KR101645452B1

KR101645452B1 - 진저레논 에이를 함유하는 심혈관 질환 예방용 식품조성물 및 심혈관 질환 치료용 약품 조성물

Info

Publication number: KR101645452B1
Application number: KR1020150053420A
Authority: KR
Inventors: 이기원; 김희주; 양희; 김종란; 김종은; 손조은; 이형주
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 주식회사 밥스누
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2016-08-04

Abstract

본 발명의 심혈관 질환 개선용 식품 조성물 및 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 우수한 혈관내피세포와 면역세포 부착 억제효과, VCAM-1 단백질 발현 억제효과, VCAM-1 및 MCP-1 mRNA 발현 억제효과를 발휘하는 진저레논 에이를 유효성분으로 함유하기 때문에 우수한 심혈관 질환 개선, 예방 또는 치료 효과를 발휘한다.

Description

진저레논 에이를 함유하는 심혈관 질환 예방용 식품조성물 및 심혈관 질환 치료용 약품 조성물 {Food composition and pharmaceutical composition against atherosclerosis containing Gingerenone A}

본 발명은 심혈관 질환 개선용 식품 조성물 및 심혈관 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 진저레논 에이(Gingerenone A)를 유효성분으로 함유하는 심혈관 질환 개선용 식품 조성물 및 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

심혈관 질환은 심장, 혈관, 뇌혈관 시스템과 관련된 것으로 전세계 사망률의 3분의 1을 차지할 정도로 그 심각성이 크다. 또한 심혈관 질환으로 인한 사망 중에서도 가장 많은 비율을 차지하는 허혈성 심장질환은 동맥경화가 주된 원인으로 꼽히고 있다. 2030년까지 허혈성 심장질환의 사망률은 증가할 것으로 예측된다 (B Cannon, Nature, 493:S2-S3, 2013).

동맥경화증의 주원인으로는 고혈압, 비만, 흡연, 고지혈증 등이 꼽히고는 있으나, 동맥경화증은 다인성질환이므로 정확한 원인을 찾기는 어렵다 (B Cannon, Nature, 493:S2-S3, 2013). 동맥경화의 발병기전은 크게 초기와 후기 단계로 이루어지는데 (L Qin et al., Pharmacology, 93:69-75, 2014), 동맥경화 초기단계는 혈중 지단백이 여러 위험인자와 함께 혈관 내피조직에 축적되어 산화되는 것으로 시작된다. 이때 산화된 지단백으로 인해 혈중에 존재하던 단핵구가 내피세포에 부착하여 내피하조직으로 이동하게 되는데, 이때 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1), ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), E-셀렉틴(E-selectin)과 같은 부착물질의 발현을 증가시킨다. 또한, 내피하조직으로 유입된 단핵구는 대식세포로 분화되고 계속되는 지단백의 산화로 인해 더 많은 단핵구의 유입을 촉진하며 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)의 발현을 증가시킨다.

이외에도 염증에 관여하는 사이토카인인 종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor-alpha; TNF-alpha), 인터류킨-1(interleukin-1; IL-1) 등을 분비하며 세포를 증식시키는 물질, 응고를 촉진하는 물질들을 분비하여 만성적인 염증반응을 일으키게 되는데, 이러한 만성적인 염증반응은 동맥경화의 발병과 진전에 중요한 역할을 한다 (L Qin et al., Pharmacology, 93:69-75, 2014). 대식세포의 계속된 산화물질의 생성과 섭취로 인해 대식세포는 스스로 포말세포로 변하게 된다.

후기단계로는 단핵구의 유입이 촉진되고 증식함에 따라 평활근 세포의 이동과 섬유화가 이루어진다 (김치정, 한국지질 동맥경화학회지, 11(4):413-419, 2001). 대식세포로부터 포말세포로 변화한 세포들은 지방선조를 생성하는 것 뿐 아니라 전 염증성 사이토카인을 분비하며 진행되는데, 이때 여러 다른 사이토카인들과 함께 TGF-beta(Transforming growth factor-beta), PDGF(Platelet derived growth factor)와 같은 성장 요인들을 분비하여 평활근세포의 증식과 이동을 촉진시킨다. 이로 인해 죽종을 생성하게 된다. 또한, 염증 자극을 얻은 혈관 평활근세포는 넓어지는 내막쪽으로 이동하는 엘라스틴과 콜라겐을 감소시키는 효소들을 분비한다. 최종적으로 염증성 인자들은 콜라겐 합성을 막고 콜라겐 분해효소의 발현을 증가시킨다. 이러한 불균형은 혈관 섬유종 뚜껑의 콜라겐 함유량을 감소시켜 섬유종이 쉽게 파괴될 가능성이 높아진다. 섬유종이 파괴될 경우 혈액 속에 혈전이 생성되고 (R Packard et al., Clinical Chemistry, 54(1):24-38, 2008), 이 혈전으로 인해 동맥의 심한 협착이나 폐쇄에 의한 급성심장증후군이 발생하게 된다 (김치정, 한국지질 동맥경화학회지, 11(4):413-419, 2001)(C Weber et al., Nature Reviews Immunology, 8:802-815, 2008).

동맥경화가 이미 진전된 후기단계에서는 혈중에 존재하는 혈전을 제거하기 위해서 외과적 수술이 필요하며, 급성심장증후군이 발생했을 경우에는 약물만으로는 치료가 어렵기 때문에 동맥경화의 초기단계인 지단백의 산화로 인한 염증성 질환을 방지하는 것이 중요하다 (김철민, 대한임상건강증진학회 춘계합동학술대회, 97-100, 2013).

한편, 동맥경화의 예방 및 치료법으로는 약물요법, 운동요법, 식이요법, 금연, 체중조절 등이 있다. 동맥경화의 기전에 따라 지단백의 산화는 동맥경화의 발병에 있어 중요한 역할을 하므로 일반적으로 고 콜레스테롤 혈증 환자들이 동맥경화증으로 발전될 확률이 크다. 따라서 동맥경화의 약물요법으로는 고 콜레스테롤혈증 환자들을 대상으로 위험인자들을 진단하여 필요에 의해 처방한다. 위험인자를 대사성증후군과 염증성 경향으로 나누어 진단을 하게 되는데, 대사성증후군은 허리둘레로 측정하는 비정상 비만도, 중성지질, HDL-C(high density lipoprotein cholesterol), 혈압, 공복혈당으로 판단하고, 염증성 경향은 C-반응성 단백검사(high-sensitivity C-reactive protein (CRP))를 이용하여 체내 염증 정도를 평가한다. 순수콜레스테롤혈증일 경우에는 스타틴(Statin) 계열의 HMG-CoA 환원효소저해제 혹은 담즙산제거제를 처방하여 혈중 콜레스테롤을 낮춘다. 순수고중성지방혈증의 경우에는 리피딜, 리판틸, 노리포와 같은 피브레이트(Fibrate)와 올베탐과 같은 니아신(Niacin) 류로 중성지방을 낮춘다. 이외에도 오메가 3 지방산과 아시피목스(Acipimox)와 같이 다양한 지질 수치를 낮추는 약물들이 존재한다. 하지만 대부분 체내 콜레스테롤의 합성을 막고 중성지질의 합성을 막을 뿐, 스타틴(Statin)의 경우에만 항염증 효능을 나타내고 있는 실정이다 (K Han, J Korean Med Assoc.,52(3):299-311, 2009).

한편, 위와 같이 동맥경화의 치료단계는 발병 후기단계보다 초기단계가 유리하다. 혈중의 지질 축적이 동맥경화 발병의 주요한 원인이라고 말할 수 없지만, 축적된 지질의 산화가 혈관 내피세포에 염증을 일으켜 기능장애가 발생할 경우에 동맥경화가 진전이 된다고 할 수 있기 때문에, 무엇보다도 산화된 지단백의 염증을 효과적으로 억제하는 소재의 개발이 필요하다.

대한민국 공개특허 제10-2011-0063129 (공개일자: 2011.06.10)에는, 인진쑥 배지에서 배양한 노루궁뎅이버섯 균사체 및 그 배양에 사용된 인진쑥 배지의 혼합물의 용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 고지혈증 또는 심혈관 질환의 개선용 식품 조성물에 대한 기술이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-337422호 (등록일자: 2013.11.29)에는, 활성성분이 에키노시스트산 3 내지 1 중량부 및 올레아놀산 1 중량부로 이루어지는 것을 특징으로 하는 심혈관장애 치료용 약학적 조성물에 대한 기술이 기재되어 있다.

본 발명은 진저레논 에이(gingerenone A)를 유효성분으로 함유하는 심혈관 질환 개선용 식품 조성물 및 진저레논 에이(gingerenone A)를 유효성분으로 함유하는 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 진저레논 에이(Gingerenone A)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 개선용 식품 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 발명자들은 심혈관 질환을 예방하는 생리활성물질을 탐색하는 과정에서 생강(Zingiber officinale Roscoe)에 함유되어 있는 생리 활성 물질인 진저레논 에이(gingerenone A)에 주목하게 되었다. 일반적으로 생강 추출물은 생물학적인 활성성분으로 진저롤(gingerol), [6]-쇼가올([6]-shogaol), [6]-진저롤([6]-gingerol), [8]-진저롤([8]-gingerol), [10]-진저롤([10]-gingerol)을 포함하는 것으로 알려져 있으며, 이 성분들은 항암 효과, 항산화 효과 등을 나타낸다고 보고되고 있다 (Grzannan et al., J. Med. Food, 8(2):125-132, 2005; Lantz et al., Phytomedicine, 14(2-3):123-8, 2007; Katiyar et al., Cancer Research, 56(5):1023-1030, 1996; Surh, Food Chem. Toxicol., 40(8):1091-7, 2002; Eguchi et al., Free Radic. Res., 39(12):1367-1375, 2005; Masuda et al., BioFactor, 21(1-4):293-6, 2004).

한편, 진저레논 에이(gingerenone A)는 생강 추출물에서 새롭게 발견된 물질로 현재까지는 이 물질에 대한 생리활성은 보고된 것이 거의 없다. 진저레논 에이(gingerenone A)는 디아릴헵타논(diarylheptenone) 구조로 이루어져 있으며, 화학식은 C₂₁H₂₄O₅이다. 본 발명에 사용되는 진저레논 에이(gingerenone A)는 도 1에 나타낸 공정에 따라, 강황 또는 울금이라 불리는 식물의 뿌리에서 추출되는 천연 색상의 소재인 커큐민(curcumin)을 수소화(hydrogenation) 처리 및 탈수소화(dehydration) 처리하여 합성 할 수 있다 (S Venkateswarlu et al., Indian J. Chem., Sect. B: Org. Chem. Incl. Med. Chem., 40:495-497, 2001).

한편, 혈관의 내피는 일반적으로 백혈구의 부착을 방지하는데, 전염증성 자극으로 인해 혈관 내피 세포에 염증이 일어나면 부착에 관련된 물질들의 발현이 증가한다. 부착과 관련된 물질로는 VCAM-1(Vascular cell adhesion molecule-1)이 가장 대표적이다. 또한, 혈관 내피의 염증으로 인해 혈관의 투과성이 높아지고 산화된 지단백의 영향으로 혈중에 있는 면역세포들을 이끄는 역할을 하는 MCP-1(Monocyte chemoattractant Protein-1)이 발현한다. MCP-1의 발현이 증가하면 면역세포가 혈관의 내막으로 모인 후 분화되어 대식세포가 된 다음, 내막에 있던 지질들로 인해 포말세포로 변하게 된다 (R Packard et al., Clinical Chemistry, 54(1):24-38, 2008). 또한, 염증을 유도하는 물질로 주로 사용하고 있는 종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α, 또는 TNF)는 급성 염증반응과정에서 주요한 역할을 하는 사이토카인이다. TNF-α는 주로 활성화된 대식세포에 의해 분비되는데, 보조 T 세포, 자연살해세포, 그리고 뉴런 등의 다양한 세포에서도 분비된다. 무엇보다도 TNF-α의 가장 중요한 역할은 면역세포의 조절에 관여된다는 것이다.

본 발명의 실험예에서는 진저레논 에이가 심혈관 질환의 시초가 되는 혈관 내피세포의 염증 완화 효과를 가지는지 여부를 확인하기 위해 TNF-alpha(Tumor Necrosis Factor-alpha)로 염증을 유도한 상태에서 면역세포 부착 평가(monocyte adhesion assay) 실험을 수행하였고, 혈관내피세포와 면역세포의 부착단백질인 VCAM-1의 단백질 발현을 확인하는 실험을 수행하였으며, VCAM-1 및 면역세포 징집 물질인 MCP-1의 mRNA 발현을 확인하는 실험을 수행하였다. 실험 결과, 진저레논 에이 처리군에서 다른 생강 유래물질 (커큐민, [6]-쇼가올, [6]-진저롤,[10]-진저롤) 처리군보다 면역세포와 혈관내피세포의 부착이 가장 적었고, VCAM-1의 단백질 발현도 가장 적음을 확인함으로써 진저레논 에이의 혈관 내피세포에서의 항염증 효능을 확인하였다. 또한, 진저레논 에이의 농도 의존적으로 VCAM-1과 MCP-1의 mRNA 발현이 감소함을 확인함으로써 진저레논 에이의 심혈관 질환의 항염증 효능을 확인하였다.

한편, 본 발명의 심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 진저레논 에이는, 바람직하게 심혈관 질환 개선용 식품 조성물 전체 중량 대비 0.0001~50중량% 포함되는 것이 좋다. 0.0001중량% 미만으로 첨가되면 심혈관 질환 개선효과가 미미하고, 50중량%를 초과하여 첨가되면 사용량 대비 효과 상승률이 낮아 비경제적일 수 있다.

한편, 본 발명의 심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 진저레논 에이는, 바람직하게 농도가 5~20 μM인 것이 좋은데, 반드시 이에 한정되지는 아니한다.

한편, 본 발명의 심혈관 질환 개선용 식품 조성물은 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것인 것이 좋으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 가지는 진저레논 에이(Gingerenone A)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명의 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 진저레논 에이는, 바람직하게 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 전체 중량 대비 0.0001~50중량% 포함되는 것이 좋다. 0.0001중량% 미만으로 첨가되면 심혈관 질환 예방 및 치료효과가 미미하고, 50중량%를 초과하여 첨가되면 사용량 대비 효과 상승률이 낮아 비경제적일 수 있다.

한편, 본 발명의 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 진저레논 에이는, 바람직하게 농도가 5~20 μM인 것이 좋은데, 반드시 이에 한정되지는 아니한다.

한편, 본 발명의 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 예방 및 치료제가 약제인 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가적으로 포함될 수 있다.

한편, 본 발명의 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITIORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.

한편, 본 발명의 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일예로, 본 발명의 심혈관 질환 예방 및 치료제는 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여 가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.

도 1은 커큐민으로부터 진저레논 에이를 합성하는 공정을 나타낸 도이다.
도 2는 진저레논 에이의 면역세포 부착 평가(monocyte adhesion assay) 실험의 결과이다. 레인 1은 무처리 대조군, 레인 2는 TNF-alpha 10 ng/㎖를 처리한 염증 유도군, 레인 3은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 20 μM을 처리한 군, 레인 4는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 커큐민 20 μM을 처리한 군, 레인 5는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 [6]-쇼가올 20 μM을 처리한 군, 레인 6은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 [6]-진저롤 20 μM을 처리한 군, 레인 7은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 [8]-진저롤 20 μM을 처리한 군, 레인 8은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 [10]-진저롤 20 μM을 처리한 군이다.
도 3은 진저레논 에이의 VCAM-1의 단백질 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏(Western Blot) 실험으로 확인한 결과이다. 레인 1은 무처리 대조군, 레인 2는 TNF-alpha 10 ng/㎖를 처리한 염증 유도군, 레인 3은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 5 μM을 처리한 군, 레인 4는 TNF-alpha 10 ng/㎖ 진저레논 에이 10 μM을 처리한 군, 레인 5는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 20 μM을 처리한 군이다.
도 4는 진저레논 에이의 VCAM-1 및 MCP-1의 mRNA 발현 저해능을 실시간 중합효소 연쇄반응법(Quantitative Realtime PCR)을 통하여 확인한 결과이다. 레인 1은 무처리 대조군, 레인 2는 TNF-alpha 10 ng/㎖를 처리한 염증 유도군, 레인 3은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 5 μM을 처리한 군, 레인 4는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 10 μM을 처리한 군, 레인 5는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 20 μM을 처리한 군이다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실험예 1: 진저레논 에이의 인간 혈관내피세포와 면역세포의 부착 저해능 측정]

본 실험예에서는 진저레논 에이(gingerenone A)의 혈관내피세포와 면역세포의 부착 정도를 평가하고자 하였다.

인간 혈관내피세포인 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)에 진저레논 에이와 그 외 생강 유래 물질 (커큐민, [6]-쇼가올, [6]-진저롤,[10]-진저롤)을 20 μM로 각각 처리 후, 1시간 뒤 TNF-alpha를 10 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 6시간 후, 칼세인 에이엠 용액(Calcein AM solution, SIGMA #C1359)을 2 μM의 농도로 인간 면역세포(Human Leukemia THP-1)를 염색한 뒤에 진저레논 에이를 처리한 혈관내피세포와 함께 1시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양했다. 1시간 후, 배지와 세포들을 모두 버리고 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline)로 헹궈준 다음 형광검출기를 이용하여 혈관내피세포와 부착되어있는 인간 면역세포의 형광 값을 485 nm (Excitation), 538 nm (Emission)에서 측정하였다.

실험결과, 생강 유래 물질들 중 진저레논 에이를 처리한 군에서 인간 혈관 내피세포와 면역세포의 부착정도가 제일 낮았으며, 그 정도가 무처리 대조군과 비슷한 수준임을 확인할 수 있었다 (도 2). 도 2는 진저레논 에이의 면역세포 부착 평가(monocyte adhesion assay) 실험의 결과이다. 레인 1은 무처리 대조군, 레인 2는 TNF-alpha 10 ng/㎖를 처리한 염증 유도군, 레인 3은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 20 μM을 처리한 군, 레인 4는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 커큐민 20 μM을 처리한 군, 레인 5는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 [6]-쇼가올 20 μM을 처리한 군, 레인 6은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 [6]-진저롤 20 μM을 처리한 군, 레인 7은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 [8]-진저롤 20 μM을 처리한 군, 레인 8은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 [10]-진저롤 20 μM을 처리한 군이다.

[실험예 2: 인간 혈관내피세포에서 진저레논 에이의 부착단백질 VCAM-1의 발현 억제 효능 측정]

본 실험예에서는 진저레논 에이의 인간 혈관내피세포(HUVEC)에서 발현되는 부착단백질인 VCAM-1의 발현 억제 효능을 측정하기 위하여 웨스턴 블랏(Western Blot) 실험을 수행하였다.

6 웰 플레이트(well plate)에서 인간 혈관내피세포에 진저레논 에이의 농도를 5, 10, 20 μM 세 가지로 설정하여 1시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 처리하였다. 1시간 후, TNF-alpha를 10 ng/㎖의 농도로 처리하고, 6시간 뒤에 세포에 있는 배지를 제거한 후 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline)로 두 번 세척하였다. 그 후, RIPA 용액(Cell Signaling)으로 세포를 용해시킨 후, 원심분리하여 수득한 상등액으로 시료를 준비하였다. 상기와 같이 수득한 시료를 단백질 정량 키트 (Bio-rad Corp., Richmond, CA, USA)를 사용하여 로우리 법(Lowry method)으로 정량하고, 웨스턴 블랏(Western Blot) 실험에서 VCAM-1 단백질 발현을 확인하고자 하였다. 10% SDS-PAGE에 넣어 전기 영동하여 분리하고, VCAM-1(H-276)(Santa Cruz) 항체를 이용하여 반응시킨 후, 암실에서 SUPEX 키트를 사용하여 감지하였다.

실험결과, 진저레논 에이의 농도가 증가할수록 VCAM-1의 단백질 발현이 점차 감소함을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 진저레논 에이의 VCAM-1의 단백질 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏(Western Blot)실험으로 확인한 결과이다. 레인 1은 무처리 대조군, 레인 2는 TNF-alpha 10 ng/㎖를 처리한 염증 유도군, 레인 3은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 5 μM을 처리한 군, 레인 4는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 10 μM을 처리한 군, 레인 5는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 20 μM을 처리한 군이다.

[실험예 3: 인간 혈관내피세포에서 진저레논 에이의 부착단백질 VCAM-1 및 면역세포 징집 물질 MCP-1의 mRNA 발현 저해능 측정]

본 실험예에서는 진저레논 에이의 혈관내피세포(HUVEC)에서 발현되는 부착단백질인 VCAM-1과 면역세포 징집 물질인 MCP-1의 mRNA 발현 저해능을 측정하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응법(Quantitative Realtime PCR)을 수행하였다.

인간 혈관내피세포에 진저레논 에이의 농도를 5, 10, 20 μM 세 가지로 설정하여 처리했다. 1시간 후, TNF-alpha를 10 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 그 후, 4시간 뒤 세포에 있는 배지를 제거하고 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline)로 세척해준 다음 RNA iso PLUS(TAKARA)를 넣어 세포를 용해시켰다. 그 후, 용해물질에 클로로포름(Choloroform)(Junsei)을 넣고 원심분리하여 RNA층을 분리하였다. 그 후, 이소프로판올(2-propanol)(Junsei)을 넣고 원심분리하여 분리된 상등액을 버리고 70% 에탄올로 두 번 세척해준 뒤, 다시 원심분리하여 분리된 상등액을 버려 RNA를 추출하였다. 그 후, cDNA 합성 키트(TAKARA)를 이용하여 cDNA를 만든 다음 Realtime PCR(Biorad) 기기로 VCAM-1과 MCP-1의 mRNA 발현을 측정하였다.

실험결과, 진저레논 에이의 농도가 증가할수록 VCAM-1과 MCP-1의 mRNA 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 4). 도 4는 진저레논 에이의 VCAM-1 및 MCP-1의 mRNA 발현 저해능을 실시간 중합효소 연쇄반응법(Quantitative Realtime PCR)을 통하여 확인한 결과이다. 레인 1은 무처리 대조군, 레인 2는 TNF-alpha 10 ng/㎖를 처리한 염증 유도군, 레인 3은 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 5 μM을 처리한 군, 레인 4는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 10 μM을 처리한 군, 레인 5는 TNF-alpha 10 ng/㎖와 진저레논 에이 20 μM을 처리한 군이다.

[실시예 1: 심혈관 질환 개선용 식품 조성물 제조]

본 실시예에서는 하기와 같이 심혈관 질환 개선용 식품 조성물을 제조하였다.

(1) 선식 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 검정콩, 검정깨 및 들깨 각각을 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 후 배전 및 분쇄하여 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 이후, 현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%, 찹쌀 9중량%, 들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%, 진저레논 에이 3중량%, 영지 0.5중량% 및 지황 0.5중량%를 혼합하여 선식을 제조하였다.

(2) 츄잉껌 제조

껌 베이스 20중량%, 설탕 76.9중량%, 향료 1중량%, 물 2중량% 및 진저레논 에이 0.1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.

(3) 캔디 제조

설탕 60중량%, 물엿 39.8중량%, 향료 0.1중량% 및 진저레논 에이 0.1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.

(4) 비스킷 제조

박력 1급 25.59중량%, 중력 1급 22.22중량%, 정백당 4.80중량%, 식염 0.73중량%, 포도당 0.78중량%, 팜쇼트닝 11.78중량%, 암모니움 1.54중량%, 중조 0.17중량%, 중아황산나트륨 0.16중량%, 쌀가루 1.45중량%, 비타민 B₁0.0001 중량%, 비타민 B₆ 0.0001중량%, 밀크향 0.04중량%, 물 20.6998중량%, 전지분유 1.16중량%, 대용분유 0.29중량%, 제일인산칼슘 0.03중량%, 살포염 0.29중량% 및 분무유 7.27중량%와 진저레논 에이 1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스킷을 제조하였다.

(5) 건강음료 제조

꿀 0.26중량%, 치옥토산아미드 0.0002중량%, 니코틴산아미드 0.0004중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001중량%, 염산피리독신 0.0001중량%, 이노시톨 0.001중량%, 오르트산 0.002중량%, 물 98.7362중량% 및 진저레논 에이 1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 건강 음료를 제조하였다.

(6) 소시지 제조

돈육 65.18중량%, 계육 25중량%, 전분 3.5중량%, 대두단백 1.7중량%, 식염 1.62중량%, 포도당 0.5중량% 및 글리세린 1.5중량%와 진저레논 에이 1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 소시지를 제조하였다.

(7) 건강보조식품 제조

스피루리나 55중량%, 구아검효소 분해물 10중량%, 비타민 B₁염산염 0.01중량%, 비타민 B₆염산염 0.01중량%, DL-메티오닌 0.23중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7중량%, 유당 22.2중량% 및 옥수수전분 1.85중량%와 진저레논 에이 10중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다.

(8) 주류 제조

진저레논 에이 0.5중량%를 소주, 맥주, 양주 또는 과실주와 혼합하여 에멀전 상태로 만든 후, 고속믹서기로 9,000 rpm에서 혼합하여 진저레논 에이 혼합물이 함유된 주류를 제조하였다.

[실시예 2: 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 제조]

본 실시예에서는 하기와 같이 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제조하였다.

(1) 산제 제조

진저레논 에이 2 g에 유당 1 g을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

(2) 정제 제조

진저레논 에이 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

(3) 캡슐제 제조

진저레논 에이 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

(4) 주사제 제조

진저레논 에이 100 ㎎에 주사용 증류수 적량을 가하여 용해시키고, pH를 약 7.5로 조절한 다음 2 ㎖용량의 앰플에 충진 및 멸균하여 주사제를 제조하였다.

Claims

하기 화학식 1의 구조를 가지는 진저레논 에이(Gingerenone A)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 개선용 식품 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 진저레논 에이는,
농도가 5~20 μM인 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 개선용 식품 조성물.
하기 화학식 1의 구조를 가지는 진저레논 에이(Gingerenone A)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제3항에 있어서,
상기 진저레논 에이는,
농도가 5~20 μM인 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.