KR101638690B1 - Suicide vector for producing murtant strain of multidrug-resistant strain - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다제내성 균주에서 복제되지 않고, 다제내성 균주의 변이주 제작에 사용될 수 있는 자살벡터, 상기 자살벡터를 포함하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트, 상기 자살벡터를 이용하여 다제내성 균주의 표적유전자가 결실된 변이주를 제작하는 방법 및 상기 방법으로 제작되어 다제내성 균주의 표적유전자가 결실된 변이주에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터 또는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트를 이용하면, 다양한 다제내성 균주의 연구에 사용할 수 있는 제한된 항생제 저항성 유전자만을 이용하여도, 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 하나 또는 다수의 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주를 제작할 수 있으므로, 다양한 다제내성 균주의 유전체, 생리활성 등의 다양한 분야의 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a suicide vector which is not replicated in a multidrug-resistant strain but can be used for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain, a kit for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain containing the suicide vector, A method for producing a mutant strain in which a gene is deleted, and a mutant strain produced by the above method and having deletion of a target gene of a multidrug-resistant strain. Using the kit for producing a mutant strain of a suicide vector or a multidrug resistant strain for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain provided by the present invention, even when only a limited antibiotic resistance gene that can be used for studying various multidrug resistant strains can be used, Since a mutant strain in which one or more target genes or target polynucleotides are deleted from the genomic DNA can be produced, it can be widely used in various fields such as genome and physiological activity of various multidrug-resistant strains.
Description
본 발명은 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 다제내성 균주에서 복제되지 않고, 다제내성 균주의 변이주 제작에 사용될 수 있는 자살벡터, 상기 자살벡터를 포함하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트, 상기 자살벡터를 이용하여 다제내성 균주의 표적유전자가 결실된 변이주를 제작하는 방법 및 상기 방법으로 제작되어 다제내성 균주의 표적유전자가 결실된 변이주에 관한 것이다.
The present invention relates to a suicide vector for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain. More particularly, the present invention relates to a suicide vector which is not replicated in a multidrug resistant strain but can be used for producing a mutant strain of a multidrug resistant strain, Resistant mutant strain, a method for producing a mutant strain in which a target gene of a multidrug-resistant strain has been deleted using the suicide vector, and a mutant strain produced by the method and a target gene of the multidrug-resistant strain have been deleted.
항생제는 축산이나 수산업에 있어서 질병에 대하여 예방의 차원 또는 성장촉진을 위해서 사용되거나 치료를 목적으로 빈번히 사용되어 왔다. 그러나, 항생제의 과다사용으로 인하여 항생제에 내성을 가진 항생제 내성균의 발생이 증가하고 있을 뿐만 아니라, 상기 항생제 내성균은 축수산 식품을 통하여 사람에게 전파될 수 있다는 위험성으로 인하여, 이들의 내성을 유발하는 작용기작을 규명하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.Antibiotics have been frequently used in the livestock and fishery industries for the prevention or growth of diseases, or for treatment purposes. However, the overuse of antibiotics not only increases the incidence of antibiotic-resistant bacteria resistant to antibiotics, but also increases the risk that the antibiotic-resistant bacteria can spread to humans through fish food, Researches are being actively carried out.
한편, 상기 항생체에 의하여 내성이 유발된 균주 이외에도 자연계에는 천연적으로 다양한 항생제에 대하여 내성을 나타내는 내성균이 존재한다. 예를 들어, 다제내성 그람음성 균주에 속하는 것으로 알려진 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.) 균주는 흔히 토양이나 물 등의 자연환경에 널리 존재하며 특히 병원환경에 오랫동안 서식하다가 면역력이 약한 환자에게서 결막염, 피부염, 폐렴, 뇌수막염, 패혈증, 심내막염, 복강 내 감염, 수술부위 감염, 요로감염 등의 합병증을 일으키는 전형적인 병원감염균으로 알려져 있다. 현재까지 연구된 아시네토박터 속 균주로 동정된 균주는 27종이 알려져 있고, 혼성화방법에 의하여 구별되는 종류로는 약 11종이 알려져 있다. 이 중에서도 아시네토박터 캘코아세티쿠스(A. calcoaceticus, genospecies 1형), 아시네토박터 바우마니(A. baumannii, genospecies 2형), 아시네토박터 피티(A. pittii, genospecies 3형) 및 아시네토박터 노소코미알리스(A. nosocomialis, genospecies 13 TU)는 유전적으로 밀접하게 연관되어 있어서 표현형에 기초하여 분류하는 일반적인 방법으로는 상기 균주를 구별하는 것 조차 어려운 실정이어서, 때로는 이들 균주를 모아 ACB 복합균주(A. calcoaceticus-A. baumannii complex, ACB complex)라고 지칭하기도 한다. On the other hand, in addition to the strains induced by the above-mentioned antibiotics, resistant strains resistant to various antibiotics naturally exist in nature. For example, strains of Acinetobacter sp., Which are known to belong to the multidrug-resistant Gram-negative strains, are widely present in natural environments such as soil and water. In particular, in strains of the immune system, It is known as a typical hospital infection causing complications such as dermatitis, pneumonia, meningitis, sepsis, endocarditis, intraperitoneal infection, surgical site infection and urinary tract infection. Twenty-seven strains identified as strains of the genus Ashinoto bacterium that have been studied to date are known, and about 11 strains are known to be distinguished by the hybridization method. Of these, A. calcoaceticus (genospecies type 1), A. baumannii (genospecies type 2), A. pittii (genospecies type 3) and Ashineto A. nosocomialis (genospecies 13 TU) is closely related genetically, so it is difficult to distinguish the above strains as a general method of classification based on phenotypes. Sometimes, these strains are collected and the ACB complex strain ( A. calcoaceticus - A. baumannii complex, ACB complex).
이처럼 구별이 어려운 다제내성 균주를 보다 간편하기 구별하는 방법을 개발하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 예를 들어, 한국특허공개 제2014-19219호에는 다제내성 균주의 일종인 아시네토박터 속 균주의 유전적 차이를 나타내는 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 상기 영역을 검출할 수 있는 프로브를 사용하여, 아시네토박터 속 균주를 동정하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 상기 다제내성 균주는 병원에서 이차적으로 감염될 수 있다고 알려져 있기 때문에, 이러한 감염에 의해 발생되는 다양한 증상을 신속하게 치료하는 방법을 개발하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 예를 들어, WO 2010/064261호에는 카르바페넘과 아즈트레오남의 복합제제를 사용하여 다제내성 균주의 일종인 아시네토박터 바우마니 감염증을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 한국특허등록 제820960호에는 항균활성을 나타내는 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주를 이용하여 다제내성 균주의 일종인 아시네토박터 바우마니 감염증을 치료하는 방법이 개시되어 있다.Studies have been actively undertaken to develop a method for distinguishing more difficult-to-distinguish multidrug resistant strains from simpler strains. For example, in Korean Patent Laid-Open Publication No. 2014-19219, a primer capable of amplifying a region showing a genetic difference of a strain of the genus Ashithobacter, a kind of multidrug-resistant strain, or a probe capable of detecting the region, A method for identifying a strain belonging to the genus Ashentubara is disclosed. In addition, since it is known that the above-mentioned multidrug-resistant strains can be secondarily infected in hospitals, studies are actively conducted to develop a method for rapidly treating various symptoms caused by such infections. For example, WO 2010/064261 discloses a method for treating an infectious disease of Acinetobacter baumannii, which is a kind of multidrug-resistant strain, using a combination preparation of carbapenum and aztreonam; Korean Patent Registration No. 820960 A method of treating a strain of multidrug-resistant Staphylococcus aureus, Streptomyces cinnamonensis, which exhibits antibacterial activity, is disclosed.
그럼에도 불구하고, 아직까지는 상기 항생제에 의해 내성이 유발되거나, 또는 천연적으로 다양한 항생제에 대하여 내성을 나타내는 다제내성 균주는 이들에 대한 연구가 충분히 진행되지 않고 있어서, 상기 다제내성 균주의 감염에 의하여 질병이 유발될 경우에는, 이에 대한 치료성공율이 낮다는 문제점이 해결되지 않고 있다. 이같은 문제점을 해결하기 위하여는, 상기 다제내성 균주에서 발현되는 각 유전자의 특성 및 기능을 규명하는 연구가 선행되어야 하지만, 항생제에 대하여 저항성을 나타낸다는 특성 때문에, 상기 다제내성 균주의 유전학적 및 생리학적 연구가 활발히 진행되지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 다제내성 균주의 변이주를 용이하게 제작하여, 상기 내성균주의 유전체를 보다 구체적으로 연구할 수 있는 방법론의 개발이 절실히 요구되고 있다.
Nevertheless, studies on multidrug-resistant strains which are resistant to the antibiotics or exhibit resistance to various naturally occurring antibiotics have not been sufficiently conducted, and thus, the infection of the multidrug- The problem that the treatment success rate is low is not solved. In order to solve such a problem, studies to characterize the functions and genes of the genes expressed in the multidrug-resistant strains should be preceded. However, because of their resistance to antibiotics, the genetic and physiological Research is not actively progressing. Therefore, there is an urgent need to develop a methodology for easily producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain and studying the genome of the resistant strain more specifically.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 다제내성 균주의 연구에 사용할 수 있는 제한된 항생제 저항성 유전자를 이용하여, 다제내성 변이주를 용이하게 제작하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 다제내성 균주에서 복제되지 않는 자살벡터를 이용할 경우, 다제내성 균주의 연구에 사용할 수 있는 제한된 항생제 저항성 유전자만을 이용하여도 목적하는 다제내성 균주의 변이주를 용이하게 제작할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have made extensive efforts to develop a method for easily producing a multidrug-resistant mutant strain using a limited antibiotic resistance gene that can be used in the study of a multidrug-resistant strain. As a result, , It was confirmed that mutant strain of the desired multidrug-resistant strain can be easily produced even by using only the limited antibiotic resistance gene which can be used for the study of multidrug-resistant strain, and the present invention has been completed.
본 발명의 하나의 목적은 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a suicide vector for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain.
본 발명의 다른 목적은 상기 자살벡터를 포함하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain containing the suicide vector.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 자살벡터를 이용하여 다제내성 균주의 변이주를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain using the suicide vector.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조되어, 다제내성 균주의 표적 유전자가 결실된 변이주를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a mutant strain produced by the above method, wherein a target gene of a multidrug-resistant strain has been deleted.
본 발명자들은 다양한 항생제에 대하여 저항성을 나타내는 다제내성 균주의 연구에 사용할 수 있는 제한된 항생제 저항성 유전자를 이용하여, 다제내성 균주의 변이주를 효과적으로 제작하는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 자살벡터에 주목하게 되었다. The present inventors have conducted various studies to develop a method for efficiently producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain using a limited antibiotic resistance gene that can be used for studying a multidrug-resistant strain exhibiting resistance to various antibiotics, .
통상적으로, 자살벡터는 특정 숙주안에서 복제되지 않는 플라스미드 또는 파아지를 의미하는데, 본 발명자들은 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자의 전체 또는 그의 일부를 결실 또는 치환 등의 방법으로 변이시키기 위한 수단으로서 사용하기 위하여, 다제내성 균주에서 복제되지 않는 자살벡터를 제작하였다. 본 발명자들이 제작한 자살벡터는 통상의 다른 벡터와 마찬가지로 외래 유전자가 삽입될 수 있는 다클론부위를 포함하는데, 상기 다클론부위는 복잡한 제한효소를 사용하지 않고서도 상기 자살벡터에 DNA 삽입단편을 용이하게 도입할 수 있도록 평활말단이 도입될 수 있는 다양한 제한효소 절단부위를 포함하도록 구성하였다. 이러한 다클론부위로 인하여, 통상적인 PCR 방법으로 제작되어 평활말단을 갖는 DNA 삽입단편은 특별한 제한효소를 처리하지 않고서도 상기 자살벡터에 용이하게 도입될 수 있다.Generally, a suicide vector means a plasmid or a phage that is not replicated in a specific host. The present inventors have found that a suicide vector is a means for mutating all or part of a target gene contained in the genomic DNA of a multidrug-resistant strain by deletion or substitution , A suicide vector not replicated in the multidrug-resistant strain was constructed. The suicide vector produced by the present inventors includes a polyclonal region into which a foreign gene can be inserted as in the case of other conventional vectors, and the polyclonal region can be inserted into the suicide vector without using a complex restriction enzyme The restriction endonuclease cleavage site can be introduced so that the restriction endonuclease can be introduced. Because of this polyclonal site, DNA insert fragments produced by conventional PCR methods and having smooth ends can be easily introduced into the suicide vectors without treatment with special restriction enzymes.
한편, 본 발명자들은 상기 제작된 자살벡터에 DNA 삽입단편을 도입하여 재조합벡터를 제작하고, 이를 상기 특정 숙주에 도입하면, 단일교차 재조합(single cross-over recombination)을 통해 상기 DNA 삽입단편을 상기 숙주의 게놈에 도입시켜서 형질전환체를 제작할 수 있음을 확인하였다.
On the other hand, the present inventors have succeeded in introducing a DNA insertion fragment into the prepared suicide vector to prepare a recombinant vector, and introducing the recombinant vector into the specific host, the single stranded DNA fragment is introduced into the host Into the genome of the transformant.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터를 제공한다.
In one embodiment of the present invention, the present invention provides a suicide vector for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain.
본 발명자들은 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자의 전체 또는 그의 일부(이하, '표적 폴리뉴클레오티드'라 함)를 결실 또는 치환 등의 방법으로 변이시키기 위한 수단으로서 사용하기 위하여, 다제내성 균주에서 복제되지 않는 자살벡터를 제작하였는데, 상기 자살벡터는 R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자 및 다클론부위를 순차적으로 포함하도록 구성하였다. 상기 자살벡터에 포함된 다클론부위는 복잡한 제한효소를 사용하지 않고서도 상기 자살벡터에 DNA 삽입단편을 용이하게 도입할 수 있도록 평활말단이 도입될 수 있는 다양한 제한효소 절단부위를 포함하도록 구성하였는데, 이로 인하여 통상적인 PCR 방법으로 제작되어 평활말단을 갖는 DNA 삽입단편은 특별한 제한효소를 처리하지 않고서도 상기 자살벡터에 용이하게 도입될 수 있다. 또한, sacB 유전자는 수크로스를 분해하는 효소로 알려진 수크라제를 발현시키는데, 상기 발현된 수크라제는 과다한 수크로스를 포함하는 환경에서는 수크로스를 분해하여 다제내성 균주에게 독성을 나타내는 산물을 생성함으로써, 숙주세포의 게놈DNA에서 단일교차 재조합을 유발시킬 수 있다.
The inventors of the present invention have found that the use of a multidrug-resistant strain (hereinafter, referred to as " target polynucleotide ") for use as a means for mutating all or part of a target gene contained in genomic DNA of a multidrug-resistant strain . The suicide vector was constructed to include R6K ori, mob RP4 gene, cat gene, sacB gene, and polyclonal region in sequence. The polyclonal site contained in the suicide vector includes various restriction enzyme cleavage sites capable of introducing a smooth end into the suicide vector so as to easily introduce the DNA insert into the suicide vector without using complex restriction enzymes. Therefore, a DNA-inserted fragment having a smooth end prepared by a conventional PCR method can be easily introduced into the suicide vector without treating with a special restriction enzyme. In addition, the sacB gene expresses sucrase, which is known as an enzyme that degrades sucrose. The expressed sucrase decomposes sucrose in an environment containing excessive sucrose to produce a toxic product , It is possible to induce a single cross-over recombination in the genomic DNA of the host cell.
이러한 구성요소를 포함하는 자살벡터에 DNA 삽입단편이 도입된 재조합 벡터를 다제내성 균주에 도입하면, 상기 DNA 삽입단편에 포함된 5'-영역 단편 또는 3'-영역 단편으로 인하여, 1차 단일교차 재조합이 유발되어, 상기 재조합벡터 전체가 다제내성 균주의 게놈 DNA에 삽입된 형질전환체를 제작할 수 있다. 상기 형질전환체의 제작성공여부는 상기 DNA 삽입단편에 포함된 마커영역 단편의 발현여부에 의해 확인될 수 있다. 이어, 상기 제작된 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하면, 자살벡터에 포함된 sacB 유전자로부터 발현된 수크라제에 의해 수크로스를 분해시키고, 이로부터 생성되는 독성산물로 인하여 상기 재조합벡터가 삽입된 게놈 DNA 내에서 2차 단일교차 재조합이 유발될 수 있다. 상기 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 앞서 삽입된 재조합벡터가 게놈 DNA가 제거되어 야생형 다제내성 균주로 복귀하거나, 또는 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 제거된 다제내성 균주의 변이주가 제조될 수 있다. 상기 변이주의 제조여부는 최종적으로 생산된 균주의 기능 또는 게놈 DNA 크기를 비교하여 확인할 수 있다.When a recombinant vector into which a DNA-inserted fragment is introduced into a suicide vector containing such components is introduced into a multidrug-resistant strain, the 5'-region fragment or the 3'-region fragment contained in the DNA- A transformant in which the recombination is induced and the whole of the recombinant vector is inserted into the genomic DNA of the multidrug-resistant strain can be produced. Successful production of the transformant can be confirmed by the expression of a marker region fragment contained in the DNA-inserted fragment. Then, the transformant thus prepared is inoculated into a culture medium containing an excess amount of sucrose and cultured, whereby the sucrose is degraded by sucrase expressed from the sacB gene contained in the suicide vector, and toxic products , A second single cross-over recombination can be induced in the genomic DNA into which the recombinant vector is inserted. When the second single cross-over recombination is induced, the inserted recombinant vector may be removed from the genomic DNA to return to the wild-type multidrug-resistant strain, or a mutant strain of the multidrug-resistant strain in which the target gene or the target polynucleotide has been removed may be produced. Whether or not the mutant is produced can be confirmed by comparing the function of the finally produced strain or the genomic DNA size.
따라서, 상기 제작된 다제내성 균주에서 복제되지 않는 자살벡터에 DNA 삽입단편이 도입된 재조합벡터를 상기 다제내성 균주에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 이를 수크로스가 포함된 배지에서 배양할 경우, 다제내성 균주의 게놈에서 단일교차 재조합이 유발되어 다제내성 균주의 게놈 DNA의 일부가 결실 또는 치환된 변이주를 제작할 수 있다.
Therefore, when a recombinant vector into which a DNA-inserted fragment is introduced into a suicide vector that is not replicated in the prepared multidrug-resistant strain is introduced into the multidrug-resistant strain to obtain a transformant and cultured in a medium containing sucrose, Mutant strains in which a single cross-over recombination is induced in the genome of a multidrug-resistant strain, whereby a part of the genomic DNA of the multidrug-resistant strain is deleted or substituted, can be produced.
본 발명에서 제공하는 자살벡터는 다제내성 균주의 변이주를 제작하는데 사용할 수 있고, 상기 변이주의 제작시에 동일한 마커영역 단편을 반복적으로 사용하여 연속적으로 다양한 변이주를 제조할 수 있다는 장점이 있다. The suicide vectors provided in the present invention can be used to prepare mutant strains of multidrug-resistant strains, and it is advantageous to continuously produce various mutant strains by repeatedly using the same marker region fragments in the production of the mutant strains.
본 발명에서 사용하는 다제내성 균주는 다양한 항생제에 대하여 저항성을 갖고 있어 변이주의 제작시에 사용될 수 있는 항생제 저항성 마커유전자가 제한되는데, 종래의 변이주 제조방법을 사용할 경우에는 사용된 항생제 저항성 마커유전자가 변이주의 게놈 DNA에 잔류하게 되어, 추가적인 변이주를 제작하기 위하여는 또 다른 항생제 저항성 마커유전자를 사용하여야 하므로, 다제내성 균주의 변이주 제작이 제한될 수 밖에 없다.The multidrug-resistant strains used in the present invention are resistant to various antibiotics, so that the antibiotic resistance marker genes that can be used in the production of the mutant strains are limited. When the conventional mutant strains are used, the antibiotic resistance marker genes used are mutants Of the genomic DNA of the present invention, so that it is necessary to use another antibiotic resistance marker gene in order to produce additional mutants, so that mutant strains of multidrug-resistant strains are limited.
이러한 종래의 변이주 제조방법과는 달리, 본 발명에서 제공하는 자살벡터를 사용하면 중간과정에서 항생제 저항성 마커유전자를 사용하기는 하지만, 최종적으로 제조된 변이주의 게놈 DNA에는 항생제 저항성 마커유전자가 남아있지 않으므로, 동일한 항생제 저항성 마커유전자를 사용하여 2차 변이주를 제조할 수 있다. 또한, 동일한 마커영역 단편을 사용한 동일한 방식으로, 상기 2차 변이주를 이용한 3차 변이주의 제조, 상기 3차 변이주를 이용한 4차 변이주의 제조 등의 연속적인 변이주를 제조할 수 있다.
Unlike the conventional mutant strains, antibiotic resistance marker genes are used in the intermediate process using the suicide vectors provided in the present invention, but the antimicrobial resistance marker gene is not left in the genomic DNA of the finally prepared mutant strains , A second mutant can be produced using the same antibiotic resistance marker gene. Further, in the same manner using the same marker region fragment, successive mutants such as the production of a third mutant using the second mutant and the production of a fourth mutant using the third mutant can be produced.
본 발명에서 제공하는 자살벡터는 특정 균주에 대한 특이성을 나타내지 않으므로, 다제내성 균주 뿐만 아니라 다제내성을 나타내지 않는 균주를 대상으로 할 경우에도 변이주를 제작하는데 사용될 수 있다. 그러나, 다제내성을 나타내지 않는 균주를 대상으로 할 경우에는 종래의 벡터를 이용할 경우에 보다 효과적으로 변이주를 제작할 수 있는 반면, 다제내성 균주를 대상으로 할 경우에는 본 발명에서 제공하는 자살벡터를 사용할 경우에 보다 효과적으로 변이주를 제작할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 자살벡터는 다제내성을 나타내는 균주이기만 하다면 이의 변이주 제작을 위하여 제한없이 사용되어 본 발명의 자살벡터가 제공하는 장점을 누릴 수 있다.
Since the suicide vector provided by the present invention does not show specificity for a specific strain, it can be used to prepare a mutant as well as a multidrug-resistant strain as well as a multidrug resistant strain. However, when a strain that does not show multidrug resistance is used, a mutant strain can be produced more effectively when a conventional vector is used. On the other hand, in the case of a multidrug-resistant strain, when the suicide vector provided in the present invention is used It is possible to produce a mutant strain more effectively. Therefore, the suicide vector of the present invention can be used without limitation for the production of a mutant strains thereof, as long as it is a strain exhibiting multidrug resistance, and can enjoy the advantages provided by the suicide vector of the present invention.
본 발명의 용어 "다제내성 균주"란, 다양한 항생제에 대하여 저항성을 나타내는 균주를 의미하는데, 인위적인 항생제 처리로 인하여 후천적으로 항생제에 대하여 내성을 나타내는 균주 뿐만 아니라 천연적으로 다양한 항생제에 대하여 내성을 나타내는 균주를 모두 포함한다, The term " multidrug-resistant strain " of the present invention means a strain showing resistance to various antibiotics, as well as a strain showing resistance to antibiotics inherently due to an artificial antibiotic treatment, as well as a strain Lt; / RTI >
본 발명에 있어서, 상기 다제내성 균주는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 다제내성을 나타내는 그람음성 균주가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 다제내성을 나타내는 그람음성 간균이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 다제내성을 나타내는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii, A. baumannii) 균주가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 상기 다제내성 균주의 예시로써, 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii, A. baumannii) 균주를 사용하였다.In the present invention, the multidrug-resistant bacterium is not particularly limited, but preferably it can be a gram negative strain showing multidrug resistance, more preferably a gram negative bacterium showing multidrug resistance, ( Acinetobacter , < RTI ID = 0.0 > Acinetobacter < / RTI > baumannii , A. baumannii ). For example, in the present invention, examples of the multidrug-resistant strains include Acinetobacter baumannii , A. baumannii ) strains were used.
본 발명의 용어 "아시네토박터 바우마니 균주(Acinetobacter baumannii, A. baumannii) 균주"란, MRAB(multidrug-resistant Acinetobacter baumannii)라고도 지칭되는 병원균의 일종으로서, 카바페넘계, 아미노글리코사이드계 및 플로로퀴놀론계열의 항생제에 대하여 저항성을 나타내는 감염성 병원균을 의미한다. 상기 균주는 면역저하자, 만성 폐질환자, 당뇨병 환자등에 쉽게 감염된다고 알려져 있다.
Terms of the present invention, "Acinetobacter baumannii strains (Acinetobacter baumannii , A. baumannii ) strain "refers to MRAB (multidrug-resistant Acinetobacter baumannii ), and refers to an infectious pathogen resistant to carbapenem , aminoglycoside and fluroquinolone antibiotics. It is known that the strain is easily infected with immunosuppression, chronic lung disease, diabetes mellitus, and the like.
본 발명의 용어 "자살벡터(suicide vector)"란, 숙주 균주의 게놈 DNA에 DNA 삽입단편을 전달하기 위한 전달매체가 되는 도입벡터의 일종으로서, 특정 숙주 균주안에서 복제되지 않고, 이에 포함된 삽입단편이 발현되지도 않는 플라스미드 또는 파아지를 의미한다. The term "suicide vector " of the present invention is a kind of introduction vector which serves as a delivery medium for delivering a DNA-inserted fragment to a genomic DNA of a host strain, and is not replicated in a specific host strain, Lt; RTI ID = 0.0 > plasmid < / RTI > or phage.
본 발명에 있어서, 상기 자살벡터는 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터인 것으로 해석될 수 있는데, 상기 자살벡터는 다제내성 균주내에서 복제되지 않는 특성을 나타낸다. 이를 위한 구성요소로서 R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자 및 다클론부위가 순차적으로 포함하는 형태가 될 수 있는데, 상기 다클론부위는 다양한 평활말단을 생성하는 제한효소에 의하여 절단될 수 있는 부위를 포함할 수 있다. 상기 평활말단을 생성하는 제한효소는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 PstI, FspI, NotI, BglII 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. In the present invention, the suicide vector may be interpreted as a suicide vector for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain, wherein the suicide vector exhibits a property of not replicating in a multidrug-resistant strain. As a constituent for this, the R6K ori, the mob RP4 gene, the cat gene, the sacB gene and the polyclonal region may be sequentially included, and the polyclonal region may be cleaved by restriction enzymes generating various smooth ends And the like. The restriction endonuclease producing the blunt end is not particularly limited, but PstI, FspI, NotI, BglII and the like can be used alone or in combination.
또한, 상기 자살벡터에 포함된 R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자, 다클론부위 등은 야생형 서열 뿐만 아니라, 동일한 기능을 나타내는 한, 이들과 상동성을 나타내는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있는데, 예를 들어, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다. In addition, the R6K ori, mob RP4 gene, cat gene, sacB gene, polyclonal region, and the like included in the suicide vector include not only the wild type sequence but also a polynucleotide including a sequence showing homology thereto, Can be used, and can be, for example, a polynucleotide exhibiting a similarity of preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 98% or more.
예를 들어, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 도 1b에 도시된 개열지도를 가지는 자살벡터, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자살벡터가 될 수 있다.
For example, the suicide vector provided in the present invention may be a suicide vector having the cleaved map shown in Fig. 1B, a suicide vector containing the polynucleotide of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 용어 "DNA 삽입단편"이란, 변이를 유발시키고자 하는 목적 균주에 도입하여 목적 균주의 유전형질을 변이시킬 수 있는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.The term "DNA insert fragment " of the present invention means a gene or polynucleotide that can be introduced into a target strain to cause mutation and thereby mutate the genetic traits of the target strain.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 삽입단편은 상기 자살벡터의 다클론부위에 도입되는 DNA 삽입단편은 숙주인 다제내성 균주의 게놈 DNA 내에 도입되어 단일교차 재조합이 유발될 수 있도록 구성된 폴리뉴클레오티드와 자살벡터의 도입여부를 확인할 수 있는 마커를 포함하도록 구성될 수 있다. In the present invention, the DNA-inserted fragment is inserted into the genomic DNA of the host-resistant multidrug-resistant strain to introduce a polynucleotide configured to induce a single cross-over recombination, and a suicide vector And may include a marker for confirming the introduction.
구체적으로, 상기 DNA 삽입단편은 다제내성 균주의 게놈 DNA에 위치한 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드의 상류에 인접한 염기서열(이하, '5'-영역 단편'이라 함), 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드의 하류에 인접한 염기서열(이하, '3'-영역 단편'이라 함) 및 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제에 대한 저항성을 가지는 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열(이하, '마커영역 단편'이라 함)을 순차적으로 포함하도록 구성될 수 있는데, 상기 5'-영역 단편과 3'-영역 단편은 다제내성 균주의 게놈 DNA 내에서 단일교차 재조합을 유발시킬 수 있고, 상기 마커영역 단편은 자살벡터의 도입여부를 확인할 수 있는 마커로서 작용할 수 있다.Specifically, the DNA-inserted fragment includes a nucleotide sequence (hereinafter referred to as a '5'-region fragment') upstream of a target gene or a target polynucleotide located in the genomic DNA of the multidrug-resistant strain, a downstream region of a target gene or a target polynucleotide (Hereinafter, referred to as a '3'-region fragment') and a nucleotide sequence of a gene encoding an antibiotic marker protein having resistance to an antibiotic against which the multidrug-resistant strain does not exhibit resistance (hereinafter referred to as 'marker region fragment' , Wherein the 5'- and 3'-region fragments can induce a single cross-over recombination in the genomic DNA of a multidrug-resistant strain, wherein the marker region fragment is a suicide vector As a marker for confirming whether or not the introduction of the marker is possible.
본 발명의 용어 "표적 폴리뉴클레오티드의 상류에 인접한 염기서열"이란, 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 표적 폴리뉴클레오티드의 5'에 연결된 염기서열 또는 이와 동일한 염기서열을 가지는 DNA 단편을 의미하고, 본 발명의 용어 "표적 폴리뉴클레오티드의 하류에 인접한 염기서열"이란, 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 표적 폴리뉴클레오티드의 3'에 연결된 염기서열 또는 이와 동일한 염기서열을 가지는 DNA 단편을 의미한다.The term "nucleotide sequence adjacent to the upstream of the target polynucleotide" of the present invention means a DNA sequence having the base sequence or the same base sequence linked to 5 'of the target polynucleotide in the genomic DNA of the multidrug-resistant strain, The term "base sequence adjacent to the downstream of the target polynucleotide" means a base sequence or a DNA fragment having the same base sequence linked to the 3 'of the target polynucleotide in the genomic DNA of the multidrug-resistant strain.
본 발명의 용어 "항생제 마커 단백질"이란, 항생제에 대하여 저항성을 부여하여, 형질전환시 마커로서 사용될 수 있는 단백질을 의미한다.The term "antibiotic marker protein" of the present invention means a protein which is resistant to an antibiotic and can be used as a marker in transformation.
본 발명에 있어서, 상기 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자는 DNA 삽입단편의 마커영역 단편으로 사용되고, 상기 자살벡터에 DNA 삽입단편이 도입되어 제작된 재조합벡터가 다제내성 균주에 도입되어, 이의 게놈 DNA에 삽입되면, 상기 게놈 DNA로부터 제거되기 전까지는 독립적으로 발현된다. 상기 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자는 다제내성 균주에 내재적으로 포함되지 않는 한, 종래에 사용되었던 모든 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자를 사용할 수 있는데, 다제내성 균주에 따라 상기 항생제 마커 단백질은 적절한 것을 사용할 수 있다. In the present invention, the gene encoding the antibiotic marker protein is used as a marker region fragment of the DNA-inserted fragment, and the recombinant vector prepared by introducing the DNA-inserted fragment into the suicide vector is introduced into the multidrug-resistant strain, Once inserted, they are independently expressed until they are removed from the genomic DNA. The gene encoding the antibiotic marker protein may be a gene coding for any antibiotic marker protein which has been used in the past unless the gene encoding the antibiotic marker protein is implicitly contained in the multidrug resistant strain. .
예를 들어, 본 발명에서는 다제내성 균주로서 아시네토박터 바우마니 균주를 사용하였는데, 상기 아시네토박터 바우마니 균주에 사용할 수 있는 항생제 마커 단백질은 카나마이신 저항성 유전자인 nptI, 테트라사이클린 저항성 유전자인 tetM, tetC, tetR 등을 단독으로 또는 조합한 것이 될 수 있다. For example, in the present invention, a strain of Asnithobacter baumannii was used as a multidrug-resistant strain. Antibiotic marker proteins that can be used for the strains of Asnithobacter baumannii include kanamycin resistance gene nptI, tetracycline resistance genes tetM, tetC , tetR can be used singly or in combination.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주의 일종인 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에 위치한 표적 유전자의 상류에 인접한 염기서열(5'-영역 단편), 상기 표적 유전자의 하류에 인접한 염기서열(3'-영역 단편) 및 아시네토박터 바우마니 균주가 저항성을 나타내지 않은 카나마이신에 대한 저항성을 나타내는 단백질을 코딩하는 nptI 유전자의 염기서열(마커영역 단편)을 순차적으로 포함하도록 설계된 DNA 삽입단편을 합성하여 사용하였다.
According to one embodiment of the present invention, the nucleotide sequence (5'-region fragment) adjacent to the upstream of the target gene located in the genomic DNA of the strain of Asnithobacter baumannii, which is a kind of multidrug resistant strain, a base adjacent to the downstream of the target gene A DNA insert fragment designed to sequentially include a sequence (3'-region fragment) and a nucleotide sequence (marker region fragment) of an nptI gene coding for a protein exhibiting resistance to kanamycin that does not exhibit resistance to Asnithobacter baumannii Were synthesized and used.
본 발명의 용어 "표적 유전자"란, "내재 유전자"라고도 하고, 상기 목적하는 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함되어 상기 목적 유전자를 사용하여 변이를 유발시키는 대상이 되는 유전자를 의미한다.The term "target gene" of the present invention refers to a gene that is also referred to as an " inherent gene ", which is included in the genomic DNA of the desired multidrug-resistant strain and is used to induce mutation using the target gene.
본 발명에 있어서, 상기 표적 유전자는 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함되어 결실 또는 치환의 대상이 되는 유전자인 것으로 해석될 수 있는데, 상기 표적 유전자는 다제내성 균주에 따라 적절한 것이 될 수 있다. In the present invention, the target gene may be interpreted as a gene that is included in the genomic DNA of a multidrug-resistant strain to be subjected to deletion or substitution, and the target gene may be appropriate depending on the multidrug-resistant strain.
예를 들어, 본 발명에서는 다제내성 균주로서 아시네토박터 바우마니 균주를 사용하였는데, 상기 아시네토박터 바우마니 균주의 표적 유전자로는 게놈 DNA에 포함된 basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3 등을 단독으로 또는 조합한 것이 될 수 있다.
For example, in the present invention, a strain of Asnithobacter baumanni was used as a multidrug-resistant strain. As the target gene of the strain of Asnithobacter baumannii, basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3, etc., alone or in combination.
본 발명에서 제공하는 자살벡터는 이의 다클론 부위에 삽입될 수 있는 상기 DNA 삽입단편을 서로 다른 목적에 부합되도록 설계하여, 다양한 형태의 다제내성 균주의 변이주를 제작하는데 사용될 수 있다.
The suicide vectors provided in the present invention can be used to prepare mutant strains of various types of multidrug-resistant strains by designing the DNA insert fragments that can be inserted into their polyclonal regions to be compatible with different purposes.
첫 번째 사용예로서, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 상기 DNA 삽입단편과 함께, 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주의 제작에 사용될 수 있다.
As a first use example, the suicide vector provided in the present invention can be used together with the DNA insert fragment to prepare a mutant strain in which a target gene or a target polynucleotide contained in the genomic DNA of a multidrug-resistant strain has been deleted.
이하에서는, 5'-영역 단편(A), 표적 유전자(X), 3'-영역 단편(B)을 포함하는 다제내성 균주의 게놈 DNA(이하, '-A-X-B-'로 표시함)와 5'-영역 단편(A), 3'-영역 단편(B), 마커영역 단편(nptI), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 재조합벡터(이하, '-A-B-nptI-sacB-'로 표시함)를 사용하여, 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주의 제조방법을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.Hereinafter, the genomic DNA (hereinafter, referred to as "-AXB-") of a multidrug-resistant strain containing the 5'-region fragment (A), the target gene (X) (Hereinafter referred to as '-AB-nptI-sacB-') comprising a region segment (A), a 3'-region segment (B), a marker region segment (nptI), and a sacB gene The method for producing the mutant strain of the multidrug-resistant strain provided by the present invention will be described in more detail.
상기 재조합벡터(-A-B-nptI-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 게놈 DNA(-A-X-B-)에 도입되어, 형질전환체(-A-B-nptI-sacB--A-X-B- 또는 -A-X-B-nptI-sacB--A-B-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하면, 상기 형질전환체에 포함된 sacB 유전자로부터 발현된 수크라제에 의해 수크로스를 분해시키고, 이로부터 생성되는 독성산물로 인하여 상기 재조합벡터가 삽입된 게놈 DNA 내에서 2차 단일교차 재조합이 유발될 수 있다. When the recombinant vector (-AB-nptI-sacB-) is introduced into a multidrug-resistant strain, it is introduced into the genomic DNA (-AXB-) through primary single cross-over recombination and transformed (-AB-nptI- AXB- or -AXB-nptI-sacB-AB-). Subsequently, when the transformant is inoculated into a culture medium containing an excessive amount of sucrose and cultured, the sucrose is degraded by sucrase expressed from the sacB gene contained in the transformant, and toxic products , A second single cross-over recombination can be induced in the genomic DNA into which the recombinant vector is inserted.
상기 형질전환체(-A-B-nptI-sacB--A-X-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-B-nptI-sacB--A)이 생성되고; 상기 형질전환체(-A-B-nptI-sacB--A-X-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 유전자가 결실된 게놈 DNA(-A-B-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--A-X-B)이 생성되며; 상기 형질전환체(-A-X-B-nptI-sacB--A-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 유전자가 결실된 게놈 DNA(-A-B-)와 DNA 단편(-X-B-nptI-sacB--A)이 생성되고; 상기 형질전환체(-A-X-B-nptI-sacB--A-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--A-B)이 생성된다.When a second single cross-over recombination is induced in the 5'-region fragment (A) of the transformant (-AB-nptI-sacB-AXB-), wild-type genome DNA (-AXB-) and DNA fragment nptI-sacB-A) is generated; When the second single cross-over recombination is induced in the 3'-region fragment (B) of the transformant (-AB-nptI-sacB-AXB-), genomic DNA (-AB-) (-nptI-sacB-AXB) is generated; When the second-order single cross-over recombination is induced in the 5'-region fragment (A) of the transformant (-AXB-nptI-sacB-AB-), genomic DNA (-AB-) (-XB-nptI-sacB-A) is generated; When a second single cross-over recombination is induced in the 3'-region fragment (B) of the transformant (-AXB-nptI-sacB-AB-), wild-type genome DNA (-AXB-) and DNA fragment (-nptI- sacB - AB) is generated.
상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 야생형 DNA를 갖는 야생형 균주 또는 표적 유전자가 결실된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 수득할 수 있다. 상기 야생형 균주에 비하여 변이주는 표적 유전자가 결실되어 게놈 DNA의 크기가 감소하므로, 상기 표적 유전자의 기능발현 여부 또는 전기영동을 이용한 게놈 DNA의 크기분석 등의 방법을 통해 변이주를 간단하게 구별할 수 있다.
Since the resulting DNA fragment is cleaved and removed by various nuclease in cells, a wild-type strain having a wild-type DNA or a mutant strain having genomic DNA in which a target gene has been deleted can be obtained as a result. Since the target gene is deleted and the size of the genomic DNA is reduced compared with the wild-type strain, the mutant strain can be easily distinguished by the function expression of the target gene or the size analysis of the genomic DNA using electrophoresis .
아울러, 상술한 바와 같이 동일한 마커영역 단편을 반복적으로 사용하여 다양한 변이주를 제조할 수 있다는 장점을 응용하여, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 다제내성 균주에 포함된 다중의 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주를 제조하는데 사용될 수 있는데, 이때 다중의 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드는 순차적으로 하나씩 결실되어 최종적으로는 모든 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주를 제조할 수 있다.The suicide vector of the present invention can be applied to a variety of mutant strains by repeatedly using the same marker region fragment as described above. Thus, the suicide vector of the present invention can be applied to a variety of target genes or target polynucleotides Wherein the multiple target genes or target polynucleotides can be sequentially deleted one by one to produce a mutant strain in which all target genes or target polynucleotides have been deleted.
예를 들아, 유전자 M, N, O, P 및 Q 가 순차적으로 포함된 게놈 DNA(-M-N-O-P-Q-)를 포함하는 다제내성 균주 균주에, 유전자 N을 결실시키기 위한 재조합벡터(-M-O-nptI-sacB-)를 가하고 수크로스배지에서 배양하여 유전자 N이 결실된 게놈 DNA(-M-O-P-Q-)를 포함하는 1차 변이주를 제작하고; 상기 1차 변이주에 유전자 O를 결실시키기 위한 재조합벡터(-M-P-nptI-sacB-)를 가하고 수크로스배지에서 배양하여 유전자 O가 결실된 게놈 DNA(-M-P-Q-)를 포함하는 2차 변이주를 제작하며; 상기 2차 변이주에 유전자 P를 결실시키기 위한 재조합벡터(-M-Q-nptI-sacB-)를 가하고 수크로스배지에서 배양하여 유전자 P가 결실된 게놈 DNA(-M-Q-)를 포함하는 3차 변이주를 제작할 수 있다. 이때, 동일한 항생제 저항성 마커유전자(nptI)를 반복적으로 사용할 수 있다.
For example, in a multidrug-resistant strain containing genomic DNA (-MNOPQ-) in which genes M, N, O, P and Q are sequentially included, a recombinant vector (-MO-nptI-sacB -) was added and cultured in a sucrose medium to prepare a first mutant strain containing genomic DNA (-MOPQ-) in which gene N was deleted; A recombinant vector (-MP-nptI-sacB-) for deletion of the gene O was added to the first mutant and cultured in a sucrose medium to prepare a second mutant strain containing the genomic DNA (-MPQ-) in which the gene O was deleted ; A recombinant vector (-MQ-nptI-sacB-) for deletion of the gene P is added to the second mutant and cultured in a sucrose medium to prepare a third mutant strain containing the genomic DNA (-MQ-) in which the gene P has been deleted . At this time, the same antibiotic resistance marker gene (nptI) can be repeatedly used.
두 번째 사용예로서, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 상기 DNA 삽입단편과 함께, 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자 전체가 아닌 일부가 결실된 변이주의 제작에 사용될 수 있다.
As a second use example, the suicide vector provided in the present invention can be used together with the DNA insertion fragment to prepare a mutant strain in which a part of the target gene contained in the genomic DNA of the multidrug-resistant strain is deleted.
이하에서는, 하나의 유전자 내에 포함된 5'-영역 단편(a), 표적 폴리뉴클레오티드(x), 3'-영역 단편(b)을 포함하는 표적 유전자를 포함하는 다제내성 균주의 게놈 DNA(이하, '-axb-'로 표시함)와 5'-영역 단편(a), 3'-영역 단편(b), 마커영역 단편(nptI), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 재조합벡터(이하, '-ab-nptI-sacB-'로 표시함)를 사용하여, 다제내성 균주의 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주의 제조방법을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, a genomic DNA of a multidrug-resistant strain comprising a target gene containing a 5'-region fragment (a), a target polynucleotide (x) and a 3'-region fragment (b) a recombinant vector derived from a suicide vector (referred to as '-axb-') and a 5'-region fragment (a), a 3'-region fragment (b), a marker region fragment (nptI), a sacB gene (Hereinafter referred to as "-ab-nptI-sacB-") is used to specifically describe a method for producing a mutant strain in which a target polynucleotide of a multidrug-resistant strain has been deleted.
상기 재조합벡터(-ab-nptI-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 게놈 DNA(-axb-)에 도입되어, 형질전환체(-ab-nptI-sacB--axb- 또는 -axb-nptI-sacB--ab-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하면, 상기 형질전환체에 포함된 sacB 유전자로부터 발현된 수크라제에 의해 수크로스를 분해시키고, 이로부터 생성되는 독성산물로 인하여 상기 재조합벡터가 삽입된 게놈 DNA 내에서 2차 단일교차 재조합이 유발될 수 있다. When the recombinant vector (-ab-nptI-sacB-) is introduced into a multidrug-resistant strain, it is introduced into the genomic DNA (-axb-) through primary single cross-over recombination and transformants (-ab-nptI- axb- or -axb-nptI-sacB-ab-). Subsequently, when the transformant is inoculated into a culture medium containing an excessive amount of sucrose and cultured, the sucrose is degraded by sucrase expressed from the sacB gene contained in the transformant, and toxic products , A second single cross-over recombination can be induced in the genomic DNA into which the recombinant vector is inserted.
상기 형질전환체(-ab-nptI-sacB--axb-)의 5'-영역 단편(a)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-axb-)와 DNA 단편(b-nptI-sacB--a)이 생성되고; 상기 형질전환체(-ab-nptI-sacB--axb-)의 3'-영역 단편(b)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 게놈 DNA(-ab-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--axb)이 생성되며; 상기 형질전환체(-axb-nptI-sacB--ab-)의 5'-영역 단편(a)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 게놈 DNA(-ab-)와 DNA 단편(xb-nptI-sacB--a)이 생성되고; 상기 형질전환체(-axb-nptI-sacB--ab-)의 3'-영역 단편(b)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-axb-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--ab)이 생성된다.When a second single cross-over recombination is induced in the 5'-region fragment (a) of the transformant (-ab-nptI-sacB-axb-), wild-type genomic DNA (-axb-) and DNA fragment -sacB-a) is generated; When a second single cross-over recombination is induced in the 3'-region fragment (b) of the transformant (-ab-nptI-sacB-axb-), genomic DNA (-ab-) with the target polynucleotide deleted and DNA A fragment (-nptI-sacB-axb) is generated; When a second single cross-over recombination is induced in the 5'-region fragment (a) of the transformant (-axb-nptI-sacB-ab-), genomic DNA (-ab-) A fragment (xb-nptI-sacB-a) is generated; When a second single cross-over recombination is induced in the 3'-region fragment (b) of the transformant (-axb-nptI-sacB-ab-), wild-type genome DNA (-axb-) and DNA fragment (-nptI- sacB - ab) is generated.
상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 야생형 DNA를 갖는 야생형 균주 또는 표적 유전자가 결실된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 수득할 수 있다. 상기 야생형 균주에 비하여 변이주는 표적 폴리뉴클레오티드가 제거되어 표적 유전자의 기능이 억제되거나 또는 게놈 DNA의 크기가 감소하므로, 상기 표적 유전자 기능발현 여부 또는 전기영동을 통한 게놈 DNA의 크기분석 등의 방법을 통해 변이주를 간단하게 구별할 수 있다.
Since the resulting DNA fragment is cleaved and removed by various nuclease in cells, a wild-type strain having a wild-type DNA or a mutant strain having genomic DNA in which a target gene has been deleted can be obtained as a result. Since the target polynucleotide is deleted and the function of the target gene is inhibited or the size of the genomic DNA is reduced compared to the wild-type strain, the mutant strain can be expressed by the expression of the target gene function or the size analysis of the genome DNA through electrophoresis Mutants can be easily distinguished.
세 번째 사용예로서, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 상기 DNA 삽입단편과 함께, 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자가 치환된 변이주의 제작에 사용될 수 있다.
As a third use example, the suicide vector provided in the present invention can be used together with the DNA insert fragment to prepare a mutant strain in which the target gene contained in the genomic DNA of the multidrug-resistant strain is substituted.
이하에서는, 5'-영역 단편(A), 표적 유전자(X), 3'-영역 단편(B)을 포함하는 다제내성 균주의 게놈 DNA(이하, '-A-X-B-'로 표시함)와 5'-영역 단편(A), 치환 유전자(E), 3'-영역 단편(B), 마커영역 단편(nptI), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 재조합벡터(이하, '-A-E-B-nptI-sacB-'로 표시함)를 사용하여, 다제내성 균주의 표적 유전자가 치환된 변이주의 제조방법을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the genomic DNA (hereinafter, referred to as "-AXB-") of a multidrug-resistant strain containing the 5'-region fragment (A), the target gene (X) Derived recombinant vector (hereinafter referred to as '-AEB-1') comprising a region fragment (A), a substitution gene (E), a 3'-region fragment (B), a marker region fragment (nptI), a sacB gene quot; nptI-sacB- "), a method for producing a mutant strain in which a target gene of a multidrug-resistant strain is substituted will be described in detail.
상기 재조합벡터(-A-E-B-nptI-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 게놈 DNA(-A-X-B-)에 도입되어, 형질전환체(-A-E-B-nptI-sacB--A-X-B- 또는 -A-X-B-nptI-sacB--A-E-B-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하면, 상기 형질전환체에 포함된 sacB 유전자로부터 발현된 수크라제에 의해 수크로스를 분해시키고, 이로부터 생성되는 독성산물로 인하여 상기 재조합벡터가 삽입된 게놈 DNA 내에서 2차 단일교차 재조합이 유발될 수 있다. When the recombinant vector (-AEB-nptI-sacB-) is introduced into a multidrug-resistant strain, it is introduced into the genomic DNA (-AXB-) through primary single cross-over recombination and transformed (-AEB-nptI- AXB- or -AXB-nptI-sacB-AEB-). Subsequently, when the transformant is inoculated into a culture medium containing an excessive amount of sucrose and cultured, the sucrose is degraded by sucrase expressed from the sacB gene contained in the transformant, and toxic products , A second single cross-over recombination can be induced in the genomic DNA into which the recombinant vector is inserted.
상기 형질전환체(-A-E-B-nptI-sacB--A-X-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-E-B-nptI-sacB--A)이 생성되고; 상기 형질전환체(-A-E-B-nptI-sacB--A-X-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 유전자가 치환된 게놈 DNA(-A-E-B-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--A-X-B)이 생성되며; 상기 형질전환체(-A-X-B-nptI-sacB--A-E-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 유전자가 치환된 게놈 DNA(-A-E-B-)와 DNA 단편(-X-B-nptI-sacB--A)이 생성되고; 상기 형질전환체(-A-X-B-nptI-sacB--A-E-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--A-E-B)이 생성된다.When a second single cross-over recombination is induced in the 5'-region fragment (A) of the transformant (-AEB-nptI-sacB-AXB-), wild-type genome DNA (-AXB-) and DNA fragment (-EB- nptI-sacB-A) is generated; When a second single cross-over recombination is induced in the 3'-region fragment (B) of the transformant (-AEB-nptI-sacB-AXB-), genomic DNA (-AEB-) (-nptI-sacB-AXB) is generated; When a second-order single cross-over recombination is induced in the 5'-region fragment (A) of the transformant (-AXB-nptI-sacB-AEB-), genomic DNA (-AEB-) (-XB-nptI-sacB-A) is generated; When a second-order single cross-over recombination is induced in the 3'-region fragment (B) of the transformant (-AXB-nptI-sacB-AEB-), wild-type genome DNA (-AXB-) and DNA fragment (-nptI- sacB - AEB) is generated.
상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 야생형 DNA를 갖는 야생형 균주 또는 표적 유전자가 치환된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 수득할 수 있다. 상기 야생형 균주에 비하여 변이주는 표적 유전자가 치환되므로, 상기 표적 유전자 또는 치환 유전자의 기능발현 여부 등의 방법을 통해 변이주를 간단하게 구별할 수 있다.
The resulting DNA fragment is decomposed and removed by various nuclease agents in the cell. As a result, a wild-type strain having a wild-type DNA or a mutant strain having a genomic DNA in which a target gene has been substituted can be obtained. Since the target gene is substituted for the mutant in comparison with the wild-type strain, the mutant can be easily distinguished through a method such as the expression of the function of the target gene or the substitution gene.
네 번째 사용예로서, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 상기 DNA 삽입단편과 함께, 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자의 일부 폴리뉴클레오티드(표적 폴리뉴클레오티드)가 치환된 변이주의 제작에 사용될 수 있다.
As a fourth use example, the suicide vector provided in the present invention can be used together with the DNA insertion fragment to prepare a mutant strain in which some polynucleotides (target polynucleotide) of the target gene contained in the genomic DNA of the multidrug-resistant strain are substituted have.
이하에서는, 하나의 유전자 내에 포함된 5'-영역 단편(a), 표적 폴리뉴클레오티드(x), 3'-영역 단편(b)을 포함하는 표적 유전자를 포함하는 다제내성 균주의 게놈 DNA(이하, '-axb-'로 표시함)와 5'-영역 단편(a), 치환 폴리뉴클레오티드(e), 3'-영역 단편(b), 마커영역 단편(nptI), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 재조합벡터(이하, '-aeb-nptI-sacB-'로 표시함)를 사용하여, 다제내성 균주의 표적 폴리뉴클레오티드가 치환된 변이주의 제조방법을 이하에서 구체적으로 설명한다.Hereinafter, a genomic DNA of a multidrug-resistant strain comprising a target gene containing a 5'-region fragment (a), a target polynucleotide (x) and a 3'-region fragment (b) (a), a substituted polynucleotide (e), a 3'-region fragment (b), a marker region fragment (nptI), and a sacB gene (sacB) Hereinafter, a method for producing a mutant strain in which a target polynucleotide of a multidrug-resistant strain is substituted using a suicide vector-derived recombinant vector (hereinafter referred to as '-aeb-nptI-sacB-') will be described in detail.
상기 재조합벡터(-aeb-nptI-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 게놈 DNA(-axb-)에 도입되어, 형질전환체(-aeb-nptI-sacB--axb- 또는 -axb-nptI-sacB--aeb-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하면, 상기 형질전환체에 포함된 sacB 유전자로부터 발현된 수크라제에 의해 수크로스를 분해시키고, 이로부터 생성되는 독성산물로 인하여 상기 재조합벡터가 삽입된 게놈 DNA 내에서 2차 단일교차 재조합이 유발될 수 있다. When the recombinant vector (-aeb-nptI-sacB-) is introduced into a multidrug-resistant strain, it is introduced into the genomic DNA (-axb-) through primary single cross-over recombination to produce a transformant (-aeb-nptI- axb- or -axb-nptI-sacB-aeb-). Subsequently, when the transformant is inoculated into a culture medium containing an excessive amount of sucrose and cultured, the sucrose is degraded by sucrase expressed from the sacB gene contained in the transformant, and toxic products , A second single cross-over recombination can be induced in the genomic DNA into which the recombinant vector is inserted.
상기 형질전환체(-aeb-nptI-sacB--axb-)의 5'-영역 단편(a)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-axb-)와 DNA 단편(eb-nptI-sacB--a)이 생성되고; 상기 형질전환체(-aeb-nptI-sacB--axb-)의 3'-영역 단편(b)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 폴리뉴클레오티드가 치환된 게놈 DNA(-aeb-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--axb)이 생성되며; 상기 형질전환체(-axb-B-nptI-sacB--aeb-)의 5'-영역 단편(a)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 폴리뉴클레오티드가 치환된 게놈 DNA(-aeb-)와 DNA 단편(xb-nptI-sacB--a)이 생성되고; 상기 형질전환체(-axb-nptI-sacB--aeb-)의 3'-영역 단편(b)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-axb-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--aeb)이 생성된다.When a second single cross-over recombination is induced in the 5'-region fragment (a) of the transformant (-aeb-nptI-sacB-axb-), wild-type genomic DNA (-axb-) and DNA fragment (eb- -sacB-a) is generated; When a second single cross-over recombination is induced in the 3'-region fragment (b) of the transformant (-aeb-nptI-sacB-axb-), the genomic DNA (-aeb-) substituted with the target polynucleotide and DNA A fragment (-nptI-sacB-axb) is generated; When a second single cross-over recombination is induced in the 5'-region fragment (a) of the transformant (-axb-B-nptI-sacB-aeb-), the target polynucleotide is substituted with genomic DNA (-aeb-) And a DNA fragment (xb-nptI-sacB-a) are generated; When a second single cross-over recombination is induced in the 3'-region fragment (b) of the transformant (-axb-nptI-sacB-aeb-), wild-type genome DNA (-axb-) and DNA fragment (-nptI- sacB - aeb) is generated.
상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 야생형 DNA를 갖는 야생형 균주 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 치환된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 수득할 수 있다. 상기 야생형 균주에 비하여 변이주는 표적 유전자의 일부가 치환되었으므로, 상기 표적 유전자의 기능발현 여부 등의 방법을 통해 변이주를 간단하게 구별할 수 있다.
The resulting DNA fragment is decomposed and removed by various nuclease in the cell. As a result, a wild-type strain having a wild-type DNA or a mutant strain having a genomic DNA in which a target polynucleotide has been substituted can be obtained. Since a part of the target gene is substituted for the mutant in comparison with the wild-type strain, the mutant strain can be easily distinguished through a method such as the function expression of the target gene.
다섯 번째 사용예로서, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 상기 DNA 삽입단편과 함께, 다제내성 균주에 포함된 서로 다른 두 개의 표적 유전자가 동시에 결실된 변이주의 제작에 사용될 수 있다.
As a fifth use example, the suicide vector provided in the present invention can be used together with the DNA insertion fragment to produce a mutant strain in which two different target genes contained in the multidrug-resistant strain are simultaneously deleted.
이하에서는, 5'-영역 단편(A), 제1 표적 유전자(X), 중간 단편(B), 제2 표적 유전자(Y) 및 3'-영역 단편(C)을 포함하는 다제내성 균주의 게놈 DNA(이하, '-A-X-B-Y-C-'로 표시함); 5'-영역 단편(A), 중간 단편(B), 제1 마커영역 단편(nptI), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 제1 재조합벡터(이하, '-A-B-nptI-sacB-'로 표시함); 및 중간 단편(B), 3'-영역 단편(C), 제2 마커영역 단편(tetR), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 제2 재조합벡터(이하, '-B-C-tetR-sacB-'로 표시함)를 사용하여, 다제내성 균주의 서로 다른 두 개의 표적 유전자가 동시에 결실된 변이주의 제조방법을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the genome of a multidrug-resistant strain comprising the 5'-region fragment (A), the first target gene (X), the intermediate fragment (B), the second target gene (Y) and the 3'- DNA (hereinafter referred to as "-AXBYC-"); A first recombinant vector derived from a suicide vector (hereinafter referred to as '-AB-nptI-sacB') containing a 5'-region fragment (A), an intermediate fragment (B), a first marker region fragment (nptI) - '); And a second recombinant vector derived from a suicide vector (hereinafter referred to as '-BC-tetR-R') including a middle fragment (B), a 3'-region fragment (C), a second marker region fragment (tetR) sacB- '), a method for producing a mutant strain in which two different target genes of a multidrug-resistant strain are simultaneously deleted is described in detail.
일례로서, 상기 제1 재조합벡터(-A-B-nptI-sacB-)와 제2 재조합벡터(-B-C-tetR-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 제1 재조합벡터가 게놈 DNA(-A-X-B-Y-C-)의 5'-영역 단편(A)에 도입되어, 1차 형질전환체(-A-B-nptI-sacB--A-X-B-Y-C-)를 제작할 수 있고, 2차 단일교차 재조합을 통해 제2 재조합벡터가 상기 1차 형질전환체의 첫 번째 중간 단편(B)에 도입되어, 2차 형질전환체(-A-B-C-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A-X-B-Y-C-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 2차 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하여, 상기 2차 형질전환체의 3'-영역 단편(C)에서 3차 단일교차 재조합이 유발되면, 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA(-A-B-C-)와 DNA 단편(-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A-X-B-Y-C)이 생성되는데, 상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 제조할 수 있다. As an example, when the first recombinant vector (-AB-nptI-sacB-) and the second recombinant vector (-BC-tetR-sacB-) are introduced into the multidrug-resistant strain, the first recombinant vector Can be introduced into the 5'-region fragment (A) of the genomic DNA (-AXBYC-) to produce a first transformant (-AB-nptI-sacB-AXBYC-), followed by a second single cross- A second recombinant vector is introduced into the first intermediate fragment (B) of the first transformant to prepare a second transformant (-ABC-tetR-sacB-B-nptI-sacB-AXBYC-) have. Subsequently, the secondary transformant is inoculated into a culture medium containing an excessive amount of sucrose and cultured to cause a tertiary single-crossed recombination in the 3'-region fragment (C) of the secondary transformant, Genomic DNA (-ABC-) in which the target gene (X) and the second target gene (Y) are deleted and a DNA fragment (-tetR-sacB-B-nptI-sacB-AXBYC) The fragment is cleaved and removed by various nuclease in the cell. As a result, a mutant strain having the genomic DNA in which the first target gene (X) and the second target gene (Y) are deleted can be produced.
다른 일례로서, 상기 제1 재조합벡터(-A-B-nptI-sacB-)와 제2 재조합벡터(-B-C-tetR-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 제2 재조합벡터가 게놈 DNA(-A-X-B-Y-C-)의 3'-영역 단편(C)에 도입되어, 1차 형질전환체(-A-X-B-Y-C-tetR-sacB--B-C-)를 제작할 수 있고, 2차 단일교차 재조합을 통해 제1 재조합벡터가 상기 1차 형질전환체의 두 번째 중간 단편(B)에 도입되어, 2차 형질전환체(-A-X-B-Y-C-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A-B-C-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 2차 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하여, 상기 2차 형질전환체의 5'-영역 단편(A)에서 3차 단일교차 재조합이 유발되면, 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA(-A-B-C-)와 DNA 단편(-X-B-Y-C-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A)이 생성되는데, 상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 제조할 수 있다. As another example, when the first recombinant vector (-AB-nptI-sacB-) and the second recombinant vector (-BC-tetR-sacB-) are introduced into the multidrug-resistant strain, the second recombinant Vector can be introduced into the 3'-region fragment (C) of genomic DNA (-AXBYC-) to produce a first transformant (-AXBYC-tetR-sacB-BC-), and a second single cross- , A first recombinant vector is introduced into the second intermediate fragment (B) of the first transformant to prepare a second transformant (-AXBYC-tetR-sacB-B-nptI-sacB-ABC-) . Subsequently, the secondary transformant is inoculated into a culture medium containing an excess amount of sucrose and cultured to cause a tertiary single cross-over recombination in the 5'-region fragment (A) of the secondary transformant, Genomic DNA (-ABC-) in which the target gene (X) and the second target gene (Y) are deleted and a DNA fragment (-XBYC-tetR-sacB-B-nptI-sacB-A) DNA fragments are cleaved and removed by various nuclease in the cells. As a result, a mutant strain having the genomic DNA in which the first target gene (X) and the second target gene (Y) are deleted can be produced.
또 다른 일례로서, 상기 제1 재조합벡터(-A-B-nptI-sacB-)와 제2 재조합벡터(-B-C-tetR-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 상기 제1 재조합벡터의 중간 단편(B) 부위에 제2 재조합벡터가 도입되어, 제3 재조합벡터(-A-B-C-tetR-sacB--B-nptI-sacB-)를 제작할 수 있고, 2차 단일교차 재조합을 통해 제3 재조합벡터가 게놈 DNA(-A-X-B-Y-C-)의 5'-영역 단편(A)에 도입되어, 2차 형질전환체(-A-B-C-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A-X-B-Y-C-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 2차 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하여, 상기 2차 형질전환체의 3'-영역 단편(C)에서 3차 단일교차 재조합이 유발되면, 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA(-A-B-C-)와 DNA 단편(-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A-X-B-Y-C)이 생성되는데, 상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 제조할 수 있다. As another example, when the first recombinant vector (-AB-nptI-sacB-) and the second recombinant vector (-BC-tetR-sacB-) are introduced into a multidrug-resistant strain, A second recombinant vector can be introduced into the intermediate fragment (B) of the first recombinant vector to produce a third recombinant vector (-ABC-tetR-sacB-B-nptI-sacB-) (-ABC-tetR-sacB-B-nptI-sacB-AXBYC-) was introduced into the 5'-region fragment (A) of genomic DNA (-AXBYC-) through the third recombinant vector . Subsequently, the secondary transformant is inoculated into a culture medium containing an excessive amount of sucrose and cultured to cause a tertiary single-crossed recombination in the 3'-region fragment (C) of the secondary transformant, Genomic DNA (-ABC-) in which the target gene (X) and the second target gene (Y) are deleted and a DNA fragment (-tetR-sacB-B-nptI-sacB-AXBYC) The fragment is cleaved and removed by various nuclease in the cell. As a result, a mutant strain having the genomic DNA in which the first target gene (X) and the second target gene (Y) are deleted can be produced.
상기 각 방법에 의하여 제조된 변이주는 야생형 균주에 비하여 두 개의 표적 유전자가 결실되므로, 상기 각 표적 유전자의 기능발현 여부 또는 전기영동을 통한 게놈 DNA의 크기분석 등의 방법을 통해 변이주를 간단하게 구별할 수 있다.
Since the mutant strains prepared by each of the above methods are deficient in two target genes as compared to the wild type strains, mutants can be easily distinguished through the expression of function of each of the target genes or the size analysis of genomic DNA through electrophoresis .
본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주의 일종인 아세토박터 바우마니 균주(A. baumannii)에서 복제되지 않는 자살벡터인 pHKD01 벡터를 제작하고(도 1a 및 1b), 상기 제작된 pHKD01 벡터를 이용하여 다양한 표적 유전자(basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD 또는 rhbC3)를 결실시킬 수 있는 다양한 상동재조합 벡터(pHKD02 내지 pHK13)를 제작하였다(도 3의 A).
According to one embodiment of the present invention, a pHKD01 vector, which is a non-replicating suicide vector in A. baumannii , a kind of multidrug-resistant strain, is prepared (FIGS. 1A and 1B) (PHKD02 to pHK13) capable of deleting various target genes (basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD or rhbC3) A).
본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터를 포함하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트를 제공한다.
As another embodiment for achieving the object of the present invention, the present invention provides a kit for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain comprising a suicide vector for producing a mutant strain of the multidrug-resistant strain.
본 발명의 키트는 다제내성 균주의 게놈 DNA에 DNA 삽입단편을 도입하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 자살벡터 뿐만 아니라, 다제내성 균주의 변이주 제작에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. The kit of the present invention can be used for introducing a DNA insert into a genomic DNA of a multidrug-resistant strain, but is not limited to the suicide vector, but may include one or more other components suitable for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain Compositions, solutions, or devices.
구체적인 일례로서, 상기 DNA 삽입단편이 다제내성 균주에 도입되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 상기 DNA 삽입단편의 마커영역 단편으로 사용될 수 있는, 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제에 대한 저항성을 가지는 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자가 포함될 수 있다. 그 외에도, 상기 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머, DNA 삽입단편을 평활말단으로 절단하기 위한 제한효소(PstI, FspI, NotI, BglII 등), 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 단독으로 또는 필요에 따라 조합하여 포함할 수 있다.
As a specific example, in order to confirm whether the DNA-inserted fragment has been introduced into a multidrug-resistant strain, a multidrug-resistant strain, which can be used as a marker region fragment of the DNA-inserted fragment, has antibiotic resistance A gene encoding a marker protein may be included. (PstI, FspI, NotI, BglII, etc.), a test tube or other appropriate container, a reaction buffer (for example, a primer for amplifying a gene encoding the antibiotic marker protein, enzymes such as deoxynucleotides (dNTPs), Taq polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, etc., And may be combined and included.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 자살벡터를 이용하여, 다제내성 균주의 변이주를 제작하는 방법을 제공한다.
As another embodiment for achieving the object of the present invention, the present invention provides a method for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain using the suicide vector.
구체적으로, 본 발명의 다제내성 균주의 변이주의 제작방법은, (a) R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자 및 다클론부위를 순차적으로 포함하는 자살벡터의 다클론부위에 DNA 삽입단편이 도입된 재조합벡터를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 재조합벡터를 다제내성 균주에 도입하여, 형질전환체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체를 수크로스를 포함하는 배지에서 배양하여 표적 유전자가 결실된 변이주를 선발하는 단계를 포함한다.
Specifically, the method for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain of the present invention comprises the steps of (a) introducing a DNA insert fragment (a) into a polyclonal region of a suicide vector sequentially containing R6K ori, mob RP4 gene, cat gene, sacB gene, Obtaining the introduced recombinant vector; (b) introducing the obtained recombinant vector into a multidrug-resistant strain to obtain a transformant; And (c) culturing the transformant in a medium containing sucrose to select a mutant strain in which the target gene has been deleted.
상술한 바와 같이, 본 발명의 자살벡터를 사용할 경우, 동일한 마커영역 단편을 반복적으로 사용하여 연속적으로 다양한 변이주를 제조할 수 있으므로, 상기 변이주의 제작방법은 표적 유전자를 달리하여 전체 과정을 반복수행함으로써, 다제내성 균주에 포함된 다양한 유전자 중에서 하나 이상의 유전자가 순차적으로 결실된 연속적인 변이주를 제조할 수 있다. As described above, when the suicide vector of the present invention is used, various mutant strains can be continuously produced by repeatedly using the same marker region fragment. Therefore, the mutant strains can be produced by repeating the entire process with different target genes , A continuous mutant strain in which one or more genes among the various genes contained in the multidrug-resistant strain are sequentially deleted can be produced.
즉, 다제내성 균주로부터 하나의 표적유전자가 결실된 변이주의 게놈 DNA에 존재하는 다른 표적유전자를 추가로 결실시키기 위하여, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 반복수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 방법에 비하여, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 반복수행하는 단계를 포함하는 방법을 비교하면, 사용되는 다제내성 균주가 하나의 표적유전자가 결실된 다제내성 균주의 변이주라는 점과 사용되는 DNA 삽입단편이 다른 표적유전자를 결실시키기 위하여 제작된 점이라는 부분에서만 차이가 있다.That is, the step (a) to (c) may be repeated to further delete other target genes present in the genomic DNA of the mutant strain in which one target gene has been deleted from the multidrug-resistant strain have. Comparing the method comprising repeating the steps (a) to (c) compared to the method comprising the steps (a) to (c), the multi- Is a mutation of a multidrug-resistant strain that has been deleted and that the DNA insert used is designed to delete another target gene.
즉, 상기 다른 표적 유전자는 목적하는 야생형 또는 변이된 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 추가로 결실시키고자 하는 대상이 되므로, 상기 DNA 삽입단편은 다른 표적유전자의 염기서열을 분석하여, 상기 다른 표적유전자에 부합되도록 5'-영역 단편과 3'-영역 단편을 설계하고, 이들과 함께 마커영역 단편을 포함하도록 합성된 형태의 DNA 단편이 될 수 있다. 또한, 상기 DNA 삽입단편에 포함된 마커영역 단편은 이전에 사용된 마커영역 단편과 동일한 것이 될 수도 있고, 다른 것이 될 수도 있다.That is, since the other target gene is an object to be further deleted from the genomic DNA of the desired wild-type or mutated multidrug-resistant strain, the DNA insert fragment can be obtained by analyzing the base sequence of another target gene, The 5 '-region fragment and the 3'-region fragment may be designed so as to be compatible with each other, and may be a DNA fragment synthesized to include a marker region fragment together therewith. In addition, the marker region fragment included in the DNA insert may be the same as or different from the previously used marker region fragment.
예를 들어, 본 발명에서는 다제내성 균주로서 아시네토박터 바우마니 균주를 사용하였으며, 상기 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에 포함된 basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3 등의 유전자 중에서, basD 유전자를 대상으로 상기 다제내성 균주의 변이주의 제작방법을 적용하여, basD 유전자가 결실된 1차 변이주를 제작하고; 상기 1차 변이주의 게놈 DNA에 포함된 bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3 등의 유전자 중에서, bauA 유전자를 대상으로 상기 다제내성 균주의 변이주의 제작방법을 적용하여, basD 및 bauA 유전자가 결실된 2차 변이주를 제작하며; 상기 2차 변이주의 게놈 DNA에 포함된 rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3 등의 유전자 중에서, rimL 유전자를 대상으로 상기 다제내성 균주의 변이주의 제작방법을 적용하여, basD, bauA 및 rimL 유전자가 결실된 3차 변이주를 제작하고; 상기 3차 변이주의 게놈 DNA에 포함된 piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3 등의 유전자 중에서, piuB 유전자를 대상으로 상기 다제내성 균주의 변이주의 제작방법을 적용하여, basD, bauA, rimL 및 piuB 유전자가 결실된 4차 변이주를 제작하는 방식으로, 아시네토박터 바우마니 변이주를 연속적으로 제조할 수 있다.
For example, in the present invention, strains of Asnithobacter baumanni were used as multidrug-resistant strains, and the strains of basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, a first mutant strain in which the basD gene has been deleted is prepared by applying the method for producing the mutant strains of the multidrug-resistant strain to the basD gene among genes such as rhbC2, araJ, iucD, and rhbC3; Among the genes such as bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD and rhbC3 contained in the genomic DNA of the first mutant, the bauA gene was used to prepare mutant strains of the above- To produce a second mutant in which the basD and bauA genes have been deleted; Among the genes such as rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD and rhbC3 contained in the genomic DNA of the secondary mutant, the method of producing the mutant strains of the multidrug-resistant strain is applied to the rimL gene To produce a third mutant in which the basD, bauA and rimL genes were deleted; Among the genes such as piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD and rhbC3 contained in the genomic DNA of the third mutant strain, piuB gene was applied to the mutant strains of the above- the fourth strain of mutant strain in which the basD, bauA, rimL and piuB genes have been deleted can be produced in succession to produce the Ashinotobacter baumanni mutant.
이하에서는, 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주의 제작방법을 각 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명한다.
Hereinafter, the method for producing the mutant strain of the multidrug-resistant strain provided by the present invention will be described in more detail by dividing each step.
첫 째, 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주의 제작방법에 있어서, (a) 단계는 다제내성 균주에서 복제되지 않는 자살벡터에 상기 DNA 삽입단편이 도입된 재조합벡터를 수득하는 단계이다.First, in the method for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain provided by the present invention, step (a) is a step of obtaining a recombinant vector into which the DNA-inserted fragment is introduced into a suicide vector not replicated in a multidrug-resistant strain.
상기 (a) 단계는 다제내성 균주의 게놈 DNA에 존재하는 표적 유전자를 변이시킬 수 있는 재조합벡터를 제작하는 단계로서, 상기 자살벡터는 상술한 바와 같이, 다제내성 균주에서 복제되지 않도록 R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자 및 다클론부위를 순차적으로 포함하고, 상기 DNA 삽입단편은 상술한 바와 같이, 5'-영역 단편, 3'-영역 단편 및 마커영역 단편을 순차적으로 포함한다. 이때, 상기 5'-영역 단편과 3'-영역 단편은 각각 상기 표적 유전자의 상류 및 하류에 인접한 염기서열이므로, 상기 5'-영역 단편과 3'-영역 단편은 표적 유전자의 염기서열에 의하여 결정되고, 상기 마커영역 단편은 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제에 대한 저항성을 가지는 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자가 될 수 있다.The step (a) comprises the step of preparing a recombinant vector capable of mutating a target gene present in the genomic DNA of the multidrug-resistant strain, wherein the suicide vector is selected from the group consisting of R6K ori, mob The RP4 gene, the cat gene, the sacB gene, and the polyclonal region, and the DNA insertion fragment sequentially includes a 5'-region fragment, a 3'-region fragment, and a marker region fragment, as described above. Since the 5'-region fragment and the 3'-region fragment are respectively adjacent to the upstream and downstream of the target gene, the 5'-region fragment and the 3'-region fragment are determined by the nucleotide sequence of the target gene Wherein the marker region fragment can be a gene encoding an antibiotic marker protein having resistance to an antibiotic that does not exhibit resistance by the multidrug-resistant strain.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주로서 아세토박터 바우마니 균주를 사용하고, 이에 적합하도록 5'-영역 단편(A), 3'-영역 단편(B) 및 마커영역 단편(nptI)을 포함하는 DNA 삽입단편(-A-B-nptI-)을 자살벡터(-R6K-mobRP4-cat-sacB-MCS-)의 다클론부위(multi-cloning site, MCS)에 도입하여 재조합벡터(-R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-nptI-)를 제작하였다.
According to one embodiment of the present invention, an Acetobacter baumanni strain is used as a multidrug resistant strain, and a 5'-region fragment (A), a 3'-region fragment (B) and a marker region fragment (nptI) (-AB-nptI-) was introduced into a multi-cloning site (MCS) of suicide vector (-R6K-mobRP4-cat-sacB-MCS-) to obtain a recombinant vector (-R6K-mobRP4 -cat-sacB-AB-nptI-).
둘 째, 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주의 제작방법에 있어서, (b) 단계는 상기 수득한 재조합벡터를 다제내성 균주에 도입하여, 형질전환체를 수득하는 단계이다.Second, in the method for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain provided by the present invention, step (b) is a step of introducing the obtained recombinant vector into a multidrug-resistant strain to obtain a transformant.
상기 (b) 단계는 재조합벡터가 도입된 형질전환체를 수득하는 단계로서, 상기 표적 유전자를 게놈 DNA에 포함하는 다제내성 균주에 상기 수득한 재조합벡터를 도입하면, 표적 유전자의 상류부위(5'-영역 단편) 또는 하류부위(3'-영역 단편)에서 단일교차 재조합이 유발되어 상기 재조합벡터가 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자의 상류 또는 하류에 도입되어, 결과적으로는 재조합벡터를 포함하는 형질전환체를 수득할 수 있다. 아울러, 상기 수득한 형질전환체는 재조합벡터에 포함된 마커영역 단편에서 발현되는 단백질에 의하여 저항성을 나타내는 항생제를 포함하는 배지에서 배양함으로써, 선별할 수 있다.The step (b) is a step of obtaining a transformant into which a recombinant vector is introduced. When the recombinant vector obtained is introduced into a multidrug-resistant strain containing the target gene in the genomic DNA, -Region fragment) or a downstream site (3'-region fragment), so that the recombinant vector is introduced upstream or downstream of the target gene contained in the genomic DNA of the multidrug-resistant strain, resulting in a recombinant vector To obtain a transformant. In addition, the transformant can be selected by culturing in a medium containing an antibiotic exhibiting resistance by a protein expressed in a fragment of a marker region contained in the recombinant vector.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주로서 아세토박터 바우마니 균주를 사용하고, 이에 적합하도록, 표적 유전자(X), 이의 상류부위(5'-영역 단편, A) 및 하류부위(3'-영역 단편, B)를 포함하는 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA(-A-X-B-)에 재조합벡터(-R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-nptI-)가 도입되면, 상기 표적 유전자의 상류부위에서 단일교차 재조합이 수행되어 변이된 게놈 DNA(-A-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-X-B-) 또는 상기 표적 유전자의 하류부위에서 단일교차 재조합이 수행되어 변이된 게놈 DNA(-A-X-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-)를 포함하는 형질전환체를 수득할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, an Acetobacter baumannii strain is used as a multidrug-resistant strain, and a target gene (X), its upstream region (5'-region fragment, A) (-R6K-mobRP4-cat-sacB-AB-nptI-) is introduced into the genomic DNA (-AXB-) of an Escherichia bacterium var. (-AB-nptl-R6K-mobRP4-cat-sacB-AXB-) or genomic DNA (-AXB-AXB-) which undergoes a single cross-over recombination on the downstream of the target gene by performing a single cross- -nptI-R6K-mobRP4-cat-sacB-AB-) can be obtained.
상기 수득한 형질전환체는 게놈 DNA에 마커영역 단편(nptI)이 도입되었으므로, 상기 nptI에 의하여 발현되는 단백질에 의하여 카나마이신 저항성을 나타내지만, 상기 재조합벡터가 게놈 DNA에 도입되지 않은 아시네토박터 바우마니 균주는 자살벡터의 특성상 상기 재조합벡터가 아시네토박터 바우마니 균주에서 복제되지 않으므로, 상기 아시네토박터 바우마니 균주가 증식함에 따라 희석되어 말소되기 때문에 결과적으로는 nptI로부터 발현되는 단백질이 존재하지 않게 되어, 카나마이신 저항성을 나타내지 않는다. 따라서, 상기 재조합벡터가 도입된 아시네토박터 바우마니 균주를 카나마이신이 포함된 배지에서 배양하면, 형질전환체를 선별하여 수득할 수 있다.
Since the obtained transformant was introduced with a marker region fragment (nptI) in the genomic DNA, the recombinant vector exhibited resistance to kanamycin by the protein expressed by the nptI but the recombinant vector was not introduced into genomic DNA, Since the recombinant vector is not replicated in the strain of Asnithobacter baumannii due to the nature of the suicide vector, the strains of Asnithobacter baumannii are diluted and erased as the strain grows. As a result, there is no protein expressed from nptI , Indicating no resistance to kanamycin. Therefore, when the strain of Asnithobacter baumannii into which the recombinant vector is introduced is cultured in a medium containing kanamycin, the transformant can be obtained by selecting.
셋 째, 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주의 제작방법에 있어서, (c) 단계는 상기 형질전환체를 수크로스를 포함하는 배지에서 배양하여 표적 유전자가 결실된 변이주를 선발하는 단계이다.Third, in the method for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain provided by the present invention, the step (c) is a step of culturing the transformant in a medium containing sucrose to select a mutant strain in which the target gene has been deleted.
상기 (c) 단계는 상기 수득한 형질전환체의 게놈 DNA에서 단일교차 재조합에 의하여 표적 유전자를 결실시켜서 변이주를 제작하는 단계로서, 이는 자살벡터에 포함된 sacB 유전자에서 발현된 수크라제와 수크로스를 포함하는 배지를 사용함으로써 수행될 수 있다. 즉, 상기 수득한 형질전환체를 과량의 수크로스를 포함하는 배지에 접종하여 배양하면, 형질전환체의 게놈 DNA에 삽입된 sacB에서 발현된 수크라제에 의하여 상기 수크로스가 분해되고, 이에 따라 수크로스의 분해산물로서 독성산물이 발생되는데, 상기 독성산물은 형질전환를 손상시켜서, 게놈 DNA 내에서 단일교차 재조합이 발생할 수 있는 환경이 조성된다. 게놈 DNA에 도입된 재조합벡터로 인하여, 형질전환체의 게놈 DNA에는 표적 유전자에 인접한 5'-영역 단편과 3'-영역 단편이 중복으로 포함되므로, 상기 단일교차 재조합이 발생할 수 있는 환경이 조성되면, 상기 5'-영역 단편 또는 3'-영역 단편에서 단일교차 재조합이 발생할 수 있다. 상기 5'-영역 단편 또는 3'-영역 단편에서 단일교차 재조합이 발생하면, 앞서 게놈 DNA에 도입된 재조합벡터가 그대로 결실되어 야생형 다제내성 균주의 게놈 DNA로 회복되거나 또는 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자가 결실된 변이주를 제작할 수 있다. 상기 제작된 다제내성 균주의 변이주는 게놈 DNA에서 표적 유전자가 결실되었으므로, 상기 표적 유전자의 기능발현여부를 검사하거나 또는 게놈 DNA의 크기를 비교하여, 비교적 용이하게 야생형 균주와 구별하여 선별할 수 있다.The step (c) is a step of producing a mutant by deleting the target gene by a single cross-over recombination in the genomic DNA of the obtained transformant. This step is a step of transforming sucrase and sucrose expressed in the sacB gene contained in the suicide vector ≪ / RTI > That is, when the transformant obtained is inoculated and cultured in a culture medium containing an excessive amount of sucrose, the sucrose is decomposed by sucrase expressed in sacB inserted into the genomic DNA of the transformant, Toxic products are generated as degradation products of sucrose, which damage the transformation and create an environment in which single cross-over recombination can occur within the genomic DNA. Due to the recombination vector introduced into the genomic DNA, the 5'-region fragment and the 3'-region fragment adjacent to the target gene are overlapped in the genomic DNA of the transformant, so that an environment in which the single cross-over recombination can occur , Single cross-over recombination may occur in the 5'-region fragment or the 3'-region fragment. When a single cross-over recombination occurs in the 5'-region fragment or the 3'-region fragment, the recombinant vector introduced into the genomic DNA is deleted as it is and is recovered to the genomic DNA of the wild-type multidrug-resistant strain or the genomic DNA of the multidrug-resistant strain A mutant strain in which the target gene has been deleted can be produced. Since the target gene is deleted from the genomic DNA, the mutant strain of the prepared multidrug-resistant strain can be easily distinguished from the wild type strain by comparing the size of the genomic DNA or checking the function of the target gene.
따라서, 상기 표적 유전자가 결실된 변이주의 선발은 (c1) 수크로스를 포함하는 배지에서 배양된 형질전환체를 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제가 포함된 배지에서 배양하고, 생존하지 않는 균주를 선발하는 단계; 및, (c2) 상기 선발된 균주로부터 게놈 DNA를 수득하고 그의 크기를 야생형 다제내성 균주의 게놈 DNA의 크기와 비교하여, 상기 게놈 DNA의 크기가 감소된 균주를 선별하는 단계에 의하여 수행하거나; 또는 (c1') 수크로스를 포함하는 배지에서 배양된 형질전환체를 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제가 포함된 배지에서 배양하고, 생존하지 않는 균주를 선발하는 단계; 및, (c2') 상기 선발된 균주에서 나타나는 표적 유전자의 활성을 측정하여, 야생형 다제내성 균주에서 측정된 표적 유전자의 활성보다 상대적으로 낮은 수준을 나타내는 균주를 선별하는 단계에 의하여 수행될 수 있다.
Therefore, selection of the mutant strain in which the target gene is deleted can be performed by (c1) culturing the transformant cultured in the medium containing sucrose in a medium containing an antibiotic resistant to the multidrug-resistant strain, Selecting; And (c2) obtaining a genomic DNA from the selected strain and comparing the size of the genomic DNA with the size of the genomic DNA of the wild-type multidrug-resistant strain, thereby selecting a strain of reduced size of the genomic DNA; Or (c1 ') sucrose in a culture medium containing an antibiotic in which the multidrug-resistant strain does not exhibit resistance, and selecting a non-viable strain; And (c2 ') measuring the activity of the target gene expressed in the selected strain, and selecting a strain showing a level that is relatively lower than the activity of the target gene measured in the wild-type multidrug-resistant strain.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주로서 아세토박터 바우마니 균주를 사용하고, 이에 적합하도록, 상기 형질전환체에 포함된 게놈 DNA(-A-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-X-B- 또는 -A-X-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-)에는 각각 두 개의 5'-영역 단편(A)과 3'-영역 단편(B)이 존재하므로 이들에서 두 번째 단일교차 재조합이 유발될 수 있다. According to one embodiment of the present invention, an Acetobacter baumanni strain is used as a multidrug-resistant strain, and a genomic DNA (-AB-nptI-R6K-mobRP4-cat-sacB- Domain fragment (A) and 3'-region fragment (B) are present in each of the 5'-AXB- or -AXB-nptI-R6K-mobRP4- Recombination may be induced.
먼저, 첫 번째 게놈 DNA(-A-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-X-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 두 번째 단일교차 재조합이 유발되면, 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A)이 생성되는데, 상기 DNA 단편은 세포내 뉴클레아제 등에 의하여 분해되므로, 게놈 DNA 만이 잔류하게 되고, 결과적으로는 야생형의 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA(-A-X-B-)로 회복된다. 또한, 상기 첫 번째 게놈 DNA(-A-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-X-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 두 번째 단일교차 재조합이 유발되면, 게놈 DNA(-A-B-)와 DNA 단편(-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-X-B)이 생성되는데, 동일한 이유로 게놈 DNA 만이 잔류하게 되고, 결과적으로는 표적 유전자(X)가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 게놈 DNA(-A-B-)가 새로이 형성된다.First, when a second single cross-over recombination is induced in the 5'-region fragment (A) of the first genomic DNA (-AB-nptI-R6K-mobRP4-cat-sacB-AXB-), genomic DNA (-AXB-) And the DNA fragment (-B-nptI-R6K-mobRP4-cat-sacB-A) is generated. Since the DNA fragment is degraded by intracellular nucleases, only the genomic DNA is left. As a result, It is restored to the genomic DNA (-AXB-) of the strain Ashtenobacter baumannii. In addition, when a second single cross-over recombination is induced in the 3'-region fragment (B) of the first genomic DNA (-AB-nptI-R6K-mobRP4-cat-sacB- AXB-), genomic DNA (-AB- ) And a DNA fragment (-nptI-R6K-mobRP4-cat-sacB-AXB) are generated. For the same reason, only the genomic DNA remains, resulting in the deletion of the target gene (X) Genomic DNA (-AB-) is newly formed.
다음으로, 두 번째 게놈 DNA(-A-X-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 두 번째 단일교차 재조합이 유발되면, 게놈 DNA(-A-B-)와 DNA 단편(-X-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A)이 생성되는데, 동일한 이유로 게놈 DNA 만이 잔류하게 되고, 결과적으로는 표적 유전자(X)가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 게놈 DNA(-A-B-)가 새로이 형성된다. 또한, 상기 두 번째 게놈 DNA(-A-X-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 두 번째 단일교차 재조합이 유발되면, 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B)이 생성되는데, 동일한 이유로 게놈 DNA 만이 잔류하게 되고, 결과적으로는 야생형의 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA(-A-X-B-)로 회복된다.
Next, when a second single cross-over recombination is induced in the 5'-region fragment (A) of the second genomic DNA (-AXB-nptI-R6K-mobRP4-cat-sacB-AB-), genomic DNA (-AB- ) And a DNA fragment (-XB-nptI-R6K-mobRP4-cat-sacB-A) are generated. For the same reason, only genomic DNA remains, resulting in the deletion of the target gene (X) The mutant genomic DNA (-AB-) is newly formed. In addition, when a second single cross-over recombination is induced in the 3'-region fragment (B) of the second genomic DNA (-AXB-nptI-R6K-mobRP4-cat-sacB-AB-), genomic DNA (-AXB- ) And a DNA fragment (-nptI-R6K-mobRP4-cat-sacB-AB) are generated. For the same reason, only the genomic DNA is left. As a result, the genomic DNA of the wild-type Asnithobacter baumannii strain (-AXB- ).
상기 두 번째 단일교차 재조합은 확률적으로 유발되므로, 경우에 따라서는 단일교차 재조합이 발생할 수 있는 환경이 조성된다 하여도 두 번째 단일교차 재조합이 유발되지 않을 수도 있다. 상기 두 번째 단일교차 재조합이 수행된 균주인지의 여부는 상기 수크로스 배지에서 배양된 균주를 상기 재조합벡터에 포함된 마커영역 단편에서 발현되는 단백질에 의하여 저항성을 나타내는 항생제를 포함하는 배지에서 배양함으로써, 선별할 수 있다. 즉, 상기 두 번째 단일교차 재조합이 수행된 균주는 어떠한 경우에도, 게놈 DNA에 상기 마커영역 단편이 잔류하지 않으므로, 상기 항생제를 포함하는 배지에서는 생존할 수 없는 반면, 상기 두 번째 단일교차 재조합이 수행되지 않은 균주는 동일한 배지에서 생존할 수 있으므로, 이러한 차이를 이용하여 두 번째 단일교차 재조합이 수행된 균주를 선별할 수 있다.Since the second single cross-over recombination occurs stochastically, the second single cross-over recombination may not be induced even if an environment in which single cross-over recombination occurs may be generated in some cases. Whether or not the second single cross-over recombination is performed can be determined by culturing the strain cultured in the sucrose medium in a medium containing an antibiotic exhibiting resistance by a protein expressed in the marker region fragment contained in the recombinant vector, Can be selected. That is, in any case, the second single cross-over recombination can not survive in the medium containing the antibiotic because the marker region fragment does not remain in the genomic DNA, while the second single cross-over recombination is performed Strains can survive in the same medium, so that the strain subjected to the second single cross-over recombination can be selected using this difference.
따라서, 상기 형질전환체를 수크로스 배지에서 배양하면, 단일교차 재조합이 추가로 발생하여 야생형 다제내성 균주 또는 다제내성 균주의 변이주가 제작될 수 있는데, 상기 제작된 다제내성 균주의 변이주는 게놈 DNA에서 표적 유전자가 결실되었으므로, 상기 표적 유전자의 기능발현여부를 검사하거나 또는 게놈 DNA의 크기를 비교하여, 비교적 용이하게 야생형 균주와 구별하여 선별할 수 있다.
Therefore, when the transformant is cultured in a sucrose medium, a single cross-over recombination is further generated to produce a mutant strain of a wild-type multidrug-resistant strain or a multidrug-resistant strain. The mutant strain of the multidrug- Since the target gene has been deleted, it can be easily distinguished from the wild-type strain by screening for the function of the target gene or comparing the sizes of the genomic DNA.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주의 일종인 아세토박터 바우마니 균주에서 복제되지 않는 자살벡터인 pHKD01 벡터를 제작하고(도 1), 상기 제작된 pHKD01 벡터를 이용하여 다양한 표적 유전자(basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD 또는 rhbC3)를 결실시킬 수 있는 다양한 상동재조합 벡터(pHKD02 내지 pHK13)을 제작하였으며(도 3의 A), 상기 제작된 상동재조합 벡터를 이용하여 A. baumannii 균주에서 상기 표적 유전자가 결실된 다양한 변이균주(HDK01 내지 HDK12)를 제작하였고(도 3의 B 및 도 4의 B), 상기 제작된 변이균주의 전사체를 대상으로 실시간 PCR 방법을 수행하여 표적 유전자의 발현수준을 정량분석한 결과, 상기 변이균주에서는 표적 유전자가 발현되지 않음을 확인하였다(도 3의 C 및 도 5).
According to one embodiment of the present invention, a pHKD01 vector, which is a non-replicating suicide vector, is prepared from the Acetobacter baumannii strain, which is a kind of multidrug-resistant strain (Fig. 1) (pHKD02 to pHK13) capable of deleting the bovine, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD or rhbC3 Using the homologous recombination vector, various mutant strains (HDK01 to HDK12) in which the target gene was deleted in the A. baumannii strain (FIG. 3B and FIG. 4B) were prepared and the transcript of the prepared mutant strain (Fig. 3C and Fig. 5). As a result, the expression level of the target gene was quantitatively analyzed by real-time PCR. As a result, it was confirmed that the target gene was not expressed in the mutant strain (Fig.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제작되어, 다제내성 균주의 표적 유전자가 게놈 DNA에서 결실된 형태의 변이주를 제공한다.
As another embodiment for accomplishing the object of the present invention, the present invention provides a mutant strain produced by the above method, in which a target gene of a multidrug-resistant strain is deleted from genomic DNA.
본 발명의 용어 "다제내성 균주의 변이주"란, 다제내성 균주에서 표적 유전자가 결실된 형태로 변이된 다제내성 균주를 의미한다. The term " mutant strain of a multidrug-resistant strain "of the present invention means a multidrug-resistant strain in which a target gene is mutated in a multidrug-resistant strain.
본 발명에 있어서, 상기 다제내성 균주의 변이주는 야생형 다제내성 균주에서 표적 유전자만이 제거되었을 뿐, 외부에서 도입된 어떠한 유전자도 게놈 DNA에 남아있지 않은 유전형을 나타내므로, 상술한 변이주의 제조방법을 수행할 때, 재조합벡터가 도입되는 다제내성 균주로서 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 제공하는 방법을 사용하여 첫 번째 표적 유전자를 결실시킨 변이주를 제작하고, 상기 변이주를 대상으로 본 발명에서 제공하는 방법을 다시 사용하여 두 번째 표적 유전자를 결실시킨 변이주를 제작할 수 있다.
In the present invention, the mutant strain of the multidrug-resistant strain shows a genotype in which only the target gene is removed from the wild-type multidrug-resistant strain, and no gene externally introduced remains in the genomic DNA. Therefore, It can be used as a multidrug-resistant strain into which a recombinant vector is introduced. That is, a mutant strain in which the first target gene has been deleted can be prepared using the method provided in the present invention, and a mutant strain in which the second target gene has been deleted can be produced using the mutant strains again by the method provided in the present invention .
본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주로서 아세토박터 바우마니 균주를 사용하여, 상기 균주에 존재하는 basD가 결실된 변이주(HKD02)에 본 발명의 자살벡터를 이용하여 제작된 다른 재조합벡터를 추가로 도입함으로써, 상기 basD 유전자 뿐만 아니라, cirA 유전자가 추가로 결실된 변이주를 제작하였다(도 6).
According to one embodiment of the present invention, another recombinant vector produced by using the suicide vector of the present invention in a mutant strain (HKD02) in which basD is deleted in the strain, using an Acetobacter baumanni strain as a multidrug-resistant strain, As a result, a mutant strain in which the basD gene as well as the cirA gene was further deleted was prepared (Fig. 6).
본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터 또는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트를 이용하면, 다양한 다제내성 균주의 연구에 사용할 수 있는 제한된 항생제 저항성 유전자만을 이용하여도, 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 하나 또는 다수의 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주를 제작할 수 있으므로, 다양한 다제내성 균주의 유전체, 생리활성 등의 다양한 분야의 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.
Using the kit for producing a mutant strain of a suicide vector or a multidrug resistant strain for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain provided by the present invention, even when only a limited antibiotic resistance gene that can be used for studying various multidrug resistant strains can be used, Since a mutant strain in which one or more target genes or target polynucleotides are deleted from the genomic DNA can be produced, it can be widely used in various fields such as genome and physiological activity of various multidrug-resistant strains.
도 1a는 본 발명에서 제공하는 자살벡터인 pHKD01 벡터의 제조방법을 나타내는 개략도이다.
도 1b는 pHKD01 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 pHKD01 벡터를 이용하여 아시네토박터 바우마니 균주에서 표적 유전자를 결실시키는 방법의 흐름을 나타내는 개략도이다.
도 3의 A는 표적 유전자인 basD 또는 bauA를 대상으로, 증폭된 3가지 폴리뉴클레오티드(5'-영역 단편, 3'-영역 단편 및 nptI 유전자)의 전기영동 결과 및 overlap extension PCR을 수행하여 수득한 평활말단 DNA 단편의 전기영동 사진이다.
도 3의 B는 표적 유전자(basD 또는 bauA)가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01 또는 HKD02)의 게놈 DNA를 전기영동한 사진이다.
도 3의 C는 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01 또는 HKD02)에서 표적 유전자(basD 또는 bauA)의 발현여부를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4의 A는 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 다양한 표적 유전자(rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD 또는 rhbC3)의 상대적인 위치를 나타내는 개략도이다.
도 4의 B는 표적 유전자(rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD 또는 rhbC3)가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03 내지 HKD12)의 게놈 DNA를 전기영동한 사진이다.
도 5는 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03 내지 HKD12)에서 표적 유전자(rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD 또는 rhbC3)의 발현여부를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 두 가지 표적 유전자(bauA 및 cirA)가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD13)의 게놈 DNA를 전기영동한 사진이다.1A is a schematic diagram showing a method for producing a pHKD01 vector, which is a suicide vector provided in the present invention.
1B shows a cleavage map of the pHKD01 vector.
FIG. 2 is a schematic diagram showing the flow of a method of deleting target genes from the strain of Ashtonobacter baumanni using the pHKD01 vector.
FIG. 3A shows the result of electrophoresis of three amplified polynucleotides (5'-region fragment, 3'-region fragment and nptI gene) and overlap extension PCR on basD or bauA as a target gene This is an electrophoresis image of a smooth end-portion DNA fragment.
FIG. 3B is a photograph of a genomic DNA of an Asnithobacter baumannii mutant (HKD01 or HKD02) in which a target gene (basD or bauA) has been deleted.
FIG. 3C is a graph showing the results of quantitative analysis of the expression of the target gene (basD or bauA) in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD01 or HKD02).
FIG. 4A is a schematic diagram showing the relative positions of various target genes (rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, or rhbC3) in the genomic DNA of an Acinetobacter baumannii strain.
FIG. 4B shows an electrophoresis image of the genomic DNA of an Asnithobacter baumannii mutant (HKD03 to HKD12) lacking the target gene (rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD or rhbC3) to be.
5 is a graph showing the results of quantitative analysis of the expression of target genes (rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, or rhbC3) in the Ashtonobacter baumanni mutant HKD03 to HKD12 .
Fig. 6 is a photograph of genomic DNA of an Asnithobacter baumannii mutant (HKD13) in which two target genes (bauA and cirA) are deleted.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
1: One:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
균주에서 복제되지 않는 자살벡터( Suicidal vectors not replicated in the strain (
pHKD01pHKD01
벡터)의 제작 Vector)
다제내성 균주의 하나인 아세토박터 바우마니 균주를 이용하여 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주를 제작하고자 하였다.
Resistant strains of the present invention were prepared using the Acetobacter baumanni strain, which is one of the multidrug resistant strains.
어닐링 올리고뉴클레오티드 클로닝(annealed oligonucleotide cloning) 방법을 응용하여, 제한효소 사이트를 고려하지 않아도 되는 평활말단 클로닝이 가능한 벡터(pHKD01 벡터)를 다음과 같이 제작하였다.
An annealed oligonucleotide cloning method was applied to construct a vector (pHKD01 vector) capable of blunt end cloning which does not require restriction enzyme sites to be considered as follows.
먼저, 첫 번째 평활말단을 위한 제한효소 절단 부위 염기서열을 갖는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 이때, 상기 올리고뉴클레오티드는 평활말단으로 절단하는 제한효소인 FspI의 절단 부위염기서열인 TGCGCA를 포함한다. 또한, 상보적인 올리고뉴클레오티드는 서로 어닐링될 때, DNA 단편의 5' 말단과 3' 말단이 PstI 제한효소에 의해 잘려진 DNA에 직접적으로 연결될 수 있도록 제작되었다. First, a complementary oligonucleotide having a restriction enzyme cleavage site sequence for the first smooth end was prepared. At this time, the oligonucleotide includes TGCGCA, which is a cleavage site sequence of FspI, which is a restriction enzyme that cleaves at the smooth end. In addition, the complementary oligonucleotides were constructed such that, when annealed to each other, the 5 'and 3' ends of the DNA fragments could be directly linked to the DNA truncated by the PstI restriction enzyme.
다음으로, 상기 제작된 각 올리고뉴클레오티드 2㎍을 50㎕의 반응완충액(10mM Tris, 50mM NaCl, 1mM EDTA, pH 7.5)에 가하고, 95℃ 5분 및 25℃ 60분동안 반응시켜서 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 수득하고, 이를 제한효소 PstI으로 절단된 pDS132 벡터에 도입하여 다제내성 아시네토박터 바우마니 균주에서 복제되지 않는 자살벡터 pHKD01(서열번호 1)을 제작하였다(도 1).Next, 2 쨉 g of each oligonucleotide thus prepared was added to 50 의 of reaction buffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) and reacted at 95 캜 for 5 minutes and at 25 캜 for 60 minutes to obtain double stranded oligonucleotides , And introduced into a pDS132 vector digested with restriction enzyme PstI to produce a suicide vector pHKD01 (SEQ ID NO: 1) which is not replicated in the multidrug-resistant Acinetobacter baumanni strain (Fig. 1).
도 1은 본 발명에서 제공하는 자살벡터인 pHKD01 벡터의 제조방법 및 제조된 pHKD01 벡터의 개열지도를 나타내는 개략도이다.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for producing a pHKD01 vector, which is a suicide vector provided by the present invention, and a cleavage map of the pHKD01 vector prepared.
한편, 상기 제작된 pHKD01 벡터는 아시네토박터 바우마니 균주에서 표적 유전자를 결실시키는데 사용될 수 있다(도 2). 도 2는 pHKD01 벡터를 이용하여 아시네토박터 바우마니 균주에서 표적 유전자를 결실시키는 방법의 흐름을 나타내는 개략도이다.On the other hand, the prepared pHKD01 vector can be used to delete a target gene in an Acinetobacter baumannii strain (Fig. 2). FIG. 2 is a schematic diagram showing the flow of a method of deleting target genes from the strain of Ashtonobacter baumanni using the pHKD01 vector.
도 2에서 보듯이, 결실된 표적 유전자를 포함하는 평활말단 DNA 단편(표적 유전자의 5'-말단 부분(Gene A 영역), 표적 유전자의 3'-말단 부분(Gene B 영역) 및 카나마이신 저항성 유전자(nptI 영역)를 포함)을 PCR 방법으로 증폭하여 수득하고, 상기 수득한 평활말단 DNA 단편을 제한효소 FspI으로 절단된 pHKD01 벡터에 도입하여 상동재조합 벡터(sacB-Gene A-Gene B-nptI)를 수득한 다음, 상기 수득한 상동재조합 벡터를 아시네토박터 바우마니 균주에 도입하여 형질전환체를 제작할 수 있는데, 상기 제작한 형질전환체는 카나마이신이 포함된 배지를 사용하여 선별한다. 표적 유전자의 5'-말단 부분(Gene A 영역)에서 1차 단일교차 재조합(first single cross-over recombination)이 발생하면, 상기 형질전환체에 도입된 발현벡터(sacB-Gene A-Gene B-nptI)이 상기 아시네토박터 바우마니 균주의 염색체에 포함된 정상적인 표적 유전자(Gene A-Gene X-Gene B)와 교차되며, 상기 발현벡터가 아시네토박터 바우마니 균주의 염색체에 존재하는 표적 유전자의 내부에 도입된 형태(Gene A-Gene B-nptI-sacB-Gene A-Gene X-Gene B)를 형성한다. 이어, 상기 형질전환체를 수크로스가 포함된 배지에서 배양하면, 상기 염색체에 도입된 sacB 유전자에서 발현된 수크라제에 의해 수크로스가 분해되면서, 독성부산물을 형성하고, 이로 인하여 상기 상동재조합벡터가 도입된 염색체내의 표적 유전자의 3'-말단 부분(Gene B 영역)에서 2차 단일 교차 상동재조합이 발생하면, 염색체로부터 유래된 표적 유전자 부분(Gene X 영역)과 발현벡터에서 유래된 부분(sacB 영역 및 nptI 영역)이 상기 염색체로부터 제거되어 최종적으로는 정상적인 표적 유전자(Gene X 영역)가 결실된 형태의 염색체(Gene A-Gene B)를 포함하는 아시네토박터 바우마니 변이주를 제조할 수 있다. 상기 아시네토박터 바우마니 변이주는 카나마이신이 포함된 배지를 사용하여 선별할 수 있다. 상기 아시네토박터 바우마니 변이주에는 카나마이신에 대한 저항성을 나타내는 nptI가 포함되어 있지 않으므로, 상기 nptI을 이용하여 아시네토박터 바우마니 변이주로부터 또 다른 표적 유전자를 결실시킬 수 있다.
As shown in FIG. 2, a blunt-ended DNA fragment containing the deleted target gene (the 5'-terminal portion (Gene A region) of the target gene, the 3'-terminal portion (Gene B region) of the target gene and the kanamycin resistance gene Gene A-Gene B-nptI) was obtained by amplifying the homologous recombinant vector (sacB-Gene B-nptI) by amplifying it by the PCR method and introducing the obtained smooth end DNA fragment into the pHKD01 vector digested with restriction enzyme FspI Then, the homologous recombination vector obtained can be introduced into an Acinetobacter baumannii strain to produce a transformant. The transformant is selected using a medium containing kanamycin. When the first single cross-over recombination occurs in the 5'-terminal region (Gene A region) of the target gene, an expression vector (sacB-Gene A-Gene B-nptI ) Is crossed with a normal target gene (Gene A-Gene X-Gene B) contained in the chromosome of the strain of Acinetobacter baumanni, and the expression vector is inserted into the inside of the target gene existing on the chromosome of the strain of Asnithobacter baumannii (Gene A-Gene B-nptI-sacB-Gene A-Gene X-Gene B). When the transformant is cultured in a culture medium containing sucrose, the sucrose is decomposed by sucrase expressed in the sacB gene introduced into the chromosome, thereby forming a toxic by-product. As a result, the homologous recombinant vector (Gene X region) derived from a chromosome and a portion derived from an expression vector (sacB region) derived from a chromosome, when a second single-cross homologous recombination occurs in the 3'-terminal portion (Gene B region) Region and nptl region) is removed from the chromosome and finally a chromosome (Gene A-Gene B) in which a normal target gene (Gene X region) is deleted can be produced. The Asnithobacter baumannii mutant can be screened using a medium containing kanamycin. Since the Asnithobacter baumannii mutant does not contain nptI which shows resistance to kanamycin, another target gene can be deleted from the Asnithobacter baumannii mutant using the nptI.
실시예Example
2: 2:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
균주에서 복제되지 않는 자살벡터를 이용하여, 표적 유전자가 결실된 변이 균주의 제작 Using a suicide vector that is not replicated in the strain, a mutant strain in which the target gene is deleted is produced
상기 실시예 1에서 제작한 자살벡터 pHKD01 벡터를 이용하면, 아시네토박터 바우마니 균주에서 다양한 유전자를 결실시킬 수 있을 것으로 예상되었으므로, 이를 실험적으로 확인하였다.
Using the suicide vector pHKD01 vector prepared in Example 1, it was expected that various genes could be deleted in the strain of Ashtonobacter baumanni.
실시예Example
2-1: 2-1:
basDbasD
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작 Production of mutant strains
먼저, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, basD 유전자의 5'-말단을 증폭시키기 위한 S1/S2 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 basD 유전자의 5'-영역 단편의 폴리뉴클레오티드를 수득하였다.
First, a polynucleotide of the 5'-region fragment of the basD gene was obtained by carrying out PCR using the genomic DNA of the strain of Ashinobacter baumanni as a template and the S1 / S2 primer for amplifying the 5'-end of the basD gene Respectively.
S1 primer(BASD01F): S1 primer (BASD01F):
5'-GAAGCAATTGAGCGGTTCAGG-3'(서열번호 2)5'-GAAGCAATTGAGCGGTTCAGG-3 '(SEQ ID NO: 2)
S2 primer(BASD01R): S2 primer (BASD01R):
5'-AAATGATGAAAGTTCAAAATACGAATTGTTAATCATTTCCAATTTTGCTGT-3'(서열번호 3)
5'-AAATGATGAAAGTTCAAAATACGAATTGTTAATCATTTCCAATTTTGCTGT-3 '(SEQ ID NO: 3)
다음으로, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, basD 유전자의 3'-말단을 증폭시키기 위한 S3/S4 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 basD 유전자의 3'-영역 단편의 폴리뉴클레오티드를 수득하였다.
Next, PCR was carried out using S3 / S4 primer for amplifying the 3'-terminal of the basD gene, using the genomic DNA of the strain of Asnithobacter baumanni as a template to obtain a polynucleotide of the 3'-region fragment of the basD gene .
S3 primer(BASD02F): S3 primer (BASD02F):
5'-TTCGTATTTTGAACTTTCATCATTTTGG-3'(서열번호 4)5'-TTCGTATTTTGAACTTTCATCATTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 4)
S4 primer(BASD02R): S4 primer (BASD02R):
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACTGTGCAAACAGGTTAAACGCAG-3'(서열번호 5)
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACTGTGCAAACAGGTTAAACGCAG-3 '(SEQ ID NO: 5)
아울러, pUC4K를 주형으로 하고, nptI 유전자를 증폭시키기 위한 U1/U2 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 nptI 유전자의 폴리뉴클레오티드를 수득하였다.
In addition, PCR was carried out using U1 / U2 primer for amplifying the nptI gene with pUC4K as a template to obtain polynucleotide of nptI gene.
U1: 5'-GTCTGCCTCGTGAAGAAGGTG-3'(서열번호 6)U1: 5'-GTCTGCCTCGTGAAGAAGGTG-3 '(SEQ ID NO: 6)
U2: 5'-GATCCGTCGACCTGCAGG-3'(서열번호 7)
U2: 5'-GATCCGTCGACCTGCAGG-3 '(SEQ ID NO: 7)
상기 수득한 3가지 폴리뉴클레오티드(5'-영역 단편, 3'-영역 단편 및 nptI 유전자)를 전기영동하여 그의 크기를 측정하였다(도 3의 A). 도 3의 A는 PCR 방법으로 증폭된 표적 유전자의 5'-말단. 3'-말단 및 nptI 유전자의 폴리뉴클레오티드 및 이들 각 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하여 overlap extension PCR을 수행하여 수득한 평활말단 DNA 단편를 나타내는 전기영동사진이다.The resulting three polynucleotides (5'-region fragment, 3'-region fragment and nptI gene) were electrophoresed and their sizes were measured (FIG. 3A). FIG. 3A shows the 5'-terminal of the target gene amplified by the PCR method. 3 ' -terminal and polynucleotide of nptI gene, and polynucleotides thereof, respectively, and performing an overlap extension PCR using the polynucleotide as a template.
상기 수득한 3가지 폴리뉴클레오티드(5'-영역 단편, 3'-영역 단편 및 nptI 유전자)를 주형으로 하고, 상기 S1/U2 프라이머를 사용한 overlap extension PCR을 수행하여, 상기 각 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 결합된 평활말단 DNA 단편을 수득하였다(도 3의 A).
Using the above-obtained three polynucleotides (5'-region fragment, 3'-region fragment and nptI gene) as a template, overlap extension PCR was performed using the S1 / U2 primer, and each of the polynucleotides was sequenced (Figure 3 A). ≪ tb >< TABLE >
한편, 상기 실시예 1에서 제작한 pHKD01 벡터를 제한효소 FspI으로 절단하고, 상기 절단부위에 상기 수득한 평활말단 DNA 단편을 도입하여, 재조합벡터(pHKD02)를 수득하였다.On the other hand, the pHKD01 vector produced in Example 1 was digested with restriction enzyme FspI, and the thus obtained smooth end DNA fragment was introduced into the cleavage site to obtain a recombinant vector (pHKD02).
상기 수득한 재조합벡터(pHKD02: pHKD01 with ΔbasD::nptI; Cmr,Kmr)를 아시네토박터 바우마니 균주(ATCC 19606)에 도입하고, 상기 도입된 균주를 카나마이신(30㎍/㎖)이 포함된 LB 평판배지에서 배양하여, 형질전환체를 선별하였다. 상기 선별된 형질전환체를 10%(w/v) 수크로스가 포함된 평판배지에서 배양하여 각각의 콜로니를 수득하고, 상기 수득한 각각의 콜로니를 LB 평판배지와 카나마이신(30㎍/㎖)이 포함된 LB 평판배지에서 배양하여, LB 평판배지에서는 성장하지만, 카나마이신이 포함된 LB 평판배지에서는 성장하지 않는 콜로니를 선별하여, 최종적으로 basD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01: ATCC 19606 with ΔbasD)를 제작하였다(도 3의 B). 도 3의 B는 표적 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 게놈 DNA를 전기영동한 사진이다. 도 3의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
The obtained recombinant vector (pHKD02: pHKD01 with ΔbasD :: nptI; Cmr, Kmr) was introduced into an Acinetobacter baumanni strain (ATCC 19606), and the introduced strain was transformed with LB containing kanamycin (30 μg / The transformants were selected by culturing on a plate medium. The selected transformants were cultured in a plate medium containing 10% (w / v) sucrose to obtain respective colonies, and each of the colonies obtained was cultured on LB plate medium and kanamycin (30 μg / ml) The colonies which did not grow in the LB plate medium containing kanamycin but grown in the LB plate medium were cultured in the LB plate medium contained, and then the colonies of the Ashinobacter baumannii mutant (HKD01: ATCC 19606 with ΔbasD) (FIG. 3B). FIG. 3B is a photograph of the genomic DNA of an Asnithobacter baumannii mutant in which the target gene has been deleted. As shown in Fig. 3B, it was confirmed that the size of the genomic DNA was decreased in the case of the Ashinotobacter baumanni mutant as compared with the wild type Ashinotobacter baumanni strain. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-2: 2-2:
bauAbauA
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작 Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 BAUA01F/BAUA01R/BAUA02F/BAUA02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD03(pHKD01 with ΔbauA::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, bauA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD02: ATCC 19606 with ΔbauA)를 제작하였다. 이때, 증폭된 3가지 폴리뉴클레오티드(5'-영역 단편, 3'-영역 단편 및 nptI 유전자)의 전기영동 결과 및 overlap extension PCR을 수행하여 수득한 평활말단 DNA 단편의 전기영동 결과는 도 3의 A에 나타내었고, 아시네토박터 바우마니 변이주로부터 유래된 게놈 DNA의 전기영동 결과는 도 3의 B에 나타내었다.
Except that BAUA01F / BAUA01R / BAUA02F / BAUA02R were used as S1 / S2 / S3 / S4 primers and pHKD03 (pHKD01 with ΔbauA :: nptI; Cmr, Kmr) was used as a homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD02: ATCC 19606 with ΔbauA) in which the bauA gene was deleted was prepared. At this time, electrophoresis results of the amplified three polynucleotides (5'-region fragment, 3'-region fragment and nptI gene) and electrophoresis results of the smoothed end DNA fragment obtained by carrying out overlap extension PCR were shown in FIG. 3 And the result of electrophoresis of the genomic DNA derived from the Ashtonobacter baumannii mutant is shown in Fig. 3B.
BAUA01F: BAUA01F:
5'-GTCGATTTGGAGAAAACGTAAGC-3'(서열번호 8)5'-GTCGATTTGGAGAAAACGTAAGC-3 '(SEQ ID NO: 8)
BAUA01R: BAUA01R:
5'-CATAAATTTTCACTATTTTGCTATGATAAAAAAACCCGCAATCGC-3'(서열번호 9)5'-CATAAATTTTCACTATTTTGCTATGATAAAAAAACCCGCAATCGC-3 '(SEQ ID NO: 9)
BAUA02F: BAUA02F:
5'-CATAGCAAAATAGTGAAAATTTATGCTC-3'(서열번호 10)5'-CATAGCAAAATAGTGAAAATTTATGCTC-3 '(SEQ ID NO: 10)
BAUA02R: BAUA02R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACATCATAGCGGCAGCTGTCAC-3'(서열번호 11)
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACATCATAGCGGCAGCTGTCAC-3 '(SEQ ID NO: 11)
도 3의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 3B, it was confirmed that the size of the genomic DNA was decreased in the case of the Ashinotobacter baumanni mutant as compared with the wild type Ashinotobacter baumanni strain. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-3: 2-3:
rimLrimL
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 RIML01F/RIML01R/RIML02F/RIML02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD04(pHKD01 with ΔrimL::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, rimL 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03: ATCC 19606 with ΔbauA)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 rimL 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.
Except that RIML01F / RIML01R / RIML02F / RIML02R were used as S1 / S2 / S3 / S4 primers and pHKD04 (pHKD01 with ΔrimL :: nptI; Cmr, Kmr) was used as a homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD03: ATCC 19606 with? BauA) in which the rimL gene was deleted was prepared (Fig. 4). At this time, the relative position of the target gene rimL gene in the genomic DNA of the strain of Ashinobacterium Vaumani is shown in Fig. 4A. The result of electrophoresis of genomic DNA of the Ashinotobacter baumannii mutant (HKD03) B of Fig.
RIML01F: RIML01F:
5'-ACTTTGCTTCTATCTGGATGCG-3'(서열번호 12)5'-ACTTTGCTTCTATCTGGATGCG-3 '(SEQ ID NO: 12)
RIML01R: RIML01R:
5'-CTTGCAGGTCTACCCATACCAGAAACGGTCCTTGCTATGACATAACC-3'(서열번호 13)5'-CTTGCAGGTCTACCCATACCAGAAACGGTCCTTGCTATGACATAACC-3 '(SEQ ID NO: 13)
RIML02F: RIML02F:
5'-TTTCTGGTATGGGTAGACCTGC-3'(서열번호 14)5'-TTTCTGGTATGGGTAGACCTGC-3 '(SEQ ID NO: 14)
RIML02R: RIML02R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGGGATAAATTGATCAAGATCGG-3'(서열번호 15)
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGGGATAAATTGATCAAGATCGG-3 '(SEQ ID NO: 15)
도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 4B, it was confirmed that the genome DNA was reduced in size compared to the wild-type Acinetobacter baumannii strains of the Ashinotobacter baumanni mutant. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-4: 2-4:
piuBpiuB
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작 Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 PIUB01F/PIUB01R/PIUB02F/PIUB02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD05(pHKD01 with ΔpiuB::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, piuB 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD04: ATCC 19606 with ΔpiuB)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 piuB 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD04)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.
Except that PIUB01F / PIUB01F / PIUB01R / PIUB02F / PIUB02R was used as S1 / S2 / S3 / S4 primer and pHKD05 (pHKD01 with ΔpiuB :: nptI; Cmr, Kmr) was used as a homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD04: ATCC 19606 with ΔpiuB) in which the piuB gene was deleted was prepared (FIG. 4). At this time, the relative position of the target gene piuB gene in the genome DNA of the strain of Ashinobacterium var. Mariana is shown in Fig. 4A. The result of electrophoresis of the genome DNA of the Ashinotobacter baumanni mutant (HKD04) B of Fig.
PIUB01F: PIUB01F:
5'-GGCTTAAATCTGGGATTGACTGG-3'(서열번호 16)5'-GGCTTAAATCTGGGATTGACTGG-3 '(SEQ ID NO: 16)
PIUB01R: PIUB01R:
5'-CCCAAAATAATGATGCAAAGCTCATTTAAGCCACTCCCCATTTAGCTA-3'(서열번호 17)5'-CCCAAAATAATGATGCAAAGCTCATTTAAGCCACTCCCCATTTAGCTA-3 '(SEQ ID NO: 17)
PIUB02F: PIUB02F:
5'-ATGAGCTTTGCATCATTATTTTGG-3'(서열번호 18)5'-ATGAGCTTTGCATCATTATTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 18)
PIUB02R: PIUB02R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGCACATGTCTTCTACTACAGCCG-3'(서열번호 19)
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGCACATGTCTTCTACTACAGCCG-3 '(SEQ ID NO: 19)
도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 4B, it was confirmed that the genome DNA was reduced in size compared to the wild-type Acinetobacter baumannii strains of the Ashinotobacter baumanni mutant. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-5: 2-5:
cirAcirA
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작 Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 CIRA01F/CIRA01R/CIRA02F/CIRA02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD06(pHKD01 with ΔcirA::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, cirA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD05: ATCC 19606 with ΔcirA)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 cirA 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD05)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.
Except that CIRA01F / CIRA01F / CIRA01R / CIRA02F / CIRA02R were used as S1 / S2 / S3 / S4 primers and pHKD06 (pHKD01 with ΔcirA :: nptI; Cmr, Kmr) was used as a homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD05: ATCC 19606 with ΔcirA) lacking the cirA gene was prepared (FIG. 4). The relative position of the target gene, cirA gene, in the genomic DNA of the strain of Aspergillus bacterium var. Marii is shown in Fig. 4A. The result of electrophoresis of genomic DNA of the Asnithobacter baumannii mutant (HKD05) B of Fig.
CIRA01F: CIRA01F:
5'-AGTTAGCGAAAATAGGTCGCGTACC-3'(서열번호 20)5'-AGTTAGCGAAAATAGGTCGCGTACC-3 '(SEQ ID NO: 20)
CIRA01R: CIRA01R:
5'-ACAGGCATCTCTTTCGTTAGTTGCATTCTCCCTAGCCCAAATGTTACTCAAC-3'(서열번호 21)5'-ACAGGCATCTCTTTCGTTAGTTGCATTCTCCCTAGCCCAAATGTTACTCAAC-3 '(SEQ ID NO: 21)
CIRA02F: CIRA02F:
5'-TGCAACTAACGAAAGAGATGCCTG-3'(서열번호 22)5'-TGCAACTAACGAAAGAGATGCCTG-3 '(SEQ ID NO: 22)
CIRA02R: CIRA02R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACAACAGTCCAGTAAAGGCCATCACC-3'(서열번호 23)
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACAACAGTCCAGTAAAGGCCATCACC-3 '(SEQ ID NO: 23)
도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 4B, it was confirmed that the genome DNA was reduced in size compared to the wild-type Acinetobacter baumannii strains of the Ashinotobacter baumanni mutant. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-6: 2-6:
menGmenG
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작 Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 MENG01F/MENG01R/MENG02F/MENG02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD07(pHKD01 with ΔmenG::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, menG 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD06: ATCC 19606 with ΔmenG)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 menG 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD06)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.
Except that MENG01F / MENG01R / MENG02F / MENG02R was used as the S1 / S2 / S3 / S4 primer and pHKD07 (pHKD01 with ΔmenG :: nptI; Cmr, Kmr) was used as the homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD06: ATCC 19606 with? MenG) in which the menG gene was deleted was prepared (Fig. 4). The relative position of the target gene, the menG gene, in the genomic DNA of the Acinetobacter baumannii strain is shown in Fig. 4A. The result of electrophoresis of the genomic DNA of the Asnithobacter baumannii mutant (HKD06) B of Fig.
MENG01F: MENG01F:
5'-TGGTCTGTACTTGCTCATGCGT-3'(서열번호 24)5'-TGGTCTGTACTTGCTCATGCGT-3 '(SEQ ID NO: 24)
MENG01R: MENG01R:
5'-CGAACATTAATGAGAATGATTTTTACTTTAAATTTTCCGATTTCTTTTAAACGTAAG-3'(서열번호 25)5'-CGAACATTAATGAGAATGATTTTACTTTAAATTTTCCGATTTCTTTTAAACGTAAG-3 '(SEQ ID NO: 25)
MENG02F: MENG02F:
5'-TAAAAATCATTCTCATTAATGTTCGTATT-3'(서열번호 26)5'-TAAAAATCATTCTCATTAATGTTCGTATT-3 '(SEQ ID NO: 26)
MENG02R: MENG02R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGAGTAATCAGGTCCGTAGTCAGTATCC-3'(서열번호 27)
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGAGTAATCAGGTCCGTAGTCAGTATCC-3 '(SEQ ID NO: 27)
도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 4B, it was confirmed that the genome DNA was reduced in size compared to the wild-type Acinetobacter baumannii strains of the Ashinotobacter baumanni mutant. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-7: 2-7:
fhuFfhuF
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작 Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 FHUF01F/FHUF01R/FHUF02F/FHUF02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD08(pHKD01 with ΔfhuF::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, fhuF 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD07: ATCC 19606 with ΔfhuF)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 fhuF 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD07)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.
Except that FHUF01F / FHUF01R / FHUF02F / FHUF02R was used as the S1 / S2 / S3 / S4 primer and pHKD08 (pHKD01 with ΔfhuF :: nptI; Cmr, Kmr) was used as the homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD07: ATCC 19606 with ΔfhuF) in which the fhuF gene was deleted was prepared (FIG. 4). The relative position of the target gene, fhuF gene, in the genomic DNA of the strain of Aspergillus baumannii is shown in Fig. 4A. The result of electrophoresis of the genome DNA of the genus Asnithobacter baumannii mutant (HKD07) B of Fig.
FHUF01F: FHUF01F:
5'-CCGATAGGAATTAAAGCTCTTGG-3'(서열번호 28)5'-CCGATAGGAATTAAAGCTCTTGG-3 '(SEQ ID NO: 28)
FHUF01R: FHUF01R:
5'-CTTTAGAAGTATCAATTTGATTCATCGTCAGATATCACTAACAATTTAAGGC-3'(서열번호 29)5'-CTTTAGAAGTATCAATTTGATTCATCGTCAGATATCACTAACAATTTAAGGC-3 '(SEQ ID NO: 29)
FHUF02F: FHUF02F:
5'-ATGAATCAAATTGATACTTCTAAAGCACT-3'(서열번호 30)5'-ATGAATCAAATTGATACTTCTAAAGCACT-3 '(SEQ ID NO: 30)
FHUF02R: FHUF02R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACAGCAACTTTACGACCTGCCG-3'(서열번호 31)
5'-GCAACACTTCTTCACGAGGCAGACAGCAACTTTACGACCTGCCG-3 '(SEQ ID NO: 31)
도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 4B, it was confirmed that the genome DNA was reduced in size compared to the wild-type Acinetobacter baumannii strains of the Ashinotobacter baumanni mutant. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-8: 2-8:
rhbC1rhbC1
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작 Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 RHBC101F/RHBC101R/RHBC102F/RHBC102R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD09(pHKD01 with ΔrhbC1::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, rhbC1 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD08: ATCC 19606 with ΔrhbC1)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 rhbC1 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD08)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.
Except that RHBC101F / RHBC101R / RHBC102F / RHBC102R were used as S1 / S2 / S3 / S4 primers and pHKD09 (pHKD01 with ΔrhbC1 :: nptI; Cmr, Kmr) was used as a homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD08: ATCC 19606 with? RhbC1) lacking the rhbC1 gene was prepared (Fig. 4). At this time, the relative position of the target gene rhbC1 gene in the genome DNA of the strain of Ashinobacterium Vaumani is shown in Fig. 4A. The genomic DNA of the Ashinotobacter baumanni mutant (HKD08) B of Fig.
RHBC101F: RHBC101F:
5'-GCCCAACAATCTCTACGCAC-3'(서열번호 32)5'-GCCCAACAATCTCTACGCAC-3 '(SEQ ID NO: 32)
RHBC101R: RHBC101R:
5'-AAGACATATTCATCGTCAGATATCAAGATAAATCTCACTTCACCTGCAAT-3'(서열번호 33)5'-AAGACATATTCATCGTCAGATATCAAGATAAATCTCACTTCACCTGCAAT-3 '(SEQ ID NO: 33)
RHBC102F: RHBC102F:
5'-TGATATCTGACGATGAATATGTCTTTTAA-3'(서열번호 34)5'-TGATATCTGACGATGAATATGTCTTTTAA-3 '(SEQ ID NO: 34)
RHBC102R: RHBC102R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGACTCAATCCGAACCGTACG-3'(서열번호 35)
5'-GCAACACTTCTTCACGAGGCAGACGACTCAATCCGAACCGTACG-3 '(SEQ ID NO: 35)
도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 4B, it was confirmed that the genome DNA was reduced in size compared to the wild-type Acinetobacter baumannii strains of the Ashinotobacter baumanni mutant. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-9: 2-9:
rhbC2rhbC2
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작 Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 RHBC201F/RHBC201R/RHBC202F/RHBC202R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD10(pHKD01 with ΔrhbC2::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, rhbC2 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD09: ATCC 19606 with ΔrhbC2)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 rhbC2 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD09)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.
Except that RHBC201F / RHBC201R / RHBC202F / RHBC202R were used as S1 / S2 / S3 / S4 primers and pHKD10 (pHKD01 with ΔrhbC2 :: nptI; Cmr, Kmr) was used as a homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD09: ATCC 19606 with ΔrhbC2) in which the rhbC2 gene was deleted (FIG. 4) was prepared. At this time, the relative position of the target gene rhbC2 gene in the genome DNA of the strain of Ashinobacterium var. Mariana is shown in Fig. 4A. The result of electrophoresis of the genome DNA of the Ashinotobacter baumanni mutant (HKD09) B of Fig.
RHBC201F: RHBC201F:
5'-CCATGATCATGCTAACCTTAGCAG-3'(서열번호 36)5'-CCATGATCATGCTAACCTTAGCAG-3 '(SEQ ID NO: 36)
RHBC201R: RHBC201R:
5'-GCTGAAGTGCATTCATAGATAAATCTTTTATTAATCCTATTTCTTTAATTGGTCG-3'(서열번호 37)5'-GCTGAAGTGCATTCATAGATAAATCTTTTATTAATCCTATTTCTTTAATTGGTCG-3 '(SEQ ID NO: 37)
RHBC202F: RHBC202F:
5'-GATTTATCTATGAATGCACTTCAGCC-3'(서열번호 38)5'-GATTTATCTATGAATGCACTTCAGCC-3 '(SEQ ID NO: 38)
RHBC202R: RHBC202R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCCAAGAGCTTTAATTCCTATCGG-3'(서열번호 39)
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCCAAGAGCTTTAATTCCTATCGG-3 '(SEQ ID NO: 39)
도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 4B, it was confirmed that the genome DNA was reduced in size compared to the wild-type Acinetobacter baumannii strains of the Ashinotobacter baumanni mutant. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-10: 2-10:
araJaraj
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 ARAJ01F/ARAJ01R/ARAJ02F/ARAJ02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD11(pHKD01 with ΔaraJ::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, araJ 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD10: ATCC 19606 with ΔaraJ)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 araJ 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD10)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.
ARAJ01F / ARAJ01R / ARAJ02F / ARAJ02R were used as S1 / S2 / S3 / S4 primers and pHKD11 (pHKD01 with ΔaraJ :: nptI; Cmr, Kmr) was used as a homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD10: ATCC 19606 with ΔaraJ) in which the araJ gene was deleted was prepared (FIG. 4). At this time, the relative position of the araJ gene as a target gene in the genomic DNA of the strain of Ashinobacterium var. Marijuana is shown in Fig. 4A. The result of electrophoresis of the genome DNA of the Ashinotobacter baumannii mutant (HKD10) B of Fig.
ARAJ01F: ARAJ01F:
5'-GGGTACAACTCCACATTTACCAG-3'(서열번호 40)5'-GGGTACAACTCCACATTTACCAG-3 '(SEQ ID NO: 40)
ARAJ01R: ARAJ01R:
5'-TGTAATTGTCCCATTTTTATTAATCATCCTCTGTTTAGCTTATTCAATATGC-3'(서열번호 41)5'-TGTAATTGTCCCATTTTTATTAATCATCCTCTGTTTAGCTTATTCAATATGC-3 '(SEQ ID NO: 41)
ARAJ02F: ARAJ02F:
5'-GATTAATAAAAATGGGACAATTACATCC-3'(서열번호 42)5'-GATTAATAAAAATGGGACAATTACATCC-3 '(SEQ ID NO: 42)
ARAJ02R: ARAJ02R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGCAACCAGTCTGTAATAATTGGC-3'(서열번호 43)
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGCAACCAGTCTGTAATAATTGGC-3 '(SEQ ID NO: 43)
도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 4B, it was confirmed that the genome DNA was reduced in size compared to the wild-type Acinetobacter baumannii strains of the Ashinotobacter baumanni mutant. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-11: 2-11:
iucDiucD
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작 Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 IUCD01F/IUCD01R/IUCD02F/IUCD02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD12(pHKD01 with ΔiucD::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, iucD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD11: ATCC 19606 with ΔiucD)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 iucD 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD11)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.
Except that IUCD01F / IUCD01R / IUCD02F / IUCD02R were used as S1 / S2 / S3 / S4 primers and pHKD12 (pHKD01 with ΔiucD :: nptI; Cmr, Kmr) was used as a homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD11: ATCC 19606 with? IucD) lacking the iucD gene was prepared (Fig. 4). At this time, the relative position of the target gene iucD gene in the genomic DNA of the strain of Ashinobacterium bumani is shown in Fig. 4A. The result of electrophoresis of the genomic DNA of the Ashinotobacter baumannii mutant (HKD11) B of Fig.
IUCD01F: IUCD01F:
5'-GATATTGGTTTACGTGGATGGC-3'(서열번호 44)5'-GATATTGGTTTACGTGGATGGC-3 '(SEQ ID NO: 44)
IUCD01R: IUCD01R:
5'-TCCATACACATATCCTCTGTTTAGCTCAAGCATAACTCACATCCTTCTGT-3'(서열번호 45)5'-TCCATACACATATCCTCTGTTTAGCTCAAGCATAACTCACATCCTTCTGT-3 '(SEQ ID NO: 45)
IUCD02F: IUCD02F:
5'-GCTAAACAGAGGATATGTGTATGGAAC-3'(서열번호 46)5'-GCTAAACAGAGGATATGTGTATGGAAC-3 '(SEQ ID NO: 46)
IUCD02R: IUCD02R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACTCATTAGCGCAAAACCAGTCC-3'(서열번호 47)
5'-GCAACACTTCTTCACGAGGCAGACTCATTAGCGCAAAACCAGTCC-3 '(SEQ ID NO: 47)
도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 4B, it was confirmed that the genome DNA was reduced in size compared to the wild-type Acinetobacter baumannii strains of the Ashinotobacter baumanni mutant. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
2-12: 2-12:
rhbC3rhbC3
유전자가 결실된 Gene-deficient
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주의 제작 Production of mutant strains
S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 RHBC301F/RHBC301R/RHBC302F/RHBC302R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD13(pHKD01 with ΔrhbC3::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, rhbC3 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD12: ATCC 19606 with ΔrhbC3)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 rhbC3 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD12)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.
RHb301F / RHBC301R / RHBC302F / RHBC302R were used as S1 / S2 / S3 / S4 primers and pHKD13 (pHKD01 with ΔrhbC3 :: nptI; Cmr, Kmr) was used as a homologous recombination vector. -1, an Asnithobacter baumannii mutant (HKD12: ATCC 19606 with ΔrhbC3) in which the rhbC3 gene was deleted (FIG. 4) was prepared. At this time, the relative position of the target gene rhbC3 gene in the genomic DNA of the strain of Ashinobacterium Vaumani is shown in Fig. 4A. The result of electrophoresis of the genome DNA of the Ashinotobacter Vaumani mutant (HKD12) B of Fig.
RHBC301F: RHBC301F:
5'-ATTGTTTTTTGTTCGGTGTTCG-3'(서열번호 48)5'-ATTGTTTTTTGTTCGGTGTTCG-3 '(SEQ ID NO: 48)
RHBC301R: RHBC301R:
5'-GTCCAATTCCAATAAAATCAAGCATCTGACTACATCCTATTCAGAATCTTAAGC-3'(서열번호 49)5'-GTCCAATTCCAATAAAATCAAGCATCTGACTACATCCTATTCAGAATCTTAAGC-3 '(SEQ ID NO: 49)
RHBC302F: RHBC302F:
5'-ATGCTTGATTTTATTGGAATTGGA-3'(서열번호 50)5'-ATGCTTGATTTTATTGGAATTGGA-3 '(SEQ ID NO: 50)
RHBC302R: RHBC302R:
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACTGCTGCAATAACACAATCAGCC-3'(서열번호 51)
5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACTGCTGCAATAACACAATCAGCC-3 '(SEQ ID NO: 51)
도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.
As shown in Fig. 4B, it was confirmed that the genome DNA was reduced in size compared to the wild-type Acinetobacter baumannii strains of the Ashinotobacter baumanni mutant. From these results, it was found that the target gene was deleted in the Asnithobacter baumannii mutant provided in the present invention.
실시예Example
3: 실시간 3: Real time
PCRPCR
분석 analysis
상기 실시예 2에서 제조된 각각의 아시네토박터 바우마니 변이주에서 표적 유전자가 발현되는 지의 여부를 확인하기 위하여, 실시간 PCR 분석을 수행하였다.
Real-time PCR analysis was carried out to confirm whether the target gene was expressed in each of the strains of Asmanobacter baumannii prepared in Example 2 above.
실시예Example
3-1: 3-1:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD01HKD01
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
0.15mM의 철 포획물질(2,2-dipyridyl)을 포함하는 LB 배지에 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)와 basD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01)를 접종하고, OD600에서 흡광도가 0.7이 될때까지 배양하였으며, 배양이 종료된 후, 배양된 각 균체로부터 전사체를 수득하였다. 상기 전사체로부터 합성된 cDNA를 주형으로 하고, S5/S6 프라이머를 사용한 실시간 PCR을 수행하여 표적 유전자의 발현수준을 정량분석하였다(도 3의 C). 이때, 발현수준의 정량분석은 표적 유전자의 발현수준을 측정하고, 상기 측정된 값을 내부대조군인 16S rRNA의 발현수준으로 정상화(normalization)하여 산출한 것을 사용하여 수행하였다.
(WT) and an Asnithobacter baumannii mutant (HKD01) in which the basD gene had been deleted were inoculated in an LB medium containing 0.15 mM iron capturing material (2,2-dipyridyl) The culture was continued until the absorbance reached 0.7, and a transcript was obtained from each cultured cell after the completion of the culture. Real-time PCR using the cDNA synthesized from the transcript as a template and S5 / S6 primer was performed to quantitatively analyze the expression level of the target gene (FIG. 3C). At this time, quantitative analysis of the expression level was carried out by measuring the expression level of the target gene and normalizing the measured value to the expression level of the internal control 16S rRNA.
S5 primer(BASD03F): S5 primer (BASD03F):
5'-GACTGACCCAAACACCTCAA-3'(서열번호 52)5'-GACTGACCCAAACACCTCAA-3 '(SEQ ID NO: 52)
S6 primer(BASD03R): S6 primer (BASD03R):
5'-GGAAATGCTTCTTGGGCATAATC-3'(서열번호 53)
5'-GGAAATGCTTCTTGGGCATAATC-3 '(SEQ ID NO: 53)
도 3의 C에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 basD 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 53배(log101.72) 증가)된 반면, basD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01)에서는 표적 유전자인 basD 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 3C, the expression level of the basD gene, the target gene, was increased (the expression level was increased 53 times (log 10 1.72)) in the wild-type Asnithobacter baumanni strain (WT) It was confirmed that the basD gene, the target gene, was not expressed in the Asnithobacter baumannii mutant (HKD01) in which the basD gene was deleted.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 basD 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the basD gene, which is a target gene essential for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashinotobacter baumanni mutant strain (HKD01).
실시예Example
3-2: 3-2:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD02HKD02
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 bauA 유전자가 결실된 HKD02를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 BAUA03F/BAUA03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD02)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 3의 C).
The same method as in Example 3-1 was used, except that HKD02 in which the bauA gene was deleted as the Aspinabacter baumannii mutant and BAUA03F / BAUA03R was used as the S5 / S6 primers, respectively, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene in the baumannii mutant (HKD02) (Fig. 3C).
BAUA03F: BAUA03F:
5'-CACGTGGTGTTAACGTCTCTAC-3'(서열번호 54)5'-CACGTGGTGTTAACGTCTCTAC-3 '(SEQ ID NO: 54)
BAUA03R: BAUA03R:
5'-CACGAATCATTGCGCCTTTATC-3'(서열번호 55)
5'-CACGAATCATTGCGCCTTTATC-3 '(SEQ ID NO: 55)
상기 도 3의 C에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 bauA 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 91배(log101.95) 증가)된 반면, bauA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD02)에서는 표적 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 3C, the bauA gene, which is a target gene, is expressed at a high level (the expression level is increased 91 times (log 10 1.95)) in the wild type Ashtonobacter baumanni strain (WT) , and that the target gene was not expressed at all in the Asnithobacter baumanni mutant strain (HKD02) in which the bauA gene was deleted.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD02)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 bauA 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the bauA gene, which is an essential gene for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD02).
실시예Example
3-3: 3-3:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD03HKD03
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 rimL 유전자가 결실된 HKD03를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 RIML03F/RIML03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서의 표적 유전자인 rimL 유전자의 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).
The same procedure as in Example 3-1 was carried out except that HKD03 in which the rimL gene was deleted as the Ashinatoottera baumannii mutant and RIML03F / RIML03R was used as the S5 / S6 primer, respectively, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene rimL gene in the Baumani mutant (HKD03) (Fig. 5).
RIML03F: RIML03F:
5'-GCTACTCATTACGTCAGGTTCAG-3'(서열번호 56)5'-GCTACTCATTACGTCAGGTTCAG-3 '(SEQ ID NO: 56)
RIML03R: RIML03R:
5'-CCACTGAGGAATAACGTGTGG-3'(서열번호 57)
5'-CCACTGAGGAATAACGTGTGG-3 '(SEQ ID NO: 57)
도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 rimL 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 198배(log102.30) 증가)된 반면, rimL 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 표적 유전자인 rimL 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 5, the expression level of the target gene, rimL gene (expression level: 198 times (log 10 2.30)) was increased in the wild type Ashtonobacter baumanni strain (WT) under iron deficiency condition, whereas the rimL gene (HKD03) showed that the target gene, rimL gene, was not expressed at all.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 rimL 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the rimL gene, which is a target gene essential for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD03).
실시예Example
3-4: 3-4:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD04HKD04
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 piuB 유전자가 결실된 HKD04를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 PIUB03F/PIUB03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD04)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).
The same procedure as in Example 3-1 was carried out except that HKD04 in which the piuB gene was deleted as the Ashinatootberger baumannii mutant and PIUB03F / PIUB03R was used as the S5 / S6 primer, respectively, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene in the baumannii mutant (HKD04) (Fig. 5).
PIUB03F: PIUB03F:
5'-AAAGATGGCGAGTCACAGTAG-3'(서열번호 58)5'-AAAGATGGCGAGTCACAGTAG-3 '(SEQ ID NO: 58)
PIUB03R: PIUB03R:
5'-CCCAATAGCTCTCCGGTATTAG-3'(서열번호 59)
5'-CCCAATAGCTCTCCGGTATTAG-3 '(SEQ ID NO: 59)
도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 piuB 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 8배(log100.89) 증가)된 반면, piuB 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD04)에서는 표적 유전자인 piuB 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 5, the expression level of the target gene, piuB gene (expression level 8 times (log 10 0.89)) was increased in the wild-type Asnithobacter baumanni strain (WT) under iron deficiency conditions, whereas the piuB gene (HKD04) showed that the target gene, piuB gene, was not expressed at all.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 piuB 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the piuB gene, which is a target gene essential for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD03).
실시예Example
3-5: 3-5:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD05HKD05
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 cirA 유전자가 결실된 HKD05를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 CIRA03F/CIRA03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD05)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).
The same method as in Example 3-1 was used except that HKD05 in which the cirA gene had been deleted as the Ashinatto bacterium mutant and CIRA03F / CIRA03R was used as the S5 / S6 primers, respectively, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene in the baumannii mutant (HKD05) (Fig. 5).
CIRA03F: CIRA03F:
5'-GTAGTAACTGCGACTCGTACAC-3'(서열번호 60)5'-GTAGTAACTGCGACTCGTACAC-3 '(SEQ ID NO: 60)
CIRA03R: CIRA03R:
5'-GCCGTAGCTTGCTGGATAA-3'(서열번호 61)
5'-GCCGTAGCTTGCTGGATAA-3 '(SEQ ID NO: 61)
도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 cirA 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 26배(log101.41) 증가)된 반면, cirA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD05)에서는 표적 유전자인 cirA 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.5, the expression of the target gene, cirA gene (expression level 26 times (log 10 1.41)) was increased in the wild-type Asnithobacter baumanni strain (WT) under iron deficiency conditions, whereas the cirA gene (HKD05) showed that the target gene, cirA gene, was not expressed at all.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 cirA 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the cirA gene, which is an essential target gene for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD03).
실시예Example
3-6: 3-6:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD06HKD06
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 menG 유전자가 결실된 HKD06를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 MENG03F/MENG03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD06)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).
The same method as in Example 3-1 was used, except that HKD06 in which the menG gene was deleted as the Ashinabotobacter baumanni mutant was used and MENG03F / MENG03R was used as the S5 / S6 primer in each case, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene in the Baumani mutant (HKD06) (Fig. 5).
MENG03F: MENG03F:
5'-CGTTGTGGTCTTAGGTGCTATT-3'(서열번호 62)5'-CGTTGTGGTCTTAGGTGCTATT-3 '(SEQ ID NO: 62)
MENG03R: MENG03R:
5'-CCCTTCATTGCGAGTGGTTA-3'(서열번호 63)
5'-CCCTTCATTGCGAGTGGTTA-3 '(SEQ ID NO: 63)
도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 menG 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 3배(log100.46) 증가)된 반면, menG 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD06)에서는 표적 유전자인 menG 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 5, in the wild type Ashtonobacter baumannii strain (WT) under the condition of iron deficiency, the expression level of the target gene, menG gene was increased to 3 times (log 10 0.46) (HKD06) showed no expression of the target gene, menG, at all.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 menG 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the menG gene, which is an essential target gene for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD03).
실시예Example
3-7: 3-7:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD07HKD07
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 fhuF 유전자가 결실된 HKD07를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 FHUF03F/FHUF03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD07)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).
The same procedure as in Example 3-1 was carried out except that HKD07 in which the fhuF gene was deleted as the Ashinatoottera baumannii mutant and FHUF03F / FHUF03R was used as the S5 / S6 primer, respectively, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene in the baumannii mutant (HKD07) (Fig. 5).
FHUF03F: FHUF03F:
5'-GTGCGTTTATGGAATGGATGG-3'(서열번호 64)5'-GTGCGTTTATGGAATGGATGG-3 '(SEQ ID NO: 64)
FHUF03R: FHUF03R:
5'-AGGGACAATTACGGCATAAGG-3'(서열번호 65)
5'-AGGGACAATTACGGCATAAGG-3 '(SEQ ID NO: 65)
도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 fhuF 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 10배(log101.00) 증가)된 반면, fhuF 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD07)에서는 표적 유전자인 fhuF 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 5, in the wild-type Asnithobacter baumanni strain (WT) under the condition of iron deficiency, the expression level of the target gene, fhuF gene was increased to 10 times (log 10 1.00) (HKD07) showed that the target gene, fhuF gene, was not expressed at all.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 fhuF 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the fhuF gene, which is an essential gene for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD03).
실시예Example
3-8: 3-8:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD08HKD08
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 rhbC1 유전자가 결실된 HKD08를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 RHBC103F/RHBC103R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD08)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).
The same procedure as in Example 3-1 was carried out except that HKD08 in which the rhbC1 gene was deleted as the Ashinatootberta baumannii mutant was used and RHBC103F / RHBC103R was used as the S5 / S6 primer, respectively, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene in the baumannii mutant (HKD08) (Fig. 5).
RHBC103F: RHBC103F:
5'-CAAAGCTTGGCACATAGATTCC-3'(서열번호 66)5'-CAAAGCTTGGCACATAGATTCC-3 '(SEQ ID NO: 66)
RHBC103R: RHBC103R:
5'-CTTGCTGACTGAGACCTTCTT-3'(서열번호 67)
5'-CTTGCTGACTGAGACCTTCTT-3 '(SEQ ID NO: 67)
도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 rhbC1 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 104배(log102.01) 증가)된 반면, rhbC1 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD08)에서는 표적 유전자인 rhbC1 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 5, while under conditions of iron deficient in the wild type Acinetobacter baumannii strain (WT) in the target gene of rhbC1 gene expression (expression amount is 104 times (log 10 2.01) increase) at a high level, rhbC1 gene (HKD08) showed that the target gene, rhbC1 gene, was not expressed at all.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 rhbC1 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the rhnC1 gene, which is a target gene essential for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD03).
실시예Example
3-9: 3-9:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD09HKD09
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 rhbC2 유전자가 결실된 HKD09를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 RHBC203F/RHBC203R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD09)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).
The same procedure as in Example 3-1 was carried out except that HKD09 in which the rhbC2 gene was deleted as the Ashinatto bacterium mutant and RHBC203F / RHBC203R was used as the S5 / S6 primer, respectively, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene in the baumannii mutant (HKD09) (Fig. 5).
RHBC203F: RHBC203F:
5'-GGCAAAGTCAGGATCGCTATT-3'(서열번호 68)5'-GGCAAAGTCAGGATCGCTATT-3 '(SEQ ID NO: 68)
RHBC203R: RHBC203R:
5'-ACGTGAGCTTGATGTGTTAGTT-3'(서열번호 69)
5'-ACGTGAGCTTGATGTGTTAGTT-3 '(SEQ ID NO: 69)
도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 rhbC2 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 18배(log101.25) 증가)된 반면, rhbC2 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD09)에서는 표적 유전자인 rhbC2 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in Fig. 5, in the wild type Ashtonobacter baumanni strain (WT) under the condition of iron deficiency, the expression level of the target gene rhbC2 gene was increased (the expression level was increased 18 times (log 10 1.25)), whereas the rhbC2 gene (HKD09) showed that the target gene, rhbC2 gene, was not expressed at all.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 rhbC2 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the rhbC2 gene, which is a target gene essential for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD03).
실시예Example
3-10: 3-10:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD10HKD10
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 araJ 유전자가 결실된 HKD10를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 ARAJ03F/ARAJ03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD10)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).
The same procedure as in Example 3-1 was carried out except that HKD10 in which the araJ gene had been deleted as the Aspinobacter baumannii mutant and ARAJ03F / ARAJ03R was used as the S5 / S6 primer, respectively, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene in the baumannii mutant (HKD10) (Fig. 5).
ARAJ03F: ARAJ03F:
5'-CATGGCTTAGGAATGGGACTT-3'(서열번호 70)5'-CATGGCTTAGGAATGGGACTT-3 '(SEQ ID NO: 70)
ARAJ03R: ARAJ03R:
5'-GGCCGCTTGAGTAACTAGATG-3'(서열번호 71)
5'-GGCCGCTTGAGTAACTAGATG-3 '(SEQ ID NO: 71)
도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 araJ 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 27배(log101.41) 증가)된 반면, araJ 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD10)에서는 표적 유전자인 araJ 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 5, the expression level of the araJ gene (expression level 27 times (log 10 1.41) increased) in the wild-type Asnithobacter baumanni strain (WT) under iron deficiency conditions, whereas the araJ gene (HKD10) showed that the target gene, araJ gene, was not expressed at all.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 araJ 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that in the case of the Ashinotobacter baumanni mutant strain (HKD03), the araJ gene, which is a target gene essential for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted.
실시예Example
3-11: 3-11:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD11HKD11
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 iucD 유전자가 결실된 HKD11를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 IUCD03F/IUCD03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD11)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).
The same method as in Example 3-1 was carried out except that HKD11 in which the iucD gene was deleted as the Ashinatootberger baumani mutant and IUCD03F / IUCD03R was used as the S5 / S6 primer, respectively, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene in the baumannii mutant (HKD11) (Fig. 5).
IUCD03F: IUCD03F:
5'-TGATGTGGAGGTAGTGTGTAATG-3'(서열번호 72)5'-TGATGTGGAGGTAGTGTGTAATG-3 '(SEQ ID NO: 72)
IUCD03R: IUCD03R:
5'-GCTTTCTGGTAAATGTGGAGTTG-3'(서열번호 73)
5'-GCTTTCTGGTAAATGTGGAGTTG-3 '(SEQ ID NO: 73)
도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 iucD 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 30배(log101.45) 증가)된 반면, iucD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD11)에서는 표적 유전자인 iucD 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 5, the expression level of the target gene iucD gene (expression level 30 times (log 10 1.45)) was increased in the wild-type Asnithobacter baumanni strain (WT) under iron deficiency conditions, whereas the iucD gene (HKD11) showed that the target gene, iucD gene, was not expressed at all in the Asnithobacter baumannii mutant (HKD11).
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 iucD 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the iucD gene, which is a target gene essential for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD03).
실시예Example
3-12: 3-12:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니Baumanni
변이주( Mutation
HKD12HKD12
)의 실시간 ) Real time
PCRPCR
분석 analysis
아시네토박터 바우마니 변이주로서 rhbC3 유전자가 결실된 HKD12를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 RHBC303F/RHBC303R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD12)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).
Using the same method as in Example 3-1, except that HKD12 in which the rhbC3 gene had been deleted as the Aspinabata baumannii mutant was used and RHBC303F / RHBC303R was used as the S5 / S6 primer, respectively, Real-time PCR analysis confirmed the deletion of the target gene in the Baumani mutant (HKD12) (Fig. 5).
RHBC303F: RHBC303F:
5'-GAGCAGCCAATTTCAGATCAAG-3'(서열번호 74)5'-GAGCAGCCAATTTCAGATCAAG-3 '(SEQ ID NO: 74)
RHBC303R: RHBC303R:
5'-GAGCTTGCCAAGGATGTAGT-3'(서열번호 75)
5'-GAGCTTGCCAAGGATGTAGT-3 '(SEQ ID NO: 75)
도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 rhbC3 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 102배(log102.00) 증가)된 반면, rhbC3 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD12)에서는 표적 유전자인 rhbC3 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 5, in the case of the wild type Ashtonobacter baumanni strain (WT) under the condition of iron deficiency, the rhbC3 gene as a target gene was expressed at a high level (the expression level was increased by 102 times (log 10 2.00)), whereas the rhbC3 gene (HKD12) showed that the target gene, rhbC3 gene, was not expressed at all.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 rhbC3 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the rhbC3 gene, which is a target gene essential for obtaining iron at the time of iron deficiency, was deleted in the Ashtonobacter baumannii mutant (HKD03).
실시예Example
4: 4:
아시네토박터Ashton Bauber
바우마니에서From Baumanni
복제되지 않는 자살벡터를 이용하여, 2종의 표적 유전자가 결실된 변이 균주의 제작 Production of a mutant strain in which two target genes have been deleted using a non-replicating suicide vector
실시예 2-2에서 제작한 bauA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 균주(HKD02)에 실시예 2-5에서 사용된 상동재조합 벡터 pHKD06를 도입하고, 실시예 2-1의 방법으로 배양하여, 상기 아시네토박터 바우마니 균주(HKD02)에서 cirA 유전자가 추가로 결실된 아시네토박터 바우마니 균주(HKD13)를 제작하였다. 상기 제작된 아시네토박터 바우마니 균주(HKD13)는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(ATCC 19606)에서 bauA 유전자와 cirA 유전자가 동시에 결실된 변이균주이며, 이를 확인하기 위하여, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD13)의 게놈 DNA를 전기영동하였다(도 6). The homologous recombinant vector pHKD06 used in Example 2-5 was introduced into the strain of Asnithobacter baumani (HKD02) in which the bauA gene prepared in Example 2-2 was deleted and cultured in the same manner as in Example 2-1, (HKD13) was obtained in which the cirA gene was further deleted from the Ashinotobacter baumanni strain (HKD02). In order to confirm that the bacterium bauA gene and the cirA gene have been deleted in the wild type Ashtonobacter baumanni strain (ATCC 19606), the Ashinotobacter baumanni strain (HKD13) (HKD13) were electrophoresed (FIG. 6).
도 6은 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(ATCC 19606)에서 bauA 유전자와 cirA 유전자가 동시에 결실된 변이균주인 아시네토박터 바우마니 균주(HKD13)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.6 is a photograph showing the result of electrophoresis of the genomic DNA of the strain Ashinotobacter baumanni (HKD13), which is a mutant strain in which the bauA gene and the cirA gene are simultaneously deleted in the wild-type Asnithobacter baumanni strain (ATCC 19606).
상기 도 6에서 보듯이, 상기 제작된 변이균주인 아시네토박터 바우마니 균주(HKD13)는 bauA 유전자와 cirA 유전자가 동시에 결실된 변이균주임을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 6, it was found that the strain Ashnootobacter baumanni (HKD13) produced was a mutant strain in which the bauA gene and the cirA gene were simultaneously deleted.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Suicide vector for producing murtant strain of multidrug-resistant strain <130> KPA140482-KR <160> 75 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pHKD01 <400> 1 ccatgtcagc cgttaagtgt tcctgtgtca ctcaaaattg ctttgagagg ctctaagggc 60 ttctcagtgc gttacatccc tggcttgttg tccacaaccg ttaaacctta aaagctttaa 120 aagccttata tattcttttt tttcttataa aacttaaaac cttagaggct atttaagttg 180 ctgatttata ttaattttat tgttcaaaca tgagagctta gtacgtgaaa catgagagct 240 tagtacgtta gccatgagag cttagtacgt tagccatgag ggtttagttc gttaaacatg 300 agagcttagt acgttaaaca tgagagctta gtacgtgaaa catgagagct tagtacgtac 360 tatcaacagg ttgaactgct gatcttcaga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggat 420 ccagccgacc aggctttcca cgcccgcgtg ccgctccatg tcgttcgcgc ggttctcgga 480 aacgcgctgc cgcgtttcgt gattgtcacg ctcaagcccg tagtcccgtt cgagcgtcgc 540 gcagaggtca gcgagggcgc ggtaggcccg atacggctca tggatggtgt ttcgggtcgg 600 gtgaatcttg ttgatggcga tatggatgtg caggttgtcg gtgtcgtgat gcacggcact 660 gacgcgctga tgctcggcga agccaagccc agcgcagatg cggtcctcaa tcgcgcgcaa 720 cgtctccgcg tcgggcttct ctcccgcgcg gaagctaacc agcaggtgat aggtcttgtc 780 ggcctcggaa cgggtgttgc cgtgctgggt cgccatcacc tcggccatga cagcgggcag 840 ggtgtttgcc tcgcagttcg tgacgcgcac gtgacccagg cgctcggtct tgccttgctc 900 gtcggtgatg tacttcacca gctccgcgaa gtcgctcttc ttgatggagc gcatggggac 960 gtgcttggca atcacgcgca ccccccggcc gttttagcgg ctaaaaaagt catggctctg 1020 ccctcgggcg gaccacgccc atcatgacct tgccaagctc gtcctgcttc tcttcgatct 1080 tcgccagcag ggcgaggatc gtggcatcac cgaaccgcgc cgtgcgcggg tcgtcggtga 1140 gccagagttt cagcaggccg cccaggcggc ccaggtcgcc attgatgcgg gccagctcgc 1200 ggacgtgctc atagtccacg acgcccgtga ttttgtagcc ctggccgacg gccagcaggt 1260 aggccgacag gctcatgccg gccgccgccg ccttttcctc aatcgctctt cgttcgtctg 1320 gaaggcagta caccttgata ggtgggctgc ccttcctggt tggcttggtt tcatcagcca 1380 tccgcttgcc ctcatctgtt acgccggcgg tagccggcca gcctcgcaga gcaggattcc 1440 cgttgagcac cgccaggtgc gaataaggga cagtgaagaa ggaacacccg ctcgcgggtg 1500 ggcctacttc acctatcctg cccggctgac gccgttggat acaccaagga aagtctacac 1560 gaaccctttg gcaaaatcct gtatatcgtg cgaaaaagga tggatatacc gaaaaaatcg 1620 ctataatgac cccgaagcag ggttatgcag cggaaaagcg ctgcttccct gctgttttgt 1680 ggaatatcta ccgactggaa acaggcaaat gcaggaaatt actgaactga ggggacaggc 1740 gagagacgat gccaaagagc tacaccgacg agctggccga gtgggttgaa tcccgcgcgg 1800 ccaagaagcg ccggcgtgat gaggctgcgg ttgcgttcct ggcggtgagg gcggatgtcg 1860 aggcggcgtt agcgtccggc tatgcgctcg tcaccatttg ggagcacatg cgggaaacgg 1920 ggaaggtcaa gttctcctac gagacgttcc gctcgcacgc caggcggcac atcaaggcca 1980 agcccgccga tgtgcccgca ccgcaggcca aggctgcgga acccgcgccg gcacccaaga 2040 cgccggagcc acggcggccg aagcaggggg gcaaggctga aaagccggcc cccgctgcgg 2100 ccccgaccgg cttcaccttc aacccaacac cggacaaaaa ggatcctcta cgccggacgc 2160 atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaagt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc 2220 accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt 2280 atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgct gcctcgcgcg 2340 tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 2400 tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 2460 gtgtcggggc gcagccatga cccgggaatt acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact 2520 gttgtaattc attaagcatt ctgccgacat ggaagccatc acaaacggca tgatgaacct 2580 gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa 2640 cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc 2700 agggattggc tgagacgaaa aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt 2760 tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt 2820 ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag 2880 ggtgaacact atcccatatc accagctcac cgtctttcat tgccatacgg aattccggat 2940 gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt 3000 tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt 3060 gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg 3120 tggtatatcc agtgattttt ttctccattt 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catgagagct 240 tagtacgtta gccatgagag cttagtacgt tagccatgag ggtttagttc gttaaacatg 300 agagcttagt acgttaaaca tgagagctta gtacgtgaaa catgagagct tagtacgtac 360 tatcaacagg ttgaactgct gatcttcaga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggat 420 ccagccgacc aggctttcca cgcccgcgtg ccgctccatg tcgttcgcgc ggttctcgga 480 aacgcgctgc cgcgtttcgt gattgtcacg ctcaagcccg tagtcccgtt cgagcgtcgc 540 gcagaggtca gcgagggcgc ggtaggcccg atacggctca tggatggtgt ttcgggtcgg 600 gtgaatcttg ttgatggcga tatggatgtg caggttgtcg gtgtcgtgat gcacggcact 660 gcgcgctga tgctcggcga agccaagccc agcgcagatg cggtcctcaa tcgcgcgcaa 720 cgtctccgcg tcgggcttct ctcccgcgcg gaagctaacc agcaggtgat aggtcttgtc 780 ggcctcggaa cgggtgttgc cgtgctgggt cgccatcacc tcggccatga cagcgggcag 840 gt; gtcggtgatg tacttcacca gctccgcgaa gtcgctcttc ttgatggagc gcatggggac 960 gtgcttggca atcacgcgca ccccccggcc gttttagcgg ctaaaaaagt catggctctg 1020 ccctcgggcg gaccacgccc atcatgacct tgccaagctc gtcctgcttc tcttcgatct 1080 tcgccagcag ggcgaggatc gtggcatcac cgaaccgcgc cgtgcgcggg tcgtcggtga 1140 gccagagttt cagcaggccg cccaggcggc ccaggtcgcc attgatgcgg gccagctcgc 1200 ggacgtgctc atagtccacg acgcccgtga ttttgtagcc ctggccgacg gccagcaggt 1260 aggccgacag gctcatgccg gccgccgccg ccttttcctc aatcgctctt cgttcgtctg 1320 gaaggcagta caccttgata ggtgggctgc ccttcctggt tggcttggtt tcatcagcca 1380 tccgcttgcc ctcatctgtt acgccggcgg tagccggcca gcctcgcaga gcaggattcc 1440 cgttgagcac cgccaggtgc gaataaggga cagtgaagaa ggaacacccg ctcgcgggtg 1500 ggcctacttc acctatcctg cccggctgac gccgttggat acaccaagga aagtctacac 1560 gaaccctttg gcaaaatcct gtatatcgtg cgaaaaagga tggatatacc gaaaaaatcg 1620 ctataatgac cccgaagcag ggttatgcag cggaaaagcg ctgcttccct gctgttttgt 1680 ggaatatcta ccgactggaa acaggcaaat gcaggaaatt actgaactga ggggacaggc 1740 gagagacgat gccaaagagc tacaccgacg agctggccga gtgggttgaa tcccgcgcgg 1800 ccaagaagcg ccggcgtgat gaggctgcgg ttgcgttcct ggcggtgagg gcggatgtcg 1860 aggcggcgtt agcgtccggc tatgcgctcg tcaccatttg ggagcacatg cgggaaacgg 1920 ggaaggtcaa gttctcctac gagacgttcc gctcgcacgc caggcggcac atcaaggcca 1980 agcccgccga tgtgcccgca ccgcaggcca aggctgcgga acccgcgccg gcacccaaga 2040 cgccggagcc acggcggccg aagcaggggg gcaaggctga aaagccggcc cccgctgcgg 2100 ccccgaccgg cttcaccttc aacccaacac cggacaaaaa ggatcctcta cgccggacgc 2160 atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaagt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc 2220 accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt 2280 atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgct gcctcgcgcg 2340 tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 2400 tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 2460 gtgtcggggc gcagccatga cccgggaatt acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact 2520 gttgtaattc attaagcatt ctgccgacat ggaagccatc acaaacggca tgatgaacct 2580 gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa 2640 cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc 2700 agggattggc tgagacgaaa aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt 2760 tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt 2820 ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag 2880 ggtgaacact atcccatatc accagctcac cgtctttcat tgccatacgg aattccggat 2940 gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt 3000 tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt 3060 gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg 3120 tggtatatcc agtgattttt ttctccattt tagcttcctt agctcctgcc ctatgggatt 3180 cacctttatg ttgataagaa ataaaagaaa atgccaatag gatatcggca ttttcttttg 3240 cgtttttatt tgttaactgt taattgtcct tgttcaagga tgctgtcttt gacaacagat 3300 gttttcttgc ctttgatgtt cagcaggaag cttggcgcaa acgttgattg tttgtctgcg 3360 tagaatcctc tgtttgtcat atagcttgta atcacgacat tgtttccttt cgcttgaggt 3420 acagcgaagt gtgagtaagt aaaggttaca tcgttaggat caagatccat ttttaacaca 3480 aggccagttt tgttcagcgg cttgtatggg ccagttaaag aattagaaac ataaccaagc 3540 atgtaaatat cgttagacgt aatgccgtca atcgtcattt ttgatccgcg ggagtcagtg 3600 aacaggtacc atttgccgtt cattttaaag acgttcgcgc gttcaatttc atctgttact 3660 gtgttagatg caatcagcgg tttcatcact tttttcagtg tgtaatcatc gtttagctca 3720 atcataccga gagcgccgtt tgctaactca gccgtgcgtt ttttatcgct ttgcagaagt 3780 ttttgacttt cttgacggaa gaatgatgtg cttttgccat agtatgcttt gttaaataaa 3840 gattcttcgc cttggtagcc atcttcagtt ccagtgtttg cttcaaatac taagtatttg 3900 tggcctttat cttctacgta gtgaggatct ctcagcgtat ggttgtcgcc tgagctgtag 3960 ttgccttcat cgatgaactg ctgtacattt tgatacgttt ttccgtcacc gtcaaagatt 4020 gatttataat cctctacacc gttgatgttc aaagagctgt ctgatgctga tacgttaact 4080 tgtgcagttg tcagtgtttg tttgccgtaa tgtttaccgg agaaatcagt gtagaataaa 4140 cggatttttc cgtcagatgt aaatgtggct gaacctgacc attcttgtgt ttggtctttt 4200 aggatagaat catttgcatc gaatttgtcg ctgtctttaa agacgcggcc agcgtttttc 4260 cagctgtcaa tagaagtttc gccgactttt tgatagaaca tgtaaatcga tgtgtcatcc 4320 gcatttttag gatctccggc taatgcaaag acgatgtggt agccgtgata gtttgcgaca 4380 gtgccgtcag cgttttgtaa tggccagctg tcccaaacgt ccaggccttt tgcagaagag 4440 atatttttaa ttgtggacga atcgaattca ggaacttgat atttttcatt tttttgctgt 4500 tcagggattt gcagcatatc atggcgtgta atatgggaaa tgccgtatgt ttccttatat 4560 ggcttttggt tcgtttcttt cgcaaacgct tgagttgcgc ctcctgccag cagtgcggta 4620 gtaaaggtta atactgttgc ttgttttgca aactttttga tgttcatcgt tcatgtctcc 4680 ttttttatgt actgtgttag cggtctgctt cttccagccc tcctgtttga agatggcaag 4740 ttagttacgc acaataaaaa aagacctaaa atatgtaagg ggtgacgcca aagtatacac 4800 tttgcccttt acacatttta ggtcttgcct gctttatcag taacaaaccc gcgcgattta 4860 cttttcgacc tcattctatt agactctcgt ttggattgca actggtctat tttcctcttt 4920 tgtttgatag aaaatcataa aaggatttgc agactacggg cctaaagaac taaaaaatct 4980 atctgtttct tttcattctc tgtatttttt atagtttctg ttgcatgggc ataaagttgc 5040 ctttttaatc acaattcaga aaatatcata atatctcatt tcactaaata atagtgaacg 5100 gcaggtatat gtgatgggtt aaaaaggatc gatcctctag agtcgacctg cagttttctg 5160 cagtgcgcag cggccgcaga tctcctcgaa gactgcaggt cgacggatcc caagcttctt 5220 ctagaggtac cgcatgcgat atcgagctct cccgggaatt ccacaaattg ttatccgctc 5280 acaattccac atgtggaatt ccacatgtgg aattc 5315 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaagcaattg agcggttcag g 21 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaatgatgaa agttcaaaat acgaattgtt aatcatttcc aattttgctg t 51 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttcgtatttt gaactttcat cattttgg 28 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcaacacctt cttcacgagg cagactgtgc aaacaggtta aacgcag 47 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtctgcctcg tgaagaaggt g 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gatccgtcga cctgcagg 18 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtcgatttgg agaaaacgta agc 23 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cataaatttt cactattttg ctatgataaa aaaacccgca atcgc 45 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 catagcaaaa tagtgaaaat ttatgctc 28 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gcaacacctt cttcacgagg cagacatcat agcggcagct gtcac 45 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 actttgcttc tatctggatg cg 22 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cttgcaggtc tacccatacc agaaacggtc cttgctatga cataacc 47 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tttctggtat gggtagacct gc 22 <210> 15 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gcaacacctt cttcacgagg cagacgggat aaattgatca agatcgg 47 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ggcttaaatc tgggattgac tgg 23 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cccaaaataa tgatgcaaag ctcatttaag ccactcccca tttagcta 48 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 atgagctttg catcattatt ttgg 24 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gcaacacctt cttcacgagg cagacgcaca tgtcttctac tacagccg 48 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 agttagcgaa aataggtcgc gtacc 25 <210> 21 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 acaggcatct ctttcgttag ttgcattctc cctagcccaa atgttactca ac 52 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tgcaactaac gaaagagatg cctg 24 <210> 23 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gcaacacctt cttcacgagg cagacaacag tccagtaaag gccatcacc 49 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tggtctgtac ttgctcatgc gt 22 <210> 25 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cgaacattaa tgagaatgat ttttacttta aattttccga tttcttttaa acgtaag 57 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 taaaaatcat tctcattaat gttcgtatt 29 <210> 27 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gcaacacctt cttcacgagg cagacgagta atcaggtccg tagtcagtat cc 52 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ccgataggaa ttaaagctct tgg 23 <210> 29 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ctttagaagt atcaatttga ttcatcgtca gatatcacta acaatttaag gc 52 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 atgaatcaaa ttgatacttc taaagcact 29 <210> 31 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gcaacacctt cttcacgagg cagacagcaa ctttacgacc tgccg 45 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gcccaacaat ctctacgcac 20 <210> 33 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 aagacatatt catcgtcaga tatcaagata aatctcactt cacctgcaat 50 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tgatatctga cgatgaatat gtcttttaa 29 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gcaacacctt cttcacgagg cagacgactc aatccgaacc gtacg 45 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ccatgatcat gctaacctta gcag 24 <210> 37 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gctgaagtgc attcatagat aaatctttta ttaatcctat ttctttaatt ggtcg 55 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gatttatcta tgaatgcact tcagcc 26 <210> 39 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gcaacacctt cttcacgagg cagacccaag agctttaatt cctatcgg 48 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gggtacaact ccacatttac cag 23 <210> 41 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 tgtaattgtc ccatttttat taatcatcct ctgtttagct tattcaatat gc 52 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gattaataaa aatgggacaa ttacatcc 28 <210> 43 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gcaacacctt cttcacgagg cagacgcaac cagtctgtaa taattggc 48 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gatattggtt tacgtggatg gc 22 <210> 45 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 tccatacaca tatcctctgt ttagctcaag cataactcac atccttctgt 50 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gctaaacaga ggatatgtgt atggaac 27 <210> 47 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gcaacacctt cttcacgagg cagactcatt agcgcaaaac cagtcc 46 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 attgtttttt gttcggtgtt cg 22 <210> 49 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gtccaattcc aataaaatca agcatctgac tacatcctat tcagaatctt aagc 54 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 atgcttgatt ttattggaat tgga 24 <210> 51 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gcaacacctt cttcacgagg cagactgctg caataacaca atcagcc 47 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gactgaccca aacacctcaa 20 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ggaaatgctt cttgggcata atc 23 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 cacgtggtgt taacgtctct ac 22 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 cacgaatcat tgcgccttta tc 22 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gctactcatt acgtcaggtt cag 23 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 ccactgagga ataacgtgtg g 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 aaagatggcg agtcacagta g 21 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 cccaatagct ctccggtatt ag 22 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 gtagtaactg cgactcgtac ac 22 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 gccgtagctt gctggataa 19 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 cgttgtggtc ttaggtgcta tt 22 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 cccttcattg cgagtggtta 20 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 gtgcgtttat ggaatggatg g 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 agggacaatt acggcataag g 21 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 caaagcttgg cacatagatt cc 22 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 cttgctgact gagaccttct t 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 ggcaaagtca ggatcgctat t 21 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 acgtgagctt gatgtgttag tt 22 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 catggcttag gaatgggact t 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ggccgcttga gtaactagat g 21 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 tgatgtggag gtagtgtgta atg 23 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 gctttctggt aaatgtggag ttg 23 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 gagcagccaa tttcagatca ag 22 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 gagcttgcca aggatgtagt 20
Claims (10)
A protein encoding a protein exhibiting resistance to an antibiotic which comprises a polyclonal region including R6K ori, a mob RP4 gene, a cat gene, a sacB gene, and a restriction enzyme cleavage site cleaved at a blunt end, A suicide vector for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain.
상기 자살벡터는 다제내성 균주에서 복제되지 않는 특성을 나타내는 것인 자살벡터.
The method according to claim 1,
Wherein the suicide vector exhibits a property of not replicating in a multidrug-resistant strain.
상기 자살벡터는 도 1b에 도시된 개열지도를 갖는 것인 자살벡터.
The method according to claim 1,
Wherein the suicide vector has the cleavage map shown in FIG. 1B.
서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 자살벡터.
The method according to claim 1,
1. A suicide vector comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 1.
상기 다클론부위에, 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자를 변이시킬 수 있는 DNA 삽입단편이 도입되는 것인 자살벡터.
The method according to claim 1,
Wherein a DNA insert fragment capable of mutating the target gene contained in the genomic DNA of the multidrug resistant strain is introduced into the polyclonal region.
상기 DNA 삽입단편은 다제내성 균주의 게놈 DNA에 위치한 표적 유전자의 상류에 인접한 염기서열, 상기 표적 유전자의 하류에 인접한 염기서열 및 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제에 대한 저항성을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열을 순차적으로 포함하는 것인 자살벡터.
6. The method of claim 5,
Wherein the DNA-inserted fragment comprises a base sequence adjacent to an upstream of a target gene located in the genomic DNA of the multidrug-resistant strain, a base sequence adjacent to the downstream of the target gene, and a DNA encoding a protein exhibiting resistance to an antibiotic A suicide vector that sequentially contains the nucleotide sequence of the gene.
상기 다제내성 균주는 아시네토박터 바우마니 균주(Acinetobacter baumannii)인 것인 자살벡터.
The method according to claim 1,
Wherein said multidrug-resistant strain is an Acinetobacter baumannii strain.
A kit for producing a mutant strain of a multidrug-resistant strain comprising the suicide vector according to any one of claims 1 to 7.
다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자를 변이시킬 수 있는 DNA 삽입 단편 및 상기 자살벡터의 다클론부위를 평활말단으로 절단하기 위한 제한효소를 추가로 포함하는 것인 키트.
9. The method of claim 8,
A DNA insert fragment capable of mutating a target gene contained in the genomic DNA of the multidrug-resistant strain, and a restriction enzyme for cleaving the polyclonal region of the suicide vector into a blunt end.
상기 제한효소는 PstI, FspI, NotI, BglII 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 효소인 것인 키트.
10. The method of claim 9,
Wherein the restriction enzyme is an enzyme selected from the group consisting of PstI, FspI, NotI, BglII, and combinations thereof.
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Alexis H. K 등. JOURNAL OF BACTERIOLOGY. Vol. 191, No. 19, 페이지 5953-5963 (2009)* |
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