KR101628232B1 - 형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원의 활용 및 세포 재이용 시스템을 통한 재조합 트립신의 대량 생산방법 - Google Patents

형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원의 활용 및 세포 재이용 시스템을 통한 재조합 트립신의 대량 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101628232B1
KR101628232B1 KR1020140111560A KR20140111560A KR101628232B1 KR 101628232 B1 KR101628232 B1 KR 101628232B1 KR 1020140111560 A KR1020140111560 A KR 1020140111560A KR 20140111560 A KR20140111560 A KR 20140111560A KR 101628232 B1 KR101628232 B1 KR 101628232B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
rice
sucrose
rice cells
fumaric acid
Prior art date
Application number
KR1020140111560A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160024586A (ko
Inventor
양문식
김란선
Original Assignee
전북대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전북대학교산학협력단 filed Critical 전북대학교산학협력단
Priority to KR1020140111560A priority Critical patent/KR101628232B1/ko
Publication of KR20160024586A publication Critical patent/KR20160024586A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101628232B1 publication Critical patent/KR101628232B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 (a) 당 고갈시 작동하는 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼 세포를 당-풍부 배지에서 현탁배양하여 상기 벼 세포를 생장시키는 단계; 및 (b) 상기 벼 세포를 당이 없고 대체 탄소원을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 벼 세포 현탁배양을 통한 목적 단백질의 생산 방법과 (a) 당 고갈시 작동하는 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼 세포를 당-풍부 배지에서 현탁배양하여 상기 벼 세포를 생장시키는 단계; (b) 상기 벼 세포를 푸마르산 및 수크로스 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 벼 세포를 새로운 푸마르산 및 수크로스 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 벼 세포의 반복 사용을 통한 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.

Description

형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원의 활용 및 세포 재이용 시스템을 통한 재조합 트립신의 대량 생산방법{Method for high-level production of recombinant trypsin in transgenic rice cell culture through utilization of an alternative carbon source and cell recycling system}
본 발명은 형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원의 활용 및 세포 재이용 시스템을 통한 재조합 트립신의 대량 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 당 고갈시 작동하는 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼 세포를 당-풍부 배지에서 현탁배양하여 상기 벼 세포를 생장시키는 단계; 및 (b) 상기 벼 세포를 당이 없고 대체 탄소원을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 벼 세포 현탁배양을 통한 목적 단백질의 생산 방법과 (a) 당 고갈시 작동하는 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼 세포를 당-풍부 배지에서 현탁배양하여 상기 벼 세포를 생장시키는 단계; (b) 상기 벼 세포를 푸마르산 및 수크로스 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 벼 세포를 새로운 푸마르산 및 수크로스 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 벼 세포의 반복 사용을 통한 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
식물세포에서 재조합 단백질을 생산하는 것은 식물세포에서 발현할 수 있는 프로모터 및 목적유전자를 포함하는 발현벡터로 식물세포를 형질전환 하는 것으로서, 식물세포배양에 사용할 수 있는 기본배지로는 AA, MS, N6, WHITE 및 SH 배지 등이 있으며, 식물세포배양은 동물세포배양에 비해 동물 유래의 바이러스와 독소 등을 포함하지 않는다는 점, 동물세포배양에 비해 그 정제과정이 간단하고 경제적이라는 점에서 많은 연구가 이루어지고 있다
한편 벼 세포의 경우 현탁배양에서 배지내로 분비되는 총 단백질의 20~40%는 알파 아밀라아제 유전자 집단(α-amylase gene family)인 RAmy3D와 RAmy3E이고, 이 두 가지 유전자는 배지내 당 농도에 따라 발현양의 현저한 차이를 나타낸다. 특히 RAmy3D는 배지내 당이 고갈되었을 때 발현양이 165배 증가되며, 이와 반대로 배지내 수크로즈, 글루코즈, 프락토즈, 갈락토즈 같은 당이 존재할 시 RAmy3D 유전자의 발현이 억제된다고 알려져 있다. 이러한 유도 프로모터(inducible promoter)를 배양에 이용하면 세포생장 시 당을 첨가하여 세포의 농도를 증진시키고, 당 고갈에 의해 생산성을 향상시킬 수 있는 2단계 배양이 가능하기 때문에, 최근, 형질전환된 식물세포의 대표적인 예로서, 벼 세포에서 RAmy3D 프로모터를 이용해 재조합 단백질을 생산하고 있다.
그러나, RAmy3D 프로모터 시스템은 많은 생물학적인 측면과 기술적인 측면에서 제한점이 남아 있는데, 이는 배양 배지에서 당 고갈을 야기하는 배지 교환 방법이 에너지 대사를 위한 탄소원의 손실 때문에 세포 사멸을 유도할 수도 있다는 점이다. 이것은 또한, 삼투압의 변화로 세포 파열을 야기할 수도 있고, 다양한 인자가 세포사멸을 야기할 수도 있고, 또한 생산기 동안 단백질 분해효소가 세포에서 축적되어 배양 배지로 분비될 수도 있으므로 목적 재조합 단백질의 생산을 감소시킬 수도 있다. 따라서, 재조합 단백질 생산을 향상시키기 위해 몇몇의 대체 탄소원의 첨가가 이루어져 왔는데, 재조합 안티트립신(rAAT) 생산에서, 글루코스 및 피루베이트는 형질전환 벼 세포 현탁배양에서 rAAT 생산을 향상시키기 위한 효과가 있었다(Terashima et al. Biotechnol Progt 2001;17:403-406). 일일초(Catharanthus roseus) 현탁 세포 배양에서 알칼로이드의 합성을 향상시키기 위해, 시트르산 회로에 참여하는 숙신산, 말산 및 시트르산 모두가 배지로 첨가되었으나, 각각은 알칼로이드 생산에서 매우 다른 효과를 나타내었다. 숙신산 및 말산은 알칼로이드 생산을 현저히 증가시켰으나, 시트르산은 별다른 효과가 없었다(Zhao et al. Biotechnol Lett 2000;22:1221-1226).
따라서, 본 발명자는 시트르산 회로에서 매개물질(intermediate)을 분석하기 위해, 숙신산, 푸마르산 및 말산을 프럭토오스 및 피루브산에 첨가하였고, 이는 긍정적인 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이들 중에서 푸마르산은 다음 실험을 위해 선별되었는데, 이는 재조합 트립신의 생산에 가장 좋은 효과를 나타냈기 때문이다. 본 발명자가 적당한 탄소원을 첨가하여 그러한 매개물질을 생산하는 반응 단계를 우회시킬 수 있다면, 재조합 단백질 합성을 위한 에너지원은 고농도로 공급될 수 있을 것이다. 본 발명에서는 몇몇의 대체 탄소원을 이용하여 재조합 트립신의 생산량을 향상시키기 위한 방법 및 플라스크 크기에서 재이용 회분 배양 시스템을 개발하였고, 대량 배양에서 경제적인 재조합 트립신 생산을 위해 수크로스 및 푸마르산의 조합을 이용한 가능성을 제안하였다.
한국등록특허 제1171269호에서는 '식물 유래 단백질 가수분해물을 포함하는 식물세포 배양 배지 및 재조합 단백질 대량생산 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1244025호에서는 '벼 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 소 트립신의 대량생산방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원의 활용 및 세포 재이용 시스템을 통한 재조합 트립신의 대량 생산방법에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 RAmy3D 프로모터에 의해 발현이 조절되는 재조합 트립신의 생산량을 증가시키기 위한 조건으로, 형질전환 벼 세포의 현탁배양시 당 고갈 후 이루어지는 생산기에서 효과적인 대체 탄소원 및 유도시간을 선발하기 위해, 당 고갈 조건 후 프럭토오스, 피루브산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산 및 말산을 첨가하여 다양한 시간별로 트립신 생산량을 조사한 결과 40 mM 푸마르산을 첨가하여 5일간 배양한 결과, 최고의 수율을 얻는 것을 확인하였다.
또한, 형질전환 벼 세포 현탁배양에서 재조합 트립신의 대량 생산 시스템을 발전시키는데 있어서 가장 큰 문제점 중 하나인 당 고갈 이후 현탁배양 세포를 재사용할 수 없는 문제점을 극복하고자, 3% 수크로스가 포함된 배지에서 4일 동안 배양된 현탁배양 세포의 배양액을 흡입을 통해 제거한 후, 이어서 40 mM 푸마르산과 1% 수크로스를 함유하는 배지를 첨가하여 4일간 배양한 후, 다시 벼 배양 세포만을 모은 후 신선한 40 mM 푸마르산과 1% 수크로스를 함유하는 배지를 첨가하여 배양하는 단계를 반복한 결과, 재조합 트립신 생산을 위해 현탁배양 세포를 5회 반복 사용이 가능한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 당 고갈시 작동하는 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼 세포를 당-풍부 배지에서 현탁배양하여 상기 벼 세포를 생장시키는 단계; 및
(b) 상기 벼 세포를 당이 없고 대체 탄소원을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 벼 세포 현탁배양을 통한 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 당 고갈시 작동하는 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼 세포를 당-풍부 배지에서 현탁배양하여 상기 벼 세포를 생장시키는 단계;
(b) 상기 벼 세포를 푸마르산 및 수크로스 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 벼 세포를 새로운 푸마르산 및 수크로스 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 벼 세포의 반복 사용을 통한 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, RAmy3D 프로모터에 의해 발현이 조절되어 재조합 트립신을 생산하는 형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원으로 40 mM 푸마르산이 가장 적합하며, 40 mM 푸마르산과 1% 수크로스를 함유하는 배지를 이용함으로써 세포의 생장단계 및 재조합 단백질의 생산단계에서 배지교환 작업이 없는 간소화된 재조합 단백질 생산 공정을 제공할 수 있으며, 또한, 현탁배양 벼 세포의 5회 반복 이용을 가능하게 함으로써, 이는 기존 재조합 단백질 생산에 비해 저렴한 생산 비용, 간소화된 대량생산공정 개발을 통하여 형질전환 벼 식물세포배양에서 재조합 단백질의 대량생산시, 저비용, 고효율로 생산성을 증대시키는데 이용될 수 있다.
도 1은 재조합 트립신 생산에 효과적인 대체 탄소원 (80 mM) 선발 결과를 나타낸다. (A) 대체 탄소원 (80 mM)을 첨가한 회분식 현탁배양 동안 재조합 트립신의 생산이 직접 ELISA로 측정되었다. Ctrl (대조구)은 재조합 트립신을 높은 수준으로 발현하는 형질전환 벼 세포 (T111-04)를 배양한 대체 탄소원이 포함되지 않은 배양액을 나타낸다. 오차 막대는 3회 반복 배양한 결과의 표준 오차를 나타낸다. (B) 노던 블럿 분석은 형질전환 벼 세포 현탁배양에서 재조합 트립신 유전자의 발현을 측정하기 위해 사용되었다. 레인 NC는 대조구로서 형질전환되지 않은 벼 세포의 총 RNA 추출물이다. 레인 1은 대체 탄소원이 포함되지 않은 배지에서 배양한 형질전환 벼 세포 (T111-04)의 총 RNA 추출물이다. 레인 2-6은 각각 대체 탄소원 (프럭토오스 (fructose), 피루브산 (pyruvic acid), 시트르산 (citric acid), 숙신산 (succinic acid), 푸마르산 (fumaric acid) 및 말산 (malic acid))이 포함된 배지에서 배양한 형질전환 벼 세포의 총 RNA 추출물들이다. (C) 표준 로딩은 EtBr 염색된 rRNA로 나타냈다.
도 2는 재조합 트립신의 생산 및 활성에 대한 대체 탄소원의 영향을 나타낸 결과이다. (A) 다양한 농도의 숙신산, 푸마르산 및 말산이 각 대체 탄소원의 최적 농도를 측정하기 위해 배양 배지에 첨가되었다. (B, C, D 및 E) 시간 경과에 따른 ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블럿 분석 및 자이모그래피 (zymography)가 최대 트립신 생산량 및 활성을 확인하기 위해 수행되었다. Ctrl (대조구)은 재조합 트립신을 높은 수준으로 발현하는 형질전환 벼 세포 (T111-04)를 배양한 대체 탄소원이 포함되지 않은 배양 배지를 나타낸다. 오차 막대는 3회 반복 배양한 결과의 표준 오차를 나타낸다. 레인 M은 미리 염색된 분자량 표준 (PageRuler™ Protein Ladder)이다. 레인 Bt는 양성 대조구로서 소 (Bos taurus) 유래의 정제된 트립신 5 ng이다. 레인 Zm은 양성 대조구로서 옥수수 (Zea mays) 유래의 정제된 트립신 5 ng이다. 레인 NC는 음성 대조구로서 5 ㎍의 형질전환되지 않은 벼 세포의 배양액이다. (C), (D), (E)에서 레인 1, 2, 3 및 4는 수크로스가 없는 것 (레인 1), 수크로스가 없고 숙신산, 푸마르산 및 말산이 포함된 (레인 2~4) 트립신 생산기의 배양액 5㎍이다. (C)에서 화살표는 재조합 소 트립신의 위치를 가리킨다. 어두운 배경의 겔 상에 나타난 선명한 밴드는 단백질 분해효소 활성을 나타낸다 (E).
도 3은 형질전환 벼 세포 현탁배양에서 트립신 생산에 대한 다양한 농도의 수크로스 및 40 mM 푸마르산의 조합 효과를 ELISA (A), 세포 중량 (B) 및 세포 생존도 (C)로 측정하였다. TTC 환원도는 3% 수크로스를 함유하는 배지에서 배양한 세포의 환원도를 100%로 간주하였고, 다양한 농도의 수크로스를 포함하는 배지에서 배양된 세포의 시간 경과에 따른 환원도를 백분율로 환산하였다. 오차 막대는 3회 반복 배양한 결과의 표준 오차를 나타낸다.
도 4는 회분식 현탁배양 동안 1% 수크로스 및 40 mM 푸마르산 첨가가 재조합 트립신 생산에 미치는 영향을 시간별로 확인한 결과를 나타낸다. 웨스턴 블럿 분석 (A) 및 ELISA (B)가 배양 배지에 대해 수행되었다. 레인 M은 미리 염색된 분자량 표준 (PageRuler™ Protein Ladder)이다. 레인 PC는 양성 대조구로서 옥수수 (Zea mays) 유래의 정제된 트립신 100 ng이다. 레인 NC는 음성 대조구로서 5 ㎍의 형질전환되지 않은 벼 세포 배양액이다. 레인 1, 3, 5, 7, 9 및 11은 각각 트립신 생산기의 배양액 5 ㎍이다. 오차 막대는 3회 반복 배양한 결과의 표준 오차를 나타낸다.
도 5는 1% 수크로스 및 40 mM 푸마르산이 포함된 배지에서 형질전환 벼 세포의 재조합 트립신 생산 반복성을 확인한 결과를 나타낸다. T111-04 현탁배양 세포는 3% 수크로스 배지로 매 7일마다 계대배양하여 유지되었다. 세포 재이용 실험을 위해, 3% 수크로스 배지에서 형질전환 벼 세포를 4일 동안 배양한 후 현탁배양액을 흡입하여 제거하였고, 이어서 5 g의 신선한 세포가 0% 수크로오스 (-S), 0% 수크로오스 및 40 mM 푸마르산, 또는 1% 수크로스 및 40 mM 푸마르산이 각각 포함된 50 mL의 신선한 배지로 옮겨졌다. 각 배양액은 배양 4일 후에 수확되었으며, 상기 3 종류의 신선한 배지가 각 플라스크에 다시 첨가되었다. 세포 재이용은 20일의 기간 동안 5회 반복되었다. 배양액 및 세포는 ELISA에 의한 재조합 트립신의 농도 측정 (A) 및 세포 생존도의 측정 (B)을 위해 각 배양 주기마다 수집되었다. TTC 환원도는 3% 수크로스를 함유하는 배지에서 배양한 세포의 환원도를 100%로 간주하였고, 다양한 농도의 수크로스를 포함하는 배지에서 배양된 세포의 시간 경과에 따른 환원도를 백분율로 환산하였다. 오차 막대는 3회 반복 배양한 결과의 표준 오차를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 당 고갈시 작동하는 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼 세포를 당-풍부 배지에서 현탁배양하여 상기 벼 세포를 생장시키는 단계; 및
(b) 상기 벼 세포를 당이 없고 대체 탄소원을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 벼 세포 현탁배양을 통한 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 대체 탄소원은 푸마르산, 숙신산 또는 말산일 수 있고, 바람직하게는 푸마르산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 푸마르산의 농도는 30~70mM일 수 있고, 바람직하게는 30~50mM일 수 있고, 가장 바람직하게는 40mM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 푸마르산의 농도가 20mM 이하 또는 80mM 이상에서는 목적 단백질의 생산량이 현저히 떨어지는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (b)단계는 당이 없고, 30~50mM의 푸마르산을 함유하는 배지에서 3~7일 동안 벼 세포를 배양하는 것일 수 있고, 바람직하게는 4~6일 동안 벼 세포를 배양하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 5일 동안 벼 세포를 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 30~50mM의 푸마르산을 함유하는 배지에서 2일 이하 또는 9일 이상 벼 세포를 배양하는 경우 목적 단백질의 생산량이 현저히 떨어지는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 당 고갈시 작동하는 프로모터는 RAmy3D(Rice α-amylase 3D) 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 목적 단백질은 소 트립신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
(a) 당 고갈시 작동하는 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼 세포를 당-풍부 배지에서 현탁배양하여 상기 벼 세포를 생장시키는 단계;
(b) 상기 벼 세포를 푸마르산 및 수크로스 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 벼 세포를 새로운 푸마르산 및 수크로스 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 벼 세포의 반복 사용을 통한 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (a)단계의 당-풍부 배지에서 현탁배양하는 기간은 4일이 바람직하다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 상기 (c)단계를 3~5회 반복하는 것일 수 있고, 바람직하게는 4회 반복하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 배양된 벼 세포를 새로운 푸마르산 및 수크로스 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 3~5일 동안 배양하는 것일 수 있고, 바람직하게는 4일 동안 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (c)단계를 4회 반복하는 경우, 본 발명의 목적 단백질을 생산하기 위해 상기 (a)단계에서 (c)단계까지 소요되는 총 배양 시간은 20일에 해당될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (b) 및 (c)단계의 푸마르산 및 수크로스 혼합물은 푸마르산 30~50mM 및 수크로스 0.5~1.5%(w/v)의 농도로 혼합된 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 푸마르산 40mM 및 수크로스 1%(w/v)의 농도로 혼합된 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 당 고갈시 작동하는 프로모터는 RAmy3D 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 목적 단백질은 소 트립신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다
재료 및 방법
발현 시스템 및 식물 세포주
재조합 소 트립신은 재조합 단백질의 발현을 높이기 위해 개발된 강력한 프로모터이며, 수크로스 고갈에 의해 유도되는 벼 α-아밀라아제 3D (RAmy3D) 프로모터의 조절 하에서 발현되었다 (Shin et al. Biotechnol Bioeng 2003;82:778-783). 형질전환 벼 세포주 pMYT111-04는 이전에 기술된 방법으로 본 연구소에서 확립 및 유지되었다 (Kusnadi et al. Biotechnol Bioeng 1997;56:473-484).
식물 세포 배양
형질전환 벼 세포는 28℃의 암조건에서 회전 속도 110 rpm의 회전식 교반기를 사용하여 증식 및 배양되었다. 세포주를 유지하기 위하여, 현탁배양 세포는 50 mL의 N6 배지 (2 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 0,02 mg/L 키네틴 및 3%(w/v) 수크로스)가 포함된 300 mL 플라스크에서 배양되었다. 10 mL의 접종액이 계대 배양을 위해 매 7일마다 옮겨졌다. RAmy3D 프로모터의 조절 하에서 트립신 유전자의 발현을 유도하기 위해, N6 배지는 흡입을 통해 세포 현탁배양액에서 제거되었고, 세포의 10% (세포 생체 중량/배지의 부피)가 수크로스가 없는 신선한 N6 (S-) 배지로 옮겨졌다. 배양 상층액은 유도된 벼 세포의 배양 배지로부터 얻은 세포 현탁배양액을 2-3겹의 Myracloth (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 통과시켜 수집되었다. 배양액 내의 단백질은 세포 침전물을 제거하기 위해 4℃에서 10분 동안 18,000 g로 원심분리하여 수집하였다.
대체 탄소원의 선발 및 세포의 생체 중량 및 건조 중량의 측정
플라스크 배양에서 최적의 대체 탄소원 및 유도 시간을 선발하기 위해, 배양 7일 후 (생장기)에 세포 현탁배양액에서 배양 배지를 흡입하여 제거하였고, 5 g의 세포를 수크로스 없이 다양한 농도의 다양한 탄소원을 포함하는 신선한 N6 배지 50 mL에 접종한 후, 5일 동안 배양하였다(생산기). 프럭토오스, 피루브산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산 및 말산이 대체 탄소원의 효과를 시험하기 위해 사용되었다. 각 대체 탄소원은 수크로스가 없는 N6 배지에 완전하게 용해되었고, 각 배지는 1N NaOH를 사용하여 pH 5.8로 조절하였다. 1% 수크로스와 40 mM 푸마르산을 포함하는 신선한 N6 배지를 사용하여 배양 세포의 재이용이 수행되었다. 대체 탄소원을 첨가한 후에 세포 중량의 변화를 측정하기 위해, 세포의 생체 중량 및 건조 중량이 하기와 같이 측정되었다. 50 mL 배지에서 단백질 발현을 유도하기 위해 접종한 초기 형질전환 벼 세포는 생체 중량 5 g이었다. 유도 7일 후에, 배양액이 흡입을 통해 세포 현탁배양액으로부터 제거되었고, 다양한 탄소원을 포함하는 50 mL의 신선한 N6 배지 (수크로스가 없는)가 첨가되어 지정된 시간 동안 배양되었다. 세포는 약한 진공 압력 하에서 와트만 No.2 여과지를 이용하여 배지를 제거한 후에 수집되었고, 증류수로 3회 세척한 후에 생체 세포 중량이 측정되었다. 건조 세포 중량은 일정한 중량이 유지될 때까지 65℃의 건조기에서 세포를 건조시킨 후에 측정되었다.
노던 블럿 분석
노던 블럿 분석을 위해, 총 RNA가 RNeasy 식물 총 RNA 추출 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여, N6 (-S) 액체 배지 및 대체 탄소원 (프럭토오스, 피루브산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산 및 말산)이 포함된 N6 (-S) 액체 배지에서 5일 동안 배양한 현탁배양 세포로부터 분리되었다. RNA는 포름알데하이드를 함유한 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리되었다. 분리된 RNA는 Hybond N+ 막 (Amersham Pharmacia Biotech RPN82B, Piscataway, NJ, USA)으로 옮겨졌다. 이어서 상기 막은 Prime-a 유전자 표지 시스템 (Promega U1100, Madison, WI, USA)을 사용하여 65℃의 혼성화 반응기 (FINEPCR Combi-H, Seoul, Korea)에서 32P-표지 트립신 프로브와 혼성화되었다. 상기 막은 65℃에서 각 15분 동안 2×SSC 및 0.1% SDS로 2회 세척된 후에, 2×SSC 및 1% SDS로 2회 더 세척되었다. 혼성화된 밴드는 X-레이 필름 (Fuji Photo Film Co. HR-G30, Tokyo, Japan) 상에 자기방사법을 통해 검출되었다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 분석
웨스턴 블럿 분석을 위하여, 5 ㎍의 세포 배양액 유래 단백질이 12% (w/v) SDS-PAGE를 통해 분리되었고, 니트로셀룰로오스 막 상에 전기적으로 블럿팅되었다. 상기 막은 토끼 다클론 항-트립신 항체와 반응시켰고, 이어서 2차 항체로 AP (alkaline phosphatase) 결합 항-토끼 IgG (Calbiochem, San Diego, CA, USA)와 반응시켰다. 소 췌장에서 추출된 상용 소 트립신 (Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 TrpyZean™ (Sigma)이 양성 대조구로 사용되었다. SDS-PAGE 겔은 쿠마시 블루 염색 용액 (0.25% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250, 45% 메탄올 및 10% 빙초산 (glacial acetic acid))으로 염색되었다. 단백질 농도는 브래드포드법 (Bradford method)에 근거한 단백질 분석 시약 (Sigma)으로 측정되었으며, 표준 물질로 BSA (bovine serum albumin)가 사용되었다.
재조합 트립신의 정량
재조합 트립신의 양을 측정하기 위해, 하기의 방법으로 ELISA가 수행되었다. 표준 물질 (0.1 ㎍/mL) 및 샘플은 코팅버퍼로 희석시켰고, ELISA 플레이트 (Thermo Scientific, Roskilde, Denmark)에 분주한 후에 4℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 플레이트는 PBST 버퍼 (2.4 g/L KH2PO4, 11.6 g/L Na2HPO4, 80.0 g/L NaCl, 2.0 g/L KCl을 포함하는 pH 7.4의 PBS 버퍼 및 0.05% Tween 20)로 3회 세척되었고, 이어서 비특이적 항체 반응을 방지하기 위해 블로킹 버퍼인 0.1% 탈지유 200 ㎕를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 블로킹 버퍼를 제거한 후, 2.5 ㎍/mL의 비오틴 부착 토끼 항-트립신 다클론 항체 (Abcam, ab34676) 100 ㎕가 플레이트의 각 웰에 첨가되었다. 상기 플레이트는 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후에 PBST로 세척되었고, 1:1000으로 희석된 아비딘-HRP (avidin-horseradish peroxidase)(BD Pharmingen, 554058) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 다시 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 샘플은 PBST로 4회 세척되었으며, 100 ㎕의 TMB 기질 용액이 각 웰에 첨가되었다. 상기 반응은 상온에서 20분 동안 반응시킨 후에 50 ㎕의 6.3% H3PO4를 첨가하여 정지시켰고, 샘플의 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 430 nm에서 기록하였다.
세포 생존도의 측정
세포 생존도는 이전에 기술된대로 TTC (triphenyl tetrazolium chlorice)의 환원에 의해 측정되었다. 포마잔 (formazan)-생성 반응을 위해, 0.1 g의 신선한 세포가 1.6 mL의 TTC 용액이 담긴 마이크로튜브에 첨가되었다. 반응은 20℃에서 24시간 동안 수행되었고, 상층액은 4℃에서 15,000g로 10분 동안 원심분리하여 제거되었다. 이어서 살아있는 세포 유래의 포마잔이 1 mL의 95% 에탄올을 사용하여 60℃에서 30분 동안 추출되었다. 상층액은 4℃에서 15,000g로 30분 동안 원심분리하여 분리되었고, 추출된 포마잔의 흡광도는 485 nm에서 측정되었다.
실시예 1. 트립신 생산에 대한 대체 탄소원의 효과
트립신 생산량 증가에 효과적인 대체 탄소원을 선발하기 위해, 프럭토오스, 피루브산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산 및 말산이 조사되었다. 벼 세포는 50 mL의 N6 배지가 포함된 300 mL 플라스크에서 7일 동안 배양하여 유지되었고, 단백질 발현 유도를 위해서는 세포 배양 5일 후에 흡입을 통해 배양액이 제거되었다. 5 g의 세포가 수크로스 없이 80 mM의 다양한 대체 탄소원을 각각 포함하는 신선한 N6 배지 50 mL에 접종되었고, 5일 동안 배양되었다. 대조구로서, 대체 탄소원이 없는 당 결핍 조건이 조사되었다. 도 1에 나타난 것처럼, 대조구 (Ctrl)에 비해, 숙신산, 푸마르산 및 말산이 포함된 배지에서 재조합 트립신 단백질 (도 1A) 및 mRNA 전사체 (도 1B)의 양이 현저하게 증가되었다. 따라서 상기 세 가지 대체 탄소원이 추가의 실험을 위해 선발되었다.
트립신 생산을 위한 각 탄소원의 최적 농도 및 배양 시간을 측정하기 위해, 20, 40, 60, 80 및 100 mM 농도의 세 가지 탄소원이 각각 조사되었다. 명백하게, 40 mM의 푸마르산을 포함하는 배양 배지에서 세포가 5일 동안 배양되었을 때 가장 높은 생산성을 나타냈다 (도 2A 및 B). 가장 높은 트립신 생산량은 배양 5일에 68 mg/L에 도달했으며, 이는 대조구의 트립신 생산량 (18 mg/L)보다 약 4.3배 더 높다.
대체 탄소원을 사용하여 배양 배지 내에 축적된 트립신 및 효소 활성이 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿 분석 및 자이모그래피 (zymography)를 사용하여 확인되었다 (도 2C, D 및 E). 배양 배지로부터 수집된 총 분비 단백질은 SDS-PAGE로 분석되었으며, 겔은 0.25% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색되었다. 당 결핍 조건에 의해 유도된 44-46 kDa의 벼 α-아밀라아제 단백질은 겔에 표시되었다. 이전 논문에 기술된 것처럼 (Kim et al. Protein Exp Purif 2011;76:121-126), 분자량 24-26 kDa의 단백질에 해당하는 벼 세포 배양액 유래의 2가지 형태의 트립신이 웨스턴 블럿 분석 및 젤라틴 자이모그래피에서 관찰되었다. 양성 대조구에서, 소 (Bos taurus, Bt) 유래의 트립신은 24 kDa에서만 나타난 반면, 옥수수 (Zea mays, Zm) 유래의 재조합 트립신은 벼 세포 배양액 유래의 트립신과 유사하게 분자량 24-26 kDa의 위치에서 나타났다. 이는 식물 유래 트립신의 비일치 (nonconsensus) N-연결 당화 위치에서 기인했다 (Zhang et al. Anal Chem 2010;82:10095-10101). 또한, 웨스턴 블럿 분석 및 자이모그래피에서 40 mM 푸마르산이 포함된 배양액이 대조구 배양액보다 더 강한 밴드를 나타낸 것과 유사한 결과가 ELISA에서도 나타났다. 이 결과는 대체 탄소원이 포함된 배양액 중에서 가장 높은 트립신 생산량 및 활성이 40 mM 푸마르산을 포함하는 배양액에서 관찰된다는 것을 나타낸다. 따라서 상기 조건이 추가의 분석을 위해 선발되었다.
실시예 2. 푸마르산과 다양한 농도의 수크로스의 효과
일반적으로, 당 고갈 조건은 식물 세포에서 세포 성장의 저지, 호흡률의 감소, 탄수화물, 지질, 단백질과 같은 세포 성분의 분해 및 당분해 효소 활성의 감소를 유발한다. 따라서 현탁배양 세포는 당 고갈 이후에 재사용될 수 없다. 이는 형질전환 벼 세포 현탁배양에서 재조합 트립신의 대량 생산 시스템을 발전시키는데 있어서 가장 큰 문제점 중 하나이다. 수크로스와 푸마르산의 조합 효과를 측정하기 위해, 0, 0.5, 1 및 2% 수크로스와 40 mM 푸마르산의 조합이 조사되었으며, 그 결과는 ELISA (도 3A), 건조 세포 중량 (도 3B) 및 세포 생존도 (도 3C)의 측정을 통해 분석되었다. 도 3A, 3B 및 3C에 나타난 것처럼, 0% 수크로스와 40 mM 푸마르산의 조합은 배양 5일에 가장 높은 트립신 생산량 (68.2 mg/L)을 보여주었으며, 건조 세포 중량 및 세포 생존도는 배양 5일에 각각 대조구 (3% 수크로스, 데이터 미제시)의 21.2% 및 31%로 나타났다. 40 mM 푸마르산 및 0 내지 2% 농도의 수크로스 배지는 배양 5일에 62.8 mg/L에서 12 mg/L로 트립신 생산량 감소를 초래했지만, 수크로스 농도의 증가와 함께 건조 세포 중량 및 세포 생존도를 증가시켰다. 상기 결과에 따르면, 1% 수크로스 및 40 mM 푸마르산의 조합은 트립신 생산, 건조 세포 중량 및 세포 생존도를 상승 작용에 의해 향상시켰다. 이는 수크로스가 없는 배양 실험의 결과와 대조적이었으며, 이러한 이유로 상기 조건이 세포 재이용 연구를 위해 선발되었다.
실시예 3. 세포 재이용 및 트립신 생산을 위한 배양 시간
형질전환 벼 세포 현탁배양은 기본적으로 3% 수크로스가 포함된 배지로 매 7일마다 계대배양되었다. 배지 교환을 위한 최적 시간을 결정하기 위해, 3% 수크로스가 포함된 배양 배지는 다양한 배양 기간 (0, 2, 4, 6 및 8일) 이후에 제거되었고, 이어서 1% 수크로스와 40 mM 푸마르산을 포함한 신선한 배지가 첨가되었다. 지정된 배양 기간 이후에, 트립신 생산량이 웨스턴 블럿 분석 및 ELISA로 확인되었다. 도 4에 나타난 것처럼, 1% 수크로스 및 40 mM 푸마르산이 표시된 시간에 첨가되었을 때, 트립신 생산은 모든 조건에서 증가되었다. 4일 동안 배양된 세포가 사용되었을 때, 배양 5일 째에 가장 높은 트립신 생산량 (55 mg/L)이 관찰되었다. 따라서, 3% 수크로스 배지에서 4일 동안 배양된 세포가 벼 아밀라아제 3D 시스템에서 현탁배양 세포의 반복 사용 가능성을 시험하는데 사용되었다.
실시예 4. 1% 수크로스 및 40 mM 푸마르산이 포함된 배지에서 형질전환 벼 세포의 반복 사용으로 향상된 트립신 생산
트립신 생산량을 증가시키기 위한 세포의 반복 사용 가능성을 조사하기 위해, 형질전환 벼 세포는 0% 수크로스 (-S), 0% 수크로스와 40 mM 푸마르산 및 1% 수크로스와 40 mM 푸마르산을 각각 포함하는 배양 배지 50 mL이 담긴 300 mL 플라스크에서 회분식 배양으로 시험되었다. 세포는 3% 수크로스 배지를 사용하여 매 7일 마다 계대배양되었다. 세포 재이용 과정을 시험하기 위해, 3% 수크로스가 포함된 배지에서 4일 동안 배양된 현탁배양 세포의 배양액이 흡입을 통해 제거되었다. 이어서 세 종류의 신선한 배양 배지 50 mL이 각 플라스크에 첨가되었고, 지정된 기간 동안 배양되었다. 지정된 배양 기간 이후에 재조합 트립신 축적 및 세포 생존도가 관찰되었다. 현탁배양 세포는 재조합 트립신 생산을 위한 현탁배양 세포의 반복 사용 가능성을 확인하기 위해 5회 재사용되었다. 0%의 수크로스가 포함된 샘플에서, 트립신 축적량은 세포의 첫번째 사용 이후에 약 33%, 두번째 사용 이후에 22.2% 이하로 급격하게 감소되었다. 0% 수크로스의 경우에 첫번째 사용시 세포 생존도는 약 26.7%였으며, 이어서 16.7% 이하로 급속히 감소되었다. 또한 수크로스가 다시 공급되었을 때, 회복된 세포 성장이 없었기 때문에 세포 손상은 비가역적이었다 (데이터 미제시). 0% 수크로스 및 40 mM 푸마르산의 경우, 첫번째 사용 후에 트립신 생산 및 세포 생존도의 지연된 감소에도 불구하고 0% 수크로스의 경우와 유사한 현상이 관찰되었다. 그러나 1% 수크로스 및 40 mM 푸마르산의 경우에는 세포가 5회 반복 사용된 이후에 재조합 트립신 생산 및 세포 생존도의 미약한 감소가 나타났다. 5회의 세포 재이용 이후에, 재조합 트립신의 생산량은 초기 생산량의 73.6%였으며, 세포 생존도는 81.3%였다 (도 5A 및 B).

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. (a) 당 고갈시 작동하는 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 벼 세포를 당-풍부 배지에서 현탁배양하여 상기 벼 세포를 생장시키는 단계;
    (b) 상기 벼 세포를 푸마르산 및 1%(w/v) 이하의 수크로스의 농도로 혼합된 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 배양된 벼 세포를 새로운 푸마르산 및 1%(w/v) 이하의 수크로스의 농도로 혼합된 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 배양하여 상기 벼 세포로부터 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 벼 세포의 반복 사용을 통한 목적 단백질의 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 (c)단계를 3~5회 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서, 상기 (c)단계는 상기 배양된 벼 세포를 새로운 푸마르산 및 1%(w/v) 이하의 수크로스의 농도로 혼합된 혼합물을 함유하는 배지로 옮긴 후 3~5일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020140111560A 2014-08-26 2014-08-26 형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원의 활용 및 세포 재이용 시스템을 통한 재조합 트립신의 대량 생산방법 KR101628232B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140111560A KR101628232B1 (ko) 2014-08-26 2014-08-26 형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원의 활용 및 세포 재이용 시스템을 통한 재조합 트립신의 대량 생산방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140111560A KR101628232B1 (ko) 2014-08-26 2014-08-26 형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원의 활용 및 세포 재이용 시스템을 통한 재조합 트립신의 대량 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160024586A KR20160024586A (ko) 2016-03-07
KR101628232B1 true KR101628232B1 (ko) 2016-06-08

Family

ID=55540078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140111560A KR101628232B1 (ko) 2014-08-26 2014-08-26 형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원의 활용 및 세포 재이용 시스템을 통한 재조합 트립신의 대량 생산방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101628232B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102193521B1 (ko) 2019-07-01 2020-12-21 인하대학교 산학협력단 소르비톨 및 헥소키나제 저해제의 병용 처리를 통한 형질전환 벼 세포 배양에서의 재조합 인간 산 알파-글루코시다아제 생산성 증진용 조성물

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101244025B1 (ko) 2010-11-16 2013-03-14 전북대학교산학협력단 벼 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 소 트립신의 대량생산방법
KR101426459B1 (ko) * 2012-12-17 2014-08-05 전북대학교산학협력단 형질전환 벼 세포 현탁 배양으로 생산된 재조합 트립신의 효율적인 정제 방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101093737B1 (ko) * 2009-05-06 2011-12-19 인하대학교 산학협력단 Ｔｃａ 회로 중간생성물 및 당알코올을 포함하는 식물세포 배양 배지 및 재조합 단백질 대량생산 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101244025B1 (ko) 2010-11-16 2013-03-14 전북대학교산학협력단 벼 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 소 트립신의 대량생산방법
KR101426459B1 (ko) * 2012-12-17 2014-08-05 전북대학교산학협력단 형질전환 벼 세포 현탁 배양으로 생산된 재조합 트립신의 효율적인 정제 방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102193521B1 (ko) 2019-07-01 2020-12-21 인하대학교 산학협력단 소르비톨 및 헥소키나제 저해제의 병용 처리를 통한 형질전환 벼 세포 배양에서의 재조합 인간 산 알파-글루코시다아제 생산성 증진용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160024586A (ko) 2016-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tran et al. Biochemical and molecular characterization of AtPAP12 and AtPAP26: the predominant purple acid phosphatase isozymes secreted by phosphate‐starved Arabidopsis thaliana
Kobayashi et al. The rice transcription factor IDEF1 is essential for the early response to iron deficiency, and induces vegetative expression of late embryogenesis abundant genes
Mitsui et al. Physicochemical and serological characterization of rice [alpha]-amylase isoforms and identification of their corresponding genes
Koike et al. OsYSL2 is a rice metal‐nicotianamine transporter that is regulated by iron and expressed in the phloem
Helle et al. Proteome analysis of potato starch reveals the presence of new starch metabolic proteins as well as multiple protease inhibitors
Pérez-Pérez et al. Pectin de-methylesterification and AGP increase promote cell wall remodeling and are required during somatic embryogenesis of Quercus suber
Lin et al. A unique caleosin serving as the major integral protein in oil bodies isolated from Chlorella sp. cells cultured with limited nitrogen
Douché et al. Brachypodium distachyon as a model plant toward improved biofuel crops: Search for secreted proteins involved in biogenesis and disassembly of cell wall polymers
Hinz et al. Localization of vacuolar transport receptors and cargo proteins in the Golgi apparatus of developing Arabidopsis embryos
Schüssler et al. The effects of the loss of TIP1; 1 and TIP1; 2 aquaporins in Arabidopsis thaliana
Ge et al. iTRAQ protein profile differential analysis between somatic globular and cotyledonary embryos reveals stress, hormone, and respiration involved in increasing plantlet regeneration of Gossypium hirsutum L.
Weil et al. Cell wall invertase in tobacco crown gall cells: enzyme properties and regulation by auxin
Yua et al. AtECB1/MRL7, a thioredoxin-like fold protein with disulfide reductase activity, regulates chloroplast gene expression and chloroplast biogenesis in Arabidopsis thaliana
Kim et al. High-level production of recombinant trypsin in transgenic rice cell culture through utilization of an alternative carbon source and recycling system
Bölter et al. A chloroplastic inner envelope membrane protease is essential for plant development
Jemmat et al. Coordination of five class III peroxidase-encoding genes for early germination events of Arabidopsis thaliana
Chi-Ham et al. The DNA-compacting protein DCP68 from soybean chloroplasts is ferredoxin: sulfite reductase and co-localizes with the organellar nucleoid
Liu et al. Purification and characterization of soluble invertases from suspension-cultured bamboo (Bambusa edulis) cells
CN102027122A (zh) 一种在植物中生产人类蛋白质的方法,特别是在谷物胚乳中生产人重组溶酶体酶
KR101628232B1 (ko) 형질전환 벼 세포 배양에서 대체 탄소원의 활용 및 세포 재이용 시스템을 통한 재조합 트립신의 대량 생산방법
Zhang et al. NtCP56, a new cysteine protease in Nicotiana tabacum L., involved in pollen grain development
Ye et al. EMB2738, which encodes a putative plastid‐targeted GTP‐binding protein, is essential for embryogenesis and chloroplast development in higher plants
Segretin et al. Transformation of Solanum tuberosum plastids allows high expression levels of β-glucuronidase both in leaves and microtubers developed in vitro
KR101321890B1 (ko) 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 용도
De Nisi et al. Application of the split root technique to study iron uptake in cucumber plants

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190508

Year of fee payment: 4