KR101647143B1 - A method for inactivating a desired gene in Bacteria beloning genus Clostridium - Google Patents

Abstract

본 발명은 클로스트리듐(Clostridium) 속(屬) 미생물에서의 목적 유전자를 불활성화시키는 방법 및 이에 따른 목적유전자가 불활성된 클로스트리듐 속 변이 미생물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 람다 레드(Lambda Red) 재조합 효소를 발현하는 벡터 및 특정 선형 DNA를 이용하여 클로스트리듐 속 미생물의 염색체에 존재하는 유전자를 불활성화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전자를 불활성화시키는 방법은 기존의 유전자 불활성화 방법에 비하여 단순하다는 점과 유전자가 불활성화된 균주 선택이 쉽다는 점에서 유용하다. The present invention relates to a method for inactivating a target gene in a Clostridium sp. Microorganism, and a method for producing a Clostridium sp. Mutant microorganism in which a target gene is inactivated. More specifically, Lambda Red) recombinase and a method for inactivating a gene present on the chromosome of a microorganism of the genus Clostridium using a specific linear DNA. The method of inactivating the gene according to the present invention is advantageous in that it is simpler than the conventional gene inactivation method and that it is easy to select a gene inactivated strain.

클로스트리듐, 유전자 불활성화, DNA 재조합효소 Clostridium, gene inactivation, DNA recombinase

Description

클로스트리듐 속 미생물 유전자를 불활성화시키는 방법{A method for inactivating a desired gene in Bacteria beloning genus Clostridium}[0001] The present invention relates to a method for inactivating a Clostridium genus microorganism gene,

본 발명은 클로스트리듐 속 미생물에서 유전자를 불활성화하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 람다 레드 재조합 효소 또는 RecET 재조합 효소를 발현하는 벡터를 이용하여 형질전환(transformation)한 후, 선형(linear) DNA를 도입하여 유전자를 불활성화하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for inactivating a gene in Clostridium sp. Microorganisms. More specifically, the present invention relates to a method for inactivating a gene in Clostridium sp. And introducing DNA to inactivate the gene.

최근 고유가와 관련하여 부탄올을 생산하는 미생물에 대한 관심이 늘어나고 있다. 부탄올은 연료로서 가솔린과 비슷한 물성 및 에탄올이 가지고 있는 흡습성(hygroscopy)을 나타내지 않는 장점을 가지고 있다(Durre, 2007). 또한 부탄올의 합성경로에서는 비 재생적인 석유화학적 산물을 원료 물질로서 필요로 하며, 상대적으로 다중 단계(multi step), 다중 반응기 설계(muti-reactor design) 뿐만 아니라, 값비싼 촉매시스템과 관련한 높은 온도와 압력이 필요하다. 게다가 매우 강한 독성과 가연성이 있는 반응물이기 때문에 기존의 화학합성 경로는 환경적인 측면에서 좋지 않다. 이에, 상기 화학생산공정의 대안으로 재생가능한 바이오매스 유래 탄소원으로부터 부탄올의 생산이 필요한 실정이다.Recently, interest in microorganisms producing butanol has been increasing in relation to high oil prices. Butanol has the advantage of being similar to gasoline as fuel and not showing hygroscopy of ethanol (Durre, 2007). The butanol synthesis route also requires non-regenerative petrochemical products as feedstocks, and it has relatively high multi-stage, muti-reactor designs, as well as high temperatures Pressure is required. In addition, because of the highly toxic and flammable reactants, the existing chemical synthesis pathways are not good for the environment. Therefore, it is necessary to produce butanol from a carbon source derived from biomass that can be regenerated as an alternative to the chemical production process.

부탄올은 대표적인 옥소 알코올(oxo alcohol) 중 하나로, 플라스틱이나 페인트 도료 등의 용제로 주로 사용되어 왔다. 일반적으로 이들 옥소 알코올은 올레핀(olefin)에 수소와 일산화탄소를 첨가하여 알데하이드(aldehyde)를 얻는 과정과 이렇게 얻은 알데하이드에 수소를 첨가하는 과정을 통하여 얻게 된다. 이 두 과정을 통틀어 우리는 옥소 합성법(oxo syntheis)라고 부른다. 부탄올의 경우 프로필렌(propylene)을 원료로 하여 부티르알데히드(butyraldehyde)를 얻게 되고, 수소 첨가 반응을 거쳐 얻어진다.Butanol is one of the typical oxo alcohols, and has been mainly used as a solvent for plastics and paint paints. Generally, these oxoalcohols are obtained by adding hydrogen and carbon monoxide to an olefin to obtain an aldehyde, and then adding hydrogen to the aldehyde thus obtained. Throughout these two processes, we call it oxo syntheis. In the case of butanol, propylene is used as a raw material to obtain butyraldehyde, which is obtained by hydrogenation.

부탄올을 생산하는 미생물로 널리 알려진 것들은 클로스트리듐 속에 속해 있다(Jones and Woods, 1986). 이들 미생물의 부탄올 발효는 크게 2가지 기(phase)로 나뉘어진다. 생장 초반에는 아세트산, 부티르산 등의 유기산을 생산하면서 자라게 되고, 생장 후반기 들어 이들 산의 농도가 어느 정도 이상이 되는 경우, 부탄올과 에탄올이 생산되기 시작한다. 이 때, 아세트산과 부티르산은 세포 내로 흡수되어 에탄올 부탄올을 만드는 데 사용되고, 유기산이 재사용되는 과정에서 아세톤이 생성된다.Well-known microorganisms that produce butanol belong to the genus Clostridium (Jones and Woods, 1986). Butanol fermentation of these microorganisms is divided into two major phases. In the early stages of growth, they grow while producing organic acids such as acetic acid and butyric acid. When the concentration of these acids reaches a certain level in the latter half of the growth period, butanol and ethanol start to be produced. At this time, acetic acid and butyric acid are absorbed into cells and used to make ethanol butanol, and acetone is produced during the reuse of organic acid.

이러한 부탄올 발효는 일반적으로 효모를 사용한 에탄올 발효에 비해 최종 농도와 수율이 낮고 유기산과 아세톤 등 연료로 사용하기 부적합한 물질이 부산물로 생산되는 것이 단점으로 지적되어 왔다.This butanol fermentation has generally been pointed out as a disadvantage in that the final concentration and yield are lower than those of ethanol fermentation using yeast, and that the materials which are not suitable for use as fuels such as organic acids and acetone are produced as by-products.

고수율의 부탄올을 생성하기 위하여 기존에는 전통적인 방법인 발효 공정을 최적화하는 방법과 균주를 무작위로 돌연변이시켜 뛰어난 부탄올 생성능을 가진 균 주를 선택하는 방법이 사용되어 왔다.In order to produce high yield of butanol, a conventional method of optimizing the fermentation process and a method of randomly mutating the strain and selecting a strain having excellent butanol production ability have been used.

독일공개특허(DE3146084)에서는 인산 제한(phosphate-limited) 배지를 이용하여 2단계 발효를 통하여 연속발효에서 부탄올 생성능이 떨어지지 않는 발효 방법을 제시하였다.The German patent (DE3146084) proposes a fermentation method in which the butanol productivity is not deteriorated by continuous fermentation through a two-stage fermentation using a phosphate-limited medium.

미국공개특허(US4521516)에서는 화학 물질을 사용하지 않고 장기간의 연속 발효를 통하여 얻은 균주가 내생포자를 생성하지 않으면서 아세톤과 부탄올 생성능이 향상된 균주를 얻을 수 있었다.In the US patent (US4521516), strains obtained through continuous fermentation for a long period of time without using chemicals did not produce endospores, and acetone and butanol productivity were improved.

유럽공개특허(EP0088656)에서는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)을 돌연변이를 유발하는 화학 물질인 에틸 메탄설포네이트(ethyl methanesulfonate)로 처리한 후, 특정 농도의 부탄올을 포함한 배지에서 스크리닝하여 부탄올과 아세톤을 합한 최종 생산량이 15 g/L에서 25 g/L로 증가되고, 부탄올 생산량은 10 g/L에서 15g/L로 증가된 균주를 얻었다. 미국공개특허(US6358717)에서도 유사한 방법으로 부탄올 내성과 수율이 증가된 균주를 얻었다.In European patent application EP0088656, Clostridium acetobutylicum is treated with ethyl methanesulfonate, a mutagenic chemical, and then screened in a medium containing butanol at a specific concentration to produce butanol And acetone, increased from 15 g / L to 25 g / L and the butanol production increased from 10 g / L to 15 g / L. US Patent No. 6,358,717 also obtained strains with increased butanol tolerance and yield in a similar manner.

에틸 메탄설포네이트 이외에도 NTG (N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine)을 이용하여 향상된 녹말 분해능력과 부탄올 생성능을 가진 균주가 얻어진 바 있다(Annous and Blaschek, Appl. Env. Microbiol., 57:2544~2548, 1991)(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) in addition to ethyl methane sulfonate (Annous and Blaschek, Appl. En. Microbiol., 57 : 2544-2548, 1991)

그러나 공정과 무작위 돌연변이를 이용한 방법만으로는 부산물인 아세톤을 완전히 제거하기가 어렵다는 단점이 있다. 따라서 최근에는 미생물의 유전자를 조작하여 원하는 산물을 얻는 방법이 널리 이용되고 있다.However, there is a disadvantage in that it is difficult to completely remove acetone, a by-product, only by a process and random mutagenesis. Therefore, recently, a method of obtaining a desired product by manipulating a gene of a microorganism has been widely used.

최근에 부탄올을 생산하는 대표적인 미생물인 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824의 게놈 서열이 최초로 해독된 바 있고(Nolling et al., J. Bacteriol., 183:4823~4838, 2001), 뒤이어 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii)의 게놈 서열이 해독된 바 있다. 따라서, 이들의 용매 생성 관련 유전자를 유전자 조작이 용이한 대장균(Escherichia coli) 등의 균주에서 발현함으로써 부탄올을 생산하고자 하는 시도가 있었다(Atsumi et al., Metab. Eng., 10:305~311, 2008; Inui et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:1305~1316. 2008). 그러나 두 경우 모두 0.5 g/L 이하의 저조한 부탄올 생성능으로 인한 한계가 존재하였다.Recently, the genomic sequence of clostridium acetobutylicum ATCC 824, a representative microorganism producing butanol, has been firstly decoded (Nolling et al., J. Bacteriol., 183: 4823-4838, 2001) The genome sequence of Clostridium beijerinckii has been decoded. Therefore, attempts have been made to produce butanol by expressing these solvent-related genes in a strain such as Escherichia coli which is easy to genetically manipulate (Atsumi et al., Metab. Eng., 10: 305-311, 2008; Inui et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 77: 1305- 1316, 2008). In both cases, however, there was a limit due to a low butanol productivity of less than 0.5 g / L.

따라서 클로스트리듐 속 미생물에 직접 유전자 조작을 가하여 유기산과 아세톤의 생산을 감소하고자 하는 시도가 바람직하다. 그러나 클로스트리듐 속 미생물의 경우 대장균과 달리 상동 재조합(homologous recombination)을 이용한 유전자의 결실 또는 불활성화가 거의 일어나지 않는다는 문제가 있었다. 따라서 지금까지는 단일 교차(single crossover)를 통하여 플라스미드를 전체를 특정 유전자에 삽입하여 불활성화하는 방법이 이용되어 왔다 (Green et al., Microbiology. Aug;142:2079~2086, 1996). 그러나 이러한 방법도 극히 낮은 불활성화 빈도 및 플라스미드에 내재하는 항생제 마커(antibiotic marker)가 염색체에 삽입됨으로써 그 마커를 사용하지 못하게 된다는 단점이 있다. 따라서 이를 보완하기 위해 mobile group II intron을 이용하여 인트론을 유전자 특정 부위에 삽입하는 방법도 시도된 바 있다(Heap et al., 1: J. Microbiol. Methods., 70:452~464, 2007; Shao et al, Cell Res., 17:963~965, 2007). 그러나 이러한 방법은 마커가 사용되지 않으므로 스크리닝이 어렵다는 단점을 가지고 있다.Therefore, attempts to reduce the production of organic acids and acetone by direct genetic manipulation of microorganisms of the genus Clostridium are desirable. However, in the case of microorganisms of the genus Clostridium, unlike Escherichia coli, deletion or inactivation of genes using homologous recombination rarely occurs. So far, a method of inserting a plasmid into a specific gene and inactivating it through a single crossover has been used (Green et al., Microbiology. Aug; 142: 2079-2086, 1996). However, this method also has a disadvantage in that an extremely low inactivation frequency and an antibiotic marker inherent in the plasmid are inserted into the chromosome so that the marker can not be used. To overcome this problem, a method of inserting an intron into a gene-specific region using a mobile group II intron has also been attempted (Heap et al., 1: J. Microbiol. Methods., 70: 452-464, 2007; Shao et al., Cell Res., 17: 963-965, 2007). However, this method has a disadvantage that screening is difficult because the marker is not used.

일반적으로 대장균에서의 유전자 결실은 대장균 내에서 람다 레드(Lambda Red) 재조합 효소, 또는 재조합효소인 RecET를 발현한 후, 유전자에 상동적인 두 부위가 마커 양쪽에 달려 있는 선형 DNA를 세포 내에 도입함으로써 얻어진다. 그러나 클로스트리듐 속의 미생물에서는 이러한 시도가 행해진 바 없으며, 세포 내의 높은 DNA 분해 효소(DNase) 농도로 인하여 쉽게 성공되지 않을 것이라고 예상되고 있다(Mermelstein et al., Biotechnology, 10:190~195, 1992; Burchhardt and Durre, Curr. Microbiol., 21:307-311, 1990). Generally, gene deletion in E. coli is achieved by introducing Lambda Red recombinase or RecET, a recombinant enzyme in Escherichia coli, and then introducing linear DNA into the cell in which two regions homologous to the gene are located on both sides of the marker Loses. However, such attempts have not been made in microorganisms of the Clostridium genus, and it is expected that they will not be easily successful due to high DNase concentrations in the cells (Mermelstein et al., Biotechnology, 10: 190-195, 1992; Burchhardt and Durre, Curr. Microbiol., 21: 307-311, 1990).

또한 람다 레드 재조합 효소 중 Gam 단백질은 대장균에서 RecBCD를 저해함으로써 DNA의 분해를 막아주는 역할을 하지만(Marsic et al., J. Bacteriol., 175:4738?4743, 1993), 클로스트리듐 등의 그람 양성균에서는 RecBCD가 아닌 AddAB를 가지고 있다는 점에서 쉽게 람다 레드 재조합 효소만 이용하여서는 재조합을 일으키기 어려울 것이라고 예상된다.In addition, the Gam protein in the lambda red recombinase inhibits DNA degradation by inhibiting RecBCD in Escherichia coli (Marsic et al., J. Bacteriol., 175: 4738-4473, 1993) In the case of positive bacteria, it is expected that recombination will not be easily caused by using only lambda red recombinase since it has AddAB, rather than RecBCD.

그러나, 본 발명자들은 람다 레드 또는 RecET의 변형 없이, 클로스트리듐 균이 가지고 있는 제한 및 변형 효소(DNA 분해 효소(DNase)에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA)를 발현시킴으로써 외래 DNA 분해 활성을 감소시키고, 여기에 선형 DNA를 도입함으로써 특정 유전자를 불활성화할 수 있음을 확인하고, 도입된 플라스미드 벡터는 특정 온도에서 큐어링(curing)함으로써 본 발명을 완성하게 되 었다.However, the present inventors have found that, without modification of lambda red or RecET, it is possible to reduce the exogenous DNA-degrading activity by expressing antisense RNA against restriction enzymes (DNAase (DNase) It was confirmed that a specific gene could be inactivated by introducing linear DNA thereto, and the introduced plasmid vector was cured at a specific temperature to complete the present invention.

본 발명의 목적은 클로스트리듐 속 미생물에서의 목적유전자를 불활성화시키는 방법 및 이를 이용하여 목적유전자가 불활성된 클로스트리듐 속 변이 미생물 제조 방법을 제공하는 데 있다. It is an object of the present invention to provide a method for inactivating a gene of interest in a Clostridium sp. Microorganism and a method for producing a Clostridium sp. Mutant microorganism in which a gene of interest is inactivated using the method.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된, 목적 유전자가 불활성된 클로스트리듐 속 변이 미생물을 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a mutant microorganism of Clostridium inactivated in a desired gene, which is produced by the above method.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 In order to achieve the above object, in the present invention,

(a) DNA 재조합 효소를 발현하는, 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물을 제작하는단계; 및(a) preparing a transformed Clostridium microorganism expressing a DNA recombinant enzyme; And

(b) 상기 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물에 목적 유전자의 상동적 부위 및 선택적 마커를 포함하는 선형 DNA 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 클로스트리듐 속 미생물에서의 목적유전자를 불활성화시키는 방법을 제공한다.(b) introducing a linear DNA vector comprising a homologous region of the gene of interest and an optional marker into the transformed Clostridium microorganism, and inactivating the gene of interest in the clostridium microorganism to provide.

또한, 상기 단계에서 추가로 (c) 상기 선택적 마커를 제거하는 단계를 포함하는, 목적유전자가 불활성된 클로스트리듐 속 변이 미생물 제조 방법을 제공한다.In addition, the above step further comprises the step of (c) removing the selective marker, wherein the objective gene-inactivated microorganism is Clostridium sp.

이 때, 상기 클로스트리듐 속 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butylicum), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 타이로부틸리쿰(Clostridium tyrobutylicum), 클로스트리듐 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)으로 구성된 군에서 선택되는 1종일 수 있고, 바람직하게는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)을 사용할 수 있다. Wherein the Clostridium sp. Microorganism is selected from the group consisting of Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharobutylicum, But are not limited to, Clostridium saccharoperbutylacetonum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Clostridium butyricum, , Clostridium butylicum, Clostridium kluyveri, Clostridium tyrobutylicum, Clostridium tyrobutyricum, and the like. May be selected from the group consisting of Clostridium acetobutylicum and Clostridium acetobutylicum. .

그리고, 상기 DNA 재조합 효소는 람다 레드 재조합 효소 또는 RecET 재조합 효소일 수 있고, 여기서, 상기 DNA 재조합 효소 코딩 유전자는 exo, gam 또는 bet일 수 있다. And, the DNA recombinase may be a lambda red recombinase or a RecET recombinase, wherein the DNA recombinase coding gene may be exo, gam or bet.

특히, 상기 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물 제작은, DNA 재조합 효소 코딩 유전자를 함유하는 벡터의 도입에 의할 수 있는데, 이 때, 상기 벡터는 클로스트리듐 속 미생물 내의 제한 효소 또는 DNase의 안티센스 RNA를 전사 등을 통하여 그 활성을 감소 또는 제거시킬 수 있다. In particular, the transformed Clostridium microorganism can be produced by introducing a vector containing a DNA recombinase coding gene, wherein the vector is a restriction enzyme in a Clostridium microorganism or an antisense RNA of DNase The activity can be reduced or eliminated through transcription or the like.

한편, 상기 선택적 마커는 클로람페니콜, MLS 항생제, 카나마이신, 스펙티노마이신, 설폰아마이드계 항생제, 스트랩토마이신 내성 유전자 등의 항생제 내성 유전자일 수 있고, 특히, 선형 DNA에 포함된 유전자 DNA와 상이한 것을 특징으로 한 다. On the other hand, the selective marker may be an antibiotic resistance gene such as chloramphenicol, MLS antibiotic, kanamycin, spectinomycin, sulfonamide antibiotic, straptomycin resistance gene, etc., and is particularly different from genetic DNA contained in linear DNA do.

목적유전자가 불활성된 클로스트리듐 속 변이 미생물 제조 방법에 있어서, 상기 선택적 마커 제거 단계는 부위 특이적 재조합 효소를 발현시킴을 포함하는데, 예를 들어, 부위 특이적 재조합 효소가 플리페이즈(flippase, FLP)이고 재조합이 일어나는 부위가 FRT일 수 있고; 또는 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 재조합 효소이고 재조합이 일어나는 부위가 loxP 또는 mutant loxP일 수 있다. In the method for producing Clostridium < RTI ID = 0.0 > mutant < / RTI > microorganisms in which the desired gene is inactivated, the step of removing the selective markers comprises expressing a site- specific recombinase. For example, ) And the site of recombination may be FRT; Or the site-specific recombinase is a Cre recombinase and the site at which recombination occurs may be loxP or mutant loxP.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제작한, DNA 재조합 효소를 발현하고, 목적 유전자의 상동적 부위 및 선택적 마커를 포함하는 선형 DNA 벡터가 도입된, 목적 유전자가 불활성된 클로스트리듐 속 변이 미생물을 제공할 수 있다.The present invention also provides a clostridium genus mutant microorganism inactivated with a target gene by introducing a DNA DNA recombinant enzyme produced by the above method and containing a linear DNA vector containing a homologous region of a target gene and an optional marker can do.

본 발명은 람다 레드 재조합 효소 또는 RecET 재조합 효소를 이용하여, 빠르고 간편하게 클로스트리듐 속 미생물의 특정 유전자를 불활성화하는 데 유용하다.따라서, 원하는 목적 유전자를 간단히 불활성화시킨 클로스트리듐 속 미생물을 이용하는데 효과적으로 사용할 수 있다. The present invention is useful for rapidly and conveniently inactivating a specific gene of Clostridium microorganism by using Lambda Red recombinase or RecET recombinase. Therefore, it is possible to utilize Clostridium sp. Microorganism Can be effectively used.

이하 본 발명을 구체적으로 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에서 유전자의 '불활성화'란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당 유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다. In the present invention, "inactivation" of a gene refers to mutating, substituting, or deleting a part or whole base of the gene, or introducing a part of a base to prevent the gene from being expressed or expressing an enzyme activity even if it is expressed Concept, all of which block the biosynthetic pathway involved in the enzyme of the gene of interest.

본 발명에서 ‘상동적 부위’와 ‘재조합 부위’는 서로 같은 의미로 사용될 수 있으며, 같은 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있는 다른 영역의 DNA와 상동적 재조합을 일으킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 따라서, 본 발명에서 '목적 유전자의 상동적 부위'라고 함은 목적 유전자의 DNA와 상동적 재조합을 일으킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 말하는 것이다. In the present invention, 'homologous site' and 'recombination site' can be used interchangeably and refer to a nucleotide sequence capable of homologous recombination with DNA in another region having the same nucleotide sequence. Thus, in the present invention, the term 'homologous site of a target gene' refers to a nucleotide sequence capable of causing homologous recombination with DNA of a target gene.

본 발명에서 ‘재조합 효소’란 단독으로 또는 다른 단백질과 공동으로 작용하여 상동 재조합을 유발하는 단일 효소 또는 효소군을 지칭한다. The term " recombinant enzyme " as used herein refers to a single enzyme or a group of enzymes that act synergistically with other proteins to cause homologous recombination.

본 발명에서 ‘부위 특이적 재조합 효소 체계’는 특정 DNA 서열을 인식하여 재조합을 일으키는 단일 효소 또는 효소군으로 구성된 체계를 의미하며 서열을 의 재배치나 결실 등을 유발할 수 있다. 대표적인 예로는 플리페이즈(flippase. FLP) 또는 Cre 재조합 효소 등이 있다.In the present invention, the 'site-specific recombinase system' means a system consisting of a single enzyme or an enzyme group that recognizes a specific DNA sequence and induces recombination, and may cause rearrangement or deletion of the sequence. Representative examples include flippase (FLP) or Cre recombinase.

본 발명에서 ‘선택적 마커’란 특정 유전자의 산물을 말하는 것으로, 이 산물을 포함하는 미생물은 포함되지 않은 미생물에는 나타나지 않는 특별한 형질을 나타내어 쉽게 구별할 수 있게 된다.In the present invention, 'selective marker' refers to a product of a specific gene. Microorganisms containing this product exhibit a special characteristic that does not appear in microorganisms not containing the product, and thus can be easily distinguished.

본 발명에서 ‘스크리닝’이란 특정한 미생물을 구별하여 선택하는 작업을 의미하며, 여기에서 특정한 미생물이란 다른 미생물에는 없는 특정한 표현형 또는 특정 DNA 서열을 가지는 것을 포함하는 개념이다.In the present invention, the term 'screening' refers to a task of discriminating and selecting a specific microorganism. Herein, a specific microorganism is a concept including a specific phenotype or a specific DNA sequence which is not found in other microorganisms.

본 발명에서 ‘상동성’ 또는 ‘상동적’이란 재조합이 일어나는 부위에 적용되며, 두 DNA가 서로 동일하거나 거의 동일한 뉴클레오타이드 서열을 공유하고 있음을 의미한다.In the present invention, 'homology' or 'homology' is applied to a site where recombination occurs, which means that two DNAs share the same or almost the same nucleotide sequence.

본 발명에서 ‘형질 전환’이란 특정 외래의 DNA 가닥을 세포 밖에서 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 가닥을 포함한 숙주 미생물은 ‘형질 전환된 미생물’이라 한다.In the present invention, "transfection" means introducing a specific foreign DNA strand into a cell from outside the cell. The host microorganism containing the introduced DNA strand is called a " transformed microorganism ".

본 발명에서 ‘제한 효소’란 특정한 DNA 뉴클레오타이드에 서열에 결합하여 DNA 내부를 절단하는 효소를 통칭한다.The term " restriction enzyme " in the present invention refers to an enzyme that binds to a specific DNA nucleotide and cleaves the inside of the DNA.

본 발명에서 ‘DNA 절단 효소’란 DNA 뉴클레오타이드에 서열에 관계없이 비특이적으로 결합하여 DNA 양 말단에서 DNA를 절단하거나, DNA 내부를 절단하는 효소를 통칭한다.In the present invention, the term "DNA-cleaving enzyme" refers to an enzyme that binds to a DNA nucleotide nonspecifically regardless of the sequence, cleaves DNA at both ends of DNA, or cleaves DNA.

본 발명에서 ‘셔틀 벡터’란 두 이종 미생물 양쪽에서 복제 가능한 원점을 최소한 하나 이상 가지고 있거나, 각 미생물에서만 복제 가능한 원점을 모두 가지고 있어서 두 이종 미생물에서 모두 안정적으로 복제 가능한 벡터를 의미한다.In the present invention, the term 'shuttle vector' means a vector that has at least one origin that can be replicated on both microbes, or a vector that can replicate stably in both microbes, because it has all origin points that can be replicated only in each microorganism.

본 발명은 일 관점에서, 클로스트리듐 속 미생물에 존재하는 목적 유전자를 불활성화시키는 방법 및 이를 이용하여 목적유전자가 불활성된 클로스트리듐 속 변이 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 개략적인 과정은 도 1에 도시하고 있다.In one aspect, the present invention relates to a method of inactivating a gene of interest present in a microorganism of the genus Clostridium, and a method of producing a microorganism of the genus Clostridium genus inactivated by using the same. An outline process is shown in Fig.

도 1은 람다 레드 또는 RecET 재조합 효소를 발현하는 클로스트리듐 속 미생물에서 선형 DNA를 도입하여 특정 유전자를 불활성화하는 방법을 나타내는 도식이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에서는 클로스트리듐 속 미생물에서 람다 레드(exo, gam, bet) 또는 recE 및 recT 등 선형 DNA 재조합에 관여하는 유전자를 발현시키면 선형 DNA를 도입함으로써 특정 유전자를 불활성화시킬 수 있음을 확인하고자 하였다. 상기 재조합 효소를 도입하여 향상된 선형 DNA의 재조합 능력은 야생형 균주에 선형 DNA를 도입하고 스크리닝된 균주의 개수를 비교함으로써 확인할 수 있었다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for inactivating a specific gene by introducing linear DNA into Clostridium sp. Microorganism expressing Lambda red or RecET recombinase. As shown in FIG. 1, in the present invention, when a gene involved in linear DNA recombination such as lambda red (exo, gam, bet) or recE and recT is expressed in Clostridium sp. Microorganism, And to activate it. The recombinant ability of the improved linear DNA by introducing the recombinant enzyme was confirmed by introducing linear DNA into wild type strain and comparing the number of screened strains.

본 발명에서는 상동 재조합 방법(homologous recombination)을 이용하여 클로스트리듐 속 미생물의 염색체 내에 있는 유전자를 불활성화시킨다. In the present invention, a homologous recombination method is used to inactivate a gene in the chromosome of Clostridium microorganism.

즉, 항생제 저항성 유전자를 목적 유전자의 염기서열을 갖는 유전자 절편 중에 삽입하여 목적 유전자절편의 작용을 불활성화 시킨 후, 다시 이 불활성화된 목적 유전자 절편을 균주 내에 도입시켜 염색체 내의 목적 유전자와 이 불활성화된 목적 유전자 절편 사이에 이중 교차 재조합(double crossover recombination)이 일어나도록함으로써, 미생물의 염색체 내 목적 유전자가 불활성화 되도록 한다. 이 때, 항생제 저항성 유전자에 의해 목적 유전자 절편이 도입되어 목적 유전자가 불활성화된 균주만을 쉽게 선별할 수 있다. 이러한 재조합 과정에 관여하는 효소를 DNA 재조합효소라고 부르는데, 본 발명에서는 특히, DNA 재조합 효소를 발현하는 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물에서 목적 유전자를 불활성화 시키는 것을 특징 으로 한다. That is, an antibiotic resistance gene is inserted into a gene fragment having a base sequence of a target gene to inactivate the action of the target gene fragment, and then the inactivated target gene fragment is introduced into the strain, (Double crossover recombination) occurs between the target gene fragments of the microorganism, so that the desired gene in the chromosome of the microorganism is inactivated. At this time, only the strain in which the target gene is inactivated by introducing the target gene fragment by the antibiotic resistance gene can be easily selected. An enzyme involved in such a recombination process is called a DNA recombinant enzyme. In the present invention, in particular, a target gene is inactivated in a transformed Clostridium microorganism expressing a DNA recombinase.

따라서, 본 발명의 클로스트리듐 속 미생물 내 유전자 불활성화 방법은 Therefore, the gene inactivation method in the clostridium sp. Microorganism of the present invention

(a) DNA 재조합 효소를 발현하는, 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물을 제작하는단계; 및(a) preparing a transformed Clostridium microorganism expressing a DNA recombinant enzyme; And

(b) 상기 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물에 목적 유전자의 상동적 부위 및 선택적 마커를 포함하는 선형 DNA 벡터를 도입하는 단계를 포함한다. (b) introducing into the transformed Clostridium microorganism a linear DNA vector comprising a homologous region of the gene of interest and an optional marker.

또한, 나아가, 본 발명의 목적유전자가 불활성된 클로스트리듐 속 변이 미생물 제조 방법은Furthermore, the method for producing a Clostridium mutant microorganism in which the objective gene of the present invention is inactivated

(a) DNA 재조합 효소를 발현하는, 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물을 제작하는단계;(a) preparing a transformed Clostridium microorganism expressing a DNA recombinant enzyme;

(b) 상기 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물에 목적 유전자의 상동적 부위 및 선택적 마커를 포함하는 선형 DNA 벡터를 도입하는 단계; 및(b) introducing into the transformed Clostridium microorganism a linear DNA vector comprising a homologous region of the gene of interest and an optional marker; And

(c) 상기 선택적 마커를 제거하는 단계를 포함한다. (c) removing the selective marker.

'유전자 불활성화' 돌연변이는 시험관내에서 반드시 필요한 것은 아니지만 편리하게는 우성 선별 마커를 제공하는 외래 DNA 조각이 천연 염색체 DNA의 특정 단백질 암호화 영역내에 삽입되고 그 서열이 불활성화된 것을 가리킨다. 단백질 암호화 영역내에서의 불활성화 돌연변이는 야생형 단백질의 발현을 억제하고 보통 그 단백질에 의해 제공되는 기능을 상실시킨다.A "gene inactivation" mutation is not necessarily required in vitro, but conveniently indicates that a foreign DNA fragment providing the dominant selectable marker is inserted into a specific protein-encoding region of the native chromosomal DNA and the sequence is inactivated. Inactivating mutations in the protein-coding region inhibit the expression of wild-type proteins and usually abolish the function provided by the protein.

불활성화 절차는 불활성화 유전자 카세트를 균주의 배양물과 혼합하여 수행 할 수 있다. 천연적으로 균주는 DNA 유입에 대해 컴피턴트하여 형질전환할 수 있으나 사전에 균주를 적절한 방법에 의해 DNA 유입을 위해 컴피턴트하도록 만드는 것이 바람직하다(참조: LeBlanc et al., Plasmid 28, 130-145, 1992; Pozzi et al., J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996). 불활성화 유전자 카세트는 선별 마커를 제공할 수 있는 외래 DNA 조각이 클로닝된 천연 염색 DNA의 절편을 가리킨다. 불활성화 유전자 카세트는 게놈 DNA의 절편내에 외래 DNA 조각을 도입하고 이 서열의 야생형 염색체 카피를 불활성화 카세트로 치환시킴으로 형성된다. 한 양태로서 불활성화 프로토콜은 표적 부위 DNA를 포함한 '테일'이 불활성화 카세트의 5' 및 3' 말단에 남아 있도록 표적 DNA내로 외래 DNA 조각을 클로닝하는 것을 포함한다.The inactivation procedure can be performed by mixing the inactivated gene cassette with the culture of the strain. Naturally, the strains can be transformed by recombination with the DNA entry, but it is desirable to make the strain competent for DNA entry by appropriate methods (see LeBlanc et al., Plasmid 28, 130-145 , 1992; Pozzi et al., J. Bacteriol., 178, 6087-6090, 1996). The inactivated gene cassette refers to a fragment of native dyed DNA in which a foreign DNA fragment capable of providing a selectable marker has been cloned. An inactivated gene cassette is formed by introducing a foreign DNA fragment into a fragment of genomic DNA and replacing the wild-type chromosome copy of this sequence with an inactive cassette. In one embodiment, the inactivation protocol involves cloning the foreign DNA fragment into the target DNA such that a 'tail' containing the target site DNA remains at the 5 'and 3' ends of the inactivated cassette.

테일은 적어도 50개의 염기쌍이어야 하고 바람직하게는 효율적인 재조합 및/또는 유전자 전환을 위해 200 내지 500개 염기쌍이어야 한다. 편리상 표적 DNA내로 클로닝된 외래 DNA는 또한 선별 마커, 예를 들면 항생제 내성 유전자를 제공한다. 표적 DNA가 항생제 내성 유전자에 의해 불활성화되는 경우 형질전환체의 선별은 적절한 항생물질이 함유된 한천 평판상에서 실시한다. 형질전환 후 불활성화 카세트가 유입된 세포 분획은 그 카세트의 게놈 DNA 테일을 따라 동종 재조합 또는 유전자 전환을 겪게 되고 결국 야생형 게놈 서열은 불활성화 카세트로 치환된다. 불활성화 재조합이 이루어졌는지의 여부는 예를 들면 써던 블로팅 하이브리드화에 의해 쉽게 확인할 수 있으며, 더욱 편리하게는 PCR에 의해 검증할 수 있다.The tail should be at least 50 base pairs and should preferably be between 200 and 500 base pairs for efficient recombination and / or gene transfer. Conveniently, the exogenous DNA cloned into the target DNA also provides a selectable marker, e. G. An antibiotic resistance gene. If the target DNA is inactivated by an antibiotic resistance gene, selection of the transformant is performed on an agar plate containing appropriate antibiotics. After the transformation, the cell fraction into which the inactivated cassette is introduced undergoes homologous recombination or gene transfer along the genomic DNA tail of the cassette, and the wild-type genome sequence is eventually substituted with the inactivated cassette. Whether or not the inactivated recombination has been accomplished can be easily confirmed, for example, by Southern blotting hybridization, and more conveniently verified by PCR.

당업자는 본 발명의 불활성화 카세트 및 DNA 절편을 일반적인 클로닝 방법에 의해 제조될 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명에 따른 fadR 유전자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR 증폭 방법이 바람직하다. PCR 증폭 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다(참조: PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M.Innis et al., Academic Press (1990)). PCR은 게놈 DNA, 적합한 효소, 프라이머 및 완충액을 포함하고 편리하게는DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn. USA)에서 실시한다. 양성 PCR 결과는 예를 들면 적절한 크기의 DNA 절편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 검출함으로써 결정한다.Those skilled in the art will appreciate that the inactivated cassettes and DNA fragments of the present invention can be prepared by conventional cloning methods. A PCR amplification method using an oligonucleotide primer targeting the fadR gene according to the present invention is preferable. PCR amplification methods are well known in the art (see PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M.Innis et al., Academic Press (1990)). PCR involves genomic DNA, suitable enzymes, primers, and buffers and is conveniently performed in a DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn. USA). Positive PCR results are determined, for example, by detecting DNA fragments of appropriate size by agarose gel electrophoresis.

본 발명에서 사용되는 미생물은 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물이다.클로스트리듐(Clostridium) 속(genus, 屬) 미생물은 그람 양성 간균(Gram-positive rod bacteria)이고 완전 혐기성이며, 염색체 DNA의 GC 함량이 낮고, 내생포자(endospore)를 형성하는 특성을 가진다. 또한 이 미생물군은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 미생물 다음으로 가장 큰 분류군을 형성하는 속 중의 하나이다(Durre, 2005). 클로스트리듐 속은 병원균, 부티르산 발효균, 부탄올 발효균, 에탄올 발효균 등 다양한 특성을 가진 미생물을 포함하고 있어, 의학 및 생물공학 분야에서의 관심이 높다.The microorganism used in the present invention is a Clostridium genus microorganism. The Clostridium genus microorganism is a Gram-positive rod bacteria and is completely anaerobic. The GC of the chromosomal DNA It is low in content and has the property of forming an endospore. This microbial population is also one of the largest taxa following Streptomyces genus (Durre, 2005). Clostridium spp. Contains microorganisms having various characteristics such as pathogenic bacteria, butyric acid fermenting bacteria, butanol fermenting bacteria, and ethanol fermenting bacteria, and thus has a high interest in the fields of medicine and biotechnology.

본 발명에서는, 클로스트리듐 속(genus)이면 제한없이 사용할 수 있는데, 예를 들어, 상기 클로스트리듐 속 미생물이 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butylicum), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 타이로부틸리쿰(Clostridium tyrobutylicum), 클로스트리듐 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)을 사용하였다. In the present invention, any clostridium genus can be used without limitation. For example, the clostridial microorganism may be selected from the group consisting of Clostridium acetobutylicum, Clostridium bacillus, beijerinckii, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium spp. But are not limited to, Clostridium difficile, Clostridium butyricum, Clostridium butylicum, Clostridium kluyveri, Clostridium tirobutylicum Clostridium tyrobutylicum, Clostridium tyrobutyricum, and the like. In one embodiment of the present invention, Clostridium acetobutylicum was used.

본 발명의 일 실시예로, 클로스트리듐 속 미생물 유전자를 불활성화시키는 방법 및 이를 이용한, 목적 유전자가 불활성화된 변이 클로스트리듐 속 미생물 제조방법은 다음의 과정을 포함할 수 있다. In one embodiment of the present invention, a method for inactivating a Clostridium genus microorganism gene and a method for producing a mutant Clostridium genus microorganism in which a target gene is inactivated using the same may include the following steps.

(i) 본 발명의 방법에서는 우선, DNA 재조합 효소를 발현하는, 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물을 제작한다. 이를 위하여, 상기 DNA 재조합 효소 코딩 유전자를 함유하는 벡터를 도입하는 방법을 대표적으로 사용할 수 있다. (i) In the method of the present invention, a transformed Clostridium microorganism expressing DNA recombinase is first prepared. For this purpose, a method of introducing a vector containing the DNA recombinase coding gene may be typically used.

이 때, DNA 재조합 효소는 람다 레드 재조합 효소 또는 RecET 재조합 효소일 수 있다. 그리고, 상기 DNA 재조합 효소 코딩 유전자는 exo, gam 또는 bet 등이 있다. At this time, the DNA recombinase may be a lambda red recombinase or a RecET recombinant enzyme. The DNA recombinase coding gene includes exo, gam or bet.

람다 레드 재조합 효소’, ‘람다 레드 재조합 체계’, ‘람다 레드 체계’ 는 서로 같은 의미로 사용될 수 있으며, 박테리오파지(bacteriophage) 람다의 3개의 유전자인 exo, gam, bet에서 발현되는 효소군을 의미한다. 이 효소들은 일반적으로 대장균에서 선형 DNA의 상동 재조합 빈도를 증가시키는 것으로 알려져 있다.Lambda Red Recombinase, Lambda Red Recombination System and Lambda Red System can be used interchangeably and mean a group of enzymes expressed in three genes of bacteriophage lambda, exo, gam, bet . These enzymes are generally known to increase the homology recombination frequency of linear DNA in E. coli.

RecET 재조합 효소’는 대장균의 게놈에 존재하는 프로파지(prophage) Rac의 유전자로써 람다 레드 재조합 효소와 유사한 방법으로 이용될 수 있음이 알려져 있다(Zhang et al., Nat. Genet., 20:123-128, 1998).RecET recombinase 'is a gene of the prophage Rac present in the genome of Escherichia coli and can be used in a similar manner to the lambda red recombinase (Zhang et al., Nat. Genet., 20: 123- 128, 1998).

DNA 재조합 효소를 발현하는, 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물을 제작하는 방법으로, 이하와 같은 방법을 일례로서 실시할 수 있다. As a method for producing a transformed Clostridium microorganism expressing a DNA recombinant enzyme, the following method can be carried out as an example.

우선, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 람다 레드 재조합 효소를 발현시킬 벡터의 제작한다. 람다 레드 재조합 효소의 안정적인 발현을 위해서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 안정적으로 복제되는 셔틀 벡터인 pIMP1을 사용할 수 있다. 여기에 람다 레드 재조합 효소를 발현시키기 위해서는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 자체 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 그 중에서도 싸이올레이즈의 프로모터는 세포의 생장기에 크게 영향받지 않고 RNA를 고르게 전사하는 것으로 알려져 있다(Tummala et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:3793~3799, 1999).First, a vector is prepared which expresses a lambda red recombinase in clostridium acetobuttilicum. For the stable expression of lambda red recombinase, pIMP1, which is a shuttle vector stably replicating in clostridium acetobuttilicum, can be used. In order to express the lambda red recombinase therein, it is preferable to use its own promoter of clostridium acetobuttilicum. Among them, the promoter of thyroidase is known to transcribe RNA uniformly without being greatly affected by the cell growth period (Tummala et al., Appl. Environ. Microbiol., 65: 3793-3799, 1999).

그리고, 상기 람다 레드 재조합 효소를 발현하는 클로스트리듐-대장균 셔틀 벡터를 제작한다.Then, a clostridium-E. coli shuttle vector expressing the lambda red recombinase is prepared.

앞서 제작한 벡터에 람다 레드 재조합 효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하는데, 람다 레드 재조합 효소 유전자 3개를 포함하는 DNA를 주형으로 하고, PCR을 수 행한다. To clone the gene coding for the lambda red recombinase in the previously prepared vector, PCR is carried out using DNA comprising three lambda red recombinase genes as a template.

이 때, DNase와 제한효소 활성(Restriction enzyme activity)때문에 클로스트리듐 균주에서 형질전환 효율(Transformation efficiency)이 급격히 저하되므로, 본 발명에서는 DNase나 제한효소를 선택적으로 약화시키기 위해 antisense RNA를 도입할 수 있다. In this case, because the transformation efficiency of the Clostridium strain is rapidly lowered due to the DNase and the restriction enzyme activity, the present invention can introduce the antisense RNA to selectively weaken the DNase or the restriction enzyme have.

즉, 특히, 숙주 세포내로 도입될 외래 유전자들의 안정성 확보를 위하여,상기 벡터가 클로스트리듐 속 미생물 내의 제한 효소 또는 DNase의 활성을 감소 또는 제거킬 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 클로스트리듐 속 미생물 내의 제한 효소 또는 DNase의 안티센스(antisense) RNA를 전사할 수 있다. 즉,클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 제한 효소의 antisense RNA 발현 서킷을 독립적인 프로모터로 조절되게 벡터를 제작하는 것이 바람직하다.That is, in order to ensure the stability of foreign genes to be introduced into the host cell, it is preferable that the vector is capable of reducing or eliminating the activity of a restriction enzyme or a DNase in a clostridium microorganism. For example, antisense RNAs of restriction enzymes or DNases in Clostridium sp. Microorganisms can be transcribed. That is, it is preferable to construct the vector so that the antisense RNA expression circuit of the restriction enzyme of clostridium acetobuttilicum is regulated by an independent promoter.

한편, 상기 벡터는 복제 안정성이 온도에 의해 조절되는 것을 특징으로 한다. 상기 벡터는 37℃에서 숙주 세포 내에서 복제가 정상적으로 일어나지만, 30℃로 배양 온도를 변경하게 될 경우, 숙주 세포 내에서 벡터 플라스미드의 복제가 더 이상 진행되지 않아 다음 세대로 벡터 플라스미드의 유전이 되지 않는 특징을 가진다. 따라서, 본 발명에서는 벡터 플라스미드의 복제가 불안정한 조건을 30℃로 하였으나, 상기와 같은 큐어링(curing)을 위한 온도는 이에 제한되지 않고 다양하게 변경하여 사용할 수 있다. On the other hand, the vector is characterized in that the copying stability is controlled by the temperature. The vector normally replicates in the host cell at 37 ° C. However, when the culturing temperature is changed to 30 ° C, the replication of the vector plasmid does not proceed further in the host cell, resulting in the generation of the vector plasmid in the next generation Have features. Therefore, in the present invention, the condition for the replication of the vector plasmid is unstable at 30 ° C, but the temperature for curing as above is not limited thereto and can be variously changed.

이처럼, 본 발명에서는 상기 온도민감형 벡터(플라스미드)를 이용하는 것을 특징으로 한다. 특히, 당업계에 통상적으로 쓰이고 있는 대장균의 플라스미드 레플 리콘(replicon)과 클로스트리듐의 레플리콘은 기본적으로 완전히 다르기 때문에, 통상적인 대장균의 온도민감형 레플리콘을 그대로 클로스트리듐에 사용할 수 없고, 클로스트리듐 전용의 온도민감형 레플리콘을 제작할 필요가 있다. 현재까지 클로스트리듐에서의 온도민감형 레플리콘이 개발되어 있지 않았으나, 본 발명에서는 클로스트리듐의 온도 민감형 레플리콘을 돌연변이 또는 rational design으로 개발하여 replication protein (Rep protein)의 발현을 온도에 따라 조절할 수 있게 하였다.As described above, in the present invention, the temperature-sensitive vector (plasmid) is used. In particular, since the plasmid replicons of E. coli and replicons of clostridium, which are conventionally used in the art, are fundamentally completely different, conventional E. coli temperature-sensitive replicons can be used directly as clostridium There is no need to produce temperature-sensitive replicons dedicated to Clostridium. In the present invention, temperature-sensitive replicons in clostridium have not been developed. However, in the present invention, the temperature-sensitive replicons of clostridium have been developed as mutational or rational designs, and the expression of replication protein (Rep protein) . ≪ / RTI >

다음으로, 이와 같이 제작한 셔틀 벡터를 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에 형질 전환하여 실제로 람다 레드 재조합 효소를 발현하는 균주를 제작한다. 형질전환 방법은 당업계에 일반적으로 알려져 있는 공지의 방법을 적절히 사용할 수 있다. Next, a shuttle vector thus prepared is transformed into clostridium acetobutylicum to produce a strain that actually expresses the lambda red recombinase. As the transformation method, known methods generally known in the art can be suitably used.

본 발명의 일구체예에서는 이 때, 대장균을 이용하였다.In one embodiment of the present invention, Escherichia coli was used at this time.

클로스트리듐 아세토부틸리쿰에는 제한 효소인 Cac824I이 포함되어 있고, 상기 Cac824I의 절단 부위가 메틸화되면 절단이 일어나지 않으므로, 형질 전환된 DNA가 잘리는 것을 방지하기 위해서, 이 부위를 메틸화하는 메틸기 전달 효소를 발현하는 벡터가 들어있는 대장균 균주에 형질 전환한 후, 이 대장균 균주를 배양하여 대량으로 플라스미드 DNA를 정제하고, 이를 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 형질 전환에 사용하였다. Clostridium acetobutylicum contains the restriction enzyme Cac824I. Since the cleavage site of Cac824I is not cleaved when the cleavage site of the Cac824I is methylated, in order to prevent the transfected DNA from being cleaved, methyl group transferase After transforming E. coli strains containing the expression vector, the E. coli strains were cultured and the plasmid DNA was purified in large quantities and used for transformation of Clostridium acetobutylicum.

이 때 대장균에 사용된 벡터는 대장균 내에서 수가 적게 유지되는 low copy 플라스미드이면서, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 복제되지 않는 것이 바람직하다. At this time, the vector used for Escherichia coli is preferably a low copy plasmid in which a small number of Escherichia coli is maintained, but not replicated in Clostridium acetobutylicum.

(ii) 다음으로, 상기 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물에 목적 유전자의 상동적 부위 및 선택적 마커를 포함하는 선형 DNA 벡터를 도입한다. 그리고, 상기 선택적 마커를 제거한다.(ii) Next, a linear DNA vector containing a homologous region of the gene of interest and an optional marker is introduced into the transformed Clostridium microorganism. Then, the selective marker is removed.

즉, 상기 람다 레드 재조합 효소를 발현하는 모균주에 부위특이적 재조합효소(site-specific recombinase) 결합 부위가 양 말단에 존재하는 선택적 마커, 즉 항생제 저항성 유전자를 포함하는 목적 유전자 절편인 선형 DNA을 도입시켜 상기 목적 유전자 절편과 염색체 내의 목적 유전자간에 동형 재조합이 일어나게 한다. 이 때, 선택적 마커인 항생제 저항성 유전자에 의해 목적 유전자 절편이 도입되어 목적 유전자가 불활성화된 균주만을 쉽게 선별할 수 있다. 상기 선택적 마커는 선형 DNA에 포함된 목적 유전자 DNA와 상이해야 한다. 즉, 벡터에 포함된 유전자 DNA와 상이한 것을 특징으로 한다.That is, the parent strain expressing the lambda red recombinase is introduced with a linear DNA that is a target gene fragment containing an optional marker, that is, an antibiotic resistance gene in which a site-specific recombinase binding site exists at both ends Thereby causing homotypic recombination between the target gene fragment and the target gene in the chromosome. At this time, the target gene fragment is introduced by the selective marker, the antibiotic resistance gene, so that only the strain in which the target gene is inactivated can be easily selected. The selectable marker should be different from the target gene DNA contained in the linear DNA. That is, different from the gene DNA contained in the vector.

목적 유전자를 불활성화시키기 위해 삽입되는 선택적 마커는 항생제 내성(저항성) 유전자이고, 이러한 항생제 저항성 유전자로는 클로람페니콜, MLS 항생제, 카나마이신, 스펙티노마이신, 설폰아마이드계 항생제, 스트랩토마이신 내성 유전자, 젠타마이신 저항성 유전자 또는 앰피실린 저항성 유전자 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The selective marker inserted to inactivate the target gene is an antibiotic resistance gene. Examples of the antibiotic resistance gene include chloramphenicol, MLS antibiotic, kanamycin, spectinomycin, sulfonamidic antibiotic, straptomycin resistance gene, A resistance gene, an ampicillin resistance gene, and the like.

이 후, 부위특이적 재조합 효소의 발현을 통하여 염색체의 목적 유전자 내부에 존재하던 항생제 저항성 유전자(선택적 마커)를 제거하고, 목적 유전자 내부에 부위특이적 재조합 효소 결합 부위가 존재함으로써 목적 유전자가 불활성화된 클로스트리듐 속 미생물을 수득한다. Thereafter, an antibiotic resistance gene (selective marker) existing in the target gene of the chromosome is removed through the expression of a site-specific recombinase, and a site-specific recombinase binding site is present in the target gene, Clostridium microorganism is obtained.

즉, 항생제 저항성 특성을 이용하여 목적 유전자가 불활성화된 균주만을 선별한 후, 부위 특이적 재조합 효소를 발현시켜 균주의 염색체 내부에 삽입한 항생제 저항성 유전자를 제거한다. That is, only the strain in which the target gene is inactivated is selected using the antibiotic resistance characteristic, and then the site specific recombinase is expressed to remove the antibiotic resistance gene inserted into the chromosome of the strain.

항생제 저항성 유전자와 함께 목적 유전자 내에 부위특이적 재조합효소가 결합되는 부위를 삽입하고, 목적 유전자가 불활성화된 균주 내에 부위특이적 재조합효소를 발현시켜 항생제 저항성 유전자를 제거한다. 이를 위해 부위특이적 재조합효소 FLP, Cre또는 XerC/D가 결합하는 부위를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 부위 특이적 재조합 효소가 플리페이즈(flippase, FLP)이고 재조합이 일어나는 부위가 FRT이거나, 또는 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 재조합 효소이고 재조합이 일어나는 부위가 loxP 또는 mutant loxP인 것일 수 있다. Specific antibiotic resistance gene is removed by inserting a site to which a site-specific recombinase is bound in the target gene together with an antibiotic resistance gene and expressing a site-specific recombinase in a strain in which the target gene is inactivated. For this purpose, the region to which the site-specific recombinase FLP, Cre or XerC / D binds may be used, but is not limited thereto. Preferably, the site-specific recombinase is a flippase (FLP), the site where recombination occurs is FRT, or the site-specific recombinase is a Cre recombinase and the recombination site is loxP or mutant loxP have.

구체적으로, 미생물 염색체 내 목적 유전자를 불활성화시키기 위해, 양 말단에 loxP 부위가 결합된 클로람페니콜 저항성 유전자를 포함하는 목적 유전자 절편을 사용할 수 있고, 상기 loxP 부위는 부위특이적 재조합효소인 Cre가 결합되는 부위로써, 균주내에서 Cre 효소의 발현 및 작용에 의해 loxP 부위 사이에 있는 항생제 저항성 유전자가 염색체로부터 제거된다.Specifically, in order to inactivate the target gene in the microbial chromosome, a target gene fragment containing a chloramphenicol resistance gene to which a loxP site is bound at both ends can be used. The loxP site is linked to Cre, which is a site-specific recombinant enzyme As a result, the antibiotic resistance gene between the loxP sites is removed from the chromosome by the expression and action of Cre enzyme in the strain.

상기에서 균주내 Cre 효소의 발현은 당업계에 공지된 방법이 이용될 수 있으며, 예를 들어, cre 유전자를 포함하고 있는 플라스미드를 균주에 도입하여 Cre 효 소가 균주내에서 발현되게 할 수 있다. Expression of the Cre enzyme in the strain may be performed by a method known in the art. For example, a plasmid containing the cre gene may be introduced into a strain to express the Cre enzyme in the strain.

이와 같이, 항생제 저항성 유전자가 제거됨으로써, 동일한 균주 내에서 다른 종류의 유전자를 불활성화시키고자 할 때 상기 항생제 저항성 유전자를 다시 선택적 마커로 사용할 수 있다.Thus, by removing the antibiotic resistance gene, the antibiotic resistance gene can be used as an optional marker when it is desired to inactivate another kind of gene in the same strain.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 람다 레드 재조합 효소를 구성하는 세 유전자인 gam, bet, exo 와 엑소뉴클레아제 VIII(recE), DNA 재조합 및 복원 단백질(recT) 중 하나 이상을 발현하는 것을 특징으로 하는 클로스트리듐 속 미생물을 제작할 수 있다. As described above, according to the method of the present invention, expression of at least one of three genes, gam, bet, exo and exonuclease VIII (recE), DNA recombination and restoration protein (recT) constituting the lambda red recombinase And a microorganism belonging to the genus Clostridium.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서 DNA 재조합 효소를 발현하고, 목적 유전자의 상동적 부위 및 선택적 마커를 포함하는 선형 DNA 벡터가 도입된, 목적 유전자가 불활성된 클로스트리듐 속 변이 미생물에 관한 것이다. Accordingly, the present invention relates to a Clostridium genus-mutant microorganism in which a target gene-inactivated microorganism is introduced into which a linear DNA vector containing a homologous region of a target gene and an optional marker is expressed.

나아가, 상기 선택적 마커가 제거된, 목적 유전자가 불활성된 클로스트리듐 속 변이균주에 관한 것이다. Furthermore, the present invention relates to a Clostridium mutant strain in which the above-mentioned selective marker has been removed and the target gene is inactivated.

본 발명에서, 불활성 돌연변이 기술(Knockout Mutation Technology)을 이용하여 클로스트리듐 속 미생물의 염색체 상에 존재하는 목적 유전자를 재조합에 의해 불활성화시킨 상기 변이 미생물 또는 균주는, 불활성화시킨 목적 유전자에 따라 특정 용도로 이용할 수 있다. 가장 대표적으로, 본 발명의 클로스트리듐 속 미생물 변이 균주는 에탄올 또는 부탄올 생성에 효과적으로 이용할 수 있고, 특히, 목 적 유전자로는, 부산물 생성 회로에 관여하는 특정 유전자들을 불활성화 시켜, 아세톤과 같은 부산물의 생성 없이 연료로 바로 이용 가능한 부탄올 또는 에탄올·부탄올 혼합물을 고효율로 생산할 수 있는 미생물의 개발이 가능하다. In the present invention, the mutant microorganism or strain inactivated by recombination of a target gene present on the chromosome of the microorganism of the genus Clostridium using the inactivation mutation technology (Knockout Mutation Technology) It can be used for applications. Most notably, the Clostridium genus microbial strain of the present invention can be effectively used for the production of ethanol or butanol. Particularly, as a target gene, specific genes involved in the by-product production circuit are inactivated and byproducts such as acetone It is possible to develop a microorganism capable of producing a readily available butanol or ethanol / butanol mixture with high efficiency without generating fuel.

실시예Example

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

특히, 하기 실시예에서는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 플라스미드를 이용하여 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 유전자를 불활성화하는 방법만을 예시하였으나, 이 외에 다른 종류의 벡터와 클로스트리듐 속 미생물을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.In particular, in the following examples, only the method of inactivating the clostridium acetoobutylicum gene using a plasmid of Clostridium acetobutylicum has been exemplified. However, other types of vectors and clostridium The use of genus microorganisms will also be apparent to those skilled in the art.

또한, CAC824I의 활성 약화를 위하여 한종류의 antisense RNA를 이용한 방법만 예시하였으나, 다른 길이 및 부위 등 다른 종류의 antisense RNA를 이용하거나, 또 다른 방법으로 CAC824I의 활성을 약화시키는 방법을 사용하는 것 역시 당 업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.In order to attenuate the activity of CAC824I, only one type of antisense RNA was exemplified. However, using a different kind of antisense RNA such as a different length and region, or using another method to weaken the activity of CAC824I It will be said that it is self-explanatory.

실시예 1: 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 람다 레드 재조합 효소를 발현하는 벡터의 제작Example 1: Construction of a vector expressing lambda red recombinase in clostridium acetobutyrylchumum

1-1: 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 싸이올레이즈(thiolase) 프로모터와 라 이보좀 결합 부위를 포함하는 대장균-클로스트리듐 아세토부틸리쿰 셔틀 벡터의 제작1-1: Preparation of E. coli-clostridium acetobutylicum shuttle vector containing thiolase promoter of clostridium acetobutylicum and ribosome binding site

람다 레드 재조합 효소의 안정적인 발현을 위해서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 안정적으로 복제되는 셔틀 벡터인 pIMP1(Mermelstein et al., Biotechnology, 10:190~195, 1992)을 사용하였다. 이하, 'pIMP1’이란 대장균-클로스트리듐 아세토부틸리쿰 셔틀 벡터를 지칭한다.PIMP1 (Mermelstein et al., Biotechnology, 10: 190-195, 1992), which is a shuttle vector stably replicating in Clostridium acetoobutylicum was used for stable expression of lambda red recombinase. Hereinafter, 'pIMP1' refers to Escherichia coli-clostridium acetobutylicum shuttle vector.

그리고, 상기 셔틀 벡터에 람다 레드 재조합 효소를 발현시키기 위해 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 자체 프로모터인 싸이올레이즈(NCBI GeneID:1119056)의 프로모터를 사용하였다. In order to express the lambda red recombinase in the shuttle vector, the promoter of Clostridium acetobutylicum's own promoter, Cyollase (NCBI GeneID: 1119056), was used.

우선, 싸이올레이즈(NCBI GeneID:1119056) 상단에 위치한 프로모터를 클로닝하여 pIMP-H1del에 삽입하였다. First, the promoter located on the top of the cy allele (NCBI GeneID: 1119056) was cloned and inserted into the pIMP-H1del.

pIMP-H1del은 2개의 HindIII 제한효소 자리를 가지는 pIMP1으로부터 3408번째 염기서열에 존재하는 HindIII site 1개를 제거하고 743번째 염기열에 존재하는 제한효소 자리만 남겨둔 pIMP1을 주형으로하는 셔틀 벡터이다. pIMP-H1del is a shuttle vector having pIMP1 as a template, which removes one HindIII site existing in the 3408th nucleotide sequence from pIMP1 having two HindIII restriction enzyme sites and leaves only restriction enzyme sites in the 743th nucleotide sequence.

서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 ATCC 824 균주의 total DNA를 주형으로하여 PCR을 수행하여 싸이올레이즈 프로모터를 증폭하였다. 증폭된 싸이올레이즈 프로모터 단편들을 정제 및 회수 한 후, HindIII와 PstI 제한효소로 처리한 후, 동일 효소로 처리된 pIMP-H1del 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 pTHL2 벡터 제작을 완성하였다.PCR was performed using the total DNA of ATCC 824 strain as a template using the primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 to amplify the thialase promoter. The amplified thiolase promoter fragments were purified and recovered, treated with HindIII and PstI restriction enzymes, and ligated with the pIMP-H1del shuttle vector treated with the same enzyme to complete pTHL2 vector production.

[서열번호 1]: 5'-GGCCCCAAGCTTAGAATGAAGTTTCTTATGCACAAG-3'[SEQ ID NO: 1]: 5'-GGCCCCAAGCTTAGAATGAAGTTTCTTATGCACAAG-3 '

[서열번호 2]: 5'-AAACTGCAGCCATGGTCTAACTAACCTCCTAAATTTTGATAC-3'[SEQ ID NO: 2]: 5'-AAACTGCAGCCATGGTCTAACTAACCTCCTAAATTTTGATAC-3 '

1-2: 람다 레드 재조합 효소를 발현하는 클로스트리듐-대장균 셔틀 벡터의 제작1-2: Construction of Clostridium-Escherichia coli shuttle vector expressing lambda red recombinase

클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 람다 레드 재조합 효소가 발현될 수 있도록 상기 실시예 1-1에서 제작된 pTHL2에 람다 레드 재조합 효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하였다. A gene coding for lambda red recombinase was cloned into pTHL2 prepared in Example 1-1 so that lambda red recombinase could be expressed in clostridium acetobutyrylcomb.

람다 레드 재조합 효소 유전자 3개 gam, bet, exo를 포함하는 DNA인 pKD46(Datsenko and Wanner, PNAS, 97:6640~6645, 2000)을 주형으로 하고, 합성된 서열번호 3과 4의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 gam, bet, exo를 포함하는 절편(1742bp)을 제조하였다.Using the primers of SEQ ID NOS: 3 and 4 synthesized, using pKD46 (Datsenko and Wanner, PNAS, 97: 6640 to 6645, 2000) which is a DNA containing three gamma, bet and exo genes of lambda red recombinase gene as a template, The fragment (1742 bp) containing gam, bet, and exo was prepared by performing PCR.

[서열번호 3]: 5'-ACTCCCATGGATGAGTACTGCACTCGCAAC-3'[SEQ ID NO: 3]: 5'-ACTCCCATGGATGAGTACTGCACTCGCAAC-3 '

[서열번호 4]: 5'-AATCGGATCCTTCTTCGTCTGTTTCTACTG-3'[SEQ ID NO: 4]: 5'-AATCGGATCCTTCTTCGTCTGTTTCTACTG-3 '

그 후, PCR 산물과 pTHL2를 제한 효소(NcoI, BamHI)로 처리한 뒤, T4 DNA ligase로 처리하여 접합하고, 추가로 온도민감형 replicon으로 교체함으로써 재조합 플라스미드 벡터 pTHL2-LR을 제조하였다.Thereafter, the recombinant plasmid vector pTHL2-LR was prepared by treating the PCR product and pTHL2 with restriction enzymes (NcoI, BamHI), treating them with T4 DNA ligase, and then replacing them with temperature-sensitive replicons.

실시예 2: 람다 레드 재조합 효소를 발현하면서 클로스트리듐 아세토부틸리 쿰의 제한 효소를 억제하는 antisense RNA를 전사하는 셔틀 벡터의 제작Example 2: Construction of a shuttle vector transcribing antisense RNA that inhibits the restriction enzyme of Clostridium acetobuttilicum while expressing lambda red recombinase

숙주 세포내로 도입될 외래 유전자들의 안정성 확보를 위하여, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 제한 효소인 Cac824I 유전자의 antisense RNA 발현 서킷을 독립적인 싸이올레이즈 프로모터로 조절되게 pTHL2-LR-824I벡터를 제작하고자 하였다.To ensure the stability of the foreign genes to be introduced into host cells, the antisense RNA expression circuit of Cac824I gene, a restriction enzyme of clostridium acetobutyrylcum, was constructed to produce pTHL2-LR-824I vector to be regulated by an independent thyroid-raising promoter Respectively.

상기 실시예 1-1에서 제작한 pTHL2에서 NcoI 제한 효소가 제거된 벡터인 pTHL1을 이용하여 PstI과 EcoRI (Cac824I insert gene에 이 사이트 없는지 확인 요망) 제한효소로 처리하고, ATCC 824 균주의 total DNA를 주형으로하고 서열번호 5와 서열번호 6을 이용하여 PCR을 수행하여 증폭한 Cac824I 유전자의 antisense를 동일 제한효소로 처리한 후, 접합하여 pTHL1-824I를 완성하였다.PTHL1, which is a vector from which ncoI restriction enzyme was removed, was used in the pTHL2 prepared in Example 1-1, and the total DNA of ATCC 824 was treated with PstI and EcoRI (Cac824I insert gene was confirmed to have no site) restriction enzyme. As a template, PCR was performed using SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and the antisense of Cac824I gene amplified was treated with the same restriction enzyme and then ligated to complete pTHL1-824I.

[서열번호 5]: 5'-AAAACTGCAGAAATTGTTGTATTGGAATCTTTG-3'[SEQ ID NO: 5]: 5'-AAAACTGCAGAAATTGTTGTATTGGAATCTTTG-3 '

[서열번호 6]: 5'-GGAATTCGTTTTTAATGTGGAAGACTTAACTAG-3'[SEQ ID NO: 6]: 5'-GGAATTCGTTTTTAATGTGGAAGACTTAACTAG-3 '

[서열번호 7]: 5'-ACTCCCATGGAGAATGAAGTTTCTTATGCACAAG-3'[SEQ ID NO: 7]: 5'-ACTCCCATGGAGAATGAAGTTTCTTATGCACAAG-3 '

pTHL1-824I를 주형으로 하고 서열번호 7과 서열번호 6을 이용한 PCR을 수행하여 증폭한 단편을 BamHI과 EcoRI 제한효소로 처리하여, 동일 제한효소로 처리된 pTHL2-LR과 접합함으로써 pTHL2-LR-824I 벡터를 완성하였다. The fragment amplified by performing PCR using pTHL1-824I as a template and SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 6 was treated with BamHI and EcoRI restriction enzymes and then ligated with pTHL2-LR treated with the same restriction enzyme to obtain pTHL2-LR-824I The vector was completed.

상기 실시예 1에서 제조된 PCR 산물과 pTHL2-824I을 제한 효소(NcoI, BamHI)로 처리한 뒤, T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 벡터 pTHL2-LR-824I을 제조하였다.The recombinant plasmid vector pTHL2-LR-824I was prepared by treating the PCR product prepared in Example 1 and pTHL2-824I with restriction enzymes (NcoI, BamHI), followed by treatment with T4 DNA ligase.

실시예 3: 람다 레드 재조합 효소를 발현하는 클로스트리듐 속 미생물의 제작Example 3: Production of Clostridium sp. Microorganism expressing lambda red recombinase

상기 실시예 2에서 제작한 셔틀 벡터 pTHL2-LR를 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에 형질 전환하여 실제로 람다 레드 재조합 효소를 발현하는 균주를 제작하고자 하였다.The shuttle vector pTHL2-LR prepared in Example 2 was transformed into clostridium acetobutylicum to produce a strain expressing the lambda red recombinase.

클로스트리듐 아세토부틸리쿰에는 제한 효소인 Cac824I이 포함되어 있고, 상기 Cac824I의 절단 부위가 메틸화되면 절단이 일어나지 않으므로, 형질 전환된 DNA가 잘리는 것을 방지하기 위해서, 이 부위를 메틸화하는 메틸기 전달 효소를 발현하는 pAN1 벡터(Mermelstein and Papoutsakis, Appl. Environ. Microbiol. 59:1077~1081, 1993)가 들어있는 대장균 TOP10 균주(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)에 형질 전환하였다. 이하 ‘pAN1’이란 대장균에서만 복제 가능한 플라스미드로 고초균(Bacillus subtilis) 파지(phage)의 φ3TI 메틸 전달 효소를 발현하는 플라스미드를 지칭한다.Clostridium acetobutylicum contains the restriction enzyme Cac824I. Since the cleavage site of Cac824I is not cleaved when the cleavage site of the Cac824I is methylated, in order to prevent the transfected DNA from being cleaved, methyl group transferase (Invitrogen Inc., Carlsbad, Calif.) Containing the expression vector pAN1 (Mermelstein and Papoutsakis, Appl. Environ. Microbiol. 59: 1077-1081, 1993). Hereinafter, "pAN1" refers to a plasmid replicable only in Escherichia coli, and expresses a plasmid expressing φ3TI methyltransferase of Bacillus subtilis phage.

이 대장균 균주를 배양하여 대량으로 플라스미드 DNA를 정제한 후, 이를 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 형질 전환에 사용하였다. This E. coli strain was cultured and a large amount of plasmid DNA was purified and used for transformation of Clostridium acetoobutylicum.

상기 pAN1은 대장균 내에서 수가 적게 유지되는 low copy 플라스미드이고, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 복제되지 않으므로 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 형질 전환에 큰 영향을 미치지 않는다.The pAN1 is a low copy plasmid in which a small number is maintained in E. coli and is not replicated in clostridium acetobuttilicum, so that it does not greatly affect the transformation of clostridium acetobuttilicum.

클로스트리듐 아세토부틸리쿰을 형질 전환하기 위해서, 먼저 내생포자 현탁 액을 10 mL CGM 배지(Sillers et al., Biotechnol. Bioeng., 102:38-49, 2009)가 든 tube에 접종하고 내생포자 외의 세포들을 제거하기 위해 80℃로 10분간 가열 후 식힌 뒤, 37℃에서 혐기 배양하였다. To transform clostridium acetobutylicum, the endogenous spore suspension was first inoculated into a tube containing 10 mL CGM medium (Sillers et al., Biotechnol. Bioeng., 102: 38-49, 2009) The cells were incubated at 80 ° C for 10 min, cooled, and anaerobically incubated at 37 ° C.

이 과정 이후 원심분리 외의 모든 과정은 혐기 챔버심분에서 수행되었다. 600 nm에서의 광학밀도가 0.6이 되었을 때, 혐기 챔버심분에서 하루 이상 보관한 200 mL 2x YTG(16 g/L Bacto Tryptone, 10 g/L Bacto Yeast Extract, 4 g/L NaCl, 5 g/L glucose, pH 5.2) 배지가 든 플라스크에 배양액 10 mL을 접종하였다. After this process, all processes except centrifugation were carried out in the anaerobic chamber. When the optical density at 600 nm was 0.6, 200 mL 2x YTG (16 g / L Bacto Tryptone, 10 g / L Bacto Yeast Extract, 4 g / L NaCl, 5 g / L glucose, pH 5.2) medium was inoculated in a 10 mL culture.

이 때, 플라스크는 접종 전에 37℃가 되도록 미리 혐기 챔버심내 항온기에서 보관되었다. 이를 37℃에서 600 nm에서의 세포 농도(OD₆₀₀)가 1.1이 될 때까지 배양하였다. 그 뒤, 플라스크를 얼음에 넣고 30분간 냉각시켰고 3000 x g로 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액은 버리고 미리 얼음에 보관한 electroporation buffer 50 mL (270mM sucrose, 5mM NaH2PO4, pH 7.4)에 남은 세포를 모두 현탁하였다. At this time, the flask was stored in a thermostat in the anaerobic chamber in advance to be 37 DEG C before inoculation. This was incubated at 37 ° C until the cell concentration at 600 nm (OD ₆₀₀ ) reached 1.1. The flask was then placed in ice, allowed to cool for 30 minutes, and centrifuged at 3000 xg. After centrifugation, the supernatant was discarded and all remaining cells were suspended in 50 mL of electroporation buffer (270 mM sucrose, 5 mM NaH2PO4, pH 7.4) previously stored on ice.

이 현탁액을 다시3000 x g로 원심분리한 뒤, 2.3mL의 electroporation buffer에 세포 덩어리를 모두 현탁하였다. 이를 0.4 mm gap electroporation cuvette에 0.5 mL씩 담는 접여기에 정제된 pTHL2-LR/pAN1 DNA를 20 μg 정량하여 넣었다. The suspension was centrifuged again at 3000 x g, and the cell mass was suspended in 2.3 mL of electroporation buffer. 20 μg of purified pTHL2-LR / pAN1 DNA was added to each well of a 0.4-mm gap electroporation cuvette containing 0.5 mL of each.

이를 2.5 kV, 25 μF, ∞Ω의 조건으로 electroporation하였다. electroporation 직후 0.75 mL의 2x YTG 배지를 cuvette에 넣어주고 잘 섞어준 뒤, 2 mL Eppendorf tube에 옮겨 담고, 37℃에서 배양하였다. 5시간 후 배양액 0.2 mL 을 에리트로마이신(erythromyc배지)이 40 μg/mL 함유된 2x YTG 고체 배지 (pH 5.8)에 도말함으로써 형질 전환된 균주를 제조하였다.This was electroporated under the conditions of 2.5 kV, 25 μF, ∞Ω. Immediately after electroporation, 0.75 mL of 2x YTG medium was added to the cuvette, mixed well, transferred to a 2 mL Eppendorf tube, and incubated at 37 ° C. After 5 hours, 0.2 mL of the culture was transformed into a 2x YTG solid medium (pH 5.8) containing erythromycin (erythromyc medium) at 40 μg / mL to prepare a transformed strain.

실시예 4: 람다 레드 재조합 효소를 발현하는 클로스트리듐 속 미생물에 선형 DNA를 도입하여 spo0A 유전자 불활성화Example 4: Inhibition of spo0A gene by introducing linear DNA into Clostridium sp. Microorganism expressing lambda red recombinase

클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 유전자가 성공적으로 불활성되는지를 확인하기 위해, 내생포자 형성에 관여하는 유전자 중 하나인 spo0A 유전자(NCBI GeneID:1118254)를 대상으로 불활성화를 시도하였다.In order to confirm whether genes of clostridium acetobuttilicum were successfully inactivated, inactivation of spo0A gene (NCBI GeneID: 1118254), which is one of the genes involved in endospore formation, was attempted.

먼저, 선택적 마커를 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성(이하 CmR)으로 하는 선형 DNA를 만들기 위하여 spo0A 유전자의 상단서열(upstream)과 하단서열(downstream)에 상동적인 100개의 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머들을 사용하여 PCR을 통해 제조하였다. First, PCR was performed using primers containing 100 nucleotides homologous to the upper and lower sequences of the spo0A gene in order to make linear DNA with the selective marker of chloramphenicol resistance (hereinafter referred to as CmR) .

그리고 lox71-CmR-lox66 카세트를 포함하는 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008)를 PCR의 주형으로 사용하였다. PECmulox (Kim, J.M., Lee, K. H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008) containing the lox71-CmR-lox66 cassette was used as the template for PCR.

상기 PCR 산물들은 상기 실시예 3에 예시한 람다 레드 재조합 효소를 발현하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에 형질 전환하였다. 콜로니들은 클로람페니콜(chloramphenicol; 30 μg/ml)을 포함하는 2x YTG 고체배지에서 선택되었다. CmR 의 성공적인 유전자 대체는 direct colony PCR에 의해서 확인되었다. The PCR products were transformed into clostridium acetobutylicum expressing the lambda red recombinase exemplified in Example 3 above. Colonies were selected on 2x YTG solid medium containing chloramphenicol (30 μg / ml). Successful gene replacement of CmR was confirmed by direct colony PCR.

spo0A 유전자가 확실하게 불활성화 되었는지 확인하기 위하여 선택된 균주를 배양하여 고체 배지에 도말한 뒤, 여기에서 뜨는 콜로니(colony)를 5일간 37℃에서 혐기 배양 후, 각각의 콜로니를 채취하여 증류수에 현탁하고, 현미경으로 내생포자가 형성되는지를 확인하였다. 대조구로는 야생형의 클로스트리듐 아세토부틸리쿰인 ATCC 824 균주를 사용하였다.In order to confirm whether the spo0A gene was definitely inactivated, the selected strain was cultured and plated on a solid medium. After incubation for 5 days at 37 ° C, each of the colonies was collected and suspended in distilled water , And it was confirmed whether the endogenous spores were formed by a microscope. As a control, a wild-type clostridium acetobuttilicum strain ATCC 824 was used.

그 결과, spo0A 유전자가 불활성화 균주에서는 전혀 포자가 관찰되지 않았다. 반면, 대조구로 사용한 ATCC 824 균주에서는 포자들이 쉽게 관찰되었다.As a result, no spores were observed in the inactivated strain of spo0A gene. On the other hand, spores were easily observed in the ATCC 824 strain used as a control.

도 1은 본 발명의 방법에 대한 개략적인 모식도이다. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 is a schematic diagram of a method of the present invention.

도 2는 pIMP1으로부터 pTHL2와 pTHL2-LR을 제작하는 방법을 나타낸 모식도이다.2 is a schematic diagram showing a method for producing pTHL2 and pTHL2-LR from pIMP1.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology GS Caltex Corporation <120> A method for inactivating a desired gene in Bacteria beloning genus Clostridium <130> P09-B163 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggccccaagc ttagaatgaa gtttcttatg cacaag 36 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaactgcagc catggtctaa ctaacctcct aaattttgat ac 42 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 actcccatgg atgagtactg cactcgcaac 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aatcggatcc ttcttcgtct gtttctactg 30 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaaactgcag aaattgttgt attggaatct ttg 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggaattcgtt tttaatgtgg aagacttaac tag 33 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 actcccatgg agaatgaagt ttcttatgca caag 34 <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology          GS Caltex Corporation <120> A method for inactivating a desired gene in Bacteria beloning          genus Clostridium <130> P09-B163 <160> 7 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggccccaagc ttagaatgaa gtttcttatg cacaag 36 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaactgcagc catggtctaa ctaacctcct aaattttgat ac 42 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 actcccatgg atgagtactg cactcgcaac 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aatcggatcc ttcttcgtct gtttctactg 30 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaaactgcag aaattgttgt attggaatct ttg 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggaattcgtt tttaatgtgg aagacttaac tag 33 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 actcccatgg agaatgaagt ttcttatgca caag 34

Claims (17)

DNA 재조합 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 도입하여, DNA 재조합 효소를 발현하는, 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물을 제작하는 단계; 및 Preparing a transformed Clostridium microorganism expressing a DNA recombinant enzyme by introducing a vector containing a gene encoding a DNA recombinant enzyme; And 상기 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물에 목적 유전자의 상동적 부위 및 선택적 마커를 포함하는 선형 DNA 벡터를 도입하는 단계를 포함하고,Introducing into said transformed Clostridium microorganism a linear DNA vector comprising a homologous region of the gene of interest and an optional marker, 상기 DNA 재조합 효소는 람다 레드 재조합 효소이고, Wherein the DNA recombinase is a lambda red recombinase, 상기 벡터는 클로스트리듐 속 미생물 내의 제한효소 또는 DNase의 활성을 감소 또는 제거시키는 것을 특징으로 하는, Wherein said vector reduces or eliminates the activity of a restriction enzyme or DNase in a Clostridium sp. Microorganism. 클로스트리듐 속 미생물에서 목적유전자를 불활성화시키는 방법.A method for inactivating a gene of interest in a clostridium microorganism. DNA 재조합 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 도입하여, DNA 재조합 효소를 발현하는, 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물을 제작하는 단계;Preparing a transformed Clostridium microorganism expressing a DNA recombinant enzyme by introducing a vector containing a gene encoding a DNA recombinant enzyme; 상기 형질전환된 클로스트리듐 속 미생물에 목적 유전자의 상동적 부위 및 선택적 마커를 포함하는 선형 DNA 벡터를 도입하는 단계; 및Introducing into the transformed Clostridium microorganism a linear DNA vector comprising a homologous region of the gene of interest and an optional marker; And 상기 선택적 마커를 제거하는 단계를 포함하고,And removing the selective marker, 상기 DNA 재조합 효소는 람다 레드 재조합 효소이고,Wherein the DNA recombinase is a lambda red recombinase, 벡터는 클로스트리듐 속 미생물 내의 제한효소 또는 DNase의 활성을 감소 또는 제거시키는,The vector may be used to reduce or eliminate the activity of a restriction enzyme or DNase in Clostridium sp. 목적유전자가 불활성화된 클로스트리듐 속 변이 미생물의 제조 방법.A method for producing a Clostridium kinase mutant in which a gene of interest is inactivated. 제1항에 있어서, 상기 클로스트리듐 속 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butylicum), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 타이로부틸리쿰(Clostridium tyrobutylicum), 클로스트리듐 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)으로 구성된 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 방법.The microorganism of claim 1, wherein the Clostridium sp. Microorganism is selected from the group consisting of Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharobutylicum, But are not limited to, Clostridium saccharoperbutylacetonum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Clostridium butyricum Clostridium butyricum, Clostridium butylicum, Clostridium kluyveri, Clostridium tyrobutylicum, Clostridium tyrobutyricum, and the like. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 1, &lt; / RTI &gt; 제2항에 있어서, 상기 클로스트리듐 속 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butylicum), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 타이로부틸리쿰(Clostridium tyrobutylicum), 클로스트리듐 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)으로 구성된 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 방법.3. The method according to claim 2, wherein the Clostridium sp. Microorganism is selected from the group consisting of Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharobutylicum, But are not limited to, Clostridium saccharoperbutylacetonum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Clostridium butyricum Clostridium butyricum, Clostridium butylicum, Clostridium kluyveri, Clostridium tyrobutylicum, Clostridium tyrobutyricum, and the like. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 1, &lt; / RTI &gt; 제1항에 있어서, 상기 DNA 재조합 효소를 코딩하는 유전자는 exo, gam 또는 bet인 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 1, wherein the gene encoding the DNA recombinase is exo, gam or bet. 제2항에 있어서, 상기 DNA 재조합 효소를 코딩하는 유전자는 exo, gam 또는 bet인 것을 특징으로 하는 방법.3. The method according to claim 2, wherein the gene encoding the DNA recombinase is exo, gam or bet. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 클로스트리듐 속 미생물 내의 제한효소 또는 DNase의 안티센스 RNA를 전사하는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein said vector transcribes antisense RNA of a restriction enzyme or DNase in a Clostridium sp. Microorganism. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 클로스트리듐 속 미생물 내의 제한효소 또는 DNase의 안티센스 RNA를 전사하는 것을 특징으로 하는 방법.3. The method of claim 2, wherein said vector transcribes antisense RNA of a restriction enzyme or DNase in Clostridium sp. Microorganism. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 복제 안정성이 온도에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.3. The method of claim 1, wherein the vector is characterized in that the replication stability is controlled by temperature. 제1항에 있어서, 상기 선택적 마커는 항생제 내성 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the selective marker is an antibiotic resistance gene. 제10항에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자가 클로람페니콜, MLS 항생제, 카나마이신, 스펙티노마이신, 설폰아마이드계 항생제, 스트랩토마이신 내성 유전자로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.[Claim 11] The method according to claim 10, wherein the antibiotic resistance gene is at least one gene selected from the group consisting of chloramphenicol, MLS antibiotic, kanamycin, spectinomycin, sulfonamide antibiotic and straptomain resistant gene. 제1항에 있어서, 상기 선택적 마커는 선형 DNA에 포함된 유전자DNA와 상이한 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the selective marker is different from the genomic DNA contained in the linear DNA. 제1항에 있어서, 선택적 마커는 상기 벡터에 포함된 유전자 DNA와 상이한 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the selective marker is different from the gene DNA contained in the vector. 제2항에 있어서, 상기 선택적 마커 제거 단계는 부위 특이적 재조합 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.3. The method of claim 2, wherein said selective marker removal step comprises the step of expressing a site-specific recombinase. 제14항에 있어서, 상기 부위 특이적 재조합 효소가 플리페이즈(flippase, FLP)이고 재조합이 일어나는 부위가 FRT인 것으로 하는 방법.15. The method according to claim 14, wherein the site-specific recombinase is a flippase (FLP) and a site where recombination occurs is FRT. 제14항에 있어서, 상기 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 재조합 효소인 것을 특징으로 하는 방법15. The method according to claim 14, wherein the site-specific recombinase is a Cre recombinase 제2항의 방법으로 제조되는, A process for the preparation of a compound of formula DNA 재조합 효소를 발현하고, 목적 유전자의 상동적 부위 및 선택적 마커를 포함하는 선형 DNA 벡터가 도입되어 목적 유전자가 불활성되어 있는 클로스트리듐 속 변이 미생물.A clostridium mutant microorganism expressing a DNA recombinase and having a target gene inactivated by introducing a linear DNA vector containing a homologous region of the target gene and an optional marker.

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