KR101625595B1 - Composition of cell culture media containing LiCl for enhancing the recombinant protein production, and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고농도의 재조합 단백질을 생산할 수 있는 세포 배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 염화리튬(LiCl)이 첨가된 배지를 이용하여 재조합 단백질을 발현하는 유전자가 형질감염된 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주를 배양한 결과, 상기 염화리튬이 포함된 배지는 세포의 비생산속도, 세포의 생존율 및 목적 단백질의 최대 농도를 증가시킴으로써 치료용 재조합 단백질을 생산하는 데에 유용하게 이용될 수 있다. The present invention relates to a cell culture medium composition capable of producing a high concentration of recombinant protein, and more particularly, to a Chinese hamster ovary (CHO) transfected with a gene expressing a recombinant protein using a medium supplemented with lithium chloride (LiCl) As a result of culturing the cell line, the medium containing lithium chloride can be usefully used for producing a therapeutic recombinant protein by increasing the rate of cell production, the cell survival rate and the maximum concentration of the target protein.
Description
본 발명은 고농도의 재조합 단백질을 생산할 수 있는 세포 배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 재조합 단백질을 발현하는 유전자가 형질감염된 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주를 염화리튬(LiCl)이 추가로 첨가된 배지를 이용하여 배양함으로써 목적 단백질의 생산을 증가시킬 수 있는 세포 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a culture medium composition for cell culture capable of producing a high concentration of recombinant protein. More specifically, the present invention relates to a CHO (Chinese hamster ovary) cell line transfected with a gene expressing a recombinant protein, To a culture medium for cell culture which can increase the production of a target protein by culturing using a medium.
암, 감염성 질환 또는 자가 면역 질환의 진단, 예방 및 치료를 위한 치료제로서 단일클론 항체의 대량 생산이 1975년 영국의 밀스타인(Milstein) 박사와 콜러(Kohler) 박사에 의해 마우스의 하이브리도마 기술 개발을 통해 가능해졌다. 그러나, 하이브리도마 기술을 이용해 생산된 마우스의 단일클론 항체를 인체에 반복 투여하였을 경우, 인체의 면역반응을 유발하는 부작용이 생겼고, 그 효과가 감소하는 현상을 발견하였다. 따라서, 유전공학 기술과 단백질 공학기술을 이용하여 마우스 단일클론항체를 인간화 시키는 기술이 개발되었으며, 여러 선진국에서 경쟁적으로 다양한 질환의 예방, 진단 및 치료를 위한 의약품으로서 인간화 항체 개발을 수행하고 있다. 최근에는 인간화된 단일클론항체뿐만 아니라 다양한 재조합 단백질 의약품을 개발하고 있으며, 임상적으로 큰 효과를 보이고 있다. 이러한 인간화된 재조합 항체를 포함하는 치료용 재조합 단백질을 임상적으로 실험하고, 나아가 상품화하기 위해서는 경제적인 대량 생산이 필수적이다.
Mass production of monoclonal antibodies as therapeutic agents for the diagnosis, prophylaxis and treatment of cancer, infectious diseases or autoimmune diseases was developed by Dr. Milstein and Kohler of the United Kingdom in 1975 in the development of mouse hybridoma technology . However, when a monoclonal antibody of a mouse produced using the hybridoma technique is repeatedly administered to the human body, side effects that cause the immune response of the human body have occurred, and the effect has been found to be reduced. Therefore, techniques for humanizing mouse monoclonal antibodies using genetic engineering technology and protein engineering technology have been developed, and humanized antibodies have been developed as pharmaceuticals for the prevention, diagnosis and treatment of various diseases competitively in various advanced countries. In recent years, humanized monoclonal antibodies as well as various recombinant protein drugs have been developed and have shown great clinical effects. In order to clinically test therapeutic recombinant proteins containing such humanized recombinant antibodies and further commercialize them, economic mass production is essential.
재조합 단백질 또는 재조합 바이러스 의약품을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포로는 대장균, 효모 및 동물세포 등이 있으며, 상기 숙주 세포 중에서 동물 세포를 숙주로 하여 제조하는 재조합 의약품의 비중이 나날이 증가하고 있다. 이러한 동물 세포로는 CHO(Chinese Hamster Ovary), BHK(Baby Hamster Kidney), NS0 골수종 세포 등이 널리 이용되고 있다. 동물세포 유래의 재조합 의약품을 산업적으로 생산하기 위해서는 동물 세포를 배양해야 하는데, 최근에는 동물 세포를 배양하는 방법으로 무혈청 배지를 사용하는 배양 방법이 널리 보편화되고 있다.
Host cells used for producing recombinant protein or recombinant virus drugs include Escherichia coli, yeast, and animal cells. Among these host cells, the proportion of recombinant drugs produced using animal cells as a host is increasing day by day. As such animal cells, Chinese hamster ovary (CHO), baby hamster kidney (BHK) and NS0 myeloma cells are widely used. In order to industrially produce recombinant pharmaceuticals derived from animal cells, animal cells must be cultured. Recently, culture methods using serum-free medium as a method of culturing animal cells have become widely used.
치료용 재조합 단백질의 대량 생산을 위해 산업적으로 이용되고 있는 방법으로는 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR)가 결핍된 CHO 세포주(CHO dhfr(-)), CHO K1 세포주(subclone from the parental CHO cell), BHK(Baby Hamster Kidney fibroblasts) 세포주 및 NS0(murine myeloma) 세포주 등을 이용한 방법이 있다. 이들 세포주 중에서 CHO dhfr(-) 세포주는 치료용 재조합 단백질을 산업적으로 대량 생산하기 위하여 가장 널리 사용되고 있는 숙주세포주이다. CHO dhfr(-) 세포주가 산업적으로 가장 선호되는 이유는 하기와 같다. The CHO cell line (CHO dhfr (-)) deficient in dihydrofolate reductase (DHFR), the CHO K1 cell line (subclone from the parental CHO cell, BHK (baby hamster kidney fibroblasts) cell line, and NS0 (murine myeloma) cell line. Among these cell lines, the CHO dhfr (-) cell line is the most widely used host cell line for industrial mass production of therapeutic recombinant proteins. The reason why the CHO dhfr (-) cell line is the most preferred in industry is as follows.
첫째, 단백질의 번역 후 수정과정(posttranslational modification), 즉 당쇄화(glycosylation) 과정 및 인산화(phosphorylation) 과정이 인간 세포와 유사하여 인체의 면역 반응을 최소화하며, 인체 내에서 효과가 높은 치료용 재조합 단백질의 생산이 가능하다. 둘째, 부유 배양이 가능하여 고농도 배양 및 대량 생산 공정에 적용하기 좋다. 셋째, 디하이드로폴레이트 환원효소/메쏘트렉세이트(dihydrofolate reductase, DHFR/methotrexate, MTX) 유전자 증폭 시스템을 이용하여 높은 치료용 재조합 단백질의 생산이 가능하다. 넷째, 오랜 연구를 통해 안전성이 검증되어 있기 때문에 FDA와 같은 감독기관으로부터 허가를 쉽게 받을 수 있다. First, posttranslational modification, that is, glycosylation process and phosphorylation process of the protein is similar to human cell, minimizing the immune reaction of the human body, Can be produced. Secondly, floating culture is possible, so it is suitable for high concentration culture and mass production process. Third, it is possible to produce high therapeutic recombinant proteins by using dihydrofolate reductase (DHFR / methotrexate, MTX) gene amplification system. Fourth, since the safety has been verified through long-term studies, it is easy to obtain permission from the regulatory body such as FDA.
상기 CHO dhfr(-) 세포주에 치료용 재조합 단백질 유전자가 포함된 벡터를 형질감염시켜 전환시킴으로써 치료용 재조합 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포주가 제조된다. The CHO dhfr (-) cell line is transformed by transfection with a vector containing a therapeutic recombinant protein gene to produce a recombinant CHO cell line that produces a therapeutic recombinant protein.
디하이드로폴레이트 환원효소는 전자 기증체로서 NADPH를 사용하여 디하이드로폴레이트(dihydrofolate)를 세포 증식 및 성장에 필수적인 퓨린(purine), 티미딜릭산(hymidylic acid) 및 특정 아미노산의 합성에 요구되는 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate)으로 환원시키는 효소이다. 대부분의 생물체에서 DHFR은 테트라하이드로폴레이트의 양을 조절하는데 주요한 역할을 한다. Dihydrofolate reductase uses dihydrofolate as an electron donor to convert purine, hymidylic acid, and tetra (2-ethylhexyl), which are essential for cell proliferation and growth, Is an enzyme which reduces to tetrahydrofolate. In most organisms, DHFR plays a major role in controlling the amount of tetrahydrofolate.
CHO 세포를 이용한 치료용 재조합 단백질의 수요가 크게 증가함에 따라, 치료용 재조합 단백질의 생산성을 높이기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 특히 세포의 성장억제를 통하여 단위세포당 치료용 재조합 단백질의 생산성을 증가시켜 최종 치료용 재조합 단백질의 생산성을 높이는 방법은 가장 효율적인 생산성 증가 방법 중의 하나이다. 세포 성장억제를 위해 대목적으로 사용되고 있는 화학 첨가물로는 부티르산염(sodium butyrate)이 있다. 부티르산염은 세포 성장 억제를 통해 비생산 속도(qp) 및 목적 단백질의 최종 농도를 증가할 수 있지만 동시에 그 자체의 세포독성에 의해 세포예정사를 유도하기 때문에 실제적으로 높은 농도의 부티르산염을 사용하는데는 문제가 있다. As the demand for recombinant proteins for therapeutic use in CHO cells is greatly increased, various studies are being conducted to increase the productivity of therapeutic recombinant proteins. In particular, a method of increasing the productivity of the recombinant protein for treatment by increasing the productivity of therapeutic recombinant protein per unit cell through inhibition of cell growth is one of the most efficient methods of increasing the productivity. Sodium butyrate is the chemical additive used for cell growth inhibition. Butyrate can increase the rate of production (q p ) and the final concentration of the target protein through inhibition of cell growth, but at the same time it induces the cell to be cytotoxic by its own cytotoxicity, so that a practically high concentration of butyrate is used There is a problem with this.
따라서, 상기 부티르산염에 의해 유도되는 세포예정사를 억제하기 위해 Bcl-2 단백질과 같은 생존단백질을 재조합 CHO 세포로부터 과발현시켜 세포 사멸을 억제하는 실험이 시도된바 있으며, 목적 단백질의 최종 농도를 증가시키는데 성공한 바 있다(Kim and Lee, Biotechnol. Bioeng., 71, 184-193, 2001). 그러나, 재조합 세포주를 개발하는 것은 시간과 노동력의 소모가 크며, 선별된 세포주간의 효과가 크게 차이가 나기 때문에 실제 산업적으로 쓰이기 어려운 점이 있다. 따라서 비생산속도를 증가시킴과 동시에 세포를 배양하는 배지에 독성이 없는 새로운 첨가물을 첨가하여 생산속도를 증가시킬 필요성이 끊임없이 대두하여 왔다.
Therefore, an attempt has been made to suppress cell death by overexpressing survival proteins such as Bcl-2 protein from recombinant CHO cells in order to inhibit the cells to be induced by the butyrate salt. (Kim and Lee, Biotechnol. Bioeng., 71, 184-193, 2001). However, the development of recombinant cell lines is time consuming and labor-intensive, and the effectiveness of selected cell lines is very different, making them difficult to use in industry. Therefore, there is a continuing need to increase the rate of production by adding non-toxic new additives to the medium for cell culture, while increasing the rate of non-production.
염화리튬(LiCl)은 지난 100년 이상 조울병을 비롯한 다양한 정신 질환 치료제로 널리 사용되고 있는 물질로 글리코겐 합성 키나제-3베타(Glycogen synthase kinase 3-beta; GSK-3β)의 대표적인 억제제이다. GSK-3β세포의 생존, 발생, 단백질 생산, 분열 및 세포예정사 등 다양한 세포 내 신호 전달을 조절하는 유전자로, 특히 G2/M 세포 주기를 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 염화리튬은 GSK-3β를 효과적으로 억제하며, 이를 통해 세포를 G2/M 세포주기에 멈추게 하는 효과가 있고(Cao Q et al., Cell Res., 16, 671-677, 2006), 리튬은 알츠하이머병에 걸릴 확률을 감소시킨다는 보고가 있다(Medizinauskunft.de., 2004). 우울증에 보이는 효력은 아마도 세로토닌의 신경 전달을 강화하는 데에서 비롯되고, 조울병은 도파민 수용체를 억누르기 때문인 것으로 추측된다. 그러나, 지금까지 염화리튬을 이용하여 CHO 세포주를 비롯한 다른 동물 유래 세포주에서 치료용 재조합 단백질의 생산을 위해 사용한 보고는 아직까지 알려진 바 없다.
Lithium chloride (LiCl) has been widely used as a therapeutic agent for various psychiatric diseases including manic depression for over 100 years, and is a typical inhibitor of Glycogen synthase kinase 3-beta (GSK-3β). It is known that GSK-3β plays a role in regulating G2 / M cell cycle, which regulates various signaling pathways such as survival, development, protein production, division and cell proliferation. Lithium chloride effectively inhibits GSK-3 beta, thereby causing cells to stop in the G2 / M cell cycle (Cao Q et al., Cell Res., 16, 671-677, 2006) (Medizinauskunft.de., 2004). In addition, there is a growing body of evidence suggesting that the risk of developing The effect seen in depression is presumably due to the enhancement of neurotransmission of serotonin, and manic depression suppresses dopamine receptors. However, a report on the production of therapeutic recombinant proteins in cell lines derived from other animal including CHO cell line using lithium chloride has not yet been known.
이에, 본 발명자들은 고농도의 치료용 재조합 단백질을 생산할 수 있는 배지 조성물을 얻기 위해 연구한 결과, 배지에 염화리튬을 1 내지 20 mM의 농도로 첨가함으로써 비생산속도 및 세포 생존율을 높여 결과적으로 목적 단백질을 고농도로 얻을 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors have conducted studies to obtain a culture composition capable of producing a high-concentration therapeutic recombinant protein. As a result, lithium chloride was added to the medium at a concentration of 1 to 20 mM to increase the rate of non-production and cell viability, Can be obtained at a high concentration. Thus, the present invention has been completed.
본 발명의 목적은 재조합 단백질 생산 증가를 위한 염화리튬을 포함하는 세포 배양용 배지 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a culture medium composition for cell culture comprising lithium chloride for increased recombinant protein production and its use.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기본 배지에 염화리튬(LiCl)을 함유하는 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a culture medium for cell culture comprising lithium chloride (LiCl) in a basic medium.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 염화리튬이 포함된 배지에 목적하는 재조합 단백질을 생산하는 형질 전환체를 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및1) culturing a transformant producing the desired recombinant protein in a medium containing lithium chloride, and obtaining a culture; And
2) 상기 단계 1)의 배양액으로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질 생산 방법을 제공한다.2) separating the recombinant protein from the culture medium of step 1).
나아가, 본 발명은 염화리튬을 유효성분으로 함유하는 배지 첨가제를 제공한다.
Further, the present invention provides a culture medium additive containing lithium chloride as an active ingredient.
본 발명은 고농도의 재조합 단백질을 생산할 수 있는 세포 배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 재조합 단백질을 발현하는 유전자가 형질감염된 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주를 1 내지 20 mM 농도로 염화리튬(LiCl)이 첨가된 배지를 이용하여 배양한 결과, 세포의 비생산속도, 세포의 생존율 및 목적 단백질의 최대 농도를 증가시키는 것을 확인함으로써 상기 염화리튬이 첨가된 배지 조성물을 고농도의 재조합 단백질을 생산하는 관련 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
The present invention relates to a culture medium composition for cell culture capable of producing a high concentration of a recombinant protein, and more particularly, to a Chinese hamster ovary (CHO) cell line transfected with a gene expressing a recombinant protein, ), It was found that the cell growth rate, cell survival rate and maximum concentration of the target protein were increased. As a result, it was confirmed that the culture medium to which lithium chloride had been added was used for the production of a recombinant protein at a high concentration And can be used in industrial fields.
도 1은 치료용 재조합 단백질을 생산하는 세포를 플라스크에서 다양한 농도의 염화리튬을 첨가한 조건에서 회분식 배양하였을 때, 세포 성장, 세포 생존율 및 치료용 재조합 단백질 농도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 치료용 재조합 단백질을 생산하는 세포를 생물반응기에서 최적 농도(10 mM)의 염화리튬을 첨가한 조건에서 회분식 배양하였을 때, 세포 성장, 세포 생존율 및 치료용 재조합 단백질의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 치료용 재조합 단백질을 생산하는 세포를 플라스크에서 최적 농도(10 mM)의 염화리튬을 첨가한 조건에서 유가식 배양하였을 때, 세포 성장, 세포 생존율 및 치료용 재조합 단백질의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 치료용 재조합 단백질을 생산하는 세포를 플라스크에서 최적 농도(10 mM)의 염화리튬을 배양 초기 및 배양 중간에 첨가하여 회분식 배양하였을 때, 세포 성장, 세포 생존율 및 치료용 재조합 단백질 농도를 나타낸 그래프이다. FIG. 1 is a graph showing cell growth, cell viability, and recombinant protein concentration for therapeutic treatment when the cell producing the therapeutic recombinant protein is batch-cultured in a flask with various concentrations of lithium chloride added thereto.
FIG. 2 is a graph showing cell growth, cell viability, and concentration of therapeutic recombinant protein when the cells producing the therapeutic recombinant protein are batch-cultured under the condition of adding lithium chloride at an optimal concentration (10 mM) in a bioreactor .
FIG. 3 is a graph showing cell growth, cell viability, and concentration of therapeutic recombinant protein when the cell producing the therapeutic recombinant protein is cultured in a flask under the condition of adding lithium chloride at an optimal concentration (10 mM) .
FIG. 4 shows cell growth, cell viability, and therapeutic protein concentration when the cells producing the therapeutic recombinant protein were cultured in a flask at an optimal concentration (10 mM) of lithium chloride at the initial stage of culture and in the middle of culture Graph.
이하, 본 발명의 용어를 상세히 설명한다.
Hereinafter, the terminology of the present invention will be described in detail.
본 발명의 용어 "회분식배양(batch culture)"은 처음 공급한 원료기질이 모두 소비될 때까지 배양을 계속하는 방법으로 기질의 농도, 대사생산물의 농도, 세포의 농도 등이 시간에 따라 계속 변화하는 배양법을 의미한다.The term " batch culture "of the present invention is a method of continuing cultivation until all the raw material substrates are consumed, and the concentration of the substrate, the concentration of the metabolite product, the concentration of the cells, Culture method.
본 발명의 용어 "유가식 배양(fed-batch culture)"은 배지를 간헐적으로 공급하는 배양법으로서 배양액 중의 기질 농도를 임의로 제어할 수 있고, 기질은 적당한 속도로 첨가되며 유출이 없기 때문에 공급되는 기질의 양을 자유롭게 제어할 수 있는 장점이 있다. 유가식 배양은 주로 기질이 비교적 낮은 농도에서 세포의 생장을 저해하는 경우, 특정 기질의 농도가 높아지면 목적생산물의 생산이 억제되는 경우, 또는 영양요구성주(auxotroph)의 배양에서 특정 요구물질의 첨가가 필요한 경우에 사용할 수 있는 배양법을 의미한다.
The term " fed-batch culture "of the present invention is a culture method in which a medium is fed intermittently, wherein the substrate concentration in a culture medium can be arbitrarily controlled, the substrate is added at a proper rate, There is an advantage that the amount can be freely controlled. The fed-batch culture is mainly used when the substrate inhibits cell growth at a relatively low concentration, when production of the desired product is inhibited when the concentration of the specific substrate is increased, or when addition of a specific required substance is required in culturing the auxotroph Means a culture method that can be used when necessary.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 기본 배지에 염화리튬(LiCl)을 함유하는 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.The present invention provides a culture medium for cell culture containing lithium chloride (LiCl) in a basic medium.
상기 기본 배지는 동물세포 배양용 배지 또는 이들의 변형된 배지로부터 사용되는 공지된 배지를 의미하며 시판중인 무혈청 배지, 무단백 배지 및 화학 정의 배지(chemically defined media)로부터 선택되는 것이 바람직하다. The above-mentioned base medium means a known medium used from an animal cell culture medium or a modified medium thereof, and is preferably selected from commercially available serum-free medium, endless white medium and chemically defined medium.
상기 무혈청 배지는 재조합 의약품을 생산하는데 널리 이용되고 있는 숙주세포를 배양하는데 사용되는 배지로 SFM4CHO 배지(HyClone), Iscove's 배지, Ultra-CHO-배지(BioWhittaker) 또는 EX-Cell(JHR Bioscience)인 것이 바람직하고, 인슐린형 성장인자 Ⅰ(Insulin like growth factor Ⅰ, IGF-Ⅰ), 변형 표피 성장인자(Long epidermal growth factor, Long EGF), 소듐 셀레니트(Sodium selenite), 퓨트레신(Putrescine), 에탈올아민(Ethanolamine), 글루타치온(Glutathione), 레티노익산(Retinoic acid), 전환성장인자 β1(Human transfor ming growth factor β1, hTGF-β1), 페릭 클로라이드(Ferric chloride) 및 플루로닉 F68(Pluronic F68)이 첨가될 수 있으나 이에 한정하지 않는다.The serum-free medium is SFM4CHO medium, Iscove's medium, Ultra-CHO medium (BioWhittaker), or EX-Cell (JHR Bioscience) medium used for culturing host cells widely used for producing recombinant pharmaceuticals (IGF-I), long epidermal growth factor (EGF), sodium selenite, putrescine, and insulin-like growth factor I (Human transfor ming growth factor? 1, hTGF-? 1), ferric chloride, and Pluronic F68. But the present invention is not limited thereto.
상기 무단백 배지는 동물 유래 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지에서 특히 분자량 10 kDa 이상의 단백질이 전혀 첨가되지 않은 배양 배지로서, ProCH05 배지인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.The above-mentioned media is preferably a ProCH05 medium, but is not limited thereto, in a serum-free medium containing no animal-derived serum, in particular, a medium in which no protein having a molecular weight of 10 kDa or more is added at all.
상기 화학 정의 배지는 동물 유래의 성분이 없고, 모든 성분이 공지된 화학적 구조를 가지며 미지 조성물의 성분, 단백질 또는 가수분해물이 전혀 없는 무혈청 배지이며, 상기 화학 정의 배지는 PF-CHO(JHR-Bioscience)와 같은 단백질 없는 배지, ProCHO 4CDM(Bio Whittaker) 또는 SMIF 7(Gibco/BRL-Life Technologies)와 같은 화학적으로 규명된 배지인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.Wherein the chemically defined medium is a serum-free medium free from animal-derived components, all components having a known chemical structure, no component of the unknown composition, no protein or hydrolyzate, and the chemically defined medium is PF-CHO (JHR-Bioscience ), A chemically defined medium such as ProCHO 4 CDM (Bio Whittaker) or SMIF 7 (Gibco / BRL-Life Technologies), but is not limited thereto.
상기 염화리튬은 1 내지 20 mM의 농도인 것이 바람직하고, 상기 염화리튬이 1 mM 이하인 경우에는 낮은 세포 성장 억제와 낮은 목적 단백질 생산성을 보이고, 20 mM 이상의 경우에는 목적 단백질의 생산성이 현저히 낮아지므로 상기 염화리튬은 1 내지 20 mM의 농도인 것이 바람직하고, 5-15 mM인 것이 보다 바람직하고, 10 mM인 것이 가장 바람직하다.The lithium chloride preferably has a concentration of 1 to 20 mM, and when the lithium chloride is 1 mM or less, low cell growth inhibition and low target protein productivity are shown. When the concentration is 20 mM or more, the productivity of the target protein is remarkably low. The concentration of lithium chloride is preferably 1 to 20 mM, more preferably 5 to 15 mM, most preferably 10 mM.
상기 배지 조성물은 재조합 단백질의 생산성을 향상시키는 것이 바람직하다.It is preferable that the culture medium composition improves the productivity of the recombinant protein.
본 발명의 목적상 상기 재조합 단백질은 해당 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 포유동물 숙주세포에서 발현된 단백질을 의미한다. 재조합 단백질은 포유동물 숙주세포에서 정상 발현되는 단백질과 동일하거나 유사한 것일 수 있다. 또한, 재조합 단백질은 숙주세포에 대해 외인성인, 즉 숙주세포에서 정상 발현되는 단백질과 이종성인 것일 수 있다. 또는 재조합 단백질은 일부는 숙주세포에서 정상 발현되는 단백질과 동일하거나 유사한 반면, 다른 일부는 숙주세포에 대해 외인성인 아미노산 서열을 함유한다는 점에서 키메라성일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 치료용 재조합 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 트롬보포이에틴(TPO), 에리트로포이에틴(EPO), 항혈액응고제(tPA), 단일클론항체 또는 Fc 함유 융합 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. For the purposes of the present invention, the recombinant protein refers to a protein expressed in a mammalian host cell genetically engineered to express the protein. The recombinant protein may be the same or similar to the normally expressed protein in the mammalian host cell. In addition, the recombinant protein may be heterologous to the host cell, i. E., Heterologous to the protein normally expressed in the host cell. Or recombinant proteins may be chimeric in that some contain the amino acid sequence that is identical or similar to that normally expressed in the host cell, while the other part is exogenous to the host cell. For the purpose of the present invention, the therapeutic recombinant protein is preferably a fusion protein containing thrombopoietin (TPO), erythropoietin (EPO), anti-coagulant (tPA), monoclonal antibody or Fc But not limited to this.
상기 배지 조성물은 동물 세포주의 비생산속도(단위세포당 생산성, qp) 및 세포 생존율을 증가시킨다.The medium composition increases the rate of production of an animal cell line (productivity per unit cell, q p ) and cell viability.
상기 동물 세포주는 재조합 단백질을 발현하는 유전자를 형질전환 또는 형질주입이 가능한 세포가 바람직하고, CHO, CHO K1, VERO, BHK, HeLa, Cv1, MDCK, 293, 3T3, 골수(myeloma), PC12 및 WI38 세포인 것이 더욱 바람직하고, CHO 세포를 이용하는 것이 더욱 바람직하고, DHFR 유전자가 결실된 CHO(CHO dhfr(-))세포인 것이 바람직하다.
Preferably, the animal cell line is a cell capable of transfection or transfection of a gene expressing a recombinant protein, and CHO, CHO K1, VERO, BHK, HeLa, Cv1, MDCK, 293, 3T3, myeloma, PC12 and WI38 More preferably a CHO cell, more preferably a CHO (CHO dhfr (-)) cell in which a DHFR gene is deleted.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 재조합 단백질을 고농도로 생산하기 위한 최적의 배지 조성을 확인하기 위하여, 플라스크(저용량(125 ㎖) 또는 대용량(3 ℓ))에 있는 0, 1, 5, 10 및 20 mM 농도의 염화리튬이 첨가된 무혈청 배지에서 재조합 CHO 세포를 회분식 배양하고 세포 생존율 및 재조합 단백질의 생산성을 조사한 결과, 10 mM의 염화리튬을 첨가하였을 때 세포 성장 억제 및 치료용 재조합 단백질의 생산성이 크게 증가함을 확인하였으며, 이는 대용량 위주의 산업적 측면에도 상기 방법을 적용할 수 있음을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조). In a specific embodiment of the present invention, 0, 1, 5, 10 and 20 mM in a flask (low volume (125 ml) or large volume (3 l)) to confirm the optimum medium composition for high- Recombinant CHO cells were cultured in a serum-free medium supplemented with lithium chloride at a concentration of 10 mM, and cell viability and productivity of recombinant proteins were measured. As a result, when 10 mM lithium chloride was added, And it is confirmed that the above method can be applied also to the industrial aspect of large capacity (refer to FIG. 1 and FIG. 2).
유가식 생산 공정에서 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인한 결과, 10 mM의 염화리튬이 첨가된 유가식 배양은 유의적인 세포성장 억제 및 단위 세포당 재조합 단백질의 생산성을 증가시키고, 상기 회분식 배양과 비교하여 재조합 단백질 생산 증가 효과를 확인하였다(도 3 참조).
As a result, it was found that 10 mM lithium chloride-added fed-batch culture increased significant cell growth inhibition and productivity of recombinant protein per unit cell, and compared with the batch culture Confirming the effect of increasing recombinant protein production (see FIG. 3).
따라서, 본 발명의 염화리튬이 첨가된 배지는 재조합 단백질의 생산성이 크게 증가하고, 산업적으로 적용할 수 있음을 확인함으로써 치료용 재조합 단백질 생산 증가용 배지 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the culture medium containing lithium chloride of the present invention can be effectively used as a culture medium for increasing the production of therapeutic recombinant protein by confirming that the productivity of recombinant protein is greatly increased and can be industrially applied.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 본 발명의 염화리튬이 포함된 배지에 목적하는 재조합 단백질을 생산하는 형질 전환체를 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및1) culturing a transformant producing the desired recombinant protein in a medium containing lithium chloride of the present invention and obtaining a culture; And
2) 상기 단계 1)의 배양액으로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질 생산 방법을 제공한다.2) separating the recombinant protein from the culture medium of step 1).
상기 단계 1)의 배지는 염화리튬을 1 내지 20 mM 농도로 함유하는 것이 바람직하고, 염화리튬의 농도가 10 mM인 것이 바람직하다.The medium of step 1) preferably contains lithium chloride in a concentration of 1 to 20 mM, and the concentration of lithium chloride is preferably 10 mM.
상기 단계 1)의 형질 전환체를 배양하는 배지에 염화리튬을 추가적으로 첨가하는 것이 바람직하다.It is preferable to add lithium chloride to the culture medium for culturing the transformant of step 1).
상기 재조합 단백질은 해당 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 포유동물 숙주세포에서 발현된 단백질을 의미한다. 재조합 단백질은 포유동물 숙주세포에서 정상 발현되는 단백질과 동일하거나 유사한 것일 수 있다. 또한, 재조합 단백질은 숙주세포에 대해 외인성인, 즉 숙주세포에서 정상 발현되는 단백질과 이종성인 것일 수 있다. 또는 재조합 단백질은 일부는 숙주세포에서 정상 발현되는 단백질과 동일하거나 유사한 반면, 다른 일부는 숙주세포에 대해 외인성인 아미노산 서열을 함유한다는 점에서 키메라성일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 치료용 재조합 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 트롬보포이에틴(TPO), 에리트로포이에틴(EPO), 항혈액응고제(tPA), 단일클론항체 또는 Fc 함유 융합 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. The recombinant protein refers to a protein expressed in a mammalian host cell genetically engineered to express the protein. The recombinant protein may be the same or similar to the normally expressed protein in the mammalian host cell. In addition, the recombinant protein may be heterologous to the host cell, i. E., Heterologous to the protein normally expressed in the host cell. Or recombinant proteins may be chimeric in that some contain the amino acid sequence that is identical or similar to that normally expressed in the host cell, while the other part is exogenous to the host cell. For the purpose of the present invention, the therapeutic recombinant protein is preferably a fusion protein containing thrombopoietin (TPO), erythropoietin (EPO), anti-coagulant (tPA), monoclonal antibody or Fc But not limited to this.
상기 배지는 동물세포 배양용 배지 또는 이들의 변형된 배지로부터 사용되는 공지된 배지를 의미하며 시판중인 무혈청 배지, 무단백 배지 및 화학 정의 배지(chemically defined media)로부터 선택되는 것이 바람직하다. The medium refers to a known medium used from an animal cell culture medium or a modified medium thereof, and is preferably selected from commercially available serum-free medium, endless white medium and chemically defined medium.
따라서, 본 발명의 염화리튬이 첨가된 배지는 재조합 단백질의 생산성을 크게 증가시키므로, 상기 염화리튬이 포함된 배지를 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법을 산업적으로 치료용 재조합 단백질 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the culture medium containing lithium chloride of the present invention greatly increases the productivity of the recombinant protein, so that a method of producing the recombinant protein using the culture medium containing lithium chloride can be industrially used for producing the therapeutic recombinant protein have.
또한, 본 발명은 염화리튬을 유효성분으로 함유하는 배지 첨가제를 제공한다.The present invention also provides a culture medium additive containing lithium chloride as an active ingredient.
상기 염화리튬은 1 내지 20 mM의 농도인 것이 바람직하고, 상기 염화리튬이 1 mM 이하인 경우에는 낮은 세포 성장 억제와 낮은 목적 단백질 생산성을 보이고, 20 mM 이상의 경우에는 목적 단백질의 생산성이 현저히 낮아지므로 상기 염화리튬은 1 내지 20 mM의 농도인 것이 바람직하고, 5-15 mM인 것이 보다 바람직하고, 10 mM인 것이 가장 바람직하다.
The lithium chloride preferably has a concentration of 1 to 20 mM, and when the lithium chloride is 1 mM or less, low cell growth inhibition and low target protein productivity are shown. When the concentration is 20 mM or more, the productivity of the target protein is remarkably low. The concentration of lithium chloride is preferably 1 to 20 mM, more preferably 5 to 15 mM, most preferably 10 mM.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 염화리튬을 첨가제로서의 역할 가능성에 대하여 조사한 결과, 염화리튬을 배양 0 일째 및 배양 2일째에 첨가한 경우, 배양 0 일째에 염화리튬을 첨가한 군과 비교하여 비생산 속도 및 재조합 단백질 농도가 현저히 증가하는 효과를 나타내므로(도 4 참조), 상기 염화리튬은 배지 첨가제로 사용될 수 있음을 확인하였다.
In a specific example of the present invention, the inventors of the present invention investigated the possibility that lithium chloride acts as an additive. As a result, when lithium chloride was added on the 0th day of culture and on the 2nd day of culture, (See FIG. 4), it was confirmed that the lithium chloride can be used as a culture additive.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
However, the following Examples and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following Examples and Experimental Examples.
<< 실시예Example 1> 치료용 재조합 단백질을 생산하는 재조합 1> Recombinant Producing Therapeutic Recombinant Proteins CHOCHO 세포의 125 ㎖ 플라스크에서의 부유배양 Suspension culture in 125 ml flasks of cells
본 발명자들은 패혈증(Sepsis)과 관련된 Fc 단백질(Fc-fusion protein)과 같은 치료용 재조합 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포(이수 앱지스, 한국)를 무혈청 배지와 125 mL 플라스크 (Corning, Corning, NY)를 사용하여 다양한 염화 리튬이 첨가된 배지에서 부유배양을 수행하였다.The present inventors have found that Fc-fusion protein associated with sepsis Recombinant CHO cells (Isu Abies, Korea) producing the therapeutic recombinant protein were subjected to suspension culture in a serum-free medium and a 125 mL flask (Corning, Corning, NY) supplemented with various lithium chloride.
실제적인 배양 부피는 50 ㎖였으며, 무혈청 배지인 SFM4CHO(Hyclone, Logan, Utah)에 300 nM MTX(Methotrexate) 및 4 mM 글루타민(glutamine)을 첨가하여 회분식 배양을 하였다. 교반기(Adolf Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)의 속도는 110 rpm 이었고, 초기 세포 농도는 2.0 × 105 (cell/㎖)로 접종하였다. 다양한 농도의 염화리튬을 첨가하기 위하여 10 M의 농축액을 만든 후, 세포 접종과 동시에 0, 1, 5, 10 및 20 mM의 농도가 되도록 첨가해 주었다. 하기의 다양한 분석을 위하여 매일 1 ㎖의 배지를 회수하였다.
Actual culture volume was 50 ml, and 300 nM MTX (Methotrexate) and 4 mM glutamine were added to serum-free medium SFM4CHO (Hyclone, Logan, Utah) for batch culture. The speed of the agitator (Adolf Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland) was 110 rpm and the initial cell concentration was 2.0 × 10 5 cells / ml. To add various concentrations of lithium chloride, a 10 M concentrate was prepared and added at concentrations of 0, 1, 5, 10 and 20 mM simultaneously with cell inoculation. One ml of the medium was collected daily for various assays described below.
<< 실시예Example 2> 치료용 재조합 단백질을 생산하는 재조합 2> Recombinant Producing Therapeutic Recombinant Protein CHOCHO 세포의 3 ℓ 부유배양 3 L suspension culture of cells
본 발명자들은 치료용 재조합 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포를 무혈청 배지와 3 ℓ동물세포반응기(New Brunswick Scientific, Edison, NJ)를 사용하여 최적의 염화 리튬 첨가 농도인 10 mM 이 첨가된 배양과 대조군의 배양을 부유배양으로 수행하였다. 상기 배양은 플라스크 배양에서 보인 단위세포당 치료용 재조합 단백질의 생산성 증가 및 최종 치료용 재조합 단백질의 생산성 증가 현상이 대규모 배양에서도 적용되는지 알아보기 위하여 수행되었다. The recombinant CHO cells producing the therapeutic recombinant protein were cultured in a serum-free and 3 L animal cell reactor (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) supplemented with 10 mM of the optimal concentration of lithium chloride Was carried out by suspension culture. The culturing was carried out in order to investigate whether the increase of the productivity of the recombinant protein for therapeutic treatment per unit cell and the increase of the productivity of the recombinant protein for the final treatment applied in the flask culture was applied to the large scale culture.
실제 배양 부피는 2 ℓ였으며, 무혈청배지 SFM4CHO(Hyclone, Logan, Utah)에 300 nM MTX와 4 mM 글루타민을 첨가하여 회분식 배양을 하였다. pH는 7.2, 용존산소량은 50% 및 임펠러(impller)의 회전속도는 50 rpm으로 조절하였고, 초기 세포 농도는 2.0 × 105 cell/㎖로 접종하였다. 10 M 농도의 염화리튬 농축액을 최적의 첨가 농도인 10 mM이 되도록 세포 접종과 함께 넣어주었다. 하기의 다양한 분석을 위하여 매일 50 ㎖ 부피의 배지를 회수하였다.
Actual culture volume was 2 L. Batch culturing was performed by adding 300 nM MTX and 4 mM glutamine to serum-free medium SFM4CHO (Hyclone, Logan, Utah). The pH was adjusted to 7.2, the dissolved oxygen amount to 50% and the rotation speed of the impeller to 50 rpm, and the initial cell concentration was 2.0 × 10 5 cells / ㎖. A 10 M lithium chloride concentrate was added to the cells at a concentration of 10 mM. A 50 mL volume of the medium was collected daily for various assays described below.
<< 실험예Experimental Example 1> 염화리튬의 농도 의존적 처리에 의한 재조합 단백질의 생산효과 확인 1> Confirmation of production effect of recombinant protein by concentration-dependent treatment of lithium chloride
상기 <실시예 1>에서 염화리튬의 첨가 농도에 따라 세포의 성장, 세포 생존율 및 치료용 재조합 단백질의 생산성이 어떻게 변화하는지 조사하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. In order to investigate how the cell growth, cell viability, and productivity of the therapeutic recombinant protein vary according to the concentration of lithium chloride added in Example 1, the following experiment was conducted.
구체적으로, 125 ㎖ 플라스크에서 제조한 재조합 CHO 세포가 있는 기본 무혈청 배지에 0, 1, 5, 10 및 20 mM의 염화리튬을 첨가한 후, 매일 1 ㎖씩 회수한 배지를 가지고 효소결합면역흡수법(ELISA)을 이용하여, 목적 단백질인 치료용 재조합 단백질의 생산량의 변화를 확인하였다. 효소결합면역흡수법 측정은 먼저 96-웰 플레이트(Nunc)에 항-인간 IgG(Sigma)로 코팅을 하고, 0.1% 트윈-20(Sigma)이 포함된 PBS에 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin(Sigma))이 포함된 용액으로 블라킹(blocking)을 하였다. 여기에 배양 샘플을 넣어 반응을 시킨 후, 퍼옥시다제가 결합된 염소 항-인간 IgG(peroxidase conjugated goat anti-human IgG (Sigma)로 결합을 시켰다. 3,3’,5,5’-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine(TMB))(Sigma) 용액으로 발색을 시킨 후 2.5M H2SO4을 이용하여 반응을 정지시키고 UV ELISA 리더(reader)에서 흡광도를 측정하였다.Specifically, 0, 1, 5, 10 and 20 mM lithium chloride was added to the basic serum-free medium containing the recombinant CHO cells prepared in the 125 ml flask, and 1 ml of the solution was collected every day. (ELISA) was used to confirm the change in the production amount of the therapeutic recombinant protein as the target protein. Enzyme-linked immunosorbent assay was performed by first coating 96-well plates (Nunc) with anti-human IgG (Sigma), adding 1% bovine serum albumin (PBS) to PBS containing 0.1% Tween- (Sigma)). ≪ / RTI > After incubation, the reaction mixture was incubated with peroxidase-conjugated goat anti-human IgG (Sigma) conjugated goat anti-human IgG (3,3 ', 5,5'-tetramethyl The color was developed with a solution of tetramethylbenzidine (TMB) (Sigma), and the reaction was stopped using 2.5M H 2 SO 4 and the absorbance was measured in a UV ELISA reader.
또한, 생존한 세포의 수 및 세포 생존율을 현미경으로 세포의 수를 측정하여 계산하였다. The number of surviving cells and cell viability were calculated by measuring the number of cells by a microscope.
그 결과, 도 1 및 표 1에서 나타낸 바와 같이 낮은 농도의 염화리튬을 첨가하였을 때는 낮은 세포 성장억제 및 단위 세포당 재조합 단백질 생산성을 나타냈으나, 첨가된 염화리튬의 농도가 증가할수록 재조합 CHO 세포의 비성장 속도(단위 시간당 세포가 자라는 속도를 나타내고, 비성장속도가 높을수록 자라는 속도가 빠름을 의미함)는 줄어드는 반면에, 비생산 속도가 크게 증가하고, 치료용 재조합 단백질의 농도가 크게 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 10 mM의 염화리튬을 첨가하였을 때는 현저한 세포 성장억제와 더불어 단위 세포당 높은 치료용 재조합 단백질 생산성의 증가를 보였고, 결과적으로 최종 치료용 재조합 단백질의 생산성이 크게 증가하는 것을 확인하였다(표 1 및 도 1). As a result, as shown in FIG. 1 and Table 1, when low concentration of lithium chloride was added, low cell growth inhibition and recombinant protein productivity per unit cell were exhibited. However, as the concentration of added lithium chloride increased, While the rate of non-growth (indicating the rate of cell growth per unit time and the rate of growth as the non-growth rate is higher) is reduced, the rate of non-production is greatly increased and the concentration of therapeutic recombinant protein is greatly increased Respectively. In particular, when 10 mM of lithium chloride was added, the productivity of the recombinant protein for therapeutic treatment was increased and the productivity of the final therapeutic recombinant protein was greatly increased, as shown in Table 1 And Fig. 1).
따라서, 산업적 측면에서 치료용 재조합 단백질 생산할 경우에 10 mM 농도의 염화리튬 첨가가 더욱 높은 생산량을 얻을 수 있음을 확인하였다.
Therefore, it has been confirmed from the industrial viewpoint that the addition of lithium chloride at a concentration of 10 mM can produce higher yields when producing recombinant proteins for therapeutic use.
(/day)Non Growth Rate (μ)
(/ day)
(pg/cell/day)Non production rate (q p )
(pg / cell / day)
단백질 농도
(g/ℓ)Therapeutic recombination
Protein concentration
(g / l)
<< 실험예Experimental Example 2> 대규모 배양에서 염화리튬의 재조합 단백질 생산 효과 확인 2> Confirmation of recombinant protein production effect of lithium chloride in large-scale culture
상기 <실험예 1>의 플라스크 배양에서 보인 치료용 단백질 생산성 증가의 효과가 대규모 배양에서도 적용되는지 확인하기 위하여, 상기 <실시예 2>에 개시된 바와 같이, 3 ℓ 동물세포 반응기를 이용하여 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 생존한 세포수, 세포 생존율 및 재조합 단백질 생산성을 확인하였다. In order to confirm that the effect of the increase in the productivity of the therapeutic protein in the flask culture of Example 1 was also applied to the large-scale culture, as described in Example 2, Cell viability and recombinant protein productivity were confirmed by the same method as in Example 1>.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 10 mM의 염화리튬을 첨가한 배지 및 동물세포반응기(bioreactor)를 이용한 대규모 배양에서도 치료용 재조합 단백질의 생산량 증가가 유사하게 나타났음을 확인하였다. 10 mM의 염화리튬을 첨가한 배지 군에서 생존한 세포 수는 감소하였지만 세포 생존율은 증가하였다. 또한, 생산성을 나타내는 치료용 재조합 단백질의 농도가 시간이 지남에 따라 크게 증가하는 것을 확인하였다(도 2).As a result, as shown in FIG. 2, it was confirmed that the increase in the amount of recombinant protein produced in the treatment was also similar in a large-scale culture using 10 mM lithium chloride-added medium and an animal cell reactor (bioreactor). In the medium supplemented with 10 mM lithium chloride, the number of surviving cells was decreased but the cell survival rate was increased. In addition, it was confirmed that the concentration of therapeutic recombinant protein showing productivity increased significantly over time (FIG. 2).
따라서, 대규모 용량을 주로 하는 산업적 측면에서도 치료용 재조합 단백질을 생산하는 데 상기 방법을 적용할 수 있음을 확인하였다.
Therefore, it has been confirmed that this method can also be applied to the production of recombinant proteins for treatment in industrial aspects mainly involving large-scale capacity.
<< 실험예Experimental Example 3> 3> 유가식Oil price formula 배양에서 염화리튬의 치료용 재조합 단백질 생산 효과 확인 Confirmation of production effect of recombinant protein for treatment of lithium chloride in culture
현재 산업적으로 가장 널리 사용되고 있는 생산 방법인 유가식 생산 공정에 본 발명의 염화리튬이 첨가된 배지가 재조합 단백질 생산성 증가에 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.In order to confirm whether the medium containing lithium chloride of the present invention is effective in increasing the productivity of recombinant proteins, the following experiment was conducted.
기존의 유가식 배양 방법을 사용하였으며, 공급 칵테일(feeding cocktail(HyClone Cell Boost))을 0.35%의 농도로 배양 4일째부터 2일 마다 한번 씩 첨가하였다.Feeding cocktail (HyClone Cell Boost) was added at a concentration of 0.35% once every 2 days from the 4th day of culture.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 10 mM의 염화리튬이 첨가된 유가식 배양은 유의적인 세포 성장 억제 및 단위 세포당 재조합 단백질 생산성을 증가시키고, 또한 상기 <실험예 1> 및 <실험예 2>의 회분식 배양과 비교하여 유의적인 재조합 단백질 생산 증가 효과를 확인하였다(도 3).As a result, as shown in FIG. 3, the fed-batch culture in which 10 mM lithium chloride was added increased the inhibition of cell growth and the productivity of recombinant proteins per unit cell. Further, in Experimental Example 1 and Experimental Example 2, (Fig. 3). As shown in Fig.
따라서, 유가식 생산 공정은 치료용 재조합 단백질 생산에 있어 가장 널리 사용되고 있는 생산 방법이므로, 본 발명의 염화리튬이 첨가된 배지 조성물은 산업적으로 적용할 수 있음을 확인하였다.
Therefore, it has been confirmed that the culture medium containing lithium chloride of the present invention can be industrially applied since it is the most widely used production method for producing recombinant proteins for therapeutic use.
<< 실험예Experimental Example 4> 염화리튬 유가를 통한 4> Through the lithium chloride price 비생산속도Non-production rate 증가 효과 확인 Confirmation of increase effect
염화리튬이 배지 조성물로서 역할뿐만 아니라 첨가제로서 역할할 수 있는지를 조사하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.In order to investigate whether lithium chloride can serve not only as a role but also as an additive, the following experiment was conducted.
구체적으로, 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 재조합 CHO 세포를 배양한 후, 0일째, 또는 0일째 및 2일째에 각각 염화리튬의 농도가 10 mM이 되도록 배지에 첨가하였고, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 생존한 세포 수 및 생산성을 측정하였다. Specifically, recombinant CHO cells were cultured in the same manner as in <Example 1>, and added to the medium so that the concentration of lithium chloride was 10 mM on
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 실험군 1(10 mM 염화리튬, 0일째 추가) 및 실험군 2(10 mM 염화리튬, 0일째 및 2일째 첨가)는 염화리튬을 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 유의적인 재조합 단백질 생산성을 나타내고, 특히 염화리튬을 추가적으로 첨가하는 실험군 2는 염화리튬을 배양 2일째에 투여한 실험군 1과 비교하여 비생산 속도 및 재조합 단백질 농도가 크게 증가하는 것을 확인하였다(도 4). As a result, as shown in Fig. 4, the experimental group 1 (10 mM lithium chloride, added at day 0) and the experimental group 2 (10 mM lithium chloride, added at
따라서, 염화리튬은 배지로서의 역할과 함께, 치료용 재조합 단백질의 산업적 생산을 위한 배지 첨가물로 유용하게 역할할 수 있음을 확인하였다.
Thus, it has been confirmed that lithium chloride plays a role as a medium, and can also serve as a medium supplement for the industrial production of therapeutic recombinant proteins.
Claims (12)
A medium composition for improving recombinant protein productivity in CHO cells, which contains 10 mM lithium chloride (LiCl) in a basic medium that is a serum-free medium, an endless white medium, or a chemically defined medium.
The culture medium for improving the productivity of recombinant proteins in CHO cells according to claim 1, wherein the culture medium composition improves the productivity of the recombinant protein.
5. The method of claim 4, wherein the recombinant protein is selected from the group consisting of thrombopoietin (TPO), erythropoietin (EPO), tissue plasminogen activator (tPA) A Fc-containing fusion protein, and a Fc-containing fusion protein.
2. The culture medium composition for enhancing recombinant protein productivity in CHO cells according to claim 1, wherein the culture medium composition increases the rate of production of an animal cell line (productivity per unit cell, q p ) and cell survival rate.
The culture medium for improving the productivity of recombinant proteins in CHO cells according to claim 6, wherein the animal cell line is a CHO cell.
8. The method of claim 7, Wherein the CHO cell line is a CHO dhfr (-) cell in which the DHFR gene is deleted.
2) 상기 단계 1)의 배양액으로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질 생산 방법.
1) culturing a transformant producing the desired recombinant protein in the medium composition of claim 1, and obtaining a culture; And
2) separating the recombinant protein from the culture of step 1).
The method for producing a recombinant protein according to claim 9, wherein lithium chloride is additionally added to a medium for culturing the transformant of step 1).
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190429 Year of fee payment: 4 |