KR101652427B1 - Cell culture substrate with ZnO thin film formed by atomic layer deposition - Google Patents

Abstract

본 발명은 원자층 증착방식(atomic layer deposition, ALD)에 의해 형성된 산화아연(ZnO) 박막을 구비한 세포 배양 기재; 상기 세포 배양 기재를 이용한 액틴 발현을 향상시키는 세포 배양방법; 상기 세포 배양 기재 상에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포의 액틴 재배열을 조절하는 방법 및 세포 형태 변화를 유도하는 방법; 및 상기 산화아연 박막을 구비한 세포 배양 기재를 포함한 이식체 또는 피부부착용 패치에 관한 것이다.
본 발명의 세포 배양 기재에 구비된 산화아연(ZnO) 박막은 원자층 증착방식(ALD)에 의해 제조된 것으로서, 나노미터 단위로 미세하게 조절할 수 있다. 또한, 상기 ZnO 박막의 표면 상에서 세포를 배양함으로써 인위적으로 세포 증식 속도를 조절할 수 있으므로, 증식이 필요한 세포의 증식 증가와 증식이 불필요한 세포의 증식 억제를 통한 치료적 활용이 가능하다.The present invention relates to a cell culture substrate having a zinc oxide (ZnO) thin film formed by atomic layer deposition (ALD); A cell culture method for improving actin expression using the cell culture substrate; A method of regulating actin rearrangement of cells and inducing cell morphology change comprising culturing cells on the cell culture substrate; And a cell culture substrate having the zinc oxide thin film.
The zinc oxide (ZnO) thin film provided in the cell culture substrate of the present invention is prepared by atomic layer deposition (ALD), and can be finely adjusted in nanometer scale. In addition, since the cell growth rate can be controlled by artificially culturing the cells on the surface of the ZnO thin film, it is possible to utilize therapeutically by increasing the proliferation of cells requiring proliferation and inhibiting proliferation of cells that do not require proliferation.

Description

원자층 증착방식에 의해 형성된 산화아연 박막을 구비한 세포 배양 기재{Cell culture substrate with ZnO thin film formed by atomic layer deposition}[0001] The present invention relates to a cell culture substrate having a zinc oxide thin film formed by an atomic layer deposition method,

본 발명은 원자층 증착방식(atomic layer deposition, ALD)에 의해 형성된 산화아연(ZnO) 박막을 구비한 세포 배양 기재; 상기 세포 배양 기재를 이용한 액틴 스트레스 섬유 발현을 향상시키는 세포 배양방법; 상기 세포 배양 기재 상에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포의 액틴 재배열을 조절하는 방법 및 세포 형태 변화를 유도하는 방법; 및 상기 산화아연 박막을 구비한 세포 배양 기재를 포함한 이식체 또는 피부부착용 패치에 관한 것이다.
The present invention relates to a cell culture substrate having a zinc oxide (ZnO) thin film formed by atomic layer deposition (ALD); A cell culture method for enhancing actin stress fiber expression using the cell culture substrate; A method of regulating actin rearrangement of cells and inducing cell morphology change comprising culturing cells on the cell culture substrate; And a cell culture substrate having the zinc oxide thin film.

산화아연(ZnO)은 넓은 밴드갭(band gap)을 가진 Ⅱ-Ⅵ족의 반도체 물질로서, 물질 연구의 많은 분야에서 사용되고 있다. ZnO의 우수한 광학적 투명도(optical clarity) 및 비교적 금속성을 띠므로, 스마트 윈도우 또는 터치스크린에 전극용 투명전도성산화물(TCO) 물질로 사용할 수 있다. 또한 ZnO는 on/off 비가 크고, 중간수준의 전계 유효 이동도(field effective mobility)를 가지므로, Si 기반의 장치에도 응용할 수 있어, 반도체 산업에서 박막 트랜지스터에서의 활성 채널 물질로도 폭넓게 사용되고 있다. 또한, 다양한 광학적 응용분야에서 광전자 필름으로 널리 사용되며, ZnO의 압전성은 에너지 장치에 대한 광범위한 연구를 시작하게 하였다. 이처럼 ZnO는 우수한 광학적, 전기적 그리고 압전 특성으로 인해 지난 수십 년 동안 많은 연구가 수행되고 있는 재료로서 표면 음향 소자, 투명 전극 또는 광소자 등으로 응용 가능성이 큰 물질이다. 그러나, 이와 같은 ZnO의 폭넓은 응용분야에도 불구하고 바이오-의학 분야에 응용한 예는 재료, 전기전자 등 다른 산업분야에 비해서 미비한 실정이다.Zinc oxide (ZnO) is a semiconductor material of group II-VI having a wide band gap and is used in many fields of material research. Because of its excellent optical clarity and relatively metallic properties, ZnO can be used as a transparent conductive oxide (TCO) material for electrodes in smart windows or touch screens. In addition, since ZnO has a large on / off ratio and moderate field effective mobility, it can be applied to Si-based devices and is widely used as an active channel material in thin film transistors in the semiconductor industry. In addition, it is widely used as optoelectronic film in various optical applications, and the piezoelectricity of ZnO has led to the start of extensive research on energy devices. As such, ZnO has been widely studied for decades due to its excellent optical, electrical, and piezoelectric properties, and is a material that is highly applicable to surface acoustic devices, transparent electrodes, or optical devices. However, in spite of a wide range of application fields of ZnO, examples of applications to bio-medical fields are inferior to those of other industrial fields such as materials, electric and electronic fields.

생물학에서 ZnO를 이용한 이전 연구들은 대부분 세포에 대한 독성을 관찰하기 위하여 나노입자를 사용하였다. 이러한 형태의 거동은 크게 하기의 2가지 이론으로 설명할 수 있다: ⅰ) 용해 및 독성 양이온의 방출, 및 ⅱ) 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)의 생성. 전자의 경우, ZnO는 산성 또는 염기성 환경(pH＜4 또는 pH＞8)에서 Zn^{2 +} 및 O^{2 -}로 쉽게 이온화하며, 세포내 섭취가 산성조건을 형성하므로 용해가 일어나 생성된 Zn 이온이 심각한 부작용을 야기한다. 그러나, 이러한 현상은 ZnO 입자의 크기가 세포 자체보다 작을 경우에만 발생하며 선이나 박막의 형태로 제공될 때는 세포에 대한 독성을 나타내지 않는다. 후자의 경우, 시료 취급 과정에서 전제되는 것으로, ZnO 박막이 유연한 기재 상에 억지로 형성되었을 때, 박막에서 원자뒤틀림(atomic distortion)에 의해 ROS가 생성된다. 또한, ZnO 박막이 자외선에 노출되었을 때, 박막 내의 산소결함으로부터 ROS가 방출된다.
Previous studies using ZnO in biology have used nanoparticles to observe toxicity to most cells. This type of behavior can be largely explained by two theories: i) release of dissolution and toxic cations, and ii) generation of reactive oxygen species (ROS). In the former case, ZnO easily ionizes into Zn ^{2 +} and O ^{2 -} in an acidic or basic environment (pH <4 or pH> 8), and since the intracellular uptake forms an acidic condition, dissolution occurs, It causes side effects. However, this phenomenon occurs only when the size of the ZnO particles is smaller than the cell itself, and when it is provided in the form of a line or a thin film, it does not show toxicity to the cells. In the latter case, when the ZnO thin film is forcibly formed on a flexible substrate, ROS is generated by atomic distortion in the thin film. Also, when the ZnO thin film is exposed to ultraviolet rays, ROS is released from oxygen defects in the thin film.

한편, 종래의 세포 배양 기재와 관련된 연구들은 생체외(in vitro)에서의 세포 배양시, 생체내(in vivo)에서와 동일한 수준의 세포 기능을 유지하기 위하여 세포를 고밀도로 배양하는 것에 주로 초점을 맞춰왔다. 이에 따라, 세포 배양 기재의 소수성 표면을 친수성화 시키거나, 또는 세포외 매트릭스(extracellular matrix) 또는 세포 접착성 물질을 사용하여 세포 배양의 효율성을 높이는 방법이 개발되어 왔으나, 현재까지 세포 배양 기재의 두께 등을 조절함으로써 표면 상에서 배양되는 세포의 증식속도 및/또는 분화를 조절하거나 세포의 형질변화를 유도하는 방법에 대한 연구는 진행되지 않았다.
On the other hand, studies related to conventional cell culture substrates have focused mainly on culturing cells at high density in order to maintain cell functions at the same level as in vivo when cells are cultured in vitro I guess. Accordingly, methods have been developed for increasing the efficiency of cell culture by hydrophilizing the hydrophobic surface of the cell culture substrate or using an extracellular matrix or a cell adhesive material. However, until now, the thickness of the cell culture substrate Etc. have not been studied to control the growth rate and / or differentiation of cells cultured on the surface or to induce a change in the traits of the cells.

본 발명자들은 원자층 증착방식(ALD)으로 형성된 ZnO 박막의 두께와 그에 따른 전기적 특성을 인위적으로 조절함으로써 ZnO 박막의 표면 상에 존재하는 세포의 형태, 증식속도 및/또는 형질을 조절할 수 있음을 확인하였다. 이처럼 박막 표면의 화학적 조성은 동일하면서 전기적 특성만을 조절하여 세포의 증식에 영향을 주는 것은, 기존의 한 가지 종류의 물질로는 불가능하였으나 본 발명에서는 이를 최초로 구현하였고, 나아가 상기 ZnO 박막의 코팅을 통하여 세포와 조직의 재생을 위한 제제 및 세포의 증식 제어를 통한 다양한 유해세포 예컨대, 암세포 또는 유해세균 등의 억제제로의 응용 또한 가능함을 확인하였다.
The present inventors confirmed that it is possible to control the morphology, growth rate and / or trait of cells existing on the surface of the ZnO thin film by artificially controlling the thickness of the ZnO thin film formed by the atomic layer deposition (ALD) and the electrical characteristics thereof Respectively. It is impossible to use this material as a kind of material that affects the cell proliferation by controlling the electrical characteristics of the thin film by the same chemical composition. However, the present invention has realized this for the first time, and furthermore, by coating the ZnO thin film It has been confirmed that it can be applied to various harmful cells such as cancer cells or harmful bacteria by controlling the proliferation of cells and tissues for cell and tissue regeneration.

본 발명의 제1양태는, 원자층 증착방식(atomic layer deposition, ALD)에 의해 형성된 산화아연(ZnO) 박막을 구비한 세포 배양 기재를 제공한다.A first aspect of the present invention provides a cell culture substrate having a zinc oxide (ZnO) thin film formed by atomic layer deposition (ALD).

본 발명의 제2양태는, 세포 배양방법에 있어서, 상기 세포 배양 기재 상에서 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 상기 세포 배양 기재는 세포의 액틴 스트레스 섬유 발현을 향상시키는 것인 방법을 제공한다.The second aspect of the present invention provides a method for cell culture, comprising culturing cells on the cell culture substrate, wherein the cell culture substrate enhances actin stress fiber expression of the cells.

본 발명의 제3양태는, 세포의 액틴 재배열을 조절하는 방법에 있어서, 상기 세포 배양 기재 상에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.A third aspect of the present invention provides a method for regulating actin rearrangement of cells, comprising culturing cells on the cell culture substrate.

본 발명의 제4양태는, 세포 형태 변화를 유도하는 방법에 있어서, 상기 세포 배양 기재 상에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.A fourth aspect of the present invention provides a method for inducing a cell morphology change, comprising culturing a cell on the cell culture substrate.

본 발명의 제5양태는, 상기 산화아연 박막을 구비한 세포 배양 기재를 포함한 이식체 또는 피부부착용 패치를 제공한다.A fifth aspect of the present invention provides an implant or skin patch comprising the cell culture substrate having the zinc oxide thin film.

본 발명의 제6양태는, 상기 세포 배양 기재 상에서 암세포를 배양하는 제1단계; 상기 제1단계 이전, 중간 또는 이후에 항암치료 후보물질을 처리하는 제2단계; 및 상기 항암치료 후보물질 처리 전과 후의 암세포에서의 변화를 확인하여 항암치료제를 선별하는 제3단계를 포함하는, 항암치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
A sixth aspect of the present invention provides a method for culturing cancer cells, comprising: a first step of culturing cancer cells on the cell culture substrate; A second step of treating an anticancer therapy candidate substance before, during or after the first step; And a third step of identifying a chemotherapeutic agent by confirming a change in cancer cells before and after the treatment with the chemotherapeutic candidate substance, and a third step of screening the chemotherapeutic agent.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

앞서 설명한 바와 같이, 기존의 산화아연(ZnO)은 세포독성을 나타내는 물질로 취급되어 이의 생물학적 응용은 세포독성을 관찰하기 위한 물질이나, 항균활성을 갖는 물질로서 사용한 것에 불과하였다. 한편, 종래의 세포 배양 기재는 기재 표면을 친수성화하거나 세포 접착성 물질을 코팅하는 등에 의해 세포 배양의 효율성을 높이는 데에만 주력해왔다.As described above, conventional zinc oxide (ZnO) is regarded as a substance exhibiting cytotoxicity, and its biological application has been used only as a substance for observing cytotoxicity or as a substance having antimicrobial activity. On the other hand, conventional cell culture substrates have focused on improving the efficiency of cell culture by hydrophilizing the surface of the substrate or coating a cell adhesive material.

그러나, 본 발명에 따른 세포 배양 기재는 원자층 증착방식(atomic layer deposition, ALD)에 의해 형성된 산화아연(ZnO) 박막을 구비하여 상기 박막의 두께를 조절하여 이에 따라 주어지는 부도체, 반도체 또는 전도체적인 전기적 특성을 이용함으로써 상기 박막 상에서 배양되는 세포의 증식속도를 인위적으로 조절할 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다.However, the cell culture substrate according to the present invention includes a zinc oxide (ZnO) thin film formed by atomic layer deposition (ALD) to control the thickness of the thin film, Characterized in that the rate of proliferation of the cells cultured on the thin film can be artificially regulated.

일반적으로 세포 배양은 세포 배양 용기에 배양하고자 하는 세포와 함께, 이의 성장, 증식, 분화 등에 필요한 영양분, 성장인자, 이외의 기타 첨가물을 포함하는 배양 배지를 넣어 적정한 온도, 대기, 습도 조건하에서 배양한다. 일반적인 배양 조건은 미생물의 증식에도 호의적이므로, 원하지 않는 미생물에 의한 오염을 방지하기 위하여, 상기 배양 배지 첨가물은 보통 항생제(antibiotics)를 추가로 포함한다. 한편, ZnO 박막은 자체적으로 항미생물(antimicrobial)(항박테리아(antibacterial) 및/또는 항진균(antofungal)) 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 ZnO 박막을 구비한 세포 배양 기재를 이용하면, 상기 세포 배양을 위한 배지 첨가물 중 항생제의 사용을 배제할 수 있다.In general, a cell culture is cultured in a cell culture container with a culture medium containing nutrients, growth factors, and other additives necessary for its growth, proliferation, differentiation and the like, together with cells to be cultured under appropriate temperature, atmosphere, and humidity conditions . Since general culture conditions are also favorable for the growth of microorganisms, the culture medium additives additionally include antibiotics, in order to prevent contamination by unwanted microorganisms. On the other hand, ZnO thin films are known to have antimicrobial (antibacterial and / or antofungal) activity on their own. Therefore, when the cell culture substrate having the ZnO thin film is used, the use of antibiotics among the culture additives for cell culture can be excluded.

원자층 증착방식(ALD)이란, 반도체 제조 공정 중 화학적으로 달라붙는 단원자층의 현상을 이용한 나노 박막 증착 기술로서, 웨이퍼 표면에서 분자의 흡착과 치환을 번갈아 진행함으로 원자층 두께의 초미세 층간(layer-by-layer) 증착이 가능하고, 산화물과 금속 박막을 최대한 얇게 쌓을 수 있다. 또한 가스의 화학반응으로 형성된 입자들을 웨이퍼 표면에 증착시키는 화학 기상 증착(CVD)보다 낮은 온도(500도 이하)에서 막질을 형성할 수 있어 시스템온칩(SoC) 제조에 적합한 기술이다. 원자층 증착방식의 한 사이클은 DEZ 노출(DEZ exposure) → 질소 퍼지(nitrogen purge) → H2O 노출(H2O exposure) → 질소 퍼지(nitrogen purge)로 구성될 수 있다.Atomic layer deposition (ALD) is a nano thin film deposition technology that utilizes the phenomenon of chemically sticking mononuclear layer in the semiconductor manufacturing process. By alternately advancing adsorption and substitution of molecules at the surface of the wafer, -by-layer deposition is possible, and the oxide and the metal thin film can be stacked as thin as possible. In addition, it is a technology suitable for system-on-chip (SoC) production because it can form a film at a lower temperature (less than 500 degrees) than chemical vapor deposition (CVD) in which particles formed by a chemical reaction of a gas are deposited on a wafer surface. One cycle of atomic layer deposition may consist of DEZ exposure → nitrogen purge → H2O exposure → nitrogen purge.

바람직하게, 상기 원자층 증착방식을 이용하면 형성되는 ZnO 박막의 두께를 nm 수준에서 조절할 수 있다.
Preferably, the thickness of the ZnO thin film formed by the atomic layer deposition method can be controlled at the nm level.

바람직하게, 본 발명에 따른 세포 배양 기재는 산화아연(ZnO) 박막의 두께, 전기전도도 또는 둘다를 조절하여 세포의 증식 속도를 조절할 수 있다. 상기 세포 배양 기재에 구비된 산화아연(ZnO) 박막의 두께에 따라 전기전도도가 변화하며, 이에 따른 박막 표면 상에 대한 세포의 부착성 및 세포내 골격체(cytoskeleton)의 형태가 달라지고 이에 따라 세포주기의 진행을 조절할 수 있으므로, 결과적으로 세포의 증식 속도가 변화할 수 있다. 따라서, 형성되는 ZnO 박막의 두께 및/또는 전기전도도를 조절함으로써 세포의 증식 속도를 인위적으로 조절할 수 있다.
Preferably, the cell culture substrate according to the present invention can control the growth rate of cells by controlling the thickness, electric conductivity or both of the zinc oxide (ZnO) thin film. The electrical conductivity changes according to the thickness of the zinc oxide (ZnO) thin film provided on the cell culture substrate, and thus the cell adhesion to the surface of the thin film and the shape of the cytoskeleton are changed, Since the progression of the cycle can be controlled, the growth rate of the cells can be changed as a result. Therefore, the growth rate of the cells can be artificially controlled by controlling the thickness and / or the electric conductivity of the formed ZnO thin film.

바람직하게, 상기 형성되는 ZnO 박막의 두께는 원자층 증착방식(ALD)의 사이클 수에 따라 조절할 수 있다. 상기 원자층 증착방식에 의한 사이클 수에 따라 형성된 ZnO 박막의 두께는 나노미터의 단위로까지 미세하게 조절할 수 있으며, 사이클 수가 증가함에 따라 ZnO 박막의 두께는 증가한다. 예컨대, 상기 과정을 50 사이클 수행하여 7 ㎚ 두께의 ZnO 박막을 형성할 수 있다. 또는 100 사이클 또는 200 사이클로 횟수를 증가시켜 각각 18 ㎚ 및 34 ㎚ 두께의 ZnO 박막을 형성할 수 있다. 따라서, 상기 사이클 수를 조절하여 형성되는 ZnO 박막의 두께를 ㎚ 수준에서 조절할 수 있다.Preferably, the thickness of the formed ZnO thin film can be controlled according to the number of cycles of the atomic layer deposition (ALD) method. The thickness of the ZnO thin film formed according to the number of cycles by the atomic layer deposition method can be finely adjusted to the nanometer unit and the thickness of the ZnO thin film increases as the cycle number increases. For example, the ZnO thin film having a thickness of 7 nm can be formed by performing the above process for 50 cycles. Or by increasing the number of times by 100 cycles or 200 cycles, ZnO thin films of 18 nm and 34 nm thickness can be formed, respectively. Therefore, the thickness of the ZnO thin film formed by controlling the number of cycles can be controlled at the level of nm.

또한 본 발명의 ZnO 박막의 두께에 따라 전기전도도가 달라질 수 있다. 구체적으로, 원자층 증착방식(ALD)의 사이클 수를 증가시킴으로써 형성된 ZnO 박막의 두께가 두꺼워질수록 박막의 금속성이 강해지고, 전하 운반체 밀도가 증가하며, 이에 따라 전기전도도 또한 증가한다(실험예 1-1). 따라서, ZnO 박막의 전기전도도는 ZnO 박막의 두께, 나아가 원자층 증착방식(ALD)의 사이클 수에 의해 인위적으로 조절가능하다.Also, the electrical conductivity may vary depending on the thickness of the ZnO thin film of the present invention. Specifically, as the thickness of the ZnO thin film formed by increasing the number of cycles of atomic layer deposition (ALD) increases, the metallicity of the thin film becomes stronger, the charge carrier density increases, and thus the electric conductivity also increases (Experimental Example 1 -One). Therefore, the electrical conductivity of the ZnO thin film is artificially controllable by the thickness of the ZnO thin film and further by the number of cycles of the atomic layer deposition (ALD) method.

바람직하게, 상기 형성된 ZnO 박막은 두께가 0 ㎚ 초과 18 ㎚ 미만(100 cycles, 즉 도 2b로부터 부도체 영역으로 판단되는 부분에 해당하는 두께)인 것일 수 있으며, 이때 전기전도도는 1 Ω^-1·㎝^-1 미만, 바람직하게는 Ω^-1·㎝^-1에 근접하는 값일 수 있다.Preferably, the formed ZnO thin film may be one of (a thickness corresponding to a portion from the 100 cycles, i.e., Figure 2b is determined by non-conductive region) having a thickness of less than 0 ㎚ ㎚ 18, wherein the electrical conductivity is 1 Ω ^-1 · ㎝ ^-1 , preferably close to? ^-1 ? Cm ^-1 .

또한, 바람직하게, 상기 형성된 ZnO 박막은 두께가 18 ㎚ 내지 25 ㎚ (100 내지 150 cycles, 즉 도 2b로부터 반도체 영역으로 판단되는 부분 에 해당하는 두께)인 것일 수 있으며, 이때 전기전도도는 0 Ω^-1·㎝^-1 내지 75 Ω^-1·㎝^-1일 수 있다.Further, preferably, ZnO thin film so formed will be that of (the thickness corresponding to the portion from 100 to 150 cycles, i.e., Figure 2b is determined as a semiconductor region) having a thickness of 18 ㎚ to 25 ㎚, wherein the electrical conductivity is 0 Ω ^{- 1,} may be ㎝ ^-1 to about 75 Ω ^-1 · ㎝ ^-1.

또한, 바람직하게, 상기 형성된 ZnO 박막은 두께가 25 ㎚ 이상(150 cycles, 즉 도 2b로부터 도체 영역으로 판단되는 부분 에 해당하는 두께 이상)인 것일 수 있으며, 이때 전기전도도는 75 Ω^-1·㎝^-1 이상일 수 있다. 상기 박막의 두께는 상한없이 제조할 수 있으나, 물성과 제조효율을 고려할 때, 바람직하게 상기 형성된 ZnO 박막은 두께가 25 ㎚ 내지 500 ㎚일 수 있으며, 보다 바람직하게는 25 ㎚ 내지 100 ㎚일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Preferably, the formed ZnO thin film may have a thickness of 25 nm or more (150 cycles, that is, a thickness corresponding to a portion judged as a conductor region from FIG. 2B), wherein the electric conductivity is 75? ^-1 ? ^-1 . &Lt; / RTI &gt; The thickness of the thin film can be manufactured without an upper limit, but considering the physical properties and manufacturing efficiency, the formed ZnO thin film may have a thickness of 25 nm to 500 nm, more preferably 25 nm to 100 nm , But is not limited thereto.

ZnO 박막 두께 및/또는 전기전도도에 따른 박막 표면에 대한 세포의 부착성은 세포 골격의 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber)의 형성정도를 관찰함으로써 확인할 수 있다. 예컨대, 상기 액틴 스트레스 섬유는 다수의 교차결합된(cross-linked) 액틴 필라멘트 번들로 구성되어 있으며, 세포 부착, 이동 및 형태발생(morphogenesis)과 같은 많은 세포 공정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 액틴 세포골격은 세포외부의 신호를 세포주기의 진행과 연결짓는 세포 증식의 핵심 조절자로도 알려져 있다. 상기 액틴 스트레스 섬유의 형성 여부는 팔로이딘(phalloidin) 염색법에 의하여 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The adhesion of cells to the thin film surface according to the ZnO thin film thickness and / or electrical conductivity can be confirmed by observing the degree of formation of actin stress fibers in the cytoskeleton. For example, the actin stress fibers are composed of a number of cross-linked actin filament bundles and are known to be involved in many cellular processes such as cell adhesion, migration, and morphogenesis. Actin cytoskeleton is also known as a key regulator of cellular proliferation that links signals outside the cell to cell cycle progression. Whether or not the actin stress fibers are formed can be confirmed by phalloidin staining, but is not limited thereto.

구체적으로, 구비된 ZnO 박막의 두께가 45 ㎚ 내지 100 ㎚일 경우 상기 박막 표면에 대한 세포의 액틴 스트레스 섬유 발현이 증가하고, 이에 따라 상기 액틴의 재배열이 유도되어 길쭉하게 세포 형태가 변화할 뿐만 아니라, 세포의 부착성도 변화하여, 세포주기의 진행이 지연됨으로써 세포증식 속도가 감소할 수 있다. 반면, 구비된 ZnO 박막의 두께가 7 ㎚ 내지 25 ㎚일 경우에는, 액틴 스트레스 섬유 발현이 감소하여, 세포의 형태변화를 유발하지 않으므로, 상대적으로 높은 세포증식 속도를 나타낼 수 있다.Specifically, when the thickness of the ZnO thin film provided is 45 nm to 100 nm, the expression of actin stress fibers on the surface of the thin film is increased, and the rearrangement of the actin is induced, Alternatively, cell adhesion may also change, delaying the progression of the cell cycle, thereby reducing cell proliferation rate. On the other hand, when the thickness of the prepared ZnO thin film is 7 nm to 25 nm, the expression of actin stress fibers is decreased and does not induce the morphological changes of the cells, so that the cell growth rate can be relatively high.

본 발명의 실시예에서는 원자층 증착방식(ALD)의 사이클 수에 따라 ZnO 박막의 두께를 조절하였고, 이에 따른 세포 증식 및 골격의 변화를 관찰한 결과, 두께가 두꺼워지고, 전기전도도가 증가할수록 세포 내의 액틴 재배열(actin rearrangement)이 촉진되어, 액틴 스트레스 섬유의 형성이 증가하였다. 이에 따라 박막 표면에서 배양된 세포의 형태가 길쭉하게 펼쳐진 형태로 변화되고, 세포의 부착성 역시 변화하여, 결과적으로 세포의 증식속도가 감소함을 확인하였다(실험예 2-2).
In the embodiment of the present invention, the thickness of the ZnO thin film was controlled according to the number of cycles of atomic layer deposition (ALD), and the cell proliferation and skeletal changes were observed. As a result, the thickness became thicker and the electric conductivity The actin rearrangement in the matrix was promoted and the formation of actin stress fibers was increased. As a result, it was confirmed that the morphology of the cells cultured on the surface of the thin film changed to an elongated shape and the cell adhesion was also changed, resulting in a decrease in cell proliferation rate (Experimental Example 2-2).

본 발명의 세포 배양 기재는 배지(medium)을 포함할 수 있다. 배지는 균, 세포 또는 식물체 등의 배양에 필요한 영양소를 충분히 공급하고, 배양에 적당한 삼투압, pH 등을 조절하여 줌으로써 세포 배양을 더욱 증진시킬 수 있다. 배지의 종류는 배양되는 세포 등에 따라 상이할 수 있으므로, 본 발명에서의 배지는 특정 배지에 제한되지 않으며, 상업적으로 판매하는 배지를 사용할 수도 있고, 직접 제조하여 사용할 수도 있다.The cell culture substrate of the present invention may comprise a medium. The culture medium can further promote cell culture by supplying a sufficient amount of nutrients necessary for culturing bacteria, cells or plants, and adjusting the osmotic pressure and pH suitable for the culture. Since the kind of the medium may differ depending on the cells to be cultured and the like, the medium in the present invention is not limited to a specific medium, and commercially available medium may be used or may be used by direct preparation.

또한 본 발명의 세포 배양 기재는 세포 배양의 효율성을 증진시키기 위하여 세포외 매트릭스 또는 세포 접착 인자와 같은 세포 접착 물질로 고정화 및/또는 흡착된 것일 수 있다.
In addition, the cell culture substrate of the present invention may be immobilized and / or adsorbed with a cell adhesion material such as an extracellular matrix or a cell adhesion factor in order to improve the efficiency of cell culture.

바람직하게, 본 발명의 세포 배양 기재는 세포 및 이의 배양을 위한 배지를 함유할 수 있도록 격벽을 갖는 용기 안에 배치되거나, 기재 자체가 용기 형태인 것일 수 있다. 예컨대, 용기의 격벽으로 둘러싸인 바닥면 상에 ZnO 박막을 형성하여 제조할 수 있다.Preferably, the cell culture substrate of the present invention may be placed in a container having a partition wall so as to contain cells and culture medium for culturing thereof, or the substrate itself may be in the form of a container. For example, it can be produced by forming a ZnO thin film on the bottom surface surrounded by the partition walls of the container.

상기 세포 배양 기재는 원자층 증착방식(ALD)에 의해 형성된 ZnO 박막 자체 또는 상기 박막이 코팅된 기재인 것일 수 있다. 따라서 원자층 증착방식에 의해 형성된 ZnO 박막 자체를 세포 배양 기재로 사용할 수도 있고, 상기 ZnO 박막을 다른 기판 등에 코팅하여 이를 세포 배양 기재로 사용할 수도 있다. ZnO 박막을 다른 기판 등에 코팅하여 사용할 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 페트리 디쉬, 플레이트, 인큐베이터, 배양 백, 필름, 섬유, 마이크로캐리어, 비즈 등과 같은 종래부터 세포 배양에 사용되고 있는 기재, 또는 세포 배양에 사용될 수 있는 다른 기재, 이식체 또는 피부부착용 패치에 적용할 수 있다.The cell culture substrate may be a ZnO thin film formed by atomic layer deposition (ALD) or a substrate coated with the thin film. Therefore, the ZnO thin film formed by the atomic layer deposition method itself may be used as a cell culture substrate, or the ZnO thin film may be coated on another substrate and used as a cell culture substrate. When the ZnO thin film is coated on another substrate or the like, it is possible to use a substrate which is conventionally used for cell culture such as petri dishes, plates, incubators, culture bags, films, fibers, microcarriers, It may be applied to other substrates, implants or skin patches that may be used.

상기 원자층 증착방식에 의해 형성된 ZnO 박막의 표면 상에서 세포를 배양할 수 있다면 본 발명의 세포 배양 기재는 어느 형태로든 존재할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 세포 배양 기재 자체가 용기, 이식체 또는 패치의 형태일 수도 있고, 또는 용기, 이식체 또는 패치의 일부인 형태일 수 있다. 또한 본 발명의 세포 배양 기재는 형태 외에 크기, 모양, 재질, 색상, 용적 등에는 제한되지 않는다.
The cell culture substrate of the present invention may exist in any form as long as the cells can be cultured on the surface of the ZnO thin film formed by the atomic layer deposition method. For example, the cell culture substrate itself of the present invention may be in the form of a container, an implant or a patch, or may be in the form of a container, an implant or a patch. Further, the cell culture substrate of the present invention is not limited in size, shape, material, color, volume, etc. in addition to the form.

본 발명에 따른 세포 배양 기재 상에 배양할 수 있는 세포의 종류 또한 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 세포 배양 기재는 동물 세포, 특히 접착성 세포로서, 섬유아세포, 평활근세포, 혈관내피세포, 각막세포, 연골세포, 간질세포, 소장표피세포, 표피각질세포, 골아세포, 골수간엽세포, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 신경줄기세포, 신경세포, 신경교세포, 종양세포 등의 배양에 널리 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 혈액 세포 등의 부유 세포를 배양하는 데에도 사용될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 세포 배양 기재는 정상세포에 비해 현저히 빠른 속도로 증식하는 암세포(종양세포)의 증식속도를 조절할 수 있으며, 따라서 암전이 속도 또는 암세포의 증식을 억제함으로써 항암 효과를 나타낼 수 있다.The type of cells that can be cultured on the cell culture substrate according to the present invention is also not particularly limited. Specifically, the cell culture substrate of the present invention can be used as an animal cell, particularly as an adhesive cell, a fibroblast, a smooth muscle cell, a vascular endothelial cell, a corneal cell, a cartilage cell, an interstitial cell, a small epithelial cell, a epidermal keratinocyte, Can be used not only for culturing mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, adult stem cells, neural stem cells, neurons, glial cells, tumor cells and the like but also for culturing floating cells such as blood cells. Preferably, the cell culture substrate of the present invention can regulate the proliferation rate of cancer cells (tumor cells) proliferating at a significantly faster rate than normal cells, and thus can exhibit anticancer effects by inhibiting the rate of metastasis or the proliferation of cancer cells .

또한, 본 발명에 따른 세포 배양 기재는 박테리아 배양에도 이용될 수 있다. 상기 박테리아의 비제한적인 예는 단구균(coccus), 쌍구균(diplococci), 연쇄상구균(streptococci), 포도상구균(staphylococci), 팔련구균(sarcina) 및 사련구균(tetrad)를 포함하는 구균(cocci); 짧은 막대균(coccobacillus), 쌍간균(diplobacilli), 울타리형 간균(palisades.), 연쇄상간균(Streptobacillus), 방추간균(fusiform bacillus) 및 콤마간균(Comma shaped bacillus)을 포함하는 간균(bacilli); 보렐리아(Borellia), 비브리오(bibrio), 스피로헤타(Spirochete) 및 렙토스피라(Reptospirra)을 포함하는 나선균; 및 헬리코박터(Helicobacter), 비브리오(Vibrio), 델로비브리오(Bdellovibrio) 및 코리네박테리아(Corynebacteriaceae)를 포함하는 기타균이 있다. ZnO는 항균 또는 멸균 활성을 가지므로 본 발명에 따른 세포 배양 기재를 이용하여 박테리아를 배양함으로써 박테리아의 생장 및/또는 증식을 조절할 수 있다.
The cell culture substrate according to the present invention can also be used for bacterial culture. Non-limiting examples of such bacteria include: cocci, including coccus, diplococci, streptococci, staphylococci, sarcina and tetrad; Bacilli including coccobacillus, diplobacilli, palisades., Streptobacillus, fusiform bacillus, and comma-shaped bacillus; Helicobacteria including Borellia, Bibrio, Spirochete and Reptospirra; And other bacteria including Helicobacter, Vibrio, Bdellovibrio and Corynebacteriaceae. Since ZnO has antibacterial or sterilizing activity, the growth and / or proliferation of bacteria can be controlled by culturing the bacteria using the cell culture substrate according to the present invention.

본 발명에 따른 세포 배양 기재는 세포의 배양을 위한 세포 배양 물질을 ZnO 박막 상에 추가로 코팅한 것일 수 있다.The cell culture substrate according to the present invention may further be coated with a cell culture material for culturing cells on a ZnO thin film.

상기 세포 배양 물질을 코팅하는 방법의 일 구체예는, (a) 본 발명에 따른 ZnO 박막을 구비한 기재를 살균시키는 단계; (b) 살균된 ZnO 박막을 혈청 또는 알부민, 성장인자, 항체와 같은 세포 배양에 관여하는 단백질 등의 생체물질을 함유하는 세포 배양액에 침지시키는 단계; 및 (c) 이산화탄소 배양기에서 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.
One embodiment of the method for coating the cell culture material includes the steps of: (a) sterilizing the substrate having the ZnO thin film according to the present invention; (b) immersing the sterilized ZnO thin film in a cell culture medium containing biomaterials such as serum or proteins involved in cell culture such as albumin, growth factors, and antibodies; And (c) incubating in a carbon dioxide incubator.

상기 (a) 단계에서 세포 배양 기재에 형성된 ZnO 박막을 살균시키는 단계는 당업계에서 상용되는 통상의 살균법에 의하여 수행할 수 있다. 일례로, 알코올 등에 일정 시간동안 침지시킴으로써 살균할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올에 1시간 이상 침지시켜 살균할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이후, 상기 (a) 단계는 남아있는 알코올 용액을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 일례로 인산염 완충식염수(Phosphate buffered saline; PBS)로 2 회 이상 씻어낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
The step of sterilizing the ZnO thin film formed on the cell culture substrate in the step (a) may be performed by a conventional sterilization method commonly used in the art. For example, it can be sterilized by soaking in alcohol or the like for a predetermined time, preferably sterilized by immersion in ethanol for 1 hour or more, but is not limited thereto. Thereafter, the step (a) may further include removing the remaining alcohol solution. For example, the step (a) may be washed twice with phosphate buffered saline (PBS), but is not limited thereto.

상기 (b) 단계에 앞서, 살균된 ZnO 박막 표면을 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin) 등을 포함하는 세포외기질(extracellular matrix protein) 또는 폴리-D/L-라이신(poly-D/L-lysine)과 같은 배양 기재에 대한 세포부착을 돕는 물질로 코팅하는 과정을 추가로 포함할 수 있다. 상기 세포부착을 돕는 물질을 코팅함으로써 신경세포 및 줄기세포(예컨대, 배아줄기세포, 신경줄기세포 등) 등 특정 세포의 부착을 용이하게 할 수 있다.Prior to the step (b), the surface of the sterilized ZnO thin film is treated with an extracellular matrix protein or a poly-D / L-lysine such as laminin, collagen, fibronectin, -D / L-lysine). &Lt; / RTI &gt; By coating the cell adhesion-promoting substance, adhesion of specific cells such as nerve cells and stem cells (for example, embryonic stem cells, neural stem cells, etc.) can be facilitated.

상기 (b) 단계에서 살균된 ZnO 박막의 표면에 코팅되는 혈청은 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 바람직하게는 상기 세포 배양액은 혈청을 5 내지 20 중량%로, 보다 바람직하게는 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The serum coated on the surface of the ZnO thin film sterilized in the step (b) may be Fetal Bovine Serum (FBS), but is not limited thereto. Preferably, the cell culture solution may contain 5 to 20% by weight, more preferably 10% by weight, of serum, but is not limited thereto.

바람직하게는 상기 세포 배양액에는 줄기세포가 특정 세포로 분화(differentiation)되도록 유도하는 물질, 상피세포의 중간엽 세포로의 전환(epithelial mesenchymal transition, EMT)을 유도하는 물질 등과 같은 세포의 이동 유도 물질 등을 포함할 수 있다. 이의 구체적인 예로는 유기화합물, 고분자, 펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 등의 유전자를 모두 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 물질들을 배양액에 추가로 첨가하거나, 혈청을 포함하는 배양액에 특정 세포를 배양한 후 세포를 제거하여 수득한 배양된 세포로부터 분비된 물질을 포함하는 배양액을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Preferably, the cell culture medium contains a substance inducing differentiation of stem cells into specific cells, a cell migration inducer such as a substance inducing epithelial mesenchymal transition (EMT), etc. . &Lt; / RTI &gt; Specific examples thereof include genes such as organic compounds, macromolecules, peptides, proteins, polynucleotides, DNA, and RNA. For example, a culture medium containing the substances secreted from the cultured cells obtained by adding the above substances to the culture medium, or culturing a specific cell in a culture medium containing serum, and then removing the cells may be used .

구체적으로 줄기세포의 특정세포로의 분화 유도 물질은 줄기세포의 종류 및 분화시키려는 특정 세포의 종류에 따라 상이하므로, 당업계에서 분화 유도 물질로 알려진 것이면 제한되지 아니하다.
Specifically, the inducing substance for inducing differentiation of a stem cell into a specific cell differs depending on the kind of a stem cell and a specific cell to be differentiated, and is not limited as long as it is known in the art as a differentiation inducing substance.

한편, 상기 (b) 단계에서 세포 배양액에 침지시켰던 ZnO 박막을 이산화탄소 배양기(CO2 incubator)에서 배양함으로써 ZnO 박막을 세포 배양물질로 코팅할 수 있다. 바람직하게는 상기 배양기에 12시간 이상 인큐베이션할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 결과로 생성된 세포 배양 기재는 세포 배양물질로 코팅되어 세포의 부착배양이 가능한 동시에 ZnO 박막의 두께를 조절함으로써 세포증식의 제어가 가능하므로 증식 조절이 필요한 세포의 배양에 유용하게 사용할 수 있다.
Meanwhile, the ZnO thin film immersed in the cell culture liquid in the step (b) can be coated with a cell culture material by culturing in a CO 2 incubator. Preferably, the incubator can be incubated for 12 hours or more, but is not limited thereto. The resultant cell culture substrate is coated with a cell culture material to enable cell adhesion and culture, and the cell growth can be controlled by controlling the thickness of the ZnO thin film, so that the cell culture substrate can be effectively used for culturing cells that require regulated growth.

본 발명은 본 발명에 따른 세포 배양 기재 상에서 세포를 배양하여 세포의 액틴 스트레스 섬유 발현을 향상시킬 수 있다.The present invention can improve the expression of actin stress fibers in cells by culturing the cells on the cell culture substrate according to the present invention.

상기 액틴은 세포의 이동성, 세포 내 물질수송, 신호전달, 세포 골격유지 및 변화에 따른 세포의 다양한 변형과 탄성을 유지시키는 역할을 한다. 또한 액틴의 발현을 조절함으로써 세포이동 조절, 세포주기 조절을 통한 세포증식 조절, 세포사멸 유도, 세포-세포간 부착 능력 조절, 특정유전자 발현 조절 등을 기대할 수 있다. 특히 전기전도도 증감에 따른 상기 능력의 조절은 암세포의 이동을 제한하는 매커니즘 탐구를 통한 암전이 제어, 암전이 제어 억제제 탐색 및 스크리닝에 필요한 세포 배양 기판 제조, 암세포 사멸을 유도하는 세포주변 미세환경 탐색과 이를 통한 신개념 항암효과 탐색, 줄기세포 분화를 위한 전기적 미세환경 조절 등에 응용할 수 있다.
Actin plays a role in maintaining various deformations and elasticity of cells due to cell mobility, intracellular substance transport, signal transduction, cytoskeletal maintenance and changes. Further, by regulating the expression of actin, regulation of cell migration, regulation of cell proliferation through regulation of cell cycle, induction of apoptosis, regulation of cell-cell adhesion, and regulation of specific gene expression can be expected. In particular, the regulation of the ability according to the increase and decrease of the electric conductivity can be performed by controlling the cancer metastasis through exploring a mechanism for restricting the movement of cancer cells, preparing a cell culture substrate necessary for screening and screening of cancer inhibition inhibitors, It can be applied to discover new concept of anti-cancer effect and to control electric microenvironment for stem cell differentiation.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 배양 기재 상에서 세포를 배양하여 세포의 액틴 재배열을 조절할 수 있다.In addition, the present invention can regulate cell rearrangement by culturing cells on a cell culture substrate according to the present invention.

세포내 액틴 재배열 조절을 통해 액틴 스트레스 섬유 형성을 유도하면 세포의 유연성과 이동성이 떨어지게 되고, 세포주기 속도에 영향을 주어 세포증식 속도를 인위적으로 변화시킬 수 있다. 따라서 이러한 원리는 암세포의 이동성을 연구하고 암전이 매커니즘 탐색 및 암전이 억제제 탐색을 위한 연구와 제품 개발에 사용될 수 있다. 또한 세포주기 속도에 영향을 미치므로 전기전도도 및 액틴 재배열 환경을 암세포 주변에 만들어주어 과도한 부작용없이 암세포 진행속도 조절할 수 있는 차세대 항암치료에 사용할 수 있다. 또한 세포증식 속도를 조절하고 세포의 분화 형태를 유도함으로써 조직재생 및 줄기세포이용 조직 재생의 기능성 세포지지대 및 기판역할을 수행하여 재생의학에도 유용하게 사용될 수 있다.
Induction of actin stress fiber formation through regulation of actin rearrangement in cells leads to decreased cell flexibility and mobility, and can affect cell cycle rate and artificially alter cell proliferation rate. Therefore, these principles can be used to study the mobility of cancer cells and to study the mechanisms of cancer metastasis and to search for inhibitors of cancer metastasis and product development. In addition, it affects the cell cycle rate, so it can be used for the next generation of chemotherapy which can control the progress of cancer cell without excessive side effects by making electric conductivity and actin rearrangement environment around cancer cells. In addition, it regulates the cell proliferation rate and induces the differentiation pattern of the cells, thereby functioning as a functional cell support and substrate for tissue regeneration and regeneration of stem cell utilization tissue, and thus can be useful for regenerative medicine.

게다가, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 배양 기재 상에서 세포를 배양하여 세포 형태 변화를 유도할 수 있다.
In addition, the present invention can induce cell morphology by culturing cells on a cell culture substrate according to the present invention.

나아가, 본 발명은 본 발명에 따라 산화아연(ZnO) 박막을 구비한 세포 배양 기재를 포함한 이식체 또는 피부부착용 패치를 제공한다.Furthermore, the present invention provides an implant or patch for skin attachment including a cell culture substrate having a zinc oxide (ZnO) thin film according to the present invention.

본 발명의 용어, "이식체"는 손상된 부위를 외부로부터 격리하거나 이식된 세포나 분비된 치료 물질이 머물러 있도록 하는 지지체로서, 인체 또는 포유동물에 이식될 수 이는 물질을 의미한다. 이와 같은 이식체는 조직공학용 지지체로서 생분해성을 가지는 합성고분자와 천연재료 등 당업계에 다양하게 사용되는 물질을 제한없이 포함한다.As used herein, the term "implant" refers to a material that can be implanted in a human or mammal, such as a scaffold that isolates a damaged site from the outside or allows the grafted cells or secreted therapeutic material to remain. Such grafts include, without limitation, various materials used in the art such as biodegradable synthetic polymers and natural materials as supports for tissue engineering.

본 발명의 용어, "피부부착용 패치"는 피부에 부착된 상태를 유지할 수 있을 정도의 접착성을 띠는 한 그 재료에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 피부부착용 패치는 ZnO 박막 자체 이외에 지지층, 접착제층, 박리층 등을 추가로 포함할 수 있으나, 상기 구성은 필요에 따라 가감될 수 있다. 상기 각 구성의 재질 등에 대해서는 이후 자세히 설명할 것이다.The term "patch for skin attachment" of the present invention is not limited to the material as long as it has adhesiveness to such an extent that it can maintain the state attached to the skin. The patch for skin attachment according to the present invention may further include a supporting layer, an adhesive layer, a peeling layer and the like in addition to the ZnO thin film itself, but the above configuration may be added or subtracted as necessary. Materials and the like of each of the above structures will be described in detail later.

바람직하게, 이식체 또는 피부부착용 패치로 활용하기 위하여, 상기 세포 배양 기재에서 ZnO 박막이 코팅되는 기재는 생체적합성 고분자 또는 생분해성 고분자로 제조된 기재일 수 있다.Preferably, the substrate coated with the ZnO thin film in the cell culture substrate may be a biocompatible polymer or a substrate made of a biodegradable polymer, for use as a graft or skin patch.

상기 생분해성 고분자의 비제한적인 예로는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리에틸렌글리콜, 폴리트리메틸렌카보네이트, 폴리카프로락톤, 폴리다이옥사논 등이 있다. 또한 생분해성이 아닌 고분자의 비제한적인 예로는 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄 등이 있다.Non-limiting examples of the biodegradable polymer include polylactic acid, polyglycolic acid, poly (lactic-co-glycolic acid), polyethylene glycol, polytrimethylene carbonate, polycaprolactone, polydioxanone and the like. Non-limiting examples of non-biodegradable polymers include polymethyl methacrylate, polyethylene, polytetrafluoroethylene, polyvinyl chloride, polydimethylsiloxane, and polyurethane.

상기 생체적합성 고분자는 생분해성 고분자, 생분해성이 아닌 고분자, 또는 이들의 공중합체일 수 있으며, 2종 이상의 고분자가 혼합되어 있는 블렌드 일수도 있다. 즉, 상기 생체적합성 고분자는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리에틸렌글리콜, 폴리트리메틸렌카보네이트, 폴리카프로락톤, 폴리다이옥사논, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄 및 이들의 공중합체로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.The biocompatible polymer may be a biodegradable polymer, a non-biodegradable polymer, or a copolymer thereof, or may be a blend in which two or more polymers are mixed. That is, the biocompatible polymer may be selected from the group consisting of polylactic acid, polyglycolic acid, poly (lactic-co-glycolic acid), polyethylene glycol, polytrimethylene carbonate, polycaprolactone, polydioxanone, polymethylmethacrylate, Tetrafluoroethylene, polyvinyl chloride, polydimethylsiloxane, polyurethane, and copolymers thereof, but is not limited thereto.

바람직하게, 본 발명에 따른 이식체 또는 패치는 체내 이식시 또는 피부부착시 이물감 및/또는 거부감을 없애고, 자유롭고 자연스러운 움직임이 가능하도록 유연성 있는 기재 상에 ZnO 박막을 코팅하여 제조할 수 있다.Preferably, the implants or patches according to the present invention can be prepared by coating a ZnO thin film on a flexible substrate so that free and natural movement can be achieved by eliminating the sense of foreign body and / or rejection upon transplantation or skin attachment.

또한, 세포의 부착 및 성장을 향상시킬 수 있도록 본 발명에 따른 세포 배양 기재는 ZnO 박막을 혈청으로 추가로 코팅하는 것이 바람직하다.In addition, it is preferable that the cell culture substrate according to the present invention is further coated with the ZnO thin film to improve adhesion and growth of cells.

본 발명에 따른 상기 ZnO 박막을 구비한 세포 배양 기재를 포함한 이식체 또는 피부부착용 패치는 항균 또는 멸균 활성을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 ZnO 박막의 두께에 따라, 세포의 부착 및/또는 증식을 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 목적에 따라 혈청 및/또는 적절한 세포 배양 물질을 코팅한 기재를 사용함으로써 세포의 분화, 이동성 및 형질 등을 조절할 수 있으므로, 조직재생용, 상처치유용 또는 암의 증식 또는 전이 억제용으로 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 ZnO 박막의 두께가 증가할수록 암세포의 부착 및/또는 증식은 감소한다. 따라서, 암세포의 성장 및 증식을 억제하기 위해서는 30 ㎚ 이상의 두꺼운 ZnO 박막을 구비한 세포 배양 기재를 포함하도록 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 세포 배양 기재는 줄기세포의 분화 및 증식을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 이식체 또는 패치는 조직재생용으로 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 세포 배양 기재는 상피세포의 중간엽세포로의 전환 즉, 상피-간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition; EMT)을 유도할 수 있다. 상기 EMT 현상은 상피세포가 세포의 극성 및 세포-세포간 부착성을 잃고 이동성 및 침습성을 획득하여 중간엽세포가 되는 과정을 의미하는 것으로, 상처치유를 유발할 수 있다. 한편, 상기 EMT는 또한 조직의 섬유화나 암 전이의 개시를 유발할 수 있다. 따라서, 목적에 따라 적절한 두께의 ZnO 박막을 구비한 세포 배양 기재를 포함하도록 제조하는 것이 바람직하다. 또는 필요에 따라 적절한 세포 배양 물질을 추가로 코팅시켜 사용할 수 있다.The implant or skin patch including the cell culture substrate having the ZnO thin film according to the present invention may have an antibacterial or sterilizing activity. In addition, it is possible to control adhesion and / or proliferation of cells according to the thickness of the ZnO thin film, and to use the substrate coated with serum and / or a suitable cell culture material according to purposes, It can be used for tissue regeneration, wound healing, or cancer proliferation or inhibition of metastasis. For example, adhesion and / or proliferation of cancer cells decreases as the thickness of the ZnO thin film increases. Therefore, in order to suppress the growth and proliferation of cancer cells, it can be manufactured to include a cell culture substrate having a thick ZnO thin film of 30 nm or more. In addition, the cell culture substrate according to the present invention can control the differentiation and proliferation of stem cells. Therefore, the implants or patches according to the present invention can be usefully used for tissue regeneration. Furthermore, the cell culture substrate according to the present invention can induce the conversion of epithelial cells into mesenchymal cells, that is, epithelial-mesenchymal transition (EMT). The EMT phenomenon refers to a process in which epithelial cells lose cell polarity and cell-cell adhesion and acquire mobility and invasiveness to become mesenchymal cells, which may cause wound healing. On the other hand, the EMT can also cause initiation of fibrosis or cancer metastasis of the tissue. Therefore, it is preferable to prepare a cell culture substrate having a ZnO thin film having an appropriate thickness according to the purpose. Alternatively, a suitable cell culture material may be further coated and used as needed.

본 발명의 패치형 제제는 ZnO 박막을 포함하므로, 이를 손상된 피부, 근육 조직 등에 부착함으로써 상기 피부, 근육 조직 등의 미세한 움직임에도 표면 전하가 유도되어 조직재생을 효과적으로 유도하고 활성화시킬 수 있다.Since the patch-type preparation of the present invention includes a ZnO thin film, the surface charge can be induced even in the minute movements of the skin, muscle tissue and the like by attaching it to damaged skin and muscle tissue, thereby effectively inducing and activating tissue regeneration.

바람직하게 본 발명의 패치형 제제는 세포 배양액에 포함된 줄기세포의 분화 유도 물질과 같은 세포 이동 유도 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 이를 손상된 조직 등에 부착함으로써 조직 재생을 유도하고 활성화시킬 수 있다.
Preferably, the patch-type preparation of the present invention may further contain a cell migration inducing substance such as a stem cell differentiation inducing substance contained in a cell culture solution, and may induce and activate tissue regeneration by attaching the cell migration inducing substance to a damaged tissue or the like.

본 발명에 따른 패치는 경피투여형 제제로서 원자층 증착방식(ALD)에 의해 형성된 ZnO 박막 자체 및 이에 세포의 이동 유도 물질을 포함시켜 제조한 패치일 수 있다.The patch according to the present invention may be a patch prepared by including the ZnO thin film itself formed by atomic layer deposition (ALD) as a transdermal dosage form and a cell migration inducing substance.

본 발명에 따른 패치는 상기 ZnO 박막 자체 및 이에 세포의 이동 유도 물질을 포함한 제제 본체 이외에 지지층, 접착제층, 박리층 등으로 구성될 수 있으며, 수지 필름 등과 같은 포장재로 제조된 패키지 내에 담아 제공될 수 있다. 상기 지지층으로는 구체적으로 부직포를 사용할 수 있고, 접착층에 사용되는 접착물질로는 굳기 정도에 따라 고체 타입과 반고체 타입을 사용할 수 있는데, 구체적으로 고체 타입의 접착물질로는 내셔널스타치사의 듀로탁(Duro-Tak)을 사용할 수 있고, 반고체 타입은 친수성 고분자 겔(hydrogel)을 사용할 수 있다. 그리고, 박리층은 실리콘수지가 도포된 폴리에틸렌을 사용할 수 있다. 다만, 본 발명의 패치형 제제의 구성은 상기 예에 제한되지 않는다.
The patch according to the present invention may be constituted of a supporting layer, an adhesive layer, a peeling layer and the like in addition to the main body including the ZnO thin film itself and the cell migration inducing substance, and may be provided in a package made of a packaging material such as a resin film have. As the supporting layer, a nonwoven fabric may be used. As the adhesive material used for the adhesive layer, a solid type or a semi-solid type may be used depending on the degree of hardness. Specific examples of the solid type adhesive material include Duolotak Duro-Tak) can be used, and as the semi-solid type, a hydrophilic polymer gel (hydrogel) can be used. The release layer may be made of polyethylene coated with a silicone resin. However, the constitution of the patch-type preparation of the present invention is not limited to the above examples.

나아가, 본 발명에 따른 세포 배양 기재는 항암치료제의 스크리닝에 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 세포 배양 기재 상에서 암세포를 배양하는 제1단계; 상기 제1단계 이전, 중간 또는 이후에 항암치료 후보물질을 처리하는 제2단계; 및 상기 항암치료 후보물질 처리 전과 후의 암세포에서의 변화를 확인하여 항암치료제를 선별하는 제3단계를 수행하여 항암치료 후보물질로부터 항암치료제를 스크리닝하여 선별할 수 있다.
Furthermore, the cell culture substrate according to the present invention can be used for screening of an anticancer therapeutic agent. Specifically, a first step of culturing cancer cells on the cell culture substrate; A second step of treating an anticancer therapy candidate substance before, during or after the first step; And a third step of selecting a chemotherapeutic agent by confirming the change in the cancer cells before and after the treatment with the chemotherapeutic candidate, and screening for the chemotherapeutic agent from the candidate chemotherapeutic agent can be selected.

본 발명의 세포 배양 기재에 구비된 산화아연(ZnO) 박막은 원자층 증착방식(ALD)에 의해 제조된 것으로서, 나노미터 단위로 미세하게 조절할 수 있다. 또한, 상기 ZnO 박막의 표면 상에서 세포를 배양함으로써 인위적으로 세포 증식 속도를 조절할 수 있으므로, 증식이 필요한 세포의 증식 증가와 증식이 불필요한 세포의 증식 억제를 통한 치료적 활용이 가능하다.The zinc oxide (ZnO) thin film provided in the cell culture substrate of the present invention is prepared by atomic layer deposition (ALD), and can be finely adjusted in nanometer scale. In addition, since the cell growth rate can be controlled by artificially culturing the cells on the surface of the ZnO thin film, it is possible to utilize therapeutically by increasing the proliferation of cells requiring proliferation and inhibiting proliferation of cells that do not require proliferation.

또한, 상기 ZnO 박막 두께의 미세제어 기술과 그에 따른 전기적 특성 제어 및 동물세포 배양 가능한 혈청코팅 방법을 응용하여 패치 제제로 제작될 경우, 줄기세포 분화와 이식을 통한 손상된 세포와 조직의 재생을 유도할 수 있어 재생의학 분야에 활용도가 크다.In addition, when the micropatterning technique of the ZnO thin film thickness, the electrical characteristic control thereof and the serum coating method capable of culturing animal cells are applied, it is possible to induce regeneration of damaged cells and tissues through stem cell differentiation and transplantation And it is highly utilized in the field of regenerative medicine.

또한 ZnO은 그 증착 방법 및 구조에 따라 다양한 전기적 특성이 제어된 박막을 만들 수 있으며, 생친화성 물질이면서 항균효과도 큰 것으로 알려져 있어, 상처, 손상된 피부, 근육 조직 재생에 있어 패치 형태의 신소재 의약품으로 개발할 수 있다.
In addition, ZnO is a biocompatible material with a wide range of electrical properties controlled according to its deposition method and structure. It is also known to have a high antimicrobial effect. It is a new drug substance in patch form for wound, damaged skin and muscle tissue regeneration. Can be developed.

도 1은 교아종 세포에서의 전하 운반체 밀도의 영향을 나타낸 도이다. 유리 기판상의 ZnO 박막의 두께에 따라 전기전도도가 조절됨을 보여준다. ZnO 박막의 두께가 두꺼울수록(도 1에서 분홍색에서 붉은색으로 갈수록) 전하 운반체의 밀도가 높아지고, 또한 해당 배양용기에서 배양한 세포의 액틴 스트레스 섬유가 증가함을 보여준다.
도 2a는 원자층 증착방식(ALD)을 사용하여 산화아연(ZnO) 박막을 제조하는 모식도이다. 도 2b는 ZnO 박막의 ALD 사이클 수에 따른 전기전도도(conductivity) 및 저항률(resistivity)의 변화를 나타낸 도이다.
도 3a는 세포배양을 위한 ZnO 박막에 표면처리 과정을 개략적으로 나타낸 도이다. 먼저 에탄올로 살균한 후 인산완충염용액(PBS)으로 세척(좌측)하고, 소태아혈청(FBS)을 함유하는 동물세포 배양배지를 처리하고 전 인큐베이션하여 표면처리(가운데)한 후, 세포를 분주하고 일반적인 세포배양방법을 이용하여 세포를 배양(오른쪽)한다.
도 3b 및 3c는 각각 ZnO 박막 코팅을 위한 ALD 사이클 수 및 상기 혈청 무처리 및 혈청 코팅 ZnO 박막 상에서 배양한 세포의 상태를 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3d는 ZnO 박막의 ALD 사이클 수에 따른 뇌종양 세포주 SF295의 상대적 세포증식율을 OD로 측정하여 나타낸 도이다.
도 3e는 ZnO 박막의 ALD 사이클 수에 따른 뇌종양 세포주 SF295의 세포생존율을 나타낸 도(아래)이다. 특히, ROS에 대한 세포생존율을 나타낸다. 이는 ZnO 박막 표면에서 배출된 Zn 이온이 세포 내부의 ROS 억제에 관여하는 단백질에 영향을 주고 그 활성을 저해하여 세포의 ROS 보호 시스템을 무력화시키는지 여부에 대한 결과를 보여주는 것으로서, Zn 이온의 양이 ROS 독성을 유발시킬 정도로 많지 않음을 확인하였다. 구체적으로, ZnO 박막을 혈청을 포함하는 세포 배양배지에 넣어두고 Zn 이온이 방출되도록 유도한 후, 배지를 회수하여 SF295 세포에 처리하여 세포독성 여부를 확인하였다(위).
도 4는 ZnO 박막의 각 ALD 사이클 수에 따른 시간대별 세포의 수를 셈하여 세포가 증식하는 속도를 나타낸 도이다. 250 사이클 이전에는 지수곡선(exponential curve)의 형태로 세포 수가 증가하였으나, 250 사이클을 초과하면 선형 곡선(linear curve)의 형태로 증가함을 확인하였다.
도 5는 뇌종양 세포주 SF295를 혈청 처리한 ZnO 박막에 두께별로 7일간 배양한 후 시간대 별로 세포의 수를 셈한 결과를 상대적인 생존율로 나타낸 도이다. ZnO 박막의 두께가 얇을수록 세포의 증식속도가 빨리지고, 두께가 두꺼워질수록 세포의 증식속도가 감소함을 확인하였다.
도 6a는 ZnO 박막의 ALD 사이클 수에 따른 액틴 염색의 결과를 나타내는 도이다. 250, 500 사이클에서 액틴이 정렬하여 액틴 스트레스 섬유를 강하게 형성한 것을 볼 수 있고, 이것은 박막의 표면에서 강력하게 유도되는 전하의 영향을 의미한다.
도 6b는 ZnO 박막의 ALD 사이클 수에 따른 EdU 어세이의 결과를 나타낸 도이다. 좌측은 Hoechst 33342 형광염료를 사용하여 세포핵을 염색(파란색)한 이미지와 EdU 염색(녹색) 이미지를 중첩시켰으며, 우측은 EdU 어세이로 증식하고 있는 세포의 염색체를 구성하는 DNA만을 특이적으로 염색한 이미지이다. 특히, EdU에 결합한 DNA는 세포주기상 S 단계에 있는 것으로 판단할 수 있다.
도 6c는 ZnO 박막의 ALD 사이클 수에 따른 EdU 결합율을 나타낸 도이다. 일반 유리 상에서 배양한 세포에 비해 최대 20% 이상 EdU 결합율의 차이를 나타내었으며(500 사이클 ZnO 박막), 이는 ZnO 박막 두께에 따른 세포증식속도 차이가 있음을 나타내는 것이다.
도 7은 혈청 코팅된 ZnO 박막의 ALD 사이클 수에 따른 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)의 배양상태를 현미경으로 관찰하여 나타낸 도이다.Figure 1 is a graph showing the effect of charge carrier density on syngeneic cells. The electrical conductivity is controlled by the thickness of the ZnO thin film on the glass substrate. The thicker the ZnO thin film (from pink to red in FIG. 1), the higher the charge carrier density and the increased actin stress fibers in the cultured cells.
FIG. 2A is a schematic diagram for preparing a zinc oxide (ZnO) thin film using atomic layer deposition (ALD). FIG. 2B is a diagram showing the change of electrical conductivity and resistivity according to the number of ALD cycles of the ZnO thin film.
3A is a schematic view illustrating a surface treatment process of a ZnO thin film for cell culture. First, the cells were sterilized with ethanol, washed with phosphate buffered saline (PBS) (left), treated with an animal cell culture medium containing fetal bovine serum (FBS), subjected to surface treatment (middle) And cultivate the cells using the usual cell culture method (right).
FIGS. 3B and 3C are photographs of the ALD cycle number for ZnO thin film coating and the state of the cells cultured on the serum-free and serum-coated ZnO thin film, respectively, by a microscope.
FIG. 3D is a graph showing the relative cell proliferation rate of the brain tumor cell line SF295 measured by OD according to the number of ALD cycles of the ZnO thin film.
3E is a graph showing the cell survival rate of the brain tumor cell line SF295 according to the number of ALD cycles of the ZnO thin film. In particular, it represents the cell survival rate for ROS. This indicates that the Zn ions released from the surface of ZnO thin film affect the proteins involved in ROS inhibition inside the cell and inhibit the activity of the cells to neutralize the ROS protection system of the cells. But not enough to cause ROS toxicity. Specifically, the ZnO thin film was placed in a cell culture medium containing serum to induce release of Zn ions, and the medium was recovered and treated with SF295 cells to confirm cytotoxicity (Above).
FIG. 4 is a graph showing the rate of cell proliferation by counting the number of cells per time period according to the number of ALD cycles of the ZnO thin film. It was confirmed that the number of cells increased in the form of an exponential curve before 250 cycles, but increased in the form of a linear curve in the case of exceeding 250 cycles.
FIG. 5 is a graph showing the relative survival rate of the brain tumor cell line SF295 after counting the number of cells per time zone after culturing the serum-treated ZnO thin film for 7 days. The thinner the ZnO thin film, the faster the cell growth rate, and the thinner the thickness, the smaller the cell growth rate.
6A is a graph showing the results of actin staining according to the number of ALD cycles of a ZnO thin film. At 250 and 500 cycles, the actin aligns to form strongly actin stress fibers, which means the effect of strongly induced charge on the surface of the film.
6B is a graph showing the results of the EdU assay according to the number of ALD cycles of the ZnO thin film. On the left, Hoechst 33342 fluorescent dye was used to superimpose the image of the nucleus (blue) and the image of the EdU staining (green). On the right side, only the DNA constituting the chromosome of the cell proliferating with the EdU assay was specifically stained It is an image. In particular, the DNA bound to EdU can be judged to be in the step S of the cell line.
6C is a diagram showing the EdU binding ratio according to the number of ALD cycles of the ZnO thin film. The EDU binding rate was up to 20% (500 cycles ZnO thin film) compared to the cells cultured on plain glass, indicating that there is a difference in cell proliferation rate according to the ZnO thin film thickness.
FIG. 7 is a microscopic view showing the cultivation state of mesenchymal stem cells according to the number of ALD cycles of the serum-coated ZnO thin film. FIG.

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically in the following examples. However, these examples are provided only to aid understanding of the present invention, and the present invention is not limited thereto.

실시예Example 1:  One: 원자층Atomic layer 증착방식(ALD)에Deposition method (ALD) 의한 두께 조절가능한  Thickness adjustable ZnOZnO 박막 제조 Thin film manufacturing

실리콘 산화막이 100 ㎚ 형성되어 있는 실리콘 기판을 챔버 내에 투입하여 위치시켰다. 상기 기판 상에, 원자층 증착방식을 이용하여 박막 매트릭스 원자층을 적층함으로써 ZnO 단일박막을 제조하였다. 박막 매트릭스 전구체인 디에틸아연(DEZ)과 수증기를 교차 펄스로 주입하여 사이클을 50회 내지 500회 반복 수행함으로써, 총 두께 7 ㎚ 내지 93 ㎚의 ZnO 단일박막을 제조하였다.
A silicon substrate having a silicon oxide film of 100 nm formed therein was placed in the chamber. A ZnO single thin film was prepared by laminating a thin film matrix atom layer on the substrate using an atomic layer deposition method. A single thin film of ZnO having a total thickness of 7 nm to 93 nm was prepared by repeating the cycle 50 to 500 times by injecting diethylzinc (DEZ), which is a precursor of the thin film matrix, and water vapor as crossed pulses.

실험예Experimental Example 1:  One: ZnOZnO 박막 두께에 따른 전기전도도 분석 Electrical Conductivity Analysis by Thin Film Thickness

원자층 증착방식(ALD)에 의하여 제조된 ZnO 박막의 두께에 따른 전기적 특성을 관찰하기 위하여, 각각 사이클 수를 다르게 한 상기 실시예의 ALD ZnO 박막의 전기전도도를 측정하였다.In order to observe the electrical characteristics according to the thickness of the ZnO thin film produced by the ALD method, the electrical conductivity of the ALD ZnO thin film of the above example in which the number of cycles was different was measured.

그 결과, ⅰ) 박막이 얇은 경우, 예컨대 18 ㎚ 미만인 경우, 박막의 전도도는 절연체에 가까울 정도로 상당히 낮았다. ⅱ) 반면, 중간 정도의 두께 예컨대, 18 ㎚ 내지 25 ㎚인 경우에서는 온화한 전도도와 함께 반도체적 성질을 보였으며, ⅲ) 25 ㎚를 초과하는 두께의 두꺼운 박막은 겉보기에도 금속으로 보이고, 전극으로서 역할을 수행할 수 있을 만큼의 충분이 큰 전도도를 가짐을 확인하였다(도 2b).
As a result, i) when the thin film is thin, for example, less than 18 nm, the conductivity of the thin film is considerably low as close to the insulator. Ii) On the other hand, in the case of a medium thickness, for example, 18 to 25 nm, the semiconductor exhibited a mild conductivity, and iii) the thick film having a thickness exceeding 25 nm seemed to be a metal, (Fig. 2B). &Lt; tb &gt;&lt; TABLE &gt;

실험예Experimental Example 2:  2: ZnOZnO 박막 두께에 따른 세포의 증식속도 분석 Analysis of Cell Growth Rate by Thin Film Thickness

실험예Experimental Example 2-1:  2-1: ZnOZnO 박막 두께에 따른  Thin film thickness 세포증식율Cell proliferation rate (( cellcell proliferationproliferation raterate ) 분석) analysis

원자층 증착방식(ALD)에 의하여 제조된 ZnO 박막의 두께에 따른 세포의 증식속도 변화를 관찰하기 위하여, 각각 사이클 수를 다르게 한 상기 실시예의 ALD ZnO 박막에서 일정기간 세포를 배양하여 세포 증식율을 측정하였다. 구체적으로는 뇌종양 세포주 SF295를 혈청을 처리한 상기 실시예의 두께가 상이한 ZnO 박막에 장시간(약 7일, 140시간) 배양하면서, 각 시간대 별로 세포의 수를 측정하였다.In order to observe the changes in the growth rate of cells according to the thickness of the ZnO thin film produced by the atomic layer deposition (ALD) method, the cells were cultured for a certain period of time in the ALD ZnO thin films of the above- Respectively. Specifically, the brain tumor cell line SF295 was cultured for a long time (about 7 days, 140 hours) in ZnO thin films having different thicknesses of the above-mentioned sera treated cells, and the number of cells was measured at each time period.

세포 배양에 앞서, ZnO 박막 표면을 FBS를 포함하는 배양배지로 처리하여 전 인큐베이션하고 뇌종양 세포주인 SF295 세포의 본 배양을 수행하였다(도 3a). 상기 혈청 처리군에서의 세포배양상태(도 3c)를 현미경으로 관찰하고, 혈청 무처리군(도 3b)과 비교하여 나타내었다.Prior to cell culture, the surface of the ZnO thin film was treated with a culture medium containing FBS to preincubate and the main culture of SF295 cells as a brain tumor cell line was performed (Fig. 3A). The cell culture condition (FIG. 3c) in the serum treatment group was observed under a microscope and compared with the serum treatment group (FIG. 3b).

그 결과, 약 50 내지 200 사이클에 의해 제조된 ALD ZnO 박막에서 배양된 세포의 수는 지수 곡선(exponential curve)으로 그려지는 반면, 250 내지 500 사이클에 의해 제조된 ALD ZnO 박막에서 배양된 세포의 수는 선형 곡선(linear curve)으로 그려짐을 확인하였다(도 4). 즉, ALD 사이클 수가 증가함에 따라 ZnO 박막의 두께가 두꺼워질수록 박막의 표면 상에서 배양되는 세포의 증식속도는 감소함을 확인하였다. 상기 세포 배양 기재에 대한 최적화 곡선에 대한 정보를 하기 표 1에 나타내었다.As a result, while the number of cells cultured in the ALD ZnO thin film produced by about 50 to 200 cycles was plotted as an exponential curve, the number of cells cultured in the ALD ZnO thin film produced by 250 to 500 cycles Was plotted as a linear curve (Fig. 4). That is, as the number of ALD cycles increases, the growth rate of the cells cultured on the surface of the thin film decreases as the thickness of the ZnO thin film increases. Information on the optimization curve for the cell culture substrate is shown in Table 1 below.

또한, 상기 결과를 다양한 두께의 ALD ZnO 박막에서 동일한 시간동안 배양된 세포수로 플롯하여 도 5에 나타내었다. 그 결과, 배양 초기에는 ZnO 박막층의 두께에 따른 세포증식에 대한 효과가 미미하였으나, 배양시간이 증가함에 따라 ZnO 박막층의 두께에 따른 세포증식에 대한 효과가 현저히 차이나기 시작하였다.
In addition, the above results are plotted in the number of cultured cells for the same time in the ALD ZnO thin films of various thicknesses and are shown in FIG. As a result, the effect on the cell proliferation by the thickness of the ZnO thin film layer was small at the initial stage of culture, but the effect of the thickness of the ZnO thin film layer on the cell proliferation began to vary significantly as the incubation time increased.

나아가, 상기 세포증식율의 증가가 ZnO 박막의 독성에 의한 세포사멸에 의한 것이 아님을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로 ZnO 박막을 포함하는 세포 배양 기재에 세포를 포함하지 않은 것을 제외하고는 상기와 동일한 조건으로 SF295 세포 배양배지에 담가 7일간 인큐베이션하였다. 이로부터 수거한 배지를 배양배지로 이용하여 상기한 조건으로 SF295 세포를 배양하고 세포생존율을 확인하였다. 상기 실험의 구성 및 측정한 세포생존율을 도 3e에 나타내었다.Further, in order to confirm that the increase of the cell proliferation rate is not caused by apoptosis caused by the toxicity of the ZnO thin film, the following experiment was conducted. Specifically, except that the cells were not included in the cell culture substrate containing the ZnO thin film, the cells were incubated in the SF295 cell culture medium for 7 days under the same conditions as above. SF295 cells were cultured under the conditions described above using the medium collected from the culture medium as a culture medium, and cell viability was confirmed. The composition of the experiment and the measured cell viability are shown in FIG. 3E.

도 3e에 나타난 바와 같이, ZnO 박막 두께에 무관하게 90% 이상의 세포생존율을 나타내었다. 이는 ZnO 박막이 세포 비독성 물질이며, 상기 ZnO 박막으로부터 배출될 수 있는 이온에 의한 세포독성이 없음을 나타내는 것으로, 이는 상기 세포증식율의 감소가 세포독성에 의한 세포사멸의 결과가 아니며, ZnO 박막에 의해 조절된 세포증식에 의한 것임을 나타내는 바이다.
As shown in FIG. 3E, the cell viability was 90% or more regardless of the thickness of the ZnO thin film. This indicates that the ZnO thin film is a cell non-toxic substance and has no cytotoxicity due to ions that can be emitted from the ZnO thin film. This is because the reduction of the cell growth rate is not a result of cell death due to cytotoxicity, Lt; RTI ID = 0.0 &gt; regulated &lt; / RTI &gt; cell proliferation.

실험예Experimental Example 2-2:  2-2: ZnOZnO 박막 두께에 따른 세포 형태( Cell shape by thin film thickness ( morphologymorphology ) 분석) analysis

원자층 증착방식(ALD)에 의하여 제조된 ZnO 박막의 두께에 따른 세포 골격의 변화를 관찰하기 위하여, F-액틴-특이적 결합 펩타이드인 팔로이딘(Phalloidin)을 사용하여, PFA(polymeric filametous actin)인 F-액틴을 형광염색하였다. 특히 세포 골격에 있어 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber)의 형성 정도에 따라 세포 형태 변화 및 표면에 대한 세포의 부착성을 확인할 수 있으므로, 액틴 스트레스 섬유 형성의 증가여부를 중점적으로 확인하였다.In order to observe the change of the cytoskeleton according to the thickness of the ZnO thin film produced by the atomic layer deposition (ALD) method, P-actin-specific binding peptide, Phalloidin, was used and PFA (polymeric filametous actin) Gt; F-actin &lt; / RTI &gt; was fluorescently stained. Especially, the increase of actin stress fiber formation was emphasized because the change of cell morphology and cell adhesion to the surface can be confirmed by the degree of formation of actin stress fiber in the cytoskeleton.

그 결과, ZnO 박막의 두께에 따라 SF295 세포의 형태가 변화됨을 관찰하였다. 구체적으로, ZnO 박막의 두께가 증가함에 따라 박막의 표면상의 세포 내의 액틴 재배열(actin rearrangement)이 촉진되어, 액틴 스트레스 섬유의 형성이 증가하였고, 이에 따라 박막 표면상의 세포의 형태가 길쭉하게 펼쳐진 형태로 변형됨을 확인하였다(도 6a). 전기전도도의 크기에 따라 액틴 스트레스 섬유의 형성이 증가함을 고려할 때, ZnO 박막의 두께가 증가함에 따라 함께 증가된 전기전도도에 의해 ZnO 박막 표면 상의 세포의 액틴 재배열이 조절되어, 세포 형태의 변화 및 표면에 대한 감소되었던 세포 부착력의 복원을 이끌어 냄을 확인하였다.
As a result, it was observed that the shape of SF295 cells was changed according to the thickness of the ZnO thin film. Specifically, actin rearrangement in the cells on the surface of the thin film is promoted as the thickness of the ZnO thin film is increased, so that the formation of actin stress fibers is increased. As a result, the shape of the cells on the surface of the thin film is elongated (Fig. 6A). Considering that the formation of actin stress fibers increases with the magnitude of electric conductivity, actin rearrangement of cells on the surface of ZnO thin film is controlled by increased electrical conductivity as the thickness of ZnO thin film increases, And restoration of reduced cell adhesion to the surface.

실험예Experimental Example 2-3:  2-3: EdUEdU -형광염색 기법에 의한 - by fluorescence staining technique ZnOZnO 박막 두께에 따른 세포의 증식률 분석 Analysis of cell proliferation by thin film thickness

ZnO 박막 두께에 따른 세포 증식의 변화를 관찰하기 위하여, 비-방사선 티미딘(thymidine) 유도체인 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 형광염색 기법을 사용하였다. EdU는 증식 중인 세포 내의 이중나선 DNA에 손쉽게 결합할 수 있으며, EdU가 결합된 DNA는 Cu⁺ 에 의해 촉매되는 DNA의 말단 알카인기(terminal alkyne group)와 Alexa Flour azide 반응으로 관찰 가능하다. 이를 이용하여, 세포 내로의 EdU를 1시간 동안 펄스처리한 후, 24시간 배양하였고, 그 후 구리-촉매 반응(copper-catalyzed reaction)에 의해 염색된 초기의(nascent) DNA를 분석하였다.5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) fluorescence staining technique was used to observe the change of cell proliferation according to the thickness of ZnO thin film. EdU can easily bind to double helix DNA in proliferating cells, and EdU-bound DNA can be observed with the terminal alkyne group of DNA catalyzed by Cu ⁺ and Alexa Flour azide reaction. Using this, EdU into cells was pulsed for 1 hour, then incubated for 24 hours, and then analyzed for nascent DNA stained by copper-catalyzed reaction.

그 결과, ALD의 사이클 수가 증가하여 형성된 ZnO 박막이 두꺼워질수록 EdU 양성 세포 비율을 상당히 감소시키는 것을 관찰하였다. 특히 500 사이클에 의해 제조된 ALD ZnO 박막은 유리 플레이트에서 배양된 경우에 비해 EdU 양성 세포의 비율을 약 25% 감소시켰다(도 6b 및 도 6c). 이러한 결과는 ZnO 박막의 두께와 이에 의한 전기전도도는 세포주기와 관련있는 것으로 알려진 액틴 스트레스 섬유 형성을 유도하여 세포 증식에 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 이는 교아종 세포에서 항암 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
As a result, it was observed that the thicker the ZnO thin film formed by increasing the cycle number of ALD, the more the EdU positive cell ratio was reduced. In particular, ALD ZnO thin films prepared by 500 cycles reduced the proportion of EdU positive cells by about 25% compared to those cultured on glass plates (Fig. 6b and Fig. 6c). These results suggest that the thickness of ZnO thin film and its electrical conductivity affect the cell proliferation induced by actin stress fiber formation, which is known to be related to the cell cycle, do.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described examples are illustrative in all aspects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention, rather than the above detailed description, as well as all changes or modifications derived from the meaning and scope of the appended claims and their equivalents.

Claims (24)

1) 원자층 증착방식(atomic layer deposition, ALD)의 사이클 수에 따라 세포 배양 기재 상의 산화아연(ZnO) 박막의 두께를 조절하는 단계; 및
2) 상기 두께가 조절된 산화아연 박막을 구비한 세포 배양 기재 상에서 분리된 암세포, 체세포, 줄기세포 및 섬유아세포로 구성된 군으로부터 선택되는 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는, 동물세포의 세포 증식 속도를 조절하는 방법으로서,
배양된 세포의 생존율이 90% 이상으로 유지되면서 세포 증식 속도만이 조절되는 것을 특징으로 하는, 방법.
1) adjusting the thickness of the zinc oxide (ZnO) thin film on the cell culture substrate according to the number of cycles of atomic layer deposition (ALD); And
2) culturing an animal cell selected from the group consisting of cancer cells, somatic cells, stem cells and fibroblasts isolated on the cell culture substrate having the zinc oxide thin film with the thickness controlled, / RTI &gt;
Characterized in that the cell growth rate is regulated only while the survival rate of the cultured cells is maintained above 90%.
제1항에 있어서,
상기 세포 배양 기재는 혈청 또는 알부민, 성장인자 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생체물질이 추가로 코팅된 것인, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the cell culture substrate is further coated with at least one biomaterial selected from the group consisting of serum or albumin, growth factors, and antibodies.
제1항에 있어서,
상기 1) 단계에서 산화아연 박막의 두께를 45 nm 내지 100 nm로 조절함으로써 산화아연 박막을 구비하지 않은 기재 상에서 배양하는 것에 비해 세포 증식 속도를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the rate of cell proliferation is reduced as compared to culturing on a substrate without a zinc oxide thin film by controlling the thickness of the zinc oxide thin film to 45 nm to 100 nm in the step 1).
제1항에 있어서,
상기 1) 단계에서 산화아연 박막의 두께를 7 nm 내지 25 nm로 조절함으로써 세포 증식 속도를 유지시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the cell growth rate is maintained by adjusting the thickness of the zinc oxide thin film to 7 nm to 25 nm in the step 1).
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 세포 배양 기재는 암전이 또는 암세포의 증식을 억제하는 것인, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said cell culture substrate suppresses the proliferation of cancer metastasis or cancer cells.
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