KR101640499B1 - 형질 전환 누에고치로부터 추출한 형광 실크 단백질 용액의 제조 방법 및 이를 이용한 지지체 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 a) 형광 누에고치를 정련제를 포함하는 수용액에 넣어 8-24시간 동안 40-60℃로 가열한 후 증류수로 세척하여 정련된 형광 실크 피브로인을 얻는 단계; b) 상기 정련된 형광 실크 피브로인을 9-9.6M LiBr 100 ㎖ 당 디티오트레이톨 (Dithiothreitol, DTT) 15mg-1.5g을 혼합한 용매에 40-60℃에서 1-5시간 동안 용해시키는 단계; 및 c) 상기 용해된 형광 실크 피브로인을 1차 증류수에서 48-96 시간동안 투석시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 실크 피브로인 용액을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 정련제는 알칼레이즈 (alcalase) 및 탄산수소나트륨 (NaHCO3)를 포함하는 것이 바람직하다.
형광 누에고치를 기존 실크 피브로인 용액 제조 방법으로는 낮은 온도에서 실크 피브로인을 용해시키지 못하며, 형광을 잃어버리는 단점이 있다. 하지만 본 발명에 의하면, 환원제를 첨가한 방식은 낮은 온도에서 형광 실크 피브로인 용액을 제조할 수 있으며, 형광을 유지하는 장점이 있다. 따라서 본 발명에 의하면 형광 실크 피브로인의 대량 생산이 가능하고, 생체 적합 형광 단백질을 용이하게 제조하여 제공할 수 있기 때문에, 조직 재생용 지지체, bioimaging 과 biochip을 통한 바이오 센서 등의 바이오 산업에 응용 가능한 재료를 제공할 수 있다.
형광 누에고치를 기존 실크 피브로인 용액 제조 방법으로는 낮은 온도에서 실크 피브로인을 용해시키지 못하며, 형광을 잃어버리는 단점이 있다. 하지만 본 발명에 의하면, 환원제를 첨가한 방식은 낮은 온도에서 형광 실크 피브로인 용액을 제조할 수 있으며, 형광을 유지하는 장점이 있다. 따라서 본 발명에 의하면 형광 실크 피브로인의 대량 생산이 가능하고, 생체 적합 형광 단백질을 용이하게 제조하여 제공할 수 있기 때문에, 조직 재생용 지지체, bioimaging 과 biochip을 통한 바이오 센서 등의 바이오 산업에 응용 가능한 재료를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 환원제를 첨가한 형광실크 단백질 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 환원제를 이용하여 형질 전환 누에고치를 형광을 유지하면서 많은 양의 단백질을 얻기 위한 형광실크 단백질 제조 방법 및 이를 이용한 지지체 제조 및 활용에 관한 것이다.
실크 피브로인은 누에에서 추출하여 제조한 전형적인 자연 고분자 물질로 오랫동안 직물의 섬유소재 및 봉합사와 같은 의공학 소재로 이용되어 왔다. 실크 피브로인은 생체에 적용할 때 염증 반응을 거의 일으키지 않으면서 섬유모세포나 각질 세포 등에 세포 부착 능력과 증식효과가 뛰어나 생체 적합성이 우수한 인공피부의 소재로서 많은 관심이 모아지고 있다. 또한, 다른 천연 고분자 재료와 달리 실크 피브로인은 곤충을 통하여 순수한 단백질을 대량으로 쉽게 얻을 수 있으며 생체적합성이 우수하여 특별한 정제과정을 거치지 않아도 인체에 대한 거부 반응이 거의 일어나지 않고 분말, 막, 다공질체 및 겔 등 다양한 형태로 성형할 수 있다는 특징이 있다.
녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)은 1962년 일본의 해양생물학자인 시모무라 오사무가 해파리 (Aequorea victoria)의 형광 물질을 연구하는 도중 처음 발견되었으며, 1969년 Hasting 과 Morin에 의해 녹색 형광 단백질로 명명되었다. GFP는 생체 내에서 칼슘에 의해 활성된 발광단백질(Photoprotein)이나 루시페레이스-옥시루시페린 복합체의 에너지를 운반하는 에너지 전달 수용체로 작용하며, 에쿼린 (Aequorin)으로부터 에너지를 받아 508nm의 녹색 형광을 방출하는 2차 형광 단백질로서 작용한다. 세포에 이 GFP를 암호화하고 있는 DNA나 mRNA가 존재할 경우, GFP 단백질이 세포 내에서 합성되어 강한 형광을 발한다. 발현 정도를 조사하고 싶은 유전자에 GFP를 암호화하는 서열을 연결하면 실제 조사하길 원하는 유전자가 발현하는 장소에서 GFP가 형광을 발현하게 되므로, 유전자의 발현을 조사하는데 많이 사용한다. 특히 관찰이 용이하고 독성을 지니고 있지 않다는 장점으로 인해, 유전자의 발현의 유무와 장소, 시간 측정 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 이와 기능적으로 유사한 노랑 형광 단백질 (YFP), 청록색 형광 단백질 (CFP)도 개발되었으며 이 외에도 적색, 황색 등 다양한 색의 형광 단백질이 만들어져 있다. 이렇게 다양한 형광 단백질은 여러 단백질의 지역분포를 한번에 알아보고자 할 때 유용하게 사용된다.
형질전환누에는 북미산 해파리의 녹색 형광 유전자를 견사 (누에고치에서 뽑은 실)의 주성분인 피브로인 (누에고치의 섬유를 구성하는 섬유단백질) 유전자에 삽입한 다음, 이를 미세주사장치로 누에알에 주입해 만든 것이다. 이 누에는 형질전환이 매우 어려운 실용품종이다. 일본에서 개발한 다화성 (한해에 여러 번 알을 까는 성질) 품종을 대상으로 한 형질전환누에보다 3배 이상의 녹색 형광 실크를 생산할 수 있다. 특히 유전자의 누에알 주입시 최적의 미세주사 위치를 밝힌 독자적인 원천기술을 확보해 형질전환 효율을 10% 전후의 일본보다 훨씬 높은 평균 42.5%, 최대 75%까지 향상시켰다. 형질전환 누에에서 뽑은 녹색 형광 실크는 특정 파장의 빛을 비추면 어둠 속에서 영롱한 녹색 형광을 나타내며, 자연광에서도 엷은 녹색을 띤다. 또 실크 생산을 위한 정련과정에서 색깔이 없어지는 칼라고치나 황금고치와는 달리 정련을 해도 녹색형광이 그대로 유지된다. 녹색 형광 유전자는 다음 세대까지 전달된다. 이에 따라 별도의 염색처리 없이 패션의류, 벽지, 조명등갓, 액세서리, 인테리어용품 등의 소재로 사용이 가능하다
형광 실크 피브로인 지지체를 만들기 위한 용액은 기존의 제조 방법으로는 형광을 유지할 수 없다. Green Fluorescent Protein (GFP)는 강한 염과 반응하면서 형광을 잃어버린다. 따라서 기존 실크 피브로인 용액은 제조 방법으로 정련을 통해 얻은 실크 피브로인 섬유를 용액으로 제조하는 과정에서 강한 염인 9.5M의 LiBr 수용액으로 녹이기 때문에 GFP의 형광을 유지하기 어렵다. 또한 기존 B.mori와 다르게 9.5M LiBr 수용액에 잘 녹지 않아 용액 제조에 제한이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 형광 누에고치를 이용하여 형광을 유지하면서 용액을 제조하고 이를 이용한 지지체를 제조하고자 연구한 결과, 환원제를 첨가하는 제조방법을 발명하였다.
따라서, 본 발명은 a) 형광 누에고치를 정련제를 포함하는 수용액에 넣어 8-24시간 동안 40-60℃로 가열한 후 증류수로 세척하여 정련된 형광 실크 피브로인을 얻는 단계; b) 상기 정련된 형광 실크 피브로인을 9-9.6M LiBr 100 ㎖ 당 디티오트레이톨 (Dithiothreitol, DTT) 15mg-1.5g을 혼합한 용매에 40-60℃에서 1-5시간 동안 용해시키는 단계; 및 c) 상기 용해된 형광 실크 피브로인을 1차 증류수에서 48-96 시간동안 투석시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 실크 피브로인 용액을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 정련제는 알칼레이즈 (alcalase) 및 탄산수소나트륨 (NaHCO3)를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 제조방법으로 제조된 형광 실크 피브로인 용액을 포함하는 조직 재생용 지지체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 제조방법으로 제조된 형광 실크 피브로인 용액을 포함하는 바이오 이미징용 조성물을 제공한다.
형광 누에고치를 기존 실크 피브로인 용액 제조 방법으로는 낮은 온도에서 실크 피브로인을 용해시키지 못하며, 형광을 잃어버리는 단점이 있다. 하지만 본 발명에 따른 환원제를 첨가한 방식은 낮은 온도에서 형광 실크 피브로인 용액을 제조할 수 있으며, 형광을 유지하는 장점이 있다. 따라서 본 발명에 의하면 형광 실크 피브로인의 대량 생산이 가능하고, 생체 적합 형광 단백질을 용이하게 제조하여 제공할 수 있기 때문에, 조직 재생용 지지체, bioimaging 과 biochip을 통한 바이오 센서 등의 바이오 산업에 응용 가능한 재료를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해, 유전자변형 누에고치로부터 많은 형광 실크 단백질을 얻을 수 있으며, 여러 가지 원하는 형태로 제작이 가능하고, 세포독성이 없어 생체 적합한 생체재료로 대체 가능하다. 또한 형광 실크 물질로 제작하였을 때 형광을 잃지 않기 때문에 의료는 물론 형광을 요구하는 바이오 메디컬에 많은 기여를 할 수 있다.
도1은 형광 실크 피브로인 용액 제조 방법이다.
도2는 SDS-PAGE를 통한 형광 실크 피브로인 분자량 확인한 결과이다.
도3은 형광 실크 피브로인 용액의 형광 확인한 결과이다.
도4는 형광 실크 피브로인 막을 공초점 현미경 (Confocal Microscopy)으로 관찰한 형광과 세포 증식 (cell proliferation) 결과이다.
도5는 형광실크 피브로인 막에 배양한 세포 독성 실험 결과이다.
도6은 주사전자현미경 (SEM, Scanning Electron Microscope)과 공초점 현미경 (Confocal Microscopy)으로 관찰한 형광 실크 피브로인 나노 막이다.
도7은 형광 실크 피브로인 지지체를 동물에 삽입한 후 관찰한 이미지이다.
도8은 형광 실크 피브로인 지지체를 삽입한 동물의 조직 이미지이다.
도9는 쥐의 식도 천공을 형광 실크 피브로인을 이용한 추적 이미지이다.
도10은 위(stomach) 내에서 흡수하는 형광 단백질에 대한 조직 이미지이다. (a: control, b: EGFP-SF)
도11은 fluorescent SF-labeled p53 antibody 를 이용한 암세포에서의 p53 발현을 관찰한 이미지이다.
도2는 SDS-PAGE를 통한 형광 실크 피브로인 분자량 확인한 결과이다.
도3은 형광 실크 피브로인 용액의 형광 확인한 결과이다.
도4는 형광 실크 피브로인 막을 공초점 현미경 (Confocal Microscopy)으로 관찰한 형광과 세포 증식 (cell proliferation) 결과이다.
도5는 형광실크 피브로인 막에 배양한 세포 독성 실험 결과이다.
도6은 주사전자현미경 (SEM, Scanning Electron Microscope)과 공초점 현미경 (Confocal Microscopy)으로 관찰한 형광 실크 피브로인 나노 막이다.
도7은 형광 실크 피브로인 지지체를 동물에 삽입한 후 관찰한 이미지이다.
도8은 형광 실크 피브로인 지지체를 삽입한 동물의 조직 이미지이다.
도9는 쥐의 식도 천공을 형광 실크 피브로인을 이용한 추적 이미지이다.
도10은 위(stomach) 내에서 흡수하는 형광 단백질에 대한 조직 이미지이다. (a: control, b: EGFP-SF)
도11은 fluorescent SF-labeled p53 antibody 를 이용한 암세포에서의 p53 발현을 관찰한 이미지이다.
본 발명은 형광 누에고치를 환원제를 첨가하여 형광을 유지하는 생체적합성 형광 단백질 및 응용 지지체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면 소량의 형질 전환 형광 누에고치로부터 대량의 형광 실크 피브로인 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명에 의한 형광 실크 피브로인 용액은 a) 형광 누에고치를 정련제를 포함하는 수용액에 넣어 8-24시간 동안 40-60℃로 가열한 후 증류수로 세척하여 정련된 형광 실크 피브로인을 얻는 단계; b) 상기 정련된 형광 실크 피브로인을 9-9.6M LiBr 100 ㎖ 당 디티오트레이톨 (Dithiothreitol, DTT) 15mg-1.5g을 혼합한 용매에 40-60℃에서 1-5시간 동안 용해시키는 단계; 및 c) 상기 용해된 형광 실크 피브로인을 1차 증류수에서 48-96 시간동안 투석시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 정련제는 알칼레이즈 (alcalase) 및 탄산수소나트륨 (NaHCO3)를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 a)단계에서 정련시간이 8시간 미만이면 세리신 단백질이 완전히 제거되지 않을 수 있고 24시간을 초과하면 피브로인 단백질이 변성될 수 있다. 또한, 상기 a)단계에서 온도가 40℃ 미만이면 알칼레이즈(alcalase) 등의 효소 정련제가 활성화 되지 않을 수 있으며 60℃를 초과하면 형광 단백질이 변성될 수 있다. 상기 b) 단계에서 LiBr이 9M 미만이면 형광 실크 피브로인 단백질이 용해 되지 않을 수 있고 9.6M 초과이면 LiBr가 상온에서 용해되지 않을 수 있다. 또한, 상기 b)단계에서 디티오트레이톨이 15mg 미만이면 형광이 발현 되지 않을 수 있고 1.5g 초과이면 독성이 발현될 수 있어 생체재료로 사용하기 적합하지 않을 수 있다. 또한 상기 b) 단계에서 40℃ 미만이면 형광실크 피브로인이 용해되지 않을 수 있고 60℃ 초과이면 형광단백질이 변성 될 수 있으며, 용해시간이 1시간 미만이면 형광실크 피브로인이 완전히 용해되지 않을 수 있고 5시간 초과이면 형광실크 피브로인의 분자량이 낮아질 수 있다. 상기 c)단계에서 형광실크 피브로인 용액 투석 시간이 48시간 미만이면 형광실크 피브로인 용액의 염이 제거 되지 않을 수 있고 96시간을 초과하면 실크 피브로인 단백질이 변성될 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 설명한다. 그러나, 이는 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것으로 여겨져서는 안된다.
1. 형광 실크 피브로인 용액의 제조
도 1과 같이 증류수 600㎖에 Alcalase 0.9㎖와 NaHCO3 1.8g을 넣어 만든 정련수에 형광 누에고치 20g을 넣어 12시간 동안 60℃로 가열하고 증류수로 3회 반복 세척의 정련과정을 거쳤다. 이렇게 세리신 단백질과 불순물 등을 제거하여 순수한 형광 실크 피브로인 섬유 15g을 얻었다. 정련된 형광 실크 피브로인은 1mM 디티오트레이톨 (Dithiothreitol(DTT), DTT 15.41mg을 첨가하면 1mM DTT가 되며, DTT가 1mM 이상시 형광 발현됨)이 혼합된 9.5M LiBr 100㎖를 40℃에서 3시간 동안 용해시킨 다음 1차 증류수에서 72시간 동안 투석하였고, 4 w/w%의 순수한 형광 실크 피브로인 용액 200㎖ (Fluorescent Silk Fibroin Solution)을 제작하였다 (도1).
2. 형광 실크 피브로인 분자량 확인
상기에서 제작된 형광 실크 피브로인의 분자량 분석을 위해, SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE는 Mini-PROTEAN 3 Cell system (Bio-Rad)을 사용하였다. 시료는 4가지 다른 색(B. mori silk fibroin, EGFP, mKate2, EYFP)의 실크 피브로인 용액을 준비하고, 10% acrylamide gel 과 4% condensing gel에 처리하였고, protein band는 0.25% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 염색하여 분자량을 확인하였다 (도2). B. mori silk fibroin(lane 1)은 15-250 kDa 범위에 끌려 있다. EGFP(lane 2), mKate2(lane 3), EYFP(lane 4)는 heavy chain 약 60 kDa에 나타나며 light chain 26 kDa도 확인할 수 있었다.
3. 형광 실크 피브로인 용액의 형광 확인
제조된 4% 형광 실크 피브로인 용액을 LS-55 (Perkin Elmer, Santa Clara, CA, USA) fluorescence spectrophotometer을 사용하여 형광 스펙트럼을 관찰하였다. 각각의 형광 단백질은 488 nm (EGFP), 514 nm (EYFP) and 588 nm (mKate2)에서 excitation 파장, 507 nm (EGFP), 527 nm (EYFP) and 633 nm (mKate2)에서 emission 파장을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그 결과 형광 누에고치의 excitation(도3-a)와 형광 실크 피브로인 용액의 excitation(도3-c)는 서로 유사하며 기존 형광 단백질의 파장과도 유사한 것을 확인 하였다. 형광 누에고치의 emission(도3-b)과 형광 실크 피브로인 용액의 emission(도3-d) 역시 서로 유사하며 기존 emission 파장과도 유사하였다(도3). 따라서, 형광 누에고치로부터 제조된 형광 실크 피브로인 용액은 형광을 유지함을 확인하였다.
형광
실크
피브로인 막 제작 및 세포 증식 (cell
prliferation
) 확인
형광 실크 피브로인 막은 다음과 같이 제작한다. 제조된 형광 실크 피브로인 용액을 90×15 mm 페트리디쉬에 5~10㎖ 붓고 평균온도 26℃의 실내에서 48시간 동안 건조한다. 상기 건조하여 제조된 각 형광 실크 피브로인 필름을 직경 3 mm의 biopsy punch 사용하여 원형으로 만든 후 96 well Cell Culture Plate 에서 NIH 3T3 fibroblast 세포를 파종하여 24시간 동안 배양하였다. 육안적 관찰을 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), hodamine phalloidin (Invitrogen Co., San Diego, CA, USA)를 이용해 세포를 염색하여 형광현미경 (Eclipse 80i, Nikon Co., Japan)을 통해 관찰하였다. 그 결과, 형광 실크 피브로인 필름은 고유의 형광을 유지할 뿐만 아니라 세포 부착도가 뛰어남을 관찰할 수 있었다 (도4). 또한 형광 실크 피브로인 필름의 세포 친화성 및 배양 정도를 알아보기 위해 배양 1, 3, 7일 후 CCK-8 assay를 시행하였다. 그 결과, 각 지지체에 파종된 세포의 수는 시간이 지남에 따라 점차 증가하는 양상을 보였다.(도5)
따라서, 본 발명에 따른 형광 실크 피브로인은 필름으로 제조하여도 형광을 잃지 않고 각각의 고유한 형광을 유지하는 것이 확인되었고, 세포 배양에 있어서 부착이 잘 되는 것을 관찰할 수 있다.
형광
실크
피브로인 나노 막 제작 및 확인
형광 피브로인 나노 섬유 막은 다음과 같이 제작하였다. 실시예 2에서 제작된 형광 실크 피브로인 스펀지를 98% formic acid 수용액을 용매로 6.5%(w/v)로 16시간 동안 40℃에서 녹인다. 제조된 용액을 10mL 주사기에 넣었다. 유속은 0.3 mL/h로 유지되도록 하고 22 gauge 주사기 팁(0.7 mm OD × 0.4 mm ID)을 사용하였고 주사기 팁과 방사판의 거리(TCD, Tip to C+ollector Distance)는 15cm로 하였으며 주사기 팁에는 +20 kV, 방사판은 -2kV로 설정하여 주사기 4개를 12시간 동안 방사하였다.
제작된 형광 실크 피브로인 나노 막의 나노 섬유와 섬유에서 형광을 유지하는지 확인하기 위해 주사전자현미경(SEM, Scanning Electron Microscope)과 공초점 현미경(Confocal Microscopy)으로 확인하였다. 주사전자현미경 사진(도6-a,b,c) 보아 전기 방사를 통한 나노 크기의 섬유를 제작 할 수 있으며, 공초점현미경을 통한 사진(도6-d,e,f) 결과 형광을 유지 하는 것을 확인 할 수 있다.(도6)
동물 모델을 이용한
In
vivo
형광 이미지
1. 실크 지지체의 생체 내 삽입을 통한 biophotonic
제조된 형광 실크 피브로인 용액을 -80℃ 에 12시간 얼린 후 24-36시간 동안 동결 건조하여 형광 실크 피브로인 스펀지를 제작하였다. 제작된 형광 실크 피브로인 스펀지를 동물 모델에 삽입 후 생체 내 형광 이미지 효과를 확인하였다. 동물 모델은 hairless mouse를 사용하였고, Fluorescence Animal Imaging System (IVIS 200, Perkin Elmer, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 in vivo에서 형광을 발현하는 것을 확인하였다. 확인 결과 각각의 스펀지가 있는 조직에서 형광을 발현하는 것을 관찰할 수 있었다 (도7). 또한 24시간 이내 조직과 1년후 조직을 적출하여cryosection 을 통해 샘플을 제작하였고 육안적 관찰을 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), hodamine phalloidin (Invitrogen Co., San Diego, CA, USA)를 이용해 세포를 염색하여 형광현미경 (Eclipse 80i, Nikon Co., Japan)을 통해 관찰하였다 (도8). 그 결과, 24시간(도8-a,b,c) 및 1년후(도8-d,e,f)의 샘플에서 각각의 지지체 모두 형태와 형광을 유지하는 것을 관찰할 수 있었다.
2. 식도 천공 모델
본 연구에서 제작된 형광 실크 피브로인 용액을 동물 모델에 적용하여 바이오포토닉에 활용 가능한지 확인하였다. 동물 모델은 SD 랫트 식도에 0.5mm 천공을 만들고 제작된 형광 실크 피브로인 용액을 경구 투입한 후 형광 현미경을 이용해 0.2초 마다 관찰하였다. 관찰 결과 통과 시간에 따라 형광 물질이 천공 부위에서 검출 되었고 미세한 천공부위를 추적할 수 있었다 (도9).
3. 위(stomach) 내에서 흡수하는 형광 단백질 조직학적 관찰
상기 실시예 2에서 제작한 형광실크 피브로인 스펀지 1g을 SD 랫트에 경구 투입하여 위 내에서 소화 흡수 되는 형광 물질을 관찰하였다. 형광 실크 피브로인 스펀지를 24시간 경구 투입 후 위 조직을 적출하였다. 대조군으로는 SD 랫트에 백옥잠 실크 스펀지 1g를 경구 투입한 후 조직을 적출하였다. 적출한 조직을 cryosection을 통해 샘플을 제작하였고 육안적 관찰을 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 이용해 세포를 염색하여 형광현미경 (Eclipse 80i, Nikon Co., Japan)을 통해 관찰하였다. 그 결과 대조군인 백옥잠 실크 스펀지를 경구 투입한 경우(도10-a)에는 형광 입자가 관찰 되지 않지만, 본 발명의 형광 실크 피브로인 스펀지를 경구 투입한 경우(도10-b)에는 위점막 안에서 형광 입자들이 분포하고 있는 것을 관찰할 수 있었다(도10). 따라서 형광 실크 피브로인 입자는 위의 산에서 형광을 잃지 않으며 위점막 내부로 침투가 가능한 바이오포토닉 생체재료로 활용될 수 있다.
4. fluorescent SF -labeled p53 antibody 제작 및 이를 이용한 암세포에서의 p53 발현 확인
0.2%로 희석한 정제된 형광 실크 용액 1㎖에 NHS-PEG4-Biotin solution 154.05㎕ (EZ-Link NHS-PEG4-Biotinylation Kit, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)를 넣어주고 ice 상에서 4시간 incubation 후 desalting column을 통과시켜 biotinylated-silk를 제작하였다. 이 용액 500㎕에 p53 antibody 7㎕ (antibody 농도 1mg/㎖)(Ahbcore Inc, Ramona, CA, USA)를 섞어서 2시간 incubation하여 fluorescent SF-labeled p53 antibody를 제작하였다. HeLa 세포를 96 well plate에 배양하여 제작된 antibody를 각 well당 300㎕를 처리하여 24시간 뒤에 형광현미경 (Eclipse 80i, Nikon Co., Japan)을 통해 관찰하였다 (도11). 형광이 태그된 antibody에 의해 HeLa 세포에서 과발현된 p53 유전자를 확인할 수 있었다.
Claims (4)
- a) 형질전환 형광 누에고치를 정련제를 포함하는 수용액에 넣어 8-24시간 동안 40-60℃로 가열한 후 증류수로 세척하여 정련된 형광 실크 피브로인을 얻는 단계;
b) 상기 정련된 형광 실크 피브로인을 9-9.6M LiBr 100 ㎖ 당 디티오트레이톨 (Dithiothreitol, DTT) 15mg-1.5g을 혼합한 용매에 40-60℃에서 1-5시간 동안 용해시키는 단계; 및
c) 상기 용해된 형광 실크 피브로인을 1차 증류수에서 48-96 시간동안 투석시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 실크 피브로인 용액을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 정련제는 알칼레이즈 (alcalase) 및 탄산수소나트륨 (NaHCO3)를 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 실크 피브로인 용액을 제조하는 방법.
- 제1항 내지 제2항 중 선택된 어느 한 항의 제조방법에 따라 형질전환 형광 누에고치로부터 제조된 형광 실크 피브로인 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 지지체.
- 제1항 내지 제2항 중 선택된 어느 한 항의 제조방법에 따라 형질전환 형광 누에고치로부터 제조된 형광 실크 피브로인 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 이미징용 조성물.
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