KR101647804B1 - 신규 세포투과 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 세포투과 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 적은 수의 아미노산(구체적으로는, 4개의 아미노산)으로 구성되며 소수성 아미노산의 비중이 높아 분해 효소에 의해 잘 분해되지 않고 우수한 세포투과성을 가진다. 또한, 본 발명의 펩타이드의 양 말단, 특히 C-말단에 목적 카르고와 결합되어 상기 목적 카르고(예컨대, siRNA)를 안정적이고 효과적으로 세포 내(세포질)로 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약물전달체, 그리고 이를 이용하는 목적 카르고의 전달방법 및 조성물은 질병 또는 질환의 치료, 특정 세포의 검출, 질병(예컨대, 암)의 진단, 특정 세포의 위치 추적 및 인 비보 이미징, 등에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 세포투과 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
짧은 간섭 RNA(Small interfering RNAs, siRNAs)는 특정 유전자를 선택적으로 조절할 수 있어 잠재적인 치료 능력을 지니고 있다. RNA 간섭(RNAi)은 유전자 발현을 억제하는 대표적인 방법이다. 두 가닥의 siRNA를 투여했을 때 RNA-유도된 사일런싱 복합체를 이루어 아고너트 2(argonaute 2)로부터 분해되는 과정을 거친다. siRNA는 대략 19-23 bp의 길이로 DNA보다 짧은 서열을 지니고 있고 양이온성 물질과 강하게 결합할 수 있다. 하지만, siRNA를 포함한 핵산 약물은 세포 투과도가 낮아 특정세포나 조직에 전달하는 방법이 개선되어야하며 안정성 문제가 있다. 이러한 핵산 약물이 세포에 투과되는 방법은 엔도사이토시스를 통해 유입이 되지만, 리소좀 효소들에 의해 분해되어 제 기능을 발휘하기 어렵다. 리소좀에서 분해되지 않기 위해 엔도좀에서 리소좀으로 핵산 약물이 이동되기 전에 세포질로 나오는 실험방법이 제시되고 있다.
핵산 약물을 세포 내에 전달하기 위해 다양한 벡터들이 제시되고 있는데, 예를 들어 폴리머, 리포좀, 그리고 바이러스 유래 벡터가 있다. 비-바이러스계 벡터는 바이러스계 벡터에 비해 세포투과 능력이 떨어지지만, 바이러스계의 벡터들의 면역원성과 병원성에서 자유로울 수 있는 장점이 있다. 비-바이러스계 벡터들의 낮은 세포투과 능력을 개선시킨다면 좋은 약물전달체로 발전할 수 있을 것이다.
비-바이러스계에 새로운 접근방법으로 다양한 바이오 활성 분자들을 세포 내로 투과하는 펩타이드, 즉 세포투과 펩타이드(cell penetrating peptides, CPPs)를 사용하기 시작했다. CPP는 5-30개의 아미노산 서열로 이루어져 있고, 투과하고자 하는 분자와의 융합이 간편하고 안정적이며 융합 분자에 영향을 끼치지 않아 각광받고 있다. 따라서 CPP를 이용하여 siRNA와 같은 유전자를 전달하는데 유용하다고 할 수 있다. CPP 계열 중 HIV에서 유래된 TAT 단백질 중 48-60번 아미노산 서열이 세포투과 서열을 가지고 있다고 가장 처음 알려졌고, 다양한 분자들을 세포 내에 전달할 수 있었다. 이후 세포 내 투과 과정이 밝혀지면서 음적 전하를 띠는 세포막에 잘 붙어 세포 내로 전달하기 위한 양이온이 많은 서열들이 제조되기 시작했다. 대표적으로 아르기닌(arginine), 라이신(lysine), 그리고 히스티딘(histidine)과 같은 아미노산을 이용한 합성 CPP가 만들어졌었다. CPP는 짧게는 5개, 길게는 30개 이상의 아미노산 서열로 이뤄져있는데 길이가 긴 CPP일수록 단백질 분해효소나 펩타이드 분해효소에 의해 절단되는 경우가 많고 특히 양전하를 띠는 서열(아르기닌, 라이신, 히스티딘)을 많이 함유할수록 더 많은 분해가 된다고 보고되고 있다.
현재까지 알려진 CPP는 크게 3가지로 나뉠 수 있다: (i) 양친매성 펩타이드(transportan, pep-1, MPG, pVEC, MAP, CADY); (ii) 양이온 펩타이드(polyarginine, TAT, penetratin, P22N); 및 (iii) 소수성 펩타이드(K-FGF, C105Y). 양친매성과 양이온 펩타이드는 많이 알려져 있는 반면 소수성 펩타이드는 서열들의 합성으로 인위적으로 만들어진 것이 아니어서 현재까지 알려져 있는 펩타이드가 매우 적다. CPP는 생물학적 분자들이 통과하지 못하는 세포투과를 할 수 있는데 이는 세포막의 글라이코사미노글라이칸(glycosaminoglycan, GAG)을 통해 세포 내로 들어갈 수 있으며 또한 엔도사이토시스 경로를 통해 유입될 수 있다. CPP와 생물학적 물질(예컨대, siRNA, 핵산, 작은 분자, 단백질, 세포독성 약물, 이미징제, 등) 간의 결합이 다양한 범위에서 이루어지고 있다. 기존의 전달체(예컨대, 리포좀, 폴리머, 등)보다 CPP의 중요한 장점은 치료 목적이나 진단용으로 세포 내에 전달하고자 할 때 낮은 독성과 치료에 대한 면역거부반응이 적고, 고농도의 처리 방법에 따른 문제점을 단계적인 처리기법으로 개선할 수 있는 이점을 지니고 있다.
이에 따라, 임상에서 사용되는 CPP는 극히 드물고 바이러스에서 유래된 CPP의 경우 면역반응에 영향을 미치는 등의 문제점을 지니고 있어, 바이러스에서 유래되지 않으면서 전달효율이 높은 전달체 발굴이 당업계에서 시급히 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 목적 카르고(cargo of interest)를 세포 내로 전달할 수 있는 보다 효율적인 펩타이드 및 이를 이용한 약물전달체(drug delivery system)를 개발하고자 노력한 결과, 인간 아넥신 단백질로부터 유래된 4개의 아미노산으로 이루어진 신규한 세포투과 펩타이드를 동정하였고, 상기 펩타이드가 주로 소수성 아미노산으로 구성하며 목적 운반 카르고(예컨대, siRNA 같은 약물)의 세포 내 전달에 효율적으로 적용(구체적으로는, 본 발명의 펩타이드와 융합된 siGFP)될 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포투과 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 세포투과 펩타이드를 포함하는 약물전달체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적 카르고의 세포 내 전달 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적 카르고 운반용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적 카르고의 트랜스펙션 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 세포투과 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 세포투과 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 세포투과 펩타이드; (b) 상기 펩타이드에 결합된 목적 카르고(cargo of interest)를 포함하는 약물전달체(drug delivery system)를 제공한다.
본 발명자들은 목적 카르고를 세포 내로 전달할 수 있는 보다 효율적인 펩타이드 및 이를 이용한 약물전달체를 개발하고자 노력한 결과, 인간 아넥신 단백질로부터 유래된 4개의 아미노산으로 이루어진 신규한 세포투과 펩타이드를 동정하였고, 상기 펩타이드가 주로 소수성 아미노산으로 구성하며 목적 운반 카르고(예컨대, siRNA 같은 약물)의 세포 내 전달에 효율적으로 적용(구체적으로는, 본 발명의 펩타이드와 융합된 siGFP)될 수 있다는 것을 확인하였다.
세포투과 펩타이드가 세포 내로 전달될 때에는 세포 표면의 프로테오글리칸(proteoglycans)과 교류하여 정전기적 결합을 하는 것이 첫 번째 단계인데, 대부분의 세포투과 펩타이드의 경우, 세포 표면의 HSPG(heparin sulfate proteoglycans)와 상호작용을 통해 들어간다는 점에서 본 발명자들은 이전에 세포막과 결합/상호작용하는 단백질들을 조사하여, 세포투과기능을 가지는 아미노산 서열을 가질 가능성이 높은 아넥신 단백질들로부터 세포투과 펩타이드를 다수 분리/동정하였다. 이를 기반으로, 보다 짧은 길이의 아미노산으로 구성된 본 발명의 펩타이드들을 최종적으로 선별하였다.
아넥신(annexin)은 칼슘 이온에 의해 세포막의 인지질에 결합함으로서 세포막을 통해 이온 농도를 조절하고 이온의 세포막 내외로의 수송에 관여하고, 세포 구조에 관여하는 단백질인 F-액틴(actin)과 결합하면서 세포 구조의 역학을 조절한다. 아넥신은 생물체에 따라 5가지 주요 그룹(A 내지 E 그룹)으로 분류된다(즉, 인간, 곤충, 곰팡이, 식물 및 원생생물). 또한, 아넥신은 세포막과 결합할 뿐 아니라 엔도사이토시스(endocytosis) 및 엑소사이토시스(exocytosis)를 통해 세포 안팎을 드나드는 기능이 있다는 것을 2005년에 Gerke V 등(Nature Review Mol Cell Biol ., 6: 449-461, 2005)이 보고하였다.
이전에 본 발명자들에 의해 동정된 10개의 아미노산 서열로 이루어진 아넥신-유래된 펩타이드에서 세린과 트립신이 세포투과능에 매우 중요하였다(참고: 도 1). 따라서, 본 발명자들은 상기 아미노산 잔기들을 위주로 4개의 아미노산 서열로 구성된 다양한 펩타이드들을 제조하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 펩타이드는 아넥신 단백질의 N-말단에 위치된 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 세포투과 펩타이드는 다음의 일반식 1 내지 일반식 4 중 어느 하나로 표시되는 펩타이드
, 및 서열번호 5 내지 서열번호 7의 펩타이드를 포함한다.
상기 일반식 1 내지 일반식 4에서, 상기 Xaa1, Xaa3 및 Xaa4는 트립토판(Trp)을 제외한 소수성 아미노산 중 어느 하나의 아미노산이고, 상기 Xaa2는 극성 아미노산 중 어느 하나의 아미노산이며, Xaa5는 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 시스테인(Cys) 또는 프롤린(Pro)이며, Xaa6은 염기성 아미노산 중 어느 하나의 아미노산일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 Xaa1, Xaa3 및 Xaa4는 알라닌(Ala), 발린(Val), 이소루이신(Ile), 루이신(Leu), 메티오닌(Met) 또는 티로신(Tyr)이고, 상기 Xaa2는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn) 또는 글루타민(Gln)이며, Xaa5는 글리신 또는 알라닌이며, Xaa6은 히스티딘(His) 또는 라이신(Lys)이다. 보다 더 구체적으로는, 상기 Xaa1, Xaa3 및 Xaa4는 알라닌, 발린, 이소루이신 또는 루이신이고, 상기 Xaa2는 세린이며, Xaa5는 글리신 또는 알라닌이며, Xaa6은 히스티딘이다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 다음의 일반식 3 내지 일반식 6 중 어느 하나로 표시되는 펩타이드
, 및 서열번호 5 내지 서열번호 7의 펩타이드를 포함한다.
상기 일반식 3 내지 일반식 6에서, 상기 Xaa1, Xaa3 및 Xaa4는 트립토판을 제외한 소수성 아미노산 중 어느 하나의 아미노산이고, Xaa5는 글리신, 알라닌 또는 시스테인이며, Xaa6은 염기성 아미노산 중 어느 하나의 아미노산일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 Xaa1, Xaa3 및 Xaa4는 알라닌, 발린, 이소루이신, 루이신 또는 메티오닌이고, Xaa5는 글리신 또는 알라닌이며, Xaa6은 히스티딘 또는 라이신이다. 보다 더 구체적으로는, 상기 Xaa1, Xaa3 및 Xaa4는 알라닌, 발린, 이소루이신 또는 루이신이고, Xaa5는 글리신 또는 알라닌이며, Xaa6은 히스티딘이다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 보다 구체적으로는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로는 서열번호 1 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하며, 가장 구체적으로는 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다(참고: 표 2 및 도 2a).
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 세포질로 투과된다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 1 μM 이상의 농도, 보다 구체적으로는 5 μM 이상의 농도, 및 보다 더 구체적으로는 10 μM 이상의 농도에서 우수한 세포투과능을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 아넥신보다 안정성이 훨씬 우수하지만, 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 추가적으로 결합될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드의 N-말단은 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되어 안정성을 증가시킬 수 있다.
상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다. 또한, 상기 변형된 펩타이드는 보호기로 인해 우수한 열안정성을 나타내며, 또한 산과 알칼리 등의 물리화학적 인자에 대한 안정성을 우수하다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 장기 보존성이 뛰어나게 변형될 수 있으므로, 의약품, 의약외품, 화장품 및 구강용품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다. 상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드 안정성을 크게 개선하는 작용을 하고, 본 명세서에서 언급되는 용어 "안정성"은 인 비보 안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.
일반적으로, 단백질 운반 도메인(PTD)은 라이신/아르기닌 등 기본 아미노산 잔기들을 주로 포함하고 있어서 이와 융합된 단백질들을 세포막을 투과하여 세포내로 침투시키는 역할을 한다. 상기 단백질 운반 도메인(PTD)은 HIV-1 Tat 단백질, 드로소필라 안테나페디아의 호메오도메인(페네트라틴), HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유도된 MTS 펩타이드, 트랜스포탄 또는 Pep-1 펩타이드에서 유래된 서열 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이, 바이러스 또는 양이온성 펩타이드로부터 동정/합성된 다양한 세포투과 펩타이드들(예를 들어, TAT48 -60, 페네트라틴(pAntp)43 -58, 폴리아르기닌, Pep-1, 트랜스포르탄, 등)은 생물학적 활성 물질, 약물 운반 벡터들의 이동을 매개하기 위해 세포 내재화(internalization)가 가능한 활성을 가진다. 하지만, 종래의 세포투과 펩타이드를 이용한 약물들에 대한 임상 결과는 아직까지 성공적이지 못 하다. 예를 들어, 폴리아르기닌과 사이클로스포린의 컨쥬게이트인 PsorBan®의 건선 치료제로서의 임상은 임상 II기에서 중단되었다. 또한, 최초의 세포투과 펩타이드인 TATp를 이용한 임상 Irl가 현재 진행중이다(ISS P-002; Istituto Superiore di Sanita and Novartis). 이 외에도, 암 치료용 PTD(protein transduction domain) 컨스트럭트(TAT-DRBD(double stranded RNA binding domain))에 대한 연구가 Traversa, Inc.에 의해 수행되고 있다. 상술한 연구들은 종결되거나 현재 진행형이지만 아직까지 임상적으로 승인되지 않은 상태인데, 이러한 측면에서 세포투과 펩타이드 연구에서 중요한 점은 세포독성 및 혈청에서의 분해율, 등을 꼽을 수 있다. 특히, 혈청에서의 펩타이드 분해율은 목적 카르고를 세포에 전달하기 위해 매우 중요하다.
본 발명의 펩타이드는 소수성 아미노산을 포함하는 4개의 아미노산 서열로 이루어져 혈청에서의 분해율이 매우 낮을 것으로 예측돼, 약물전달체로서의 개발 가능성이 매우 높다. 따라서, 본 발명은 (a) 상술한 세포투과 펩타이드; 및 (b) 상기 펩타이드에 결합된 목적 카르고(cargo of interest)를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 우수한 세포투과능으로 인해 이와 결합된 목적 카르고를 세포질로 효과적으로 이동시킬 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 있어서, 본 발명의 펩타이드를 10 μM의 농도로 처리하는 경우에 10개의 아미노산 서열로 이루어진 대조군(AA3H)과 유사한 세포투과능을 나타냈다(참고: 도 2a 및 도 2b). 또한 혈청에서의 펩타이드 분해율의 측면에서 상기 대조군(AA3H)이 최소 24시간까지 안정적으로 유지되었기 때문에, 본 발명의 펩타이드들도 우수한 혈청 내 안정성을 나타낼 것으로 예측되었다(결과를 보이지 않음).
통상적으로, 세포투과 펩타이드는 목적 카르고와 비공유결합 또는 공유결합을 통해 연결되어 구성될 수 있다. 예를 들어, 세포투과 펩타이드와 목적 카르고가 화학적 교차-연결(cross-linking)을 통해 공유결합 컨쥬게이트를 형성하는 것일 수 있다(Zatsepin, TS, et al ., Curr . Pharm . Des ., 11: 3639-3654(2005)). 따라서, 본 발명의 펩타이드는 목적 카르고와 공유결합 또는 비공유결합적으로 연결되어 세포 또는 조직 내로 전달시키는 기능을 할 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 목적 카르고로서 siRNA와 형광성 모이어티를 통해 연결된 약물전달체는 세포막을 투과하여 상기 siRNA를 안정적이고 높은 효율로 전달하였다(참고: 도 4a 및 도 4b).
본 명세서에서 사용되는 용어 "목적 카르고(cargo of interest)"는 공유결합 또는 비공유결합을 통해 본 발명의 펩타이드와 컨쥬게이트를 이루어 세포 내로 운반될 물질을 의미하며, 예를 들어, 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 PNA(peptide-nucleic acid)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약물전달체는 본 발명의 펩타이드와 목적 카르고 사이에 링커를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 링커는 세포투과 활성에 영향을 미치지 않는 한 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있다. 예를 들어, 형광물질[예컨대, 플루오레신, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린(Coumarin)], 형광 단백질(fluorescence protein; GFP, RFP, CFP, YFP, BFP, 루시퍼라제 또는 이의 변이체), 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 화학물질(예컨대, 바이오틴), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함한다. 본 발명의 약물전달체가 방사능동위원소를 포함하여 구성되는 경우(즉, 동위원소로 표지된 본 발명의 펩타이드 및 siRNA 복합체), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT, Single Photon Emission Computed Tomography) 또는 양전자 방출 단층촬영(PET, Positron Emission Tomography)에 적용되어 조직의 이미징에 이용될 수도 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 약물전달체의 목적 카르고는 상술한 펩타이드의 N- 또는 C-말단, 보다 구체적으로는 C-말단에 결합되며, 상기 결합은 공유결합 또는 비공유결합일 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 펩타이드와 목적 카르고 간의 결합은 링커는 통해 이루어지며, 보다 구체적으로는 상기 펩타이드와 목적 카르고 각각에 결합된 형광성 모이어티(예컨대, FITC, 바이오틴, 스트렙토마이신, 등)를 통해 이루어진다.
상기 링커는 본 발명의 펩타이드의 세포투과 활성을 최대화하기 위하여 특별하게 선택된 길이 및/또는 서열, 구체적으로는 복수의 아미노산 잔기로 이루어진 링커일 수 있다. 상기 아미노산 서열로 이루어진 링커는 Huston, et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88(1991), 및 Whitlow, et al ., Protein Eng., 6: 989(1993)에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
또한, 본 발명의 약물전달체는 다양한 목적으로 이용될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 약물전달체는 화학물질, 핵산, 나노입자, 등의 물질의 운반에 이용될 수 있으며, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 PNA를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 약물전달체는 운반 대상의 카르고에 따라, 질병 또는 질환의 치료, 특정 세포의 검출, 질병(예컨대, 암)의 진단, 특정 세포의 위치 추적 및 인 비보 이미징 등에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584(1990)).
한편, 본 발명은 상술한 세포투과 펩타이드(서열번호 1 내지 서열번호 7)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하며, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상술한 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이라면 제한되지 않고, 이들의 구체적인 예는 서열번호 1 내지 서열번호 7에 대해 각각 서열번호 8 내지 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열로 예시되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 언급되는 용어 "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584(1990)).
또한, 본 발명은 상술한 세포투과 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공할 수 있다. 보다 상세하게는, 본 발명의 재조합 발현벡터는 (a) 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된(operatively linked) 서열번호 8 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 인코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 약물전달체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 목적 카르고의 세포 내 전달방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 약물전달체를 포함하는 목적 카르고 운반용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 약물전달체를 포함하는 트랜스펙션 키트를 제공한다.
본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 상술한 세포투과 펩타이드 및 이를 포함하는 약물전달체를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 피내 주입, 병변내(intralesional) 주입, 근육내 주입, 복강내 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 결정될 수 있으며 일반적으로 0.0001-100 mg/kg의 범위일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 포유동물, 보다 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이에 적용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 트랜스펙션 키트(transfection kit)는 외부의 DNA/RNA를 포유동물의 세포 내로 도입이 용이하도록 최적화된 시스템이다. 현재까지 DNA/RNA에 대한 트랜스펙션 키트는 주로 칼슘포스페이트법, 지질결합체를 이용하는 방법, 덱스트란 복합체를 이용하는 방법 등이 있으나 이들의 효율성은 1/106 내지 1/102 정도이고 세포의 종류에 의존성이 있는 한계가 있다. 이를 극복하기 위해 세포투과 펩타이드/단백질을 이용한 트랜스펙션 키트를 이용할 수 있다.
본 발명의 트랜스펙션 키트는 추가로 상기 펩타이드와 목적 카르고 간의 링커/결합인자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결합인자는 전사인자 또는 바이러스 단백질을 포함하는 특정 DNA/RNA 서열 또는 단백질 등의 목적 카르고와 결합할 수 있는 단백질 전체 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, Gal4는 DNA 결합인자로, 진핵세포생물, 원핵세포 생물, 바이러스에서 널리 사용되는 전사인자이다. DNA/RNA 결합인자는 인 비보 및 인 비트로에서 PTD와 융합단백질을 제조할 수 있는 단백질 발현벡터를 적용하여 이용가능하다. 또한, DNA/RNA 결합인자와 PTD 간의 융합은 화학적 결합, 물리적 공유결합, 또는 비공유 결합에 의해서도 가능하다.
본 발명의 세포투과 펩타이드와 DNA/RNA과의 융합 컨스트럭트를 만들어 이를 세포 외부에 처리해 주면 효율성과 세포 종류에 의존적인 한계를 극복할 수 있게 된다. 본 발명의 펩타이드와 DNA/RNA 결합인자를 이용하여 인 비보 및 인 비트로에서 다양한 세포의 세포질로 DNA/RNA를 효율적으로 도입할 수 있게 된다. 예를 들어, 전달 방법은 근육내, 복강내, 정맥, 경구, 피하, 피내, 비강내, 흡입을 포함하는 다양한 방법을 통해서 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명의 트렌스펙션 키트는 본 발명의 방법에 의해서 유전자 치료와 DNA/RNA 백신에 대한 새로운 방법을 제공할 수 있으며, 일시적 또는 영구적으로 발현이 가능하며 DNA/RNA 백신과 유전자치료와 같은 의학임상 적용에서 뿐만 아니라 기초 연구의 활용에서도 다양하게 사용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 신규한 세포투과 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 펩타이드는 적은 수의 아미노산(구체적으로는, 4개의 아미노산)으로 구성되며 소수성 아미노산의 비중이 높아 분해 효소에 의해 잘 분해되지 않고 우수한 세포투과성을 가진다.
(c) 또한, 본 발명의 펩타이드의 양 말단, 특히 C-말단에 목적 카르고와 결합되어 상기 목적 카르고(예컨대, siRNA)를 안정적이고 효과적으로 세포 내(세포질)로 전달할 수 있다.
(d) 따라서, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약물전달체, 그리고 이를 이용하는 목적 카르고의 전달방법 및 조성물은 질병 또는 질환의 치료, 특정 세포의 검출, 질병(예컨대, 암)의 진단, 특정 세포의 위치 추적 및 인 비보 이미징, 등에 이용될 수 있다.
도 1은 알라닌 치환을 통한 AA3H-CPP의 세포투과능을 확인한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 펩타이드의 세포 투과능을 확인한 결과이다. 도 2a는 유세포 분석을 통한 세포투과도 확인(좌측 패널) 및 이의 수치화 그래프(우측 패널)이고, 도 2b는 이에 대한 형광을 보여주는 사진이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 펩타이드의 각 말단에 단백질 융합시킨 컨스트럭트의 세포 투과능을 보여주는 결과이다. 도 3a는 CPP의 N-, C-말단의 단백질 융합 후 세포투과 효율을 유세포 분석을 통해 비교한 결과 비교(위쪽 패널) 및 이의 수치화 결과(아래쪽 패널)을 제시한다. 도 3b는 CPP의 C-말단에 융합한 단백질의 세포투과 능력을 형광현미경으로 확인한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 펩타이드 CPP를 이용한 siRNA 전달을 보여주는 결과이다. 도 4a는 CPP와 siGFP의 융합을 통한 GFP 발현량 감소를 유세포분석기로 확인하고 이의 그래프 결과(위쪽 패널), 그리고 siGFP가 세포내로 들어갔다는 것 확인하고 이의 그래프 결과(아래쪽 패널)이다. 도 4b는 CPP-siGFP의 GFP 발현양 감소를 형광현미경으로 확인한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 펩타이드의 세포 투과능을 확인한 결과이다. 도 2a는 유세포 분석을 통한 세포투과도 확인(좌측 패널) 및 이의 수치화 그래프(우측 패널)이고, 도 2b는 이에 대한 형광을 보여주는 사진이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 펩타이드의 각 말단에 단백질 융합시킨 컨스트럭트의 세포 투과능을 보여주는 결과이다. 도 3a는 CPP의 N-, C-말단의 단백질 융합 후 세포투과 효율을 유세포 분석을 통해 비교한 결과 비교(위쪽 패널) 및 이의 수치화 결과(아래쪽 패널)을 제시한다. 도 3b는 CPP의 C-말단에 융합한 단백질의 세포투과 능력을 형광현미경으로 확인한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 펩타이드 CPP를 이용한 siRNA 전달을 보여주는 결과이다. 도 4a는 CPP와 siGFP의 융합을 통한 GFP 발현량 감소를 유세포분석기로 확인하고 이의 그래프 결과(위쪽 패널), 그리고 siGFP가 세포내로 들어갔다는 것 확인하고 이의 그래프 결과(아래쪽 패널)이다. 도 4b는 CPP-siGFP의 GFP 발현양 감소를 형광현미경으로 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
2-1.
펩타이드
합성
고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 AA3H(Annexin A3 Human form) N-말단의 10개의 아미노산 서열, 이로부터 유래된 변형 아미노산 서열 및 4-mer CPP들을 합성하였고, 링크-아미드 MBHA 레진(rink-amide methylbenzylhydrylamine resin; Novabiochem, #855003)을 사용하여 C-말단에서부터 각 아미노산을 연결하고 N-말단에 형광물질인 FITC 이소머 I(fluorescein isothiocyanate isomer I; Sigma, #F7250)를 붙였다. 마지막 단계에서 95% TFA(trifluoroacetic acid; Sigma, #302031)/2.5% 트리이소프로필실란(triisopropylsilane; Sigma, #233781)/2.5% H2O를 섞어 2시간 동안 상온에서 반응하고 디에틸 에테르(Sigma #309966)로 침전시켰다. 합성된 펩타이드는 역상 HPLC C18 컬럼을 통해 추출하였고, 0.1% TFA가 들어있는 물과 아세토니트릴(Fisher scientific #955-1)의 5-80% 농도에서 각 펩타이드를 획득하였다. 또한 각각의 펩타이드 N- 또는 C-말단에 바이오틴(biotin-NHS, biotin(Lys)-ε amino)을 붙였다. 각 펩타이드의 분자 크기는 MALDI-TOF 질량분석기(mass spectroscopy)를 통해 측정하여 확인하였다.
2-2.
펩타이드의
세포 투과 효능 분석
각 펩타이드의 세포 투과도를 확인하기 위해 인간 자궁암 세포주(HeLa)에 1 μM 또는 10 μM 농도의 펩타이드를 4시간 동안 처리하였다. 처리 후 DPBS(Culbecco's phosphate buffered saline)으로 두 번 세척하고 0.01% 트립신/EDTA를 10분 동안 처리한 후 단일세포를 DPBS에 현탁하였다. 상기 얻어진 세포는 1,500 x g로 2분 동안 원심분리기를 이용하여 펠렛팅하고, 동일한 과정으로 두 번 세척 후 유세포 분석기(Guava easyCyte, milipore, USA)로 세포투과 효율을 확인하였다. 또한, 펩타이드 처리하고 두 번 세척 후 형광현미경으로 관찰하였다.
2-3. 바이오틴 표지된 펩타이드와 FITC 표지된 스트렙토아비딘의 융합
각 N- 또는 C-말단에 표지된 바이오틴 펩타이드(B-CPPs, CPPs-B)와 스트렙토아비딘-FITC(STV-FITC)를 4:1 비율로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 세포투과 효율을 비교하였다. 세포에 들어간 펩타이드는 녹색 형광을 나타내므로 유세포 분석기로 확인하였고 동일한 조건으로 형광현미경으로 다시 한 번 확인하였다.
2-4. 세포투과
펩타이드와
siGFP
의 융합 및 효능 비교
세포투과 펩타이드와 siGFP를 융합하기 위해 펩타이드에는 말레이이미드(maleimide)를 연결하였고, siGFP의 센스의 C-말단에 티올(thiol) 기를 부착시켰다. 이황화 결합(disulfide bond)을 위해 티올 기-부착된 siGFP에 DTT를 15분 동안 처리하여 활성화시켰고 7K zeba 컬럼(Cat# 89883; Thermo scientific, USA)으로 남은 DTT를 제거하였다. 활성화된 티올의 siGFP는 펩타이드와 저온(4℃)에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 펩타이드와 융합된 siGFP는 12% 네이티브 젤에서 확인하였다(결과를 보이지 않음).
상기 융합된 컨스트럭트(CPPs-siGFP; siGFP 기준으로 100 nM)를 48시간 동안 HeLa-GFP 세포와 반응시켰다. HeLa-GFP 세포는 GFP는 지속적으로 발현될 수 있도록 만든 세포로, 1 μg/mL의 퓨로마이신 항생제를 넣고 배양하였다. HeLa-GFP의 발현량 감소는 유세포 분석기와 형광현미경을 통해 확인하였다. 이용된 siGFP의 서열 정보는 다음의 표 1에 기재되어 있다.
이름 | 서열 | 말단 변형 |
센스 | ACAUGAAGCAGCACGACUU(dTdT) | 5’-Cy5.5, 3’-티올 변형 |
안티센스 | AAGUCGUGCUGCUUCAUGU(dTdT) |
이용된 siGFP 서열.
실험결과
3-1. 알라닌 스캐닝을 통한 주요 아미노산 서열 확인
10개의 아미노산 서열을 알라닌으로 치환하여 주요 서열을 확인하였다. 알라닌은 이차구조를 지니지 않고 다른 아미노산에 영향을 주지 않아 서열의 중요한 역할을 확인하기 위해 쓰는 대중적인 방법이다. 알리닌으로 치환한 서열의 이름과 서열, 크기 및 정보는 표 2에 나타냈다. 도 1에서 확인할 수 있듯이, 10개의 아미노산 중 세린(serin, S3A)과 트립토판(tryptophan, W5A)이 세포 투과에 중요한 잔기임을 확인할 수 있었다. 세린을 알라닌으로 치환했을 때 세포 투과도가 31% 감소하였고 트립토판을 알라닌으로 치환했을 때는 71% 감소하였다(도 1). 따라서, 세포투과 펩타이드 서열 중 세린과 트립토판이 중요한 잔기임을 알 수 있었다. 세포투과의 주요잔기인 세린과 트립토판을 중심으로 펩타이드를 4개의 아미노산으로 총 7개로 나눠서 세포투과율을 확인하였다.
펩타이드
이름 |
서열 | 크기( Da ) | 등전점 | pH 7에서의 전하 | 형광 |
AA3H-WT | MASIWVGHRG | 1113.3 | 10.55 | 2 | N-말단에 FITC (녹색형광) 연결 |
M1A | AASIWVGHRG | 1053.18 | 10.55 | 2 | |
A2A | MASIWVGHRG | 1113.3 | 10.55 | 2 | |
S3A | MAAIWVGHRG | 1097.3 | 10.55 | 2 | |
I4A | MASAWVGHRG | 1071.22 | 10.55 | 2 | |
W5A | MASIAVGHRG | 998.17 | 10.55 | 2 | |
V6A | MASIWAGHRG | 1085.25 | 10.55 | 2 | |
G7A | MASIWVAHRG | 1127.33 | 10.55 | 2 | |
H8A | MASIWVGARG | 1047.24 | 10.55 | 1 | |
R9A | MASIWVGHAG | 1028.19 | 7.55 | 1 | |
G10A | MASIWVGHRA | 1127.33 | 10.55 | 2 | |
4-mer CPPs | MASI | 922.11 | 6.02 | 0 | |
ASIW | 977.13 | 6.02 | 0 | ||
SIWV | 1005.19 | 6.02 | 0 | ||
IWVG | 975.17 | 6.02 | 0 | ||
WVGH | 999.15 | 7.55 | 1 | ||
VGHR | 969.12 | 10.55 | 2 | ||
GHRG | 927.04 | 10.55 | 2 |
펩타이드 종류, 서열, 크기 등전점, 전하에 관한 정보.
3-2.
주요잔기별로
나뉜
펩타이드의
세포투과 효율비교
도 1에서 확인하여 나눈 총 7개의 펩타이드(MASI, ASIW, SIWV, IWVG, WVGH, VGHR 및 GHRG)를 저 농도(1 μM)와 고 농도(10 μM)로 4시간 동안 처리했을 때 본래의 AA3H-CPP와 세포투과도를 비교하였다. 저 농도에서는 본래의 서열인 AA3H-CPP 보다 SIWV가 두 배 이상 세포 투과율이 좋았고, ASIW의 경우 AA3H-CPP 만큼 좋은 효율을 보였다. 고농도에서는 AA3H-CPP의 세포투과율이 좋았으나 다른 7개의 펩타이드 중에서는 SIWV 펩타이드가 가장 우수한 효과를 보였다(도 2a). 또한 형광현미경에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었는데, 1 μM에서는 SIWV의 세포투과율이 좋았음을 저배율(20 x) 및 고배율(100 x)에서 확인하였다(도 2b). 4개의 아미노산 서열만으로도 우수한 세포투과 효율을 가진다는 점에서, 상기 결과로부터 투과 효율이 좋은 4종류의 펩타이드(ASIW, SIWV, IWVG 및 WVGH)를 생물학적 물질을 전달하는데 최종 후보로 선택하였다.
또한 4개의 아미노산 서열로도 세포투과효율이 있음을 증명하였고 이 중 효율과 아미노산 서열의 중요도를 고려하여 4종류의 펩타이드를 선택하였다. 기존의 논문을 통해 트립토판이 세포막과 교류하는데 중요한 아미노산임을 알 수 있었고, 이 논문을 바탕으로 트립토판이 함유되어 있는 효율이 좋은 펩타이드 4종류(ASIW, SIWV, IWVG, WVGH)를 생물학적 물질을 전달하는데 최종 후보로 선택하였다.
3-3. N- 또는 C-말단의 단백질 융합을 통한
CPP
의 물질 전달 효율 비교
바이오틴을 각 CPP의 N- 또는 C-말단에 부착하여 스트렙토아비딘 융합을 통해 세포 투과도를 비교하였다. 바이오틴(B)과 융합한 스트렙토아비딘(STV)의 모식도는 도 3a의 위쪽 패널에 제시되어 있다. B-CPPs와 CPPs-B과 융합된 STV-FITC는 세포 내에 투과되면 형광도를 나타내므로 유세포 분석기로 확인할 수 있었다. 융합된 CPPs-FITC, FITC-CPPs는 인간 자궁암 세포(HeLa)에 처리하여 비교하였는데, CPP의 C-말단에 전달물질을 융합시켰을 때 더 좋은 효율을 보였다. 특히 ASIW-CPP의 경우 N-말단에 물질을 융합했을 때 보다 C-말단에 융합했을 때 투과 효율이 15배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 또한, SIWV-CPP 경우도 C-말단에 융합했을 때 5배 이상 효율이 좋은 것을 알 수 있었다. IWVG-CPP는 C-말단에 융합했을 때 4배, WVGH-CPP는 2배 이상 증가하였다(도 3a). 형광현미경을 통해 CPPs-FITC의 투과도를 확인했을 때 ASIW-CPP가 가장 좋은 효율을 보였다(도 3b). 도 3의 결과에 의하면, 전달물질의 위치에 따라 2배 내지 15배까지 세포투과율이 다른 것으로 보아 어느 위치에 전달 물질을 융합하느냐에 따라 그 효율이 다르다는 것을 추정할 수 있었다.
3-4. C-말단에
siGFP
융합한
CPPs
의 효율 비교
도 3의 결과를 토대로, CPPs의 C-말단에 전달물질을 융합하여 세포 내로 전달하였다. GFP가 지속적으로 발현되는 HeLa-GFP 세포에 4가지의 펩타이드에 각각 융합한 siGFP를 처리하여 그 효율을 확인하였다. 융합된 siGFP는 100 nM로 48 시간 동안 처리하여 유세포 분석기를 통해 결과를 확인하였는데, 그림 4a에서와 같이 GFP의 발현이 감소하는 것을 알 수 있었다. 각 CPPs-siGFP의 GFP의 발현량을 감소시키는 효율은 약 48-53%로 나타났다. siGFP의 센스 가닥에 cy5.5가 붙어있어 CPP에 의해 siGFP가 세포 내로 들어갔다는 것을 유세포 분석기로 확인할 수 있었다(도 4a, 아래쪽 패널). siGFP의 세포 내 전달은 4개의 CPP 모두 비슷한 효율이 나타났다. 또한 형광현미경을 통해 GFP의 발현량이 감소한다는 것을 재확인하였고, DIC로 세포 형태를 보여주었고, 형광세포임을 GFP 파장으로 형광이미지를 보여주었다. 또한, 핵 염색을 통해 정상적인 세포임을 보여주었고 각각의 이미지를 겹쳐서 어느 세포의 GFP 발현양이 줄었는 지를 확인하였다(도 4b).
4. 전망
본 발명은 4개의 아미노산 서열로도 세포투과가 가능하며, 단백질 및 유전자를 전달할 수 있다는 것을 제시한다. 또한 전달물질의 위치에 따라 그 효율이 달라지므로 CPP를 이용한 물질전달에 효과적인 방법을 제시하는 기초적인 자료가 될 것이다. 짧은 아미노산 서열의 합성은 기존의 CPP들의 합성 및 제조 보다 저렴한 비용으로 생산이 가능하며 간단한 융합 방법을 통해 물질을 전달할 수 있는 장점을 지니고 있어, 전달체로서 유용하게 사용될 것으로 예상한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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<400> 5
Val Gly His Arg
1
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<223> AA3H_06
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Gly His Arg Gly
1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> AA3H_07
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1
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gttggccata ga 12
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ggtcacagag gg 12
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<213> Artificial Sequence
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<223> AA3H_07_NT
<400> 14
atggcgtcca ta 12
Claims (18)
- 서열번호 1 내지 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 세포투과 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP).
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 1 μM 이상의 농도에서 세포투과능을 가지는 것인 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포질로 투과되는 것인 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 공유결합 또는 비공유결합으로 연결된 목적 카르고(cargo of interest)를 세포 또는 조직 내로 전달시키는 것인 펩타이드.
- 제6항에 있어서, 상기 연결은 상기 펩타이드의 C-말단으로 이루어지는 것인 펩타이드.
- 제6항에 있어서, 상기 목적 카르고는 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 PNA인 것인 펩타이드.
- 제1항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
- (a) 제1항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 세포투과 펩타이드; (b) 상기 펩타이드에 결합된 목적 카르고(cargo of interest)를 포함하는 약물전달체(drug delivery system).
- 제10항에 있어서, 상기 목적 카르고는 상기 펩타이드의 C-말단에 결합되는 것인 약물전달체.
- 제10항에 있어서, 상기 펩타이드와 목적 카르고 간의 결합은 링커를 통해 이루어지는 것인 약물전달체.
- 제12항에 있어서, 상기 링커는 상기 펩타이드와 목적 카르고 각각에 결합된 형광성 모이어티를 추가적으로 포함하는 것인 약물전달체.
- 제10항에 있어서, 상기 결합은 공유결합 또는 비공유결합인 것인 약물전달체.
- 제10항에 있어서, 상기 목적 카르고는 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 PNA인 것인 약물전달체.
- 삭제
- 제10항의 약물전달체를 포함하는 목적 카르고 운반용 조성물.
- 제10항의 약물전달체를 포함하는 트랜스펙션 키트.
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