεRI expression was stimulated with 1 μg / mL αDNP IgE (Sigma) for 24 hours at 37 ° C to obtain enhanced FcεRI expression.

유세포분석(flow cytometry)에 사용된 항체들은: 1) 피코에리트린(PE) 형광이 접합된 Sca-1(E13-161.7); 2) 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 형광이접합된 c-kit(2B8), IgE(R35-72), Gr-1(RB3-8C5), CD11b(M1/70), CD8(53-6.7) 및 Flk-1(AVAS12); 3) 피코에리트린-Cy5 형광이 접합된 CD45(30-F11), CD4(H129.19), B220(RA3-6B2) 및 CD135(Flt3, A2F10); 4) Alexa Fluor 647 형광이 접합된 CD34(RAM34) 및 CD150(TC15-12F 12.2); 및 5) 바이오틴화된 리니지(lineage) 칵테일을 사용하였다. 바이오틴화된 1차 항체는 스트렙아비딘-FITC 및 스트렙아비딘-PE를 이용하여 유세포분석에 사용되었다. PE-Cy5 형광이 접합된 CD135(Flt3, A2F10)(eBioscience)를 제외한 모든 항체는 BD Pharmingen(San Diego, CA)에서 구입하였다. 유세포분석(Flow cytometry)은 FACSCalibur 또는 LSR II flow cytometer(Becton Dickinson)를 사용하여 수행하였다.The antibodies used in flow cytometry were: 1) Sca-1 (E13-161.7) conjugated with picoerythrin (PE) fluorescence; 2) Fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescence conjugated c-kit (2B8), IgE (R35-72), Gr-1 (RB3-8C5), CD11b (M1 / 70) 6.7) and Flk-1 (AVAS12); 3) CD45 (30-F11), CD4 (H129.19), B220 (RA3-6B2) and CD135 (Flt3, A2F10) conjugated with picoerythrin-Cy5 fluorescence; 4) CD34 (RAM34) and CD150 (TC15-12F 12.2) conjugated with Alexa Fluor 647 fluorescence; And 5) biotinylated lineage cocktails were used. The biotinylated primary antibodies were used for flow cytometry using streptavidin-FITC and streavidin-PE. All antibodies were purchased from BD Pharmingen (San Diego, CA) except for PE-Cy5 fluorescently conjugated CD135 (Flt3, A2F10) (eBioscience). Flow cytometry was performed using a FACSCalibur or LSR II flow cytometer (Becton Dickinson).

그 결과, HAR-NDS를 소장(또는 간) 표면, 정맥 내부 및 림프관 내부에서 수득할 수 있었다. 상기 HAR-NDS의 세포들을 분리하여 조혈모세포(hematopoietic progenitor)의 특성을 분석하는 데 사용하였고, 체외에서 HAR-NDS의 세포들을 배양하여 CFU-GM, BFU-E 및 CFU-GEMM 콜로니(colonies)를 형성할 수 있었다(도 2A-a, -b, -c). 장기 표면에서 유래한 HAR-NDS의 세포들은 상기 3종류의 조혈모세포 콜로니를 형성하였고, 정맥 내부의 HAR-NDS 세포들은 CFU-GEMM 및 BFU-E를, 림프관 내부의 HAR-NDS 세포들은 CFU-GM만을 형성할 수 있었다. 또한, CFU-GM 조건에서 자란 콜로니의 대다수가 마스트모세포(MCPs)들로 구성되어 있었다(도 2A-d).As a result, HAR-NDS could be obtained on the small intestine (or liver) surface, intravenously and intra-lymphatic. The cells of HAR-NDS were isolated and used to analyze the characteristics of hematopoietic progenitor. The cells of HAR-NDS were cultured in vitro to obtain CFU-GM, BFU-E and CFU-GEMM colonies. (Figs. 2A-a, -b, and -c). The HAR-NDS cells from the long-term surface formed the three kinds of hematopoietic stem cell colonies, the HAR-NDS cells inside the veins were CFU-GEMM and BFU-E, the HAR- . In addition, the majority of colonies grown under CFU-GM conditions consisted of mast cells (MCPs) (Fig. 2A-d).

Wright-Giemsa 염색 결과로, 전구체들(precursors)로부터 기원한 각각의 콜로니를 구성하고 있는 다양한 종류의 조혈모세포를 확인할 수 있었다. 즉, CFU-GEMM 콜로니(도 2A-a)의 호염기성구/ 거대핵구/ 호산구(도 2B); CFU-GM 콜로니(도 2A-b)의 대식세포/ 호중구(도 2B); BFU-E 콜로니(도 2A-c)의 적아구/ 적혈구(erythroblasts/ erythrocytes)(도 2B); 및 MCPs 콜로니(도 2A-d)의 마스트세포(도 2B)를 확인할 수 있었다.As a result of Wright-Giemsa staining, we could identify various types of hematopoietic stem cells constituting each colony originating from precursors. That is, the basophilic spheres / macrophages / eosinophils of CFU-GEMM colonies (Fig. 2A-a) (Fig. 2B); Macrophages / neutrophils (Figure 2B) of CFU-GM colonies (Figures 2A-b); Erythroblasts / erythrocytes (Figure 2B) of BFU-E colonies (Figures 2A-c); And mast cells of MCPs colonies (Fig. 2A-d) (Fig. 2B).

HAR-NDS 유래 CFU-GEMM, CFU-GM 및 BFU-E 콜로니의 출현빈도는 BM보다 낮게 나타났고(표 1), 비장에 있는 CFU-GM 및 BFU-E 콜로니의 출현빈도는 HAR-NDS보다 높았으나, CFU-GEMM 콜로니는 비장과 HAR-NDS에서 유사하게 나타났다(표 1).The frequencies of CFU-GEMM, CFU-GM and BFU-E colonies from HAR-NDS were lower than those of BM (Table 1), and the frequencies of CFU-GM and BFU-E colonies in the spleen were higher than HAR-NDS However, CFU-GEMM colonies were similar in spleen and HAR-NDS (Table 1).

한편, 단위 세포 수준(a per-cell basis)에서 보면, HAR-NDS에서 유래한 MCPs의 개수는 약 5배 이상 BM보다 높았고 100배 이상 비장의 것보다 높게 나타났다(표 1 및 도 2C).On the other hand, on a per-cell basis, the number of MCPs derived from HAR-NDS was about 5 times higher than that of BM and higher than that of spleen 100 times or more (Table 1 and FIG. 2C).

골수, 비장 및 HAR-NDS의 조혈모세포의 출현 빈도 비교Comparison of the incidence of hematopoietic stem cells in bone marrow, spleen and HAR-NDS
조직
group

콜로니 빈도
Colony frequency
CFU-GEMM
CFU-GEMM
CFU-GM
CFU-GM

BFU-E
BFU-E
MCP
MCP
골수
(25,000 세포들)
marrow
(25,000 cells)

17.7 ± 6.8
17.7 ± 6.8
106.7 ± 6.7
106.7 ± 6.7
12.7 ± 2.3
12.7 ± 2.3
5.3 ± 0.6
5.3 ± 0.6
비장
(100,000 세포들)
spleen
(100,000 cells)

5.0 ± 1.4
5.0 ± 1.4
35.5 ± 4.9
35.5 ± 4.9
8.0 ± 1.4
8.0 ± 1.4
1.0 ± 1.4
1.0 ± 1.4
HAR-NDS
(100,000 세포들)
HAR-NDS
(100,000 cells)

3.67 ± 1.5
3.67 ± 1.5
2.5 ± 0.5
2.5 ± 0.5
1.67 ± 0.6
1.67 ± 0.6
111 ± 13.8
111 ± 13.8

MCPs 콜로니가 마스트세포로 발달가능한지 확인하기 위해서 MCPs에서 세포를 분리하여 IL-3 및 rSCF(recombinant stem cell factor)가 함유된 배지에서 14일간 배양하였다. 그 결과, MCPs에서 유래한 세포는 lin-Sca-1+c-kit+FcεRI+ 면역학적 특성(표현형)을 보여 마스트세포임을 확인할 수 있었다(도 2D; 양쪽 패널).To determine whether MCPs colonies could develop into mast cells, cells were isolated from MCPs and cultured in medium containing IL-3 and rSCF (recombinant stem cell factor) for 14 days. As a result, MCPs-derived cells showed lin - Sca-1 + c-kit + FcεRI + immunological characteristics (phenotype), indicating that they were mast cells (FIG. 2D; both panels).

미성숙 세포를 분석하기 위해서 장기의 표면(도 1A-a)에서 HAR-NDS를 수득한 후 유세포분석을 수행하였다. 표현형 분석에 의하면 HAR-NDS 세포들의 약 2%가lineage-, sca-1+, c-kit+ 및 CD34-의 면역학적 특성을 가져서 HAR-NDS 세포들 중 소수의 조혈줄기세포(HSC)를 가지는 것으로 확인되었다. 다음으로, HAR-NDS가 조혈모세포를 지속해서 생성 가능한 성체 만능줄기세포(PSC)를 가지는지 확인하였다. 즉, 미성숙 혈액 세포의 전구체인 조혈아세포(hemangioblast)를 HAR-NDS 세포들로부터 유도할 수 있는지를 확인하기 위해서 HAR-NDS에서 유래한 세포 구성물 전체를 OP9 세포와 공동배양하였다.To analyze immature cells, flow cytometry was performed after obtaining HAR-NDS on the surface of the organ (Fig. 1A-a). According to the phenotypic analysis HAR-NDS about 2% of the cells are lineage -, sca-1 +, c-kit + and CD34 - immuno gajyeoseo the characteristics having the HAR-NDS cells in a small number of hematopoietic stem cells (HSC) of the Respectively. Next, we confirmed that HAR-NDS has adult pluripotent stem cells (PSC) capable of continuously producing hematopoietic stem cells. Namely, to determine whether hemangioblast, which is a precursor of immature blood cells, can be derived from HAR-NDS cells, whole cell constructs derived from HAR-NDS were co-cultured with OP9 cells.

그 결과, CD45-이나 Flk-1을 발현하는 조혈아세포(모든 종류의 혈액 세포와 내피세포로 분화가 가능)를 검출할 수 있었다.As a result, hematopoietic cells expressing CD45 - or Flk - 1 (capable of differentiating into all kinds of blood cells and endothelial cells) were detected.

상기 결과들을 종합하면, HAR-NDS 유래의 세포들은 체외 조건에서 배양하게 되면 다양한 유형의 조혈 콜로니(세포집락)를 형성할 수 있었다. 특히, HAR-NDS 세포들로부터 조혈아세포-유사 세포들이 유도될 수 있다는 것은 HAR-NDS에서 조혈이 일어난다는 것을 의미하였다.
In conclusion, HAR-NDS-derived cells were able to form various types of hematopoietic colonies (cell colonies) when cultured under in vitro conditions. In particular, the ability to induce hematopoietic-like cells from HAR-NDS cells implies that hematopoiesis occurs in HAR-NDS.

[실시예 3] HAR-NDS 유래 만능 줄기세포(Pluripotent stem cell, PSC)의 특성[Example 3] Characterization of HAR-NDS-derived pluripotent stem cell (PSC)

소장(또는 간)의 표면으로부터 수득한 HAR-NDS 세포들 중 1 x 105 세포들을 OP9 세포 상에 분주한 다음 6일간 20% FBS, 항생제, 사이토카인 재조합 생쥐 SCF(50 ng/ml, PeproTech), 재조합 생쥐 Flt3L(5 ng/ml, ProSpec) 및 재조합 생쥐 IL-7(5 ng/ml, ProSpec)이 첨가된 α-MEM에서 공동배양(37℃, 5% CO2)하였다. OP9 세포는 B-계통 및 마일로이드 계통 세포를 유도하는데 사용하였고, OP9-DL1 세포는 T-계통 세포를 유도하는데 사용하였다.1 x 10 &lt; 5 &gt; cells of HAR-NDS cells obtained from the surface of the small intestine (or liver) were divided on OP9 cells and cultured for 20 days with 20% FBS, antibiotics, cytokine recombinant mouse SCF (50 ng / ml, PeproTech) (37 ° C, 5% CO 2 ) in α-MEM supplemented with recombinant mouse Flt3L (5 ng / ml, ProSpec) and recombinant mouse IL-7 (5 ng / ml, ProSpec). OP9 cells were used to induce B-lineage and myloid lineage cells, and OP9-DL1 cells were used to induce T-lineage cells.

코블스톤-에리어 포밍 세포들(Cobblestone-area forming cells, CAFCs)을 OP9 상에서 mSCF의 첨가 또는 미첨가 조건 하에서 배양하여 형성된 조혈아세포-유사 세포들을 CD45(PE-Cy5) 및 Flk-1(FITC) 항체로 염색하여 유세포분석을 수행하였다. 사이토카인으로 유도된 마일로이드 및 B-계통 세포는 각각 Gr-1/CD11b(FITC) 및 CD45(PE-Cy5)와 B220(PE-Cy5) 항체를 사용하였고, T-계통 세포는 CD4(PECy5)와 CD8(FITC) 항체를 사용하여 유세포분석을 수행하였다.Hemocyte-like cells formed by culturing Cobblestone-area forming cells (CAFCs) on OP9 with or without mSCF were incubated with CD45 (PE-Cy5) and Flk-1 (FITC) And analyzed by flow cytometry. T-cell lines were obtained from CD4 (PECy5) cells using Gr-1 / CD11b (FITC) and CD45 (PE-Cy5) And CD8 (FITC) antibodies were used for flow cytometry analysis.

그 결과, HAR-NDS 세포들을 OP9 세포 상에서 6일간 공동배양하면 코블스톤-에리어 포밍 세포들(cobblestone-area forming cells, CAFCs)이 생성된 것을 확인할 수 있었다(도 3A). 모든 CAFCs를 6일째 되는 날 수득하고 유세포분석(flow cytometry)을 수행한 결과, 약 2.3%의 세포들은 CD45-Flk-1+이고 12.4%의 세포는 CD45+Flk-1-(도 3B-a, -b)이었다. 즉, HAR-NDS 세포를 OP9 조혈지지세포와 공동배양하면 조혈아세포(hemangioblast)-유사 세포(CD45-Flk-1+ 세포)를 생성한다는 것을 확인할 수 있었다.As a result, when HAR-NDS cells were co-cultured on OP9 cells for 6 days, it was confirmed that cobblestone-area forming cells (CAFCs) were produced (FIG. 3A). Results obtained day 6th day all CAFCs and performing flow cytometric analysis (flow cytometry), in about 2.3% of the cells are CD45 - Flk-1 + and 12.4% of the cells are CD45 + Flk-1 - (Fig. 3B-a, -b). In other words, it was confirmed that HAR-NDS cells were co-cultured with OP9 hematopoietic support cells to produce hemangioblast-like cells (CD45 - Flk-1 + cells).

HAR-NDS 유래 세포와 OP9(NDS/OP9)의 공동배양에서 형성된 CAFCs의 면역학적 특성(표현형)을 추가로 더 분석하였다. 10일간 NDS/OP9 공동배양하게 되면 대부분 세포들은 CD45+Flk1- 세포가 되었고(도 3C-a), rSCF를 첨가하면 CD45+Flk- 세포 수는 증가하였다. 10일째 되는 날 NDS/OP9 배양을 분석하면 90% 이상의 세포들이 lin-CD45+인 것으로 확인되었으며(도 3C-a, b), 대부분 세포들(~70%)은 Sca-1+c-kit+ 및 CD34-CD135-이었다. CAFCs의 주요 세포군은 원시(primitive) HSC의 면역학적 표지자(표현형)인 lin-Sca-1+c-kit+CD34-CD135-(도 3C-c, -d)를 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 슬램 표지자들(slam markers, 도 3C-e)를 이용하여 추가 분석한 결과, 주요 세포군(~82.5%)은 CD48+CD150-이고 lin-Sca-1+c-kit+CD34-CD135-CD150-CD48+(CD150-CD48+LSK)와 일치하며 소수의 세포군은 CD150-CD48-LSK(14.8%) 및 CD150+CD48-LSK(0.5%)로 구성되어 있었다(도 3D).The immunological characteristics (phenotype) of CAFCs formed in co-culture of HAR-NDS-derived cells and OP9 (NDS / OP9) were further analyzed. After 10 days NDS / OP9 co-culture that most CD45 + cells are Flk1 - When was a cells (Fig. 3C-a), the addition of CD45 + Flk rSCF - cell number was increased. As a result of an analysis of the Day NDS / OP9 culture it is 10 days, more than 90% cell lin - were found to be CD45 + (Fig. 3C-a, b), the Sca-1 + c-kit +, most cells (~ 70%) And CD34 - CD135 - . Major cell population of the native CAFCs (primitive) of immunological markers (phenotype) of the HSC lin - was identified as having a (Fig. 3C-c, -d) - Sca -1 + c-kit + CD34 - CD135. In addition, SLAM markers of (slam markers, Fig. 3C-e), a further analysis using the result, the main cell population (~ 82.5%) of CD48 + CD150 - and lin - Sca-1 + c- kit + CD34 - CD135 - CD150 - CD48 + (CD150 - CD48 + LSK) and a small number of cells were composed of CD150 - CD48 - LSK (14.8%) and CD150 + CD48 - LSK (0.5%).

HAR-NDS 세포들을 1 x 105 세포들로 OP9 상에서 9일간 rSCF 및 IL-3 첨가 하에 공동배양하면 마일로이드(myeloid) 계통 세포가 출현하였다(도 3E-a). HAR-NDS 세포를 OP9 상에서 15일간 rSCF, IL-7 및 Flt3L 첨가 하에 공동배양하면 B220+ B 림프구가 검출된 것으로 확인되었다(도 3E-b). 또한, HAR-NDS 세포를 OP9-DL1 상에서 9일간 rSCF, IL-7 및 Flt3L 첨가 하에 공동배양하면 CD4+, CD4+CD8+ 및 CD8+ T 림프구가 생성되었다(도 3E-c). 이러한 결과에 의하면, HAR-NDS 유래 세포들은 적절한 배양조건에서 다양한 종류의 조혈세포를 생성할 수 있는 잠재력을 갖는 것으로 확인되었다.HAR-NDS cells were co-cultured with 1 x 10 5 cells on OP9 for 9 days with addition of rSCF and IL-3, resulting in myeloid lineage cells (Fig. 3E-a). When HAR-NDS cells were co-cultured on OP9 for 15 days with addition of rSCF, IL-7 and Flt3L, B220 + B lymphocyte was detected (Fig. 3E-b). In addition, co-culture of HAR-NDS cells on OP9-DL1 for 9 days with addition of rSCF, IL-7 and Flt3L produced CD4 + , CD4 + CD8 + and CD8 + T lymphocytes (Fig. 3E-c). These results indicate that HAR-NDS-derived cells have the potential to produce various types of hematopoietic cells under appropriate culture conditions.

결국, HAR-NDS 유래의 세포에 적절한 사이토카인을 첨가하고 조혈지지세포에 배양하게 되면 분화능력을 가지는 만능 줄기세포(PSC)에서 기원한 조혈아세포(hemangioblast)-유사 세포 및 다양한 유형의 성숙 혈액세포로 분화할 수 있었다.
As a result, when appropriate cytokines are added to cells derived from HAR-NDS and cultured in hematopoietic support cells, hemangioblast-like cells originated from pluripotent pluripotent stem cells (PSC) and various types of mature blood cells Respectively.

[실시예 4] HAR-NDS 유래 조혈줄기/모세포(Hematopoietic stem/progenitor cell, HSPC)의 분화 특성[Example 4] Differentiation characteristics of HAR-NDS-derived hematopoietic stem / progenitor cell (HSPC)

HAR-NDS 유래 조혈줄기세포로부터 조혈모세포를 유도하기 위해서 1% 메틸셀룰로스를 기반으로 하는 CFU-GEMMM 배지에 실시예 3의 CAFC를 분주하였고, 매회 10일마다 콜로니를 수득하여 CFU-GEMM 배지에 같은 농도의 1x 105 cells/mL의 세포를 분주하였다. 다양한 혈액세포로의 조혈줄기/모세포(HSPC)의 분화는 Wright-Giemsa 또는 톨루이딘 블루 염색 후에 광학현미경 하에서 관찰하였다.In order to induce hematopoietic stem cells from HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells, the CAFC of Example 3 was divided into CFU-GEMMM medium based on 1% methylcellulose, colonies were obtained every 10 days, and CFU-GEMM medium Cells at a concentration of 1x10 &lt; 5 &gt; cells / mL. Differentiation of hematopoietic stem cells / HSPCs into various blood cells was observed under optical microscope after Wright-Giemsa or toluidine blue staining.

그 결과, CAFCs가 CFU-GEMM 메틸셀룰로스 배지에서 10일간 더 배양하게 되면 균일하고 작은 크기의 세포들(colony forming cells, CFC)이 형성되었고(도 4A), 콜로니에 있는 세포(지름: ~5 μm)는 Lin-Sca-1+c-kit+CD34-CD135- 면역학적 특성을 가지며 조혈줄기/모세포(Hematopoietic stem/progenitor cell, HSPC)의 분화상태를 유지한 것으로 확인되었다(도 4B). 10일마다 다시 분주한 결과 50일 배양기간 동안 세포의 수는 증가하였고(도 4C), 5계대 배양에서 수득한 세포들을 Wright-Giemsa 또는 톨루이딘 블루로 염색한 결과, 적혈구(RBC), 미성숙한 거핵세포(megakaryocytes), 마스트모세포(mast cell progenitors) 및 단핵구(monocytes) (도 4D)의 출현을 확인할 수 있었다.As a result, when CAFCs were further cultured in CFU-GEMM methylcellulose medium for 10 days, uniform and small size colony forming cells (CFC) were formed (FIG. 4A) ) Was confirmed to have Lin - Sca-1 + c-kit + CD34 - CD135 - immunological characteristics and maintained the differentiation state of hematopoietic stem / progenitor cell (HSPC) (Fig. 4B). The number of cells was increased during the 50-day culture period (Fig. 4C). As a result of staining with Wright-Giemsa or toluidine blue cells obtained from the 5th passage culture, red blood cells (RBC) The presence of megakaryocytes, mast cell progenitors, and monocytes (Fig. 4D) could be confirmed.

결국, HAR-NDS 유래 만능 줄기세포(Pluripotent stem cell, PSC)에서 기원한 조혈아세포-유사 세포는 조혈줄기/모세포(Hematopoietic stem/progenitor cells, HSPC)로 추가 분화가 가능하여 다양한 혈액세포를 생산할 수 있었다.
The hematopoietic stem / progenitor cells (HSPC), which originate from HAR-NDS-derived pluripotent stem cells (PSC), can be further differentiated to produce various blood cells there was.

[실시예 5] HAR-NDS-, 골수- 및 혈액(비장)-유래 MCPs의 조절 기전 비교Example 5 Comparison of the Regulatory Mechanisms of HAR-NDS-, Bone Marrow- and Blood (Spleen) -derived MCPs

골수 또는 비장과 비교하여 HAR-NDS의 MCPs는 높은 출현 빈도로 존재하였기 때문에 HAR-NDS에서의 MCPs의 생성이 골수 또는 비장과는 다르게 조절되는지 조사하기 위해서, 골수, 비장 및 HAR-NDS 사이의 MCPs 생성의 차이를 명료하게 보여줄 수 있는 특정 유전자가 결핍된 다양한 종류의 변이 생쥐를 사용하였다. 특히, IFN-γ는 체외(in vitro) 및 체내( in vivo)에서 마스트세포의 발달 및 기능을 조절하는 것으로 알려졌기 때문에 이 유전자가 결핍된 변이 생쥐를 사용하였다.In order to investigate whether the production of MCPs in HAR-NDS is different from that of bone marrow or spleen, the MCPs of HAR-NDS and HAR-NDS were compared with those of bone marrow or spleen. A variety of mutant mice deficient in specific genes were used to clearly show differences in production. In particular, IFN-γ is in vitro (in vitro ) and the body ( in vivo , it was known to control the development and function of mast cells, so mutant mice deficient in this gene were used.

그 결과, IFN-γ-/- 생쥐의 HAR-NDS에서는 MCPs의 생산이 급격하게 감소하는 것을 확인하였고, 이는 IFN-γ가 HAR-NDS MCPs 생성에 밀접하게 연결되어 있다는 것을 의미한다(도 5A). 반면, 비장에서의 MCPs의 생성은 IFN-γ에 의존적이지 않았다(도 5B, 표 2). W-sash 이형접합(heterozygote) 생쥐와 비교할 때 c-kitW - sh /W- sh에서의 HAR-NDS의 MCPs 생성은 현저하게 감소하는 것(도 5C)으로 봐서, 골수 또는 비장의 마스트세포와 마찬가지로, c-kit locus는 HAR-NDS 마스트세포의 발달에 중요하다는 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the production of MCPs was abruptly decreased in HAR-NDS of IFN-γ - / - mice, which implies that IFN-γ is closely linked to the production of HAR-NDS MCPs (FIG. 5A) . On the other hand, the production of MCPs in the spleen was not dependent on IFN-y (Fig. 5B, Table 2). The production of MCPs in HAR-NDS in c-kit W - sh / W- sh was markedly reduced (Fig. 5C) as compared to heterozygous mice in W-sash Likewise, c-kit locus was found to be important for the development of HAR-NDS mast cells.

대조군(B6) 및 IFN-γ결핍 변이 생쥐의 콜로니 출현빈도 비교Comparison of the incidence of colonies in the control (B6) and IFN-γ deficient mutant mice
비장
(1 x 105 cells)
spleen
(1 x 10 5 cells)

콜로니 빈도
Colony frequency
CFU-GEMM
CFU-GEMM

CFU-GM
CFU-GM
BFU-E
BFU-E
MCP
MCP
합계
Sum
B6
B6

5.0 ± 1.4
5.0 ± 1.4

30.5 ± 2.1
30.5 ± 2.1
8.0 ± 1.4
8.0 ± 1.4
1.0 ± 1.4
1.0 ± 1.4

44.5 ± 3.5
44.5 ± 3.5

B6-IFN-γ-ko
B6-IFN-? -Co

6.0 ± 1.4
6.0 ± 1.4

21.0 ± 8.5
21.0 ± 8.5

13.0 ± 4.2
13.0 ± 4.2
3.5 ± 2.1
3.5 ± 2.1

43.05 ± 16.3
43.05 + 16.3

결국, 일례로 실시된 결과에서 IFN-γ-/-생쥐의 HAR-NDS는 비장과 달리 급격한 MCPs의 생산감소가 있으므로 IFN-γ 신호체계에 의존적이었다. 즉, 골수, 혈액 및 HAR-NDS의 MCPs 생성에 있어 조혈 조절이 다소 상이하다는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, in one example, HAR-NDS of IFN-y - / - mice was dependent on the IFN-y signaling system because there was a sharp decrease in the production of MCPs unlike the spleen. In other words, it was confirmed that hematopoiesis control is somewhat different in the production of MCPs in bone marrow, blood and HAR-NDS.

[실시예 6] HAR-NDS- 및 골수-유래 조혈세포의 보완성(compatibility)[Example 6] Compatibility of HAR-NDS- and bone marrow-derived hematopoietic cells [

HAR-NDS 유래 조혈줄기세포의 조혈세포 생착능 잠재성(hematopoietic engraftment potential)을 조사하기 위해서, 조혈세포 생착능 분석(Hematopoietic engraftment assay)을 2가지 방식으로 수행하였다.In order to investigate the hematopoietic engraftment potential of HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells, hematopoietic engraftment assay was performed in two ways.

즉, 경쟁적 재구성 조혈줄기세포 분석(competitive repopulation HSC assay)의 경우 치명적으로 방사선 조사(1,100 cGy의 흡수선량)된 8주령 C57Bl/6 F1 생쥐(CD45.1+/CD45.2+)를 수여자(recipient)로 하고, B6(CD45.2+)의 HAR-NDS 유래의 5 x 105 세포들과 B6.BoyJ(CD45.1+) 골수 세포들을 같은 비율로 혼합하여 공급 세포(donor cells)로 사용하여 수여자(recipient)에게 정맥주사(intravenous injection, i.v.)로 주입한 후 혈액세포의 재구성(reconstitution) 여부를 조사하였다.In the competitive repopulation HSC assay, 8-week-old C57Bl / 6 F1 mice (CD45.1 + / CD45.2 + ), which were fatal (radiation dose of 1,100 cGy) recipient) and 5 × 10 5 cells from B6 (CD45.2 + ) HAR-NDS and B6.BoyJ (CD45.1 + ) bone marrow cells were mixed at the same ratio and used as donor cells The recipient was injected intravenously (iv) and the blood cells were reconstituted.

또한, 비경쟁적 생착 분석(engraftment assay)은 HAR-NDS(Thy1.2+)의 5 x 105 세포들을 치명적인 방사선(1,100 cGy)에 조사된 동일유전자(congenic) 생쥐(Thy1.1+)에게 정맥주사(intravenous injection, i.v.)로 주입하여 조사하였다.In addition, non-competitive for intravenous engraftment analysis (assay engraftment) is HAR-NDS same gene (congenic) mice (Thy1.1 +) examined the 5 x 10 5 cells to a lethal radiation (1,100 cGy) of (Thy1.2 +) And injected with intravenous injection (iv).

상기 경쟁적 또는 비경쟁적 조혈세포 재구성의 생착 분석은 숙주(host) 생쥐 또는 이에 주입된 세포들에 의한 생존(률)을 이식 1개월 또는 3개월 후에 분석하였다.Survival analysis of the competitive or noncompetitive hematopoietic cell reconstitution was performed after 1 or 3 months of graft survival by the host mice or cells injected therefrom.

그 결과, 경쟁적 재구성(repopulation) HSC 분석에 의하면 HAR-NDS 세포(CD45.2+)는 치명적으로 방사선 조사된 F1(CD45.1+/CD45.2+) 생쥐에 생착되지 못하였으나 BM-MNC(CD45.1+)는 생착이 가능한 것으로 확인되었다. 비경쟁적 실험분석에서 치명적으로 방사선 조사된 동계(syngeneic) 생쥐에 EGFP+ HAR-NDS 세포를 다양한 농도(doses)로, 5 x 105 cells/생쥐 농도까지, 이식했을 때 모든 생쥐는 이식 후 10∼14일 이내에 사망하였다. 이 결과에 의하면 HAR-NDS 유래 조혈줄기/모세포(hematopoietic stem/progenitor cell)는 방사능에 대한 방어능력(radioprotection)을 갖지 못하는 것으로 나타났다.Competitive repopulation HSC analysis showed that HAR-NDS cells (CD45.2 +) did not engage in fatal irradiated F1 (CD45.1 + / CD45.2 + ) mice, but BM-MNC CD45.1 + ) was found to be capable of engraftment. In non-competitive experimental assays, EGFP + HAR-NDS cells were dosed at doses of 5 x 10 5 cells / mouse to lethally irradiated syngeneic mice, He died within 14 days. These results indicate that HAR-NDS-derived hematopoietic stem / progenitor cells do not have radioprotection capability.

한편, 골수세포(BM-MNC)가 HAR-NDS로 이동하여 생착되는지 조사하였다. HAR-NDS로의 골수 세포의 이동 양상을 조사하기 위해서 치명적으로 방사선 조사(1,100 cGy)된 B6 생쥐에 EGFP+ 동계의 BM-MNC를 2 x 106 cells/생쥐 농도로 정맥주사 하였다. EGFP+ BM-MNC 세포의 HAR-NDS로의 이동은 형광도립현미경(Fluorescence inverted microscope; Observer Z1, Zeiss) 하에서 관찰하였다.On the other hand, bone marrow cells (BM-MNC) were transferred to HAR-NDS and examined for engraftment. In order to investigate the migration pattern of bone marrow cells into HAR-NDS, BM-MNC of EGFP + winter was intravenously injected at 2 x 10 6 cells / mouse concentration in B6 mice irradiated with fatal radiation (1,100 cGy). The migration of EGFP + BM-MNC cells to HAR-NDS was observed under a fluorescence inverted microscope (Observer Z1, Zeiss).

그 결과, 녹색 형광을 가지는 골수세포인 EGFP+ BM-MNC(2 x 106 cells/생쥐)를 동계(syngeneic)의 치명적으로 방사선 조사된 B6 생쥐에 주입하면 이식 10일 후부터 HAR-NDS의 도관(도 6A-b)과 절(도 6A-c)에서 EGFP+ 세포를 검출할 수 있었다(도 6A). 또한, 21일째 되는 날 HAR-NDS는 완전하게 EGFP+ BM-MNC로 재구성되었다(도 6B). 재구성된 HAR-NDS의 세포를 OP9와 공동배양하면, CAFCs가 생성되는 것으로 봐서 골수 및 HAR-NDS는 조혈아세포-유사 세포의 회로(이동경로)가 연결되는 것으로 확인되었다(도 6C).As a result, EGFP + BM-MNC (2 x 10 6 cells / mouse), a green fluorescent bone marrow cell, was injected into a syngeneic lethally irradiated B6 mouse. EGFP + cells could be detected in Figures 6A-b) and 6 (Figures 6A-c) (Figure 6A). On the 21st day, HAR-NDS was completely reconstituted with EGFP + BM-MNC (Fig. 6B). When the reconstituted HAR-NDS cells were co-cultured with OP9, it was confirmed that CAFCs were produced, and the bone marrow and HAR-NDS were linked to the circuit (movement pathway) of hematopoietic cells-like cells (Fig. 6C).

결국, 해부학적으로 원천적인 차이가 있는 조혈 생성 장소인 골수 및 HAR-NDS간에 조혈세포의 이동 및 생착을 할 수 있다는 것은 HAR-NDS는 조혈에 있어 독립적인 체계이면서 골수 및 혈액 체계를 보완하는 역할을 하고 있음을 알 수 있다.
In conclusion, HAR-NDS is an independent system for hematopoiesis and complementary to the bone marrow and blood system in that hematopoietic cell migration and engraftment between the bone marrow and HAR-NDS, As shown in Fig.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will readily appreciate that many modifications are possible in the exemplary embodiments without materially departing from the novel teachings and advantages of this invention. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

Claims (25)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete (a) HAR-NDS를 알시안 블루(Alcian blue), 메틸렌 블루(Methylene blue) 및 야누스 그린 B(Janus green B, JGB)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 HAR-NDS용 염색시료로 염색하고 추출하여 그 세포들을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a)에서 분리된 HAR-NDS의 구성 세포들을 혈청 및 사이토카인을 함유하는 CFCs용 메틸셀룰로오스 배지에서 배양하여 집락형성세포(CFCs; colony forming cells)를 형성시키는 단계; 및
(c) 상기 (b)에서 수득한 집락형성세포(CFCs; colony forming cells)로부터 lin-,sca-1+,c-kit+및 CD34-의 면역학적 특성을 가지는 세포를 분리하는 단계를 포함하는 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포의 분리방법.
(a) HAR-NDS is stained with any one of HAR-NDS staining samples selected from the group consisting of Alcian blue, Methylene blue and Janus green B (JGB) Extracting and separating the cells;
(b) culturing constituent cells of HAR-NDS separated in (a) above in a methylcellulose medium for CFCs containing serum and cytokine to form colony forming cells (CFCs); And
(c) separating cells having the immunological properties of lin - , sca-1 + , c-kit + and CD34 - from the colony forming cells (CFCs) obtained in the above (b) A method for the isolation of HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells.
제7항에 있어서, 상기 HAR-NDS는 장기 표면, 혈관내, 림프관내 및 피부에 존재하는 절(node)과 도관(duct)으로 구성되는 망상 구조인 것을 특징으로 하는 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포의 분리방법.
[8] The HAR-NDS-derived hematopoietic stem cell according to claim 7, wherein the HAR-NDS is a reticulate structure consisting of nodes and ducts existing in the organ surface, the blood vessel, .
삭제delete 제7항에 있어서, 상기 사이토카인은 에리트로포이에틴(erythropoietin), SCF (stem cell factor), GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor), IL-3/-7, FL(flt3/flt2 ligand), LIF(Leukemia inhibitory factor) 및 TPO(thrombopoietin)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포의 분리방법.
8. The method of claim 7, wherein the cytokine is selected from the group consisting of erythropoietin, stem cell factor (SCF), granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), IL-3/7, FL (flt3 / flt2 ligand) , Leukemia inhibitory factor (LIF), and thrombopoietin (TPO).
제7항에 있어서, 상기 CFCs용 메틸셀룰로오스 배지는 CFU-GEMM 메틸셀룰로오스(methylcellulose)인 것을 특징으로 하는 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포의 분리방법.
[8] The method according to claim 7, wherein the methyl cellulose medium for CFCs is CFU-GEMM methylcellulose.
제7항에 있어서, 상기 (b)단계에서 형성된 집락형성세포(CFCs)를 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 또는 Wright-Giemsa의 CFCs용 염색시료로 염색하여 CFU-GEMM(colony-forming unit-granulocyte erythroid macrophage, megakaryocyte), CFU-GM(colony forming unit-granulocyte, macrophage), BFU-E(burst-forming unit-erythroid colonies) 및 MCPs(mast cell progenitors)로 구분하는 단계를 추가로 포함하는 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포의 분리방법.
The method according to claim 7, wherein the colony forming cells (CFCs) formed in step (b) are stained with a staining sample for CFCs of toluidine blue or Wright-Giemsa to form a colony-forming unit-granulocyte erythroid macrophage N-linked hematopoietic stem cells (HSCs) further comprising a step of dividing the cells into a megakaryocyte, a CFU-GM (colony forming unit-granulocyte, macrophage), a burst-forming unit-erythroid colon (BFU-E) A method for separating stem cells.
삭제delete 다음의 단계를 포함하는, HAR-NDS 유래 세포로부터 혈액세포의 생성방법:
(a) 제 7항의 방법으로 분리한 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 혈청 및 사이토카인을 함유하는 배지에서 조혈지지세포와 공동배양하여 코블스톤-에리어 포밍 세포(CAFCs, cobblestone-area forming cells)를 형성시키는 단계;
(b) 상기 (a)에서 형성된 CAFCs로부터 CD45-및 Flk-1+의 면역학적 특성을 가지는 조혈 줄기세포를 분리하는 단계; 및
(c) 상기 (b)에서 수득된 HAR-NDS 유래 조혈줄기세포를 CFCs용 메틸셀룰로오스 배지에서 계대배양하여 성숙한 혈액세포(hematopoietic cell)를 형성시키는 단계.
A method for producing blood cells from HAR-NDS derived cells, comprising the steps of:
(a) culturing the HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells isolated by the method of claim 7 in a culture medium containing serum and cytokine to co-culture with hematopoietic support cells to produce cobblestone-area forming cells (CAFCs) ;
(b) separating hematopoietic stem cells having the immunological characteristics of CD45 - and Flk-1 + from the CAFCs formed in (a) above; And
(c) subculturing the HAR-NDS-derived hematopoietic stem cells obtained in (b) above in a methylcellulose medium for CFCs to form mature hematopoietic cells.
제14항에 있어서, 상기 조혈지지세포는 OP9 또는 OP9-DL1인 것을 특징으로 하는 HAR-NDS 유래 세포로부터 혈액세포의 생성방법.
15. The method of claim 14, wherein the hematopoietic support cell is OP9 or OP9-DL1.
제14항에 있어서, 상기 사이토카인은 에리트로포이에틴(erythropoietin), SCF(stem cell factor), GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor), IL-3/-7, FL(flt3/flt2 ligand), LIF(Leukemia inhibitory factor) 및 TPO(thrombopoietin)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 HAR-NDS 유래 세포로부터 혈액세포의 생성방법.
15. The method according to claim 14, wherein said cytokine is selected from the group consisting of erythropoietin, stem cell factor (SCF), granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), IL-3/7, FL (flt3 / flt2 ligand) , Leukemia inhibitory factor (LIF), and thrombopoietin (TPO). The method for producing blood cells from HAR-NDS-derived cells according to claim 1,
제14항에 있어서, 상기 집락형성세포(CFCs)용 배지는 CFU-GEMM 메틸셀룰로스(methylcellulose)인 것을 특징으로 하는 HAR-NDS 유래 세포로부터 혈액세포의 생성방법.
15. The method of claim 14, wherein the medium for the colony forming cells (CFCs) is CFU-GEMM methylcellulose.
제14항에 있어서, 상기 (c)단계의 성숙한 혈액세포를 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 또는 Wright-Giemsa의 CFCs용 염색시료로 염색하여 콜로니를 형성하는 세포의 크기와 분화형태를 구분하는 단계를 추가로 포함하는 HAR-NDS 유래 세포로부터 혈액세포의 생성방법.
15. The method according to claim 14, wherein the step (c) is performed by staining a mature blood cell with a staining sample for CFCs of toluidine blue or Wright-Giemsa to distinguish the size and differentiation pattern of the cells forming the colony / RTI &gt; from the HAR-NDS-derived cells.
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