KR101638662B1 - Purification method for hyaluronic acid andor salts thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명에는, 고분자 히알루론산 및 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산 용액을 한외 여과막으로 투석 처리하는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제법이 개시된다. 본 발명의 방법에 따르면, 단백질, 핵산, 락트산, 금속 등이 제거된 고품질인 히알루론산 및/또는 그의 염을 간편하면서도 고수율로 공업적 규모로 제조할 수 있다.The present invention discloses a method for purifying hyaluronic acid and / or a salt thereof, which comprises a step of dialyzing a hyaluronic acid solution containing a polymer hyaluronic acid and a salt thereof and an impurity with an ultrafiltration membrane. According to the method of the present invention, high-quality hyaluronic acid and / or salt thereof from which protein, nucleic acid, lactic acid, metal and the like have been removed can be produced easily and at a high yield on an industrial scale.
Description
본 발명은, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for purifying hyaluronic acid and / or a salt thereof.
히알루론산은 화장품의 보습제 이외에, 안과, 정형 외과, 피부과 등에서 의약품으로서 이용되고 있다. 히알루론산은 동물 조직, 예를 들면 닭의 계관, 소의 눈의 유리체 등으로부터의 추출물에 의해 제조할 수 있지만, 협잡물로서 콘드로이틴황산 등이 혼입되거나, 조직 내에 포함되는 히알루로니다아제 등에 의해 저분자량화되기 쉽기 때문에, 히알루론산 생산능을 갖는 미생물을 배양하고, 배양액으로부터 히알루론산을 제조하는 것(발효법)도 행해지고 있다(비특허문헌 1 및 특허문헌 1).Hyaluronic acid is used as a medicine in ophthalmology, orthopedics, dermatology, and the like in addition to moisturizing agents for cosmetics. The hyaluronic acid can be produced by extracting from an animal tissue, for example, a chicken gauge, a vitreous body of a cattle eye, etc. However, it can be produced by incorporating chondroitin sulfate as an impurity or by hyaluronidase contained in a tissue (Fermentation method) of culturing a microorganism capable of producing hyaluronic acid and cultivating hyaluronic acid from a culture medium has also been carried out (Non-Patent Document 1 and Patent Document 1).
추출법이나 발효법에 의해 제조되는 히알루론산에는 단백질이나 발열성 물질 등이 불순물로서 존재하기 때문에, 이들을 분리 제거하여 고순도의 제품을 얻는 방법이 검토되고 있다. 특히 제조 초기 단계에서의 불순물의 제거는, 이후의 정제 공정의 부하의 경감을 가능하게 하고, 의약품으로서도 사용 가능한 고순도인 제품을 얻는 방법으로서의 개발이 기대되고 있다. 히알루론산을 고순도로 정제하는 방법으로서, 예를 들면 단백질, 핵산 등의 부생물 및 배지 유래의 무기염류를 제거하기 위해 히알루론산 및 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산 용액을, 플러스로 대전한 필터에 통과시킨 후에 수용성 유기 용제를 첨가하고, 히알루론산나트륨을 석출ㆍ침강시키고, 상청액을 추출함으로써 정제하는 방법이 알려져 있다(비특허문헌 2).Since hyaluronic acid produced by an extraction method or a fermentation method contains a protein or a pyrogenic substance as an impurity, a method of separating and removing the hyaluronic acid to obtain a high-purity product has been studied. Particularly, removal of impurities at the initial stage of production is expected to be developed as a method for reducing the load of the subsequent purification step and obtaining a product of high purity which can be used as a medicine. As a method for purifying hyaluronic acid in high purity, for example, a hyaluronic acid solution containing hyaluronic acid and its salts and impurities to remove inorganic salts derived from a by-product and a medium such as protein and nucleic acid, , A water-soluble organic solvent is added, and sodium hyaluronate is precipitated and settled, and the supernatant is extracted to obtain a purified solution (Non-Patent Document 2).
그러나, 공업적 규모로 의약품으로서 사용할 수 있는 고순도의 히알루론산류를 얻기 위해서는, 상기한 방법에서도 히알루론산의 회수율이 낮다는 등의 과제가 남아 있었다.However, in order to obtain high purity hyaluronic acids that can be used as pharmaceuticals on an industrial scale, there is a problem that the recovery rate of hyaluronic acid is low even in the above method.
본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 간편하면서도 고수율로 고순도의 히알루론산류를 공업적 규모로 정제하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention has been made in view of the above circumstances, and it is an object of the present invention to provide a method for purifying hyaluronic acids of high purity on an industrial scale with a simple and high yield.
본 발명자들은 상기 목적을 해결하기 위해, 히알루론산 및 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산 용액으로부터 불순물을 효율적으로 분리 제거하고, 고순도의 히알루론산류를 간편하면서도 효율적으로 정제하는 방법에 대하여 다양하게 검토한 결과, 히알루론산류 용액을 산성측의 pH로 제조한 후, 한외 여과막으로 투석 처리함으로써, 핵산, 발열성 물질, 단백질, 락트산, 무기염류 등을 효과적으로 제거할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.In order to solve the above object, the inventors of the present invention have studied various methods for efficiently and efficiently separating and removing impurities from a hyaluronic acid solution containing hyaluronic acid and its salts and impurities and purifying hyaluronic acids of high purity with ease and efficiency As a result, it has been found that a nucleic acid, a pyrogenic substance, a protein, a lactic acid, an inorganic salt and the like can be effectively removed by preparing a solution of hyaluronic acid at a pH of the acidic side and dialyzing it with an ultrafiltration membrane It came to the following.
즉, 본 발명에 따르면, 히알루론산 및 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산 용액을 산성측의 pH로 제조한 후, 한외 여과막으로 투석 처리하는 공정을 포함하는 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제법이 제공된다. 이 제조 방법에 따르면, 불순물을 효과적으로 제거할 수 있다.That is, according to the present invention, there is provided a method for purifying hyaluronic acid and / or a salt thereof, which comprises preparing a hyaluronic acid solution containing hyaluronic acid and its salt and an impurity at a pH of the acidic side, / RTI > According to this manufacturing method, impurities can be effectively removed.
〔용어의 설명〕[Description of Terms]
본 명세서에 있어서의 「히알루론산 및/또는 그의 염」과 「히알루론산류」는 동일한 의미이며, 교환 가능하게 사용되고, 유리된 히알루론산, 및 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위에서 사용 가능한 임의의 히알루론산염(이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염 등의 금속염이나, 염산염, 인산염, 시트르산염 등의 산 부가물 등)이나 수화물, 이들의 혼합물을 의미한다. 여기서, 히알루론산이란, N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산이 결합한 2당 단위가 반복 연쇄되어 이루어지는 고분자량의 다당류를 말하며, 각종 염은 주로 글루쿠론산 부분이 염의 형태가 된 것을 말한다. 히알루론산은, 절첩 가능한 쇄 부분과, D-글루쿠론산 부분의 카르복실기의 마이너스 전하의 상호 작용에 의해 공간에 전개되기 쉽고, 이에 따라 대량의 물과 결합하여 겔을 형성할 수 있다. 또한, 저농도여도 분자간력이 강하기 때문에, 비교적 높은 점성을 갖는다. 이러한 작용으로부터, 예를 들면 관절의 습윤 작용, 피부의 유연 작용 등을 갖고, 생리적으로도 이들의 역할을 담당하고 있다.The terms " hyaluronic acid and / or salt thereof " and " hyaluronic acid " in this specification have the same meaning and can be used interchangeably and include free hyaluronic acid and any arbitrary (For example, metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts and lithium salts, acid addition salts such as hydrochloride salts, phosphate salts and citric acid salts), hydrates, and mixtures thereof it means. Here, hyaluronic acid refers to a polysaccharide having a high molecular weight composed of repeating two saccharide units bonded with N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid, and various salts are those in which the glucuronic acid moiety is in the form of a salt It says. Hyaluronic acid is liable to develop in the space due to the interaction between the foldable chain portion and the negative charge of the carboxyl group of the D-glucuronic acid moiety, and thus can bond with a large amount of water to form a gel. Further, even at a low concentration, since the intermolecular force is strong, it has a relatively high viscosity. From these actions, for example, they have the wetting action of the joints, the softening action of the skin, and the physiological roles thereof.
히알루론산류 중에서도 분자량 약 200만 Da인 히알루론산나트륨은, 분자량 약 80만 Da인 것에 비해 의약품으로서 변형성 슬관절증, 견관절 주위염, 만성 관절 류마티스 등의 치료에 우수한 효과를 발휘한다는 것이 알려져 있다(문헌 [약리와 치료, Vol.22, No.9, 289(1994); 약리와 치료, Vol.22, No.9, 319(1994)]). 또한, 그 이외에 외과 수술 후의 유착 방지용으로서, 피부과 영역, 안과 영역에서도 의약품으로서의 효과가 알려져 있으며, 일부는 임상적으로 일반적으로 사용되고 있다. 의약품으로서 이용하는 경우에는, 평균 분자량이 100만 이상인 히알루론산류를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 입수나 취급의 용이함을 감안하면, 평균 분자량100만 내지 500만 Da의 히알루론산류가 의약품으로서는 바람직하고, 평균 분자량150만 내지 400만 Da의 히알루론산류가 특히 바람직하다. 또한, 이러한 고분자량의 히알루론산류는, 화장품 용도로서 사용했을 때에도 그의 높은 보습력으로부터 우수한 효과를 발휘한다.Among the hyaluronic acids, sodium hyaluronate having a molecular weight of about 2,000,000 Da is known to exert excellent effects in the treatment of deformable knee joint, shoulder joint inflammation, chronic joint rheumatism and the like as a medicine, compared with a molecular weight of about 800,000 Da [ Vol.22, No.9, 289 (1994); Pharmacology and Therapy, Vol.22, No.9, 319 (1994)). In addition to this, the effect as medicine for dermatological and ophthalmic areas is known for preventing adhesion after surgery, and some of them are generally used clinically. When used as a medicine, hyaluronic acid having an average molecular weight of at least 1,000,000 is preferably used. In view of ease of acquisition and handling, hyaluronic acids having an average molecular weight of 1 million to 5 million Da are preferable as pharmaceuticals, and hyaluronic acids having an average molecular weight of 1,500 to 4,000,000 Da are particularly preferable. Such high molecular weight hyaluronic acids also exert excellent effects from their high moisturizing power even when they are used for cosmetic applications.
본 명세서에 있어서의 「평균 분자량」에 대하여, 특기하지 않는 한 히알루론산류의 평균 분자량을 나타낼 때에는 점도 평균 분자량을 말한다. 점도 평균 분자량은, 당업자가 통상 행하는 방법에 의해 구할 수 있다. 바람직하게는, 각국의 약전 등에서 일반적으로 이용되고 있는 측정 방법에 의해 구할 수 있으며, 보다 바람직하게는 일본 약전에서 이용되고 있는 측정 방법에 의해 구할 수 있다. 일례로서는, 예를 들면 히알루론산나트륨이 본원 발명에 가까운 평균 분자량(150만 내지 390만)을 가질 것으로 기대되는 경우, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 그의 평균 분자량은 극한 점도[η]를 이용하여 하기 수학식 1에 의해 구할 수 있다.The term " average molecular weight " in the present specification refers to the viscosity average molecular weight when the average molecular weight of hyaluronic acids is not specified. The viscosity average molecular weight can be determined by a method commonly practiced by those skilled in the art. Preferably, it can be obtained by a measurement method generally used in the pharmacopoeia of each country, and more preferably by a measurement method used in the Japanese Pharmacopoeia. For example, when sodium hyaluronate is expected to have an average molecular weight (1.5 to 3.9 million) similar to that of the present invention, it is not limited to this, but the average molecular weight thereof is determined by using an intrinsic viscosity [?] Can be obtained by the following equation (1).
의약품으로서, 히알루론산류를 용해하는 주사용 용해액으로서는, 주사용수, 생리 식염수 등에, 산, 알칼리, 인산염과 같은 완충제를 포함하는 pH 조정제 등을 가한 일반적으로 이용되는 주사용 용해액(예를 들면, 각국 약전에서 인정되고 있는 것)을 적절하게 사용할 수 있다.Examples of the pharmaceutical solution used for dissolving hyaluronic acids include a commonly used solution for injection (for example, water for injection, physiological saline, etc.), a pH adjusting agent containing a buffer such as an acid, an alkali, , Which is recognized in each country's pharmacopeia) can be used appropriately.
이들 히알루론산류는, 동물 조직으로부터 추출하는 추출법에 의해 제조한 것일 수도, 히알루론산 생산 미생물 균주를 이용하여 발효시켜 얻는 발효법으로 제조한 것일 수도 있다. 그러나, 동물 조직으로부터 추출한 것에는 다른 무코 다당 등의 불순물이 비교적 많고, 히알루론산류의 분자량도 작기 때문에, 발효법으로 얻어지는 것을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 적합한 발효법의 일례에서는, 예를 들면 스트렙토코커스속의 미생물을 사용하여 기지된 방법으로 히알루론산류를 얻을 수 있다.These hyaluronic acids may be produced by an extraction method extracted from animal tissues or may be produced by a fermentation method obtained by fermentation using a microorganism strain producing hyaluronic acid. However, in the case of extracting from animal tissues, since impurities such as other mucopolysaccharides are relatively large and the molecular weight of hyaluronic acids is also small, it is preferable to use those obtained by the fermentation method. In one example of a fermentation method suitable for the present invention, hyaluronic acids can be obtained by a known method using microorganisms of the genus Streptococcus, for example.
발효법에 의해 얻어진 발효액을 본 발명의 방법 등에 이용하는 경우에는, 기지된 방법, 예를 들면 원심 분리나 여과 처리 등으로 제균한 액을 사용하는 것이 바람직하다. 경우에 따라서는, 알코올 등의 수용성 유기 용매를 첨가하여 히알루론산을 석출 정제한 것을 사용할 수도 있다. 또한, 알루미나 등으로 처리한 것을 이용할 수도 있다.When the fermentation broth obtained by the fermentation method is used in the method of the present invention or the like, it is preferable to use a solution which has been inactivated by a known method, for example, centrifugation or filtration. In some cases, a water-soluble organic solvent such as alcohol may be added to precipitate and refine hyaluronic acid. Further, it may be treated with alumina or the like.
본 명세서에 있어서의 「스트렙토코커스」에는, 히알루론산을 생산할 수 있는 스트렙토코커스(Streptococcus)속의 임의의 세균ㆍ그의 변이주가 포함된다. 특히, 특허문헌 2에 기재된 스트렙토코커스ㆍ에퀴 FM-100(미공연균기 제9027호), 일본 특허 공개 (평)2-234689호 공보에 기재된 스트렙토코커스ㆍ에퀴 FM-300(미공연균기 제2319호)과 같은 고수율로 안정적으로 히알루론산을 생산하는 변이주를 이용하는 것이 바람직하다. 히알루론산의 생산에 적합한 스트렙토코커스속의 세균의 예로서는, 그 이외에 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 스트렙토코커스ㆍ에퀴(Streptococcus equi), 스트렙토코커스ㆍ주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus), 스트렙토코커스ㆍ에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스ㆍ디스갈락티에(Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스ㆍ피오게네스(Streptococcus pyogenes) 및 이들의 변이주 등을 들 수 있다.In the present specification, "Streptococcus" includes any bacterium of Streptococcus or its mutant strains capable of producing hyaluronic acid. In particular, Streptococcus aurei FM-100 (Unphosphorylated Bacteria No. 9027) described in Patent Document 2 and Streptococcus aure FM-300 (Unphosphorylated Bacteria No. 2319) described in Japanese Patent Application Laid- It is preferable to use a mutant strains which stably produce hyaluronic acid at a high yield such as the hyaluronic acid. Examples of the bacterium belonging to the genus Streptococcus which are suitable for the production of hyaluronic acid include, but are not limited to, Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus Streptococcus equisimilis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, and mutant strains thereof.
본 명세서에 있어서의 「한외 여과막」이란, 공경이 0.001 내지 0.01 ㎛인 여과막 및/또는 분획 분자량이 1000 내지 300000 정도인 여과막을 의미한다. 한외 여과막의 재질은 무기막과 유기막으로 크게 구별되며, 나아가 소수성과 친수성으로 나누어진다. 소수성의 유기막으로서 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리에테르, 폴리불화비닐리덴, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등을 들 수 있다. 친수성의 유기막으로서 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리이미드, 아세트산셀룰로오스 등을 들 수 있다. 그의 여과재 형상으로서는, 평막, 관상막, 나선형막, 홀로우 파이버(중공사)막 등, 모든 모듈 형식이 포함된다.The term "ultrafiltration membrane" in this specification means a filtration membrane having a pore diameter of 0.001 to 0.01 μm and / or a filtration membrane having a molecular weight cutoff of 1,000 to 300,000. Ultrafiltration membranes are classified into inorganic membranes and organic membranes, and further divided into hydrophobic and hydrophilic. Examples of the hydrophobic organic film include, but are not limited to, polysulfone, polyethersulfone, polyether, polyvinylidene fluoride, polyethylene, and polypropylene. Examples of the hydrophilic organic film include, but are not limited to, polyacrylonitrile, polyamide, polyimide, cellulose acetate and the like. The shape of the filter medium includes all module types such as a flat membrane, a tubular membrane, a spiral membrane, and a hollow fiber membrane.
여과 방식으로서는, 전량 여과 방식과 크로스 플로우 방식이 포함된다. 전량 여과 방식은 막에 공급되는 물의 전량을 여과하는 방식을 말한다. 이에 비해, 크로스 플로우 방식은 막면에 대하여 평행한 흐름을 형성함으로써 막에 공급되는 물에 포함되는 현탁 물질이나 콜로이드가 막면에 퇴적하는 현상을 억제하면서 여과를 행하는 방식을 말한다. 크로스 플로우 방식에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 원패스 방식, 백 플러쉬 방식 및 리버스 방식이 포함된다. 원패스 방식이란, 도 1의 A에 도시한 바와 같이, 한외 여과막으로부터의 투과액을 재이용하지 않고 여과를 행하는 방식을 말한다. 백 플러쉬 방식이란, 도 1의 B에 도시한 바와 같이, 한외 여과막으로부터의 투과액을 투과액 탱크에 저장하고, 투과액 탱크로부터 한외 여과막에 이송하고, 여과막 표면에 부착된 히알루론산류를 세정 제거하는 공정을 포함하는 여과 방식을 말한다. 리버스 방식이란, 도 1의 C에 도시한 바와 같이, 한외 여과막으로부터의 투과액을, 투과액 밸브를 잠가서 역류시킴으로써, 여과막 표면에 부착된 히알루론산류를 세정 제거하는 공정을 포함하는 여과 방식을 말한다.The filtration system includes a full-volume filtration system and a cross-flow system. The total volume filtration method refers to a method of filtering the entire amount of water supplied to the membrane. On the other hand, the cross-flow system refers to a system in which filtration is performed while suppressing the phenomenon that suspended substances or colloids contained in water supplied to the membrane are deposited on the membrane surface by forming a flow parallel to the membrane surface. The cross flow method includes, but is not limited to, an one-pass method, a back-flush method, and a reverse method. The one-pass method is a method in which filtration is performed without reusing the permeated liquid from the ultrafiltration membrane, as shown in Fig. 1 (A). 1B, the permeate from the ultrafiltration membrane is stored in a permeate tank, transferred from the permeate tank to the ultrafiltration membrane, and the hyaluronic acid attached to the surface of the filtration membrane is cleaned and removed The filtration method including the step of As shown in Fig. 1C, the reverse method is a filtration method including a step of cleaning and removing the hyaluronic acid adhering to the surface of the filtration membrane by causing the permeate liquid from the ultrafiltration membrane to flow backward by locking the permeate valve It says.
본 명세서에 있어서의 「불순물」이란, 히알루론산류, 물 그 이외의 용매 성분, 무기염 이외의 물질, 특히 최종 제품으로서의 히알루론산류를 이용할 때에 불이익을 줄 수 있는 물질(발열성 물질 등)을 말한다. 주된 불순물원으로서는, 히알루론산류의 생산 단계에서의 조직, 미생물 또는 배양액(배지)에서 유래하는 것, 또는 그 후의 정제 단계 등에서 혼입된 것을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서의 불순물의 예로서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 조직 또는 균체, 단백질, 핵산, 다당류, 저분자 화합물 또는 엔도톡신 등을 들 수 있다. 불순물로서의 조직 또는 균체에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 각각 추출법에서 이용한 추출 원료로서의 조직 유래의 조직편 등이나, 발효법에서 이용한 미생물의 균체 또는 균체편 등이 포함된다. 불순물로서의 단백질에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 상기 조직, 균 유래의 단백질이나, 생산 후의 공정에서 혼입된 단백질 등이 포함된다. 불순물로서의 엔도톡신에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 상기 균 유래의 리포 다당류 등이 포함된다.The term " impurities " in this specification refers to substances other than hyaluronic acids, water and other solvent components and inorganic salts, particularly substances (pyrogenic substances) which can cause disadvantages when using hyaluronic acids as final products It says. Examples of the main impurity source include those derived from tissues, microorganisms or culture medium (medium) in the stage of production of hyaluronic acids, or those which have been introduced in the subsequent purification step or the like. Examples of the impurities in the present specification include, but are not limited to, tissues or cells, proteins, nucleic acids, polysaccharides, low molecular compounds or endotoxins. The tissue or cells as the impurities include, but are not limited to, tissue pieces derived from the tissue as an extraction raw material used in the extraction method, microbial cells or microbial cells used in the fermentation method, and the like. Proteins as impurities include, but are not limited to, proteins derived from the above tissues and bacteria, proteins incorporated in a post-production process, and the like. Endotoxin as an impurity includes, but is not limited to, lipopolysaccharide derived from the above-mentioned bacteria.
본 명세서에 있어서의 「저분자 화합물」이란, 히알루론산류에 비해 분자량이 비교적 작은 화합물을 말하며, 예를 들면 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 분자량 2000 Da이하, 또는 분자량 1000 Da, 또는 분자량 500 Da 이하의 화합물을 말한다. 이러한 저분자 화합물에는, 각종 아미노산, 유기산(예를 들면, 락트산), 당(예를 들면, 글루코오스) 등이 포함된다.Refers to a compound having a relatively small molecular weight as compared with a hyaluronic acid and includes, for example, a compound having a molecular weight of 2000 Da or less, a molecular weight of 1,000 Da, or a molecular weight of 500 Da or less Compound. Such low-molecular compounds include various amino acids, organic acids (for example, lactic acid), sugars (for example, glucose) and the like.
본 명세서에 있어서의 「제거」에는, 대상 물질을 완전히 제거하는 것 뿐만 아니라, 부분적으로 제거하는(그 물질의 양을 감소시키는) 것도 포함된다. 본 명세서에 있어서의 「정제」에는, 임의의 또는 특정한 불순물을 제거하는 것이 포함된다.As used herein, the term " removing " includes not only removing the target material completely, but also partially removing (reducing the amount of the material). The term " tablet " in this specification includes removing any or specific impurities.
본 명세서에 있어서의 각각의 수치 범위에 대해서는, 「내지」로 표시된 상한값 및 하한값을 각각 포함하는 것으로 한다.In the present specification, each numerical range includes an upper limit value and a lower limit value indicated by "to".
〔실시 형태〕[Embodiment]
본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 이하의 실시 양태에 관한 것이다.The present invention is not limited to this but, for example, relates to the following embodiments.
실시 양태 1.Embodiments 1.
히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산 용액을 산성측의 pH로 제조한 후, 한외 여과막으로 투석 처리함으로써 불순물을 제거하는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법.A process for purifying hyaluronic acid and / or its salt, which comprises the step of preparing a solution of hyaluronic acid containing hyaluronic acid and / or salt thereof and impurities at a pH of the acidic side and then removing the impurities by dialysis with an ultrafiltration membrane.
실시 양태 2.Embodiment 2.
한외 여과막의 분획 분자량과 한외 여과막에 의한 투석 처리시의 pH가 수학식The fractional molecular weight of the ultrafiltration membrane and the pH at the dialysis treatment by the ultrafiltration membrane are given by Equation
pH≤-5×10-5×(분획 분자량)+4.4978pH? -5? 10 -5 (fraction molecular weight) +4.4978
을 만족하는 조건하에서 한외 여과막에 의한 투석 처리가 행해지는 실시 양태 1에 기재된 방법.Wherein the dialysis treatment with the ultrafiltration membrane is carried out under the condition satisfying the following conditions:
실시 양태 3.Embodiment 3.
한외 여과막의 분획 분자량이 25000 내지 35000이고, 투석 처리시의 pH가 3.3 이하인 실시 양태 1 또는 2에 기재된 방법.The method according to claim 1 or 2, wherein the fractionated molecular weight of the ultrafiltration membrane is 25000 to 35000 and the pH at the dialysis treatment is 3.3 or less.
상기 한외 여과막의 분획 분자량이 12000 내지 14000이고, 투석 처리시의 pH가 3.9 이하인 실시 양태 1 또는 2에 기재된 방법.The method according to Claim 1 or 2, wherein the ultrafiltration membrane has a cut molecular weight of 12000 to 14000 and a dialysis treatment pH of 3.9 or less.
실시 양태 4.Embodiment 4.
상기 한외 여과막의 분획 분자량이 9000 내지 11000이고, 투석 처리시의 pH가 4.1 이하인 실시 양태 1 또는 2에 기재된 방법.The method according to Claim 1 or 2, wherein the ultrafiltration membrane has a fraction molecular weight of 9000 to 11000 and a pH at the dialysis treatment of 4.1 or less.
실시 양태 5.Embodiment 5
상기 한외 여과막의 분획 분자량이 6000 내지 8000이고, 투석 처리시의 pH가 4.2 이하인 실시 양태 1 또는 2에 기재된 방법.The method according to Claim 1 or 2, wherein the ultrafiltration membrane has a fraction molecular weight of 6000 to 8000 and a pH at the dialysis treatment of 4.2 or less.
실시 양태 6.Embodiment 6.
상기 한외 여과막의 분획 분자량이 4000 내지 5000이고, 투석 처리시의 pH가 4.3 이하인 실시 양태 1 또는 2에 기재된 방법.The method according to Claim 1 or 2, wherein the ultrafiltration membrane has a cut molecular weight of 4000-5000 and a pH during dialysis treatment of 4.3 or lower.
실시 양태 7.Embodiment 7.
상기 한외 여과막이 소수성 유기막인 실시 양태 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 방법.The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the ultrafiltration membrane is a hydrophobic organic membrane.
실시 양태 8.Embodiment 8
상기 처리의 여과 방식이 리버스 방식인 실시 양태 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 방법.The method according to any one of embodiments 1 to 7, wherein the filtration method of the treatment is a reverse method.
실시 양태 9.Embodiment 9
상기 처리시의 투과 유속이 20 내지 50 L/m2ㆍ시간인 실시 양태 1 내지 8 중 어느 하나에 기재된 방법.The process according to any one of the embodiments 1 to 8, wherein the permeate flux during the treatment is 20 to 50 L / m 2 시간 hour.
실시 양태 10.
상기 불순물이 균체, 단백질, 핵산, 저분자 화합물 또는 엔도톡신을 포함하는 실시 양태 1 내지 9 중 어느 하나에 기재된 방법.11. The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the impurity comprises cells, proteins, nucleic acids, low molecular weight compounds or endotoxins.
실시 양태 11.Embodiment 11.
정제 후의 상기 히알루론산 및/또는 그의 염의 평균 분자량이 350만 내지 700만 Da인 실시 양태 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 방법.The method according to any one of embodiments 1 to 10, wherein the average molecular weight of the hyaluronic acid and / or its salt after purification is 3.5 to 7 million Da.
실시 양태 12.Embodiment 12.
상기 히알루론산류 용액 중의 히알루론산 및/또는 그의 염의 농도가 1 내지 5 g/L인 실시 양태 1 내지 11 중 어느 하나에 기재된 방법.The method according to any one of the embodiments 1 to 11, wherein the concentration of hyaluronic acid and / or its salt in the hyaluronic acid solution is 1 to 5 g / L.
이하, 본 발명의 양태에 대하여 설명한다.Hereinafter, aspects of the present invention will be described.
본 발명의 양태(예를 들면, 실시 양태 1)는, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 산성측의 pH로 제조한 후, 한외 여과막으로 투석 처리함으로써 불순물을 제거하는 공정을 포함하는 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법이다. 이 정제 방법에 따르면, 산성측의 pH로 제조함으로써 한외 여과막에 의한 여과에 있어서의 히알루론산류의 손실이 감소되고, 불순물을 효율적으로 제거할 수 있다.In an embodiment of the present invention (for example, embodiment 1), a hyaluronic acid solution containing hyaluronic acid and / or a salt thereof and an impurity is prepared at the pH of the acidic side and then dialyzed with an ultrafiltration membrane to remove impurities And / or a salt thereof. According to this purification method, the production at the pH of the acidic side reduces the loss of hyaluronic acid in the filtration by the ultrafiltration membrane, and the impurities can be efficiently removed.
한외 여과막의 분획 분자량과 한외 여과막에 의한 투석 처리시의 pH가 수학식The fractional molecular weight of the ultrafiltration membrane and the pH at the dialysis treatment by the ultrafiltration membrane are given by Equation
pH≤-5×10-5×(분획 분자량)+4.4978pH? -5? 10 -5 (fraction molecular weight) +4.4978
을 만족하는 조건하에 한외 여과막에 의한 투석 처리를 행함으로써, 실질적으로 히알루론산류를 손실시키지 않고 정제할 수 있다. 상기한 식을 만족하는 한외 여과막의 분획 분자량과 한외 여과막에 의한 투석 처리시의 pH로서, 예를 들면 분획 분자량 35000의 한외 여과막에서는 pH 2.7, 분획 분자량 30000의 한외 여과막에서는 pH 3.0, 분획 분자량 25000의 한외 여과막에서는 pH 3.3, 분획 분자량 20000의 한외 여과막에서는 pH 3.5, 분획 분자량 14000의 한외 여과막에서는 pH 3.8, 분획 분자량 13000의 한외 여과막에서는 pH 3.9, 분획 분자량 12000의 한외 여과막에서는 pH 3.9, 분획 분자량 11000의 한외 여과막에서는 pH 4.0, 분획 분자량 10000의 한외 여과막에서는 pH 4.0, 분획 분자량 9000의 한외 여과막에서는 pH 4.1, 분획 분자량 8000의 한외 여과막에서는 pH 4.1, 분획 분자량 7000의 한외 여과막에서는 pH 4.2, 분획 분자량 6000의 한외 여과막에서는 pH 4.2, 분획 분자량 5000의 한외 여과막에서는 pH 4.3, 분획 분자량 4000의 한외 여과막에서는 pH 4.3을 들 수 있다.The dialysis treatment with the ultrafiltration membrane can be carried out without substantially losing hyaluronic acid. For example, in the ultrafiltration membrane having a cut-off molecular weight of 35000 and a pH of 2.7 and a cutoff molecular weight of 30000, the cut-off molecular weight of the ultrafiltration membrane satisfying the above-mentioned formula and the pH of the dialysis treatment are pH 3.0 and 25000 In the ultrafiltration membrane having a pH of 3.3 and a molecular weight cutoff of 20,000, the pH of the ultrafiltration membrane was pH 3.8, the pH of the ultrafiltration membrane was 13.0, the pH of the ultrafiltration membrane was 3.9, and the cutoff molecular weight of the ultrafiltration membrane was pH 3.9. In the ultrafiltration membrane of pH 4.0 and molecular weight of 10000, the pH of the ultrafiltration membrane of pH 4.0 and the molecular weight of cutoff of 9000 was 4.1, the pH of the ultrafiltration membrane was 4.1, the pH of the ultrafiltration membrane was 8.4, the pH of the ultrafiltration membrane was 7, In the ultrafiltration membrane having pH 4.2 and the cutoff
여기서, 「실질적으로 히알루론산류를 손실시키지 않고」란, 히알루론산류의 손실률이 3 % 이하(회수율이 97 % 이상)가 되는 것을 말한다.Here, "substantially without causing loss of hyaluronic acid" means that the loss rate of hyaluronic acid is 3% or less (recovery rate is 97% or more).
분획 분자량이 높은 막을 사용하면 히알루론산류가 한외 여과막을 투과하여 손실이 발생할 리스크가 높아지는 한편, 분획 분자량이 낮은 막을 사용하면 단백질 등의 비교적 고분자의 불순물의 제거 효율이 저하된다. 상기 실시 형태의 방법에 따르면, 분획 분자량이 높은 막을 사용하여도, 분획 분자량이 낮은 막을 사용하여도, 막의 분획 분자량에 적합한 pH로 조정함으로써 히알루론산류를 손실시키지 않고 불순물을 제거할 수 있기 때문에, 상기 양태의 방법에 있어서 이용하는 한외 여과막의 분획 분자량은 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 25000 내지 35000의 분획 분자량을 갖는 한외 여과막을 이용하는 경우, pH를 3.3 이하로 조정함으로써 히알루론산류를 손실시키지 않고 정제할 수 있다. 12000 내지 14000의 분획 분자량을 갖는 한외 여과막을 이용하는 경우, pH를 3.9 이하로 조정함으로써 히알루론산류를 손실시키지 않고 정제할 수 있다. 9000 내지 11000의 분획 분자량을 갖는 한외 여과막을 이용하는 경우, pH를 4.1 이하로 조정함으로써 히알루론산류를 손실시키지 않고 정제할 수 있다. 6000 내지 8000의 분획 분자량을 갖는 한외 여과막을 이용하는 경우, pH를 4.2 이하로 조정함으로써 히알루론산류를 손실시키지 않고 정제할 수 있다. 4000 내지 5000의 분획 분자량을 갖는 한외 여과막을 이용하는 경우, pH를 4.3 이하로 조정함으로써 히알루론산류를 손실시키지 않고 정제할 수 있다.When a membrane having a high fractionation molecular weight is used, the risk of loss of hyaluronic acids through the ultrafiltration membrane is increased, while the removal efficiency of impurities of relatively high polymers such as proteins is lowered when a membrane having a low molecular weight fraction is used. According to the method of the above embodiment, even when a film having a high cut-off molecular weight is used, even if a film having a low cut-off molecular weight is used, impurities can be removed without loss of hyaluronic acid by adjusting the pH to a fractional molecular weight of the film. The fraction molecular weight of the ultrafiltration membrane used in the above-described method is not particularly limited. For example, in the case of using an ultrafiltration membrane having a cut-off molecular weight of 25000 to 35000, the pH can be adjusted to 3.3 or less to purify without losing hyaluronic acid species. When an ultrafiltration membrane having a cut-off molecular weight of 12000 to 14000 is used, purification can be performed without loss of hyaluronic acid by adjusting the pH to 3.9 or less. When an ultrafiltration membrane having a cut-off molecular weight of 9000 to 11000 is used, purification can be performed without loss of hyaluronic acid by adjusting the pH to 4.1 or lower. When an ultrafiltration membrane having a cut-off molecular weight of 6000 to 8000 is used, purification can be performed without loss of hyaluronic acid by adjusting the pH to 4.2 or less. When an ultrafiltration membrane having a cut-off molecular weight of 4000 to 5000 is used, purification can be performed without loss of hyaluronic acid by adjusting the pH to 4.3 or less.
여기서, 한외 여과막의 분획 분자량은, 표 1에 나타낸 바와 같은 지표 물질을 이용하여 여과를 행하고, 각각의 저지율이 90 %에 상당하는 분자량을 조사함으로써 결정할 수 있다.Here, the fraction molecular weight of the ultrafiltration membrane can be determined by performing filtration using an indicator material as shown in Table 1 and irradiating a molecular weight corresponding to 90% of each of the blocking rates.
상기 양태의 방법에 있어서 이용하는 한외 여과막의 재질은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 불순물의 제거의 관점에서는 소수성 유기막이 바람직하고, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리에테르, 폴리불화비닐리덴, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌이 더욱 바람직하다.The material of the ultrafiltration membrane used in the method of the above embodiment is not particularly limited, but a hydrophobic organic film is preferable from the viewpoint of removing impurities, and polysulfone, polyethersulfone, polyether, polyvinylidene fluoride, polyethylene, More preferable.
상기 양태의 방법에 있어서 이용하는 한외 여과막으로서, 예를 들면 PM-10, PM-50, PM-100(코츠(Koch)사 제조), NTU-3050(니토 덴꼬사 제조), IRIS3065(론ㆍ풀랑사 제조), FS-10(아사히 가세이사 제조), MU-6303(쿠라레사 제조), DUSO400(다이셀 가가꾸 고교사 제조), SLP-3053(아사히 가세이 케미컬즈사 제조) 등을 사용할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.Examples of the ultrafiltration membrane used in the method of the above embodiment include PM-10, PM-50, PM-100 (manufactured by Koch), NTU-3050 (manufactured by Nitto Denko Corporation), IRIS3065 (Manufactured by Asahi Kasei Chemicals Co., Ltd.), FS-10 (manufactured by Asahi Kasei Corporation), MU-6303 (manufactured by Kuraray Co., Ltd.), DUSO400 .
상기 양태의 방법에 있어서의 여과 방식은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 물의 막 투과 유속이 안정화되기 쉽다는 점, 여과막의 수명이 연장된다는 점 등으로부터 크로스 플로우 방식이 바람직하고, 그 중에서도 리버스 방식이 특히 바람직하다.The filtration system in the method of the above embodiment is not particularly limited, but a cross flow system is preferable from the standpoint that the membrane permeation flux of water is easily stabilized and the lifetime of the filtration membrane is extended. Among them, the reverse system is particularly preferable Do.
상기 양태의 방법에 있어서, 히알루론산류 용액의 한외 여과막 처리시의 투과 유속은, 히알루론산류 용액의 성상이나 한외 여과막의 종류에 따라 상이하여 일률적으로 규정할 수 없지만, 예를 들면 공업적 규모에서의 히알루론산류의 정제에 있어서는 20 L/m2ㆍ시간 이상인 것이 바람직하고, 25 L/m2ㆍ시간 이상인 것이 더욱 바람직하고, 30 L/m2ㆍ시간 이상인 것이 특히 바람직하다. 히알루론산류가 전단되고, 분자량의 저하가 발생하기 때문에, 히알루론산류 용액의 여과에 있어서의 투과 유속은 100 L/m2ㆍ시간 이하인 것이 바람직하고, 50 L/m2ㆍ시간 이하인 것이 더욱 바람직하다.In the method of this embodiment, the permeation flux at the time of the ultrafiltration membrane treatment of the hyaluronic acid solution differs depending on the properties of the hyaluronic acid solution and the kind of the ultrafiltration membrane and can not be uniformly defined. For example, Preferably 20 L / m 2 시간 hour or more, more preferably 25 L / m 2 시간 hour or more, and particularly preferably 30 L / m 2 시간 hour or more in the purification of the hyaluronic acid of the present invention. The flow rate of the hyaluronic acid solution in the filtration is preferably 100 L / m 2 시간 hour or less, more preferably 50 L / m 2 시간 hour or less, since the hyaluronic acid is sheared and the molecular weight is lowered Do.
상기 양태의 방법에 있어서 송액을 위한 압력에 대한 한정은 없지만, 일반적으로 가압으로 여과막을 통과시키는 것이 바람직하다. 특히 가압은 펌프 등으로 전송하는 방법이 바람직하다. 송액시에 펌프로 압력을 가할 때에 여과막을 파손하거나 클로깅시켜 성능을 열화시키지 않는 한, 특별히 한정되지 않는다. 여과막에 가해지는 압력으로서는 0.01 MPa 이상 0.30 MPa가 바람직하고, 0.03 MPa 이상 0.20 MPa가 더욱 바람직하고, 0.05 MPa 이상 0.10 MPa가 특히 바람직하다.In the method of the above embodiment, there is no limitation on the pressure for sending, but it is generally preferable to pass the filtration membrane through pressurization. Particularly, it is preferable that the pressure is transmitted by a pump or the like. So long as it does not deteriorate performance by breaking or clogging of the filtration membrane when pressure is applied to the filtrate at the time of pumping. The pressure applied to the filtration membrane is preferably from 0.01 MPa to 0.30 MPa, more preferably from 0.03 MPa to 0.20 MPa, and particularly preferably from 0.05 MPa to 0.10 MPa.
또한, 상기 양태의 방법에 따르면, 정제시의 히알루론산류의 분자량의 저하를 감소시킬 수 있으며, 특히 고분자량(예를 들면, 정제 후의 평균 분자량이 350만 내지 700만 Da)의 히알루론산류의 정제에 있어서 우수한 효과를 발휘한다. 또한, 종래에는 처리가 곤란하였던 비교적 고농도(예를 들면 0.1 내지 20 g/L, 0.5 내지 15 g/L, 1 내지 10 g/L)의 히알루론산류 용액에 대해서도, 효율적으로 처리할 수 있다.Further, according to the method of the above-described embodiment, it is possible to reduce the molecular weight of the hyaluronic acid at the time of purification and, in particular, to reduce the molecular weight of the hyaluronic acid (for example, And exhibits excellent effects in purification. In addition, it is possible to efficiently treat hyaluronic acid solutions having a relatively high concentration (for example, from 0.1 to 20 g / L, from 0.5 to 15 g / L, and from 1 to 10 g / L) conventionally difficult to treat.
또한, 상기 양태의 방법에 따르면, 히알루론산류의 소실은 낮게 억제하면서도, 불순물로서 일반적으로 한외 여과막에 의해 제거 가능해지는 저분자 화합물(예를 들면, 아미노산, 당, 유기산) 뿐만 아니라, 고분자 화합물(예를 들면, 핵산, 엔도톡신, 단백질)까지도 효율적으로 분리ㆍ제거하는 것이 가능하였다. 또한, 상기 양태의 방법은, 핵산, 엔도톡신 및/또는 단백질의 제거에도 우수한 효과를 발휘한다.Further, according to the above-described method, not only a low molecular compound (for example, an amino acid, a sugar, or an organic acid) that is generally capable of being removed by an ultrafiltration membrane as an impurity while suppressing the disappearance of hyaluronic acid, For example, nucleic acid, endotoxin, protein) can be efficiently separated and removed. In addition, the method of the above embodiment exerts an excellent effect on elimination of nucleic acid, endotoxin and / or protein.
상기 양태의 방법을 이용할 때의 히알루론산류 용액의 히알루론산류 농도는, 용액 점도의 높이에 기인하는 취급의 곤란함 및 히알루론산류의 용해도의 관점에서는 이것으로 한정되지 않지만, 0.1 내지 20 g/L가 바람직하고, 1 내지 10 g/L가 가장 바람직하다.The concentration of the hyaluronic acid in the solution of the hyaluronic acid solution when using the method of the above embodiment is not particularly limited in view of the difficulty in handling due to the height of the solution viscosity and the solubility of the hyaluronic acid, L is preferable, and 1 to 10 g / L is most preferable.
또한, 상기 양태의 방법에 있어서, 히알루론산류 용액의 점도를 낮추는 목적으로 히알루론산류 용액에 염화나트륨 등의 염류를 공존시킬 수도 있다. 이 경우, 정제 효과가 손상되지 않도록 고농도의 염의 공존은 피하는 것이 바람직하다. 이러한 염의 공존의 구체예로서는, 0.1 내지 5 중량%의 염화나트륨을 히알루론산류 용액에 첨가하는 것을 들 수 있다.In addition, in the method of the above embodiment, for the purpose of lowering the viscosity of the hyaluronic acid solution, a salt such as sodium chloride may coexist in the hyaluronic acid solution. In this case, it is preferable to avoid coexistence of salt at a high concentration so that the refining effect is not impaired. As a specific example of the coexistence of such a salt, 0.1 to 5% by weight of sodium chloride is added to the hyaluronic acid solution.
상기 양태의 방법을 이용할 때의 히알루론산류 용액의 온도는 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 0 내지 80 ℃인 것이 바람직하다. 온도가 80 ℃ 이하이면, 처리 중의 히알루론산류의 분해 및 분자량의 저하를 강하게 억제할 수 있다.The temperature of the hyaluronic acid solution when the above-described method is used is not limited to this, but is preferably 0 to 80 ° C. When the temperature is 80 占 폚 or lower, decomposition of the hyaluronic acids and degradation of the molecular weight during the treatment can be strongly suppressed.
또한, 한외 여과 투석 처리를 행할 때, 막전 처리로서 2 % 이하의 알칼리(예를 들면, 수산화나트륨 수용액), 과산화물(예를 들면, 차아염소산나트륨 수용액), 계면활성제, 시트르산, 시트르산 암모늄ㆍ효소 세제 등의 약제로 막을 세정 처리하는 화학적 방법이나, 플러싱, 스폰지볼, 공기 인젝션법 등의 물리적 방법에 의해 행하는 것이 바람직하다.When the ultrafiltration is carried out, the membrane is treated with an alkali (for example, sodium hydroxide solution) of 2% or less, a peroxide (for example, sodium hypochlorite solution), a surfactant, citric acid, ammonium citrate Or a physical method such as flushing, sponge ball, air injection method, or the like.
본 발명의 다른 양태는, 상기 제1 양태에 있어서, 상술한 공정과는 별도로 히알루론산류 용액을 무기 흡착제, 유기 흡착제 및/또는 활성탄과 접촉시키는 공정을 더 포함할 수도 있다.In another aspect of the present invention, in the first aspect, the method may further include a step of bringing the hyaluronic acid solution into contact with the inorganic adsorbent, the organic adsorbent, and / or the activated carbon separately from the above-described process.
또한, 그 후에 필요로 되는 분리ㆍ정제 공정 등을 고려하면, 추가의 정제 공정을 필요로 하는 성분의 혼입을 피하는 것이 바람직하다. 즉, 새로운 불순물의 혼입을 피하기 위한 본 발명의 다른 양태는, 상기 제1 양태에 있어서, 히알루론산류 용액의 한외 여과 후에 무기 흡착제 또는 유기 흡착제와 접촉시키는 공정을 포함하지 않는 정제 방법이다. 본 발명의 다른 양태에서는, 상기 제1 양태에 있어서, 히알루론산류 용액을 무기 흡착제 또는 유기 흡착제와 접촉시키는 공정을 포함하지 않는다. 본 발명에서는, 한외 여과로도 충분한 정제 효과를 발휘하는 것이 가능하기 때문에, 새로운 불순물의 혼입을 피하는 것을 중시하는 경우에는, 한외 여과 단독으로 처리하는 것이 바람직하다. 물론, 이 경우에도, 한외 여과와는 별도로 다른 정제 처리 등의 공정을 행할 수는 있다.Further, in consideration of the separation and purification steps required thereafter, it is desirable to avoid the incorporation of components requiring further purification steps. That is, another aspect of the present invention for avoiding incorporation of a new impurity is a purification method that does not include a step of contacting the inorganic adsorbent or the organic adsorbent after ultrafiltration of the hyaluronic acid solution in the first embodiment. In another aspect of the present invention, in the first aspect, the step of contacting the hyaluronic acid solution with an inorganic adsorbent or an organic adsorbent is not included. In the present invention, a sufficient purification effect can be exhibited even by ultrafiltration. Therefore, when it is important to avoid the incorporation of new impurities, it is preferable to perform ultrafiltration alone. Of course, in this case as well, it is possible to carry out another purification treatment or the like separately from the ultrafiltration.
또한, 본 발명의 다른 양태에서는, 상기 양태에 있어서, 히알루론산류가 스트렙토코커스ㆍ에퀴 FM-100(미공연균기 제9027호) 또는 스트렙토코커스ㆍ에퀴 FM-300(미공연균기 제2319호)에 의해 생산된다. 이들 미생물에 의해 생산된 히알루론산류를 정제 대상으로서 이용함으로써, 보다 불순물이 적고, 고분자량의 히알루론산류 정제물을 얻을 수 있으며, 특히 의약으로서 이용할 때에는 우수한 효과를 발휘한다.In another embodiment of the present invention, in the above embodiment, the hyaluronic acid is selected from the group consisting of Streptococcus equi FM-100 (Unphosphorylated Bacteria No. 9027) or Streptococcus aure FM-300 (Unphosphorylated Bacteria No. 2319) . By using the hyaluronic acids produced by these microorganisms as purification targets, it is possible to obtain refined products of hyaluronic acids with less impurities and high molecular weight, and in particular, exhibit excellent effects when used as medicines.
상기 양태의 정제 방법을 이용함으로써, 히알루론산류의 분리ㆍ정제 공정의 부하를 경감할 수 있기 때문에, 상기 양태에 관한 정제 방법은 제조의 공업적인 공정의 비교적 초기 단계에 이용하는 것이 특히 유효적이다.By using the purification method of the above-described embodiment, the burden of the separation and purification process of hyaluronic acids can be reduced. Therefore, the purification method according to the above embodiment is particularly effective when used in a relatively early stage of the industrial process of production.
또한, 상기 실시 양태, 양태에 의해 설명되는 정제 방법 등은 본 발명을 한정하는 것은 아니고, 예시하는 것을 의도하여 개시되어 있는 것이다. 본 발명의 기술적 범위는, 특허청구범위의 기재에 의해 정해지는 것이며, 당업자는 특허청구범위에 기재된 발명의 기술적 범위에 있어서 다양한 설계적 변경이 가능하다.In addition, the purification method and the like described in the above embodiments and modes are not intended to limit the present invention, but are intended to be exemplified. The technical scope of the present invention is defined by the description of the claims, and a person skilled in the art can make various design changes in the technical scope of the invention described in the claims.
예를 들면, 상기 정제 방법은 다른 공정을 포함하거나, 또는 상기 정제 방법에 이어서 또 다른 공정ㆍ방법이 실시되어, 히알루론산류 등을 제조하는 방법일 수도 있다. 이러한 공정ㆍ방법으로서는, 예를 들면 히알루론산 생산 미생물 균주를 배양하는 공정, 히알루론산 생산 미생물 균주 배양액으로부터 배양 여과액을 제조하는 공정, 정제 대상액을 원심 분리하는 공정, 대상액을 중화하는 공정, 정제 대상액을 정밀 여과하는 공정, 대상액을 투석 처리하는 공정, 정제 대상액에 방향족계 흡착 수지를 가하여 교반 및 여과하는 공정, 대상액을 크로마토그래피로 정제하는 공정, 활성탄을 대상액으로부터 분리하는 공정, 활성탄을 대상액으로부터 제거하는 공정, 유기 용매를 가하여 히알루론산류를 침전시키는 공정, 히알루론산류를 결정화하는 공정, 히알루론산류를 건조시키는 공정 등을 들 수 있다.For example, the purification method may include another step, or may be a method of producing hyaluronic acids or the like by performing another process or method subsequent to the purification method. Such processes and methods include, for example, a step of culturing a hyaluronic acid-producing microorganism strain, a step of producing a culture filtrate from a hyaluronic acid-producing microorganism culture medium, a step of centrifuging the liquid to be purified, A step of refining the liquid to be purified, a step of dialyzing the object liquid, a step of adding an aromatic adsorption resin to the liquid to be purified and stirring and filtering, a step of purifying the object liquid by chromatography, A step of removing the activated carbon from the liquid, a step of precipitating the hyaluronic acid by adding an organic solvent, a step of crystallizing the hyaluronic acid, a step of drying the hyaluronic acid, and the like.
[실시예][Example]
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
실시예 1Example 1
스트렙토코커스ㆍ에퀴 FM-100(미공연균기 제9027호)을 이용하여 배양한 배양액 45 L를 순수로 80 L로 희석하고(히알루론산나트륨 농도 2.0 g/1), 원심 분리로 균체를 제거하였다. 얻어진 조제 히알루론산을 pH 2.9로 조정한 후, 분획 분자량 30000 재질 폴리술폰의 한외 여과막(코츠사 제조ㆍPM-100) 2 m2로 투과 유속 30 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 희석 조작을 반복하여 투석 횟수 10회, 리버스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액 80 L에 식염 2.4 kg을 용해하고, pH 7로 조정한 후 에탄올 240 L로 석출, 에탄올 8 L로 세정하고, 40 ℃에서 진공 건조하여 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산 회수율을 표 2에 나타낸다.45 L of the cultured medium was diluted with 80 L of pure water (sodium hyaluronate concentration: 2.0 g / l) using Streptococcus equi FM-100 (Untreated bacterial strain No. 9027) and the cells were removed by centrifugation. After adjusting the pH of the resulting hyaluronic acid to 2.9, the filtrate was subjected to filtration with a flow rate of 30 L / m 2 시간 hour, a volume ratio of 2 times, 2 m 2 of an ultrafiltration membrane (PM-100, manufactured by Kotetsu Co., Ltd.) The dilution operation was repeated, and the dialysis was performed 10 times and the reverse mode. 2.4 kg of sodium chloride was dissolved in 80 L of the obtained solution, and the pH of the solution was adjusted to 7, followed by precipitation with 240 L of ethanol, 8 L of ethanol and vacuum drying at 40 캜 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and hyaluronic acid recovery rates are shown in Table 2.
실시예 2Example 2
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 2.9로 조정한 후, 분획 분자량 30000 재질 폴리에테르술폰의 한외 여과막(아사히 가세이사 제조ㆍFS-10) 5 m2로 투과 유속 30 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 순수 희석을 반복하여 투석 횟수 11회, 리버스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산 회수율을 표 2에 나타낸다.Examples used in the first preparation was adjusted to hyaluronic acid to pH 2.9, cut-off molecular weight: 30,000 Material polyethersulfone of the ultrafiltration membrane (manufactured by Asahi Kasei manufacturers and FS-10) 5 m 2 with flux 30 L / m 2 and hour, The volume ratio was doubled, and the pure dilution was repeated, and the dialysis was performed 11 times and the reverse mode. The resulting solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and hyaluronic acid recovery rates are shown in Table 2.
실시예 3Example 3
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 3.3으로 조정한 후, 분획 분자량 20000 재질 폴리술폰의 한외 여과막(니토 덴꼬사 제조ㆍNTU-3050) 3 m2로 투과 유속 30 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 순수 희석을 반복하여 투석 횟수 8회, 리버스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산나트륨의 회수율을 표 2에 나타낸다.After adjusting the pH of the prepared hyaluronic acid used in Example 1 to 3 m 2 using an ultrafiltration membrane (NTU-3050, manufactured by Nitto Denko Corporation) having a molecular weight cut-off of 20,000 and a permeation flow rate of 30 L / m 2 시간 hour, 2 times concentration, and pure dilution was repeatedly performed, and the dialysis was performed 8 times and reverse method. The resulting solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and the recovery rate of sodium hyaluronate are shown in Table 2.
실시예 4Example 4
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 2.9로 조정한 후, 분획 분자량 30000 재질 폴리불화비닐리덴의 한외 여과막(론ㆍ풀랑사 제조ㆍIRIS3065) 5 m2로 투과 유속 30 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 순수 희석을 반복하여 투석 횟수 9회, 리버스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산나트륨의 회수율을 표 2에 나타낸다.The pH of the prepared hyaluronic acid used in Example 1 was adjusted to 2.9, and then the filtrate was permeated at a flow rate of 30 L / m 2 시간 hour with 5 m 2 of an ultrafiltration membrane of polyvinylidene fluoride (manufactured by Ron Poulenc Company, IRIS 3065) Volume ratio of 2 times, and dilution with pure water was repeated, and the dialysis was repeated 9 times and the reverse method. The resulting solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and the recovery rate of sodium hyaluronate are shown in Table 2.
실시예 5Example 5
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 2.7로 조정한 후, 분획 분자량 40000 재질 폴리에테르술폰의 한외 여과막(다이셀 가가꾸 고교사 제조ㆍDUSO400) 5 m2로 투과 유속 30 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 순수 희석을 반복하여 투석 횟수 11회, 리버스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여, 150 g의 히알루론산나트륨이 얻어졌다. 분석 결과 및 히알루론산나트륨의 회수율을 표 2에 나타낸다.Example 1 After adjusting the preparation of hyaluronic acid used in a pH 2.7, cut-off molecular weight: 40,000 Material polyethersulfone of the ultrafiltration membrane (Daicel Kagaku Kogyo manufacture and DUSO400) 5 m transmitted to the second flow rate of 30 L / m 2 and hour , The volume ratio was doubled, and the pure dilution was repeated, and the dialysis was performed 11 times and the reverse mode. The obtained solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain 150 g of sodium hyaluronate. The analytical results and the recovery rate of sodium hyaluronate are shown in Table 2.
실시예 6Example 6
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 3.7로 조정한 후, 분획 분자량 13000 재질 폴리술폰의 한외 여과막(쿠라레사 제조ㆍMU-6303) 5 m2로 투과 유속 30 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 순수 희석을 반복하여 투석 횟수 11회, 리버스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여, 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산나트륨의 회수율을 표 2에 나타낸다.Example 1 After adjusting the preparation of hyaluronic acid used in a pH 3.7, cut-off molecular weight: 13,000 Material polysulfone of the ultrafiltration membrane (manufactured by Kuraray Co., Ltd. and MU-6303) 5 m 2 with flux 30 L / m 2 and hour, the ratio 2 Fold dilution, and so on. The dilution was repeated 11 times and the reverse method was used. The resulting solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and the recovery rate of sodium hyaluronate are shown in Table 2.
실시예 7Example 7
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 3.7로 조정한 후, 분획 분자량 10000 재질 폴리술폰의 한외 여과막(아사히 가세이 케미컬즈사 제조ㆍSLP-3053) 4.5 m2로 투과 유속 30 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 순수 희석을 반복하여 투석 횟수 11회, 리버스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여, 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산나트륨의 회수율을 표 2에 나타낸다.After adjusting the pH of the prepared hyaluronic acid used in Example 1 to 4.5, a permeation flow rate of 30 L / m 2 시간 hour, 4.5 m 2 of an ultrafiltration membrane (SLP-3053, manufactured by Asahi Kasei Chemicals Co., Ltd.) The volume ratio was doubled, and the pure dilution was repeated, and the dialysis was performed 11 times and the reverse mode. The resulting solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and the recovery rate of sodium hyaluronate are shown in Table 2.
비교예 1Comparative Example 1
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 5.5으로 조정한 후, 분획 분자량 10000 재질 폴리술폰의 소수성 한외 여과막(코츠사 제조ㆍPM-10) 2 m2로 투과 유속 30 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 희석 조작을 반복하여 투석 횟수 15회, 리버스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여, 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산 회수율을 표 2에 나타낸다.The pH of the prepared hyaluronic acid used in Example 1 was adjusted to pH 5.5, and then the filtrate was permeated at a flow rate of 30 L / m 2 시간 hour, 2 m 2 of a hydrophobic ultrafiltration membrane (PM-10, manufactured by Kotetsu Co., Ltd.) 2-fold concentration, and 1-fold dilution were repeated, and the dialysis was repeated 15 times and the reverse method. The resulting solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and hyaluronic acid recovery rates are shown in Table 2.
비교예 2Comparative Example 2
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 3.6으로 조정한 후, 분획 분자량 20000 재질 아세트산셀룰로오스의 친수성 한외 여과막(DDS사 제조ㆍCA600PP) 4.5 m2로 투과 유속 30 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 순수 희석을 반복하여 투석 횟수 10회, 리버스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여, 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산 회수율을 표 2에 나타낸다.The prepared hyaluronic acid used in Example 1 was adjusted to pH 3.6, and then 4.5 m 2 of a hydrophilic ultrafiltration membrane (CA600PP, manufactured by DDS Corporation) having a molecular weight cut-off of 20000 and a permeation flow rate of 30 L / m 2 시간 hour, Concentration, and so on. The dilution was repeated ten times and the dialysis was repeated 10 times. The resulting solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and hyaluronic acid recovery rates are shown in Table 2.
비교예 3Comparative Example 3
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 3.3으로 조정한 후, 분획 분자량 20000 재질 아세트산 폴리이미드의 친수성 한외 여과막(니토 덴꼬사 제조ㆍNTU-4220) 5 m2로 투과 유속 30 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 순수 희석을 반복하여 투석 횟수 9회, 리버스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여, 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산 회수율을 표 2에 나타낸다.Example 1 After adjusting the preparation of hyaluronic acid used in the pH 3.3, cut-off molecular weight: 20,000 Material acetate polyimide hydrophilic ultrafiltration membranes of the imide (Nitto Den Tommy Seiko manufacture and NTU-4220) 5 m transmitted to the second flow rate of 30 L / m 2 and hour , The volume ratio was doubled, and the dilution with pure water was repeated, and the dialysis was repeated 9 times and the reverse mode. The resulting solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and hyaluronic acid recovery rates are shown in Table 2.
비교예 4Comparative Example 4
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 3.7로 조정한 후, 분획 분자량 13000 재질 아세트산폴리술폰의 소수성 한외 여과막(쿠라레사 제조ㆍMU-6303) 5 m2로 투과 유속 5 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 순수 희석을 반복하여 투석 횟수 11회, 원패스 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여, 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산 회수율을 표 2에 나타낸다.Carried out after adjusting the preparation of hyaluronic acid used in Example 1 in pH 3.7, cut-off molecular weight: 13,000 Material acetate poly hydrophobic ultrafiltration membrane of polysulfone (manufactured by Kuraray Co., Ltd. and MU-6303) 5 m 2 flux 5 L / m 2 and hour, Volume ratio was doubled, and pure dilution was repeated, and the dialysis was performed 11 times and one pass. The resulting solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and hyaluronic acid recovery rates are shown in Table 2.
비교예 5Comparative Example 5
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 pH 3.7로 조정한 후, 분획 분자량 13000 재질 아세트산폴리술폰의 소수성 한외 여과막(쿠라레사 제조ㆍMU-6303) 5 m2로 투과 유속 15 L/m2ㆍ시간, 용적비 2배 농축, 등배 순수 희석을 반복하여 투석 횟수 11회, 백 플러쉬 방식으로 처리하였다. 얻어진 액은 실시예 1과 동일하게 처리하여, 히알루론산나트륨을 얻었다. 분석 결과 및 히알루론산 회수율을 표 2에 나타낸다.Carried out after adjusting the preparation of hyaluronic acid used in Example 1 in pH 3.7, cut-off molecular weight: 13,000 Material acetate poly hydrophobic ultrafiltration membrane of polysulfone (manufactured by Kuraray Co., Ltd. and MU-6303) 5 m 2 permeation flow rate 15 L / m 2 and hour, The volume ratio was doubled, and pure dilution was repeated, and the dialysis was performed 11 times and the back flush method. The resulting solution was treated in the same manner as in Example 1 to obtain sodium hyaluronate. The analytical results and hyaluronic acid recovery rates are shown in Table 2.
측정 방법How to measure
(1) 핵산 함량: 0.1 % 히알루론산나트륨의 260 nm에서의 흡광도를 측정하였다.(1) Nucleic acid content: The absorbance of sodium 0.1% hyaluronate at 260 nm was measured.
(2) 단백질 함량: 히알루론산나트륨을 0.1 N 수산화나트륨에 용해하고, 로리법으로 행하였다.(2) Protein content: Sodium hyaluronate was dissolved in 0.1 N sodium hydroxide and subjected to the Lori method.
(3) 락트산: 히알루론산나트륨을 0.1 %의 농도로 용해하고, L-LDH법으로 행하였다.(3) Lactic acid: Sodium hyaluronate was dissolved at a concentration of 0.1%, and L-LDH method was used.
(4) 금속: 히알루론산나트륨을 0.05 %의 농도로 8 N 질산에 용해하고, ICP 발광 분광 분석을 행하였다.(4) Metal: Sodium hyaluronate was dissolved in 8 N nitric acid at a concentration of 0.05%, and ICP emission spectrochemical analysis was performed.
(5) 극한 점도: 히알루론산나트륨을 0.02 %의 농도로 0.2 M 염화나트륨에 용해하여, 30 ℃에 있어서의 극한 점도를 측정하였다.(5) Intrinsic viscosity: Sodium hyaluronate was dissolved in 0.2 M sodium chloride at a concentration of 0.02%, and the intrinsic viscosity at 30 캜 was measured.
실시예 8Example 8
실시예 1에서 이용한 조제 히알루론산을 다양한 분획 분자량을 갖는 폴리술폰의 소수성 한외 여과막을 이용하여 이하의 조건으로 정제하여, 한외 여과시의 pH와 히알루론산의 회수율과의 관계를 조사하였다.The prepared hyaluronic acid used in Example 1 was purified by using a hydrophobic ultrafiltration membrane of polysulfone having various cut molecular weights under the following conditions to investigate the relationship between the pH at the ultrafiltration and the recovery rate of hyaluronic acid.
HA 용액 조건HA solution condition
HA 농도: 2 g/LHA concentration: 2 g / L
분자량: 440만(극한 점도: 55 dL/g)Molecular weight: 4.40 million (intrinsic viscosity: 55 dL / g)
여과 조건Filtration conditions
속도: 1 m/sSpeed: 1 m / s
투과 유속: 30 L/(m2ㆍ시간)Permeate flow rate: 30 L / (m 2 ㆍ hour)
농축: 2배 농축Concentration: 2x concentration
온도: 25 ℃Temperature: 25 ℃
한외 여과시의 pH와 히알루론산 회수율과의 관계를 나타내는 그래프를 도 2에 도시한다. 또한, 각 분획 분자량의 막에 대하여, 한외 여과시의 pH와 히알루론산 손실률과의 관계를 나타내는 식 1 내지 5가 얻어졌다. 하기 식 1 내지 5를 이용하여, 각 분획 분자량의 한외 여과막에 있어서의 히알루론산류의 손실이 실질적으로 발생하지 않는 pH를 산출하고, 그 pH의 범위 내(최적 pH)에서 한외 여과에 의한 정제를 행함으로써, 히알루론산류를 손실시키지 않고 정제할 수 있다.A graph showing the relationship between the pH at the time of ultrafiltration and the hyaluronic acid recovery rate is shown in Fig. Further, for the membranes having the respective cut-off molecular weights, the formulas 1 to 5 showing the relationship between the pH during ultrafiltration and the hyaluronic acid loss rate were obtained. The pH at which the loss of hyaluronic acids in the ultrafiltration membrane of each cut-off molecular weight is substantially not generated is calculated using the following formulas 1 to 5, and purification by ultrafiltration is carried out within the range of the pH (optimum pH) , It is possible to purify it without losing hyaluronic acids.
분획 분자량 30,000의 Fraction molecular weight of 30,000 한외Han 여과막을Filter membrane 이용한 경우 When using
(식 1) 히알루론산류의 손실률(%)=44.86×(한외 여과시의 pH)-131.79(Formula 1) Loss rate (%) of hyaluronic acids = 44.86 占 (pH at ultrafiltration) -131.79
(최적 pH≤2.9)(Optimum pH? 2.9)
분획 분자량 13,000의 Fractional molecular weight of 13,000 한외Han 여과막을Filter membrane 이용한 경우 When using
(식 2) 히알루론산류의 손실률(%)=40.84×(한외 여과시의 pH)-86.92(Equation 2) Loss rate (%) of hyaluronic acids = 40.84 x (pH at ultrafiltration) -86.92
(최적 pH≤3.7)(Optimum pH? 3.7)
분획 분자량 10,000의 Fraction molecular weight of 10,000 한외Han 여과막을Filter membrane 이용한 경우 When using
(식 3) 히알루론산류의 손실률(%)=24.36×(한외 여과시의 pH)-97.19(Formula 3) Loss rate (%) of hyaluronic acids = 24.36 占 (pH at ultrafiltration) -97.19
(최적 pH≤4.0)(Optimum pH? 4.0)
분획 분자량 7,000의 Fractional molecular weight of 7,000 한외Han 여과막을Filter membrane 이용한 경우 When using
(식 4) 히알루론산류의 손실률(%)=7.09×(한외 여과시의 pH)-29.02(Formula 4) Loss rate (%) of hyaluronic acids = 7.09 占 (pH at ultrafiltration) -29.02
(최적 pH≤4.1)(Optimum pH? 4.1)
분획 분자량 5,000의 Fractional molecular weight of 5,000 한외Han 여과막을Filter membrane 이용한 경우 When using
(식 5) 히알루론산류의 손실률(%)=0.79×(한외 여과시의 pH)-2.01(Equation 5) Loss rate (%) of hyaluronic acids = 0.79 x (pH at ultrafiltration) -2.01
(최적 pH≤4.2)(Optimum pH? 4.2)
히알루론산류의 손실률이 3 % 이하가 되는 pH와 한외 여과막의 분획 분자량과의 관계를 도 3에 도시한다. 또한, 히알루론산류의 손실률이 3 % 이하가 되는 pH와 한외 여과막의 분획 분자량과의 관계는 이하의 식 6을 만족한다는 것이 분명해졌다.3 shows the relationship between the pH at which the loss rate of hyaluronic acids is 3% or less and the fraction molecular weight of the ultrafiltration membrane. It has also become clear that the relationship between the pH at which the loss rate of the hyaluronic acids is 3% or less and the fraction molecular weight of the ultrafiltration membrane satisfies the following expression (6).
(식 6)(Equation 6)
히알루론산류의 손실률이 3 % 이하가 되는 pH=-5×10-5×(분획 분자량)+4.4978PH at which the loss rate of hyaluronic acids is 3% or less = -5 × 10 -5 × (fraction molecular weight) +4.4978
식 6을 이용함으로써, 한외 여과막의 분획 분자량에 대한 최적 pH의 상한을 구할 수 있으며, 최적 pH로 한외 여과막에 의한 투석을 행함으로써 손실률 3 % 이하로 히알루론산류를 정제할 수 있다.By using Equation 6, the upper limit of the optimal pH for the cut-off molecular weight of the ultrafiltration membrane can be obtained, and the hyaluronic acid can be purified at a loss rate of 3% or less by performing dialysis with an ultrafiltration membrane at an optimum pH.
이상의 실험으로부터, 본 발명에 관한 정제 방법을 이용하면, 히알루론산류 용액으로부터 불순물을 효과적으로 제거하여, 고분자량의 히알루론산류를 정제할 수 있다는 것이 확인되었다.From the above-mentioned experiments, it was confirmed that by using the purification method according to the present invention, impurities can be effectively removed from the hyaluronic acid solution to purify hyaluronic acid having a high molecular weight.
이상, 본 발명을 실시예에 기초하여 설명하였다. 이 실시예는 어디까지나 예시이며, 다양한 변형예가 가능하다는 것, 그러한 변형예도 본 발명의 범위에 있다는 것은 당업자에게 이해되는 부분이다.The present invention has been described based on the embodiments. It is to be understood by those skilled in the art that this embodiment is merely illustrative and that various modifications are possible, and that such modifications are also within the scope of the present invention.
[도면의 간단한 설명]BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig.
도 1은 크로스 플로우 방식에 포함되는 원패스 방식 (A), 백 플러쉬 방식 (B) 및 리버스 방식 (C)의 여과 방식을 도시한 도면이다.Fig. 1 is a view showing filtering methods of the one-pass method (A), the backflush method (B), and the reverse method (C) included in the cross flow method.
도 2는 한외 여과시의 pH와 히알루론산 손실률과의 관계를 나타내는 그래프이다.2 is a graph showing the relationship between pH and hyaluronic acid loss rate during ultrafiltration.
도 3은 히알루론산류의 손실률이 3 % 이하가 되는 pH와 한외 여과막의 분획 분자량과의 관계를 나타내는 그래프이다.3 is a graph showing the relationship between the pH at which the loss factor of hyaluronic acids is 3% or less and the fraction molecular weight of the ultrafiltration membrane.
Claims (13)
상기 한외 여과막의 분획 분자량과 한외 여과막에 의한 투석 처리시의 pH가 이하의 수학식
pH≤-5×10-5×(분획 분자량)+4.4978
을 만족하는 조건하에서 한외 여과막에 의한 투석 처리가 행해지는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법.A step of preparing a hyaluronic acid solution containing hyaluronic acid and / or a salt thereof and an impurity at a pH of the acidic side, and then removing the impurities by dialysis with an ultrafiltration membrane,
The cut molecular weight of the ultrafiltration membrane and the pH at the dialysis treatment with the ultrafiltration membrane satisfy the following equations
pH? -5? 10 -5 (fraction molecular weight) +4.4978
Wherein the dialysis treatment with the ultrafiltration membrane is carried out under the condition that the hyaluronic acid and / or the salt thereof is satisfactory.
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